PLATELIATM EBV-VCA IgM 7293696 testesTESTE IMUNOENZIMÁTICO PARA A DETERMINAÇÃOQUALITATIVA DOS ANTICORPOS IgM CONTRA O VÍRUS DE EPSTEIN-BARR (VIRAL CAPSID ANTIGEN) NO SORO HUMANO

1- CAMPO DE APLICAÇÃOEste dispositivo de doseamento imunológico destina-se à determinaçãoqualitativa dos anticorpos IgM contra o Antigénio da Cápside do Vírus deEpstein-Barr (VCA) no soro humano. O teste PlateliaTM EBV-VCA IgM pode serusado em conjunto com outros testes serológicos para o vírus de Epstein-Barr(PlateliaTM EBV-VCA IgG, PlateliaTM EB-NA-1-IgG e PlateliaTM EBV-EA-D IgG),como auxiliares no diagnóstico da mononucleose infecciosa.

2- SIGNIFICADO CLÍNICOO vírus de Epstein-Barr (EBV) é um agente patogénico humano comum,afectando 80% dos adultos nos EUA. Desde a descoberta do vírus de Epstein-Barr em 1964, o EBV tem sido etiologicamente implicado num número cadavez mais elevado de doenças no Homem, como é o caso da mononucleoseinfecciosa. O EBV tem sido também associado a linfomas das células B emindivíduos com deficiências imunológicas, incluindo quer doentestransplantados, quer doentes com SIDA. Com base na sua morfologia, o EBVé classificado como um membro da família dos herpesvírus. Todos osherpesvírus apresentam, em comum, a possibilidade de estabelecerem umainfecção latente nos seus hospedeiros. A mononucleose infecciosa (MI) é umadoença linfo-proliferativa, aguda, auto-limitante causada pelo EBV. Apesar dainfecção primária com EBV na infância ser assintomática, cerca de metade adois terços das infecções primárias provocadas pelo vírus em adolescentesmais velhos e adultos jovens levam ao aparecimento de uma patologiaclínica, tal como a mononucleose infecciosa, a qual apresenta os seguintessintomas: faringite febril, amigdalite, linfadenopatia, mal-estar, cefaleias,mialgias, hepatomegália e esplenomegália, erupções cutâneas e leucocitose.A infecção por HBV resulta na produção de anticorpos contra quatrocomplexos distintos: Antigénio Nuclear induzido pelo EBV (EBNA), AntigénioPrecoce induzido pelo EBV (EA), Antigénio da Cápside do Vírus (VCA) eAntigénio de Membrana induzido pelo EBV (MA). O complexo EA encontra-se dividido em dois componentes, os quais incluem o EA-D (componentedifundido) e o EA-R (componente restrito).Os anticorpos contra o VCA são detectáveis na fase inicial da doença. Osníveis de anticorpos aumentam na fase inicial, atingem um máximo ao fim de3-4 semanas e depois diminuem para níveis não detectáveis.

96

3- PRINCÍPIO DO MÉTODOOs testes imunoenzimáticos (ELISA) baseiam-se na capacidade que osmateriais biológicos (i.e., os antigénios) apresentam para seremadsorvidos pelas superfícies plásticas, como é o caso do poliestireno(fase sólida). O dispositivo PlateliaTM EBV-VCA IgM utiliza a tecnologiaELISA, na qual a afinidade do antigénio VCA purificado permite a sualigação às microcúpulas da microplaca. Quando os antigénios ligados àfase sólida são colocados em contacto com o soro do doente, oanticorpo específico do antigénio, se presente, irá ligar-se ao antigénioda fase sólida formando complexos antigénio-anticorpo. É usada umasolução de soro previamente tratado para eliminar interferênciaspotencialmente causadas pela IgG e IgM-RF. O excesso de anticorpos éremovido por lavagem. Segue-se a adição de IgM de cabra anti-humanaconjugada com peroxidase de rábano, a qual se liga aos complexosantigénio-anticorpo. O excesso de conjugado é removido por lavagem,seguindo-se a adição do Substrato, tetrametilbenzidina (TMB). Se o sorodo doente contiver anticorpos IgM específicos contra o antigénio EBV-VCA, desenvolve-se uma cor azul. Quando se interrompe a reacçãoenzimática com H2SO4 1N, o conteúdo das microcúpulas torna-seamarelo. A cor, a qual é proporcional à concentração dos anticorpos nosoro, pode ser lida num espectrofotómetro adequado ou no leitor deplacas de microcúpulas ELISA. A sensibilidade, especificidade ereprodutibilidade do método ELISA são comparáveis às de outros testesserológicos para anticorpos, tais como imunofluorescência, fixação docomplemento, hemaglutinação e radioimunoensaios.

97

4- COMPONENTES DO DISPOSITIVOTodos os reagentes são exclusivamente para uso diagnóstico in vitro.

98

Rótulo Natureza dos reagentes Apresen taçãoR1 Microplate Microplaca: 12 tiras (8 microcúpulas cada)

revestidas com o antigénio da cápside do vírus EBVpurificado com afinidade inactivada (gp 125),acondicionado numa bolsa com exsicante /indicador da humidade.

1

R2 ConcentratedWashing

Solution (20x)

Solução de lavagem concentrada (20x): TampãoTris (pH 7,2 ± 0,2) com Tween® 20 a1%.Conservantes: ProClin™ 300 (0,1%)

1 x 50 ml

R3 Non reactivecontrol

Controlo não reactivo (humano) para anticorpos IgManti-EBV-VCANegativo para o HBs Ag e para os anticorposcontra HIV-1, HIV-2 e HCV;Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) epenicilina/estreptomicina (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4a Positive Control I

Controlo positivo I (humano) para anticorpos IgManti-EBV-VCANegativo para o HBs Ag e para os anticorposcontra HIV-1, HIV-2 e HCV;Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) epenicilina/estreptomicina (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4b Positive Control II

Controlo positivo II (humano) para anticorpos IgManti-EBV-VCANegativo para o HBs Ag e para os anticorposcontra HIV-1, HIV-2 e HCV;Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) epenicilina/estreptomicina (0,01%)

1 x 0,4 ml

R5 Calibrator Calibrador (humano) para anticorpos IgM anti-EBV-VCA, com o factor específico do dispositivoimpresso na cartonagem exterior.Negativo para o HBs Ag e para os anticorposcontra HIV-1, HIV-2 e HCV;Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) epenicilina/estreptomicina (0,01%)

1 x 0,4 ml

5- ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

PrecauçõesA confiança dos resultados depende da correcta implementação dasseguintes Boas Práticas de Laboratório:• Não usar reagentes fora do prazo de validade• Não misturar reagentes de diferentes lotes no mesmo ensaio.NOTA: É possível o uso de outros lotes além dos que se encontram nodispositivo, desde que se use o mesmo lote em todo o ensaio: solução delavagem (R2), solução Substrato / Cromogénio (R9) e solução de paragem(R10). Estes reagentes podem ser usados com PlateliaTM EBV-VCA IgG,PlateliaTM EBV-EA-D IgG e PlateliaTM EB-NA-1 IgG do nosso catálogo. Contacteos nossos serviços técnicos para informações mais detalhadas.• Antes de usar, é necessário esperar 30 minutos para que os reagentes

estabilizem à temperatura ambiente.• Reconstituir cuidadosamente os reagentes evitando qualquer contami-

nação. 99

Rótulo Natureza dos reagentes Apresen taçãoR6 Conjugate Conjugado (pronto a usar): anticorpos de cabra

contra a IgM humana conjugados comperoxidase de rábano.Conservantes: ProClin™ 300 (0,1%) egentamicina

1 x 16 ml

R7 Diluent II Diluente II: tampão pronto a usar (pH 7,5) comestabilizadores de proteínas. Contém IgG decabra/ovelha anti-humana para adsorção séricacom o objectivo de eliminar a competição entreas IgG.Conservantes: ProClin™ 300 (0,1%)

2 x 45 ml

R9 ChromogenTMB

Solução Substrato/Cromogénio (pronta a usar):Tetrametilbenzidina (TMB).O reagente deve manter-se fechado quando nãoestá a ser usado; caso contrário, pode formar-seum precipitado nas microcúpulas de reacção.

1 x 15 ml

R10 StoppingSolution

Solução de paragem (pronta a usar): ÁcidoSulfúrico 1N

1 x 15 ml

Folha de registo dos resultados 1

• Não realizar o teste na presença de vapores reactivos (vapores de ácidos,de bases e de aldeídos) ou de pó, que possam alterar a actividadeenzimática do conjugado.

• Utilizar material de vidro cuidadosamente lavado e enxaguado com águadesionizada ou, preferencialmente, material de utilização única.

• Evitar que as microplacas sequem entre o final da operação de lavagem ea distribuição do reagente.

• A reacção enzimática é muito sensível a iões metálicos. Assim, evitequalquer contacto dos vários conjugados ou da solução substrato comelementos metálicos.

• A solução Substrato / Cromogénio deve ser incolor. O aparecimento deuma coloração indica que o reagente não pode ser usado e deve sersubstituído. Use uma nova ponta de pipeta para cada amostra.

• A lavagem da microplaca é um passo crítico no processo: respeitar onúmero de ciclos de lavagem recomendado e assegurar-se de que todas asmicrocúpulas são completamente cheias e depois completamenteesvaziadas. Uma lavagem incorrecta pode originar resultados incorrectos.

• Nunca usar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução dedesenvolvimento.

• Verificar as pipetas e outro equipamento para operações correctas eexactas.

• Não alterar o método de ensaio.

INSTRUÇÕES DE SAÚDE E SEGURANÇATodos os reagentes fornecidos destinam-se a uso diagnóstico in vitro.• Usar luvas descartáveis quando manusear reagentes.• Não pipetar com a boca.• Os materiais de origem humana usados na preparação dos reagentes

foram testados e mostraram ser não reactivos para o antigénio desuperfície da hepatite B (HBsAg), para os anticorpos contra a hepatite C(HCV) e para os vírus da imunodeficiência adquirida (anti-HIV1 e anti-HIV2). Porque nenhum método pode garantir de forma absoluta aausência de agentes infecciosos, deve manusear os reagentes de origemhumana e as amostras dos doentes tendo em consideração que sãopassíveis de transmitir doenças infecciosas.

100

• Considerar como material infeccioso qualquer material directamente emcontacto com as amostras e reagentes de origem humana, assim como assoluções de lavagem.

• Evitar derramar amostras ou soluções contendo amostras.• O material derramado deve ser lavado com lixívia diluída a 10%. Se o

líquido de contaminação é um ácido, o material derramado deve serpreviamente neutralizado com bicarbonato de sódio, depois limpo comlixívia e seco com papel absorvente. O material usado na limpeza deveser colocado num recipiente para resíduos contaminados.

• Amostras, reagentes de origem humana, assim como materialcontaminado e produtos devem ser eliminados somente apósdescontaminação.- quer por imersão em lixívia na concentração final de 5% de hipoclorito

de sódio durante 30 minutos.- quer por autoclavagem a 121ºC durante, no mínimo, 2 horas.

A autoclavagem durante, pelo menos, uma hora a 121ºC é o melhor métodopara inactivação dos vírus HIV e do vírus HB.

PRECAUÇÃO: NÃO INTRODUZIR SOLUÇÕES CONTENDOHIPOCLORITO DE SÓDIO NA AUTOCLAVE.

• As substâncias químicas devem ser manuseadas e rejeitadas de acordocom as Boas Práticas de Laboratório.

• Evitar qualquer contacto do tampão substrato, do cromogénio e dasolução de lavagem com a pele ou mucosas (risco de toxicidade, irritaçãoou queimadura).

Encontra-se disponível uma ficha de segurança que será entregue a pedido.

Atenção: Alguns reagentes contêm ProClin™ 300 < 1,5%

R43: Pode causar sensibilização em contacto com a peleS28-37: Após contacto com a pele, lavar imediata e abundan-temente água e sabão. Usar luvas adequadas.

101

Xi - Irritante

6- MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO• Misturador Vortex.• Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm (*).• Recipiente para lixo potencialmente contaminado.• Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio.• Água destilada ou desionizada.• Buretas.• Luvas de látex descartáveis.• Óculos de protecção ou óculos de segurança.• Papel absorvente.• Pipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou pré-ajustadas ou

multipipetas para medir e fornecer 10, 100 ou 1.000 µl.• Equipamento para lavagem manual, semi-automática ou automática de

microplacas (*).• Tubos de ensaio de utilização única. (*) Para informações mais detalhadas consulte-nos acerca do equipamentorecomendado pelo nosso departamento técnico.

7- RECONSTITUIÇÃO E CONDIÇÕES DE CONSERVAÇÃODOS REAGENTES O dispositivo deverá ser conservado entre +2-8ºC até à data de validadereferida na embalagem (excepto em caso de instruções específicas). Antes deusar, deixar que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+21 - 25ºC).Colocar todos os reagentes no frigorífico imediatamente após a suautilização.

1) Reagentes prontos a usar• Reagente 1 (R1): microplaca

Cada tabuleiro contendo 12 tiras encontra-se numa bolsa de folha dealumínio fechada. Cortar a bolsa com uma tesoura ou um bisturi, 0,5 –1 cm acima da linha de fecho. Voltar a colocar imediatamente no saco astiras que não foram utilizadas. Fechar novamente o saco e voltar a colocara +2-8ºC. Após a abertura, as tiras são estáveis durante um mês.

• Reagente 3 (R3): controlo não reactivo• Reagente 4a (R4a): controlo positivo I• Reagente 4b (R4b): controlo positivo II• Reagente 5 (R5): calibrador

102

• Reagente 6 (R6): conjugado• Reagente 7 (R7): diluente II • Reagente 9 (R9): Solução Substrato / Cromogénio • Reagente 10 (R10): solução de paragem

2) Reagentes que requerem reconstituição• Reagente 2 (R2): solução de lavagem concentrada 20xDiluir 50 ml da solução de lavagem 20x com água destilada e/oudesionizada para obter 1,0 l de uma solução pronta a ser usada. Misturarbem. Após diluição, conservar a +2-8ºC durante 5 dias.

8- COLHEITA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRARecolher a amostra de sangue de acordo com as práticas actuais. O testeserá realizado com amostras não diluídas. Separar o soro do coágulo ou doseritrócitos logo que possível, de forma a evitar qualquer hemólise. Umahemólise extensa pode afectar o desempenho do teste. As amostras comagregados devem ser sujeitas a centrifugação antes de serem testadas.Partículas ou agregados de fibrina em suspensão podem originar falsosresultados positivos.As amostras podem ser conservadas a +2 - 8ºC se a pesquisa for realizadano espaço de 5 dias, ou, podem ser congeladas a -20ºC durante váriosmeses. Evitar ciclos repetidos de congelação/descongelação. Se as amostrasforem transportadas, devem ser acondicionadas de acordo com osregulamentos em vigor no que se refere ao transporte de agentes biológicos.

NÃO USAR SORO CONTAMINADO, HIPERLIPÉMICO,HIPERHEMOLISADO ICTÉRICO OU INACTIVADO PELO CALOR.

9- MÉTODOSeguir exactamente o método proposto.Usar o calibrador e os controlos para cada série de determinações, deforma a validar os resultados do teste.Cumprir com as seguintes Boas Práticas de Laboratório:1. Estabelecer cuidadosamente a distribuição das amostras e o plano de

identificação.2. Preparar a solução de lavagem diluída (R2) (consultar a secção 7).3. Retirar o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) da bolsa de protecção.

Colocar o número desejado de tiras revestidas com o antigénio no suporte

103

das microcúpulas. Usar 1 microcúpula para o branco do reagente,3 microcúpulas para o Calibrador, 1 microcúpula para cada Controlo:Negativo, Positivo I e Positivo II.

4. Todas as amostras, controlos e calibrador deverão ser agitados no Vortexantes de usados. Diluir as amostras a testar, o Calibrador, os ControlosNegativo e Positivo de 1:81 (por ex. 10 µl + 800 µl) com Diluente II (R7)da amostra nos tubos de diluição ou na placa de diluição.

5. Pipete 100 µl de cada Calibrador diluído, Controlo ou amostra do doentepara cada microcúpula. Pipete 100 µl de Diluente II (R7) da amostra paraa primeira microcúpula para o branco do reagente.

6. Incubar a microplaca durante 30 minutos ± 2 minutos à temperaturaambiente (21-25ºC).

7. Aspirar os conteúdos de todas as microcúpulas para o recipiente dos lixospotencialmente contaminados (contendo hipoclorito de sódio). Adicionarimediatamente em cada microcúpula, um mínimo de 300 µl de solução delavagem. Aspirar novamente. Repetir esta operação pelo menos 4 vezes(no total um mínimo de 5 lavagens). Se necessário, secar a placacolocando-a de forma invertida em papel absorvente. Se usar umalavagem automática, seguir o mesmo processo.

8. Distribuir 100 µl do Conjugado (R6) pronto a usar em todas asmicrocúpulas.

9. Incubar durante 30 minutos ± 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC).

104

A

B

C

D

E

F

G

H

1

B1

R3

R4a

R4b

R5

R5

R5

S1

2

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10. Esvaziar todas as microcúpulas por aspiração e lavar 5 vezes comoanteriormente descrito.

11. Colocar rapidamente 100 µl de solução Substrato/Cromogénio (R9) emcada microcúpula.

12. Permitir o desenvolvimento da reacção no escuro durante 10 minutos± 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC). Não usar película adesivadurante este período de incubação.A solução Substrato/Cromogénio ficará azul nas microcúpulas contendoteores detectáveis de anticorpos IgM.

13. Adicionar 100 µl da Solução de Paragem (R10) a cada microcúpula.Misturar batendo suavemente na placa. A adição da Solução de Paragem(R10) irá dar origem a uma alteração na cor, de azul para amarelo.

14. Esperar pelo menos 5 minutos e ler. Limpar cuidadosamente a parte debaixo da placa. Usando um comprimento de onda de 450 nm, ler obranco e depois medir a densidade óptica de cada microcúpula. A placadeve ser lida no espaço de 30 minutos após a adição da solução deparagem (as tiras devem ser mantidas ao abrigo da luz antes da sualeitura).

15. Verificar todos os resultados para concordância entre a leitura, a placa, adistribuição das amostras e o plano de identificação.

10- CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1) Cálculo da absorvância média1. D.O. (Densidade Óptica) média de Cut-off do Calibrador– Calcular o valor

da D.O. média de Cut-off do Calibrador usando três determinações doCalibrador (R5). Se qualquer dos três valores do calibrador diferir mais de15% em relação à média, rejeitar o valor e calcular a média usandoapenas os dois valores restantes.

2. Factor de Correcção – Para reflectir as flutuações do dia-a-dia nas etapasdo teste devido à temperatura ambiente e aos tempos; é determinado umFactor de Correcção para cada lote de dispositivos. O Factor deCorrecção é impresso no frasco do Calibrador.

3. Valor de Cut-off do Calibrador– O valor de Cut-off do Calibrador paracada teste é determinado através da multiplicação do Factor de Correcçãopela D.O. média de Cut-off do Calibrador, determinada no ponto 1.

105

4. Valor do ISR – Calcular o Immune Status Ratio para cada colheita pordivisão do valor da D.O. da colheita pelo Valor de Cut-off do Calibradordeterminado no ponto 3.

Exemplo :D.Os. obtidas para o Calibrador (R5) = 0,380 - 0,400 - 0,420D.O. média para o Calibrador (R5) = 0,400Factor de correcção = 0,5Valor de Cut-off do Calibrador = 0,5 x 0,400 = 0,200D.O. obtida para o soro do doente = 0,600Valor do ISR = 0,600/0,200 = 3,00

2) Validação do teste1. Branco do Reagente (quando lido em relação ao branco de ar) deve

ser < 0,150 a 450 nm : DO (RB) < 0,1502. Controlo negativo (R3) deve ser ≤ 0,250 a 450 nm (quando lido

contra o branco do reagente): DO (R3) ≤ 0,2503. Cada Calibrador (R5) deve ser ≥ 0,250 a 450 nm (quando lido contra

o branco do reagente: DO (R5) ≥ 0,2504. Controlo positivo (R4b) deve ser ≥ 0,500 a 450 nm (quando lido

contra o branco do reagente): DO (R4b) ≥ 0,5005. Os valores do ISR (Immune Status Ratio) para os controlos negativo,

positivo I e positivo II (R3, R4a, R4b) devem estar dentro dos seusrespectivos intervalos impressos nos frascos.

Se estes critérios não se encontrarem dentro dos respectivos intervalos, oteste deverá ser considerado inválido e deverá ser repetido.

3) Interpretação dos resultadosOs valores do ISR dos doentes (Immune Status Ratio) são interpretados daseguinte forma:

106

Valor do ISR Resultados Interpretação

≤ 0.90 NegativoNão é significativo o número de anticorpos IgM EBV-VCA detectáveis

0.91-1.09 Duvidoso As amostras devem ser novamente analisadas

≥ 1.10 PositivoNível significativo de anticorpos IgM EBV-VCAdetectáveis. Indicativo de infecção actual ou recente.

1. Recomenda-se a seguinte forma para comunicação dos resultados obtidos:“Estes resultados foram obtidos com o teste PlateliaTM EBV-VCA IgM. Osvalores obtidos com diferentes métodos podem não ser comparáveis. Amagnitude do valor obtido para a IgM não pode ser correlacionada comum título final.”

2. A interpretação exacta da infecção pelo EBV baseia-se nos resultadosrelativos a quatro anticorpos EBV distintos que são usados paraproporcionar um quadro resumido da infecção pelo EBV: AntigénioNuclear IgG induzido pelo EBV (EB-NA), Antigénio Precoce IgG induzidopelo EBV (EBV-EA), Antigénio IgM e IgG da Cápside do Vírus (EBV-VCA).A interpretação exacta da infecção pelo EBV baseia-se nos resultados paratodos estes anticorpos e, para efeitos de diagnóstico, não deve basear-seapenas no resultado de um único teste.

3. As amostras cujos resultados se mantêm duvidosos após repetição do teste,devem ser testadas usando um método alternativo, por ex.,imunofluorescência (IFA). Se os resultados continuarem duvidosos, deve sercolhida uma nova amostra.

4) Valores esperados

• Fase Aguda A IgM EBV-VCA aumenta muito rapidamente na fase aguda e édetectável antes ou em simultâneo com a IgG EBV-VCA, a IgM EB-NA-1 eos anticorpos heterófilos. A IgM EBV-VCA diminui durante a fase tardiajuntamente com a IgM EB-NA-1, mas a IgG EBV-VCA mantém-se.

• Fase de TransiçãoA IgM EBV-VCA diminui para valores baixos e aproximadamente semelhantesaos valores da IgG EB-NA-1, os quais começam a aumentar. A IgG EBV-VCAmantém-se.

• Fase de Convalescença A IgM EBV-VCA diminui para valores muito baixos a negativos e a IgG EB-NA-1 aumenta para valores elevados.

5) PrevalênciaFoi testado o soro de um grupo de 158 indivíduos de uma populaçãonormal de diferentes idades, sexo e áreas geográficas dos E.U.A. com oteste PlateliaTM EBV-VCA IgM.

107

A taxa de valores positivos para o doseamento com o teste PlateliaTM EBV-VCA IgM revelou ser de 2,5% e a taxa de valores duvidosos foi de1,9%. A distribuição dos valores do ISR neste estudo é apresentada nográfico seguinte.

Distribuição dos Valores do ISR numa População Normal (n=158)

O Quadro seguinte apresenta um resumo da população normal,estratificada por faixas etárias:

108

Idade Negativo Duvidoso Positivo Total

≤ 2021 - 3031 - 4041 - 5051 - 60

Total

847482919151

300003

013004

1148512919

158

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

90

14

3 15

2 0 0 31 2 1 0 0 1

[0-0

,11[

[0,1

1-0

,21[

[0,2

1-0

,3[

[0,3

-0,4

1[

[0,4

1-0

,51[

[0,5

1-0

,61[

[0,6

1-0

,71[

[0,7

1-0

,81[

[0,8

1-0

,91[

[0,9

1-1

,09[

[1,0

9-1

,3[

[1,3

-1,6

[

[1,6

-1,9

[

[1,9

-2,5

[

[2,5

-3[

ISR

6) Limitações da sua utilização1. Processos ou práticas que não as descritas no folheto informativo

podem originar resultados questionáveis.• A não repetibilidade das reacções é frequentemente causada por:

- Lavagem inadequada da microplaca,- Passos de incubação com tempos incorrectos,- Contaminação das amostras negativas por soro ou plasma com

um elevado título de anticorpos,- Contaminação da solução de desenvolvimento por agentes

oxidantes (lixívia, iões metálicos…),- Contaminação da solução de paragem.

• uso de soro contaminado, ictérico, lipémico, hemolizado ou inactivadopelo calor pode originar resultados incorrectos e deverá ser evitado.

• As características do desempenho não foram estabelecidas para quaisquermatrizes além do soro.

2. O médico deve fazer a interpretação dos resultados deste teste, tendo emconta outras observações clínicas e métodos de diagnóstico.

• Este doseamento destina-se à determinação da resposta imunitáriaindicativa de uma infecção primária ou de uma reactivação do vírus. Ascaracterísticas do seu desempenho não foram estabelecidas para doentescom carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, outras linfadenopatiasassociadas ao EBV e outras patologias associadas ao EBV para além damononucleose relacionada com o EBV. Os resultados do teste PlateliaTM

EBV-VCA IgM obtidos com o soro de doentes imunodeprimidos devem sercuidadosamente interpretados. As características do seu desempenho nestedoseamento não foram estabelecidas para soros pediátricos.

• A ausência de níveis detectáveis de anticorpos IgM EBV-VCA não exclui apossibilidade de uma infecção actual ou recente. A amostra pode ter sidocolhida antes do aparecimento de anticorpos em valores detectáveis oumesmo após o seu desaparecimento. Caso se continue a suspeitar de umainfecção pelo EBV, deve fazer-se uma nova colheita 5-7 dias depois erepetir o teste. Frequentemente, contudo, no momento da sua detecção, asconcentrações dos anticorpos IgM encontram-se numa fase decrescente.

• As IgG específicas podem competir com as IgM para os seus locais deligação, o que pode resultar num falso resultado negativo. De modoinverso, o factor reumatóide na presença de IgG específica pode resultarnuma falsa reacção positiva.

109

As IgG de cabra/ovelha anti-humanas no Serum Diluent Plus diminuem acompetição específica das IgG e minimizam a interferência do factorreumatóide nas amostras.

• Alguns anticorpos antinucleares mostraram causar uma falsa reacçãopositiva em alguns testes ELISA.

11-COMPORTAMENTO FUNCIONAL

1 - Sensibilidade e Especificidade Relativas com Base naCaracterização do Soro

Foram testados cento e sessenta e seis soros seleccionados num laboratórioclínico. Os soros do estudo foram caracterizados como seronegativos (não foidetectada evidência de ter existido ou existir infecção por HBV), em faseaguda (presença de IgM EBV-VCA e anticorpos heterófilos, inexistência deIgG EB-NA), ou seropositivos (presença de anticorpos IgG EBV-VCA e de IgGEB-NA, não foi encontrada evidência de IgM EBV-VCA ou anticorposheterófilos, indicativos de uma anterior infecção). Os doseamentos usadospara a caracterização do soro foram os testes ELISA disponíveis no mercado.A sensibilidade, especificidade e correlação relativa do doseamento foramdeterminadas com base nesta caracterização. Assume-se que a respostarelativa à presença de IgM EBV-VCA deverá ser negativa para seronegativose soros convalescentes e positiva para soros em fase aguda. Os resultados encontram-se resumidos no quadro seguinte:

Sensibilidade relativa (aguda) = 37 / 38 = 97,4%• Intervalo de Confiança de 95% = 92,2 % - 100%Especificidade Relativa (Seronegativo) = 27 / 28 = 96,4 % • Intervalo de Confiança de 95% = 89,4 % - 100%

110

Estado AgudoIgM EBV-VCA +

IgG EB-NA –Heterófilos +

SeropositivoIgG EBV-VCA +IgG EB-NA +

IgM EBV-VCA -Heterófilos -

SeronegativoIgG EBV-VCA -IgG EB-NA –

IgM EBV-VCA -Heterófilos -

PlateliaTM

EBV-VCAIgM

PositivoDuvidosoNegativo

Total

3711

39

10

9899

10

2728

Especificidade Relativa (Seropositivo) = 98 / 99 = 99,0 % • Intervalo de Confiança de 95% = 97,0 % - 100%Correlação Relativa = 162 / 165 = 98,2 % • Intervalo de Confiança de 95% = 96,1 % - 100%Os resultados duvidosos não foram incluídos nestes cálculos.Os resultados duvidosos não foram repetidos. Foram comunicados comoduvidosos.O intervalo de confiança de 95% foi calculado usando o método normal.Notar que “relativo” se refere à comparação dos resultados deste ensaio comos de outro ensaio semelhante. Não houve tentativa de correlacionar osresultados do teste com a existência ou a inexistência da doença. Não podeser feita nenhuma avaliação sobre a exactidão do ensaio de comparaçãopara prever esta doença.

2 – Repetibilidade (Precisão Intra-Ensaio)O teste PlateliaTM EBV-VCA IgM foi avaliado em relação à precisãoatravés da análise de três soros, 10 vezes cada, na mesma placa. Osresultados encontram-se resumidos no Quadro seguinte.

X = Valor médio do ISR D.P. = Desvio PadrãoC.V. = Coeficiente de Variação

3 – Reprodutibildade (Precisão Inter-Ensaio)O teste PlateliaTM EBV-VCA IgM foi avaliado em relação à precisãoatravés da análise de três soros, 10 vezes cada, em três dias diferentes.Os resultados encontram-se resumidos no Quadro seguinte.

111

Soro n X D.P. CV %Negativo 10 0.06 0.03 54

Fraco positivo 10 1.71 0.16 9.2Positivo 10 4.15 0.21 5.1

Soro n X D.P. CV %

Negativo 30 0,05 0.03 65,6

Fraco positivo 30 1,61 0.2 12,1

Positivo 30 4,47 0.42 10,6

4 - Reactividade cruzadaForam testados soros contendo anticorpos IgM, detectáveis por ELISA, contraos Vírus Herpes Simplex I & II, Citomegalovírus e Vírus da Varicella-Zoster.Foram também testados soros contendo o factor reumatóide (FR). Todos ostestes alternativos foram os testes ELISA disponíveis no mercado.Os dados resumidos no Quadro seguinte indicam que os anticorpos contra osHerpesvirus e os soros contendo o FR não reagem de forma cruzada com oPlateliaTM EBV-VCA IgM.

Estudo de Reactividade Cruzada com o teste PlateliaTM EBV-VCA IgM

12-BIBLIOGRAFIA1. Veja a versão Inglesa.

112

Especificidade PlateliaTM EBV-VCA IgM Ensaio alternativo

FR +FR +FR +FR +FR +

IgM VZV +IgM VZV +IgM VZV +IgM VZV +IgM VZV +

IgM HSV 1 +IgM HSV 1 +IgM HSV 1 +IgM HSV 1 +IgM HSV 2 +IgM HSV 2 +IgM HSV 2 +IgM HSV 2 +IgM CMV +IgM CMV +IgM CMV +IgM CMV +

0.04 -0.03 -0.01 -0.01 -0.02 -0.33 -0.10 -0.04 -0.08 -0.03 -0.02 -0.02 -0.01 -0.01 -0.06 -0.05 -0.03 -0.04 -0.07 -0.04 -0.04 -0.06 -

1.87 +1.82 +1.73 +1.80 +1.85 +3.28 +5.46 +4.98 +2.34 +2.18 +2.53 +1.65 +1.34 +1.32 +1.76 +1.60 +2.09 +1.96 +1.23 +1.92 +3.83 +1.32 +

12-BIBLIOGRAPHY1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus Particles in Cultured

Lymphoblasts from Burkitt’s Lymphoma. Lancet. 1:702-703.

2. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong. 1965. Studies wilth Burkitt’s Lymphoma.Wister Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82.

3. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1985. Epstein-Barr Virus (Infectious Mono-nucleosis), 2ndedition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L.,R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp.97-982.

4. Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. HumanHerpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR.Basel. 1982.

5. Tobi, M. and S.E. Straus. 1985. Chronic Epstein-Barr Virus Diseas:A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann.Intern. Med. 103 (6(pt. 1)):951-953.

6. Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto. 1986. Defective Regulation of Epstein-BarrVirus Infection in Patients with Aquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDS-Related Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14):874-879.

7. Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R. 1982. Assocation of Epstein-Barr Virus withNeurological Diseases. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky,eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel.

8. Henle, G., W. Henle and V. Diehl. 1968. Relation of Burkitt’s Tumor-AssociatedHerpes-Type Virus to Infectious Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59:94-101.

9. Henle G., and W. Henle. 1978. The Virus as the Etiologic Agent of InfectiousMononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus. Berlin Sprihger-Verlag. Pp297-320.

10. Sumaya, C.V. 1986. Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: DiagnosticFactors. Lab. Mgmt. Oct., pp37-46.

11. Lenelle, E.T. and W. Henle. 1987. Epstein-Barr Virus Infections: Clinical andSerological Features. Laboratory Mgmt. Oct., pp37-46.

12. Nikoskelainen, J. and P. Hanninen. 1975. Antibody Response to Epstein-Barr Virus inInfectious Mononucleosis. Infect. Immun. 11:42-51.

13. Sumaya, C.V. 1987. Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: DiagnosticFactors. Laboratory Management. pp37-45.

14. Henle, W. and G. Henle. 1973. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis.New Eng. J. Med. 228:263-264.

15. Engvall, E. and P. Perlman. 1972. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III.Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulins inAntigen Coated Tubes. J. Immunol. 109:129-135.

18

16. Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15:232-235.

17. Engvall, E., and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA)Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:871-874.

18. Engvall, E. and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In:Proteins of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Proceedings of the NineteenthColloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p. 553-556.

19. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay.II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody-Coated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251:427-434.

20. CDC/NIH Interagency Working Group. 1993. BioSafety in Microbiological andBiomedical Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. of Health and Human Services,Public Health Service. pp18-24.

21. Drew, W.L. 1983. Diag. Med. 6:61-66.22. Lennete, E.T. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Chapter 78.23. Okano, M. 1988. Clinical Microbiology Reviews. Epstein-Barr Virus and Human

Diseases. Recent Advances in Diagnosis. Vol.1, p300-312.24. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp.

20-22.25. Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D.

1991. Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1. Journal ofVirology, ASM. Vol. 65, No.3, pp. 1466-1478.

26. Davidsohn, I. 1937. Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal ofAmerican Medical Association. 183: 289-295.

27. Evans, A.S. 1974. History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal ofMedical Science. 267: 189-195.

28. Lennette, E.T. 1988. Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis ofInfectious Diseases, Principles and Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P.,Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp. 230-246.

29. Bakerman, S. 1980. Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp 21-29.30. Voller, A. and D. E. Bidwell, 1972. Brit. J. Exp. Pathology 56 :338-339.31. R. Sohier, R.J. Freund, G. de-Thé, N.E. Day, A. Geser and G. Denhaut. 1973.

Seroepidemiology of Herpesvirus Type Epstein-Barr in Blood Donors from Communitiesaround Lyon. American Journal of Epidemiology. Vol. 99, No.6, pp 414-424.

19

12-LITTERATURLISTE1. Se den engelsk version.

TRINITY BIOTECH, Jamestown - NY 14702-1059 - USA

TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow - IRELAND

Distributed by: Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 07/2008