Priscila Madi Salloum -...
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i Priscila Madi Salloum Estrutura genética de populações de Echinolittorina lineolata (Mollusca:Gastropoda) em São Paulo Campinas, 2015
Transcript of Priscila Madi Salloum -...
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Priscila Madi Salloum
Estrutura genética de populações de Echinolittorina lineolata
(Mollusca:Gastropoda) em São Paulo
Campinas, 2015
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Este exemplar corresponde à
redação final da DISSERTAÇÃO
defendida pela candidata
PRISCILA MADI
SALLOUM
e orientada pela Profª. Dra. Vera
Nisaka Solferini.
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Resumo
A estrutura genética de populações marinhas pode ser avaliada de dois modos: espacial e
temporal. Nesse ambiente, fatores diferentes funcionam como barreiras ao fluxo gênico
para espécies distintas, apesar da expectativa de que animais com grande capacidade de
dispersão apresentem populações panmíticas ao longo de sua distribuição. Echinolittorina
lineolata (D’Orbigny 1840) é um gastrópode comum na costa brasileira e que apresenta
larvas com elevada capacidade de dispersão, sendo um interessante modelo para avaliar
estrutura genética em ambiente marinho. Este trabalho utilizou abordagens espacial e
temporal para avaliar a variabilidade genética e a estrutura populacional de E. lineolata em
duas praias do estado de São Paulo. Quatro coletas de juvenis dessa espécie foram feitas em
intervalos de 40 dias; três regiões do DNA mitocondrial foram utilizadas como marcadores
moleculares, sendo duas regiões do gene citocromo-b (Cyt-b) e uma do gene citocromo
oxidase I (CO-1). Os índices de diversidade haplotípica e nucleotídica foram baixos, o que
é semelhante a outras espécies marinhas. Redes de haplótipo, análises de variância
molecular e a estatística FST evidenciaram estrutura genética entre amostras das duas praias
(espacial) e entre amostras das quatro coletas (temporal). Dois fatores foram considerados
como prováveis geradores da estrutura genética observada nesses juvenis de E. lineolata:
variações geográficas ou oceanográficas locais e variância no sucesso reprodutivo.
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Abstract
The genetic structure of marine populations can be evaluated by two modes: spatial and
temporal. In this environment, different factors work as barriers to gene flow for different
species, although animals with high dispersal ability are expected to present panmitic
populations along their range. Echinolittorina lineolata (D’Orbigny 1840) is a common
gastropod on the Brazilian coast and has larvae with high dispersal ability, being an
interesting model to evaluate genetic structure in the marine environment. This work used
spatial and temporal approaches to evaluate the genetic variability and population structure
of E lineolata in two beaches of the São Paulo state. Four collections of juveniles were
done in 40-days intervals; three regions of the mitochondrial DNA were used as molecular
markers: two from cytochrome-b gene (Cyt-b) and one from cytochrome oxidase I gene
(CO-1). The haplotype and nucleotide diversity indexes were low, similar to other species.
Haplotype networks, analyses of molecular variance and FST statistics indicated genetic
structure among the two beaches’ samples (spatial) and among the four collections’
samples (temporal). Two factors were considered as likely drivers of the observed genetic
structure on these juveniles: local geographic or oceanographic variations and variance in
the reproductive success.
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xi
SUMÁRIO
Resumo ..................................................................................................................... vii
Abstract ..................................................................................................................... ix
Dedicatória ................................................................................................................ xv
Agradecimentos ......................................................................................................... xvii
1. Introdução............................................................................................................ 1
1.1 Estrutura genética em ambiente marinho ...................................................... 2
1.1.1 Grande escala .................................................................................... 2
1.1.2 Escala local ....................................................................................... 4
1.2 Estrutura genética em moluscos, litorinídeos e Echinolittorina lineolata ... 5
2. Objetivos ............................................................................................................ 10
3. Material e métodos ............................................................................................. 11
3.1 Local de coleta e amostragem....................................................................... 11
Figura 1: Locais de coleta ............................................................................ 12
3.2 Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento ...................... 13
3.2.1 Desenho de novos iniciadores .......................................................... 13
3.2.2 Sequenciamento ............................................................................... 14
3.3 Análises estatísticas ..................................................................................... 14
3.3.1 Desenho das análises ....................................................................... 15
3.3.1.1 Padrão geral ............................................................................... 15
3.3.1.2 Comparações no espaço (entre praias) ...................................... 15
3.3.1.3 Comparações no tempo ............................................................. 16
Figura 2: Amostras .................................................................... 17
4. Resultados ......................................................................................................... 18
4.1 Coletas ........................................................................................................ 18
4.2 Novos inciadores, amplificação por PCR e sequenciamento ..................... 18
Tabela 1: Descrição dos novos iniciadores ................................................ 19
4.3 Análises estatísticas .................................................................................... 19
4.3.1 Diversidade genética ...................................................................... 19
Tabela 2: Índices de diversidade molecular ............................................... 19
Figura 3: Redes de haplótipos .................................................................... 20
xii
4.3.2 Comparações no espaço (entre praias) ........................................... 20
4.3.2.1 Todas as amostras (Juquehy x Guaecá) ................................... 20
Tabela 3: Índices de diversidade molecular por praia ......................... 20
Tabela 4: AMOVAs Juquehy x Guaecá .............................................. 21
Tabela 5: FST par a par Juquehy x Guaecá ........................................... 21
4.3.2.2 Entre amostras de cada uma das coletas .................................. 22
Tabela 6: AMOVAs para amostras agrupadas por praia e
data de coleta ....................................................................................... 24
Tabela 7: FST par a par para cada coleta, região gênica
Cyt-b 1 ................................................................................................. 24
Tabela 8: FST par a par para coleta 4, região gênica CO-1 .................. 25
4.3.3 Comparações no tempo .................................................................. 25
4.3.3.1 Juquehy ................................................................................... 25
Tabela 9: AMOVAs por data de coleta em Juquehy .......................... 25
Tabela 10: FST par a par para amostras de Juquehy por data
de coleta .............................................................................................. 26
4.3.3.2 Guaecá ..................................................................................... 26
Tabela 11: AMOVAs por data de coleta em Guaecá ......................... 26
Tabela 12: FST par a par para amostras de Guaecá por
data de coleta ...................................................................................... 27
5 Discussão ........................................................................................................... 28
5.1 Diversidade genética ................................................................................. 28
5.2 Comparações no espaço (entre praias) ..................................................... 30
5.2.1 Todas as amostras de cada praia (Juquehy x Guaecá) .................. 30
5.2.2 Entre amostras de cada coleta ....................................................... 31
5.2.3 Entre rochas da mesma praia ........................................................ 31
5.3 Comparações no tempo ............................................................................. 32
5.3.1 Juquehy ......................................................................................... 32
5.3.2 Guaecá .......................................................................................... 32
6 Conclusão ......................................................................................................... 35
7 Referências ....................................................................................................... 36
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8 Anexos .............................................................................................................. 45
Anexo 1: Condições de realização das reações de amplificação (PCR) ........ 45
A1: Região gênica Cyt-b 1 .......................................................................... 45
A1.1 Condições ............................................................................... 45
A1.2 Ciclo de temperaturas para amplificação ............................... 45
A2: Região gênica Cyt-b 2 .......................................................................... 46
A3: Região gênica CO-1 ............................................................................. 46
Anexo 2: Índices de diversidade molecular por praia por coleta .................. 47
Tabela 13: Índices de diversidade molecular por praia
por coleta ......................................................................................... 47
Anexo 3: Informações sobre a região gênica Cyt-b 2 ................................... 48
Tabela 14: Sumário dos indivíduos que apresentam cada
haplótipo da região Cyt-b 2 ............................................................. 48
Tabela 15: Sequência de nucleotídeos de cada
haplótipo da região Cyt-b 2 ............................................................. 49
xiv
xv
Dedico este trabalho
A todos os que me apoiaram, cada um à sua maneira;
A todos os que amo e que me amam, cada um a seu modo;
A todos os que me propiciaram momentos inesquecíveis, cada um de uma forma.
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Agradecimentos
À minha orientadora, Profa. Dra. Vera Solferini, pela ótima orientação, por me direcionar
nos momentos que me perdi, por ter lido as várias versões de meus manuscritos, me
acalmar nos momentos de ansiedade e me acelerar nos momentos de calmaria, permitindo
com que eu experimentasse o início da vida acadêmica;
À Dra. Sónia Andrade, pelo apoio durante todo o desenrolar da trama, muitas vezes
fazendo com que a trama realmente desenrolasse;
Aos meus ajudantes de coleta, João Vitonis, Carolina Lemes e Jair Mendes, por tomarem
chuva e sol, ficarem horas escorados em pedras do costão rochoso, fugindo das ondas e do
vento, morrendo de frio ou derretendo de calor. Sem vocês, este trabalho jamais teria
acontecido;
Aos meus companheiros de laboratório, Elen, Tadeu, João, Jair, Cecília, Nathalia,
Fernanda, Luiz Felipe, Chico, Henrique, Beatriz, Camila e Rafael, por tornarem o ambiente
de trabalho um local agradável e por me ajudarem sempre que precisei;
À Célia Bresil, melhor técnica e companheira de trabalho que alguém poderia querer. Sua
ajuda foi essencial;
À Dra. Juliana José, pelo apoio na etapa inicial do trabalho;
Aos membros da banca de qualificação e pré-banca, Prof. Dr. Louis Bernard, Dra. Sónia
Andrade e Dr. Marcos Roberto Batista, pelos ótimos comentários e observações;
À Maria de Lourdes Fagundes, pelo excelente trabalho junto à secretaria da pós-
graduação em Genética e Biologia Molecular e pela atenção prestada a mim desde antes do
início deste trabalho;
À Capes e à Fapesp, pela bolsa de mestrado;
A toda a minha família, pelo apoio e por me completarem como pessoa além do lado
profissional. Pela ajuda a encontrar meios para solucionar problemas e pelos momentos de
alegria e comemoração vividos juntos;
Aos meus amigos, pela ótima companhia e por me propiciarem longas conversas e boas
risadas;
Ao Airton, pelo companheirismo e cumplicidade. Pelo “John”, mixer que tanto facilitou
meu trabalho na bancada. E pela paciência de ouvir (claro que muitas vezes sem escutar)
meus discursos infindáveis sobre o mestrado.
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1
1. Introdução
Uma população é considerada panmítica quando os indivíduos acasalam de modo
aleatório, ou seja, o acasalamento é igualmente provável entre todas as combinações
macho-fêmea. Esta uniformidade é inexistente em muitos casos, como em grandes
populações nas quais as chances de acasalamento são desiguais entre os indivíduos. Assim,
uma população pode estar dividida em unidades menores com frequências alélicas que se
diferenciam com o passar do tempo devido à limitação do fluxo gênico (Wright 1930,
1951). Esta heterogeneidade nas frequências alélicas de uma população gera o que se
conhece por estrutura genética.
Vários fatores temporais, comportamentais e geográficos podem atuar no sentido de
reduzir o fluxo gênico, resultando em estrutura genética (Hamilton 2009). Alguns exemplos
são seleção natural, processos aleatórios na transmissão de alelos ao longo das gerações, e
diferenças aleatórias nas frequências alélicas dos fundadores de uma população (Hartl &
Clark 2007).
Determinar a estrutura genética de populações naturais compõe parte importante da
genética de populações e possui várias aplicações na biologia evolutiva, conservação,
genética forense, cultivo de plantas e criação de animais (Meirmans & Hedrick 2011). A
estrutura genética pode ser acessada por análises das frequências alélicas e da distribuição
da variabilidade genética entre populações, o que se tornou comum após o surgimento da
eletroforese de proteínas, na década de 1960 (Bohonak 1999).
Há duas abordagens a se considerar na avaliação da estrutura genética de populações:
espacial e temporal. Na primeira, busca-se identificar como a variabilidade genética se
distribui geograficamente nas populações, observando se indivíduos de lugares distintos
possuem frequências alélicas diferentes (exemplos desta abordagem são Gallardo &
Carrasco 1996, Lebret et al. 2013, Ovčarenko et al. 2014, Tiroesele et al. 2014). Já na
abordagem temporal, o objetivo é identificar como a variabilidade genética se distribui nas
populações ao longo do tempo, ou seja, verificar se há variação nas frequências alélicas em
diferentes momentos (exemplos desta abordagem são Hogan et al. 2010, Qiu et al. 2013,
Liang et al. 2014).
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Na abordagem espacial, a estrutura genética é geralmente atribuída a fatores como:
isolamento por distância, adaptação genética (seleção natural), fronteiras biogeográficas,
comportamentos intrínsecos da espécie e eventos históricos (Orsini et al.2013, Fields &
Taylor 2014). Na abordagem temporal, a estrutura genética já foi relacionada a causas
como: existência de indivíduos com diferentes épocas reprodutivas na mesma região,
seleção natural temporalmente variável, e efeitos transientes do ambiente responsáveis por
formar barreiras temporárias ao fluxo gênico (Tracey et al.1975, Hendry & Day 2005,
Skoglund et al. 2014).
Muitas vezes, é difícil discriminar entre fatores que geram estrutura genética espacial e
temporal, além de que ambos podem influenciar concomitantemente na distribuição da
variabilidade genética em populações naturais (Kesäniemi et al. 2014). Por isso, para
acessar a estrutura genética em populações naturais é importante considerar os dois tipos de
abordagem, espacial e temporal (Calderón et al. 2012).
1.1 Estrutura genética em ambiente marinho
Muitos esforços para entender a relação entre fluxo gênico e estrutura genética foram
provenientes de estudos com organismos marinhos (Bohonak 1999). Esses organismos
detêm características interessantes para estudos de estrutura populacional, como variação
no comportamento larval, tempo e modo de desenvolvimento. Por exemplo, animais
marinhos pelágicos ou com larvas pelágicas possuem grande capacidade de dispersão, o
que deve resultar em elevado fluxo gênico entre as populações e conduzi-las à
homogeneidade genética (Hedgecock 1994, Palumbi 1994, Hellberg et al. 2002).
No contexto marinho, a variabilidade genética entre as populações pode ser estudada em
grande escala e em escala local:
1.1.1 Grande escala
Abrange milhares de quilômetros e considera boa parte da distribuição da espécie.
3
Nesta escala, há vários exemplos de espécies com fase pelágica apresentando
homogeneidade genética em suas populações, conforme o esperado (Gallardo & Carrasco
1996, Kyle & Boulding 2000, Collin 2001, Kelly & Palumbi 2010, Díaz-Ferguson et al.
2012). Entretanto, há espécies com fase pelágica que apresentam estrutura genética
populacional, como cracas, gastrópodes, bivalves, caranguejos, ermitões, ouriços e peixes
(Evans et al. 2004, Hogan et al. 2010, Kelly & Palumbi 2010, Calderón et al. 2012, Díaz-
Ferguson et al. 2012, Pespeni & Palumbi 2013).
A abordagem mais utilizada em análises nessa escala é a espacial, como feito por Baird et
al. 2011, que avaliaram a diferenciação genética populacional em espécies de anfípodes ao
longo de toda a Antártida.
Apesar de menos frequentes, há exemplos de abordagens temporais, nas quais as espécies
apresentam frequências alélicas que variam mais intensamente no tempo que no espaço,
mesmo tendo sido avaliadas por muitos quilômetros. O peixe Stegastes partitus foi
amostrado em 10 localidades ao longo de 200 quilômetros e o tempo se mostrou mais
influente que o espaço na diferenciação genética de suas populações (Hogan et al. 2010).
No ambiente marinho, é difícil generalizar sobre as causas da diferenciação genética em
grande escala, mas Palumbi (1994) ressaltou prováveis barreiras ao fluxo gênico que
poderiam levar à estrutura genética, como padrões de circulação oceânica, isolamento por
distância, seleção natural, limites comportamentais à dispersão (relacionados a
características intrínsecas de cada espécie) e eventos históricos. As três primeiras barreiras
podem influenciar a dispersão dos adultos, fazendo com que eles fiquem restritos a
determinadas localidades por não serem capazes de se movimentar além delas, ou com que
o fluxo gênico seja reduzido como consequência de adaptação genética local (Selkoe et al.
2006, Kelly & Palumbi 2010, Orsini et al. 2013). Os limites comportamentais se referem a
peculiaridades como homming, territorialismo ou outros comportamentos reprodutivos
singulares, que podem levar à redução de fluxo gênico e influenciar na estrutura genética
das populações (Byrne et al. 2013). Os eventos históricos, como mudanças climáticas ou
topográficas, já foram relacionadas com a estrutura genética apresentada por algumas
espécies (Janko et al. 2007, Baird et al. 2011).
4
Considerando organismos com fase larval pelágica, a dispersão das larvas e o seu
comportamento podem influenciar na estrutura genética das populações. Espera-se que
quanto maior o tempo de permanência das larvas no plâncton, maior será a sua capacidade
de dispersão, embora esta relação seja improvável em várias espécies (Kelly & Palumbi
2010). As fontes de larvas também influenciam as frequências alélicas das populações,
sendo que essas fontes podem mudar devido a processos de transporte aleatórios, gerando
estrutura genética entre populações (Hogan et al. 2010).
1.1.2 Escala local
Abrange apenas alguns metros e considera uma pequena porção da distribuição da
espécie.
Nesta escala, é comum que espécies sem desenvolvimento pelágico apresentem
populações vizinhas com diferenciação genética, por causa da maior dificuldade de
colonizar habitats distantes e da desconexão entre os habitats (Hellberg et al. 2002). Alguns
gastrópodes, pepinos do mar e crustáceos isópodes, todos com reduzida capacidade de
dispersão, apresentam estrutura genética populacional em escala local (Kyle & Boulding
2000, Collin 2001, Johhanesson et al. 2004, Kelly & Palumbi 2010). Contudo, há espécies
com grande capacidade de dispersão que possuem populações vizinhas com diferenciação
genética, o que é intrigante por causa da magnitude do fluxo gênico esperada e,
principalmente, porque em muitos destes casos a diferenciação genética desaparece em
grande escala (Hedgecock 1994, Kyle & Boulding 2000, Hellberg et al. 2002, Hepburn et
al. 2009). Além disso, populações que supostamente deveriam estar em equilíbrio de
Hardy-Weinberg apresentam deficiência de heterozigotos em alguns locos gênicos (Tracey
et al. 1975, Gaffney et al. 1990, Brownlow et al. 2008). Essas incongruências enfatizam a
necessidade de se esclarecer os processos relacionados à distribuição da variabilidade
genética nas populações naturais.
A aplicação da abordagem espacial em escala local permite obter informações de estrutura
genética entre populações proximamente localizadas e explicar diferentes cenários, como
quando há atuação de seleção natural ou quando houve efeito Wahlund (Hedgecock 1994,
Hellberg et al. 2002). Já a abordagem temporal é capaz de indicar variações de frequências
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alélicas ao longo do tempo em populações vizinhas, o que pode ser causado por existência
de épocas reprodutivas distintas ou variação no sucesso reprodutivo (Hendry & Day 2005,
Lee & Boulding 2009). Quando as duas abordagens são utilizadas em conjunto, é possível
identificar se são fatores espaciais ou temporais que exercem maior papel na indução de
diferenciação genética (Lee & Boulding 2009).
1.2 Estrutura genética em moluscos, litorinídeos e Echinolittorina lineolata
Diversos moluscos são utilizados como modelos para avaliar a estrutura genética de
populações, já que possuem hábitos de vida variados e diferentes formas de
desenvolvimento (direto, lecitotrófico ou planctotrófico). Além de maior compreensão da
estrutura genética das populações, estudos com estes animais têm evidenciado
características físicas e dinâmicas temporais que podem influenciar na dispersão das larvas
de diversas espécies. Um exemplo é Lottia digitalis, gastrópode com larvas pelágicas que
apresenta estrutura genética ao longo da costa da Califórnia (Kelly & Palumbi 2010). Uma
avaliação desta espécie em escala espacial mostrou que o transporte de larvas na água é
provavelmente limitado por condições de circulação oceanográfica no momento da desova,
restringindo a dispersão larval de L. digitalis e explicando a estrutura genética neste caso
(Kelly & Palumbi 2010).
O gastrópode Haliotis iris, o mexilhão dourado Limnoperna fortunei, a ostra Ostrea
edulis e o gastrópode Colisella subrugosa constituem outros exemplos de moluscos
utilizados como modelos em estudos de estrutura genética (José 2003, José & Solferini
2007, Taris et al. 2009, Will et al. 2011, Ghabooli et al. 2013). No caso de H. iris, a
diferenciação genética observada em suas populações permitiu que Will et al. (2011)
detectassem quatro barreiras filogeográficas ao longo da Nova Zelândia que influenciam na
dispersão larval deste gastrópode e provavelmente de outras espécies; já para o mexilhão
dourado, espécie invasora que se espalhou pelo mundo a partir da Ásia, múltiplos eventos
de introdução, intensa seleção natural e efeitos demográficos aleatórios podem ter
contribuído para gerar a estrutura genética em escala local observada com maior
intensidade nas populações introduzidas do que nas populações nativas (Ghabooli et al.
2013); na França, a ostra O. edulis apresenta estrutura genética ao longo do tempo, o que
pode estar relacionado à variância no sucesso reprodutivo interagindo com a biologia
6
reprodutiva da ostra somada a condições ambientais (Taris et al. 2009); quanto ao
gastrópode C. subrugosa, José (2003) e José & Solferini (2007) utilizaram abordagens
espacial e temporal para avaliar sua estrutura genética, o que permitiu maior entendimento
da dinâmica da distribuição da variabilidade genética nessa espécie: C. subrugosa possui
populações geneticamente homogêneas por amplas distâncias, apesar de que tais
populações apresentam deficiência de heterozigotos (José & Solferini 2007). Em escala
local, esses moluscos detém estrutura genética ao longo do tempo. José (2003) propôs que
processos de fertilização não aleatória e “erros de amostragem” (amostragem de uma
população desconhecendo suas subdivisões) são prováveis causas para a variação das
frequências alélicas ao longo do tempo, e que a variação genética temporal acumulada entre
as gerações pode ter resultado em deficiência de heterozigotos nas análises em grande
escala.
Moluscos litorinídeos (família Littorinidae) são bem representados em estudos de
estrutura populacional e variabilidade genética, o que pode ser devido a sua abundância,
diversidade e modos de vida. Utilizando esses organismos, Lee & Boulding (2009)
avaliaram a relação entre estrutura genética e modo de desenvolvimento larval, observando
que é mais provável existir variação genética ao longo do tempo em espécies com larvas
pelágicas do que em espécies com desenvolvimento direto. Isso foi relacionado ao fato de
que espécies com larvas pelágicas geralmente apresentam elevada fecundidade, elevada
capacidade de dispersão e reduzida sobrevivência nos primeiros estágios do
desenvolvimento, sendo que a interação entre esses fatores pode gerar estrutura genética ao
longo do tempo (Lee & Boulding 2009).
Os litorinídeos se distribuem por amplas distâncias, desempenhando importantes papéis
nas comunidades litorâneas. Sua alimentação é à base de algas unicelulares, líquens e
esporos recém-estabelecidos de macroalgas (Reid 1989). São animais dioicos, com
fertilização interna e podem apresentar os três tipos de desenvolvimento (Reid 1989, Reid
1996, Andrade 2000). Há espécies de litorinídeos em que as fêmeas são fertilizadas por
vários machos (poliandria), podendo armazenar espermatozoides no receptáculo seminal
por cerca de um ano (Zahradnik et al. 2008, Rafajlovic et al. 2013). São animais que
habitam mangues ou regiões entre marés de costões rochosos, locais que apresentam grande
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heterogeneidade ambiental. Mais especificamente, os costões rochosos estão submetidos a
extremas variações ambientais, especialmente na zona entre marés, onde flutuações de
temperatura e de salinidade, ação das ondas e incidência de radiação se associam a
transições na distribuição dos organismos, à predação e à interações interespecíficas. A
heterogeneidade ambiental pode refletir-se em elevada variabilidade genética nos
organismos e influenciar na estrutura genética das populações (Powell 1971, Mitchell-Olds
1992, Johannesson et al. 2004).
Littoraria flava é um exemplo de litorinídeo habitante de costões rochosos brasileiros e
com variabilidade e estrutura genética bem documentadas. Esses animais apresentam
elevados índices de diversidade genética e estrutura genética reduzida por amplas
distâncias, conforme o esperado em espécies de ambientes heterogêneos com ampla
capacidade de dispersão (Andrade et al. 2003). Contraditoriamente, L. flava possui
deficiência de heterozigotos em muitos locos de isozimas (Andrade et al. 2005). Em escala
local, L. flava apresenta estrutura genética entre populações proximamente localizadas
(Andrade & Solferini 2007). Os padrões observados em L. flava podem ter sido causados
por seleção natural em equilíbrio com desovas dessincronizadas e colonizações recorrentes
(Andrade & Solferini 2007).
Assim como em L. flava, a espécie Echinolittorina lineolata não apresenta estrutura
genética em grande escala, apesar de possuir deficiência de heterozigotos em vários locos
de isozimas em suas populações (Andrade et al. 2003, 2005). Uma hipótese proposta para
explicar esse desvio é que ele pode ter sido causado pela existência de múltiplos grupos de
acasalamento em uma população, gerando efeito Wahlund (Andrade et al. 2005).
E. lineolata é uma espécie do gênero Echinolittorina Habe, 1956. Este é o maior gênero
entre os litorinídeos, com 60 espécies viventes conhecidas, radiadas mundialmente em
regiões tropicais (Williams & Reid 2004, Reid 2011). Apenas duas espécies de
Echinolittorina são encontradas na costa brasileira (aproximadamente 8000 quilômetros):
E. lineolata, encontrada em costões rochosos de toda a costa do Brasil; e E. vermeiji, com
distribuição restrita às ilhas Atol das Rocas, Fernando de Noronha e Ilha de Trindade (Leal
1991, Williams & Reid 2004).
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E. lineolata apresenta grandes populações, fertilização interna, adultos bentônicos e
desenvolvimento larval planctotrófico (Williams & Reid 2004, Andrade et al. 2005). Seu
estágio larval, bem como de todo o gênero, tem duração aproximada de quatro semanas,
estimativa baseada no crescimento em laboratório da espécie E. hawaiiensis e na
uniformidade das conchas larvais de todas as espécies (Williams & Reid 2004). As larvas
podem se dispersar por cerca de 1400 quilômetros, o que foi inferido a partir da
identificação de populações além dos limites normais de ocorrência das espécies de
Echinolittorina (Williams & Reid 2004).
O presente trabalho utilizou E. lineolata como modelo para avaliar a variabilidade
genética em marcadores mitocondriais e estrutura genética no espaço e no tempo em escala
local, buscando informações que possam complementar os dados já existentes sobre a
espécie, contribuir para a explicação da deficiência de heterozigotos anteriormente
detectada em isozimas e servir de comparação para vários outros organismos com
características semelhantes.
Em espécies com grande capacidade de dispersão, pode-se utilizar marcadores genéticos
do DNA mitocondrial (mtDNA) para detectar estrutura genética em populações vizinhas,
buscando determinar quais fatores são responsáveis pela distribuição da variabilidade
genética (exemplos: Lee & Boulding 2009, Iacchei et al. 2013, D’Aloia 2014). Os
marcadores do mtDNA são sequências polimórficas, de evolução rápida, e permitem alta
resolução em estudos de estrutura genética populacional (Avise 1991, Kyle & Boulding
2000). Apresentando variações neutras, o genoma mitocondrial é haploide e herdado
maternalmente na maioria das espécies, por isso o tamanho efetivo populacional estimado
com marcadores mitocondriais deve ser um quarto do estimado com marcadores nucleares,
amplificando os efeitos de deriva genética (Kyle & Boulding 2000).
Os genes mitocondriais citocromo oxidase subunidade I (CO-1) e o citocromo b (Cyt-b)
são comumente utilizados como marcadores moleculares em litorinídeos (Reid 1996, Kyle
& Boulding 2000, Williams & Reid 2004, Lee & Boulding 2009, Díaz-Ferguson et al.
2012). O CO-1 parece ser um dos genes codificadores de proteínas mais conservados do
genoma mitocondrial animal, sendo informativo principalmente em nível de espécie
(Folmer et al. 1994). Já o Cyt-b apresenta uma taxa de substituição de nucleotídeos mais
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acelerada que o CO-1, sendo suficiente para estudos de moluscos em nível
intrapopulacional (Merritt et al. 1998). Empregando esses genes como marcadores em E.
lineolata, os objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar a variabilidade genética de juvenis
de E. lineolata no espaço e no tempo em escala local e; (ii) identificar possíveis subdivisões
populacionais de E. lineolata com abordagem espacial e temporal em escala local.
10
2. Objetivos
O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética de juvenis de E. lineolata,
bem como possíveis subdivisões populacionais, com abordagens espacial e temporal em
escala local, utilizando três regiões do DNA mitocondrial como marcadores moleculares.
11
3. Material e Métodos
O estudo foi feito com Echinolittorina lineolata, a única espécie do gênero que ocorre na
costa continental do Brasil e que é de fácil identificação.
3.1 Local de coleta e Amostragem
As praias determinadas para realização do estudo foram Juquehy (S 23°46.277’, O
45°43.307’) e Guaecá (S 23°49.220’, O 45°28.130’), devido a sua facilidade de acesso e
utilização anterior em estudos com litorinídeos (exemplos: Andrade et al. 2005, Andrade &
Solferini 2007). Essas praias distam 42 quilômetros entre si e localizam-se no litoral norte
do estado de São Paulo, sendo integrantes do município de São Sebastião (figura 1). Em
frente à costa de São Sebastião localiza-se a Ilha de São Sebastião, separada do continente
por um canal com 25 quilômetros de extensão e largura variável entre 7 e 2 quilômetros
(Alves 2012). Este canal possui intensa circulação de embarcações e atividade petrolífera.
A praia de Guaecá encontra-se na região costeira próxima à ilha e ao canal. Já Juquehy está
mais distante do canal e situa-se praticamente a sudoeste de Guaecá. Quanto à circulação de
água superficial na região do canal, Silva et al. 2004 observou que ela segue o sentido
sudoeste nos meses de primavera, verão e inverno, invertendo-se para nordeste nos meses
de outono. A ACAS (Água Central do Atlântico Sul) entra pela parte sul do canal nos
meses de primavera e verão, se aproximando da costa e influenciando tanto na salinidade
quanto na temperatura local; já nos meses de outono e inverno, não há vestígios da ACAS
no canal (Silva et al. 2004).
Quanto aos costões rochosos de coleta dos animais (esquerdo em Juquehy e direito em
Guaecá), o de Juquehy apresenta características de um costão protegido em sua
extremidade mais próxima da areia, com rochas arredondadas e desconectadas. Porém, em
sua extremidade mais próxima ao mar, este costão apresenta rochas mais íngremes e em
formato de parede, se assemelhando a um costão desprotegido. Guaecá apresenta costão
com grandes rochas arredondadas e desconectadas, com características de protegido.
12
Figura 1 Locais de coleta (escalas aproximadas e em quilômetros). (Google Earth. Acesso
em 10 de novembro de 2014).
As coletas foram feitas entre junho e novembro de 2012. Os indivíduos foram coletados
nas regiões de rochas desconectadas, diminuindo a possibilidade de movimentação dos
adultos de E. lineolata entre rochas. Em cada praia, seis rochas foram escolhidas na zona
entre marés e marcadas com cola epóxi e botões coloridos.
Uma visita preparatória dos locais de estudo foi feita em junho de 2012, na qual todos os
indivíduos de E. lineolata foram removidos das rochas escolhidas. Em julho, setembro,
outubro e novembro, respeitando intervalos de 40 dias, as rochas foram reexaminadas e
todos os juvenis foram removidos. Apenas os juvenis foram utilizados nas análises. Este
esquema amostral e a utilização apenas de juvenis tiveram o objetivo de diminuir a
influência da mistura de haplótipos de várias gerações acumuladas entre os adultos.
Todas as coletas foram feitas em períodos de maré baixa. Os indivíduos foram
identificados por morfologia externa, com auxílio de lupa binocular. De cada rocha, 45
indivíduos foram armazenados em nitrogênio líquido.
0 10
Juquehy
Guaecá
Ilha de
São Sebastião
0 500
São Sebastião
13
3.2 Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento
O DNA de 8 a 15 indivíduos por rocha de cada coleta foi extraído com kit Wizard
(Promega), utilizando os organismos inteiros e seguindo as recomendações do fabricante. O
DNA extraído foi purificado antes das reações de amplificação (PCR), usando o kit
ilustraTM
GFXTM
PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare – Life Sciences).
Três regiões do genoma mitocondrial foram amplificadas, primeiramente utilizando
iniciadores descritos na literatura:
- uma região do gene citocromo oxidase 1 (CO-1), utilizando iniciadores universais
que produzem um fragmento de aproximadamente 700 pares de base (Folmer et al. 1994).
- duas regiões do gene citocromo b (Cyt-b), utilizando dois pares de iniciadores que
produzem fragmentos de aproximadamente 250 e 230 pares de base em litorinídeos (Kyle
& Boulding 2000).
3.2.1 Desenho de novos iniciadores
Três novos pares de iniciadores foram desenhados especificamente para E. lineolata:
- CO-1: nenhuma das amplificações feitas com os iniciadores da literatura produziu
fragmentos confiáveis e, então, uma sequência parcial deste gene de E. lineolata foi obtida
no National Center for Biotechnology Information – NCBI (AJ622957.1) e a ferramenta do
NCBI foi utilizada para o desenho de um novo par de iniciadores;
- Cyt-b: as amplificações feitas com os iniciadores da literatura produziram poucas
sequências com boa qualidade. Essas sequências foram alinhadas no programa MEGA v.5
(Tamura et al. 2011) e manualmente editadas. Posteriormente, as sequências de melhor
qualidade foram utilizadas para o desenho de dois novos pares de iniciadores internos a
elas. Os novos iniciadores da região do Cyt-b foram desenhados no programa Primer3Plus
(Untergasser et al. 2007) e as duas sequências obtidas com eles não se sobrepõem.
Foi feita a padronização das reações de amplificação com os novos iniciadores, utilizando
técnicas de gradiente de concentração de reagentes e gradientes de temperatura. As
14
condições das reações de amplificação padronizadas e usadas para obtenção das sequências
deste estudo estão descritas no anexo.
3.2.2 Sequenciamento
Os fragmentos amplificados foram sequenciados no Laboratório de Biologia Molecular de
Plantas (CBMEG-UNICAMP), usando o kit BigDye terminator v 3.1 e sequenciador
automático (ABI PRISM 3730 DNA Analyzer – PE Applied Biosystems – HITACHI).
Neste trabalho, as sequências obtidas com o novo par de iniciadores para o CO-1 serão
chamadas “região CO-1” e aquelas obtidas com os novos iniciadores para o Cyt-b serão
chamadas de “região Cyt-b 1” e “região Cyt-b 2”, já que as duas sequências não se
sobrepõem.
3.3 Análises estatísticas
Todas as sequências de DNA das regiões CO-1, Cyt-b 1 e Cyt-b 2 foram alinhadas com o
programa MEGA v.5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, e Kumar 2011) e manualmente
editadas.
De cada indivíduo, as três regiões sequenciadas, alinhadas e editadas foram utilizadas nas
análises.
Os parâmetros de diversidade genética das amostras foram estimados com o programa
Arlequin 3.5 (Excoffier et al. 2005). Os índices estimados foram: número de haplótipos,
número de sítios polimórficos, diversidade haplotípica e diversidade nucleotídica. Para
comparar a diversidade haplotípica e nucleotídica foram aplicados testes de Kruskal-Wallis
com o programa Bioestat v.5.0 (Ayres & Ayres 2007).
Redes de haplótipos foram inferidas por median joining no programa Network (Bandelt et
al. 1999), para visualização das similaridades e diferenças entre os haplótipos presentes nas
amostras.
15
A existência de estrutura genética espacial foi avaliada com análises de variância
molecular (AMOVAs), feitas no programa Arlequin 3.5 (Excoffier et al. 2005), com 10000
permutações. As AMOVAs feitas neste programa analisam a variância de frequências
gênicas, e o número de mutações entre haplótipos é levado em consideração (Excoffier &
Lischer 2011). Os valores de FST retornados nestas mesmas análises também foram
considerados. Esses são valores de FST população-específicos, que permitem diferentes
níveis de divergência em uma única análise (Browning & Weir 2010, Excoffier & Lischer
2011). Estimativas de FST par a par foram feitas no programa Arlequin 3.5 (Excoffier et al.
2005). Este programa utiliza valores de FST par a par transformados que podem ser usados
como distâncias genéticas entre populações, computando também o número médio de
diferenças pareadas de Nei entre populações e dentro delas (Excoffier & Lischer 2011).
A existência de estrutura genética ao longo do tempo foi avaliada com AMOVAs
realizadas com 10000 permutações no programa Arlequin 3.5 (Excoffier et al. 2005). Os
valores de FST retornados nestas mesmas análises também foram considerados. Estimativas
de FST par a par foram feitas neste mesmo programa.
3.3.1 Desenho das análises
Foram determinados diferentes agrupamentos das amostras para realização das análises
estatísticas (figura 2).
3.3.1.1 Padrão geral
O padrão geral de diversidade genética foi obtido agrupando todas as amostras (das duas
praias, de todas as coletas). As redes de haplótipo também foram estimadas considerando
este agrupamento.
3.3.1.2 Comparações no espaço (entre praias)
A comparação entre as duas praias foi realizada considerando:
a) Todas as amostras de cada praia (Juquehy X Guaecá);
Os índices de diversidade molecular foram estimados para as amostras de Juquehy.
O mesmo foi feito para as amostras de Guaecá. Os testes de estrutura genética
16
foram feitos pela comparação de todas as amostras de Juquehy com as amostras de
Guaecá, desconsiderando a data de coleta das amostras.
b) Cada uma das coletas (J1XG1; J2XG2; J3XG3; J4XG4).
As amostras de Juquehy foram separadas por data de coleta, bem como as amostras
de Guaecá. Os índices de diversidade molecular foram estimados separadamente
para a primeira, para a segunda, para a terceira e para a quarta coleta de Juquehy. O
mesmo foi feito com as amostras de Guaecá. Os testes de estrutura genética foram
feitos pela comparação das amostras da primeira coleta de Juquehy com as amostras
da primeira coleta de Guaecá, seguido da comparação das amostras da segunda
coleta de Juquehy com as da segunda coleta de Guaecá, e assim sucessivamente.
Esse desenho foi utilizado com objetivo de diminuir a influência de fatores
temporais nessas análises, pois as comparações foram feitas entre amostras
coletadas na mesma data.
3.3.1.3 Comparações no tempo
As coletas de cada praia foram comparadas (J1XJ2XJ3XJ4; G1XG2XG3XG4).
Os testes de estrutura genética temporal foram feitos para as amostras de Juquehy e
Guaecá separadamente. Assim, as amostras da primeira, segunda, terceira e quarta coletas
de Juquehy foram comparadas. O mesmo foi feito com as amostras de Guaecá. Esse
desenho foi utilizado com o objetivo de diminuir a influência de fatores espaciais nas
análises, pois as comparações foram feitas entre amostras da mesma praia.
17
Figura 2 Amostras. Quadrado verde: amostras de Juquehy; Quadrado lilás: amostras de
Guaecá. Cada retângulo representa uma coleta em uma das praias. Cada círculo de mesma
cor representa uma rocha. J: rochas de Juquehy; G: rochas de Guaecá; 1,2,3 e 4: números
referentes às coletas 1, 2, 3 ou 4. Letras A, B, C, D, E e F: identificação de cada rocha.
18
4. Resultados
4.1 Coletas
O número de indivíduos removidos de cada rocha em cada coleta foi variável. Esses
indivíduos foram transportados ao Laboratório de Diversidade Genética no Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de Campinas, onde o número excedente foi
descartado.
4.2 Novos iniciadores, amplificação por PCR e sequenciamento
Os novos iniciadores permitiram amplificações efetivas das sequências de interesse
(tabela 1). Todas as sequências das regiões Cyt-b 1 e CO-1 foram depositadas em um
“PopSet” no NCBI (accession numbers: Cyt-b 1: KM210838-KM211279; CO-1:
KJ857561-KJ858054), juntamente com a sequência de cada iniciador utilizado para sua
obtenção. Dessa forma, as sequências dos iniciadores podem ser publicamente visualizadas
juntamente com a região de mt-DNA amplificada por eles em cada um dos indivíduos
analisados neste estudo. Os iniciadores e as sequências amplificadas da região Cyt-b 2 não
foram depositadas no NCBI porque os fragmentos possuem menos de 200 pares de base,
mas tais sequências estão mostradas no anexo.
Fragmentos de 203 pares de base da região Cyt-b 1 foram obtidos em 442 indivíduos
juvenis de E. lineolata; Os fragmentos da região Cyt-b 2 possuem 177 pares de base e
foram provenientes de 471 juvenis; Os fragmentos da região CO-1 possuem 441 pares de
base e foram amplificados em 494 juvenis. As três regiões foram sequenciadas nos mesmos
indivíduos, sendo que as diferenças no tamanho das amostras são devidas à impossibilidade
de amplificar e sequenciar determinados fragmentos em alguns deles.
19
Tabela 1 Descrição dos novos iniciadores. pb: comprimento dos fragmentos editados em
pares de base; n: número de sequências obtidas com cada par de iniciadores.
Iniciadores Orientação Sequência Pb n
El.Cyt-bI Direto 5’ TCCTTCCCGCAACTTCAAA 3’
203
442 indivíduos
Reverso 5’ ATCAAGAGGCCCCATTAGCA 3’
El.Cyt-bII Direto 5’ TAACCATGGGAGCAGCCTTT 3’
177
471 indivíduos
Reverso 5’ GCAAAGAAGCGAGTGAGGG 3’
El.CO-1 Direto 5’ TGGGGGATCTGTGGACTTAG 3’
441
494 indivíduos
Reverso 5’ CAGTAAAGTACGCCCGAGTG 3’
4.3 Análises estatísticas
4.3.1 Diversidade genética
Os índices de diversidade gerais estimados foram baixos (tabela 2). A região CO-1
apresentou maior diversidade haplotípica (Kruskal-Wallis: p<0.05). A diversidade
nucleotídica foi muito baixa nas três regiões.
Tabela 2 Índices de diversidade molecular; n: número de indivíduos; H: número de
haplótipos; S: número de sítios polimórficos; h: diversidade haplotípica; π: diversidade
nucleotídica; pb: comprimento das sequências em pares de base.
Região Gênica n H S H π Pb
Cyt-b 1 442 17 14 0.284 0.002 203
Cyt-b 2 471 24 22 0.372 0.003 177
CO-1 494 64 54 0.705 0.003 441
As redes de haplótipos que foram inferidas apresentam pequeno número de haplótipos
comuns bem distribuídos, e muitos haplótipos raros (figura 3). Essa arquitetura é típica de
cenários de expansão populacional. A rede da região Cyt-b 1 mostra um haplótipo com
elevada frequência restrito a amostras de Guaecá.
20
Figura 3 Redes de haplótipo das regiões Cyt-b 1, Cyt-b 2 e CO-1.
4.3.2 Comparações no espaço (entre praias)
4.3.2.1 Todas as amostras de cada praia (Juquehy X Guaecá)
Os índices de diversidade das amostras de Juquehy foram semelhantes aos índices gerais,
sendo o mesmo observado para as amostras de Guaecá (Kruskal-Wallis: p>0.05, tabela 3).
Tabela 3 Índices de diversidade molecular por praia; n: número de indivíduos; H: número
de haplótipos; S: número de sítios polimórficos; h: diversidade haplotípica; π: diversidade
nucleotídica; pb: comprimento das sequências em pares de base.
Região Gênica Praia n H S H Π Pb
Cyt-b 1
Juquehy
260 11 10 0.098 0.000 203
Cyt-b 2 267 16 16 0.380 0.003 177
CO-1 309 42 37 0.722 0.003 441
Cyt-b 1
Guaecá
182 9 7 0.465 0.003 203
Cyt-b 2 204 14 12 0.361 0.003 177
CO-1 185 31 32 0.672 0.003 441
CO-1 Cyt-b 2 Cyt-b 1
21
As AMOVAs geraram resultados diferentes para cada região gênica nas comparações
entre praias (tabela 4): a região Cyt-b 1 apresentou variação em três níveis hierárquicos:
- entre amostras de praias diferentes;
- entre rochas da mesma praia e;
- entre indivíduos da mesma rocha.
Quanto às outras regiões gênicas, a principal fonte de variação foi entre os indivíduos da
mesma rocha, indicando ausência de estrutura genética.
A estimativa de FST foi elevada para a região Cyt-b 1 (FST(Cyt-b1)=0.63 p<0.05), mas não
significativa para as outras regiões gênicas. O valor de FST par a par foi significativo apenas
para a região Cyt-b 1 (tabela 5).
Tabela 4 Resultados das AMOVAs para todas as amostras de cada praia (Juquehy X
Guaecá)
Fonte de Variação (%)
Região Gênica Entre indivíduos
da mesma rocha
Entre rochas da
mesma praia Entre praias
Cyt-b 1 37.17 40.76 22.07
Cyt-b 2 97.48 2.52 0.00
CO-1 98.93 0.60 0.47
Tabela 5 Estimativas de FST par a par entre praias (Juquehy X Guaecá). Região gênica
considerada: Cyt-b 1.
Praia Juquehy Guaecá
Juquehy -
Gauecá 0.24 -
22
4.3.2.2 Entre amostras de cada uma das coletas (J1XG1; J2XG2; J3XG3; J4XG4)
Os índices de diversidade de cada coleta em cada praia (J1, J2, J3, J4, G1, G2, G3 e G4) não
diferiram significativamente dos índices gerais (Kruskal-Wallis: p>0.05, tabela no anexo).
As AMOVAs geraram resultados diferentes para cada coleta e região gênica (tabela 6). Os
valores de FST e as estimativas de FST par a par também foram diferentes (tabelas 7 e 8):
- Coleta 1 (J1XG1):
A região Cyt-b 1 apresentou variação em três níveis hierárquicos na AMOVA:
- grande variação entre rochas de praias diferentes;
- pequena variação entre rochas da mesma praia e;
- variação intermediária entre os indivíduos de cada rocha.
Quanto às outras regiões gênicas, foi observada variação em dois níveis
hierárquicos:
- pequena variação entre rochas da mesma praia e;
- grande variação entre os indivíduos da mesma rocha (principal fonte de variação).
A estimativa de FST resultou em valor elevado para a região Cyt-b 1 (FST(Cyt-
b1)=0.67, p<0.05), valor baixo para a região Cyt-b 2 (FST(Cyt-b2)=0.06, p<0.05) e
valor não significativo para a região CO-1. A estimativa de FST par a par foi
significativa apenas para a região Cyt-b 1.
- Coleta 2 (J2XG2):
A região Cyt-b 1 apresentou variação em três níveis hierárquicos na AMOVA:
- grande variação entre rochas de praias diferentes;
- grande variação entre rochas da mesma praia e;
- variação intermediária entre os indivíduos da mesma rocha.
23
Quanto às outras regiões gênicas, a principal fonte de variação foi entre os
indivíduos da mesma rocha, indicando ausência de estrutura genética
populacional.
A estimativa de FST resultou em valor elevado para a região Cyt-b 1 (FST(Cyt-
b1)=0.67 p<0.05) e valores não significativos para as outras regiões gênicas. O
valor de FST par a par foi significativo apenas para a região Cyt-b 1 .
- Coleta 3 (J3XG3):
Todas as regiões gênicas apresentaram resultados de AMOVAs semelhantes: a
principal fonte de variação foi entre os indivíduos da mesma rocha, indicando
ausência de estrutura genética populacional.
As estimativas de FST não foram significativas para nenhuma região gênica, bem
como os testes de FST par a par.
- Coleta 4 (J4XG4):
A região CO-1 apresentou variação em dois níveis hierárquicos na AMOVA:
- pequena variação entre rochas de praias diferentes e;
- grande variação entre indivíduos da mesma rocha (principal fonte de variação).
Quanto às outras regiões gênicas, a variação foi unicamente entre os indivíduos da
mesma rocha, indicando ausência de estrutura genética populacional.
As estimativas de FST não foram significativas para nenhuma região gênica. O
valor de FST par a par foi significativo apenas para a região CO-1.
24
Tabela 6 Resultados das AMOVAs para as amostras agrupadas por praia e data de coleta
(* p<0.05).
Fonte de Variação (%)
Coleta Região Gênica Entre indivíduos da
mesma rocha
Entre rochas da
mesma praia
Entre rochas de
praias diferentes
Coleta 1
Cyt-b 1 33.00* 5.58* 61.42*
Cyt-b 2 93.35* 6.95* 0.00
CO-1 93.41 6.59* 0.00
Coleta 2
Cyt-b 1 18.03* 39.08* 42.89*
Cyt-b 2 98.50 1.50 0.00
CO-1 100.00 0.00 0.00
Coleta 3
Cyt-b 1 99.71 0.00 0.29
Cyt-b 2 99.01 0.00 0.99
CO-1 100.00 0.00 0.00
Coleta 4
Cyt-b 1 98.65 0.00 1.35
Cyt-b 2 98.90 0.00 1.10
CO-1 94.40 0.00 5.60*
Tabela 7 Estimativas de FST par a par para as coletas 1, 2, 3 e 4 (J1XG1; J2XG2; J3XG3;
J4XG4). Região gênica considerada: Cyt-b 1.
Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4
Juquehy Guaecá Juquhey Guaecá Juquhey Guaecá Juquhey Guaecá
Juquhey -
-
-
-
-
-
-
- Guaecá 0.63 0.48 0.002 0.01
25
Tabela 8 Estimativas de FST par a par da coleta 4 (J4XG4). Região gênica considerada: CO-1.
Coleta 4
Praia Juquehy Guaecá
Juquehy -
Guaecá 0.05 -
4.3.3 Comparações no tempo
As AMOVAs com abordagem temporal geraram resultados diferentes em Juquehy e em
Guaecá, bem como as estimativas de FST e FST par a par:
4.3.3.1 Juquehy (J1 X J2 X J3 X J4)
As três regiões gênicas geraram resultados similares (tabela 9): a maior fonte de variação
foi entre os indivíduos da mesma rocha, independentemente da data de coleta, indicando
ausência de estrutura genética ao longo do tempo.
Tabela 9 Resultados de AMOVA para amostras de Juquehy agrupadas por data de coleta.
Juquehy Fonte de Variação (%)
Região Gênica Entre indivíduos da
mesma rocha
Entre rochas da
mesma coleta Entre coletas
Cyt-b 1 99.97 0.00 0.03
Cyt-b 2 97.04 2.60 0.36
CO-1 98.95 1.05 0.00
As estimativas de FST para as coletas de Juquehy foram baixas e não significativas para
todas as regiões gênicas. Os valores de FST par a par para as coletas de Juquehy não foram
significativos (tabela 10).
26
Tabela 10 Estimativas de FST par a par para amostras de Juquehy agrupadas por data de
coleta. Região gênica considerada: Cyt-b 1.
Coletas
Juquehy 1ª 2ª 3ª 4ª
1ª -
2ª 0.002 -
3ª 0.000 0.001 -
4ª 0.001 0.008 0.019 -
4.3.3.2 Guaecá (G1 X G2 X G3 X G4)
Os resultados das AMOVAs foram diferentes entre as regiões gênicas (tabela 11): a
região Cyt-b 1 mostrou variação em três níveis hierárquicos:
- grande variação entre coletas;
-grande variação entre rochas da mesma coleta e;
- grande variação entre indivíduos da mesma rocha.
Quanto às outras regiões gênicas, a principal fonte de variação foi entre os indivíduos da
mesma rocha, indicando ausência de estrutura genética.
Tabela 11 Resultados de AMOVA para amostras de Guaecá agrupadas por data de coleta.
Guaecá Fonte de Variação (%)
Região Gênica Entre indivíduos da
mesma rocha
Entre rochas da
mesma coleta Entre coletas
Cyt-b 1 31.04 29.96 39.00
Cyt-b 2 97.49 0.94 1.57
CO-1 99.55 0.00 0.45
A estimativa de FST para as coletas de Guaecá foi elevada para a região Cyt-b 1 (FST(Cyt-
b1)=0.690 p<0.05), mas não significativa para as outras regiões gênicas. Os valores de FST
27
par a par para a região Cyt-b 1 foram significativos para as coletas 1 e 2 comparadas com as
coletas 3 e 4 (tabela 12). O mesmo não ocorreu com as outras regiões gênicas, para as quais
nenhuma comparação foi significativa.
Tabela 12 Estimativas de FST par a par para amostras de Guaecá agrupadas por data de
coleta. Região gênica considerada: Cyt-b 1.
Coletas
Guaecá 1ª 2ª 3ª 4ª
1ª -
2ª 0.020 -
3ª 0.601 0.457 -
4ª 0.598 0.454 0.000 -
28
5. Discussão
5.1 Diversidade genética
Os resultados evidenciam que os juvenis de E. lineolata amostrados apresentam baixa
diversidade molecular para os marcadores do DNA mitocondrial utilizados, o que contrasta
com a elevada variabilidade detectada anteriormente em vários locos de isozimas (Andrade
et al. 2003). Este contraste pode ser devido ao uso de marcadores moleculares com
características distintas, já que resultados divergentes são possivelmente gerados quando
alguns marcadores estão submetidos à seleção natural e outros não (Hellberg et al. 2002).
Algumas variações genéticas em isozimas foram atribuídas à seleção natural, inclusive em
espécies de litorinídeos (Johannesson et al. 1995, Nikiforov & Budnik 2004, Mäkinen et al.
2008, Schoville et al. 2012, Harrang et al. 2013). Já no DNA mitocondrial, a maioria das
variações é neutra, o genoma é haploide e geralmente herdado maternalmente, então o
tamanho efetivo populacional estimado com estes marcadores deve ser um quarto do obtido
com estimativas baseadas em marcadores nucleares (Kyle & Boulding 2000). Portanto, é
esperado encontrar menor diversidade no DNA mitocondrial do que em locos de isozimas.
Ademais, diferentes marcadores devem responder de forma distinta a influências da
heterogeneidade ambiental nos organismos, haja vista as variações não neutras detectadas
em isozimas.
A elevada diversidade genética de marcadores nucleares também já foi relacionada com
poliandria em populações de litorinídeos (Rafajlovic et al. 2013). Caso E. lineolata
apresente este comportamento reprodutivo, sua elevada diversidade genética em isozimas
pode se relacionar a ele, o que é indetectável em marcadores mitocondriais. Além disso, há
espécies de litorinídeos em que o acasalamento é diferencial, sendo que fêmeas maiores e
virgens tem maior probabilidade de se acasalarem (Zahradnik et al. 2008). Nesse segundo
tipo de comportamento, um número reduzido de fêmeas contribui efetivamente para a
próxima geração, então a diversidade genética detectada por marcadores mitocondriais
deve ser ainda menor do que a esperada em sistemas reprodutivos panmíticos,
A região CO-1 de E. lineolata apresenta maior diversidade haplotípica que as regiões Cyt-
b 1 e 2. Muitas espécies com características similares à E. lineolata apresentam diversidade
29
haplotípica nesses dois genes com valores próximos ao observado no CO-1 de E. lineolata
(Lee & Boulding 2009, Baird et al. 2011, Díaz-Ferguson et al. 2012, Ghabooli et al. 2013,
Iacchei et al. 2013). Exemplos desses casos são os litorinídios Echinolittorina ziczac no
Caribe, com hCO-1=0.75 e Littorina plena no Pacífico nordeste, com hCyt-b=0.77 (Lee &
Boulding 2009, Díaz-Ferguson et al. 2012). Já o litorinídeo Littorina scutulata mostrou
hCyt-b=0.39 mesmo possuindo fase larval planctotrófica (Lee & Boulding 2009), o que é
similar às regiões Cyt-b 1 e 2 aqui analisadas.
As estimativas de diversidade genética mostram que as três regiões gênicas consideradas
apresentam baixa diversidade nucleotídica em E. lineolata, o que indica que os organismos
estudados possuem haplótipos que diferem por um ou poucos passos mutacionais. Valores
semelhantes foram observados no CO-1 e no Cyt-b de outros invertebrados marinhos com
desenvolvimento direto ou planctotrófico (Lee & Boulding 2009, Baird et al. 2011, Díaz-
Ferguson et al. 2012, Ghabooli et al. 2013, Iacchei et al. 2013). Kely & Palumbi (2010)
amostraram 50 espécies de invertebrados ao longo da costa do Pacífico na América do
Norte e encontraram diversidade nucleotídica entre 0.0 e 0.02 para o CO-1. Quanto ao Cyt-
b, alguns litorinídeos do Pacífico nordeste apresentam diversidade nucleotídica entre 0.00 e
0.006 (Lee & Boulding 2009). As amostras de E. lineolata estudadas seguem este padrão
de baixa diversidade nucleotídica.
As redes de haplótipos apresentam poucos haplótipos com frequência elevada, presentes
nas amostras das duas praias. Há vários haplótipos raros, geralmente representados por
apenas um indivíduo. Andrade et al. (2003) encontrou alelos raros compartilhados entre
populações distintas em isozimas de Littoraria angulifera, indicando fluxo gênico entre
elas. No entanto, como para E. lineolata a maioria dos haplótipos raros é restrita a uma das
praias, o fluxo gênico nesta espécie pode ser menos intenso do que o esperado para
indivíduos com larvas planctotróficas.
Outras espécies possuem haplótipos distribuídos de forma similar às redes aqui obtidas,
como os litorinídeos Littorina plena e Littorina scutulata para o Cyt-b e Echinolittorina
ziczac e Cenchritis muricatus para o CO-1 (Lee & Boulding 2009, Díaz-Ferguson et al.
2012). Esta topologia pode ser gerada por variância no sucesso reprodutivo (Iacchei et al.
2013).
30
Ainda quanto às redes de haplótipo, observa-se que a região Cyt-b 1 apresenta um
haplótipo de maior frequência restrito a Guaecá, o que pode significar estrutura genética
populacional entre indivíduos das duas praias. Porém, as redes de haplótipos do Cyt-b 2 e
do CO-1 são características de cenários de homogeneidade genética.
5.2 Comparações no espaço (entre praias)
5.2.1 Todas as amostras de cada praia (Juquehy X Guaecá)
Os testes realizados para a região Cyt-b 1 evidenciaram estrutura genética entre praias.
Esperava-se encontrar homogeneidade genética nas amostras das duas praias, porque a
distância entre as praias é de 40 quilômetros e a capacidade de dispersão das larvas de E.
lineolata foi estimada em 1400 quilômetros (Williams & Reid 2004). Comparativamente,
há outras espécies com larvas pelágicas e diferenciação genética entre populações
próximas: o haliote Haliotis diversicolor apresenta estrutura genética em populações que
distam 35 quilômetros (Hellberg et al. 2002). Baird et al. (2011) detectaram uma espécie
críptica de anfípode (Eusirus sp.) na Antártica com estrutura populacional em uma escala
de 150 quilômetros, enquanto que outras espécies desse gênero são geneticamente
homogêneas ao longo de 5000 quilômetros. O peixe Stegastes partitus possui estrutura
genética em pequena escala espacial, o que foi atribuído a efeitos estocásticos na dispersão
das larvas e a efeitos micro geográficos (Hepburn et al. 2009).
No caso de E. lineolata, nós consideramos duas explicações para a estrutura genética
entre Juquehy e Guaecá:
(i) Efeitos oceanográficos locais podem gerar diferenças genéticas em pequenas
distâncias (Cowen et al. 2006). Esses efeitos geralmente produzem padrões
imprevisíveis de diferenciação genética, que provavelmente são transientes
(Selkoe et al. 2006, Hepburn et al. 2009).
(ii) Influência indireta de diferenças geográficas presentes na região das praias
amostradas: a praia de Guaecá está mais próxima do canal e da Ilha de São
Sebastião do que Juquehy, além de existirem diferenças físicas nos costões
31
rochosos das duas praias e também mudança na circulação das massas de água
entre as diferentes estações do ano.
5.2.2 Entre amostras de cada uma das coletas (J1XG1; J2XG2; J3XG3; J4XG4)
Os testes realizados indicaram estrutura genética entre Juquehy e Guaecá nas coletas 1 e 2
para a região Cyt-b 1. A região CO-1 apresentou indícios de estrutura genética na coleta 4.
A estrutura genética entre praias parece instável em E. lineolata, já que está presente em
determinados momentos e ausente em outros. Esta transitoriedade é uma evidência de que a
diferenciação genética em E. lineolata pode ser causada por efeitos oceanográficos locais,
como colocado na seção anterior.
5.2.3 Entre rochas da mesma praia
As AMOVAs realizadas permitiram acessar a porcentagem de variação genética entre
rochas da mesma praia: apenas as coletas 1 e 2 apresentaram variação entre rochas na
região Cyt-b 1. Isso indica estrutura genética entre grupos de indivíduos que distam apenas
alguns metros entre si, correspondentes à distância entre as rochas nas praias. Esta estrutura
genética é transiente, já que a variação genética foi detectada apenas em duas das coletas, e
pode ser resultado de diferenças nos micro habitats do costão rochoso. Ambientes muito
heterogêneos como este são caracterizados por rápidas flutuações ambientais, sendo
comum observar diferentes micro habitats (Kesäniemi et al. 2014). Como anteriormente
mencionado, a heterogeneidade do ambiente pode influenciar na variabilidade genética e na
estrutura das populações (Powell 1971, Nevo 1978, Mitchell-Olds 1992, Johannesson et al.
2004, Andrade & Solferini 2007).
De modo semelhante a E. lineolata, o litorinídeo Littoraria flava apresenta estrutura
genética entre indivíduos separados por apenas alguns metros no costão rochoso, mesmo
possuindo larvas planctotróficas (Andrade & Solferini 2007). Os marcadores moleculares
empregados na análise das populações de L. flava foram locos isozimas, no entanto é
relevante considerar que para esta espécie a estrutura genética entre indivíduos da mesma
praia parece mais importante do que aquela entre populações separadas por milhares de
quilômetros na costa brasileira (Andrade & Solferini 2007).
32
5.3 Comparações no tempo
5.3.1 Juquehy (J1 X J2 X J3 X J4)
Elevada fecundidade, grande capacidade de dispersão das larvas e baixa sobrevivência
nos estágios iniciais do desenvolvimento podem causar variância no sucesso reprodutivo de
espécies com larvas planctônicas (Hedgecock 1994, Lee & Boulding 2009, Kesäniemi et al.
2014). Por isso, estas espécies têm maior probabilidade de apresentar variação genética ao
longo do tempo do que do espaço (Lee & Boulding 2009, Kesäniemi et al. 2014). No
entanto, apesar do modo de desenvolvimento planctotrófico, as amostras de E. lineolata
coletadas em Juquehy apresentam homogeneidade genética ao longo do tempo. Assim
como nelas, no poliqueta Pygospio elegans a variação genética temporal está desassociada
do modo de desenvolvimento larval, para o qual fatores ambientais parecem mais
relevantes na determinação de estrutura genética (Kesäniemi et al. 2014).
5.3.2 Guaecá (G1 X G2 X G3 X G4)
As amostras de Guaecá apresentam evidências de estrutura genética temporal para a
região Cyt-b 1, o que confere com a hipótese anteriormente citada de que espécies com
desenvolvimento planctônico possuem maior probabilidade de apresentar variação genética
ao longo do tempo. Existem outras espécies nessas condições com variação genética
detectada em diferentes intervalos de tempo, como o bivalve Spisula ovalis em uma escala
de tempo anual e os litorinídeos Littorina scutulata e Littorina plena em um intervalo de 10
anos (David et al. 1997, Lee & Boulding 2009). Indivíduos juvenis podem apresentar maior
variação genética temporal do que adultos, como Toonen & Grosberg (2011) observaram
em análises de diferentes classes de tamanho do caranguejo Petrolisthes cinctipes. Por isso,
a análise apenas de juvenis de E. lineolata pode ter contribuído para os resultados de
estrutura genética temporal em Guaecá.
Devido ao seu desenvolvimento larval planctônico, esses organismos geralmente
apresentam elevada fecundidade e alta mortalidade nas larvas, o que pode levar à variância
no número de juvenis que os adultos deixarão para as próximas gerações, ou seja, variância
no sucesso reprodutivo (Hedgecock 1994, Hellberg et al. 2002, Lee & Boulding 2009,
Toonen & Grosberg 2011, Broquet et al. 2013, Iacchei et al. 2013, Kesäniemi et al. 2014).
33
Se um número limitado de pais contribuírem para uma coorte, haverá efeitos instantâneos
de deriva genética e FST entre coortes, sendo que a magnitude desses efeitos é inversamente
proporcional ao número de pais contribuintes (Tracey et al. 1975, David et al. 1997).
Como, nesses casos, a variância no sucesso reprodutivo parece um fenômeno aleatório, a
variação genética ao longo do tempo pode apresentar-se instável. Segundo Hepburn et al.
(2009), padrões genéticos gerados por dispersão estocástica ou por efeitos da variância no
sucesso reprodutivo podem mudar imprevisivelmente ao longo do tempo. De modo
contrário, dispersão estável ou ausência de dispersão deverão gerar padrões temporais
consistentes (Hepburn et al. 2009).
De acordo com os resultados deste estudo, a variação genética detectada entre as coletas
de Guaecá se mostra inconsistente ao longo do tempo, aparecendo em coletas diferentes.
Sendo assim, a hipótese da variância no sucesso reprodutivo pode ser considerada para
explicá-la: diferentes grupos de pais estariam contribuindo para a próxima geração, sendo
estes pais determinados ao acaso. A ausência de variação genética temporal em Juquehy
também pode estar relacionada com variância no sucesso reprodutivo, pois locais diferentes
poderiam apresentar padrões genéticos distintos devido à aleatoriedade do sucesso
reprodutivo.
Independente dos fatores responsáveis pela estrutura genética temporal em E. lineolata, a
subdivisão populacional pode gerar consequências como desvios do Equilíbrio de Hardy-
Weinberg. A amostragem de populações com diferentes frequências alélicas pode resultar
em uma amostra combinada que apresenta deficiência de heterozigotos (Gaffney et al.
1990).
Vários locos de isozimas apresentaram deficiência de heterozigotos em E. lineolata, o que
pode ser explicado por efeito Wahlund caso muitos grupos de acasalamento existam em
cada população (Andrade et al. 2003, Andrade et al. 2005).
Grupos de acasalamento são pequenos grupos reprodutivos sem fluxo gênico completo
entre si, e uma de suas consequências é variação temporal na frequência alélica dos juvenis
(Tracey et al. 1975). Muitos fatores podem ser responsáveis por gerar grupos de
acasalamento (Hendry & Day 2005). Um deles é a variância no sucesso reprodutivo, pois
34
quando um número limitado de pais contribui para a formação de uma coorte, haverá
diferenciação genética entre coortes (David et al. 1997).
As análises realizadas em Juquehy e em Guaecá indicam que é possível que exista
variância no sucesso reprodutivo de E. lineolata. Sendo assim, grupos de acasalamento
podem ser gerados de modo aleatório e um efeito Wahlund distribuído no tempo é um
potencial gerador dos desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg nessa espécie.
No entanto, deve ser considerado que a deficiência de heterozigotos em E. lineolata é de
grande magnitude e o efeito Wahlund gerado pode ser insuficiente para explicá-la, como é
o caso do bivalve Spisula ovalis (David et al. 1997). Nesse bivalve, há deficiência de
heterozigotos em vários locos de isozimas e algumas hipóteses que foram consideradas
como causadoras deste fenômeno são aneuploidia, alelos nulos e seleção natural durante a
fase larval (David et al. 1997).
No caso de E. lineolata, é provável que mais fatores, somados ao efeito Wahlund, sejam
responsáveis pela deficiência de heterozigotos. Aneuploidia e alelos nulos tiveram sua
importância minimizada para esta espécie, já que todos os indivíduos produziram padrões
enzimáticos ativos e não houve indícios de homozigotos nulos (Andrade & Solferini 2005).
Já seleção natural nos primeiros estágios do desenvolvimento é uma potencial explicação,
pois estes animais habitam ambientes heterogêneos, e a deficiência de heterozigotos foi
detectada em vários locos de isozimas (Andrade & Solferini 2005).
Devido à dificuldade de manipulação de larvas e recrutas, há poucas evidências empíricas
da seleção natural atuando nessa fase do desenvolvimento (David et al. 1997). Porém, o
emprego de diferentes marcadores moleculares em uma análise das larvas de E. lineolata
pode contribuir para esclarecer o papel da seleção natural e de outros fatores na indução da
deficiência de heterozigotos nesta espécie.
35
6. Conclusão
Em juvenis de E. lineolata, as regiões gênicas CO-1 e Cyt-b apresentam baixos índices
de diversidade molecular. Esse resultado pode se dever a características do marcador
molecular utilizado, como também pode estar relacionado a comportamentos
reprodutivos da espécie.
As AMOVAs e inferências de FST realizadas indicaram estrutura genética espacial entre
E. lineolata das praias de Juquehy e Guaecá, especialmente para região Cyt-b 1. Esta
estrutura genética pode estar relacionada a fatores como diferenças oceanográficas
locais e transientes ou diferenças físicas entre as praias.
Em duas das coletas, o marcador Cyt-b 1 demonstrou estrutura genética entre
indivíduos coletados em rochas diferentes da mesma praia, o que compreende uma
distância de apenas alguns metros.
Estrutura genética temporal foi detectada com o marcador Cyt-b 1 apenas nas amostras
coletadas em Guaecá.
Apesar de os dados analisados neste estudo serem insuficientes para especificar os
fatores responsáveis pela estrutura genética espacial e temporal em E. lineolata, é
impossível descartar que ela se relacione com a deficiência de heterozigotos
anteriormente relatada para a espécie. Este estudo não permite descartar a existência de
múltiplos grupos de acasalamento em E. lineolata.
36
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45
7. Anexos
Anexo-1. Condições de realização das reações de amplificação (PCR)
A1 Região gênica Cyt-b 1
A1.1 Condições
- Tampão: 2,5μl (10x Taq Buffer com (NH4)2SO4 e sem MgCl2);
- MgCL2 25mM: 2,5μl
- dNTP 10mM: 0,5μl
- primer Elcit-bI direto 10μM: 1μl
- primer Elcit-bI reverso 10μM: 1μl
- BSA 0,1%: 0,75μl
- Enzima Taq DNA Polimerase recombinante 5U/μl: 0,2μl
- Água MiliQ: 15,55μl
- 1μl de DNA (proveniente da reação de purificação usando o Kit ilustraTM
GFXTM
PCR DNA and Gel Band Purification, GE Healthcare – Life Sciences, eluído em 25 μl
do tampão Elution Buffer type 6, GE Healthcare).
A1.2 Ciclo de temperaturas para a amplificação (PCR)
Estágio 1 (1 repetição)
- passo 1 (denaturação inicial) – 95°C durante 1 minuto
Estágio 2 (35 repetições)
- passo 1 (denaturação por calor) – 95°C por 1 minuto
- passo 2 (anelamento de iniciadores) – 55°C por 1 minuto
-passo 3 (síntese das cadeias complementares) – 72°C por 1 minuto
46
Estágio 3 (1 repetição)
-passo 1 – 72°C por 7 minutos
-passo 2 – 4°C por tempo indeterminado (∞)
A2 Região gênica Cyt-b 2
Todas as condições são as mesmas utilizadas para a amplificação da região Cyt-b 1,
mas os iniciadores usados são Elcit-bII direto e Elcit-bII reverso.
O ciclo de temperaturas para as amplificações (PCR) é o mesmo utilizado para
amplificar a região Cyt-b 1, mas a temperatura de anelamento dos iniciadores é 56°C.
A3 Região gênica CO-1
Todas as condições são as mesmas utilizadas para a amplificação da região Cyt-b 1,
mas os iniciadores usados são ElCO-1 direto e ElCO-1 reverso.
O ciclo de temperaturas para as amplificações (PCR) é o mesmo utilizado para
amplificar a região Cyt-b 1, mas a temperatura de anelamento dos iniciadores é 46°C.
47
Anexo-2. Índices de diversidade molecular por praia por coleta (J1, J2, J3, J4, G1,
G2, G3 e G4)
Tabela 13 Índices de diversidade molecular; n: número de indivíduos; H: número de
haplótipos; S: número de sítios polimórficos; h: diversidade haplotípica; π: diversidade
nucleotídica; pb: comprimento das sequências em pares de base.
Região Gênica Praia Coleta N H S h π pb
Cyt-b 1
Juquehy
1
84 6 5 0.138 0.001 203
Cyt-b 2 85 7 6 0.423 0.003 177
CO-1 86 9 8 0.645 0.002 441
Cyt-b 1
2
68 5 4 0.115 0.001 203
Cyt-b 2 73 10 10 0.408 0.003 177
CO-1 87 19 18 0.733 0.003 441
Cyt-b 1
3
61 2 1 0.032 0.000 203
Cyt-b 2 65 6 5 0.392 0.003 177
CO-1 86 21 18 0.798 0.003 441
Cyt-b 1
4
47 2 1 0.083 0.000 203
Cyt-b 2 47 5 4 0.240 0.002 177
CO-1 50 7 9 0.695 0.003 441
Cyt-b 1
Guaecá
1
42 4 3 0.514 0.003 203
Cyt-b 2 61 6 5 0.438 0.003 177
CO-1 44 7 6 0.655 0.003 441
Cyt-b 1
2
45 4 3 0.554 0.003 203
Cyt-b 2 47 7 5 0.407 0.003 177
CO-1 45 12 14 0.702 0.003 441
Cyt-b 1
3
48 3 2 0.082 0.000 203
Cyt-b 2 48 6 5 0.334 0.002 177
CO-1 48 10 13 0.704 0.003 441
Cyt-b 1
4
47 3 2 0.084 0.000 203
Cyt-b 2 48 6 7 0.236 0.002 177
CO-1 48 14 16 0.640 0.003 441
48
Anexo-3. Informações sobre a região gênica Cyt-b 2 (tabelas 14 e 15)
Tabela 14 Sumário dos indivíduos que apresentam cada haplótipo da região Cyt-b 2. Os
haplótipos estão identificados por números de 1-24. O nome dos indivíduos é o código
utilizado para sua identificação. O número de indivíduos que apresenta determinado
haplótipo também é mostrado.
Haplótipo Indivíduos Número de
indivíduos
1
'16JE1.2' '17JE1.2' '18JE1.2' '19JE1.2' '20JE1.2' '21JE1.2' '24JE1.2' '25JE1.2' '26JE1.2' '28JE1.2'
'29JE1.2' '30JE1.2' '1JE2.2' '4JE2.2' '5JE2.2' '7JE2.2' '8JE2.2' '9JE2.2' '10JE2.2' '12JE2.2' '13JE2.2'
'14JE2.2' '15JE2.2' '2JE3.2' '5JE3.2' '14JE3.2' '1JC1.2' '3JC1.2' '5JC1.2' '6JC1.2' '7JC1.2' '8JC1.2' '9JC1.2' '10JC1.2' '11JC1.2' '12JC1.2' '13JC1.2' '14JC1.2' '15JC1.2' '1JC2.2' '2JC2.2' '3JC2.2' '5JC2.2'
'6JC2.2' '7JC2.2' '8JC2.2' '9JC2.2' '10JC2.2' '11JC2.2' '12JC2.2' '14JC2.2' '15JC2.2' '2JC3.2' '3JC3.2'
'4JC3.2' '5JC3.2' '7JC3.2' '8JC3.2' '10JC3.2' '11JC3.2' '12JC3.2' '13JC3.2' '14JC3.2' '15JC3.2' '1JE1.3'
'2JE1.3' '4JE1.3' '5JE1.3' '6JE1.3' '7JE1.3' '8JE1.3' '9JE1.3' '10JE1.3' '11JE1.3' '13JE1.3' '15JE1.3' '1JE2.3' '2JE2.3' '3JE2.3' '4JE2.3' '5JE2.3' '6JE2.3' '7JE2.3' '8JE2.3' '9JE2.3' '10JE2.3' '11JE2.3'
'1JE3.3' '3JE3.3' '4JE3.3' '6JE3.3' '7JE3.3' '8JE3.3' '1JC1.3' '2JC1.3' '4JC1.3' '5JC1.3' '6JC1.3' '8JC1.3'
'9JC1.3' '10JC1.3' '11JC1.3' '12JC1.3' '13JC1.3' '14JC1.3' '15JC1.3' '1JC2.3' '2JC2.3' '3JC2.3' '4JC2.3'
'5JC2.3' '6JC2.3' '7JC2.3' '12JC2.3' '14JC2.3' '2JC3.3' '3JC3.3' '4JC3.3' '5JC3.3' '7JC3.3' '1JE1.4' '2JE1.4' '3JE1.4' '4JE1.4' '5JE1.4' '6JE1.4' '7JE1.4' '8JE1.4' '10JE1.4' '13JE1.4' '14JE1.4' '15JE1.4'
'1JE2.4' '2JE2.4' '3JE2.4' '5JE2.4' '6JE2.4' '8JE2.4' '9JE2.4' '10JE2.4' '11JE2.4' '12JE2.4' '13JE2.4'
'14JE2.4' '15JE2.4' '1JE3.4' '2JE3.4' '3JE3.4' '5JE3.4' '7JE3.4' '8JE3.4' '1JC1.4' '3JC1.4' '4JC1.4'
'5JC1.4' '6JC1.4' '7JC1.4' '8JC1.4' '1JC2.4' '4JC2.4' '5JC2.4' '6JC2.4' '1JC3.4' '2JC3.4' '3JC3.4' '4JC3.4' '5JC3.4' '8JC3.4' '1JE1.5' '2JE1.5' '3JE1.5' '4JE1.5' '5JE1.5' '7JE1.5' '8JE1.5' '1JE2.5' '4JE2.5'
'5JE2.5' '6JE2.5' '7JE2.5' '8JE2.5' '1JE3.5' '2JE3.5' '3JE3.5' '4JE3.5' '5JE3.5' '6JE3.5' '7JE3.5' '8JE3.5'
'1JC1.5' '2JC1.5' '3JC1.5' '4JC1.5' '5JC1.5' '6JC1.5' '7JC1.5' '8JC1.5' '1JC2.5' '2JC2.5' '4JC2.5'
'5JC2.5' '6JC2.5' '7JC2.5' '8JC2.5' '2JC3.5' '3JC3.5' '4JC3.5' '6JC3.5' '7JC3.5' '1GE1.2' '3GE1.2' '4GE1.2' '6GE1.2' '10GE1.2' '20GE1.2' '21GE1.2' '22GE1.2' '23GE1.2' '3GE2.2' '6GE2.2' '14GE2.2'
'15GE2.2' '16GE2.2' '18GE2.2' '19GE2.2' '25GE2.2' '30GE2.2' '1GE3.2' '18GE3.2' '23GE3.2'
'26GE3.2' '30GE3.2' '19GC1.2' '20GC1.2' '21GC1.2' '22GC1.2' '23GC1.2' '24GC1.2' '25GC1.2'
'16GC2.2' '17GC2.2' '18GC2.2' '22GC2.2' '24GC2.2' '26GC2.2' '28GC2.2' '29GC2.2' '18GC3.2' '19GC3.2' '21GC3.2' '24GC3.2' '25GC3.2' '26GC3.2' '30GC3.2' '7GE1.3' '8GE1.3' '11GE1.3'
'12GE1.3' '13GE1.3' '15GE1.3' '3GE2.3' '4GE2.3' '5GE2.3' '7GE2.3' '11GE2.3' '12GE2.3' '2GE3.3'
'14GE3.3' '15GE3.3' '16GC1.3' '17GC1.3' '19GC1.3' '20GC1.3' '25GC1.3' '28GC1.3' '16GC2.3'
'17GC2.3' '18GC2.3' '21GC2.3' '22GC2.3' '23GC2.3' '24GC2.3' '25GC2.3' '17GC3.3' '22GC3.3' '23GC3.3' '24GC3.3' '26GC3.3' '27GC3.3' '28GC3.3' '2GE1.4' '4GE1.4' '5GE1.4' '9GE1.4' '11GE1.4'
'12GE1.4' '13GE1.4' '1GE2.4' '2GE2.4' '3GE2.4' '4GE2.4' '7GE2.4' '8GE2.4' '9GE2.4' '10GE2.4'
'4GE3.4' '5GE3.4' '12GE3.4' '13GE3.4' '15GE3.4' '2GC1.4' '6GC1.4' '7GC1.4' '9GC1.4' '13GC1.4'
'1GC2.4' '2GC2.4' '4GC2.4' '5GC2.4' '7GC2.4' '11GC2.4' '14GC2.4' '1GC3.4' '2GC3.4' '4GC3.4' '7GC3.4' '8GC3.4' '11GC3.4' '12GC3.4' '1GE1.5' '3GE1.5' '4GE1.5' '6GE1.5' '10GE1.5' '2GE2.5'
'4GE2.5' '6GE2.5' '7GE2.5' '10GE2.5' '11GE2.5' '14GE2.5' '3GE3.5' '4GE3.5' '7GE3.5' '9GE3.5'
'10GE3.5' '12GE3.5' '13GE3.5' '14GE3.5' '1GC1.5' '3GC1.5' '4GC1.5' '8GC1.5' '11GC1.5' '12GC1.5'
'14GC1.5' '2GC2.5' '3GC2.5' '5GC2.5' '6GC2.5' '7GC2.5' '8GC2.5' '9GC2.5' '10GC2.5' '1GC3.5' '2GC3.5' '3GC3.5' '6GC3.5' '7GC3.5' '8GC3.5' '14GC3.5'
371
2 '22JE1.2' '4JC2.2' '14JE1.3' '9JE1.4' '2JC2.4' '6JC3.4' '16GE3.2' 25 '6GC1.5' 9
3 '23JE1.2' '6JE2.2' '11JE2.2' '15JE3.2' '12JE1.3' '11JC2.3' '1JC3.3' '11JE1.4' '12JE1.4' '4JE3.4' '6JE3.4'
'7JC2.4' '8JC2.4' '3JE2.5' '5JC3.5' '16GE1.2' '24GE1.2' '10GE3.3' '16GC3.3' '2GE3.4' 20
4
'2JE2.2' '7JE3.2' '13JE3.2' '2JC1.2' '13JC2.2' '6JC3.2' '9JC3.2' '3JC1.3' '7JC1.3' '15JC2.3' '6JC3.3' '8JC3.3' '7JE2.4' '2JC1.4' '7JC3.4' '2JE2.5' '3JC2.5' '2GE1.2' '5GE1.2' '18GE1.2' '26GE1.2' '23GE2.2'
'4GE3.2' '6GE3.2' '26GC1.2' '29GC3.2' '1GE2.3' '2GE2.3' '7GE3.3' '8GE3.3' '23GC1.3' '1GE1.4'
'9GE3.4' '5GC1.4' '8GC1.4' '13GC2.4'
36
5 '3JE2.2' 1
6 '3JE3.2' '4JE3.2' '8JE3.2' '9JE3.2' '10JE3.2' '11JE3.2' 6
49
7 '4JC1.2' 1
8 '3JE1.3' 1
9 '14JE2.3' '15JE2.3' '10JC2.3' '10GE1.3' 4
10 '5JE3.3' '15GE1.5' 2
11 '8JC2.3' 1
12 '9JC2.3' '4JE2.4' 2
13 '13JC2.3' 1
14 '3JC2.4' 1
15 '6JE1.5' 1
16 '1JC3.5' 1
17 '7GE1.2' '21GE3.2' '5GE3.3' 3
18 '27GE2.2' 1
19 '1GE3.3' '5GE1.5' '10GC3.5' 3
20 '21GC1.3' '14GE1.5' 2
21 '8GE3.4' 1
22 '1GC1.4' 1
23 '5GC3.4' 1
24 '12GE2.5' 1
Tabela 15 Sequência de nucleotídeos de cada haplótipo da região Cyt-b 2. Os haplótipos
estão identificados por números de 1-24.
Haplótipo Sequência
1 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
2 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGGGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
3 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTATGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
4 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
5 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCAGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
6 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCTACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
7 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTAGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
8 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
50
CCACTGTAATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
9 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTTGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
10 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGCTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAATTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
11 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTAGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
12 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATGTCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
13 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGCGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
14 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCTTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
15 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCCTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
16 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CTACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
17 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGGG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
18 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAACGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
19 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGAGGGCAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
TTGAGGGGGTTTCGCGGTGGATAATGCGACCCTCACTCGCTTCTTTGCA
20 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTCGGTTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
CCACTGTGATTACAAACTTATTGTCGGCTATCCCCTATTTAGGTAAAATATTGGTTGAGTGAGT
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21 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGCTACGTTCTGCCTTGAGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
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22 TTAACCATGGGAGCAGCCTTTCTTGGTTACGTTCTGCCTTGGGGACAGATATCTTTCTGAGGAG
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