Campus de Araçatuba

Laboratório de Parasitologia e Enfermidades Parasitárias - Faculdade de Medicina Veterinária Departamento de Apoio Produção e Saúde Animal DAPSA – Rua Clóvis Pestana, 793, CEP 16050-680 Araçatuba- SP

Tel (18) 3636-1383 e-mail: bresciani@fmva.unesp.br

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA MANIPULAÇÃO DE

PRODUTOS QUÍMICOS E AMOSTRAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIOS DE

PARASITOLOGIA VETERINÁRIA E

ENFERMIDADES PARASITÁRIAS DOS ANIMAIS

Docente responsável: Profa. Adj. Katia Denise Saraiva Bresciani

Técnico Laboratorial: Dr. Luiz Gustavo Ferraz Lima

Assistente de Suporte Acadêmico Nível II: Gilmara Castilho

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1. Introdução

No Laboratório de Parasitologia e Enfermidades Parasitárias, são manipulados fluídos

biológicos que potencialmente podem albergar microrganismos da Classe de Risco II

(moderado risco individual e limitado risco para a comunidade). Nessa categoria, estão

inclusos os agentes biológicos que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo

potencial de propagação na comunidade e de disseminação no meio ambiente é limitado e

para os quais existem medidas terapêuticas e profiláticas eficazes como helmintoses e

protozooses de animais, com características zoonóticas. Dentre esses organismos destacam-se

diversos gêneros de helmintos como Toxocara spp. e Ancylostoma spp. e protozoários, como

Cryptosporidium, Toxoplasma, Giardia e Leishmania.

O conhecimento sobre o nível de risco por contato com fluídos biológicos das diversas

espécies animais, ainda não está totalmente esclarecido. Assim, existe também a possibilidade

desses fluídos estarem infectados por bactérias e vírus de patogenicidade desconhecida,

particularmente durante a manipulação de amostras fecais e de sangue.

2. Risco Biológico

2.1 Risco para Toxocara – Larvas Migrans Visceral (LMV) e Larvas Migrans Ocular

(LMO)

A larva migrans visceral (LMV) é uma síndrome causada pela migração

de larvas de Toxocara canis e Toxocara cati pelo organismo humano.

Como essas larvas (L3) não podem se reproduzir em humanos, elas migram por

vários tecidos do corpo, como coração, causando miocardite, músculos, pulmões e até para

o sistema nervoso central, onde podem provocar encefalites, meningites e convulsões. Se

essas larvas migrarem para os globos oculares, essa condição se chamará "larva migrans

ocular".

A LMV é contraída a partir da ingestão de ovos embrionados do T. canis e T. cati.

Essas formas evolutivas são eliminadas nas fezes dos cães e gatos, passam por um período de

embrionamento no ambiente, ou ainda nas amostras de fezes e se ingeridos eclodem no trato

gastrintestinal humano e as larvas migram para os tecidos para provocar a doença.

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Para o diagnóstico, é necessário a execução de biópsia dos órgãos para a visualização

das larvas. Testes sorológicos como o ELISA também são confirmatórios. O tratamento dos

sinais clínicos em função das lesões provocadas pela migração das larvas muitas vezes requer

o uso de anti-inflamatórios e antibióticos.

Risco de infecção em laboratório

Ingestão acidental de ovos embrionados de Toxocara.

2.2 Risco para Cryptosporidium – Criptosporidiose

Cryptosporidium é um gênero de protozoário apicomplexo que pode

causar criptosporidiose, com presença ou não de diarreia nos animais e no homem. A

transmissão dos oocistos é fecal-oral e pode ser prevenido por meio da filtragem e fervura da

água antes de ser bebida ou utilizada para a cocção dos alimentos.

As espécies de Cryptosporidium que mais infectam mamíferos e seres humanos

são Cryptosporidium parvum e Cryptosporidium hominis. Porém Cryptosporidium canis,

Cryptosporidium felis, Cryptosporidium meleagridis e Cryptosporidium muris também

podem causar doenças em pessoas.

A infecção com C. parvum e C. hominis ocorre principalmente pelo contato com água

contaminada. Ocasionalmente fontes de alimentos, como salada de frango, foram

identificadas como veículos de transmissão. Muitos surtos ocorreram em parques aquáticos,

piscinas comunitárias e creches.

Após a ingestão ou inalação por um hospedeiro adequado, os esporozoítos são

liberados e parasitam as células epiteliais do trato gastrointestinal ou de outros tecidos, como

o trato respiratório. Nestas células, os parasitos fazem multiplicação assexuada e

multiplicação sexuada por meio de microgametócitos (masculinos) e macrogametócitos

(femininos). Após a fertilização dos gametócitos, os oocistos esporulam desenvolvem no

hospedeiro infectado. Dois tipos diferentes de oocistos são produzidos, os de paredes espessas

para ser excretado do hospedeiro e o oocisto de paredes finas para auto-infecção. Oocistos são

infectantes assim que excretados permitindo assim a transmissão fecal-oral ou inalatória

direta e imediata.

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Para o diagnóstico, são utilizados exames coproparasitológicos para detecção dos

oocistos assim como testes sorológicos e moleculares.

Em pessoas imunocomprometidas pode causar diarreias muito mais graves,

potencialmente fatais, necessitando internação e soro intravenoso com correção de

desequilíbrios hidro-eletrolítico.

Risco de infecção em laboratório

Ingestão acidental, por meio de mão contaminada e ou inalação de oocistos

esporulados.

2.3 Risco para Toxoplasma gondii – Toxoplasmose

Toxoplasmose é uma doença infecciosa, congênita ou adquirida, sendo uma zoonose

cosmopolita causada pelo protozoário T. gondii e infectante para diversos mamíferos. Ocorre

em animais de estimação e de produção, incluindo suínos, caprinos, aves, animais silvestres,

gatos e a maioria dos vertebrados terrestres homeotérmicos (bovinos, suínos, cabras, etc.)

Este coccidio compromete seriamente as gestações, gerando abortos e nascimento de

fetos malformados. A forma congênita pode apresentar graves sequelas tardias, mesmo em

crianças assintomáticas ao nascimento.

O diagnóstico oportuno da infecção permite o tratamento adequado da gestante, capaz

de reduzir a gravidade das sequelas da toxoplasmose no feto. Porém, permanece elevada a

frequência de gestantes susceptíveis a essa infecção no país. T. gondii possui três formas

infectantes em seu ciclo de vida.: oocistos, bradizoítos (contidos em cistos) e taquizoítos.

O gato e outros felideos, que são os hospedeiros definitivos, estão relacionados com a

produção e eliminação dos oocistos (ovos) e perpetuação da doença, uma vez que somente

neles ocorre a reprodução sexuada do parasito. Eles ingerem os cistos que estão nos tecidos

dos animais homeotérmicos, principalmente dos ratos e pássaros. Após essa ingestão, passam

a eliminar nas fezes os oocistos não esporulados por um período médio de quinze dias. No

ambiente, sob condições ideais de temperatura, pressão, oxigenação e umidade, os oocistos

levam de um a cinco dias para esporular e se tornarem infectantes.

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A toxoplasmose pode ser adquirida pela ingestão de água e/ou alimentos

contaminados com os oocistos esporulados, presentes nas fezes de gatos e outros felídeos, por

meio de carnes cruas ou mal passadas, principalmente de porco e de carneiro, que abriguem

os cistos do protozoário T. gondii.

O diagnóstico é pela sorologia, ou seja, detecção dos anticorpos específicos contra o

parasito, como as imunoglobulinas IgM, que só existem nas fases agudas, e IgG que está

aumentada na fase crônica da doença.

Na maioria dos casos não é necessário tratamento já que o sistema imunitário

geralmente resolve o problema, entretanto quando necessário, podem ser preconizadas

espiramicina, pirimetamina e sulfadiazina, para controlar a multiplicação deste protozoário.

Clinicamente é difícil fazer o diagnóstico porque os casos agudos podem levar à morte ou

evoluir para a forma crônica. Esta pode assemelhar a outras doenças (mononucleose, por

exemplo).

Risco de infecção em laboratório

Ingestão acidental, por meio de mãos contaminadas e ou inalação de oocistos

esporulados.

2.4 Risco para Giardia lamblia - Giardíase ou Giardiose é a doença provocada pela

A giardíase costuma ser assintomática, mas pode causar diarreia e má absorção

intestinal de gorduras. Essa enfermidade está presente em praticamente todo o mundo, mas

afeta principalmente crianças em populações de baixo nível econômico e em regiões de clima

tropical ou subtropical ou no calor sol muito quente que pode causar doenças.

As principais manifestações da giardíase são diarreia, cólica, e perda de peso ou, no

caso de crianças, falha em ganhar peso. Tipicamente, a diarreia é caracterizada por um

excesso de gorduras nas fezes, o que recebe o nome de esteatorreia.

A giardíase é causada principalmente pela ingestão de água ou alimentos

contaminados por fezes contendo pelo menos 10 a 100 cistos de Giardia duodenalis. A

exposição deste protozoário ao suco gástrico não causa sua eliminação, porém o pH alcalino

do duodeno ocasiona a transformação dos cistos em trofozoítas, que aderem à parede

do intestino delgado (daí os nomes alternativos Giardia intestinalis e Giardia duodenalis).

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Cerca de nove dias (de seis a 15) após a infecção, a pessoa começa a eliminar cistos pelas

fezes, que podem então contaminar outras pessoas.

Discute-se ainda a importância da transmissão por contato próximo entre duas pessoas

(por exemplo, em creches), ou com animais domésticos, ou ainda por relações sexuais anais.

Para o diagnóstico, é necessário exame coproparasitológico para visualizar-se os

cistos, assim como testes sorológicos e moleculares.

O medicamento mais utilizado no tratamento para a giardíase é o metronidazol, mas

outra opção com eficácia similar, inclue o metronidazol, secnidazol ou tinidazol; ou

então albendazol por três a cinco dias.

Risco de infecção em laboratório

Ingestão acidental, por meio de mão contaminada e ou inalação de cistos.

2.5 Risco para Leishmania spp. Leishmaniose visceral (LV)

A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como calazar e febre negra, é a

forma mais severa dessa zoonose. É a segunda maior causa de morte por parasito no mundo,

depois da malária, estimando-se que cause 60 000 de mortes cada ano entre até dois milhões

de infecções mundiais. O parasito migra para os órgãos viscerais, como fígado, baço e medula

óssea e, caso se desenvolva a doença e se deixado sem tratamento, quase sempre resultará

na morte do hospedeiro humano. Sinais e sintomas incluem febre, perda de peso, anemia e

hepatoesplenomegalia. De preocupação particular, de acordo com a Organização Mundial de

Saúde (OMS), é o problema emergente da co-infecção HIV/LV, mas que tem vindo a ser

reduzido devido a terapias eficazes para a infeção com HIV.

Os flebotomíneos são cruciais na transmissão da leishmaniose visceral, que ocorre

quando os insetos se alimentam de humanos ou de animais infectados. A seguir, o

crescimento dos flagelados no tubo digestivo do vetor torna-se suficiente para assegurar sua

inoculação em hospedeiros susceptíveis.

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A leishmaniose visceral canina é uma doença mortal de curso lento e de difícil

diagnóstico, pois um cão pode estar infectado e não mostrar nenhuns sintomas exteriores. É

causada pelo protozoário Leishmania, transmitido pela picada de flebótomos (insetos)

infectados. O cão é considerado o principal reservatório da doença no meio urbano, mas não o

único. Os sintomas no cão são bastante variáveis, sendo comum na Leishmaniose cutânea o

aparecimento de lesões graves na pele acompanhadas de descamações e, eventualmente,

úlceras, falta de apetite, perda de peso, lesões oculares (tipo queimaduras), atrofia muscular e,

o crescimento exagerado das unhas. Em um estágio mais avançado, podem ser observadas

alterações renais, hepáticas e esplênicas, podendo evoluir para óbito do animal. Devido à

variedade e à falta de sintomas específicos, o médico veterinário é o único profissional

habilitado a fazer um diagnóstico da doença. Mesmo sendo considerada pela Organização

Mundial de Saúde (OMS) uma das seis maiores epidemias de origem parasitária do mundo, a

leishmaniose visceral canina continua a se expandir no mundo.

O diagnóstico da Leishmania spp. pode ser feito pela observação direta microscópica

dos parasitos em amostras de linfa, sanguíneas (raramente) ou de biopsias de baço, ou pele

(no caso de leishmaniose cutânea), após cultura ou por detecção do DNA dos parasitos ou por

testes imunológicos, como ELISA, imunofluorescência, contra-imuno eletroforese ou testes

rápidos (rK39). A Reação de Montenegro pode ser usada para detetar infeções passadas. O

tratamento humano é feito por administração de compostos de

antimônio, pentamidina, marbofloxacino, anfotericina ou miltefosina.

Risco de infecção em laboratório

Inoculação acidental de agulhas contaminadas com formas amastigotas, utilizadas na

obtenção de amostras de aspirado de linfonodo canino, durante o preparo de lâminas para

diagnóstico parasitológico.

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3. Procedimentos operacionais padrão para manipulação de amostras biológicas ou

reagentes químicos

Todas as atividades no Laboratório de Parasitologia e Enfermidades Parasitárias

devem ser realizadas de acordo com as condições previstas para o Nível de Biossegurança 2

(NB-2).

Neste documento, estão relacionados os procedimentos padrão comuns a todas as

técnicas relacionadas à manipulação de amostras biológicas ou de reagentes químicos,

visando à segurança do pessoal do laboratório. Os protocolos detalhados de cada técnica

utilizada estão disponíveis no laboratório.

3.1 Procedimentos antes do início dos trabalhos

• Somente pessoas autorizadas podem entrar no laboratório. Durante o trabalho, as portas

devem ser mantidas fechadas.

• O uso de tamancos, sandálias e chinelos é proibido no ambiente do laboratório. Utilize

calçados fechados.

• Objetos de uso pessoal devem ser guardados em armário disponível para essa finalidade,

incluindo mochilas, pastas, etc.

• É proibido utilizar relógios, anéis, brincos ou outros objetos que podem interferir na

utilização de luvas ou ser contaminados durante a manipulação de amostras.

• É proibida a utilização de aparelho celular durante a manipulação de amostras químicas ou

biológicas.

3.1.2 Procedimentos durante a execução dos trabalhos

• Lave as mãos antes de iniciar o trabalho e após a manipulação de reagentes químicos ou de

amostras biológicas, mesmo após o uso de luvas de proteção, bem como antes de deixar o

laboratório.

• Adquira o hábito de conservar as mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto.

• É obrigatória a utilização dos seguintes equipamentos de proteção individual (EPI):

• Cabelos compridos deverão ser presos.

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Protetores faciais e oculares: utilize máscara de proteção facial e óculos de proteção ao

manipular qualquer reagente (líquido ou pó) que possa ser inalado/ingerido (ex: dodecil

sulfato de sódio, isotiocianato de guanidina).

Vestimenta tipo jaleco: é obrigatória no ambiente do laboratório. No caso, de serem usadas

para manipulação de amostras reconhecidamente positivas para as espécies já relatadas

deverão ser obrigatoriamente descartadas após o uso, em recipiente para lixo biológico.

Luvas: Para manipulação de amostras biológicas, utilize luvas de látex descartáveis e óculos

de proteção. Para manipulação de reagentes químicos, utilize luvas de acordo com sua

resistência química (http://www.unesp.br/portal#!/costsa_ses/curso-de-gestao-de-epi/)

É proibido utilizar qualquer EPI em ambientes fora do laboratório.

Equipamentos de proteção coletiva (EPC), como cabines de biossegurança ou cabines

de exaustão deverão ser utilizados, obrigatoriamente durante a manipulação de amostras

biológicas ou de reagentes químicos destinados a esses fins. Na cabine de biossegurança,

deve haver sinalização informando sobre a utilização de luz UV.

• A manipulação de substâncias líquidas voláteis ou irritantes como éter, fenol e ácido

clorídrico deve ser realizada na cabine de exaustão.

• Procedimentos para a cabine e capelas destinadas à PCR (preparo de mix e adição de DNA):

ligue a lâmpada UV 30 minutos antes e 30 minutos após a realização de suas atividades. Caso

haja contaminação com solução contendo DNA, proceda à limpeza com hipoclorito de sódio

2%, deixe a solução agir por 10 minutos e depois retire o excesso com toalha absorvente e

água e ligue a lâmpada UV por 30 minutos.

• Procedimentos para a cabine de biossegurança destinada à manipulação de amostras

biológicas (tecidos e fezes): ligue a lâmpada UV 30 minutos após a realização de suas

atividades. Caso haja contaminação da cabine de segurança biológica com amostras

biológicas com status de contaminação desconhecido, o local da contaminação deve ser

coberto com papel toalha embebido em hipoclorito de sódio 2%, por 10 minutos, seguindo-se

desinfecção com álcool 70º C e exposição à luz UV por 30 minutos.

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• Caso haja contaminação da cabine de segurança biológica com amostras contaminadas, o

local da contaminação deve ser coberto com papel toalha, seguindo-se a aplicação de

peróxido de hidrogênio 6%, por 30 minutos, a limpeza com álcool 70º C e exposição à luz

UV por 30 minutos.

• Durante a manipulação de amostras fecais contendo agentes infecciosos, incluindo

Cryptosporidium spp., todo o material reaproveitável (tubos, frascos de plástico, vidraria,

etc.) deve ser imerso em água quente (no mínimo 70º C por 15 minutos).

3.1.3 Procedimentos após o término dos trabalhos

• Qualquer material armazenado no laboratório deve estar organizado e claramente

identificado. Não armazene amostras ou reagentes em sacos plásticos, frascos de margarina,

papel alumínio, etc. Utilize frascos e caixas adequadas para armazenamento.

• Sempre proceda à limpeza total de qualquer superfície ou equipamento, imediatamente após o

uso, como pias, bancadas, fluxo laminar, armários, gavetas, banho-maria, balanças e

centrífugas, utilizando papel toalha descartável embebido em álcool 70%.

• Remova qualquer solução ou reagentes (solução salina, solução de Sheather, bicromato de

potássio) presentes em equipamentos como balança, centrífuga logo após o uso. Faça a

limpeza com álcool 70% ou então, em caso de centrifugação de material infeccioso, coloque

o rotor da centrífuga em água quente (no mínimo 70º C por 15 minutos). Nunca deixe a

limpeza e a desinfecção para serem realizadas no outro dia.

• Micropipetas ou qualquer outro material utilizado para manipulação de material biológico

devem ser limpas com papel toalha embebido em álcool 70% e submetidas à luz UV por 30

minutos, no interior da cabine de biossegurança ou capela.

• Nunca deixe qualquer material sobre a bancada, como pedaços de papel alumínio, tubos,

adesivos, fitas, grampos, etc.

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3.1.4 Descarte de resíduos biológicos

Resíduos de material biológico, incluindo amostras fecais e material de consumo

contaminados com amostras biológicas devem ser descartados em recipiente adequado para

lixo biológico, disponível no laboratório.

3.1.5 Descarte de resíduos químicos

Várias substâncias químicas são manipuladas no laboratório. Os resíduos químicos

devem ser embalados, rotulados e armazenados para posterior envio para destinação final,

conforme preconizado pelo manual de descarte de resíduos químicos da unidade.

Materias perfurocortante (lâmina de vidro, agulhas e outro) deverão ser

acondicionados em caixa descarpack, em seguida colocada em saco de lixo biológico branco

com identificação de material perfuro cortante, origem e data.

3.1.6 Descarte de material perfurocortante

Os materiais perfurocortantes, tais como, agulhas de injeção, lâmina de bisturi,

lâminas histológicas, lamínulas, ampolas de medicamentos ou qualquer vidraria quebrada e

contaminada com amostra química ou biológica, devem ser descartados em caixas

apropriadas para a coleta de materiais perfurocortantes. Vidraria quebrada e não contaminada

pode ser descartada em lixo reciclável.

3.1.7 Procedimentos em caso de acidentes

Acidente com substâncias químicas

A FISPQ (Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos) dos produtos

químicos utilizados no laboratório deve estar acessível a todas as pessoas que manipulam

agentes químicos no laboratório. As informações dessa ficha, referentes à identificação dos

perigos e medidas de primeiro-socorros, devem ser utilizadas para elaboração dos

procedimentos necessários em caso de acidentes com agentes químicos.

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Como procedimento emergencial, em caso de:

Contato com a pele: lavar abundantemente com água corrente e remover

imediatamente as roupas contaminadas. Se necessário, utilizar o chuveiro de emergência.

Contato com os olhos: lavar com o chuveiro lava-olhos por 15 minutos e procurar

assistência médica.

.

Acidente com material biológico:

A porta de entrada das espécies já descritas é principalmente a via oral e, em menor

frequência, as vias respiratória ou conjuntiva ocular, e abertura na pele. Em caso de contato

com solução contendo oocistos com a mucosa oral ou a conjuntiva ocular, deve-se proceder

imediatamente à lavagem do local (chuveiro lava-olhos) ou com água corrente. O responsável

pelo laboratório deve ser imediatamente comunicado. Em caso de contato de mucosas com

oocistos infectantes, a pessoa possivelmente infectada deve ser encaminhada para assistência

médica. O único tratamento preconizado para a criptosporidiose é a administração de

nitazoxanida (Annita®), após prescrição médica.

Material biológico com status de contaminação desconhecido:

Em caso de contato com a mucosa ocular, proceder à lavagem em chuveiro lava-olhos,

com água corrente. Após contato com a pele, lavar com água e sabão, enxaguar e realizar

antissepsia com álcool 70%.

Local de atendimento médico e contatos de plantões de informações

Quando necessário, a pessoa exposta a substâncias químicas ou agentes biológicos

deverá ser encaminhada ao Pronto Socorro Municipal de Araçatuba no endereço: rua Dona

Ida, 1350, Bairro Aviação (Telefone: 3636-1160). Em caso de impossibilidade de

encaminhamento, solicitar atendimento ao Serviço de Atendimento Municipal de Urgência –

SAMU (Telefone: 192).

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Para sanar dúvidas sobre qualquer tipo de intoxicação, utilize o “Disque-Intoxicação”,

da ANVISA, pelo número 0800-722-6001. A ligação é gratuita e o usuário é atendido por

uma das 36 unidades da Rede Nacional de Centros de Informação e Assistência Toxicológica

(Renaciat).

Outras alternativas para assistência em casos de intoxicação com produtos químicos:

1) Centro de Assistência Toxicológica de São José do Rio Preto/SP, Hospital de Base -

Fundação Faculdade Regional de Medicina (FUNFARME). Av. Brigadeiro Faria Lima, 5416,

Bairro São Pedro. Telefone (17) 3201-51000, ramais 1380 ou 1560. Atendimento 24 h pelo

telefone (17) 3201-5175. e-mail: ceatox.hbase@famerp.br.

2) Centro de Assistência Toxicológica (CEATOX) do Instituto de Biociências, UNESP,

Campus de Botucatu. O CEATOX oferece atendimento telefônico na prevenção, orientação e

informações tóxico-farmacológicas a profissionais de saúde, hospitais, prontos-socorros,

postos de saúde e à comunidade em geral por meio dos contatos: telefone (14) 3815-3048 e

plantão telefônico 24 horas pelo número 0800-722-6001. E-mail: ceatox@ibb.unesp.br.

Os contatos de outros centros de assistência toxicológica estão relacionados no endereço

http://www.cvs.saude.sp.gov.br/procura_det.asp?procura_id=6

CIENTE E DE ACORDO: Todos que realizam atividades no laboratório.