AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE

PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS

INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS

ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza

CO-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior

Universidade Federal Fluminense

Niterói

2009

AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE

PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS

INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS

ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza

C0-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior

Universidade Federal Fluminense Niterói 2009

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Clínica Odontológica.

A553 Andrade, Aurimar Oliveira

Prevalência de Enterococcus sp nas infecções endodônticas primárias. / Aurimar de Oliveira

Andrade; orientadora: Profª. Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza, co-orientador: Profº. Dr. Raphael Hirata Júnior – Niterói: [s.n.], 2009.

78 f.

Inclui tabelas e figuras Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2009. Bibliografia: f. 67-75

1. Enterococos, 2. Endodontia, 3. Microbiologia. I. Scelza, Miriam Fátima Zaccaro [orien.] II. Hirata Júnior, Raphael [co-orien.] III. TÍTULO

CDD 617.6342

AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE

PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS

INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS

ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza

CO-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior

Aprovado em 20 de agosto de 2009

BANCA EXAMINADORA

____________________________________

Profa. Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza Universidade Federal Fluminense – UFF

___________________________________ Prof. Dr. Raphael Hirata Júnior

Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERJ

___________________________________ Profa. Dra. Apoena de Aguiar Ribeiro

Universidade Federal Fluminense–UFF / Nova Friburgo

Niterói 2009

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Clínica Odontológica.

Saudade, carinho e gratidão. Dedico este

trabalho a Otávio de Carvalho Andrade,

Júlia de Oliveira Andrade (meus pais),

Amaury de Oliveira Andrade e Jair de

Oliveira Andrade (meus irmãos) – in

memoriam

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e presença em todos os momentos.

Aos Professores Miriam Fátima Zaccaro Scelza e Raphael Hirata Júnior pela

excelente orientação, incentivo, dedicação e contribuição para minha formação.

À Coordenação do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade Federal

Fluminense na pessoa do Prof. Ricardo Carvalhaes Fraga.

A todos os Professores do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade

Federal Fluminense por todas as informações transmitidas.

Aos Professores da Disciplina de Endodontia da FO-UFF por terem me recebido

de forma acolhedora no período do Estágio de Docência.

À Professora Shirley de Souza Pinto pelo auxílio importantíssimo na fase de

coleta de material junto à Clínica de Endodontia da FO-UFF.

Aos colegas de turma de Mestrado pelo convívio harmônico.

Aos Professores Raphael Hirata Júnior e Ana Luíza de Mattos Guaraldi da

Disciplina de Microbiologia e Imunologia da FCM-UERJ pela generosidade em

disponibilizar as facilidades do laboratório 3 para a realização da parte

experimental desta dissertação.

Aos colegas do laboratório 3 e funcionários da Disciplina de Microbiologia e

Imunologia da FCM-UERJ pela dedicação, amizade e companheirismo.

Aos familiares e amigos que me apoiaram e incentivaram : Amaro Viana,

Andréa Andrade, Camila Fontes, Carlos Rodrigues, Cláudia Andrade,

Conceição Cova, Diva Mello, Francis Martins, José Cunha, Laís Souza, Luciano

Lemos, Marlene Andrade, Onildo Lemos e Onilene Lemos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro tão importante para o desenvolvimento deste projeto.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS RESUMO 11 ABSTRACT 12 1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 16 3. OBJETIVOS 37 4. MATERIAL E MÉTODOS 38 4.1. MATERIAL 38 4.1.1 MEIOS SELETIVOS 38 4.1.2 MEIOS DE CULTIVO 38 4.1.3 REAGENTES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA 38 4.1.4 GALERIA DE IDENTIFICAÇÃO MINIATURIZADA 39 4.1.5 OUTROS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS 39

4.2. MÉTODOS

4.2.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES, COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL CLÍNICO 40 4.2.2 CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DAS AMOSTRAS BACTERIANAS 41

4.2.3 IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA 43

5. RESULTADOS 47

6. DISCUSSÃO 59

7. CONCLUSÕES 71

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Sistema miniaturizado API 20 Strep

Figura 2. Capela de fluxo laminar. No interior da câmara todo ar circulante é

estéril

Tabela 1. Percentual de isolamento de Enterococcus sp em pacientes

portadores de dentes com canais com necrose pulpar por

gênero/dente

Tabela 2. Percentual de isolamento de Enterococcus sp. em pacientes

portadores de dentes com canais com necrose pulpar por

gênero/espécie

Tabela 3. Pacientes com culturas positivas relacionados à sintomatologia

dolorosa

Tabela 4. Percentual de dentes com culturas positivas relacionados aos

aspectos radiográficos / gênero

Tabela 5. Número de pacientes com culturas positivas que apresentaram

secreção purulenta, presença de odor, edema e fístula no

momento da coleta

Tabela 6. Dentes com cultura positiva relacionados a grupo de dentes e

gênero

Tabela 7. Espécies microbianas (isolados) relacionadas ao paciente, número

do dente por ordem de coleta e meio seletivo utilizado

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

EBM Eosina e Azul de Metileno EDTA Ácido Etilenodiamino Tetracético Dissódico EMAs Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos DNA Ácido desoxirribonucleico HIB Caldo Infuso de coração MTAD Composto de diferentes agentes microbianos NaCl Cloreto de sódio NaOCl Hipoclorito de sódio NNISS National Nosocomial Infections Surveillance System P Paciente PCR Reação em cadeia da polimerase TSA Ágar Soja Tripticaseína VRE Enterococo resistente à vancomicina

13

RESUMO

Os enterococos fazem parte da microbiota normal dos seres humanos, especialmente trato gastrintestinal, cavidade oral e trato geniturinário. A temperatura ótima de crescimento é de 35ºC, porém, a maioria das amostras tolera temperaturas que variam de 10ºC a 45ºC. Dentre as espécies atualmente descritas, Enterococcus faecalis representa de 80% a 90% dos isolamentos oriundos de material clínico humano. O objetivo deste estudo foi isolar, identificar e caracterizar fisiologicamnete Enterococcus sp de canais radiculares portadores de necrose pulpar. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antonio Pedro/Universidade Federal Fluminense sob o número 025/06 envolvendo um total de 70 pacientes. Foram isoladas 35 amostras de Enterococcus sp em 50% dos pacientes (n=35) com a seguinte incidência : 33 amostras de Enterococcus faecalis (94,28%), 1 amostra de Enterococcus faecium (2,85%) e 1 amostra de Enterococcus durans (2,85%). Dezesseis amostras foram isoladas de 27 pacientes do sexo masculino (59,25%) e 19 de 43 pacientes do sexo feminino (44,18%). Dos 35 pacientes com cultura positiva , 20 apresentaram sintomatologia dolorosa. Odor fétido e secreção purulenta foram observados em 3 dentes com cultura positiva (8,57%). Dos 35 pacientes com cultura positiva, 4 apresentaram edema no momento da coleta e apenas 1 paciente apresentou fístula. A espécie E. faecalis foi majoritária dentre os isolados, estando relacionada a sinais e sintomas.

14

ABSTRACT

Enterococci are members of normal human microbiota, particularly from gastrointestinal, oral cavity and, genitourinary tracts. Microorganisms are gram-positive, facultative anaerobic cocci. The optimum growth temperature is 35ºC. However, most samples may flourish in temperatures that vary from 10ºC to 45ºC. Among the current described species, Enterococcus faecalis represents 80% to 90% of isolations derived from human clinical material, and may be isolated from 60 to 70% endodontic infections refractory to treatment. The aim of this study was to isolate, identify and physiologically characterize Enterococcus sp from necrotic endodontic infections.The experimental protocol was approved by the Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antonio Pedro/Universidade Federal Fluminense under registration 025/06, and involved a total of 70 patients. Thirty-five Enterococcus sp strains were isolated in 50% of the patients (n=35), according to the following incidence: 33 samples of Enterococcus faecalis (94,28%), 1 sample of Enterococcus faecium (2,85%) and 1 sample of Enterococcus durans (2,85%). Sixteen strains were isolated from 27 male patients (59.25%), and 19 from 43 female patients (44.18%). From 35 individuals whose enterococci were isolated, 20 reported painful symptoms. Fetid odor and purulent discharge were observed for three teeth which enterococci were isolated (8.57%). With respect to the presence of edema, 4 patients carried enterococci at the moment of material collection, and one patient (2.85%) presented fistulae drainage at the moment of collection for culture of microorganisms. The E. faecalis was the major species isolated from root canal infections presenting signals and symptoms.

15

1. INTRODUÇÃO

Os microrganismos do gênero Enterococcus são cocos Gram-positivos, se

apresentam isoladamente, aos pares ou em cadeias curtas. As células podem ser

cocobacilares, principalmente quando a coloração de Gram é realizada a partir de

colônias crescidas em meio sólido. São microrganismos fastidiosos, com necessidades

nutricionais variáveis e o crescimento requer meios complexos, contendo soro ou

sangue. Apesar de crescerem na presença de oxigênio, são incapazes de sintetizar o

composto heme e por isto não possuem metabolismo respiratório, sendo anaeróbios

facultativos. A temperatura ótima de crescimento é de 35ºC, porém, a maioria das

amostras tolera temperaturas que variam de 10ºC a 45ºC (FACKLAM, SAHM &

TEIXEIRA, 1999).

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres

humanos fazem parte da microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato

geniturinário. Estes microrganismos toleram temperaturas equivalentes a 60ºC por até

30 minutos e são capazes de crescer em meios contendo cloreto de sódio a 6,5%.

Adicionalmente, a capacidade de hidrolisar a esculina em presença de bile e produzir

leucina-aminopeptidase (LAPase) e pyrolidonylarylamidase (PYRase), são

características importantes do gênero. Apesar de não possuírem a enzima citocromo, o

teste da catalase pode ser positivo. Isto se deve à produção de uma pseudocatalase

que caracteriza uma ligeira liberação de oxigênio quando a colônia é colocada em

16

contato com o peróxido de hidrogênio. Nas últimas décadas se tornaram importantes

agentes etiológicos das infecções hospitalares, principalmente em hospedeiros

imunocomprometidos e de superinfecções em pacientes tratados com agentes

antimicrobianos de amplo espectro (MURRAY, 1990; TEIXEIRA & FACKLAM, 2003).

Quando colonizam os canais radiculares E. faecalis são capazes de sobreviver,

utilizando-se provavelmente dos substratos oriundos dos fluidos dos tecidos

conjuntivos subjacentes (osso alveolar e ligamento periodontal). Dentre os fatores de

virulência destacam-se as enzimas líticas, citolisinas, substâncias de agregação,

feromônios e ácido lipoteicoico. E. faecalis pode interferir com a ativação dos linfócitos

e outros grupos celulares, contribuindo para o fracasso endodôntico (LEE; LIM & SON,

2004). Além da sua habilidade para invadir e permanecer no interior dos túbulos

dentinários apresenta elevada resistência aos curativos de demora utilizados entre

sessões, inclusive aqueles à base de hidróxido de cálcio. Foi descrito que as cepas de

E. faecalis possuem uma bomba de prótons capaz de proteger o citoplasma bacteriano

do elevado pH conferido pelos produtos contendo hidróxido de cálcio. A espécie

também é capaz de formar biofilmes onde as células bacterianas formam estruturas

multicelulares coesas de difícil remoção pelo sistema imunológico, além de dificultar a

atividade dos agentes antimicrobianos. Tais propriedades conferem aos E. faecalis

grande poder agressivo aos tecidos perirradiculares e maior resistência ao controle das

infecções endodônticas (MC HUGH, ZANG & MICHALEK, 2004).

Para o controle das infecções dos sistemas de canais radiculares onde os E.

faecalis fazem parte da microbiota, é necessário a máxima vigilância em relação às

17

fases da terapia endodôntica. Todas as fases devem ser executadas em um mesmo

plano de igualdade quanto à importância por serem consideradas fundamentais, a

negligência de qualquer uma dessas fases poderá influenciar no resultado final

(LEONARDO, 1973). Procedimentos de assepsia, incluindo a desinfecção do dique de

borracha com clorexidina ou hipoclorito de sódio e a desinfecção dos cones de guta-

percha com hipoclorito de sódio antes da inserção no canal radicular, são medidas

preventivas recomendadas (SENIA et al., 1975). Devido à sua alta incidência como

patógeno envolvido nas infecções endodônticas refratárias ao tratamento, a presença

dos enterococos nos canais radiculares e os fatores de virulência deste grupo

microbiano os torna alvo importante de investigações na área da endodontia.

18

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Infecções sistêmicas causadas por Enterococcus sp

Os enterococos foram primeiramente reconhecidos como potenciais patógenos

humanos em 1899 quando THIERCELIN (apud SHERMAN,1937) relatou a presença

desses microrganismos em quadros de endocardite, apendicite e meningite.

Posteriormente, foi observada a participação dos enterococos em outras infecções tais

como sepse puerperal e infecções intra-abdominais. Na Primeira Grande Guerra

Mundial foram notificados relatos sobre infecções enterocócicas em ferimentos

(MOELLERING, 1992; FRANZ, HOLZAPPEL & STILES, 1999).

Nos dias atuais sabe-se que os enterococos podem causar uma variedade de

infecções monomicrobianas e polimicrobianas, principalmente em pacientes em estado

clínico grave. Dentre esses quadros infecciosos incluem predominantemente infecções

do trato urinário, bacteremias, endocardites, infecções intra-abdominais, do trato biliar e

de feridas (incluindo operatórias), as úlceras de decúbito e do pé diabético. Em menor

freqüência, os enterococos causam infecções dos sistemas nervoso central e

respiratório, em tecidos moles, do conduto auditivo, da conjuntiva e região periodontal

19

(JOHNSON, 1994; MUNDY, SAHM & GILMORE, 2000; TENG et al., 2002;

ARCHIMBAUD et al., 2002).

De acordo com o estudo realizado pelo NNISS (National Nosocomial Infections

Surveillance System, 1997), os enterococos são a quarta principal causa de infecções

nosocomiais. Doze espécies deste gênero bacteriano já foram identificadas a partir de

infecções humanas. A maioria das amostras clínicas pertence à espécie E. faecalis

(80% a 90%) seguida de E. faecium (5% a 10%). As demais espécies são identificadas

com menor freqüência, apesar de relatos de surtos causados por E. raffinosus e E.

casseliflavus (CHIRURGI et al., 1991; NAUSCHUETZ et al., 1993). As espécies E.

avium, E. cecorum, E. gallinarum, E. díspar, E. gilvus, E. mundtii, E. durans, E. hirae, E.

pallens e variantes de E. faecalis, embora raramente, já foram identificadas em

infecções humanas, associadas normalmente a surtos específicos. Algumas espécies

ainda não foram isoladas de humanos tais como E. columbae, E. malodoratus, E.

porcinus, E. ratti, E. pseudoavium, E. saccharolyticus e E. sulfureus (TEIXEIRA &

FACKLAM, 2003).

Apesar da ampla variedade de infecções causadas por enterococos, os fatores

que determinam a patogenicidade dos membros deste gênero não são bem

conhecidos. Alguns atributos de virulência têm sido identificados, porém, não há

evidências definitivas de que seus mecanismos contribuam para a patogênese das

infecções humanas (JETT, HUYCKE & GILMORE, 1994).

20

A bacteremia é uma das apresentações clínicas mais comuns. Nesses casos, a

origem pode ser um foco infeccioso presente em qualquer sítio anatômico ou

colonização. Aparentemente, o trato urinário é a origem mais comum, o trato

hepatobiliar e as infecções intra-abdominais são outros sítios importantes. Em

bacteremias secundárias de pacientes com infecções pós-operatórias, amostras de

enterococos já foram apontadas como principal causa, assim como infecções

enterocócicas em tecidos moles constituem uma outra fonte para o desenvolvimento de

bacteremia (SHAES, LEVY & WOLINSKY, 1981; WHITESIDE, MOORE & RATZAN,

1983; MAKI & AGGER, 1988; CHENOWETH & SCHABERG, 1990). Em algumas

situações não são detectados sítios infectados que possam ser apontados como a

origem óbvia para bacteremia e nesses casos, os acessos intravasculares podem estar

implicados (GRANINGER & RAGETTE, 1992; JARVIS & MARTONE, 1992). Os fatores

de risco associados com as bacteremias enterocócicas incluem doença de base,

presença de cateter uretral ou intravascular, queimaduras, traumas múltiplos e

profilaxia e/ou terapia antimicrobiana prévia (LEWIS & ZERVOS, 1990; MONDINO et

al., 2003).

Os enterococos causam de 5% a 15% das endocardites bacterianas, podendo

levar à mortalidade cerca de 30% dos casos (MEGRAM, 1992; BADDOUR, 1994;

BERTI, 1997). Embora as endocardites enterocócicas estejam associadas a infecções

extra-hospitalares (comunitárias), também acometem pacientes hospitalizados (MAKI &

AGGER, 1988). A fonte de aquisição não é conhecida, porém, em alguns casos as

infecções do trato geniturinário constituem o foco infeccioso primário. Assim, a

endocardite muitas vezes ocorre em pacientes que tenham sofrido anteriormente

21

procedimentos invasivos, infecções no trato urinário ou aborto (CHENOWETH &

SCHABERG, 1990; LEWIS & ZERVOS, 1990; MOELLERING, 1992, BEM AMI et al.,

2004).

As infecções enterocócicas do sistema nervoso central são raras e podem ser

decorrentes de complicações cirúrgicas em geral ou de procedimentos neurológicos,

como a implantação de dispositivos de drenagem de líquor (CHENOWETH &

SCHABERG, 1990). Casos de meningite em pacientes imunocomprometidos também

já foram relatados (PATTON et al., 1991; MOELLERING, 1992; CALLEGAN et al.,

1999).

A resistência aos antimicrobianos é conceitualmente dividida em intrínseca e

adquirida. O termo resistência intrínseca é utilizado para designar os fenótipos de

resistência que são propriedades inerentes de determinada espécie bacteriana, isto é,

praticamente todas as amostras da espécie apresentam tal característica. Genes

codificadores de mecanismos de resistência intrínseca devem se localizar no

cromossomo. Os mecanismos de resistência adquirida são aqueles decorrentes de

uma mutação do DNA cromossômico bacteriano ou da aquisição de nova molécula de

DNA, como plasmídeos e/ou transposons (MURRAY, 1990).

Uma característica importante dos enterococos é a presença de resistência

intrínseca a vários antimicrobianos habitualmente utilizados no tratamento de infecções

por bactérias Gram-positivas. Os vários perfis de resistência intrínseca exibidos pelos

enterococos incluem resistência aos beta-lactâmicos, ao trimetoprim-sulfametoxazol, a

22

vancomicina, a baixas concentrações de aminoglicosídeos e clindamicina. Mecanismos

adquiridos quando expressos, induzem resistência a níveis elevados de beta-

lactâmicos, aminoglicosídeos, vancomicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina,

clindamicinas e fluoroquinolonas (MURRAY, 1998).

A resistência adquirida aos aminoglicosídeos é decorrente de dois mecanismos

diferentes: alteração do alvo ribossomal e inativação enzimática através da produção

de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos ( EMAs ). O primeiro mecanismo é

conseqüência de mutações cromossômicas enquanto o segundo é mediado por genes

localizados em plasmídeos transferíveis e transposons (ZERVOS et al., 1986).

A vancomicina é um agente antimicrobiano alternativo no tratamento de

infecções enterocócicas e na maioria das vezes é a droga de escolha quando a terapia

sinérgica com beta-lactâmicos e aminoglicosídeos falha (TEIXEIRA & FACKLAM,

2003).

Um número limitado de fatores tem sido relacionado à virulência dos

enterococos, ressaltando-se uma citolisina, uma metaloprotease (gelatinase), um

sistema Quorum Sensing ( fsr ) envolvido na regulação da gelatinase e/ou de uma

serina-protease e uma outra proteína de superfície responsável pela formação de

agregados de células bacterianas durante a transferência genética por conjugação,

conhecida como substância de agregação (GARSIN et al., 2001). A aderência

bacteriana à célula do hospedeiro é considerada como um evento inicial na patogênese

das infecções. Alguns estudos têm demonstrado que amostras de E. faecalis podem

23

aderir in vitro a uma variedade de linhagens de células como as do trato urinário,

intestinal e as cardíacas (GUZMAN et al., 1989; KREFT et al., 1992; CHOW et al.,

1993; SUSMUTH et al., 2000; WELLS et al., 2000; DUPRÈ et al., 2003). Já foi relatado

também que amostras de E. faecalis e de E. faecium mostraram ligações específicas

com proteínas da matriz extracelular tais como trombospondina, lactoferrina e

vitronectina (ZAREBA et al., 1997).

A substância de agregação é um dos fatores mais estudados dentre os que

possivelmente estão envolvidos na aderência de enterococos. Esta proteína é uma

adesina filamentar, cuja expressão é induzida por feromônio, encontra-se inserida na

parede celular e se apresenta em forma de tufos distribuídos irregularmente na

superfície da célula bacteriana (GALLI & WIRTH, 1991; HIRT, SCHLIEVERT &

DUNNY, 2002). A distribuição desta estrutura na célula é dependente da indução e do

tempo de exposição aos denominados feromônios sexuais (BENSING & DUNNY,

1993).

A importância crescente do gênero Enterococcus no cenário das infecções

humanas, principalmente as de origem nosocomial, traduziu o extenso interesse no

estudo da diversidade genética desses microrganismos. A aplicação de técnicas

moleculares tem contribuído significativamente para a definição da distribuição clonal,

tornando possível a demonstração da transmissão destes microrganismos por contato

direto e indireto entre pacientes. O rastreamento da transmissão inter e intra-hospitalar

de amostras de enterococos resistentes e também os multirresistentes a

antimicrobianos tem sido objeto diversos estudos ( PEGUES et al., 1997).

24

Atualmente a análise do DNA cromossômico por enzimas de restrição,

principalmente Smal, através de eletroforese em campo pulsado é considerado o

método “padrão ouro” extensamente referendado para a análise epidemiológica de

infecções enterocócicas independente da espécie estudada (CARVALHO et al., 1997;

CLARK et al., 1993; PEGUES et al., 1997; TOMAYKO & MURRAY, 1995).

2.2 Infecções endodônticas causadas por E. faecalis

A espécie E. faecalis há algum tempo é considerada como contaminante dos

canais radiculares, normalmente por exposição do espaço endodôntico ao ambiente da

cavidade oral. Estudos recentes investigando canais radiculares por coleta e métodos

de cultivo vem encontrando uma baixa prevalência de E. faecalis nas infecções

endodônticas primárias (GOMES et al., 2006 ; SEDGLEY et al., 2006).

A identificação de Enterococcus sp nos canais radiculares de dentes de seres

humanos foi feita pela primeira vez por MEJARE (1975) que isolou e identificou E.

faecalis e E. faecium. FERRARI et al., (2005) identificaram E. faecalis, E. faecium e E.

casseliflavus.

25

Apesar do número pouco relevante nas infecções endodônticas primárias,

SASSONE et al. em estudos de 2006 e 2008, detectaram a espécie E. faecalis em

infecções endodônticas primárias em pecentuais relativos a 89,3% e mais de 75%,

respectivamente. Paralelamente, a incidência de E. faecalis encontrados em lesões

perirradiculares persistentes é muito alta, acredita-se que este microrganismo esteja

relacionado em maior prevalência às infecções secundárias ou em casos de

contaminação durante o preparo químico-cirúrgico. Normalmente estão albergados em

áreas do canal inacessíveis aos procedimentos de desinfecção endodôntica,

mantendo-se viáveis por serem resistentes aos efeitos dos agentes químicos

empregados ou através da inativação dos mesmos em função das condições

ambientais na região do canal onde os mesmos estão alojados (LOPES & SIQUEIRA,

2004). Alguns autores vêm demonstrando o isolamento de E. faecalis como a espécie

mais comumente isolada dos canais radiculares quando do fracasso da terapia

endodôntica (MEJARE, 1975; SUNDQVIST, 1998; DAHLEN et al., 2000).

Adicionalmente, alguns autores em trabalhos utilizando métodos de cultivo

conseguiram isolar E. faecalis em diversos percentuais, a seguir : MÖLLER em 1966

(29%), MOLANDER et al., em 1998 (32%) e PECIULIENE et al., em 2000 (70%).

Outros estudos utilizaram técnicas moleculares (PCR) e altas prevalências foram

observadas : ROÇAS et al., em 2004 (33%), SIQUEIRA & ROÇAS em 2004 (77%) e

ZOLETTI et al., em 2006 (81,5%).

O controle microbiano do canal radicular é delegado à sanificação proporcionada

pela fase do preparo químico-cirúrgico. Apesar de expressiva redução de

microrganismos ser observada após a conclusão da desinfecção, alguns

26

microrganismos localizados no interior dos túbulos dentinários podem não ser

eliminados apenas com a instrumentação e irrigação (PEREZ et al.,1993). Levando-se

em consideração a complexa anatomia dos canais radiculares, a grande resistência

frente aos agentes antimicrobianos (inclusive ao efeito antimicrobiano do hidróxido de

cálcio), sua eliminação constitui um sério problema para a terapia endodôntica

(HAAPASALO, 1987; BYSTRÖM, 1985), sendo considerado um dos poucos

microrganismos facultativos associados com a periodontite apical persistente

(HAAPASALO, 1983).

Estudo realizado por EVANS et al. (2002) para apontar o pH exato em que o E.

faecalis seria eliminado em contato com o hidróxido de cálcio, observaram que este é

resistente a um pH de 11,1 e seriam eliminados a uma exposição equivalente a um pH

a partir de 11,5. A resistência dos E. faecalis foi relacionada a uma relativa força

exercida para sintetizar proteínas, por indução. Como forma de eliminação total de E.

faecalis, eles sugerem a utilização de hipoclorito de sódio como coadjuvante na inibição

da bomba de prótons do microrganismo.

Investigações têm mostrado que as infecções endodônticas persistentes são

frequentemente causadas por E. faecalis que são altamente resistentes às medicações

utilizadas durante a terapia e é dos poucos microrganismos resistentes aos efeitos

antimicrobianos do hidróxido de cálcio. DISTEL et al. (2002), apresentaram evidências

da colonização e formação do biofilme em canais radiculares de dentes humanos. É

provável que a formação de biofilme explique a habilidade dos E. faecalis em persistir

no meio pois comparadas com células flutuantes, os microrganismos agregados em

27

biofilmes são mais de 100 vezes mais resistentes à fagocitose, anticorpos e muitos

antibióticos.

Foram isolados E. faecalis de pacientes com endocardite bacteriana e os

mesmos associados à formação de biofilmes em outros sítios. Isto talvez seja atribuído

à virulência específica da produção de gelatinase e presença determinante da

aderência. Este e outros fatores de virulência foram também identificados em E.

faecalis isolados clinicamente de canais radiculares e da cavidade oral (MOHAMED et

al., 2001; SEDGLEY et al., 2006). Contudo, não existem informações da capacidade de

formações de biofilmes de E. faecalis isolados clinicamente de canais radiculares e

cavidade oral comparados à colônias de outras infecções humanas (SPRATT et al.,

2001).

Os fatores de virulência dos E. faecalis promovem sua adaptação e

sobrevivência em diferentes sítios. Substância de agregação, secreção de toxinas e

proteases são alguns desses fatores. Essa espécie microbiana também é capaz de

produzir gelatinase. A gelatinase hidroliza a gelatina, colágeno e outros peptídeos. Foi

descrito que a gelatinase é produzida por 70% de colônias de Enterococcus faecalis

isoladas de canais radiculares (SEDGLEY et al., 2005).

2.3 Controle das infecções endodônticas causadas por E. faecalis

28

Durante a terapia endodôntica, os procedimentos empregados visam a

eliminação ou prevenção da infecção causada por quaisquer patógenos capazes de

persistir no interior dos canais radiculares, incluindo E. faecalis e em virtude da

infecção por esta espécie apresentar tendência a ocorrer durante a terapia

endodôntica, entre consultas. A incapacidade de adaptação dos instrumentos

endodônticos às paredes do canal em função das variações anatômicas é outro fator

que impede o sucesso da desinfecção. São istmos, reentrâncias e ramificações dos

sistemas de canais radiculares muitas vezes não afetados durante a instrumentação,

podendo permitir a sobrevivência dos E. faecalis (WALTON, 1976). Durante o preparo

químico-cirúrgico, instrumentos endodônticos promovem a remoção mecânica de

microrganismos, seus produtos e tecidos degenerados. Quando auxiliados por uma

substância química, além de maximizar a remoção de detritos através da ação

mecânica do fluxo e refluxo, também pode exercer um efeito químico significativo

desde que possua ação antimicrobiana e solvente de matéria orgânica (LOPES &

SIQUEIRA, 1999). Mesmo quando não se emprega uma substância dotada de

atividade antimicrobiana, a ação dos instrumentos endodônticos e da irrigação são

suficientes para a eliminação de quantidade substancial de microrganismos e tecido

degenerado do interior do sistema de canais radiculares. Entretanto, a eliminação total

de microrganismos não é observada na maioria dos casos (SIQUEIRA et al., 1999).

2.3.1 Substâncias químicas auxiliares

29

As substâncias químicas auxiliares utilizadas durante a terapia endodôntica

atuam através de pulsos de irrigação-aspiração de curta duração. Os agentes químicos

e os veículos precisam apresentar eficácia e eficiência que dependem das

propriedades físicas e químicas. Atualmente, o hipoclorito de sódio é a substância mais

utilizada e mais aceita na Endodontia. VAHDATY, PITT FORD & WILSON (1993) em

estudo in vitro em dentes bovinos, concluíram que a clorexidina (0,2% e 2%) foram

igualmente eficazes como agentes antimicrobianos quando testados em concentrações

similares sobre culturas de E. faecalis. COHEN & BURNS (1997) em estudo com o

hipoclorito de sódio, relataram que é a solução irrigadora antimicrobiana mais eficaz,

podendo eliminar todos os microrganismos dos canais radiculares incluindo bactérias e

vírus formadores de esporos. Segundo eles, a utilização do hipoclorito de sódio em

baixa concentração (abaixo de 2,5%), elimina a infecção, mas não dissolve os resíduos

pulpares de maneira consistente. O poder de dissolução do NaOCl é influenciado pela

integridade estrutural dos componentes do tecido conjuntivo pulpar. Se a polpa estiver

decomposta, não demorará muito para que ocorra dissolução dos resíduos de tecido

mole remanescente. Caso a polpa esteja vital e apresentar uma pequena degeneração

estrutural , levará muito tempo para que o NaCl dissolva os resíduos. Finalizando,

frisaram que a frequência da irrigação e o volume da solução utilizados são fatores

importantes na remoção dos resíduos e que a frequência deve aumentar à medida que

se aproxima do ápice. HELING & CHANDLER (1998), compararam a clorexidina e o

hipoclorito de sódio a 0,2% e 2% que foram igualmente efetivos na eliminação de E.

faecalis. Acrescentaram o peróxido de hidrogênio ao estudo e após testarem as três

soluções, notaram um efeito sinérgico quando misturas de clorexidina e peróxido de

hidrogênio foram associadas a uma concentração específica (0,2% e 3%). SIQUEIRA

30

et al., (2000), avaliaram a redução microbiana produzida pela instrumentação e

irrigação com hipoclorito de sódio a 1%, 2,5% e 5,25% ou solução salina, em estudo in

vitro. Os autores não observaram diferença significante entre as três concentrações de

hipoclorito de sódio, visto que todas reduziram o nível microbiano nos canais

radiculares. No entanto, as soluções de hipoclorito de sódio foram bem mais efetivas

que a solução salina. SEGURA et al., (1999) demonstraram que o digluconato de

clorexidina foi menos efetivo que o hipoclorito de sódio a 5,25% pra a inibição da

capacidade do macrófago em se aderir ao substrato. Levando-se em consideração que

a aderência ao substrato é o primeiro grau no processo de fagocitose e apresentação

de antígeno, a clorexidina poderia inibir a função do macrófago e modular a resposta

inflamatória. Concluíram que a utilização da clorexidina a 0,12% ou hipoclorito de sódio

a 5,25% no preparo químico-cirúrgico dos canais, maior radiculares deverá ser feita de

maneira cuidadosa para evitar extravasamentos pois estes podem reduzir a adesão

macrofágica, alterando os mecanismos de reparo e as reações inflamatórias dos

tecidos perirradiculares. Em estudo mais recente, SASSONE et al., (2004) avaliaram in

vitro a atividade antimicrobiana do hipoclorito de sódio – NaOCl (1% e 5%) e da

clorexidina (0,12%, 0,5% e 1%). A solução de clorexidina a 0,12% não foi capaz de

eliminar os E. faecalis em nenhum intervalo de tempo testado, enquanto que as

soluções de clorexidina a 0,5% e 1% eliminaram os microrganismos, assim como as

duas concentrações de hipoclorito de sódio.

É oportuno salientar que a ação dos instrumentos durante a terapia endodôntica

parece ser um dos fatores que contribuem para a formação de uma camada residual

(conhecida como smear layer) que se extende para dentro dos túbulos dentinários,

31

funcionando como um tampão e dificultando a ação dos agentes antimicrobianos

(ARAÚJO et al., 2003). Como a incidência dos E. faecalis em lesões perirradiculares

persistentes é muito alta, parece lógico entender que esta espécie esteja incluída

nessa camada residual. No estudo de SCELZA et al., (2004) foram comparadas três

substâncias: ácido cítrico a 10%, EDTA e EDTA T para a remoção da smear layer das

paredes dentinárias em tempos de 3, 10 e 15 minutos. Os resultados mostraram que

estatisticamente houve diferença significativa quando se utilizou o ácido cítrico por 3

minutos comparando com 5 e 15 minutos. O EDTA a 17% se mostrou mais efetivo

quando utilizado por 3 minutos e o EDTAT não apresentou diferença em relação ao

tempo de utilização da substância. Concluíram que as referidas substâncias foram

efetivas e que essa efetividade não é aumentada pelo aumento do tempo. Com o

intuito de avaliar comparativamente a citotoxidade de irrigantes utilizados no sistema de

canais radiculares, MALHEIROS et al. (2005) testaram as soluções de EDTA a 17% e

ácido cítrico (10, 15 e 25%) em fibroblastos cultivados pois estas substâncias devem

ser compatíveis com os tecidos perirradiculares. A solução de ácido cítrico não

danificou o crescimento dos fibroblastos, confirmando não ser tóxica in vitro.

BYSTRÖM et al., (1985) estudaram a ação antimicrobiana do EDTA e do hipoclorito de

sódio, concluindo que o EDTA produz um efeito reduzido no combate ao E. faecalis,

porém, em combinação com o hipoclorito de sódio a 5%, apresentou atividade

antimicrobiana mais eficaz do que quando se utilizou apenas o hipoclorito de sódio.

VASSILIADIS et al., (1994) avaliaram por meio da microscopia eletrônica a penetração

do cimento de Grossman em túbulos dentinários. Houve a penetração do cimento nos

túbulos dentinários mesmo sem a remoção da smear layer. Diferentes profundidades

32

de penetração foram observadas provavelmente devido a diferenças na manipulação,

na consistência do cimento e na força empregada na condensação lateral.

Apesar do hipoclorito de sódio ser a substância mais utilizada e aceita na

Endodontia, investigações resultam em novas substâncias, como é o caso do MTAD,

composto de diferentes agentes antimicrobianos (um quelante, tetraciclina e

detergentes). Em estudos preliminares, o MTAD obteve sucesso na eliminação do E.

faecalis (TORABINEJAD et al., 2003). Se faz necessário lembrar que Enterococcus sp

costumam adquirir resistência a diversos agentes antimicrobianos e o ideal é que haja

um acompanhamento e monitoramento dessa resistência.

2.3.2 Medicação Intracanal

A finalidade principal da medicação intracanal é a eliminação de microrganismos

que sobreviveram aos efeitos do preparo químico-cirúrgico. O medicamento deve

permanecer ativo durante todo o período entre consultas, evitando a reinfecção e

reduzindo o risco de proliferação de microrganismos residuais, existe suporte científico

de que é essencial em determinadas situações clínicas. Em cerca de 40% a 70% dos

casos, microrganismos sobrevivem aos efeitos do preparo químico-cirúrgico, muitos

destes estão destinados a serem eliminados pela exposição a um material obturador

dotado de atividade antimicrobiana ou confinados no interior do canal radicular, ficando

desprovidos de nutrientes. Apesar disso, microrganismos podem sobreviver mesmo a

despeito de uma obturação adequada do canal radicular, obtendo nutrientes e

33

sobrevivendo em número suficiente para perpetuar uma lesão perirradicular

(BYSTRÖM et al., 1981).

Os E. faecalis são altamente resistentes às medicações utilizadas durante a

terapia endodôntica, sendo um dos poucos microrganismos resistentes ao hidróxido de

cálcio. TRONSTAD et al. (1981) utilizaram o hidróxido de cálcio como curativo

intracanal por quatro semanas e observaram que o pH na dentina medicada com o

hidróxido de cálcio é variável. Na dentina adjacente variou de 8 a 11, na dentina

periférica a variação ocorreu de 7,4 a 9,6 e dentro do canal o pH observado foi de 10 a

12,2. Mesmo com a alcalinização do meio, os níveis de pH são insuficientes para a

eliminação do E. faecalis que sobrevive em pH 11,5.

A invasão dos E. faecalis no interior dos canais radiculares varia em termos de

profundidade e penetração. Essa invasão não é uniforme em todos os túbulos

dentinários (HAAPASALO et al., 2003). Os procedimentos de desinfecção encontrarão

muitas dificuldades na eliminação desses microrganismos quanto maior o nível de

profundidade atingido nos túbulos dentinários. O pH alcalino do hidróxido de cálcio

talvez não seja suficiente para a inibição do crescimento dos E. faecalis nos canais

radiculares, parece promover a adesão do microrganismo ao colágeno e o aumento da

invasão aos túbulos dentinários. Nos dentes com polpa necrosada, os fluidos apicais

têm acesso direto aos tecidos perirradiculares, sendo a albumina um componente

desses fluidos. Em adição, já foi descrito que os E. faecalis estão intimamente

envolvidos com a albumina, proteínas e carboidratos contidos nesta região. Com

34

nutrientes à disposição, não parece ser difícil a sobrevivência das espécies

microbianas (SHORROCK & LAMBERT, 1989).

Apesar da limitação em relação ao pH, o hidróxido de cálcio é o medicamento

mais utilizado na terapia endodôntica. Ao longo dos anos, estudos procuram prover

essa deficiência adicionando substâncias na formulação de pastas denominadas

“pastas de hidróxido de cálcio”. ÖZCELIK, TASMAN & OGAN (2000) compararam a

tensão superficial de diferentes veículos (glicerina, solução anestésica, solução de

Ringer e solução salina) que foram associados ao hidróxido de cálcio para utilização

como medicação intracanal. Os resultados demonstraram uma diferença significativa

entre os veículos isoladamente e associados ao hidróxido de cálcio. Os autores

concluíram que a solução anestésica é o melhor veículo para ser associado ao

hidróxido de cálcio por apresentar menor tensão superficial.

SIQUEIRA et al., (1996) avaliaram a pasta de hidróxido de cálcio com água

destilada para eliminação do E. faecalis e o F. nucleatum. Mesmo após uma semana

de contato, a pasta não foi considerada eficaz. Em contrapartida, a pasta de hidróxido

de cálcio, paramonoclorofenol canforado e glicerina mostrou-se eficaz em realizar tal

intento em apenas um dia de contato. Os autores observaram que quanto maior a

quantidade de paramonoclorofenol canforado adicionado, maior a eficácia

antimicrobiana.

Em estudo in vitro que investigou a desinfecção dos túbulos dentinários

infectados por E. faecalis, TANRIVERDI et al., (1997) acompanharam a ação do

35

hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol e paramonoclorofenol canforado sobre o E.

faecalis. Eles observaram que no prazo de 3 dias, o paramonoclorofenol canforado foi

o agente antimicrobiano mais eficaz, seguido do hidróxido de cálcio. É importante

ressaltar que a exposição do microrganismo ao medicamento teve como tempo

máximo apenas 3 dias.

MENEZES et al. (2004) estudaram a eficiência do hipoclorito de sódio a 2,5%,

da clorexidina a 2% como substâncias químicas auxiliares e também de algumas

medicações utilizadas na Endodontia: hidróxido de cálcio, hidróxido de cálcio com

paramonoclorofenol canforado, paramonoclorofenol canforado, tricresol formalina e

paramonoclorofenol com furacin. Dentre as soluções testadas, a clorexidina foi mais

eficaz que o hipoclorito de sódio na eliminação do E. faecalis. Na avaliação das

medicações, o hidróxido de cálcio adicionado de paramonoclorofenol canforado

utilizado sob forma de pasta demonstrou maior eficácia tanto na eliminação do E.

faecalis quanto na eliminação da Candida albicans.

É importante lembrar que o material selador temporário utilizado entre sessões

na terapia endodôntica é mais um aliado no controle das infecções, pois impede que a

saliva e microrganismos da cavidade oral adentrem ao canal radicular, prevenindo

assim o risco de infecção ou reinfecção e evitando a passagem da medicação contida

no interior do canal radicular para o meio bucal, preservando assim a eficiência do

medicamento (WEINE, 1996).

36

2.3.3 Obturação dos canais radiculares

A obturação dos canais radiculares visa a obliteração tridimensional desde

abertura do canal até o término apical. Este procedimento aliado ao selamento

proporcionado por adequada restauração coronária previne a microinfiltração de

microrganismos, incluindo os E. faecalis (SHIPPER et al., 2004). Microrganismos

residuais que sobreviveram ao preparo químico-cirúrgico constituem em um potencial

para o insucesso endodôntico a longo prazo e uma das funções da obturação é impedir

a migração destes microrganismos para os tecidos perirradiculares (GUTMANN et al.,

1998).

A guta-percha é o material mais empregado atualmente, porém, apresenta

propriedades desfavoráveis como escoamento e adesividade, necessitando portanto da

complementação de um cimento obturador de canais radiculares (MANIGLIA et al.,

1997 ; LEONARDO & LEAL, 1998).

GOLDBERG et al., (1979) em estudo microscópico da estandardização dos

cones de guta-percha e observaram que frequentemente cones de todas as marcas

apresentavam depressões e protuberâncias em suas extremidades, as irregularidades

eram geralmente repetidas em diferentes cones de uma mesma marca e estas

discrepâncias criavam variações de calibre entre os mesmos números de diferentes

marcas. Os autores concluíram que as deformações observadas não permitiam o

ajuste correto do cone principal no canal radicular, dificultando a possibilidade de

37

obtenção de um correto selamento apical, advertiram ainda da necessidade de

fabricação de instrumentos endodônticos e cones de guta-percha em perfeita

correspondência de forma e tamanho.

A utilização dos cimentos obturadores é fator decisivo no êxito da terapia

endodôntica, seu emprego é baseado na grande necessidade de promover

preenchimento da interface cone – parede dentária, objetivando melhorar o selamento

do canal radicular. O cimento deve ser fácil de ser levado ao canal, com tempo de

trabalho satisfatório e uma vez dentro do canal juntamente com os cones de guta-

percha, satisfaça as propriedades físico-químicas desejáveis e necessárias a um

correto selamento e que seja bem tolerado pelos tecidos apicais e perirradiculares

(SIQUEIRA JR & GARCIA FILHO, 1994).

FERREIRA (2001) avaliou a capacidade da pasta L&C e do cimento AH-Plus

em associação a cones de guta-percha empregados na obturação de canais

radiculares para prevenção da infiltração de microrganismos da saliva. Após 67 dias, a

infiltração microbiana ocorreu em 45% das amostras obturadas com a pasta L&C e em

65% das obturadas com AH-Plus. Concluiu que não houve diferença significativa entre

os grupos estudados. Estudo envolvendo a eliminação de E. faecalis, incluiu o

hidróxido de cálcio dentre os cimentos endodônticos e a avaliação foi feita após um

período de 7 dias. O hidróxido de cálcio contribuiu para a redução do E. faecalis,

porém, não eliminou totalmente. Alguns cimentos como Roth 811, AH Plus e cimento

de Grossman são considerados efetivos na eliminação de E. faecalis no interior dos

túbulos dentinários (SALEH et al., 2004).

38

Além de todas as medidas descritas para a prevenção e eliminação do E.

faecalis do sistema de canais radiculares, é imperioso lembrar que a outros

procedimentos de assepsia incluindo a adequada desinfecção do dique de borracha

com clorexidina ou hipoclorito de sódio e a desinfecção dos cones de guta-percha com

hipoclorito de sódio antes da sua inserção nos canais radiculares também fazem parte

da complexa barreira para a eliminação desse e de outros microrganismos que na

grande maioria das vezes se torna um problema para quem pratica a endodontia

(SENIA et al., 1975).

39

3. OBJETIVOS

Diante do exposto sobre a participação dos enterococos nos processos

infecciosos de natureza endodôntica, seus mecanismos de resistência aos

procedimentos realizados no preparo químico-mecânico e nas situações de persistência

após a obturação do sistema de canais radiculares, a presente investigação teve como

objetivo geral o isolamento, identificação e caracterização bioquímica dos Enterococcus

sp. de canais radiculares de dentes com infecção endodôntica primária. Os seguintes

objetivos específicos foram propostos:

1) Seleção de pacientes portadores de dentes com canais radiculares com

necrose pulpar e coleta de material de canais radiculares com auxílio de

cones de papel estéreis e semeadura em meios seletivos líquidos caldo

enterococcosel e caldo EBM.

2) Isolamento e caracterização bioquímica convencional e por galeria API 20

Strep.

3) Correlação do isolamento de cepas de E. faecalis segundo o gênero e

grupo de dentes.

4) Associação do isolamento de Enterococcus sp. com situações clínicas de

edema, dor, presença de secreção purulenta intra-canal, fístula e com

aspectos radiográficos.

40

4. MATERIAL E MÉTODOS Os protocolos experimentais realizados na presente investigação foram

aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal Fluminense

sob o número 025/06.

4.1 MATERIAL

4.1.1 MEIOS SELETIVOS

- Caldo Enterococosel (Merck Darmstadt, DE)

- Caldo Eosina e Azul de Metileno (Becton & Dickinson, USA)

4.1.2 MEIOS DE CULTIVO

- Agar Cled (Becton & Dickinson, USA)

- Agar Sangue (Becton & Dickinson, USA)

- Agar Bile Esculina (Difco, USA)

- Agar Mac Conkey (Merck Darmstadt, DE)

- Agar Soja tripticaseína (TSA) – Merck Darmstadt, DE.

- Agar Soja tripticaseína + 6,5% Na Cl ( Merck Darmstadt, DE)

- Agar Enterococosel (Merck Darmstadt, DE)

- Base de descarboxilação de aminoácidos de Möeller (Difco, USA).

- Caldo HIB (Heart Infusion Broth, Difco, USA)

41

- Cystine Tryptcase Agar (Difco, USA)

- Motility medium (Becton & Dickinson, USA)

4.1.3 REAGENTES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

- Manitol P.A. (Vetec Química Fina Ltda, Duque de Caxias, RJ).

- Sorbose (Merck Darmstadt, DE).

- Arginina L (Isofar, Duque de Caxias, RJ)

- D- Sorbitol ( Merck Darmstadt, DE)

- Inulina (Merck Darmstadt, DE).

- Telurito de Potássio (Riedel-de-Häen, DE).

- Arabinose L+ (Isofar, Duque de Caxias, RJ).

- D (+)- Rafinose (Sigma Chemical Co, Saint Louis, USA)

- Sacarose P.A. (Quimibrás Ind. Químicas, RJ).

4.1.4 GALERIA DE IDENTIFICAÇÃO MINIATURIZADA

- API 20 Strep (Biomérieux, La Balme, Les Grotes, France) (Figura 1).

4.1.5 OUTROS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

- Leite Desnatado a 10% ( Skim Milk, Difco, USA )

- Glicerol 5% (Merck Darmstadt, DE)

- Câmara de Fluxo Laminar (Veco – Mod. VLF9)

- Púrpura de Bromocresol (Micro Méd Ltda, Sampaio, RJ)

- Cones de Papel Absorvente (Konne – Ind. Com. de Mat. Odont., MG)

- Peróxido de Hidrogênio 3%

- Alças descartáveis plásticas

- Placas de Petri

42

- Criotubos de Plástico (crio)

- Bulbos

- Tubos de Ensaio (Tampa de Rosca 13 x 100)

- Microtubos tipo Eppendorf

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Seleção dos pacientes, coleta e processamento do material clínico

Os pacientes participantes do estudo gozavam de boa saúde sistêmica e não

tinham sido atendidos em hospitais ou medicados com antibióticos pelo menos seis

meses antes da realização da coleta. As amostras para a pesquisa foram obtidas de

70 (setenta) pacientes submetidos a tratamento endodôntico na Clínica de

Endodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, com

diagnóstico de polpa necrosada. Os indivíduos participantes da pesquisa receberam

esclarecimento sobre a importância do estudo e o material clínico foi colhido

somente após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1).

A elaboração de fichas clínicas (Anexo 2) objetivaram as análises relativas à

sintomatologia dolorosa, aos aspectos radiográficos, presença de odor, secreção

purulenta, edema e fístula nos indivíduos envolvidos na pesquisa quando da coleta

de material dos dentes com canais radiculares com necrose pulpar. Apenas

pacientes portadores de dentes com diagnóstico de polpa necrosada sem prévio

tratamento endodôntico ou acesso prévio da cavidade oral ao sistema de canais

43

radiculares (câmara pulpar sem contaminação com a cavidade oral), foram incluídos

no estudo.

O acesso aos canais radiculares foi realizado sob isolamento absoluto,

respeitando as condições de assepsia (após remoção do biofilme supragengival e

utilização de agente antisséptico (clorexidina a 2%) e irrigação intensa com soro

fisiológico). Em seguida, cones de papel esterilizados foram introduzidos

cuidadosamente até o terço cervical e médio dos canais, removidos após 30

segundos e introduzidos em tubos contendo meios estéreis específicos para o

crescimento de microrganismos anaeróbios facultativos, incluindo Enterococcus sp:

Caldo Eosina e Azul de Metileno (EMB) e Caldo Enterococcosel. Em todas as

ocasiões os meios foram transportados para a Disciplina de Microbiologia e

Imunologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de

Janeiro e incubadas até 48/37ºC. Alíquotas dos meios de cultivo líquidos foram

semeados por esgotamento nos meios Agar Mac Conkey (Merck Darmstadt, DE),

Agar Cled (Becton, Dickinson and Company, USA), Agar Sangue (Becton, Dickinson

and Company, USA ) e Agar Soja Tripticaseína (Merck Darmstadt, DE). Todos os

procedimentos envolvendo a semeadura nos meios de cultura foram realizados no

interior de capelas de fluxo laminar (Figura 2).

4.2.2 Caracterização Fisiológica das Amostras bacterianas

a) Coloração pelo Método de Gram

44

A partir do crescimento bacteriano em placas de TSA, foram selecionadas

colônias sugestivas de enterococos. As colônias foram repicadas isoladamente para

meios de cultura e preparados esfregaços em lâminas de vidro. Depois da coloração

pelo método de Gram, os esfregaços foram observados ao microscópio óptico com

aumento de 100X. Destarte, cada colônia isolada, suspeita de Enterococcus sp. foi

semeada para a obtenção de cultura pura (massa bacteriana) para o congelamento,

realizado em 10% de Skim milk contendo 5% de glicerol, e para a caracterização

fisiológica e bioquímica, segundo proposto por TEIXEIRA & FACKLAM (2003).

b) Produção da enzima catalase

A observação da produção da catalase foi feita por metodologia convencional

com a utilização de lâmina de vidro. Foi preparada uma suspensão espessa de

microrganismos cultivados por 24h/37ºC em superfície de placas de TSA em solução

salina fisiológica estéril (NaCl 0,85%). Em seguida, uma gota de peróxido de

hidrogênio a 3% (v/v) foi colocada sobre o esfregaço. Os Enterococcus sp. são

negativos neste teste, porém, algumas poucas amostras foram capazes de produzir

pseudocatalase (MAC FADDIN, 2000).

c) Tolerância ao Cloreto de Sódio a 6,5%

Foram utilizadas placas de TSA (Agar Soja tripticaseína – Merk Darmstadt

DE) acrescidas de cloreto de sódio a 6,5%. Inicialmente foram feitas semeaduras por

esgotamento das amostras e incubadas a 37ºC por 24 horas. O crescimento

45

bacteriano nessas condições é uma das características do gênero Enterococcus

(MAC FADDIN, 2000).

d) Crescimento na Presença de 40% de bile e utilização da

esculina

As cepas bacterianas também foram cultivadas na superfície de placas de

agar bile-esculina. O crescimento em agar contendo 40% de Bile bovina e a

utilização concomitante da esculina também constitui prova chave para a

identificação bioquímica de Enterococcus sp. (MAC FADDIN, 2000).

4.2.3 Identificação Bioquímica

a) Bioquímica convencional

Após os testes fisiológicos, as amostras suspeitas de enterococos foram

divididas em 5 grupos baseados na produção de ácidos a partir de manitol e sorbose

(ambos realizados em meio HIB contendo púrpura de bromocresol como indicador

de pH) e na capacidade de decarboxilar a arginina (em base de descarboxilação de

aminoácidos de Möeller). Depois de agrupadas, as cepas foram identificadas através

de provas adicionais que incluiram a fermentação de açucares tais como arabinose,

rafinose, sorbitol, inulina, sacarose e a capacidade de crescer em meio contendo

0,04% de telurito de potássio (TEIXEIRA & FACKLAM, 2003). Durante a realização

dos ensaios, as amostras foram mantidas através de passagem em placas de Agar

soja Tripticaseína (TSA – Merck Darmstadt, DE).

46

b) Identificação por sistema miniaturizado

A identificação através do sistema de galerias miniaturizadas API 20 strep

(Biomérieux, La Balme, Les Grotes, France ) foi realizada segundo as instruções do

fabricante. As amostras foram semeadas em agar sangue durante 24 horas em

atmosfera de anaerobiose (visualização do padrão de hemólise em anaerobiose) e

em seguida utilizadas para formação de uma suspensão de trabalho em meio de

suspensão do kit de identificação. Em seguida, 100 µL da suspensão foram

utilizados para preencher as células das galerias e o material foi mantido em câmara

úmida em estufa a 37ºC. As reações foram lidas após 4 e 24 horas de incubação.

Quando necessários, testes adicionais: Crescimento em 6,5% de NaCl, crescimento

a 45ºC e fermentação de salicina, foram realizados para a confirmação do isolado

P40 (E. durans). Os resultados numéricos foram confirmados pelo sistema APIWEB,

utilizando a database da Biomérieux (BOSSHARD et al., 2004).

Análise estatística

Os dados relativos à distribuição isolamento dos enterococos por gênero e

presença de edema, dor, lesão radiográfica e odor foram analisados através de

quiquadrado através do programa GraphPad Prism. Foi considerada diferença

estatisticamente significativa quando P< 0.05.

47

Figura 1: Sistema miniaturizado API 20 Strep.

Figura 2: Capela de fluxo laminar. No interior da câmara todo ar circulante é estéril.

48

5. RESULTADOS

5.1 Frequência de isolamento de Enterococcus sp. a partir de dentes com canais radiculares com necrose pulpar

No presente estudo foram isoladas 35 (50%) amostras de Enterococcus sp. a

partir dos canais radiculares com necrose pulpar cujas câmaras pulpares não

apresentavam comunicação com a cavidade bucal, de 70 pacientes. As culturas

foram positivas em 16 dos 27 pacientes do sexo masculino (59,25%) e em 19 dos 43

pacientes do sexo feminino (44,18%). Apesar do maior número de pacientes do

gênero feminino no estudo, o maior percentual relativo de isolamento de

Enterococcus sp. ocorreu em indivíduos do gênero masculino (Tabela 1). A Tabela 2

mostra a distribuição do isolamento das espécies de Enterococcus sp. entre os

gêneros feminino e masculino, isoladas dos sistemas de canais radiculares com

necrose pulpar. Foram encontradas as espécies: E. faecalis (33 cepas - 94,2%), E.

faecium (01 cepa - 2,85%) e E.durans (01 cepa - 2,85%).

5.2 Sintomatologia Dolorosa

Em um total de 35 pacientes com culturas positivas, 20 (57,14%) relataram

sintomatologia dolorosa prévia ao tratamento endodôntico. (Tabela 3). Dentre os 19

pacientes do sexo feminino com cultura positiva, 11 (57,89%) relataram a presença

de sintomatologia dolorosa. Nove (56,25%) dos 16 pacientes do sexo masculino

relataram sintomatologia dolorosa. Não houve diferença significativa quando da

49

relação entre o isolamento de Enterococcus sp. e a presença de sintomatologia

dolorosa (P> 0.05).

50

Tabela 1 - Percentual de isolamento de Enterococcus sp em pacientes portadores de e dentes com canais com necrose pulpar por gênero/dente.

Gênero / No de dentes1 Culturas positivas para Enterococcus sp.

Percentual de isolamento

Feminino – 43 19 44,18%

Masculino – 27 16 59,25%

Total – 70 35 50% 1As coletas de material foram obtidas de um (01) dente por paciente.

Tabela 2 - Percentual de isolamento de Enterococcus sp. em pacientes portadores de e dentes com canais com necrose pulpar por gênero/espécie.

Espécies Percentual de isolamento em pacientes

Total Feminino Masculino

E. faecalis

33 (94,2%) 18 (94,8%) 15 (93,8)

E. faecium

1 (2,85%) 1 (5,3%) _

E. durans

1 (2,85%) _ 1 (6,2%)

Total* 35 19 16

51

5.3 Presença de Odor

Seis dos 70 pacientes atendidos durante a realização do estudo apresentaram

odor fétido durante o acesso aos canais radiculares. O isolamento dos enterococos

ocorreu em 3 (8,57%) pacientes. Dentre estes, 2 pacientes do sexo feminino e 1 do

sexo masculino apresentaram a espécie E. faecalis (Tabela 4).

5.4 Presença de Secreção Purulenta

A observação de secreção purulenta durante o primeiro atendimento também

foi observada em 05 pacientes. Três dentes com cultura positiva para E. faecalis

apresentaram secreção purulenta intra-canal no momento da coleta. Tal fato ocorreu

em 2 pacientes do sexo feminino e 1 paciente do sexo masculino (Tabela 4).

5.5 Presença de fístula

A drenagem externa (presença de fístula) também foi observada em apenas

dois pacientes dos 70 envolvidos no estudo. Em um deles foi isolada a espécie E.

faecalis (Tabela 4).

52

Tabela 3 - Pacientes com culturas positivas relacionados à sintomatologia dolorosa.

Sintomatologia Presente Ausente

Feminino 11 (31,43%) 8 (22,85%)

Masculino 9 (25,72%) 7 (20%)

Total 20 (57,15%) 15 (42,85%)

Tabela 4 -Número de pacientes com culturas positivas que apresentaram secreção purulenta, presença de odor, edema e fístula no momento da coleta.

Odor / Secreção purulenta / Edema / Fístula

Masculino Feminino

Odor 1 (2,85%) 2 (5,71%)

Secreção purulenta 1 (2,85%) 2 (5,71%)

Edema 2 (5,71%) 2 (5,71%)

Fístula - 1 (2,85%)

Culturas positivas 16 (45,72%) 19 (54,28%)

53

5.6 Presença de Edema

Cinco pacientes apresentaram edema ao primeiro atendimento visando o

tratamento endodôntico. Dentre os 35 pacientes com cultura positiva, 4 (11,42%)

eram portadores de edema no momento da coleta, 2 do sexo masculino e 2 do sexo

feminino. Em todas as circunstâncias foi isolada a espécie E. faecalis (Tabela 4).

5.7 Distribuição Por Grupos de Dentes

A Tabela 5 mostra a relação entre os grupos de dentes com cultura positiva

relacionado com o gênero e ordem de coleta. Os 70 indivíduos participantes (P) da

presente investigação, que assinaram o termo de consentimento informado, tiveram

os materiais clínicos numerados segundo a ordem de atendimento. Os pacientes

foram incluídos no estudo de forma randômica, ou seja, não houve uma distribuição

similar entre os grupos de dentes incluídos no estudo. Dos 15 incisivos submetidos

às coletas de material, nove (60%) apresentaram-se colonizados por E. faecalis,

enquanto três caninos (75%) dos quatro submetidos às coletas apresentaram a

espécie E. faecalis. Dos pré-molares (n=22) submetidos às coletas ocorreu o

isolamento de Enterococcus sp. de 09 dentes (41%). De forma similar, dentre os 29

molares submetidos às coletas, 14 cepas (48,2%) de Enterococcus sp. foram

isoladas.

54

Tabela 5 - Dentes com cultura positiva relacionados a grupo de dentes e gênero.

Grupo de dentes Masculino Feminino

Incisivos (n= 15) P27 (42); P34 (11); P43 (12); P68 (11)

P1(21); P12 (21); P13(11); P16 (12); P24(31)

Caninos (n= 4) P4(23) P7(13); P39(13)

Pré-molares (n=22) P14(25); P19 (34); P35(14); P67(24)

P2(25); P5(34); P23(35); P28(24); P52(45)

Molares (n=29) P15(47); P17(38); P25(17); P32(16); P33(16); P40(46);

P54(16).

P6(46); P18(47); P38(46); P45(46); P47(27); P51(46);

P66(46).

Tabela 6 - Espécies microbianas (isolados) relacionadas ao paciente, número do dente e por ordem de coleta e meio seletivo utilizado.

Espécie Ordem de coleta /meio enterococcosel

Ordem de coleta /meio eosina e azul de metileno

E.faecalis P1E; P2E; P4E; P5E; P6E; P7E; P13E; P14E; P15E; P17E; P18E; P24E; P25E; P28E; P32E; P33E; P34E; P35E; P39E; P43E; P45E; P51E; P52E; P66E; P67E; P68E.

P6EMB; P16EMB; P19EMB; P27EMB; P38EMB; P47EMB; P54EMB.

E. faecium - P23EMB.

E. durans P40E

55

5.8 Espécies de Enterococcus sp. e os Meios Seletivos Utilizados

Na Tabela 6, as espécies microbianas identificadas no estudo estão

associadas aos números dos pacientes por ordem de coleta (P), e os meios

seletivos utilizados durante a coleta do material clínico: Caldo Enterococosel (E) ou

Caldo Eosina e Azul de Metileno (EMB). Cada isolado foi representado pelo número

do paciente e o meio seletivo utilizado no procedimento de coleta (p.ex. a cepa P1E

corresponde à amostra de E. facealis isolada do primeiro paciente coletado que

cresceu no meio enterococcosel). Vinte e sete (27) isolados foram obtidos a partir do

caldo enterococcosel, totalizando 77,14% de isolamento dos casos com cultura

positiva, enquanto 8 cepas foram obtidas do caldo EMB (22,86%).

56

6. DISCUSSÃO

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente e nos seres

humanos compõem a microbiota do trato gastrintestinal, cavidade oral e trato

geniturinário. Nas últimas décadas, os enterococos se tornaram importantes

agentes etiológicos de infecções hospitalares, principalmente em hospedeiros

imunocomprometidos e de superinfecções em pacientes tratados com agentes

antimicrobianos de amplo espectro (TEIXEIRA & FACKLAM, 2003). Atualmente, é

reconhecido que os enterococos podem causar uma variedade de infecções

monomicrobianas e polimicrobianas, especialmente em pacientes em estado

clínico grave. Dentre os quadros infecciosos se destacam as infecções do trato

urinário, bacteremias, endocardites, infecções intra-abdominais, trato biliar, e de

feridas (incluindo as operatórias), úlceras de decúbito e de pé de diabéticos.

Adicionalmente, causam em menor freqüência infecções dos sistemas respiratório

e nervoso, conduto auditivo, da conjuntiva e região periodontal (JOHNSON, 1994;

MUNDY, SAHM & GILMORE, 2000; TENG et al.,2002; ARCHIMBAUD et al., 2002).

A importância crescente do gênero Enterococcus no cenário das infecções

humanas fez surgir extenso interesse no estudo da diversidade genética de tais

microrganismos. As técnicas moleculares têm auxiliado significativamente para a

definição da distribuição clonal, sendo possível a demonstração da transmissão

destes microrganismos por contato direto e indireto entre pacientes (LIVORNESE

et al.,1992; PEGUES et al., 1997). O aumento significativo de infecções

enterocócicas causadas principalmente pela espécie E. faecalis e a emergência de

57

mecanismos de resistência justificam o interesse no entendimento dos fatores de

virulência destes microrganismos, assim como a determinação da presença de

amostras portadoras dessas características em nosso meio.

O principal objetivo do presente estudo foi o de isolar, identificar e

caracterizar fisiologicamente Enterococcus sp em canais radiculares de dentes

portadores de necrose pulpar. Estudos recentes investigando a microbiota dos

canais radiculares através de coleta e métodos de cultivo vêm encontrando uma

baixa prevalência de E. faecalis nas infecções endodônticas primárias, variando de

13% a 4% dos isolamentos (FERRARI et al.,2005 – 13%; SEDGLEY et al.,2006a -

10,2%; GOMES et al.,2006 – 4%). Em nosso estudo foram isoladas 35 amostras

de Enterococcus sp de um total de 70 pacientes com diagnóstico de necrose

pulpar nos respectivos canais radiculares, perfazendo assim uma prevalência de

50%. As culturas foram positivas em 16 dos 27 pacientes do sexo masculino

(59,25%) e em 19 dos 43 pacientes do sexo feminino (44,18%). Apesar das

variações da distribuição entre os gêneros, não houve diferença estatisticamente

significativa. Poucos trabalhos realizados com a detecção de enterococos vêm

relevando a colonização dos canais radiculares por este grupo de microrganismos.

Um trabalho realizado em Singapura, com pacientes internados em hospitais,

relevou a colonização de E. faecalis resistente à vancomicina (VRE) propondo,

dentre os fatores de risco para a colonização, a associação: pacientes idosas

(sexo feminino) e diabéticas (YANG et al.,2007).

58

Quanto ao grupo de dentes (incisivos, caninos, pré-molares e molares), o

presente estudo demonstrou tendência à colonização de E. faecalis em caninos

(75%) e incisivos (60%). Para os outros grupos de dentes, os premolares e

molares apresentaram menor taxa de colonização por Enterococcus sp, de 41% e

48,2%, respectivamente. Apesar dos percentuais elevados de colonização de

caninos e incisivos por E. faecalis, novos estudos são necessários para afirmar a

tendência de colonização por esta espécie, tendo em vista a pequena amostragem

de incisivos (15 dentes) e caninos (04 dentes) envolvidos na presente

investigação.

Durante a realização dos ensaios 10 outros pacientes apresentando

dentes com câmara pulpar aberta também foram investigados (dados não

apresentados). Foram caracterizadas (07) sete cepas de E. faecalis dos dentes

portadores de canais radiculares com infecção endodôntica primária, cujas

câmaras pulpares apresentavam-se com comunicação com a cavidade oral,

representando uma prevalência de isolamento de 70%. Tais resultados não foram

incluídos no presente estudo devido ao fato da literatura consultada relacionar o

isolamento dos Enterococcus sp. com a contaminação dos sistemas de canais

radiculares por deficiência de selamento da câmara pulpar (SIREN et al., 1997).

Apesar da pequena amostragem, tais resultados sugerem que a comunicação dos

sistemas de canais rediculares com a cavidade oral pode de fato influenciar na

colonização por E. faecalis. Estes aspectos constituem perspectivas para a

realização de novos trabalhos em endodontia.

59

A infecção endodôntica primária é causada por microrganismos que

colonizam a polpa necrosada e é também conhecida como infecção inicial. Já a

infecção secundária (ou refratária) tem como origem microrganismos que

permanecem infectando o sistema de canais radiculares após a intervenção

endodôntica, ou que penetraram os canais através de falhas na manutenção da

cadeia asséptica, entre as sessões da terapia ou mesmo após a conclusão desta.

Os enterococos são os microrganismos mais comumente associados aos casos de

insucesso endodôntico, podendo manter-se viáveis por períodos variáveis de

tempo (LOPES & SIQUEIRA, 2004), sendo detectados através de técnicas

moleculares (em especial PCR) em 77% dos casos de infecções endodônticas

refratárias (SIQUEIRA & ROÇAS, 2004).

Alguns estudos realizados pelo método de cultivo comprovaram a

presença majoritária dos E. faecalis na infecção endodôntica refratária ao

tratamento ou secundária. MÖLLER em 1966, estudou casos de insucesso da

terapia endodôntica encontrou uma média de 1,6 espécie microbiana por canal.

Microrganismos anaeróbios estritos corresponderam a 51% das cepas isoladas e

E. faecalis foi encontrado em 29% dos casos. SUNDQVIST et al.,1998 relataram

uma média de 1,3 espécie por canal, sendo que 42% dos microrganismos foram

anaeróbios estritos e E. faecalis detectado em 38%. MOLANDER et al.,1998

estudaram 100 canais radiculares obturados e com lesões perirradiculares,

encontrou uma prevalência de 69% de anaeróbios facultativos e os enterococos

presentes em 32% dos elementos dentários investigados. A maior prevalência em

estudos por métodos de cultivo em casos de insucesso endodôntico foi verificada

60

no trabalho de PECIULIENE et al.,2000, em que o isolamento de E. faecalis atingiu

a marca de 70%.

Estudo empregando métodos moleculares demonstrou a presença de E.

faecalis em infecções refratárias ao tratamento endodôntico em 77% dos casos. A

associação com outras espécies microbianas também foi relevada nos casos de

infecções refratárias. Foi observada a presença de Pseudoramibacter alactolyticus

em 52%, Propionibacterium propionicum (52%), Dialister pneumosintes (48%) e

Filifactor alocis (48%). A levedura C. albicans foi encontrada em 9% das amostras

(SIQUEIRA & ROÇAS, 2004).

A identificação de Enterococcus sp nos canais radiculares de dentes de

seres humanos através de métodos de cultivo foi feita pela primeira vez por

MEJARE (1975) que isolou e identificou as espécies E. faecalis e E. faecium.

FERRARI et al., 2005 em estudo incluindo enterococos, enterobactérias e fungos,

identificaram E. faecalis, E. faecium e E. casseliflavus. No presente estudo foram

isoladas e identificadas 35 amostras de Enterococcus sp: 33 amostras de E.

faecalis (94,28%), 1 amostra de E. faecium (2,86%) e 1 amostra de E. durans

(2,86%). Esta última espécie pela primeira vez isolada e identificada em canais

radiculares de dentes de seres humanos. É oportuno ressaltar que para a

identificação da espécie E. durans foram necessárias algumas provas adicionais

tais como crescimento na presença de NaCl a 6,5%, crescimento em salicina e à

temperatura de 45ºC/48h. Estas provas adicionais diferenciaram a espécie E.

61

durans da espécie Lactococcus lactis Os resultados da identificação bioquímica

convencional foram concordantes com a identificação pelo sistema API 20 Strep.

Alguns pesquisadores detectaram E. faecalis em materiais provenientes

de infecção endodôntica primária através de diversas técnicas. ROÇAS et al., 2004

em estudo relativo à infecção endodôntica primária correlacionou os achados pela

técnica de PCR e por métodos de cultivo. O estudo contou com 50 casos e a

detecção pela técnica de PCR atingiu 33% (7 de 21 casos) de canais radiculares

associados a lesões perirradiculares crônicas assintomáticas, em 10% (1 de 10

casos) de canais radiculares associados com periodontite apical aguda e 5% (1 de

19 casos) de amostras de secreções purulentas de abscessos perirradiculares. A

prevalência foi de 18% (9 de 50 casos) dos casos de infecção endodôntica

primária.

ZOLETTI et al., (2006) detectaram E. faecalis por PCR e identificaram por

procedimentos convencionais de cultivo, além de fazerem a comparação dos dois

métodos em relação à sua eficácia. O estudo contou com 50 casos e dos 27 casos

em que os canais radiculares estavam associados a lesões perirradiculares E.

faecalis foi detectado em 22 casos (81,5%) por PCR e 5 casos (18,5%) por

métodos de cultivo. Na comparação entre os dois métodos em relação a 23 dentes

(também incluídos no estudo) com canais radiculares associados a lesões

perirradiculares com evidências de destruição óssea, a espécie E. faecalis foi

detectada em 18 casos (78%) através de PCR e em 3 casos (13%) pelos métodos

de cultivo.

62

Com o objetivo de investigar a presença de E. faecalis em vários sitios da

cavidade oral, SEDGLEY et al., (2006b) utilizaram amostras clínicas coletadas da

língua, sulco gengival, mucosa oral e de canais radiculares através do método da

reação em cadeia da polimerase e por métodos de cultivo, verificando que o

método PCR na detecção da espécie E. faecalis é mais sensível que a utilização

dos métodos de cultivo. Este trabalho contou com um número de 136 pacientes

portadores de infecção endodôntica e E. faecalis foi detectado por PCR na língua

em 55% (22 de 40), no sulco gengival em 22% (7 de 32), na mucosa oral em 29%

(12 de 41) e nos canais radiculares em 9% (2 de 23). Em contrapartida, a espécie

E. faecalis foi identificada na língua por método de cultivo em 5% (2 pacientes de

40) e mucosa oral em 10% (4 de 41 pacientes). Em outro estudo de SEDGLEY et

al.,(2006) envolvendo 88 pacientes, E. faecalis foi identificado em 9 indivíduos

(10,2%) por método de cultivo e detectado em 70 pacientes (79,5%) através de

PCR.

Em outro estudo em que os autores tentaram correlacionar o isolamento

microbiano através de métodos de cultivo e a detecção molecular pelo método

PCR, GOMES et al.,(2006) em trabalho realizado com 50 dentes, conseguiu o

isolamento de E. faecalis por método de cultivo em 2 oportunidades (4%) e a

detecção através de PCR em 41 dentes (82%). A alta detecção pelo método

molecular foi justificada pelo fato de 49 dos 50 dentes serem portadores de

infiltrações coronárias devido a restaurações deficitárias, facilitando a migração

63

dos microrganismos em questão para a câmara pulpar e posteriormente para os

canais radiculares.

Deve ser ressaltado que, comparando com os estudos anteriores

envolvendo dentes com infecção endodôntica primária, a presente investigação foi

a que mais isolou e caracterizou bioquimicamente, cepas de Enterococcus sp.

Talvez a metodologia empregada possa ter corroborado com a aproximação dos

resultados de cultura com as detecções pelos métodos moleculares, onde o

material foi coletado e imediatamente semeado em meios seletivos. Nos trabalhos

supracitados, o material coletado foi introduzido em meios de transporte tais como

VMGA III, que pode permitir o crescimento de microrganismos anaeróbios estritos,

os quais poderiam ser capazes de produzir bacteriocinas capazes de eliminar os

Enterococcus sp. comprometendo a viabilidade bacteriana durante os

procedimentos de transporte.

Outros pesquisadores utilizaram o método denominado Checkerboard pela

técnica da hibridização do DNA-DNA (sonda genômica total) para os estudos

relacionados à infecção endodôntica primária. SASSONE et al., (2007), avaliaram

a composição da microbiota predominante em infecção endodôntica primária de

111 dentes selecionados entre elementos unirradiculares com diagnóstico de polpa

necrosada. Foram detectadas 40 espécies microbianas e a de maior prevalência

nos canais radiculares com polpa necrosada foi a espécie E. faecalis, com 89,3%.

Os autores discutiram que tal resultado foi surpreendente devido à referida espécie

ser associada às infecções persistentes dos canais radiculares, apresentando

64

baixos índices de prevalência em estudos que utilizam métodos de cultivo para o

isolamento de microrganismos nas infecções endodônticas primárias.

SASSONE et al. (2008b), em estudo relacionado à microbiota das

infecções endodônticas primárias, avaliaram 15 dentes com fístula e 15 dentes

sem fístula pelo método de Checkerboard com a hibridização do DNA-DNA.

Observaram que 5 casos que apresentaram fístula e 4 que não apresentaram,

tinham relatos de sintomatologia dolorosa. Neste estudo foram detectadas 40

espécies microbianas de um total de 30 amostras. Algumas espécies estiveram

presentes em mais de 75% das amostras: E. faecalis, F. nucleatum sp.vincentii, P.

gingivalis, V. parvula, C. gracilis e N. mucosa. A espécie E. faecalis foi detectada

em 90% das amostras, índice considerado muito alto devido a esta espécie estar

geralmente associada aos casos de fracasso da terapia endodôntica, com

prevalência relativamente baixa nas infecções endodônticas primárias.

Paralelamente, 4 espécies foram detectadas em casos que não apresentavam

fístula: E. faecalis, S. anginosus, C. sputigena e C. gingivalis. Na presente

investigação, apenas 2 pacientes apresentaram fístula no momento da coleta de

material e 1 deles apresentou crescimento da espécie E. faecalis. Devido ao

pequeno número de dentes apresentando fístulas no momento da coleta de

material, é importante que as investigações acerca da colonização dos canais de

dentes apresentando drenagem externa por E. faecalis sejam ampliadas visando a

correlação da presença da espécie com a formação de abscessos.

65

Adicionalmente, fichas clínicas elaboradas objetivaram a detecção de

sintomatologia dolorosa, presença de odor fétido, secreção purulenta intra-canal e

edema. A sintomatologia dolorosa foi relatada em 20 (57,14%) dos 35 pacientes

que apresentaram cultura positiva para E. faecalis. Tais dados apresentam

concordância com o estudo de SASSONE et al. (2008a) que avaliaram a microbiota

da infecção endodôntica primária associada à sintomatologia dolorosa de 60

dentes, utilizando o método Checkerboard pela técnica de hibridização DNA-DNA.

Os autores detectaram uma média de 24 espécies nas 60 amostras (7 a 38

espécies por amostra) e os dentes que apresentaram sintomatologia dolorosa

albergavam uma média de 26 espécies detectadas (11 a 38 por amostra). Além da

espécie E. faecalis outros microrganismos foram detectados como prevalentes em

dentes apresentando sintomatologia dolorosa: Fusobacterium nucleatum

ssp.vincentii, Veillonella parvula, Treponema socranski e Campylobacter gracilis.

A presença de odor fétido foi verificada em apenas 3 dentes (8,57%), igual

número daqueles que apresentaram secreção purulenta. Quando somados os

indivíduos que apresentaram drenagem de secreção purulenta intra e extra canal,

de um total de sete, de quatro (57%) dentes foram isolados E. faecalis. Em relação

à presença de edema, dos cinco pacientes que foram atendidos com edema, em

quatro foram isolados E. faecalis.

Como abordado anteriormente, a espécie E. faecalis é a mais

predominantemente isolada de pacientes internados em unidades nosocomiais.

Em nosso estudo, o isolamento de E. faecalis seguiu o mesmo perfil de freqüência

66

nos processos infecciosos endodônticos de natureza primária, seguido pelas

outras espécies. Os enterococos vêm assumindo grande importância devido à

emergência de amostras resistentes aos agentes antimicrobianos diversos. Os

glicopeptídeos, principalmente a vancomicina, têm sido apontados como os

principais fármacos alternativos para o tratamento de enterococcias. Na maioria

das vezes, a vancomicina é a droga de escolha quando a terapia sinérgica com

beta-lactâmicos e aminoglicosídeos não logra o efeito desejado (LECLERCQ &

COURVALIN, 1997). Paralelamente, mecanismos de resistência adquirida a

vancomicina em amostras de enterococos são descritos com maior frequência e

tal resistência ocorre por aquisição de DNA extracromossômico (plasmídeos e/ou

transposons). Estudos sugerem que a utilização indiscriminada de antibióticos

incluindo, vancomicina, cefalosporinas, metronidazol e clindamicina são

importantes fatores predisponentes para a colonização e/ou infecção por amostras

resistentes a vancomicina (SUPPOLA et al.,1996; EDLUND et al.,1997). Neste

trabalho, a espécie E. faecalis foi a mais isolada de situações clínicas

acompanhadas de edema, sintomatologia dolorosa e presença de fístula. As

outras espécies isoladas não puderam ser associadas a tais situações clínicas. As

razões que determinam a maior freqüência de isolamento da espécie E. faecalis

na microbiota dos canais radiculares, os fatores de virulência apresentados por

esta espécie e o surgimento de resistência bacteriana aos agentes

antimicrobianos permanece sob investigação.

67

7. CONCLUSÕES

Enterococcus sp foram isolados e identificados a partir de espécimes clínicos

oriundos de canais radiculares de dentes com diagnóstico de necrose pulpar. A

prevalência de Enterococcus sp. foi de 50%. O diferencial aparenta ter sido os

meios seletivos utilizados: caldo enterococcosel e caldo EMB.

Três espécies de Enterococcus sp foram isoladas e identificadas: E. faecalis

(94,28%), E. faecium (2,86%) e E. durans (2,86%). A identificação de E. durans

necessitou de procedimentos adicionais: crescimento em Na Cl a 6,5%,

crescimento em salicina e crescimento em temperatura de 45ºC/48h. A espécie

E. faecalis foi a única que se associou aos dentes com situações clínicas de

edema, dor, drenagem de secreção purulenta intra-canal e fístula.

Os percentuais de isolamento entre os gêneros dos sexos masculino (59,25%) e

feminino (44,18%) indicaram a ausência de tendência entre os sexos.

Entretanto, ocorreu tendência à colonização dos incisivos e caninos por E.

faecalis.

Sintomatologia dolorosa foi verificada em 20 (57,14%) dos 35 pacientes com

cultura positiva e na análise dos aspectos radiográficos, 14 pacientes (40%)

apresentaram lesão definida no momento da coleta.

Dentre os 35 dentes que apresentaram cultura positiva, em 3 (8,57%) foram

observados odor fétido e drenagem de secreção purulenta intra-canal. A

presença de edema foi verificada em 4 dentes (11,42%) e apenas 1 dente

apresentou drenagem extra-canal (fístula) (2,85%).

68

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO CR et al. Avaliação in vitro do desempenho dos EDTAs gel e líquido pós-preparo do sistema de canais radiculares. J. Bras. Endod., 4(13): 160-164, 2003. ARCHIMBAUD C, SHANKAR N, FORESTIER C, BAGHDAYAN A, GILMORE MS, CHARBONNÉ F, JOLY B. “In vitro” adhesive properties and virulence factors of Enterococcus faecalis strains.Res. Microbiol., 153: 75-80, 2002. BADDOUR LM. Virulence factors among Gram-positive bacteria in experimental endocarditis. Infect. Immun., 62: 2143-2148, 1994. BEN-AMI, GILADI M, CARMELI Y, ORNI-WASSERLAUF R, SIEGMAN-IGRA Y. Hospital acquired infective endocarditis : should the definition be broadened ? Clin. Infect. Dis., 38(6) : 843-850, 2004. BENSING BA, DUNNY GM. Cloning and molecular analysis of genes affecting expression of binding substance, the recipients-encodid recptor (s) mediating mating aggregate formation in Enterococcus faecalis. J.Bacterial., 175: 7421-7429, 1993. BERTI M, CANDIANI G, KAUFHOLD A, MUSCHOLL A, WIRTH R. Does aggregation substance of Enterococcus faecalis contribute to development of endocarditis ? Infection., 26: 48-53, 1998. BOSSHARD PP, ABELS S, ALTWEGG M, BÖTTGER EC, ZBINDEN R. Comparison of conventional and molecular methods for identification of aerobic catalase-negativo gram-positive cocci in the clinical laboratory. Journal of Cinical Microbiology., 42(5) : 2065-2073, May 2004. BYSTRÖM A, SUNDQVIST G. Bacteriologic evaluation of the efficacy of mechanical root canal instrumentation in endodontic therapy. Scand. J. Dent.Res., 89: 321-328, 1981. BYSTRÖM A, SUNDQVIST G. The antimicrobial action of sodium hypochlorite and EDTA in 60 cases of endodontic therapy. Int. Endod. J., 18: 35-40, 1985. CALLEGAN MC, BOOTH MC, JETT BD, GILMORE MS. Pathogenesis of Gram-positive bacterial endophthalmitis. Infect. Immun., 67: 3348-3356, 1999. CARVALHO MGS, VIANNI MCE, ELLIOT JA, REEVES M, FACKLAN RR, TEIXEIRA LM. Molecular analysis of Lactococcus garvieae and Enterococcus gallinarum isolated from water buffalos with subclinical mastitis. Adv.Exp. Med.Biol., 418: 401-404, 1997. CHENOWETH D, SCHABERG D. The epidemiology of enterococci. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.Dis.,9: 80-89, 1990.

69

CHIRURGI VA, OSTER SE, GOLDBERG AA, ZERVOS MJ, MC CABE RE. Ampicilin-resistant Enterococcus raffinosus in an acute hospital : case-control study and antimicrobial susceptibilities. J. Clin.Microbiol., 29: 2663-2665, 1991. CHOW JW, THAL SA, PERRI MB, VAZQUEZ JA, DONABEDIAN SM, CLEWELL DB, ZERVOS MJ. Plasmid-associated hemolysin and aggregation substance production contribuites to virulence in experimental enterococcal endocarditis. Antimicrob. Agents Chemother., 37: 2474-247, 1993. CLARK NC, COOKSEY RC, HILL BC, SWENSON JM, TENOVER FC. Characterization of glycopeptide-resistant enterococci from US hospitals. Antimicrob. Agents. Chemother., 7: 2311-2317, 1993. COHEN S, BURNS R. Caminhos da polpa. 6ª ed. Rio de Janeiro: Ed. Guanabara Koogan, 1997. 758p. DAHLEN G, SAMUELSON W, MOLANDER A et al. Identification and antimicrobial susceptibility of enterococci isolated from the root canal. Oral Microbiol.Immunol., 15 (5), 309-312, 2000. DISTEL JW, HATTON JF, GILLESPIE, MJ. Biofilm formation in medicated root canal. J. Endod.,10 (28): 689-693, 2002. DUPRÈ I, ZANETTI S, SCHITO AM, FADDA G, SECHI LA. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J. Med. Microbiol..52: 491-498, 2003. EDLUND C, BARKHOLT L, OLSSON-LILJEQUIST B, NORD CE. Effect of vancomycin on intestinal flora of patients who previously received antimicrobial therapy. Clin. Infect. Dis., 25: 729-732, 1997. EVANS M, DAVIES JK, SUNDQVIST G, FIGDOR D. Mechanism involved in the resistance of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide. Int.Endodod J., 35: 221-228, 2002. FACKLAM RR, SAHM DF, TEIXEIRA LM. Enterococcus. In : MURRAY BE, BARON EJ, PFALLER MA, TENOVER FC, YOLKEN RH (eds.). Manual of Clinical Microbiology, 7ª ed. American Society for Microbiology Press. Washington DC, EUA, 295-305, 1999. FERRARI PHP, CAI S, BOMBANA AC. Effect of endodontic procedures on enterococci, enteric bacteria and yeasts in primary endodontic infection. Internacional Endodontic Journal., 38: 372-380, 2005. FERREIRA ALC. Estudo comparativo da capacidade seladora dos cimentos endodônticos, a saber : AH Plus, N-Richert e pasta L&C. Rio de Janeiro

70

(monografia). Curso de Especialização em Endodontia do Instituto de Odontologia da PUC-RJ, 44p, 2001. FRANZ CMAP, HOLZAPFEL WH, STLILES ME. Enterococci at the crossroads of food safety ? Int. J. Food Microbiol., 47: 1-24, 1999. GALLI D, WIRTH R. Comparative analysis of Enterococcus faecalis sex pheromone plasmids identifies a single homologous DNA region which codes for aggregation substance. J.Bacterial., 173: 3029-3033, 1991. GARSIN DA, SIFRI CD, MYLONAKIS E, QIN X, SINGH KV, MURRAY BE. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci., 10892-10897, 2001. GOLDBERG F, CURFINKBEL J, SPIELBERG C. Microscopic study of standardized gutta-percha point. Oral Surg., 47 (3): 275-276, 1979. GOMES BPFA, SOUSA ELR, ZAIA AA, SOUZA-FILHO FJ. Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase chain reaction analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.,102: 247-253, 2006. GRANINGER W, RAGETTE R. Nosocomial bacteremia due to Enterococcus faecalis without endocarditis. Clin. Infect.Dis., 15: 49-57, 1992. GUTMANN JL, WITHERSPOON DE. Obturation of the cleaned and shaped root canal system. In : COHEN S, BURNS RC. Patways of the pulp, 7ª ed. Louis: Mosby, 258-361, 1998. GUZMAN CA, PRUZZO C, LIPIRA G, CALEGARI L. Role of adherence in pathogenesis of Enterococcus faecalis urinary tract infection and endocarditis. Infect.Immun., 57: 1834-1838, 1989. HAAPASALO M et al. Facultative gram negative enteric rods in a persistent periapical infections. Acta Odontol.Scand., 41: 19-22, 1983. HAAPASALO M, ORSTAVIK D. In vitro infection and desinfection of dentinal tubules. J. Dent. Res., 66: 1375-1379, 1987. HAAPASALO M, UDNACS T, ENDAL U. Persistant recurrent and acquired infection of the root canal system post-treatment. Endodontic topics., 6: 29-56, 2003. HELING I, CHANDLER NP. Antimicrobial effect of irrigant combination within dentinal tubules. Int. Endod. J., 31: 8-14, 1998. HIRT H, SCHLIEVERT PM, DUNNY GM. In vivo induction of virulence and antibiotic resistance transfer in Enterococcus faecalis mediated by the sex pheromone-sensing system of pCF10. Infect. Immun., 70: 716-723, 2002.

71

JARVIS WR, MARTONE WJ. Predominant pathogens in hospital infections. J. Antimicrob. Chemother., 29 (Supll A) : 19-24, 1992. JETT BD, HUYCKE MM, GILMORE MS. Virulence of enterococci. Clin. Microb.Rev., 7 : 462-478, 1994. JOHNSON AP. The pathogenicity of Enterococci. J. Antimicrob. Chemother., 33 : 1083-1089, 1994. KREFT B, MARRE R, SCHRAMM U, WIRTH R. Aggregation substance of Enterococcus faecalis mediates adhesion to cultured renal tubular cells. Infect Immun., 60 : 25-30, 1992. LECLERCQ R, COURVALIN P. Resistance to glycopeptides in enterococci.Clin. Infect. Dis., 24 : 545-546, 1997. LEE W, LIM S, SON H. Sonicated extract of Enterococcus faecalis induces cell cycle arest in phytohemagglutinin-actived human lymphocytes. J. Endod., 30 : 209-212, 2004. LEONARDO MR Contribuição para o estudo da reparação apical e periapical pós-tratamento de canais radiculares. Araraquara, p. 25-28. Tese Livre Docência. Fac. Farm. Odont. Araraquara, 1973. LEONARDO MR, LEAL JM. Endodontia. Tratamento dos canais radiculares, 3ªed. São Paulo. Editora Panamericana, 1998. LEWIS CM, ZERVOS MJ. Clinical manifestation of enterococal infection. Eur. J. Clin Microbiol. Infect. Dis., 9 : 111-117. LOPES HP, SIQUEIRA JR, JF. Endodontia, Biologia e Técnica. Rio de Janeiro : Medsi, 1999. LOPES HP, SIQUEIRA JR, JF. Endodontia, Biologia e Técnica. Rio de Janeiro : Medsi – Guanabara Koogan, 2004. MAC FADIM, JF. Biochemical test for identification of medical bacteria. 3rd ed. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins, 2000. MANIGLIA et al., Aspectos da guta-percha após a obturação pela técnica de condensação lateral e ultrassônica. APCD, v.51, n.4, 1997. MAKI DG, AGGER WA. Enterococal bacteremia : clinical features the risk of endocarditis and management. Medicina., 67 : 248-249, 1988. MALHEIROS CF, MARQUES MM, GAVINI G. In vitro evaluation of the cytotoxic effects of acid solutions used as canal irrigants. J. Endod., 31(10) : 746-748, october 2005.

72

MC HUGH CP, ZANG P, MICHALEK S. Ph required to kill Enterococcus faecalis in vitro., J. Endod., 30 : 218-219, 2004. MEGRAN DW. Enterococal endocarditis. Clin. Infect. Dis., 15 : 63-71, 1992. MEJARE B. Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium in infected dental root canals at filling and their susceptibility to azidocillin and some comparable antibiotics. Odontol. Revy., 1975. MENEZES MM, VALERA MS, JORGE AOC, KOGA-ITO CY, CAMARGO & MANCINI MNG. In vitro evaluation of the effectiveness of irrigants and intracanal medicaments on microrganisms within root canals. Int. Endod. J., 37(5) : 311-319, 2004. MOELLERING RC. Emergence of Enterococcus as a significant pathogen. Clin. Infect.Dis., 14 : 1173-1178, 1992. MOHAMED JA, HUANG W, NALLAPAREDY SR, TENGE F, MURRAY BE. Influence of origin of isolates, especially endocarditis isolates and various genes on biofilm formation by Enterococcus faecalis. Infect Immun., 72 : 3658-3663, 2004. MOLANDER A et al., Microbiological status of root-filled teeth with apical periodontitis. Int. Endod. J., 31 : 1-7, 1998. MÖLLER AJR. Microbial examination of root canals and periapical tissues of human teeth. Odont. Tidsk., 74 (supplement) : 1-380, 1966. MONDINO SSB, CASTRO ACD, MONDINO PJJ, CARVALHO MGS, SILVA KMF, TEIXEIRA LM. Phenotypic and genotypic characterization of clinical and intestinal enterococci isolated from inpatients and outpatients in two brazilian hospitals. Microb. Drug. Resist., 9 : 167-173, 2003. MUNDY LM, SAHM DF, GILMORE M. Relationships between enterococal virulence and antimicrobial resistance. Clin. Microbiol.Rev., 13 : 513-522, 2000. MURRAY BE. The life and times of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3 : 46-65, 1990. MURRAY BE. Diversity among multidrug-resistant enterococci. Emerg. Infect. Dis., 4 : 37-47, 1998. NAUSCHUETZ WF, TREVINO SB, HARRISON LS, LONGFIELD RN, FLETCHER L, WORTHAM WG. Enterococcus casseliflavus as an agent of nosocomial bloodstream infections. Med Microbiol Latt., 2 : 102-108, 1993. ÖZCELIK B, TASMAN F, OGAN C. A comparison of the surface tension of calcium hydroxide mixed with different vehicles. J. Endod., 26 (9) : 500-502, sept 2000.

73

PATTON WN, BIENZ N, FRANKLIN IM, HASTING JG. Enterococal meningitis in an HIV positive haemophilic patients. J. Clin. Pathol., 44 : 608-609, 1991. PECIULIENE V et al., Isolation of Enterococcus faecalis in previously root-filled canals in a Lithuanian population. J. Endod., 26 : 593-595, 2000. PECIULIENE V et al., Isolation of yeasts and enteric bacteria in root-filled with chronic apical periodontitis. Int. Endod. J. 34 : 429-434, 2001. PEGUES DA, PEGUES CF, HIBBERD PL, FORD DS, HOOPER DC. Emergence and dissemination of a high vancomycin-resistant van A strains of Enterococus faecium at a large teaching hospital. J. Clin. Microbiol., 35 : 1565-1570, 1997. PEREZ F, CALAS P, de FALGUEROLLES A, MAURETTE A. Migration of a Streptococcus sanguis strain through the root dentinal tubules. J. Endod., 19 : 297-301, 1993. ROÇAS IN, SIQUEIRA Jr JF, SANTOS KR. Association of Enterococcus faecalis with a different forms of perirradicular diseases. J. Endod., 30(5) : 315-320, 2004. SALEH L, RUYTER IE, HAAPASALO M et al. Survival of Enterococcus faecalis in infected dentinal tubules after root canal filling with different root canal sealers in vitro. Int Endod., 37 : 193-198, 2004. SASSONE LM, FIDEL RA, FIDEL SR et al. Antimicrobial activity of different concentrations of NaOCl and chlorhexidine using a contact test. Braz. Dent. J., 14(2) : 193-198, 2004. SASSONE LM, FIDEL R, FIGUEIREDO L, FIDEL S, FAVERI M, FERES M Evaluation of the microbiota of primary endodontic infections using checkerboard DNA-DNA hybridization. Oral Microbiol. Immunol.., 22 : 390-397, 2007. SASSONE LM, FIDEL RA, FAVERI M, GUERRA R, FIGUEIREDO L, FIDEL SR, FERES M. A microbiological profile of symptomatic teeth with primary endodontoc infections. J.Endod., 34(5) : 541-545, 2008a. SASSONE LM, FIDEL R, FAVERI M, FIDEL S, FIGUEIREDO L, FERES M. Microbiological evaluation of primary endodontic infections in teeth with and without sinus tract. Int. Endod. J., 41 : 508-515, 2008b. SCELZA MFZ, PIERRO V, SCELZA P, PEREIRA M. Effect of three different time periods of irrigation with EDTA-T, EDTA and citric acid on smear layer removal. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., 98 : 499-503, oct 2004.

74

SEDGLEY CM, MOLANDER A, FLANNAGAN SE et al. Virulence phenotype and genotype characteristics of endodontic Enterococcus sp. Oral Microbiol. Immunol., 20 : 10-19, 2005. SEDGLEY CM, NAGEL A, DAHLEN G, REIT C, MOLANDER A. Real-time quantitative polymerase chain reaction and culture analyses of Enterococcus faecalis in root canals. J. Endod., 32(3) : 173-177, march 2006a. SEDGLEY CM, BUCK G, APPELBE O. Prevalence of Enterococcus faecalis at Multiple Oral sites in endodontic patients using culture and PCR. Clinical Research., 32(2) : 104-109, 2006b. SEGURA JJ, RUBIO AJ, GUERRERO JM, CALVO JR. Comparative effects of two endodontic irrigants, chlorhexidine digluconate and sodium hypochlorite on macrophage adhesion to plastic surfaces. J. Endod., 25 : 243-246, 1999. SENIA E, MARRARO RV, MITCHELL J et al. Rapid sterilization of guta-percha cones with 5,25% sodium hypochlorite. J. Endod. 1 : 136-140, 1975. SHAES DM, LEVY J, WOLINSKY E. Enterococal bacteremia without endocarditis. Arch Intern. Med., 141 : 578-581, 1981. SHERMAN JM. The streptococci. Bacteriol. Rev., 1 : 3-97, 1937. SHIPPER G, ORSTAVIK D, TEIXEIRA F et al. An evaluation of microbial leakage in roots filled with a termoplastic synthetic polymer-based root canal filling material (Resilon). J. Endod., 30 : 342-347, 2004. SHORROCK PJ, LAMBERT PA. Binding of fibronectin and albumin to Enterococcus (Streptococcus) faecalis. Microbiol. Pathogenesis., 6 : 61-67, 1989. SIQUEIRA Jr JF & GARCIA PF. Avaliação in vitro das propriedades seladoras de 3 cimentos endodônticos à base de hidróxido de cálcio. Rev. Bras. Odont., 51 : 37-40, 1994. SIQUEIRA Jr JF, MAGALHÃES FAC, UZEDA M. Avaliação da atividade antibacteriana de medicação intracanal. RGO., 44(5) : 271-274, 1996. SIQUEIRA Jr JF et al. Mechanical reduction of the bacterial cell number inside the root canal by three instrumentation techniques. J. Endod., 25 : 332-335, 1999. SIQUEIRA Jr JF, ROÇAS IN, FAVIERI A et al. Chemomechanical reduction of the bacterial population in the root canal after instrumentation and irrigation with 1%, 2,5% and 5,25% sodium hypochlorite. J. Endod., 26(6) : 331-334, 2000.

75

SIQUEIRA Jr JF, ROÇAS IN. Polymerase chain reaction-based analysis of microrganism associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., 97(1) : 85-94, 2004. SIREN EK, HAAPASALO MP, RANTA K, SALMI P, KEROSUO EN. Microbiological findings and clinical treatment procedures in endodontic cases selected for microbiological investigation. Int. Endod. J., 30(2) : 91-95, 1997. SPRATT DA, PRATTEN J, WILSON M, GULABIVALA K. An in vitro evaluation of the antimicrobial efficacy of irrigants on biofilms of root canal isolates. Int. Endod. J., 34 : 300-307, 2001. SUKAWAT C, SRISUWAN T. A comparison of the antimicrobial efficacy of the three calcium hydroxide formulations on human dentin infected with Enterococcus faecalis. J. Endod., 28 : 102-104, 2002. SUNDQVIST G, FIGDOR D, PERSSON S et al. Microbiologic analysis of teeth with failled endodontic treatment and the outcome of conservative retreatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., 85 : 86-93, 1998. SUSMUTH SD, MUSCHOLL-SILBERPORN A, WIRTH R, SUSA M, MARRE R, ROZDZINSKI E. Aggregation substance promotes adherence, phagocytosis and intracellular survival of Enterococcus faecalis within human macrophages and suppresses respiratory burst. Infect. Immun., 68 : 4900-4906, 2000. SUPPOLA JP, VOLIN L, VALTONEN V V, VAARA M. Overgrowth of Enterococcus faecium in the feces of patients with hematologic malignancies. Clin. Infect. Dis., 23 : 694-697, 1996. TANRIVERDI F et al. An in vitro test model for investigacion of desinfection of dentinal tubules infected with Enterococcus faecalis. Brazilian Dental Journal., 8(2) : 67-72, 1997. TEIXEIRA LM, FACKLAM RR. Enterococcus. In : Murray BE, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology 8ª ed. American Society for Microbiology Press. Washington DC, EUA. 422-433, 2003. TENG F, WANG L, SING KV, MURRAY BE, WEINSTOCK GM. Involvement of PhoP-Phos homologs in Enterococcus faecalis virulence. Infect. Immun., 70 : 1991-1996, 2002. TOMAYKO JF, MURRAY BE. Analysis of Enterococcus faecalis isolates from intercontinental sources by multilocus enzyme electrophoresis and pulsedfield electrophoresis. J. Clin. Microbial., 33 : 2903-2907, 1995. TORABINEJAD M, SHABAHANG S, APRECIO RM et al., The antimicrobial effect of MTAD : an in vitro investigacion. J. Endod., 29 : 400-403, 2003.

76

TRONSTAD L, ANDREASEN J, HASSELGREN G, KRISTERSON L, RIIS I. Ph change in dental tissues after root filling with calcium hydroxide. Int. Endod. J., 7 : 17-21, 1981. VAHDATY A, PITT FORD TR, WILSON FR. Efficacy of chlorhexidine in desinfecting dentinal tubules in vitro. Endod. Dent. Traumatol., 9(6) : 243-248, 1993. VASSILIADIS LP, et al. Depth of penetracion and appearance of Grossman Sealer in the dentinal tubules : an in vitro study. J. Endod. 20 : 373-376, 1994. WALTON RE. Histologic evaluation of different methods of enlarging the pulp space. J. Endod., 2 : 304-311, 1976. WEINE FS. Endodontic Therapy. 5ª ed. St. Louis : Mosby, 1996. WELLS CL, MOORE EA, HAAG JA, HIRT H, DUNNY GM, ERLANDSEN SL. Inducible expression of E. faecalis aggregation substance protein facilitates bacterial internalization by cultured enterocytes. Infect. Immun., 68 : 7190-7194, 2000. WHITESIDE M, MOORE J, RATZAN K. An investigation of enterococal bacteremia. Am J. Infect. Control., 11 : 125-129, 1983. YANG KS, FONG YT, LEE HY, KURUP A, KOH TH, KOH D, LIM MK. Predictors of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) carriage in the first major VRE outbreak in Singapore. Ann. Acad. Med. Singapore., 36(6) : 379-383, 2007. ZAREBA TW, PASCU C, HRYMEWICZ W, WADSTROM T. Binding of extracellular matrix proteins by enterococci. Curr. Microbiol., 34 : 6-11, 1997. ZERVOS MJ, DEMBINSKI S, MIKESELL TS, SCHABERG DR. High level resistance to gentamycin in Streptococcus faecalis : risk factors and evidence for exogenous acquisition of infection. J. Infect. Dis., 153 : 1057-1083, 1986. ZOLETTI GO, SIQUEIRA Jr JF, SANTOS KRN. Identification of Enterococcus faecalis in root-filled teeth with periradicular lesions by culture dependent and independent approaches. J. Endod., 32(8) : 722-726, 2006.

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FICHA DE EXAME DA PESQUISA INTITULADA "ISOLAMENTO DE

:MICRORGANISMOS AERÓBIOS E ANAERÓBIOS FACULTATIVOS DE INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS"

Anexo 2

NOME :

ENDEREÇO:

TELEFONE:

1- DENTE:

2- SINTOMATOLOGIA. (PRESENTE / AUSENTE)

3- DENTE VEIO ABERTO? SIM / NÃO.

4· CANAL PURULENTO? SIM / NÃO.

5 - CANAL COM ODOR? SIM / NÃO

6-PRESENÇA DE EDEMA? SIM / NÃO

7- PRESENÇA DE FÍSTULA? SIM / NÃO

8- DATA DA COLETA.

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