Prática de Enzimas

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DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA EM DETERGENTES EM

PÓ - UMA AULA PRÁTICA DE ENZIMOLOGIA

(The proteolitic activity in usual powder detergents — a practical class of

enzymology) AUTORES - Maria Teresa Pedrosa Silva Clerici1, Armindo Antonio Alves2, Roberval Serafim da Silva3

AFILIAÇÃO - 1 Pós- doutoranda do DTA-FEA-Unicamp-Campinas- SP 2 - Professor de Bioquímica da UNIARARAS - Araras - SP. 3 - Técnico especializado - PUC-Campinas -SP.

Endereço para correspondência : [email protected] Abstract

The goal of this work is to present a practical class that assesses the protease activity

using usual powder detergent as an enzymatic matrix. This practical class allow the

discussion of basic concepts in enzymology like enzyme activity, specific substrate,

substract, suitable temperature and pH for the maximal enzyme activity. It is possible, also

to argue about the advantages of using enzymes in usual products and how to prevent their

undesired effects.

Resumo

O objetivo deste trabalho é propor um roteiro de aula prática de enzimologia para

medir a atividade proteolítica usando como matriz enzimática detergente em pó de uso

comum. Este roteiro permite a discussão sobre noções básicas de enzimologia como

atividade enzimática, substrato específico e temperatura e pH adequados para a atividade

ótima. Cabe ainda discutir as vantagens de se utilizar enzimas em produtos industrializados

de uso comum e também os cuidadso necessários para se previnirem seus efeitos

indesejáveis.

Introdução

Neste trabalho , propomos um roteiro de aula prática para medir a atividade das

enzimas proteolíticas presentes em detergente em pó de uso comum, usando caseína como

substrato. Utilizamos esta aula na disciplina de Biotecnologia nos cursos das Instituições

onde trabalhamos. Este roteiro também pode ser utilizado em disciplinas de Bioquímica

Básica e outras disciplinas afins, porque para conceitos básicos de enzimologia como

atividade enzimática, substrato específico, temperatura e pH adequados para se atingia a

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atividade ótima. Serve ainda para discutir o uso de enzimas em produtos industrializados de

uso comum, o encapsulamento de enzimas e ainda os cuidados necessários para se

minimizar os efeitos adversos de seu uso indevido, como a dermatite de contacto.

Fundamentação Teórica

Os principais tipos de enzimas utilizadas na indústria de detergentes incluem: a)

amilases, degradam amido e outros carboidratos; b) proteases, degradam ligações

peptídicas; c) lipases, degradam lipídeos; d) celulases, degradam celulose (1). Os sabões em

pó em sua maioria são adicionados de enzimas que vão degradar a matéria orgânica, de

acordo com sua afinidade pelo substrato, presente nas manchas das roupas.

Os detergentes modernos apresentam um espectro de ação e de utilização bastante

amplo, havendo, conseqüentemente, necessidade de especialização das formulações. A

principal vantagem da formulação de detergentes que contenha enzimas é a substituição de

produtos cáusticos, ácidos e solventes tóxicos, que agridem o meio ambiente e que

provocam o desgaste de materiais e de instrumentos. O uso diversificado das enzimas deve-

se à sua característica de atuar como biocatalisadores especializados. As enzimas

adicionadas às formulações de detergentes de uso hospitalar, doméstico e industrial agem

digerindo e dissolvendo resíduos orgânicos (sangue, fezes, urina, vômitos, manchas

diversas), higienizando as partes externas e internas de instrumentos cirúrgicos,

desobstruindo canais com resíduos e coagulados, eliminando resíduos fecais dos canais e

superfícies dos fibroscópios e removendo contaminantes da rouparia hospitalar (2).

Ao analisar rótulos das caixas de sabão em pó foi verificado que existe uma

ausência de informações necessárias para o uso de enzimas pelo consumidor , que são:

a) a maioria das caixas só traz a informação: contém enzimas, sem descrever

quais enzimas contem e com qual atividade

b) o rótulo não informa as condições necessárias para manipulação do sabão em

pó, pois deve-se fazer uso de luvas, para evitar dermatites de contato

c) o fato de lavar a roupa diretamente na máquina, sem deixar o tempo de

molho, pode levar a desnaturação da enzima e, portanto, sem ação da enzima na mancha.

d) Como muitas máquinas de lavar possuem temperaturas que variam da

temperatura ambiente até 90°.C, a temperatura ótima de atividade enzimática deve ser

recomendada.



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e) Faz-se necessário esclarecer como deve ser feito o tratamento de uma

dermatite provocada por ação das enzimas presentes no sabão, ou seja quais os recursos

necessários para paralizar a atividade das enzimas durante contato com olhos, mucosas etc.

f) Uma roupa lavada manualmente pode provocar dermatites na pessoa que

lava a roupa e caso esta roupa não seja passada a ferro (para desnaturar enzimas residuais)

pode provocar reações alérgicas no usuário da roupa, fato que se agrava quando o usuário

for um bebê ou criança, um paciente acamado etc.

g) O processo de enxague da roupa deve garantir que toda a enzima foi

desnaturada, pois o habito de passar a roupa vem sendo abandonado a medida que se

aumenta o uso de tecidos sintéticos.

Portanto sabões em pó contendo enzimas, não devem ser usados para lavagem

manual de roupas, fato comum em países subdesenvolvidos, onde ainda existe as profissões

de empregada doméstica e da lavadeira, e nem sempre existe a máquina de lavar roupa.

As proteases utilizadas em sabões em pó, toleram pH entre 9 e 13, são

termoestáveis e são normalmente serina-proteases secretadas por Bacillus subtilis e Bacillus

licheniformis (3).

As proteases hidrolizam proteínas em peptídeos e aminoácidos solúveis, desta forma

é possível evitar a mancha da roupa devido a desnaturação e oxidação de proteínas

firmemente aderidas ao tecido.

No trabalho realizado por Mitidieri et al (4) analisado a atividade enzimática em

sabão em pó: as enzimas amilases, proteases e lipases foram avaliadas e houve uma grande

variação de atividade enzimática em marcas distintas de sabão em pó, mostrando a ausência

de regulamentação.

Objetivo da aula

Visando mostrar a atividade da protease em sabões em pó numa aula prática, foi

feita uma adaptação do método descrito por Mitidieri et al (2).

Materiais

a) Reagentes

• caseína 2% (m/v)

• tampão tris-HCL, pH 8,0



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• 0,8 mL de ácido tricloroacético 20% • solução de detergente a 2% • fita indicadora de pH

b) Vidrarias

• pipetas de 1, 2 e 10mL graduadas • tubos de ensaios de 10mL • banho-maria a 50°.C • centrífuga • espectrofotômetro a 400nm • banho de gelo para resfriamento

Métodos:

a) Preparar os tubos de ensaios conforme o esquema descrito na Tabela 1.

b) Resfriar em banho de gelo até precipitar toda caseína.

c) Centrifugar a 2500rpm, 5min

d) Fazer a leitura em espectrofotômetro a 400nm, utilizando-se do tubo 1 como

branco

Tabela 1: Esquema do experimento para determinar atividade proteolítica do sabão em pó Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Sol. detergente 1ml 1mL 1mL 1mL 1mL Tampão Tris 1mL 2mL 2mL 2mL 2mL Sol. caseína 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL Incubação (50°.C) O min 5min 15min 30min 45min Sol. De TCA 8mL 8mL 8mL 8mL 8mL

Sugestão para apresntação de resultados e discussão

a) Elaborar uma tabela com os resultados obtidos, conforme modelo descrito na

tabela 2.

Tabela 2. Avaliação da atividade da protease em função da absorbância e do tempo de contato com o substrato protéico.

Tempo (minutos) Absorbância (400nm) 0 5 15 30 45



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b) Fazer um gráfico de tempo x absorbância.

c) Discutir a eficácia do uso da protease em sabões em pó.

Sugestões para relatório e novas aulas práticas

Cada grupo de alunos pode realizar as análises com amostras diferentes de

detergentes em pó podendo ser feito um estudo comparativo.

Avaliar o rótulo do sabão em pó analisado, utilizando os conhecimentos de

enzimologia e propor modificações no rótulo.

Conclusão

Devemos enfatizar que esta aula prática deve levar o aluno a entender o papel das

enzimas proteases no processo de lavagem de roupas, que para ter seu efeito ótimo precisa

de temperatura e pH adequados. Pode-se ainda discutir o encapsulamento das enzimas que

permite a manutenção da atividade enzimática mesmo quando o produto é armazenado em

condições que inviabilizariam as enzimas isoladas.

Referências bibliográficas

1. BON, E.P.S. A tecnologia enzimática no Brasil. ENZITEC 95, Vol. 1: 9-14,1995.

2. GODFREY, T. Industrial Enzimology. Stockton Press, New York. 1996, 609 p. 3. WISEMAN, A. Manual de Biotecnología de los Enzimas. Ed. Acribia. Zaragoza.

1985,444p.

4. MITIDIERI, S.; MARTINELLI, A. H. S., CAMASSOLA, S.; MENGUER, P. K.;

SCBRANCK, A. & VAINSTEIN, M. H. Detergentes biológicos biodegradáveis: avaliação

das formulações do mercado. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26-p. 56-60,

maio/junho, 2002.



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