PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA DISSERTAÇÃO...
73
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ALEX CARVALHO ALAVARSE Desenvolvimento e caracterização de arcabouços à base de blendas poliméricas de PVA e de Quitosana para engenharia de tecido Santo André Setembro de 2015
Transcript of PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA DISSERTAÇÃO...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ALEX CARVALHO ALAVARSE
Desenvolvimento e caracterização de arcabouços à base de blendas
poliméricas de PVA e de Quitosana para engenharia de tecido
Santo André
Setembro de 2015
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ALEX CARVALHO ALAVARSE
Desenvolvimento e caracterização de arcabouços à base de blendas
poliméricas PVA e Quitosana para engenharia de tecido
Trabalho apresentado como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnociência pela Universidade Federal do
ABC, sob orientação do Professor Doutor Jean
Jacques Bonvent.
Santo André
Setembro de 2015
AGRADECIMENTOS
À instituição e pessoas citadas, fazem parte de um trecho desta dissertação ao qual alguns também
vou carregar comigo na estrada dessa vida e a eles que eu agradeço:
Universidade Federal do ABC, a instituição ao qual escolhi e tenho orgulho de ter feito parte dela
A Jean Jacques Bonvent, meu orientador que me acolheu e deu suporte ao longo desta tese
A Everaldo Venâncio e Maria Raquel pela colaboração de ensaiors fundamentais desta tese
Aos amigos Jandir, Carlos Eduardo, Juliana, Viviam, Asaph, Cynthia, Leonardo, Érica e Giulia
“Você é do tamanho dos seus sonhos”
Emicida.
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................................................... 16 ABSTRACT ...................................................................................................................................... 17 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 20 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................. 22 2.1 ENGENHARIA DE TECIDO BIOLÓGICO .......................................................................... 22
2.2 POLÍMEROS PARA ENGENHARIA DE TECIDO ............................................................. 25 2.2.1 QUITOSANA .......................................................................................................................... 25 2.2.2 PVA .......................................................................................................................................... 26 2.2.3 BLENDAS POLIMÉRICAS .................................................................................................. 27 2.3 ARCABOUÇOS POLIMÉRICOS ........................................................................................... 28
2.3.1 HIDROGÉIS............................................................................................................................ 28 2.3.2 MEMBRANAS FINAS ........................................................................................................... 28 2.3.3 NANOFIBRAS ........................................................................................................................ 29
2.4 ELETROFIAÇÃO ..................................................................................................................... 30 2.5 TEORIA DA ELETROFIAÇÃO .............................................................................................. 32 2.6 PARÂMETROS DA ELETROFIAÇÃO E A FORMAÇÃO DE NANOFIBRAS .............. 33 2.7 PARÂMETROS DA SOLUÇÃO .............................................................................................. 35
3. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 39
3.1 OBJETIVO PRINCIPAL .......................................................................................................... 39 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 39 4. MATERIAIS E METODOLOGIA DO TRABALHO ...................................................... 40
5. CARACTERIZAÇÃO .......................................................................................................... 42 5.1 VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES POLIMÉRICAS ............................................................ 42
5.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ARCABOUÇOS ............................................................. 42 5.2.1 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM) .............................................................. 42 5.2.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) ........................................... 44
5.3 ANÁLISE DAS INTERAÇÕES MOLECULARES NOS ARCABOUÇOS ........................ 45
5.4 ANÁLISE DINÂMICO-MECÂNICA (DMA) ........................................................................ 45 5.5 ANÁLISE TÉRMICA DOS ARCABOUÇOS ......................................................................... 46 5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................ 47
5.7 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ......................................................................................... 47 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 48 6.1 VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES POLIMÉRICAS ............................................................ 48
6.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ARCABOUÇOS ............................................................. 48 6.3 ANÁLISE POR FTIR-ATR ...................................................................................................... 54
6.4 PROPRIEDADES MECÂNICAS DAS NANOFIBRAS ........................................................ 56 6. 5 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA .................................................................................. 56 6.7 RETICULAÇÃO DOS ARCABOUÇOS ................................................................................. 61
7. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 63 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 64
Índice de Figuras
Figura 1: Estrutura molecular da quitosana formada por um anel glicosamina (esquerda) e N-
acetilglicosamina (direita). ................................................................................................................. 26 Figura 2: estrutura do PVA ............................................................................................................... 27 Figura 3: Esquema básico do arranjo experimental da técnica de eletrofiação. ............................... 31
Figura 4: Representação da formação de um cone de Taylor em uma solução polimérica.. ............ 32 Figura 5: Três exemplos de coletores rotacionais para eletrofiação. Na ordem: coletor cilíndrico,
disco e cilíndrico com fendas [fonte: http://www.electro-spinning.com/]. ........................................ 35 Figura 6: Representação de eletrofiação com dois eletrodos condutores elétricos paralelos e sua
respectiva morfologia . ....................................................................................................................... 35
Figura 7: Representações de interações intermoleculares e intramoleculares entre as cadeias
poliméricas do PVA e da quitosana. ................................................................................................... 37 Figura 8: a): Equipamento utilizado para eletrofiação: (A) bomba automática para controle de
vazão da solução polimérica na seringa (sobre a bomba); (B) fonte de alta tensão; (C) coletor
metálico. 8 b): Pequena parte da amostra (em branco) obtida de nanofibras PV A/Quitosana. ........ 41 Figura 9:Esquema mostrando o princípio básico do AFM: o circuito de retorno controla a força
entre a ponta e a amostra enquanto ocorre uma varredura em sua superfície. ................................... 43
Figura 10: Tipos de interação ponta-amostra na técnica AFM . ....................................................... 43 Figura 11: Imagem de um esquema básico de funcionamento de um MEV. .................................... 44 Figura 12: Viscosidade das soluções de PVA e PVA/Quitosana. ...................................................... 48 Figura 13: Imagens por AFM (modo contato) das amostras dissolvidas em água e ácido acético. a)
e b) PVA/Quit. 100/0; c) e d) PVA/Quit. 90/10; e) e f) PVA /Quit. 80/20; g) e h) PVA/Quit. 70/30. 50 Figura 14: Média (n = 75) dos diâmetros das amostras de nanofibras PVA /Quit. 100/0; PVA/Quit.
90/10; PVA /Quit. 80/20; PVA /Quit. 70/30. ...................................................................................... 50 Figura 15: Imagens por MEV das amostras utilizando água eácido acético como solventes com
PVA. a) e b) referentes à amostra PVA /Quit. 100/0; c) e d) à amostra PVA /Quit. 90/10; e) e f) à
amostra PVA /Quit. 80/20; g) e h) PVA /Quit. 70/30. ........................................................................ 51
Figura 16: Histograma das distribuições dos diâmetros das nanofibras a) PVA /Quit. 100/0; b) à
amostra PVA /Quit. 90/10; c) PVA /Quit. 80/20; e d) PVA /Quit. 70/30. e) Teste de Tukey para
avaliação de semelhança de variância entre as amostras. . f): média e desvio padrão do diâmetro das
nanofibras e o comportamento das amostras ) .................................................................................. 52 Figura 17: Exemplo de uma amostra editada para análise de porosidade de uma camada superficial
de nanofibras. A imagem original (esquerda), é convertida para imagem binária (direita) sendo
possível estimar a porcentagem de porosidade. ................................................................................. 53 Figura 18: Espectros de FTIR das amostras Quitosana em pó (vermelho), e nanofibras
PVA/Quitosana 100/0 (vinho), PVA/Quitosana 90/10 (Azul turquesa), PVA/Quitosana 80/20
(laranja) e PVA/Quitosana 70/30 (azul). .......................................................................................... 54 Figura 19: comportamento mecânico sob tensão controlada das amostras PVA/Quitosana 100/0 e
PVA/Quitosana 80/20. ........................................................................................................................ 56 Figura 20: Curvas das perdas de massa das amostras Quitosana em pó (vermelho), e nanofibras
PVA/Quitosana 100/0 (vinho), PVA/Quitosana 90/10 (Azul turquesa), PVA/Quitosana 90/20
(laranja) e PVA/Quitosana 70/30 (azul) ........................................................................................... 57
Figura 21:Testes de crescimento de bactérias S. aureus em ágar em TSB. Todas as amostras não
conseguiram inibir o crescimento das bactérias. a) PVA/Quitosana 100/0; b) PVA/Quitosana 90/10;
c) PVA/Quitosana 80/20; d) PVA/Quitosana 70/30. .......................................................................... 59 Figura 22: Micrografia por MEV da amostra PVA/Quitosana/Tetracilina. ..................................... 59
Figura 23:FTIR de amostra PVA/Quitsana 90/10 (vermelho) e PVA/Quitsana/tetraciclina 90/10/1%
(verde). .............................................................................................................................................. 60
Figura 24: Teste de crescimento de colônias de bactéria S. aureus de uma alçada de um tubo
contendo nanofibras com tetraciclina. ............................................................................................... 60
Figura 25:Representação da formação de grupos acetal entre PVA e glutaraldeído. ........................ 61
Figura 26: Estabilidade das amostras de PVA/Quitosana 80/20.. ..................................................... 61
Figura 27: FTIR das amostras PVA/Quitosana 100/0 sem tratamento (vermelho) e PVA/Quitosana
100/0 tratadas com glutaraldeído (azul). ........................................................................................... 62 Figura 28: Testes de inibição de crescimento em amostras de nanofibras de PVA e PVA/Quitosana
com tratamento químico com vapor de glutaraldeído.. ...................................................................... 62
Índice de Tabelas
Tabela 1:Polímeros e blendas utilizadas em arcabouços, características e aplicações. ..................... 24 Tabela 2: Levantamento da literatura dos parâmetros e média dos diâmetros das nanofibras entre
PVA e quitosana. ................................................................................................................................ 38
Tabela 3: Configurações das soluções poliméricas utilizadas para eletrofiação. .............................. 40 Tabela 4: Percentual da porosidade dos arcabouços poliméricos. .................................................... 53 Tabela 5: Principais picos identificados em PVA e Quitosana. ........................................................ 55 Tabela 6: Valores de tensão de escoamento e limite de resistência a fratura .................................... 56 Tabela 7: Valores dos principais eventos das amostras por TGA. ..................................................... 58
LISTA DE ABREVIATURAS
PVA – Poli(álcool vinílico)
Quit - Quitosana
PU – Poli(uretano)
PMMA – Poli(metilmetacrilato)
PEG – Poli(etilenoglicol)
Ppy – Poli(pirrol)
MEC – Matriz extra-celular
GAG – Glicosaminoglicanos
Hac. – Ácido acético
MM – Massa Molecular
TGA – Análise Termogravimétrica (sigla em ingês).
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
AFM – Microscopia de força atômica (sigla em inglês)
FTIR-ATR – Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier modo
refletância atenuada total (sigla em inglês)
GA - Glutaraldeído
RESUMO
Arcabouços são estruturas de inserção para suporte e regeneração de tecidos
biológicos. Vários estudos mostraram que, quando constituídas por nanofibras de
biopolímeros, essas estruturas tridimensionais apresentam características favoráveis, tais
como biocompatibilidade, não-toxicidade e biodegrabilidade, para adesão e proliferação
de componentes da matriz extra-celular. Este trabalho teve como objetivo desenvolver
nanofibras poliméricas à base de Poli (álcool vinílico) (PVA) e quitosana, avaliar suas
características morfológicas e atividade bactericida in vitro para possível aplicação
como arcabouço para reparo tecidual. Filmes com nanofibras poliméricas foram obtidos
pelo método de eletrofiação com diferentes parâmetros da solução polimérica, formada
pela mistura de dois biopolímeros, o PVA (10%) e a Quitosana (1%). A morfologia dos
filmes foi estudada por imagens de microscopia de força atômica (AFM) e microscopia
eletrônica de varredura (MEV), comparando o diâmetro das estruturas das nanofibras
obtidas de acordo com as mudanças dos parâmetros da solução polimérica. A análise da
estrutura molecular dos filmes foi realizada por espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR-ATR); a análise térmica e mecânica das amostras foi
efetuada por análise termogravimétrica (TGA) e análise dinâmica mecânica (DMA),
respectivamente. Como teste de bioatividade, as amostras foram postas em contato com
bactérias Staphylococcus aureus (ATCC 6538) para análise de inibição de crescimento.
As nanofibras foram obtidas com o diâmetro variando de acordo com a proporção de
quitosana na solução polimérica, além de obter fibras mais uniformes e com menos
contas com PVA. As blendas de PVA e Quitosana foram obtidas de forma homogênea
com aumento da estabilidade térmica e menos resistente a deformação, além de
preservar características intermoleculares de cada polímero em suas blendas. Nanofibras
com diferentes frações de quitosana em solução polimérica não foram capazes de inibir
o crescimento de bactérias, apresentando atividade bactericida somente quando
misturadas ao cloridrato de tetraciclina (1%). Tais arcabouços necessitam de estudos
mais aprofundados para a aplicação na engenharia de tecidos, para a promoção do
reparo tecidual.
Palavras-chaves: Arcabouço, Nanofibras, Análise Mecânica, Reparo
Tecidual, Eletrofiação.
ABSTRACT
Scaffolds are materials applied for support and tissue regeneration. Nanofibers
produced by polymeric matrix should attend some basics demands for scaffolds such as
being biocompatible, nontoxic, biodegradable, allowing adhesion and growing of the
matrix extra cellular components (fibroblast, collagens and integrins). The aims of this
work was to develop polymeric nanofibers, with morphological characteristics and
bactericidal activity for cell proliferation, as future scaffold candidate for skin wound
repair. The polymeric nanofibers were obtained by electrospinning method with
different solutions parameters of a mixture of Poly (vinyl alcohol) (PVA) (10 %) and
Chitosan (1%). Atomic Force Microscopy (AFM) and Scanning Electron Microscopy
(SEM) was used in order to analyze the morphology of scaffold surface, in terms of
fiber diameter and density, as well as surface layers porosity. Molecular analysis was
performed with Fourier Transformed Infrared (FTIR-ATR mode); Thermal and
mechanical properties of the scaffold were investigated by means of TGA and DMA,
respectively. As bioactivity test, samples were placed in contact with Staphylococcus
aureus bacteria (ATCC 6538) for growth inhibition analysis. The nanofibers were
obtained with the diameter varying with the proportion of chitosan in the polymer
solution, plus fibers uniform and less beads with PVA. The blends of PVA and chitosan
were obtained homogeneously with increased thermal stability and less resistant to
deformation, in addition to preserving intermolecular characteristics of each polymer in
their blends. Nanofibers with different fractions of chitosan polymer solution were
unable to inhibit the growth of bacteria, showing bactericidal activity only when mixed
with tetracycline hydrochloride (1%). Such frameworks require further study for
application in tissue engineering, to promote tissue repair.
Key words: Scaffold, nanofibers, Mechanical Analysis, Tissue Repair,
Electrospinning.
20
1. INTRODUÇÃO
Lesões severas e agudas em tecidos como a pele, cartilagem, artéria e osso, podem
ocasionar um comprometimento ou perda da sua função. Em lesões graves, podendo
resultar em perda do membro, cicatrizes hipertróficas ou infecções, faz-se necessário o
enxerto de tecido ou até mesmo implante de prótese artificial a fim de suplantar o dano.
Entretanto, essas intervenções nem sempre são ideais, pois o paciente pode apresentar
uma rejeição em decorrência de incompatibilidade sanguínea, além da eventual
manutenção ou troca da prótese. Como alternativa, procura-se cada vez mais o emprego
de materiais biorreabsorvíveis, com estruturas tridimensionais, capazes de regenerar o
tecido lesionado.
Os arcabouços são sistemas obtidos a partir de materiais biocompatíveis, que
devem levar em conta propriedades relacionadas ao tecido biológico, a fim de aprimorar
a regeneração tecidual. Os biopolímeros são aspirantes para a formação de arcabouços
por fornecer diferentes superfícies que se adequam a tipos específicos de tecidos
biológicos. Os biopolímeros podem ser extraídos de fontes naturais ou sintetizados. Os
polímeros naturais vêm ganhando espaço por serem economicamente viáveis, e por
possibilitar a obtenção de suportes celulares para adesão e crescimento. Contudo, suas
propriedades mecânicas não são compatíveis a uma matriz extra-celular, o que torna
necessário a combinação com certos polímeros sintéticos, por copolimerização ou pela
formação de blendas. A mistura física de ambos ou mais polímeros é conhecido como
blendas poliméricas, onde suas funcionalidades são agregadas permitindo utiliza-las em
arcabouços em diferentes tecidos. Os tipos de arcabouços poliméricos variam de acordo
com sua estrutura e destacam-se materiais poliméricos feitos à base de membranas
finas, hidrogéis e fibras.
A eletrofiação de polímeros é uma técnica que fornece fibras com diâmetros que
podem variar de dezenas de nanômetros até centenas de micrômetros, sendo de grande
interesse para aplicações biológicas, incluindo arcabouços. A combinação de diferentes
solventes ou polímeros, além da configuração do dispositivo permite produzir fibras de
variados tamanhos de diâmetros, poros e rugosidade. A técnica de eletrofiação é
emergente na área de arcabouços, sendo também incluída na fabricação de biomateriais
na engenharia de tecidos, que utiliza células mamárias combinadas ao arcabouço para
21
regeneração de tecido.
A estrutura das nanofibras é compatível com tecidos como a pele, pois permite a
difusão de oxigênio, a constituição de barreiras contra bactérias, além de possuir
estabilidade mecânica suficiente para o suporte de uma matriz extra-celular e substratos
para seu crescimento. Algumas proteínas, como o colágeno, apresentam essas
características semelhantes às nanofibras poliméricas [1]. Ainda há desafios a serem
superados, como a configuração e a organização da matriz de nanofibras poliméricas, a
taxa de produção de fibras em larga escala e as proporções de cada polímero na blenda
para obtenção da estrutura tridimensional com propriedades físicas e morfológicas
adequadas para a engenharia de tecido.
22
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 ENGENHARIA DE TECIDO BIOLÓGICO
Muitos acidentes e doenças acarretam a lesão de órgãos e tecidos dos mais
variados tipos, necessitando de realização de um transplante ou de um implante,
podendo resultar em muitos casos em uma rejeição do órgão ou da prótese. Uma técnica
que vem sendo bastante explorada consiste na retirada de células do próprio paciente
para cultivo in vitro em um suporte com estrutura tridimensional, para a realização de
um enxerto na região lesionada e eventualmente regenerar o tecido. Esta técnica é
conhecida por engenharia de tecido e foca em usar células mamárias e biomateriais para
diversos tecidos, como tecido ósseo, cartilagem, pele, válvulas cardíacas, nervos,
menisco, uretra e fígado [2, 3, 4].
As células de agregação também variam, embora não se tenha a informação da
função célula-célula e célula-matriz de todos os tecidos. Uma das principais proteínas
responsável pela matriz extra-celular e regeneração de tecidos é o colágeno, que pode
ser encontrada em diversas estruturas e tecidos. Muitos autores mostraram ser positivo o
uso de células mesenquimais (células troncos) já que estas mostram a capacidade de
reconhecer o tecido lesionado e diferenciar-se, até mesmo para células ósseas [5 - 7].
Estudos sobre estruturas de colágeno com células tronco da medula óssea humana
mostraram que ocorre diferenciação em células condrogênica e osteogênica, absorvendo
cálcio e fostafato, nutrientes fundamentais para o tecido ósseo [8].
O suporte para a deposição das células é conhecido como arcabouços (scaffold).
Os arcabouços podem ser elaborados a partir de uma série de materiais sintéticos e
naturais. O arcabouço exige uma série de características para a promoção da adesão e
crescimento celular. Dentre as características de um arcabouço, as principais são
viabilizar o processo de produção de proteínas e formar um novo tecido com estrutura
apropriada. A estrutura do arcabouço é determinante para operar corretamente em um
tecido. A porosidade do arcabouço é fundamental, pois permite a movimentação das
células e moléculas para diversos sítios sucedendo em seu crescimento e adesão ao
biomaterial assim como em um tecido saudável. O controle dos poros se torna
importante dependendo do tipo de tecido envolvido, sendo necessário que as estruturas
apresentem espaços com tamanhos maiores que os componentes da matriz extra-celular
e outras moléculas [9,10]. A degradação adequada de um arcabouço depende também da
23
finalidade de seu uso. Materiais usados para enxerto ósseo, por exemplo, requerem um
comportamento inerte com o tecido hospedeiro para que não se degrade rapidamente e
não tenha que ser substituído ocasionando altos custos e intervenção cirúrgica. Em
tecidos macios, a degradação de alguns materiais mostra que a reconstrução do tecido
pode aumentar, principalmente no estágio de inflamação do meio [11]. A degradação de
materiais bioreabsorvíveis também é desejada, pois sua degradação pode ser utilizada
para preenchimento de poros na matriz extra-celular, por meio de enzimas ou hidrólise
[12].
Arcabouços construídos a partir de polímeros, também classificados como
biopolímeros, é a forma mais utilizada, pois consiste em uma variedade de cadeias com
grupos funcionais diferentes, geralmente compatíveis a um tecido biológico e não-
tóxicos ao meio, sendo obtidos por síntese ou por meio natural. Esta classe polimérica
apresenta estruturas lineares, ramificadas ou ligações cruzadas, além de muitos serem
adicionados por síntese com outras cadeias moleculares, modificando sua massa
molecular e adicionando novos grupos funcionais em sua estrutura. Os biopolímeros
sintéticos termoplásticos, por exemplo, são usados na fabricação de peças automotivas,
utensílios domésticos, dispositivos eletrônicos e encapsuladores de fármacos. Sua
aplicação biomédica hoje é ampla, como no uso de arcabouços, pelo fato de ter uma
degradação mais lenta em comparação com os polímeros naturais [13].
O Poli(Uretano) (PU), por exemplo, é um polímero com um grupo uretano
(RO(CO)NHR') e começou a ser utilizado para a produção de colchões e espumas, mas,
nos anos 1980 foi aplicado para produção de biomateriais devido a sua elasticidade e
facilidade de síntese, sendo combinado com polímeros que estimulam o reparo [14] ou a
transplantes de órgãos [15]. Por outro lado, o PU tem facilidade em interagir com o
meio celular ocorrendo uma degradação rápida de sua estrutura, podendo perder
características importantes antes do tempo esperado. O poliuretano sofre reações
oxidativas, o que acelera sua decomposição afetando a longevidade do material.
Diversas copolimerizações são efetuadas com o PU a fim de desacelerar esta reação.
Suas aplicações em geral estão voltadas para materiais que não necessitam de
manutenção ou substituição, minimizando custos operatórios e dores ao paciente. Além
do PU, a Tabela 1 mostra alguns exemplos de polímeros aplicados para no enxerto de
tecido.
Os polímeros naturais são derivados de plantas e animais, formados geralmente
por grupos polissacarídeos, poliésteres ou polipeptídeos. Biopolímeros como amido,
24
celulose, quitosana, colágeno, integrinas, alginato (Tabela 1) e gelatina são usualmente
utilizados para a formação de arcabouços, apresentam biocompatibilidade e promovem
adesão e função celular. O colágeno, por exemplo, é uma classe de proteína encontrada
em tecido humano. Algumas proteínas com estruturas em forma de fibras estão
relacionadas à conectividade da pele, mas devido a sua estrutura física frágil, estas são
cultivadas em outros polímeros com maior resistência física, capaz de fornecer
substratos para o tecido lesionado e suporte físico conforme se degrada.
Tabela 1:Polímeros e blendas utilizadas em arcabouços, características e aplicações.
Polímero(s) Principais Propriedades Aplicações
Poli(uretano) (PU)
Alta flexibilidade, resistente a degradação,
superfícies porosas, compatibilidade
sanguínea
Válvula cardíaca [27]
Artéria cardíaca [28, 29]
Poli(metil metacrilato)
(PMMA)
Agente fixador de próteses ósseas, sensível a
luz UV
Tecido ósseo [30]
Implante dentário [30]
Poli(etilinoglicol)
(PEG)
Copolimerização (em bloco) com diversos
polímeros, biodegradável e hidrofílico
Tecido cartilaginoso [31]
Tecido cardíaco [32]
Poli(pirrol) (Ppy) Condutor elétrico, citotoxidade, biocompatível Tecido nervoso [33]
Nervos periféricos [34]
Alginato
Produção a baixo custo por biossíntese
bactericida, comportamento de congelamento
em presença de íons Ca2+
Tecido do fígado [35]
Tecido cartilaginoso [36]
Tecido ósseo [37], [38]
Poli(ácido lactico-co-
glicólico) (PLGA) e
Poli(álccol vinílico)
(PVA)
Blendas com perfil anfifílico, controle de
poros e biodegradação a partir da massa
molecular
Tecido adiposo [39]
Tecido cartilaginoso [40]
Gelatina e Poli(ε-
caprolactona) (PCL)
Substratos para crescimento de tecidos,
propriedades mecânicas compatíveis.
Tecido de pele [41]
Tecido cardiovascular [42]
Vasos sanguíneos [43]
Quitosana e PVA Bactericida, baixo custo de produção,
propriedades mecânicas compatíveis
Tecido vascular [44]
Tecido de pele [45]
Tecido nervoso [46]
25
2.2 POLÍMEROS PARA ENGENHARIA DE TECIDO
2.2.1 QUITOSANA
A quitosana é um aminopolissacarídeo derivado da quitina, um polímero
encontrado em exoesqueletos de crustáceos e insetos. Sua estrutura é composta por dois
anéis sacarídeos: glucosamina e N-acetil-glucosamina (figura 1). A quitosana
diferencia-se da quitina através do grau de desacetilação apresentando uma porcentagem
maior de glucosamina (> 50%) em sua estrutura, sendo solúvel em ácidos orgânicos. O
grupo amino (-NH2) da glucosamina permite reações para a copolimerização e
funcionalidades que abrangem diferentes tipos de aplicações. Sua estrutura assemelha-
se à dos glicosaminoglicanos (GAG), componente da matriz extra-celular responsável
pela regulação de vários processos celulares [16]. A complexação de quitosana em pH
ácido aos GAG, forma cadeias alongadas e com caráter dissacarídeo podendo aderir-se
às células que atuam em regeneração de tecidos, possibilitando a diminuição do tempo
do reparo da lesão.
A quitosana é insolúvel em água em pH neutro ou alcalino, e sua dissolução
ocorre em presença de ácidos orgânicos, como o ácido acético ou ácido clorídrico. Em
meio ácido, a quitosana tem sua estrutura amino protonada (-NH3+), facilitando a
solubilização em meio aquoso. Além disso, sua massa molecular e grau de desacetilação
permitem-na usá-la para diferentes finalidades. O grau de desacetilação representa a
quantidade de grupo amino disponível na cadeia polimérica e, em maior grau
percentual, somente pode ser solubilizado em meio ácido, obtendo uma maior
resistência em sua conformação estrutural, pois as cargas positivas favorecem uma
maior estabilidade às cadeias moleculares [17].
A quitosana quando empregada em lesões, estimula e induz a proliferação
celular no local [18]. Quando implantada, a quitosana atua em estágios essenciais para
o crescimento de uma nova matriz. Na fase de inflamação, por exemplo, a quitosana é
um ativador de macrófagos e neutrófilos, assim como para a granulação, migrando
fibroblastos para a nova matriz formada.
26
Figura 1: Estrutura molecular da quitosana formada por um anel glicosamina
(esquerda) e N-acetilglicosamina (direita).
As propriedades da quitosana vêm sendo testadas em vários ensaios que
envolvam regeneração ou substituição de tecidos com variados métodos de obtenção de
arcabouços [19]. Segundo CHU [20], diferentes arcabouços de quitosana foram
cultivados em hepatócitos de ratos para fígados bioartificiais. Os hepatócitos com
nanofibras apresentaram função acima de filmes finos e do material de controle, além de
ser mais biocompatíveis, não afetando a viabilização das células de adesão. A adesão e
proliferação de elastinas e colágenos com arcabouços de PVA e quitosana em forma de
fibras aplicados no tecido externo epitelial de ratos obtiveram resultados de cicatrização
melhores que em arcabouços de filmes finos e, incutido com a proteína da classe de
fator de crescimento celular, houve reconstrução do tecido epitelial por completo [21].
Diferentes bactérias são inibidas de crescimento pela quitosana, como
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium. As bactérias
Gram-negativas são inibidas quando há o rompimento da barreira da membrana externa
pela interação do grupo -NH3+ da quitosana e grupos fosforil da membrana celular [22,
23]. O efeito da quitosana em bactérias Gram-positivas também ocorre pela interação do
grupo amino da quitosana com grupos glicolipídios ou de camadas de peptidioglicanos
que circundam a membrana citoplasmática [24].
2.2.2 PVA
O Poli (Álcool Vinílico) (PVA), cuja estrutura molecular é mostrada na Figura
2, é um polímero sintético solúvel em água. As propriedades físico-químicas do PVA
dependem do grau de hidrólise e de polimerização. O PVA encontra um grande número
de aplicações em várias áreas, tais como adesivos, têxteis ou papel. Na área biomédica,
o PVA é utilizado na obtenção de membranas anfifílicas para imobilização de enzimas e
como excipiente para formulação de medicamentos e cosméticos (em pó ou
comprimidos), por sua estabilidade física, química, microbiológica e
27
biodegradabilidade. Faz parte dos polímeros empregados na preparação de
nanopartículas poliméricas (nanocápsulas ou nanoesferas) para vetorização de fármacos
tais como os anticancerígenos. Sua característica semicristalina propicia uma resistência
mecânica adequada para arcabouços e não apresenta toxicidade a tecidos biológicos.
[25]
Figura 2: estrutura do PVA
2.2.3 BLENDAS POLIMÉRICAS
A mistura física de polímeros é classificada como blenda polimérica, utilizando
um solvente que solubiliza os dois polímeros onde suas propriedades intermediárias
físico-químicas são mantidas e a mistura pode apresentar uma única ou mais fases. O
estudo da interface de uma blenda polimérica torna-se interessante, pois sua formação
influência as propriedades mecânicas do material. A miscibilidade da blenda é um fator
característico de funcionamento do material, pois termodinamicamente as blendas
imiscíveis tendem a ter duas ou mais fases, o que caracteriza uma mistura heterogênea,
sendo mantidas as propriedades intermediárias de cada polímero. Estes materiais são
usados em arcabouços por combinar polímeros com características distintas, reforçando
sua estrutura mecânica ou hidrofilicidade (afinidade à água). Testes de
biocompatibilidade e biodegradação in vitro com plaquetas sanguíneas e fibroblastos
foram realizados em blendas poliméricas de Poli(hidroxibutirato) (PHB) e Poli
(etilenoglicol) (PEG), ou seja, um polímero natural e um sintético, respectivamente.
Filmes obtidos com somente PHB apresentaram um tempo de coagulação menor, porém
sua degradação e o crescimento de células de fibroblastos são baixos. Quando o PHB é
misturado com PEG, o filme apresenta maior número de poros e torna-se mais
hidrofílico, chegando a dobrar o número de células de fibroblastos formadas e
aumentando quase em 5 vezes a velocidade de degradação, o que torna um material
potencial para arcabouços de vasos sanguíneos. [26]. Neste caso, a mistura de um
polímero sintético e um natural é vantajosa, pois a matriz sofre uma degradação
adequada, adesão e proliferação celular, dando o suporte necessário para aceleração de
28
regeneração tecidual.
De fato, diversas combinações entre polímeros sintéticos e naturais podem ser
configuradas às variedades de tecidos. Além do exemplo citado, na tabela 1
apresentam-se alguns polímeros naturais e sintéticos utilizados para tecidos específicos.
2.3 ARCABOUÇOS POLIMÉRICOS
2.3.1 HIDROGÉIS
Hidrogéis são estruturas poliméricas capazes de se expandir e reter água em uma
fração acima de 20%. Para aplicações em arcabouços, os hidrogéis tornam-se viáveis
por sua capacidade hidrofílica de manter o tecido reidratado, sua superfície suave e
fisicamente frágil para tecidos endoteliais em partes específicas como do calcanhar e
juntas em tecidos cartilaginosos [47].
Os hidrogéis podem ser obtidos de diferentes maneiras conhecidas por ligações
cruzadas físicas ou ligações cruzadas químicas. As ligações cruzadas físicas geram
hidrogéis mais flexíveis e estáveis, pois a interação da matriz polimérica é resultante de
ligações não-covalentes, onde o domínio hidrofóbico da cadeia polimérica orienta-se
para o centro do material, enquanto a parte hidrofílica localiza-se na superfície externa
interagindo com moléculas de água. O método de resfriamento e congelamento é um
dos mais simples e utilizados, devido à instabilidade termodinâmica do material
modificar os sítios de cargas, e repetindo-se o processo faz com que haja interações não-
covalentes, dando uma condição mais estável para o material. As ligações químicas
cruzadas do hidrogel, como resultado de uma reação de copolimerização entre um
monômero de baixa massa molecular e um agente de ligação, levam a uma estrutura
mais rígida que acentua suas propriedades mecânicas, com uma superfície mais porosa e
regular que o método físico, permitindo maior quantidade de água [48].
2.3.2 MEMBRANAS FINAS
Estudos de membranas poliméricas finas simples e compostas por antibióticos
em variadas células de crescimento mostram que filmes finos são capazes de servir
como arcabouços para engenharia de tecido [49]. Membranas finas podem ser obtidas
por diferentes métodos e sua espessura pode variar de alguns nanômetros até centenas
29
de micrômetros. Métodos simples de obtenção de filmes finos conhecidos por casting
(evaporação de solvente por temperatura), spray coating (aerossóis poliméricos) e spin
coating (espalhamento do polímero por força centrífuga) tem sido alvo de aplicações na
área biomédica. Suas vantagens são a formação de poros de diferentes diâmetros e a
possibilidade de combinar polímeros, depositando-os em múltiplas camadas.
2.3.3 NANOFIBRAS
A aplicação de nanofibras ocorre em diversas áreas, principalmente pela sua
disposição de formar fibras de diferentes materiais, taxa de degradação, tamanhos e
porosidades. No campo medicinal, destacam-se pesquisas envolvendo eletrofiação de
biopolímeros para liberação controlada de drogas e estruturas tridimensionais para
enxertos de diversos tecidos (epitelial, muscular, vascular, ósseo etc.) [50, 51, 52, 53].
De fato, arcabouços feitos de nanofibras apresentam uma consistência não só em termos
estruturais como seu desempenho físico se adequa à aplicação do tecido de pele,
levando à adesão celular, proliferação e expressão de gene. [54]. Artigos publicados de
aplicações in situ e enxertados in vivo mostram que os desempenhos dos materiais a
partir de nanofibras são satisfatórios. É previsível notar que muitos métodos hoje
aplicados no tratamento de lesões sejam substituídos ou adicionados por produtos
poliméricos [55, 56]. A sua aplicação ainda não é favorável à ampla produção devido ao
longo tempo gasto para obter filmes com uma espessura desejável.
O diâmetro das fibras varia de acordo com os polímeros e podem chegar a
dezenas de nanômetros a até dezenas de micrômetros. Arcabouços com fibras de
menores diâmetros dificultam a permeabilização de microrganismos em exsudatos,
melhora o espalhamento de células tronco neurais. Em contrapartida, observa-se baixa
agregação celular, sendo necessário controlar o diâmetro das fibras para se obter
resultados satisfatórios [57]. A imitação de uma matriz extra-celular é dificultada
principalmente pela sua organização dos componentes fibrilares, não fibrilares e
microfibrilas. Quando empregadas em lesões de tecidos epiteliais, as nanofibras
estimulam o crescimento de um novo tecido. Quando postas em contato com lesão, as
nanofibras comportam-se como um arcabouço (scaffold), fornecendo um suporte básico
ou aprimorado para a função celular dos componentes da matriz extra-celular (MEC),
meio fundamental para a regeneração epitelial. As nanofibras servem como ponte de
migração e crescimento de várias células devido as suas estruturas, tamanho,
30
composição e porosidade. O arcabouço deve comportar-se de modo seletivo,
viabilizando a permeabilização de oxigênio, a hidratação contínua, a liberação de
exsudatos. Mesmo após a matriz extra-celular entrar em ação para a regeneração do
tecido, o arcabouço ainda desempenha o papel de sustentação, proliferação e
diferenciação celular, até ser degradada por vias metabólicas. Seu controle morfológico
pode ser efetuado através das propriedades do equipamento de formação do filme e da
solução polimérica, conforme será discutido na seção 2.6.
As nanofibras também oferecem a oportunidade de incorporação de
nanopartículas em sua estrutura agregando a funcionalização da membrana.
Nanopartículas de prata e ferro são conhecidas por sua inibição de uma série de
bactérias. Na literatura encontram-se exemplos em que a combinação de nanofibras com
nanopartículas metálicas aperfeiçoam a atividade bactericida tanto em bactérias gram-
negativas como gram-positivas [58, 59, 60]. Atribui-se a funcionalização de
nanopartículas ao ligar-se na parede superficial da bactéria, inibindo sua proliferação
celular, ocasionando a não-funcionalização ou morte da bactéria.
Na aplicação em tecidos superficiais como a epiderme, por exemplo, é desejável
que arcabouços tenham uma aplicação fácil e não dolorosa, possibilitando que sua
estrutura seja íntegra até ocorrer o reparo tecidual necessário. Além da possibilidade de
arcabouços, as nanofibras são empregadas no uso de filtrações, dispositivos de cristais
líquidos e blindagem eletromagnética [61].
2.4 ELETROFIAÇÃO
A eletrofiação é uma técnica de obtenção de fibras poliméricas. O termo “fiação”
se originou pela produção parecida de fibras a partir de algodão para indústria têxtil
[62]. No início do século XX o uso de soluções condutoras elétricas foi estudado para
formar pequenas gotas da substância, geralmente em forma gasosa. Seu processo se
conclui quando a solução passa por um pequeno capilar com uma diferença de potencial
elevada superando a tensão superficial da solução. A técnica ficou conhecida como
eletrospray, onde sua aplicação se desenvolveu principalmente para separações de
compostos por espectroscopia de massa.
No entanto, a eletrofiação ficou popular a partir 1934 por Formhals ao patentear
um dispositivo capaz de produzir fibras eletrostáticas em segmento para área têxtil. Tal
dispositivo foi modificado duas vezes até obter fibras parcialmente secas que
31
possibilitasse seus desdobramentos usando acetato de celulose diluído em acetona [63].
Nos anos posteriores a técnica foi direcionada para explicar-se a formação de fibras,
estrutura e morfologia de acordo com os parâmetros do equipamento ou da solução. No
início dos anos 1990 a técnica começa novamente a se popularizar pela descoberta de
biomateriais e suas respectivas aplicações, sendo impulsionada pelas áreas médica e
ambiental.
Para se obter fibras por eletrofiação utiliza-se solução polimérica eletrolítica, e
seu aparato é relativamente simples como mostrado na figura 3. Quando a solução
chega até a saída da agulha, ela sofre um estiramento devido à atração eletrostática que
há entre a agulha e o coletor. A diferença de potencial deve ser alta, geralmente acima de
5 kV para que a tensão superficial da solução seja superada e o polímero seja depositado
no coletor metálico em estado sólido. A vazão da solução deve ser controlada, pois se o
volume de saída for grande não haverá estiramento suficiente para a solução sofrer
quebra de ligação entre o solvente e o polímero. A distância entre a agulha e o coletor
pode variar, mas em distâncias curtas, percebe-se que o solvente não evapora
completamente, podendo ser depositado no coletor. As extensões das fibras chegam a
ordem de quilômetros e a massa resultante de nanofibras chega em torno de 130 mg/h
[64].
Figura 3: Esquema básico do arranjo experimental da técnica de eletrofiação.
32
2.5 TEORIA DA ELETROFIAÇÃO
Ao ejetar uma gota da agulha, nota-se um estiramento da solução de aspecto
inicial regular, mas ao se afastar da gota, este sofre várias perturbações. Este
estiramento de formato cônico é conhecido por cone de Taylor (Figura 4) e seu estudo
foi aprofundado a partir de análises de imagens e vídeos. [65, 66]. O cone de Taylor
possui duas principais regiões determinantes para a formação de fibras: região estável e
região supercrítica. A região estável corresponde ao início da formação de um cone
cilíndrico na gota localizada na extremidade da agulha. O cone efetivamente se forma
quando aplicada uma diferença de potencial na qual o ângulo de curvatura da gota
atinge 49°. [67]. Esta diferença de potencial crítica é responsável pelo estiramento do
jato em relação as propriedades do dispositivo conforme apontado na equação 1,
𝑽𝒄𝟐 = 𝟒 (
𝑯𝟐
𝑳𝟐 ) (𝒍𝒏𝟐𝑳
𝑹− 𝟏, 𝟓) (𝟎, 𝟏𝟏𝟕𝝅𝜸) (1)
onde Vc é a tensão crítica, H a distância entre a agulha e o coletor, L o comprimento da
agulha, R o raio da agulha e γ a tensão superficial da solução.
Á medida em que o jato aproxima-se da placa condutora, a instabilidade e a
velocidade do jato aumentam, fazendo com que ocorra uma indefinição da direção final
do jato quando entra em contato com o coletor (região supercrítica). Devido à grande
quantidade de parâmetros envolvidos no processo, torna-se difícil equacionar o
comportamento do cone de Taylor em um aspecto amplo. Alguns trabalhos teóricos
utilizam as propriedades específicas da solução polimérica (viscosidade, tensão
superficial, condutividade elétrica, etc.), o campo elétrico, corrente elétrica para obter
uma condição que explique os resultados experimentais em relação à morfologia das
nanofibras [68, 69].
Figura 4: Representação da formação de um cone de Taylor em uma solução
polimérica. Na medida em que se aumenta o potencial elétrico, a gota de uma solução
polimérica é estirada a formação de um jato cônico e vários jatos em potenciais
elevados (Figura adaptada e permitida por [70]).
33
2.6 PARÂMETROS DA ELETROFIAÇÃO E A FORMAÇÃO DE
NANOFIBRAS
A formação de nanofibras exige um forte estiramento do jato para alcançar
diâmetros nanométricos. Muitas propriedades do processo estão intercaladas, como a
distância entre agulha e o coletor que afeta o campo elétrico, e mesmo tais propriedades
são variáveis de acordo com as propriedades da solução (concentração, solvente,
viscosidade, etc.). É pretendido que varie-se uma propriedade intrínseca para se obter
uma nanofibra desejada, não precisando efetivamente modificar outros parâmetros para
chegar ao resultado esperado. A seguir, serão mostrados alguns fatores fundamentais
que formam as nanofibras.
A tensão elétrica aplicada entre a agulha e o coletor está certamente ligada ao
processo da eletrofiação. Os polímeros possuem uma massa molecular grande, o que
torna necessária a aplicação de uma diferença de potencial na ordem de kV. Geralmente
encontram-se ensaios de eletrofiação acima de 5 kV. A diferença de potencial é
responsável pelo estiramento da solução carregada eletricamente ao coletor. Embora o
aumento da tensão cause o aumento da força elétrica, estudos mostram que a força no
campo não é uniforme, podendo acontecer a diminuição ou aumento do diâmetro das
fibras pois afetam na quantidade de volume de solução que pode ser ejetada. Além
disso, fibras produzidas com maiores valores de tensão tendem a ter um comportamento
uniforme, e uma deposição bem mais ordenada devido à instabilidade do jato [71]. Em
certos valores extremos de tensão há a ruptura do jato antes da evaporação do solvente
ou forma fibras não uniformes, com uma parte mais grossa conhecida por contas [72,
73]. Fica evidente que o valor da tensão elétrica precisa ser combinado de acordo com
outros parâmetros não só do equipamento, quanto da solução.
A distância entre a agulha e o coletor é outro fator que pode influenciar na força
elétrica e sua uniformidade, sendo um parâmetro fundamental para a formação de
nanofibras. A obtenção de nanofibras uniformes está relacionada com a evaporação do
solvente, a solidificação do polímero e o intervalo da instabilidade do jato [74]. O uso
de soluções aquosas dificulta a evaporação do solvente, necessitando de distâncias
maiores quando comparado ao uso de ácidos orgânicos. Em distâncias pequenas há
34
ocorrência de contas, devido ao pouco espaço para o alongamento das fibras, e em
distâncias entre 8 a 20 cm é provável a formação de nanofibras [63]. Doustgani
observou que quando aumentada a distância do jato, as fibras ficavam com diâmetros
maiores devido ao enfraquecimento do campo elétrico, reduzindo a velocidade da
solução no percurso para o coletor [75].
O volume de solução ejetada é um parâmetro importante para o controle da
morfologia das nanofibras na eletrofiação. É comum o uso de uma bomba automática
para o controle de fluxo da solução, mantendo fluxo do volume da solução constante, o
que poderia afetar diretamente nos diâmetros das nanofibras. Soluções que apresentam
alta viscosidade geralmente trabalham com fluxos baixos de volume, entre 0,01 ml/h a 1
ml/h, pois a tensão superficial tende a aumentar devido ao aumento da quantidade de
volume de uma solução viscosa, ejetando gotas ao invés de formar um estiramento
contínuo da solução. Em soluções de baixa viscosidade, algumas soluções podem não
formar um jato contínuo, pois a velocidade do jato é tão alta que não há volume
suficiente para continuar o estiramento. Em soluções aquosas de PVA, o aumento da
vazão da solução pode causar significativas mudanças no diâmetro das nanofibras [76,
77].
Na literatura encontram-se várias formas de coletores metálicos para depositar as
nanofibras [51, 53, 64]. O coletor mais simples é formado por uma placa metálica (aço,
alumínio, cobre, etc.) e as fibras são depositadas aleatoriamente em sua superfície.
Como forma de produção de nanofibras orientadas, utiliza-se um coletor de forma de
cilindro ou de disco em movimento rotacional (Figura 5). O coletor em forma de disco
é usado para deposição das fibras em sua borda, geralmente de baixa espessura o que
faz com que as fibras tenham alinhamento por não ter áreas maiores de deposição. O
coletor cilíndrico atua da mesma maneira, mas a área de deposição é larga, o que
diminui as chances de alinhamento, como alternativa, utiliza-se um eletrodo paralelo ao
cilindro, fazendo a curvatura do jato ir em direção a esta carga [78, 79, 80].
35
Figura 5: Três exemplos de coletores rotacionais para eletrofiação. Na ordem: coletor
cilíndrico, disco e cilíndrico com fendas [fonte: http://www.electro-spinning.com/].
Outra maneira utilizada é aplicar um segundo campo elétrico pela sobreposição
de duas ou mais barras metálicas na frente de um coletor plano, o que gera uma
orientação das fibras, de acordo com a posição das barras (Figura 6). Dan Li e
colaboradores [81] utilizaram este método para proporcionar o alinhamento das
nanofibras. Empregando eletrodos condutores em várias configurações, obtiveram até
três camadas de nanofibras orientadas, no vão entre os eletrodos (Figura 6).
Arcabouços por nanofibras alinhadas apresentam resultados mais eficientes que em
modo aleatório na maturação e proliferação celular, devido às células mamárias terem
uma morfologia organizada em um tecido natural saudável [82, 83].
Figura 6: Representação de eletrofiação com dois eletrodos condutores elétricos
paralelos e sua respectiva morfologia (Figura adaptada [81]).
A umidade no sistema de eletrofiação permite controlar a morfologia das
nanofibras pela sua relação com a taxa de evaporação do solvente. Nota-se que ao
diminuir a umidade relativa do ar, o diâmetro e a quantidade de contas diminuem [84].
A combinação de solventes voláteis e determinado grau de umidade pode propiciar
poros em nanofibras que facilitem a difusão de enzimas e oxigênio [85, 86]. Em uma
solução polimérica diluída em água, a evaporação do solvente facilita a formação do
jato, mas a relação com o diâmetro das nanofibras não aparenta uma tendência.
2.7 PARÂMETROS DA SOLUÇÃO
A solução de eletrofiação pode ser composta por diferentes polímeros,
compósitos em vários solventes e concentrações. Certos valores fixados de suas
propriedades favorecem na formação das nanofibras, sendo possível o controle
36
morfológico do material.
A viscosidade da solução polimérica está relacionada á formação de nanofibras.
Soluções com baixas viscosidades apresentam jatos instáveis e não-uniformes. Em
contrapartida, soluções altamente viscosas impossibilitam formar fibras com diâmetros
reduzidos, geralmente não-uniformes. O parâmetro da viscosidade pode ser controlado
por meio da concentração polimérica na solução. A solução polimérica de PVA em
concentrações baixas não varia consideravelmente a viscosidade, porém, a tensão
superficial da solução é alta e dificulta a formação contínua de nanofibras. Já a
concentração elevada, além de aumentar a viscosidade da solução, a tensão superficial
diminui, sendo possível formar o cone de Taylor e obter nanofibras uniformes. A
viscosidade da solução é proibida quando seu comportamento impede que as moléculas
poliméricas se estiquem suficientemente para formar o cone de Taylor, que para o PVA,
segundo Deitzel, a concentração polimérica está acima de 10 % em solução [87].
A massa molecular está relacionada com a viscosidade intrínseca da solução
polimérica, conforme a equação 2 de Mark-Houwink-Sakurada:
[𝜼] = 𝑲𝑴𝒘𝜶 (2)
onde [η] é a viscosidade intrínseca da solução, Mw é a massa molecular, α é um
parâmetro entre a interação do polímero e o solvente e K uma constante. Nesta
formulação empírica espera-se que a viscosidade do polímero aumente conforme for
maior a massa molecular do polímero. Polímeros com baixa massa molecular
apresentam dificuldades de formar fibras uniformes, geralmente são acompanhadas por
contas e são evitados ou misturados com polímeros de maior massa molecular que
forneçam estabilidade do jato da solução [88]. Por exemplo, a presença de poros em
fibras de poliestireno foi identificada em amostras com maior massa molecular (560.900
g/mol), em condições de umidade iguais para poliestireno de massa molecular menor
(190.000 g/mol) [86]. A viscosidade da solução polimérica do poli (óxido de etileno)
(PEO) dissolvido em 2 % de ácido acético altera-se consideravelmente a partir de 3 %
de PEO em solução com massa molecular de 2.300.000 g/mol a enquanto que para PEO
com massa molecular de 1.500.000 g/mol não houve alteração [89].
Solventes orgânicos possuem propriedades como condutividade elétrica e tensão
superficial que influenciam na formação de nanofibras. A utilização de água como
solvente puro torna-se impraticável pela dificuldade de evaporação e um volume fica
37
presente nas nanofibras misturando-as e descaracterizando-as. Em nanofibras de
Polibutileno succinato (PBS) apresentam morfologia livre de contas em determinadas
misturas e quantidades de solventes, apresentando contas ou microesferas quando se
alteram os parâmetros do solvente [90]. Em soluções poliméricas de poliestireno (PS)
de mesma concentração (20 %) formaram-se contas e fibras irregulares com
tetrahidrofurano (THF) e clorofórmio mesmo apresentando viscosidade característica de
eletrofiação, enquanto usando dimetilformamida (DMF) obtiveram-se nanofibras
uniformes com poucas contas. Tais soluções diferenciam-se pela condutividade elétrica
em DMF enquanto em outros solventes não apresentaram valor significativo [91]. Ainda
consideram-se outros fatores do solvente que apontam o DMF como melhor solvente
para o poliestireno em relação a outras substâncias, como a viscosidade e sua
temperatura de ebulição, evitando que evapore antes do estiramento das nanofibras [92].
Na literatura encontram-se artigos de eletrofiação de PVA e Quitosana para a
obtenção de nanofibras. O emprego destes polímeros se dá principalmente pelo seu
baixo custo dos polímeros, pela interação intramolecular (quitosana) e intermolecular
pelas cadeias moleculares poliméricas representadas na figura 7, obtendo uma forte
ligação entre eles e podendo utilizá-los como blendas poliméricas miscíveis. Na tabela
2 constam alguns artigos encontrados referentes a blendas de PVA e quitosana, para
certas condições da eletrofiação. Os resultados dos ensaios constados na tabela citada
apresentam formas bem-sucedidas de obtenção de nanofibras e a concentração entre os
polímeros é a mais discutida, além de que em todos os resultados o diâmetro das
nanofibras diminui com a proporção de quitosana adicionada na mistura.
Figura 7: Representações de interações intermoleculares e intramoleculares entre as
cadeias poliméricas do PVA e da quitosana.
Ligações intermoleculares de hidrogênio
Ligações intramoleculares de hidrogênio
38
Tabela 2: Levantamento da literatura dos parâmetros e média dos diâmetros das
nanofibras entre PVA e quitosana.
[PVA] e
[CS] % Proporção
[Solvente]
%
Vazão
(mL/h)
Distância
(cm)
Potencial
(kv)
Média
nanofibras
(nm)
Autores
6 e 6 11/89; 17/83,
50/50 Hac. (2) n.i 25 18 100 [93]
20 e 3 90/10;80/20;
75/20 Hac. (2) n.i 15 15
300, 250,
150 [94]
8 e 8 75/25 Hac. (2) 0,7 10 15 n.i [95]
10 e 7 65/35 Hac. (70) 0,1 20 20 143 [96]
7,8,9 80/20 água* 0,3 7,5 15 n.i [97]
10 e 2 70/30 Hac. (90) 0,9 12 28 n.i [98]
3, 4 e 5 80/20 Hac. (2) n.i 10 21-25 n.i [99]
* A quitosana utilizada é desprotonada.
39
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO PRINCIPAL
O objetivo do trabalho foi investigar a formação de nanofibras poliméricas a
partir de soluções de PVA e de blendas PVA/quitosana pela técnica de eletrofiação, para
aplicação como candidato a arcabouço na engenharia de tecidos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Analisar a morfologia, estrutura e interações moleculares, propriedades
térmicas e mecânicas das nanofibras de PVA e blendas PVA e quitosana em função da
composição da solução polimérica.
- Avaliar a inibição de crescimento de Staphylococcus aureus na presença das
nanofibras, sem e com agente bactericida.
40
4. MATERIAIS E METODOLOGIA DO TRABALHO
Os polímeros utilizados foram: PVA de massa molecular 130.000 g/mol, e a
quitosana (75%- 85 % desacetilado, massa molecular média), os quais foram adquiridos
da Sigma Aldrich. Como solventes, foi utilizada água deionizada para o PVA e solução
aquosa contendo ácido acético (Química moderna) para a quitosana. Para o preparo das
matrizes poliméricas, foram dissolvidos o PVA e a quitosana separadamente. O PVA
(10%) foi dissolvido em água por agitação eletromagnética a 90 °C por um período de 6
h. Já a quitosana (1%) foi misturada em solução aquosa contendo 1% de ácido acético.
A solução foi mantida sob agitação magnética por um período de 16 horas à temperatura
ambiente e não foi efetuado nenhum tratamento de purificação. A tabela 3 apresenta as
quatro diferentes misturas poliméricas de PVA/Quitosana.
Tabela 3: Configurações das soluções poliméricas utilizadas para eletrofiação.
% VOLUME PVA
% VOLUME
QUITOSANA
AMOSTRA
1 100 0
AMOSTRA
2 90 10
AMOSTRA
3 80 20
AMOSTRA
4 70 30
A eletrofiação foi procedida em colaboração com o professor Dr. Everaldo
Carlos Venâncio do Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas
(CECS) da UFABC. O equipamento (figura 8 (a)) é formado por uma bomba
automática de injeção para seringas hospitalares, uma fonte de alta tensão. A solução
polimérica foi adicionada em uma seringa plástica de insulina (1 mL) com agulha de
bisel reto, diâmetro de 8 cm e 2 mm de raio.
As condições de trabalho para eletrofiação usadas foram 20 kV, 10 cm de
distância entre a agulha e o coletor e a vazão da bomba de 0,5 mL/h. O coletor metálico
41
foi recoberto por uma folha adesiva de papel contact® a fim de facilitar a retirada da
amostra (Figura 8 (b)).
Figura 8: a): Equipamento utilizado para eletrofiação: (A) bomba automática para
controle de vazão da solução polimérica na seringa (sobre a bomba); (B) fonte de alta
tensão; (C) coletor metálico. 8 b): Pequena parte da amostra (em branco) obtida de
nanofibras PV A/Quitosana.
Após a obtenção das amostras de nanofibras, foi feito dois tipos de tratamento
químico. O primeiro tratamento químico foi feito mergulhando as amostras de
nanofibras em metanol (99%) durante 24 horas e depois foram retiradas e secas numa
estufa (37 °C) a vácuo por mais um dia.
Outra forma de tratamento químico procedida foi reticular as nanofibras com
vapor de glutaraldeído (25%). As amostras foram colocadas sobre um béquer contendo
solução de glutaraldeído aquecida por 24 horas e depois foram levadas para estufa
(37 °C) a vácuo por um período de um dia.
42
5. CARACTERIZAÇÃO
5.1 VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES POLIMÉRICAS
A viscosidade das soluções poliméricas foi medida por um viscosímetro
eletrônico para pequenos volumes (DV-I Brookerfield). Os valores foram anotados após
um intervalo de tempo de espera de 5 minutos para estabilização do sinal, à temperatura
ambiente.
5.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ARCABOUÇOS
A caracterização dos arcabouços foi feita a partir de imagens de Microscopia de
Força Atômica (AFM) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Ambas técnicas
possibilitam a obtenção de informações complementares para analisar as características
morfológicas das superfícies dos filmes obtidos, em termos de rugosidade, diâmetros
das fibras, densidade de fibras e porosidade superficial.
5.2.1 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
A microscopia de força atômica se baseia na interação entre as estruturas
atômicas da amostra e uma sonda (ponteira com extremidade da ordem de 30 nm)
varrendo a superfície da amostra (Figura 9). O equipamento permite utilizar diversos
modos para obtenção de imagens e caracterização da amostra de acordo com as
necessidades ou propriedades da amostra. Os três principais modos de interação da
ponta e a superfície são: contato, não-contato e oscilatório (modo tapping), conforme
ilustrado na Figura 10.
No modo contato, conhecido também como modo repulsivo, durante a varredura
ocorre na superfície da amostra, a forças repulsivas de van der Waals são dominantes.
Este modo é utilizado principalmente para amostras rígidas o suficiente para evitar a
danificação do material durante a varredura, porém com baixas variações de amplitudes
morfológicas [100, 101].
43
Figura 9:Esquema mostrando o princípio básico do AFM: o circuito de retorno
controla a força entre a ponta e a amostra enquanto ocorre uma varredura em sua
superfície. A diferença de força causada pela deflexão é monitorada via sensor de
deflexão posicionado acima da ponta (adaptado de [100]).
Uma característica diferencial do AFM é o fato de permitir a análise de qualquer
tipo de amostra, como isolantes, magnéticas, elétricas, líquidas, tecidos biológicos, e até
o crescimento de células biológicas em tempo real, sem necessidade de preparações
complexas prévias.
Para as observações e as análises morfológicas com a AFM, as amostras foram
recortadas dos filmes, em tiras de 1 cm2, que foram fixadas sobre um suporte metálico
mediante fita dupla-face. O equipamento utilizado foi o Microscópio de Força Atômica
e Tunelamento da marca Agilent, Series 5500. Todas as imagens foram obtidas em
modo contato, utilizando ponteiras do tipo PPP-Cont da marca Nanosensors, com
frequência de ressonância de 6-21 kHz, constante de força de 0,02 - 0,77 N/m.
Figura 10: Tipos de interação ponta-amostra na técnica AFM (adaptado em [101]).
44
5.2.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura é uma técnica explorada a partir dos
conceitos da microscopia eletrônica, comercializada a partir de 1965 pela Cambridge
Scientific Instruments [102]. Suas aplicações variam em analises de materiais orgânicos
e inorgânicos, obtendo informações físicas, químicas e elétricas de sua respectiva
superfície em áreas de até 1 μm2 [103]. Seu funcionamento (Figura 11) consiste em
uma fonte de elétrons excitados (em torno de 40 keV) focado em certa área da
superfície da amostra, que interagem com os elétrons do plano, sendo então emitidos
(elétrons secundários e retroespalhados) e amplificados para o detector e convertido em
imagem. Uma fonte de elétrons, geralmente de tungstênio, emite os elétrons que vão em
direção ao um campo elétrico até a superfície da amostra.
Figura 11: Imagem de um esquema básico de funcionamento de um MEV.
Os elétrons responsáveis pela formação da imagem são de baixa energia
(elétrons secundários) que são atraídos pelo detector ligado a uma fonte polarizada.
Devido à baixa velocidade de locomoção, o detector captura tais elétrons, gerando um
contraste da superfície da amostra. Os demais elétrons são conhecidos por elétrons
retroespalhados, possuem uma energia menor que a fonte primária do feixe, fornecendo
informações do contraste da superfície pela topografia (contraste em função do relevo) e
composição (contraste em função do número atômico dos elementos presentes na
amostra) química [104, 105].
As amostras poliméricas foram revestidas por íons metálicos de ouro (60 nm de
espessura) em uma câmara com alta pressão (SCAN COAT) bombardeada por argônio a
fim de evitar sua degradação. O equipamento para análise de micrografias utilizado foi
45
o MEV da marca JEOL, modelo JCM-6000 e as condições de uso foram a um potencial
acelerado de 15 kV sob ultra vácuo.
As imagens de MEV foram utilizadas para análises dos diâmetros das nanofibras.
Utilizou-se um total de 3 imagens (10.000x) por amostra e a quantificação dos
diâmetros foi feita pelo software ImageJ. A densidade percentual de porosidade também
foi determinada pelo software ImageJ, após a conversão da imagem em formato binário
(preto e branco), destacando as fibras em branco e os espaços vazios em preto; a área
percentual de porosidade é estimada pela razão do número de pixels pretos sobre o
número total de pixels da imagem.
5.3 ANÁLISE DAS INTERAÇÕES MOLECULARES NOS
ARCABOUÇOS
A espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier é uma técnica
de caracterização de funções químicas moleculares na faixa 12.800 cm-1 a 10 cm-1. A
técnica possui alta resolução, necessitando de alguns microgramas de amostra em certos
equipamentos além de ser uma técnica não evasiva. A interpretação dos resultados se dá
por um espectro na região de comprimento de onda no infravermelho na qual a amostra
absorve ou transmite luz. Em substâncias sólidas, o uso de espectroscopia de refletância
total atenuada (ATR) é a mais utilizada, pois a amostra não precisa passar por nenhum
tipo de tratamento, onde o feixe de luz atravessa um material de alto índice de refração
para a amostra. Quando a amostra absorve o feixe refletido (radiação evanescente),
ocorre a atenuação do feixe nos comprimentos de onda das bandas de absorção [106].
As amostras foram analisadas pelo equipamento espectrômetro de infravermelho
Frontier FT-NIR/MIR (Perkin Elmer) com varredura do número de ondas entre 850cm-1
a 4000 cm-1.
5.4 ANÁLISE DINÂMICO-MECÂNICA (DMA)
A análise por DMA pode fornecer informações sobre o comportamento
viscoelástico de um polímero ou biopolímero. Um material viscoelástico tem por
característica apresentar comportamento elástico (material sólido) e também viscoso
(líquido). Ao aplicar uma tensão controlada (esticá-lo horizontalmente) num filme
polimérico, por exemplo, é possível determinar se o material dissipa ou acumula energia
conforme sua deformação física.
46
A análise do comportamento tensão-deformação das nanofibras foi feita em
triplicata (dimensão: 1 cm x 3 cm) pelo equipamento MTS Tytron 250 com célula de
carga de 250 N e tempo de separação entre as garras de 5 mm/min.
5.5 ANÁLISE TÉRMICA DOS ARCABOUÇOS
As análises térmicas dos arcabouços foram feitas por TGA (Análise
temogravimétrica), que é uma das principais técnicas utilizadas para caracterização
polimérica. A TGA relaciona a perda ou ganho de massa de uma amostra durante uma
variação programada de temperatura. Atualmente, as análises térmicas por TGA exigem
uma pequena quantidade de amostra (em torno de 10 mg), possibilitando o estudo de
materiais com alto custo ou sintetizados com baixo rendimento, como fármacos por
exemplo. A TGA possibilita ainda a compreensão de fenômenos cinéticos que ocorrem
durante a degradação da amostra, relacionando a energia absorvida pela amostra e o
rompimento das respectivas ligações químicas [107]. Além disso, a TGA pode ser
acoplada a outras técnicas de caracterização, como FTIR, podendo permitir a
identificação da composição da substância degradada.
A TGA utiliza uma termobalança, ou seja, um dispositivo composto por uma
microbalança eletrônica e um forno, e o meio podendo ser preenchido por diferentes
gases inertes, corrosivos ou oxidativos. O controle da temperatura e da vazão do gás é
feito por um software de computador. Embora a TGA tenha um princípio simples,
algumas variáveis, como taxa de aquecimento, preenchimento do gás no meio e a
quantidade de amostra influenciam diretamente no comportamento da amostra. Em uma
taxa de aquecimento elevada, por exemplo, alguns fenômenos podem não ser detectados
ou sobrepostos, devido ao elevado grau de degradação da amostra.
As análises térmicas por TGA das amostras foram realizadas utilizando o
equipamento Q500 (TA Instrumensts), com uso de gás nitrogênio como purga e com
uma taxa de aquecimento de 10 °C/min até 450 °C. O cálculo da perda de massa e as
faixas de temperatura foram feitos pelo software TA analysis (TA instruments).
47
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise dos diâmetros das nanofibras, foram efetuados histogramas das
dispersões das nanofibras (n = 75) e por teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov.
Além disso, foi feito a análise de variância (ANOVA) one-way e teste de comparação
(teste de Tukey) com nível de significância p < 0,05.
5.7 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A bactéria selecionada para o ensaio foi a Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
uma bactéria gram-positiva frquentemente utilizada para análise antimicrobiana com
biomateriais poliméricos [108, 109].
A suspensão da bactéria foi obtida por alçada de uma cepa liofilizada de S. aureus
para 10mL de caldo triptona de soja (TSB), seguido de incubação a 37 °C por 24 horas.
Após incubação, transferiram-se duas alçadas (20 µL) da cultura bacteriana para outro
tubo contendo 10 mL de TSB, com incubação a 37 °C por 24 horas. Centrifugou-se esta
cultura a 5000 rpm por 5 minutos. Desprezou-se o sobrenadante e, as células
sedimentadas, adicionou-se um volume de solução salina a 0,85% estéril até se obter
uma turbidez de 0,5 na escala McFarland (estimativa de 108 UFC de S. aureus/mL). A
partir dessa suspensão, realizaram-se diluições seriadas (1:10) em solução salina, até se
obter a suspensão de trabalho, com concentração teórica de 1,0 x 106 UFC/mL.
Para análise de atividade antimicrobiana, as amostras foram transferidas para tubos
de ensaio esterilizados. Adicionaram-se a cada um dos tubos 1000 µL de TSB e 50 µL
da suspensão bacteriana de trabalho. Incubaram-se os tubos a 37 °C por 24 horas. Após
incubação, os tubos foram analisados quanto à presença ou ausência de turbidez
(atividade antimicrobiana). Transferiu-se uma alçada de cada tubo, através de estrias,
para superfície de ágar triptona de soja (TSA), com incubação a 37 °C por 24 horas,
para comprovar o crescimento bacteriano ou ausência deste em cada uma das amostras.
48
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES POLIMÉRICAS
Conforme a figura 12, a viscosidade das soluções sofre aumento ao adicionar um
volume maior de quitosana na solução. A viscosidade da solução é um dos principais
fatores para a produção de nanofibras poliméricas e também para o controle de sua
morfologia. Misturas de blendas poliméricas com quitosana em solução para
eletrofiação mostram que além da concentração dos polímeros, há interação
intermolecular entre os polímeros. Em misturas de quitosana e sedas de fibroína em
solução, a viscosidade da solução não apresenta um comportamento linear, pois há
ligações de hidrogênio entre os polímeros [110]. Este resultado foi semelhante ao
comportamento entre o PVA e a Quitosana, o que dificulta eletrofiar com frações
poliméricas maiores de quitosana em solução.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
200
300
400
500
600
700
800
900
Vis
co
sid
ad
e (
cP
)
Fração de Quitosana em solução (v/v)
Figura 12: Viscosidade das soluções de PVA e PVA/Quitosana.
6.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ARCABOUÇOS
A topografia da superfície dos filmes poliméricos eletrofiados foi analisada por
micrografias de AFM e MEV (Figuras 13 e 15). As fibras apresentam diâmetros entre
dezenas a centenas de nanômetros. As amostras de PVA/Quitosana 100/0 (Figuras 13
a) e 13 b), 15 a) e 15 b) apresentam uma morfologia de nanofibras com diâmetros entre
92 nm a 198 nm, com média de 140 nm (dp ± 20 nm), sem nenhuma presença de contas.
A amostra PVA/Quitosana 90/10 (Figuras 13 c) 13 d), 15 c) e 15 d)) apresenta uma
faixa de dispersão do diâmetro entre 84 nm e 191 nm, com média de 128 nm (dp ± 23
49
nm), com presença de contas junto com as nanofibras. A amostra PVA/Quitosana 80/20
(Figuras 13 e) e 13 f), 15 e) e 15 f) com dispersão dos diâmetros das nanofibras entre
73 nm e 182 nm e média de 129 nm (dp ± 22 nm) e com presença de contas, o que
taambém foi observado na amostra PVA/Quitosana 70/30 (Figura 13 g) e 13 h), 15 g) e
15 h)) com dispersão entre 58 nm a 159 nm (dp ± 20 nm). Mesmo a quitosana
possuindo uma massa molecular maior que a do PVA, o diâmetro das fibras diminuiu.
Na Figura 14, é apresentada a média dos diâmetros das nanofibras para as
diferentes proporções de quitosana na solução polimérica.
Como já ressaltado, a adição de quitosana provoca a formação de contas junto
com as nanofibras. De fato, durante o processo de eletrofiação, é possível observar o
rompimento da gota da solução polimérica na agulha. Para minimizar essas
instabilidades, alguns parâmetros da eletrofiação foram ajustados. No início do processo
de eletrofiação, a tensão elétrica foi ajustada para 15 kV até que se iniciasse a formação
de uma gota com volume suficiente para evitar o rompimento, para produzir um cone
estável. Após alguns minutos, a tensão elétrica foi aumentada para 20 kV permitindo
assim a produção de nanofibras poliméricas. De acordo com trabalhos publicados [111,
112], concentrações acima de 4% de PVA formam nanofibras uniformes, pois a
condutividade da solução é suficiente para produzir o estiramento do jato. Conforme
adiciona-se quitosana (polímero polieletrólito), a condutividade da solução aumenta e é
possível obter fibras mais finas. A interação de quitosana com ácido acético favorece a
formação de íons catiônicos de amônio, permitindo uma interação maior entre PVA-
Quitosana e uma complexação iônica entre os polímeros [113].
50
Figura 13: Imagens por AFM (modo contato) das amostras dissolvidas em água e
ácido acético. a) e b) PVA/Quit. 100/0; c) e d) PVA/Quit. 90/10; e) e f) PVA /Quit.
80/20; g) e h) PVA/Quit. 70/30.
Figura 14: Média (n = 75) dos diâmetros das amostras de nanofibras PVA /Quit.
100/0; PVA/Quit. 90/10; PVA /Quit. 80/20; PVA /Quit. 70/30.
PVA/Quit.70/30PVA/Quit.80/20PVA/Quit.90/10PVA/Quit.100/0
150
140
130
120
110
100
90
Méd
ia (
nm
)
f
51
Figura 15: Imagens por MEV das amostras utilizando água eácido acético como
solventes com PVA. a) e b) referentes à amostra PVA /Quit. 100/0; c) e d) à amostra
PVA /Quit. 90/10; e) e f) à amostra PVA /Quit. 80/20; g) e h) PVA /Quit. 70/30.
52
Os histogramas dos diâmetros das nanofibras das amostras seguem uma
distribuição normal, que foi confirmada pelo teste Kolmogorov-Smirnov (KS > 0,05)
(Figura 16). A análise da variância (teste de Tukey) foi utilizada para comparações dos
diâmetros das amostras (Figura 16 e)). A análise estatística mostra que os diâmetros
médios das nanofibras apresentam diferença significativa quando comparadas a todas as
proporções utilizadas, exceto as nanofibras obtidas com as soluções PVA/Quitosana
90/10 e PVA/Quitosana 80/20.
100/0 90/10 80/20 70/30
0
50
100
150
200
f)
*
mé
dia
do
diâ
me
tro
da
s n
an
ofib
ras (
nm
)
*
Figura 16: Histograma das distribuições dos diâmetros das nanofibras a) PVA /Quit.
100/0; b) à amostra PVA /Quit. 90/10; c) PVA /Quit. 80/20; e d) PVA /Quit. 70/30. e)
Teste de Tukey para avaliação de semelhança de variância entre as amostras. Se em um
interval valo não contém zero, as amostras são significativamente diferentes (IC 95%).
f): média e desvio padrão do diâmetro das nanofibras e o comportamento das amostras
(com estrelas no topo do limite do desvio padrão: amostras com diâmetros médio
estatisticamente iguais)
200180160140120100
20
15
10
5
0
Média 141,6
D.P 20,34
N 75
Disperão (nm)
Fre
qu
ên
cia
Histograma PVA/Quit. 100/0
a)
18016014012010080
14
12
10
8
6
4
2
0
Média 128,3
D.P 23,64
N 75
Dispersão (nm)
Fre
qu
ên
cia
Histograma PVA/Quit. 90/10
b)
18016014012010080
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Média 129,2
D.P 22,65
N 75
Dispersão (nm)
Fre
qu
ên
cia
Histograma PVA/Quit. 80/20
c)
1601401201008060
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Média 101,8
D.P 20,48
N 75
Dispersão (nm)
Fre
qu
ên
cia
Histograma PVA/Quit. 70/30
d)
53
A porosidade é um dos requisitos fundamentais para um biomaterial ser candidato a
um arcabouço. As nanofibras de PVA e quitosana apresentaram porosidades superiores a
50 %, sendo que os filmes eletrofiados com PVA/Quitosana 70/30 apresentam a mais
elevada porcentagem de poros, o que parece consistente com aos valores menores e
maior dispersão de diâmetros das nanofibras. A figura 17 mostra um exemplo de
processamento de imagem feito para o cálculo da porosidade.
Figura 17: Exemplo de uma amostra editada para análise de porosidade de uma
camada superficial de nanofibras. A imagem original (esquerda) é convertida para
imagem binária (direita) sendo possível estimar a porcentagem de porosidade.
Tabela 4: Percentual da porosidade dos arcabouços poliméricos.
Amostras Porosidade (%)
PVA/Qui. 100/0 50,71 ± 4,38
PVA/Qui. 90/10 41,52 ± 1,8
PVA/Qui. 80/20 47,34 ± 2,85
PVA/Qui. 70/30 49,44 ± 3,79
54
6.3 ANÁLISE POR FTIR-ATR
Na Figura 18, são apresentados os espectros de FTIR dos filmes eletrofiados
com as diferentes proporções de PVA e quitosana, obtidos em modo ATR. Podemos
identificar os picos relacionados aos grupos moleculares do PVA e da quitosana,
conforme mostrado na Tabela 5 [114, 115]. No caso do PVA, os picos característicos
são o alongamento vibracional –OH na faixa 3300-3278 cm-1 e em 1091 cm-1, além do
pico de transmitância em 1654 cm-1 relacionado à presença de moléculas de água, e a
ligações de hidrogênio dos grupos –OH [114].
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
C-O)
Tra
nsm
itâ
ncia
(u
.a)
Nْ mero de ondas (cm-1)
Pva/qui. 100/0
Pva/qui. 90/10
Pva/qui. 80/20
Pva/qui. 70/30
Quitosana (pَ )
-OH e -NH2
-OH
C
(C=O)
(C-O)-C-OH(=CO-C)
NH I
-C=ONH2
NH IIC-O)
(C-N) III
CH-R-CH3
Figura 18: Espectros de FTIR das amostras Quitosana em pó (vermelho), e nanofibras
PVA/Quitosana 100/0 (vinho), PVA/Quitosana 90/10 (Azul turquesa), PVA/Quitosana
80/20 (laranja) e PVA/Quitosana 70/30 (azul).
55
Tabela 5: Principais picos identificados em PVA e Quitosana [114, 115].
PVA nanofibra Quitosana (pó)
bandas (cm-1) grupos bandas (cm-1) grupos
3330- 3278 υOH 3390- 3274 υNH2/OH
2941- 2911 υ(CH) 2920 υ C-H
1654 δ (OH) OH 2879 - 2849 υC-H (assimétrico)
1238 υ (=CO-C) 1656-1640 δ NH (I) ou C=ONH2
1091 υ (C-O)-C-OH 1578 δ NH (II)
847-834 υ (C-C) 1374 δ C-N
1315 υC-N (primário)
1262 υC-N (sec.)
1149 Ligação de H
1062 - 1026 υ C-O (cíclico)
No caso da quitosana pura (em pó), observam-se também picos de estiramento
entre 3390 cm-1 (υOH), 3274 cm-1 (υ–NH2) e 1656 cm-1 (-C=ONH2 primária) e 1640cm-1
(N-H secundária) referentes às ligações de estiramento do OH e. A blenda
PVA/Quitosana apresenta deslocamentos para números menores de ondas entre 3330 –
3278 cm-1 (OH e -NH2) e, o que corresponde, segundo ZHANG et al, a uma interação
entre os polímeros por ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila do PVA e
grupos hidroxila ou amino da quitosana [116].
56
6.4 PROPRIEDADES MECÂNICAS DAS NANOFIBRAS
A Figura 19 mostra o comportamento mecânico (extensão) dos filmes
poliméricos eletrofiados quando submetidos a uma força de tração (tensão). As amostras
apresentam um comportamento típico de polímeros plásticos, característico do PVA.
Como a quitosana é considerado um polímero amorfo, com baixa resistência mecânica,
as blendas poliméricas tendem a diminuir a tensão de escoamento σ1 (limite do intervalo
elástico) e o limite de resistência à fratura (LRT).
0 5 10 15 20 25
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Deformação (%)
Tensã
o (
MP
a)
PVA/Qui. 100/0
0 5 10 15 20 25
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T
en
sã
o (
MP
a)
Deformação (%)
PVA/Qui. 80/20
Figura 19: comportamento mecânico sob tensão controlada das amostras
PVA/Quitosana 100/0 e PVA/Quitosana 80/20.
A tabela 6 apresenta os respectivos valores das nanofibras somente com PVA e
de uma blenda polimérica. A ruptura da amostra de PVA/Quitosana 100/0 ocorre com
20,2 % de deformação e a blenda PVA/Quitosana 80/20 com 19,19% de deformação.
Tabela 6: Valores de tensão de escoamento e limite de resistência a fratura
σ1 (MPa) LRT (MPa)
Pva/quitosana 100/0 4,74 7,98
Pva/quitosana 80/20 4,65 7,75
6. 5 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA
A Figura 20 apresenta as curvas de TG da quitosana em pó e dos filmes com
nanofibras. A quitosana apresenta duas regiões de perda de massa: uma entre 37 °C a
75 °C, a qual se refere à degradação de substâncias higroscópicas, enquanto a segunda
na faixa entre 284 °C e 316 °C atribuída à degradação da quitosana. No caso dos filmes
com nanofibra de PVA/Quitosana 100/0 e suas blendas, a curva de TG apresenta três
57
regiões de perda de massa considerável, sendo a primeira devida à evaporação de
solventes (até 200 °C), seguida pela degradação térmica do PVA (entre 200 °C a
330 °C) e finalmente dos produtos formados pela degradação do PVA, como alquenos e
aldeídos (400 °C a 440 °C).
50 100 150 200 250 300 350 400 450
0
20
40
60
80
100
Pe
rda
de
ma
ssa
(%
)
Temperatura (°C)
Quitosana (pó)
PVA/Quit. 70/30
PVA/Quit. 80/20
PVA/Quit. 90/10
PVA/Quit. 100/0
Figura 20: Curvas das perdas de massa das amostras Quitosana em pó (vermelho), e
nanofibras PVA/Quitosana 100/0 (vinho), PVA/Quitosana 90/10 (Azul turquesa),
PVA/Quitosana 90/20 (laranja) e PVA/Quitosana 70/30 (azul)
A Tabela 7 apresenta os principais eventos das curvas TG (Figura 20) das
amostras. As blendas poliméricas apresentaram degradação de suas segundas
respectivas curvas em uma faixa de temperatura acima dos valores comparados aos das
nanofibras de PVA e da quitosana em pó, em virtude das interações de hidrogênio entre
as cadeias moleculares dos dois polímeros. A quantidade de massa perdida das
nanofibras de blendas poliméricas nesta região não variou consideravelmente, o que
indica que o produto da degradação do PVA e da Quitosana são semelhantes.
58
Tabela 7: Valores dos principais eventos das amostras por TGA.
Quitosana (pó) Tonset (°C) Tendset (°C) Δm (%)
Evento 1 37 75 10,1
Evento 2 284 316 42,9
PVA/Quit. 100/0 Tonset (°C) Tendset (°C) Δm (%)
Evento 1 35 62 3,6
Evento 2 294 341 76,4
Evento 3 415 436 8,6
PVA/Quit. 90/10 Tonset (°C) Tendset (°C) Δm (%)
Evento 1 39 65 2,0
Evento 2 293 345 74,5
Evento 3 420 439 9,8
PVA/Quit. 80/20 Tonset (°C) Tendset (°C) Δm (%)
Evento 1 35 62 4,6
Evento 2 286 359 72,6
Evento 3 427 447 10,8
PVA/Quit. 70/30 Tonset (°C) Tendset (°C) Δm (%)
Evento 1 34 62 2,8
Evento 2 282 352 72,5
Evento 3 423 443 10,8
6.6 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Os testes bactericidas foram feitos com todas as amostras de PVA e
PVA/Quitosana. Conforme mostra a Figura 21, nenhuma amostra apresentou inibição
de bactérias S. aureus.
Na literatura, existem vários trabalhos que relatam a evidência da ação inibidora
e até bactericida de nanofibras de blendas poliméricas compostas por quitosana [117,
118], com diferentes bactérias incluindo S. aureus. Nesses dois trabalhos citados, a
concentração de quitosana em solução foi superior a 3 % em massa. No nosso estudo,
foram utilizadas solução de 1% de quitosana. Portanto, a baixa concentração de
quitosana utilizada não deve ser suficiente para a inibição do crescimento da bactéria
em questão.
59
Figura 21:Testes de crescimento de bactérias S. aureus em ágar em TSA. Todas as
amostras não conseguiram inibir o crescimento das bactérias. a) PVA/Quitosana 100/0;
b) PVA/Quitosana 90/10; c) PVA/Quitosana 80/20; d) PVA/Quitosana 70/30.
Como alternativa para avaliação do efeito bactericida dos arcabouços com
nanofibras, foi realizada a eletrofiação de 3 mL de uma solução de PVA/Quitosana
90/10 com a adição de cloridrato de tetraciclina (200 µL de solução de cloridrato de
tetraciclina a 1%). A Figura 22 mostra a morfologia das nanofibras formadas com essa
configuração. Em decorrência de uma viscosidade menor da solução, ocorre a formação
de contas nas nanofibras da amostra.
Figura 22: Micrografia por MEV da amostra PVA/Quitosana/Tetracilina.
A análise estrutural molecular do filme de PVA/Quitosana 90/10 com
incorporação de cloridrato de tetraciclina (Figura 23) mostra que a intensidade de
ligações de hidrogênio decai entre 3000 cm-1 a 3600 cm-1, mas mesmo assim não é
possível ver picos característicos de vibração N-H da tetraciclina em regiões próximas,
sendo apenas visíveis os picos de ressonância de ligações C=C e C=O (1614 cm-1 e
1582 cm-1).
a) b) c) d)
60
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
C=O
1614 cm-1
C=O
1582 cm-1
Decaimento das Ligações de hidrogênio
Tra
nsm
itân
cia
(u
.a)
Número de onda (cm-1)
PVA/Quit. 90/10
PVA/Quit/Tetraciclina
Figura 23:FTIR de amostra PVA/Quitosana 90/10 (vermelho) e
PVA/Quitosana/tetraciclina 90/10/1% (verde).
Os testes de atividade antimicrobiana realizados com as amostras com
tetracilina, conforme já descrito na seção 5.7, mostram que a inibição de bactérias foi
completa, sem crescimento de colônia de S. aureus (Figura 24). Ressaltamos que este
resultado de uma forte ação inibidora não era esperado devido à baixa concentração em
tetraciclina utilizada. No presente momento não temos uma explicação para este efeito.
Trata-se de um resultado promissor que requer maiores investigações.
Figura 24: Teste de crescimento de colônias de bactéria S. aureus de uma alçada de um
tubo contendo nanofibras com tetraciclina.
61
6.7 RETICULAÇÃO DOS ARCABOUÇOS
Para aumentar a resistência mecânica dos filmes eletrofiados e evitar a sua
dissolução precoce em solução aquosa, a fim de adequá-los para uso como arcabouços,
foi aplicado um processo de reticulação, utilizando como agente reticulante o
glutaraldeído. Trata-se de um tratamento bastante empregado na literatura.
O PVA em solução com glutaraldeído sofre uma reação química, com a
formação de ligações cruzadas [113], conforme é ilustrado na Figura 25. Estas
interações permitem uma estabilidade física das nanofibras, evitando a sua dissolução
imediata em um meio aquoso.
Figura 25: Representação da formação de grupos acetal entre PVA e glutaraldeído.
As Figuras 26a e 26b mostram o efeito da reticulação, com as imagens dos
filmes sem e com o tratamento químico por glutaraldeído, respectivamente. A amostra
tratada ficou integra em água por três dias, sem perda aparente de massa.
Figura 25: Estabilidade das amostras de PVA/Quitosana 80/20. As imagens foram
capturadas no momento em que adicionou-se as amostras na placa de Petri com água.
A amostra sem tratamento a) dissolveu-se instantaneamente, enquanto com tratamento
com vapor de b) glutaraldeído, as nanofibras não se dissolveram.
PVA
Glutaraldeído
a) b)
62
A reação de glutaraldeído na reticulação das cadeias poliméricas de PVA (figura
27) apresentam bandas características de interação em 2941 cm-1 e 2911 cm-1 referentes
ao estiramento das ligações C-H deslocadas para 2920 cm-1e 2863 cm-1 e nos picos de
absorção 3000 cm-1 a 3600 cm-1 houve uma redução da intensidade dos grupos –OH
devido a formação das pontes de acetal entre o PVA e glutaraldeído, dados também
encontrados na literatura [120].
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
c-H
Tra
nsm
itân
cia
(u
.a)
Número de ondas (cm-1)
PVA/Qui 100/0 s/ tratamento
PVA/Qui 100/0 com GA
c-HRedução da intensidade
de absorção de -OH
Figura 26: FTIR das amostras PVA/Quitosana 100/0 sem tratamento (vermelho) e
PVA/Quitosana 100/0 tratadas com glutaraldeído (azul).
Os testes de inibição de atividade bacteriana mostram que ocorre o crescimento
de S. aureus (Figura 28) de forma semelhante aos resultados encontrados com as
amostras sem tratamento químico.
Figura 27: Testes de inibição de crescimento em amostras de nanofibras de PVA e
PVA/Quitosana com tratamento químico com vapor de glutaraldeído. O comportamento
de crescimento de S. aureus foi igual ao das amostras sem tratamento químico.
63
7. CONCLUSÃO
Nanofibras de PVA e suas blendas com Quitosana foram obtidas com sucesso,
com diâmetro médio abaixo de 150 nm. Os resultados mostram que os parâmetros da
solução polimérica têm uma influência sobre a morfologia das fibras e com o aumento
da proporção de quitosana na blenda, ocorre a formação de contas junto com as
nanofibras. Para a obtenção de nanofibras para engenharia de tecidos com PVA e
quitosana, algumas propriedades importantes dos polímeros devem ser levadas em
consideração, como a massa molecular, o grau de hidrólise (PVA) e o meio de
dissolução. O processo de reticulação com glutaraldeído, como agente de ligações
cruzadas, permitiu a obtenção de arcabouços com nanofibras de PVA e quitosana
estáveis fisicamente em solução aquosa, e com manutenção das suas funções
moleculares. A inibição de bactéria gram-positivo S. aureus por nanofibras PVA e
PVA/quitosana com diferentes frações de quitosana mostrou-se ineficiente,
provavelmente em decorrência da baixa concentração de quitosana utilizada. Um
resultado interessante foi a formação de nanofibras de blenda de PVA e quitosana com a
incorporação de um antibiótico, a tetraciclina que, em concentração muito baixa,
induziu uma inibição completa da bactéria S. aureus. Tanto a ausência de efeito
bactericida observada com os arcabouços das blendas PVA/Quitosana como também a
completa inibição do crescimento da bactéria S. aureus induzida com a incorporação da
tetraciclina necessitam de estudos mais aprofundados para a aplicação desses
arcabouços na engenharia de tecidos, para a promoção do reparo tecidual.
64
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] PARENTEAU-BAREIL, R.; GAUVIN, R.; BERTHOD, F. Collagen-Based
Biomaterials for Tissue Engineering Applications. Materials v. 3, 1863-1887, 2010
[2] ROSSO, A. et al. From cell-ECM interactions to tissue engineering. journal of
cellular physiology v.199, p.174–180, 2004.
[3] KIM, B.; BAEZ, C.E.; ATALA, A. Biomaterials for tissue engineering. World
journal of urology. v. 18 (1), p. 2-9, fev. 2000.
[4] VATS, A.; TOLLEY N.S.; POLAK J.M.; GOUGH, J.E. Scaffolds and biomaterials
for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. otolaryngol. allied sci.; v.
28(3), p.165-72, jun. 2003.
[5] EVANS, D. GENTLEMAN, E.; POLAK, J.M. Scaffolds for stem cells. Material
Today, v. 9(12), p. 26-33, dez. 2006.
[6] LI, W-J. et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue
engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials, v. 26(6), p. 599-609,
fev. 2005.
[7] CORDEIRO, M.M. et al. Dental Pulp Tissue Engineering with Stem Cells from
Exfoliated Deciduous Teeth. Journal of Endodontics, v. 34(8), p. 962-69, ago. 2008.
[8] MEINEL, L. et al. Bone Tissue Engineering using human mesenchymal stem cells:
effects of scaffold material and medium flow. Annals of Biomedical Engineering, v. 32
(1), p. 112-122, jan. 2004.
[9] KARAGEORGIOU, V.; KAPLAN D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and
osteogenesis. Biomaterials, v. 26 (27), p. 5474–5491, set. 2005.
[10] PARKINSON, L.G.; GILES, N.L. et al. The potential of nanoporous anodic
aluminium oxide membranes to influence skin wound repair. Tissue eng. part A; v. 15
(12) p. 3753-63, dez. 2009.
[11] WILLIAMS, F.D. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials, v. 29 p.
2941–2953, 2008.
[12] CHEUNG, H.-Y. et al. A critical review on polymer-based bio-engineered
materials for scaffold development Composites: Part B, v. 38, p. 291–300, 2008.
[13] CAMPOS, M. Degradação de blendas poliméricas por microrganismos de solo e de
chorume. Tese, ago. 2008.
[14] HAYASHI, K. Mechanical properties of segmented polyether polyurethanes for
blood pump applications. Artificial Heart 2, p. 13-1.
[15] KHORASANI, M.T.; SHORGASHTI, S. Fabrication of microporous polyurethane
by spray phase inversion method as small diameter vascular grafts material. J Biomed
65
Mater Res A, v. 77 (2) p. 253-60, maio 2006.
[16] BERRY, D. Glycosaminoglycan regulation of cell function. Massachusetts Institute
of Technology, Tese, 2005.
[17] ILLUM, L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm. Res. v.15
(9) p. 1326-31, set. 1998.
[18] ELSABEE, M.Z.; NAGUIB, H.F.; MORSI, R.E. Chitosan based nanofibers,
review, Materials Science and Engineering: C, v. 32(7), p. 1711-26, out. 2012.
[19] KONG, M.; CHEN, X.G.; XING, K.; PARK. H.J. Antimicrobial properties of
chitosan and mode of action: a state of the art review. Int J Food Microbiol., v. 144(1),
p. 51-63, nov. 2010.
[20] CHU X.H.; SHI, X.L.; FENG, Z.Q.; GU, Z.Z.; DING, Y.T. Chitosan nanofiber
scaffold enhances hepatocyte adhesion and function. Biotechnol Lett., v. 31(3), p. 347-
52, mar. 2009.
[21] SUNDARAMURTHI, D. et al. Electrospun nanostructured chitosan-poly(vinyl
alcohol) scaffolds: a biomimetic extracellular matrix as dermal substitute. Biomed.
Mater., v. 7(4), 045005, mai. 2012.
[22] HEALNDER, I.M. et al. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer
membrane of Gram-negative bacteria. International Journal of Food Microbiology, v.
71(2-3), p. 233-44, dez. 2001.
[23] LIU, H.; DU, Y.; WANG, X.; SUN, L. Chitosan kills bacteria through cell
membrane damage. Int. J. Food Microbiol. v. 95(2), p.147-55, set. 2004.
[24] KONG, M.; CHEN, X.G.; XING, K.; PARK. H.J. Antimicrobial properties of
chitosan and mode of action: a state of the art review. Int J Food Microbiol., v. 144(1),
p. 51-63, nov. 2010.
[25] DeMERLIS, C.C., SCHONEKER, D.R. Review of the oral toxicity of polyvinyl
alcohol (PVA). Food and Chemical Toxicology, v. 41, o.319–326, mar. 2003.
[26] CHENG, G.; CAI, Z.; WANG, L. Biocompatibility and biodegradation of
poly(hydroxybutyrate)/poly(ethylene glycol) blend films. J. Mater. Sci Mater Med., v.
14(12), p. 1073-8, dez. 2003.
[27] WHEATLEY, D.J. et al. Polyurethane: material for the next generation of heart
valve prostheses? European Journal Cardio-Thoracic Surgery, v. 17 (4) p. 440-448, fev.
2000.
[28] SHARIFPOOR, S.; SIMMONS, C.A. et al. Functional characterization of human
coronary artery smooth muscle cells under cyclic mechanical strain in a degradable
polyurethane scaffold. Biomaterials, v. 32 (21), p. 4816-29, jul. 2011.
[29] EFE T.; GETGOOD. A. et al. The safety and short-term efficacy of a novel
66
polyurethane meniscal scaffold for the treatment of segmental medial meniscus
deficiency. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc., v. 20(9), p.1822-30, set. 2009.
[30] FRAZER, R.Q.; BYRON, R.T.; OSBORNE, P.B.; WEST, K.P. PMMA: an
essential material in medicine and dentistry. J. Long. Term. Eff. Med. Implants, v. 15
(6), p. 629-39, 2005.
[31] BRYANT, S.J. et al. Encapsulating chondrocytes in degrading PEG hydrogels with
high modulus: engineering gel structural changes to facilitate cartilaginous tissue
production. Biotechnol Bioeng., v. 30 (7) p. 747-55, jun 2004.
[32] IYER, R.K.; CHIU, L.L.; RADISIC, M. Microfabricated poly(ethylene glycol)
templates enable rapid screening of triculture conditions for cardiac tissue engineering.
J. Biomed. Mater. Res. A, v. 89(3) p.616-31, jun 2009.
[33] GEORGE, P.M. et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants
suitable for neural prosthetics. Biomaterials, v. 26(17) p. 3511-9, jun 2006.
[34] WANG, X. et al. Evaluation of biocompatibility of polypyrrole in vitro and in vivo.
J. Biomed. Mater. Res. A, v. 68 (3), p. 411-22, mar. 2004.
[35] DVIR-GINZBERG, M. et al. Liver tissue engineering within alginate scaffolds:
effects of cell-seeding density on hepatocyte viability, morphology, and function. Tissue
Eng., v. 9(4), p. 757-66, ago. 2003.
[36] WANG, C.C.; YANG K.C. et al. A highly organized three-dimensional alginate
scaffold for cartilage tissue engineering prepared by microfluidic technology.
Biomaterials, v. 32(29), p. 7118-26, out. 2011.
[37] UEYAMA, Y. et al. Usefulness as guided bone regeneration membrane of the
alginate membrane. Biomaterials, v. 23(9), p. 2027-33, maio 2002.
[38] DAR, A.; SHACHAR, M.; LEOR, J.; COHEN, S. Optimization of cardiac cell
seeding and distribution in 3D porous alginate scaffolds. Biotechnol Bioeng., v. 80(3),
p. 305-12, nov. 2002.
[39] CHOI, Y.S; PARK, S.N; SHU, H. Adipose tissue engineering using mesenchymal
stem cells attached to injectable PLGA spheres. Biomaterials, v. 26(29), p. 5855-63, out.
2005.
[40] ZHAO, H.; MA, L.; CHANGYOU, G.; SHEN, J. A composite scaffold of PLGA
microspheres/fibrin gel for cartilage tissue engineering: Fabrication, physical properties,
and cell responsiveness. Journal of Biomedical Materials Research Part B-applied
Biomaterials, v. 88B(1), p. 24-249, 2009.
[41] CHONG, E.J. et al. Evaluation of electrospun PCL/gelatin nanofibrous scaffold for
wound healing and layered dermal reconstitution. Acta Biomaterialia, v. 3(3), p. 321-
330, mai. 2007.
[42] HEYDARKHAN-HAGVALL, S. et al. Three-dimensional electrospun ECM-based
67
hybrid scaffolds for cardiovascular tissue engineering. Biomaterials, v. 29(19), p. 2907-
14, jul. 2008.
[43] MA, Z.; HE, W.; YONG, T.; RAMAKRISHNA, S. Grafting of gelatin on
electrospun poly(caprolactone) nanofibers to improve endothelial cell spreading and
proliferation and to control cell Orientation. Tissue Engineering, v.11(8-9), p. 1149-58,
set. 2005.
[44] VRANA, N.E.; LIU, Y.; MCGUINNESS, G.B.; CAHILL, P.A. Characterization of
Poly(vinyl alcohol)/Chitosan Hydrogels as Vascular Tissue Engineering Scaffolds.
Macromolecular Symposia, v. 269(1), p. 106-110, ago. 2008.
[45] ZHOU, Y.; YANG, D.; CHEN, X.; XU, Q.; LU, F.; NIE, J. Electrospun water-
soluble carboxyethyl chitosan/poly(vinyl alcohol) nanofibrous membrane as potential
wound dressing for skin regeneration. Biomacromolecules, v.9(1), p. 349-354, jan.
2008.
[46] ALHOSSEI, S.N. et al. Synthesis and characterization of electrospun polyvinyl
alcohol nanofibrous scaffolds modified by blending with chitosan for neural tissue
engineering. International Journal of Nanomedicine, v. 7, p. 25-34, jan. 2012.
[47] DELIGKARIS, K. et al. Hydrogel-based devices for biomedical applications.
Sensors and Actuators B: Chemical, v. 147(2), p, 765–774, jun. 2010.
[48] HACKELBUSCH,S.; SEIFFERT, S. Polymeric supramolecular hydrogels as
materials for medicine. In-Situ Gelling Polymers, Series in BioEngineering, p. 151-185,
out. 2014.
[49] VENDRA, V.K.; WU, L.; KRISHNAN, S. Polymer thin films for biomedical
applications. Nanotechnologies for the Life Sciences, v. 5, p. 1-54, jan. 2011.
[50] BURGER, C.; HSIAO, B.S.; CHU, B. Nanofibrous materials and their
applications. Annual Review of Materials Research, v. 36, p. 333-368, 2006.
[51] BAJI, A. et al. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented
morphology, structures and tensile properties. Composites Science and Technology, v.
70(5), p. 703-718, mai. 2010.
[52] TAMAYO, A. et al. Fiber-based tissue engineering: Progress, challenges, and
opportunities Biotechnology Advances. V. 31(5), p. 669-87, set. 2013.
[53] LI, D.; XIA, Y. Electrospinning of Nanofibers: Reinventing the Wheel? Advanced
Materials, v. 16(14), p. 1151–1170, jul. 2004.
[54] MA, Z.; KOTAKI, M.; INAI, R.; RAMAKRISHNA, S. Potential of nanofiber
matrix as tissue-engineering scaffolds. Tissue Eng.; v.11 (1-2), p. 101-9, jan. 2009.
[55] UHLIG, C. et al. Suprathel-an innovative, resorbable skin substitute for the
treatment of burn victims. Burns, v. 33(2), p. 221-9, mar. 2007
68
[56] IGNATIOUS, F.; SUN, L.; LEE, C.P.; BALDONI, J. Electrospun nanofibers in oral
drug delivery. Pharm Res., v. 27(4), p. 576-88, abr. 2007
[57] CHRISTOPHERSON, G.T.;, SONG, H.; MAO, H.Q. The influence of fiber
diameter of electrospun substrates on neural stem cell differentiation and proliferation.
Biomaterials, v. 30(4), p.556-64, fev. 2009.
[58] WEI, Y. et al. Magnetic biodegradable Fe3O4/CS/PVA nanofibrous membranes for
bone regeneration. Biomed. Mater., v. 6, 055008, set. 2011.
[59] HANG, A.T.; TAE, B.; PARK, J.S. Non-woven mats of poly(vinyl
alcohol)/chitosan blends containing silver nanoparticles: Fabrication and
characterization. Carbohydrate Polymers, v. 82(2), p. 472-9, set. 2010.
[60] KONG, H.; JANG J. Antibacterial properties of novel poly(methyl methacrylate)
nanofiber containing silver nanoparticles. Langmuir, v. 24(5), p. 2051-6, mar. 2008.
[61] HUANG, Z-M. et al. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their
applications in nanocomposites. Composites Science and Technology, v. 63(15), p.
2223–2253, nov. 2003.
[62] RUTLEDGE, G.C.; FRIDRIKH, S.V. Formation of fibers by electrospinning. Adv.
Drug Deliv. Rev., v. 59(14), p.1384-91, dez. 2007.
[63] SUBBIAH, T. et al. Electrospinning of Nanofibers. Journal of Applied Polymer
Science, Vol. 96, 557–569, fev. 2005.
[64] BOUDRIOT, U., DERSCH, R.; GREINER, A.; WENDORFF, J.H. Electrospinning
approaches toward scaffold engineering--a brief overview. Artif. Organs, v. 30(10), p.
785-92, out. 2006.
[65] DE VRIEZE, s. et al. Electrospinning of chitosan nanofibrous structures: feasibility
study. Journal of Materials Science, v. 42(19), p.8029-34, out. 2007.
[66] KIM, J.; OH, H.; KIM, S.S. Electrohydrodynamic drop-on-demand patterning in
pulsed cone-jet mode at various frequencies. Journal of Aerosol Science, v. 39(9), p.
819-25, set. 2008.
[67] GARG, K.; BOWLIN, G.L. Electrospinning jets and nanofibrous structures.
Biomicrofluidics, vol. 5 (1), p. 013403, mar. 2011
[68] GAÑÁN-CALVO, A.M.; On the theory of electrohydrodynamically driven
capillary jets, Journal of Fluid Mechanics, v. 335, p. 165-188, mar. 1997.
[69] RUTLEDGE, G.C. et al. A Fundamental Investigation of the Formation and
Properties of Electrospun Fibers. National Textile Center Annual Report, nov. 2001.
[70] XU, R. et al. Experimental design and instability analysis of coaxial electrospray
process for microencapsulation of drugs and imaging agents. Journal of Biomedical
Optics, v. 18(7), p. 075003 jul. 2013.
69
[71] BEACHLEYA, V.; WEN, X. Effect of electrospinning parameters on the nanofiber
diameter and length. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl., v. 29(3), p. 663-668, mar.
2011.
[72] CRAMARIUC, B. et al. Fiber diameter in electrospinning process. Journal of
Electrostatics, v. 71(3), p. 189-198, jun. 2013.
[73] GENG, X.; KWON, O-H.; JANG, J. Electrospinning of chitosan dissolved in
concentrated acetic acid solution. Biomaterials, v. 26(27), 5427-32, set. 2005.
[74] THOMPSON, C.J. et al. Effects of parameters on nanofiber diameter determined
from electrospinning model. Polymer, v. 48(23), p. 6913-22, nov. 2007.
[75] DOUSTGANI, A. et al. Optimizing the mechanical properties of electrospun
polycaprolactone and nanohydroxyapatite composite nanofibers. Composites Part B:
Engineering, v. 43(4), p.1830-36, jun. 2012.
[76] ALJEHANI, A.K. et al. Effect of electrospinning parameters on nanofiber
diameter made of poly (vinyl alcohol) as determined by Atomic Force Microscopy.
Biomedical Engineering (MECBME), p. 379-381, fev. 2014.
[77] DING, W. et al. Manipulated Electrospun PVA Nanofibers with Inexpensive Salts,
Macromolecular Materials and Engineering, v. 295(10), p. 958-965, out. 2010.
[78] THERON, A.; ZUSSMAN, E.; YARIN, A.L. Electrostatic field-assisted alignment
of electrospun nanofibres. Nanotechnology, v.12(3), p. 384, ago. 2001.
[79] EDWARDS, M.D.; MITCHELL, G.R.; MOHAN, S.D.; OLLEY, R.H.
Development of orientation during electrospinning of fibres of poly(ε-caprolactone),
European Polymer Journal, v. 46(6), jun. 2010.
[80] LEE, H.; YOON, H.; KIM, GH. Highly oriented electrospun polycaprolactone
micro/nanofibers prepared by a field-controllable electrode and rotating collector.
Applied Physics A, v. 97(3), 559-65, ago. 2009.
[81] LI, D.; WANG, Y.; XIA, Y. Electrospinning Nanofibers as Uniaxially Aligned
Arrays and Layer-by-Layer Stacked Films. Advanced Materials, v. 16(4), p. 361-366,
fev. 2004.
[82] CHEW, S.Y.; MI, R.; HOKE, A.; LEONG, K.W. The effect of the alignment of
electrospun fibrous scaffolds on Schwann cell maturation. Biomaterials, v. 29(6), p.
653-61, fev. 2008.
[83] ZHONG, S. et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and
its effects on in vitro fibroblast culture. J. Biomed. Mater. Res. A. v. 79(3), p. 456-69,
dez. 2006.
[84] TRIPATANASUWAN, S.; ZHONG, Z.; RENEKER, D.H. Effect of evaporation
and solidification of the charged jet in electrospinning of poly(ethylene oxide) aqueous
70
solution. Polymer, v 48(19), p. 5742-46, set. 2007.
[85] MEGELSKI, S. et al. Micro- and Nanostructured Surface Morphology on
Electrospun Polymer Fibers. Macromolecules, v. 35(22), p. 8456-66, set. 2002.
[86] CASPER, C.L. et al. Controlling Surface Morphology of Electrospun Polystyrene
Fibers: Effect of Humidity and Molecular Weight in the Electrospinning Process.
Macromolecules, v. 37(2), p. 573-578, dez. 2003.
[87] DEITZEL, J.M.; KLEINMEYER, J.; HARRIS, D.; BECK TAN, N.C. The effect
of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles.
Polymer, v. 42(1), p. 261-272, jan. 2001.
[88] TAN, S-H.; INAI, R.; KOTAKI, M.; RAMAKRISHNA, S. Systematic parameter
study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer, vol. 46(16),
p. 6128-34, jul. 2005.
[89] DUAN, B.; DONG, C.; YUAN, X.; YAO K. Electrospinning of chitosan solutions
in acetic acid with poly(ethylene oxide). J. Biomater. Sci. Polym. Ed., v. 15(6) p. 797-
811, 2004.
[90] LIU, Y. et al. Controlling numbers and sizes of beads in electrospun nanofibers.
Polymer International, v. 57(4), p. 632-636, abr. 2008.
[91] UYAR, T.; BESENBACHER, F. Electrospinning of uniform polystyrene fibers:
The effect of solvent conductivity, Polymer, v. 49(24), p. 5336-43, nov. 2008.
[92] JARUSUWANNAPOOM, T. et al. Effect of solvents on electro-spinnability of
polystyrene solutions and morphological appearance of resulting electrospun
polystyrene fibers. European Polymer Journal, v. 41(3), p. 409-421, mar. 2005.
[93] LI, L.; HSIEH, Y-L. Chitosan bicomponent nanofibers and nanoporous fibers.
Carbohydrate Research v.341(3), p. 374–38, fev. 2006.
[94] JIA, Y-T. et al. Fabrication and characterization of poly (vinyl alcohol)/chitosan
blend nanofibers produced by electrospinning method. Carbohydrate Polymers, v. 67(3),
p. 403–409, fev. 2007.
[95] SAJEEV, U.S.;ANAND, A.K.;MENON, D.; NAIR, S. Control of nanostructures in
PVA, PVA/chitosan blends and PCL through electrospinning. Bulletin of Materials
Science, v. 31(3), p. 343-351, jun. 2008.
[96] LIAO, H. et al. Improved cellular response on multiwalled carbon nanotube-
incorporated electrospun polyvinyl alcohol/chitosan nanofibrous scaffolds. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, v. 84(2), p. 528–535, jun. 2011.
[97] JEUN, J-P.; JEON, Y-K.; NHO, Y-C.; KANG, P-H. Effects of gamma irradiation
on the thermal and mechanical properties of chitosan/PVA nanofibrous mats. Journal of
Industrial and Engineering Chemistry, v. 15(3), p. 430-433, mai. 2009.
71
[98] NAGEH, H. et al. Evaluation of Antibacterial Activity and Drug Release Behavior
of Chitosan - Based Nanofibers (In Vitro Study). UK Journal of Pharmaceutical and
Biosciences v.. 2(3), p.01 – 05, 2014.
[99] PAIPITAK, K. et al. Characterization of PVA-Chitosan Nanofibers Prepared by
Electrospinning. Procedia Engineering, v. 8, p. 101-105, 2011.
[100] MEYER, E. Atomic Force Microscopy. Progress in Surface Science, v. 41, p. 3-
49, 1992.
[101] JALILI, N.; LAXMINARAYANA, K. A review of atomic force microscopy
imaging systems: application to molecular metrology and biological sciences.
Mechatronics, v. 14(8), p. 907-945, out. 2014.
[102] JANDT. K.D. Atomic force microscopy of biomaterials surfaces and interfaces.
Surface Science v. 491(3), p. 302-332, out. 2001.
[103] VERNON-PARRY, K.D. Scanning electron microscopy: an introduction. III-Vs
Review, v. 13(4), p.40-44, jul-ago. 2000.
[104] BOGNER, A. et al. A history of scanning electron microscopy developments:
towards "wet-STEM" imaging. Micron., v. 38(4), p. 390-401, jul. 2006.
[105] DEDAVID, B.A. Microscopia eletrônica de varredura: aplicações e preparações
de amostras. EdiPUCRS, 2007.
[106] SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Análise instrumental química.
Bookman, 5° edição, 2002.
[107] OZAWA, T. Thermal analysis — review and prospect. Thermochimica Acta, v.
355, p. 35-42, jul. 2000.
[108] SAID, S. S. et al. Antimicrobial PLGA ultrafine fibers: Interaction with wound
bacteria. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 79, p. 108-118,
set. 2011.
[109] HARRIOTT, M.M., NOVERR, C. M. Candida albicans and Staphylococcus
aureus Form Polymicrobial Biofilms: Effects on Antimicrobial Resistance. Antimicrob.
Agents chemother, vol. 53(9), p. 3914-3922, set. 2009.
[110] PARK, H. W., et al. Effect of chitosan on morphology and conformation of
electrospun silk fibroin nanofibers. Polymer, v. 45 (21), p. 7151-7157, set. 2004.
[111] CENGIZ, F.; DAO, A.T.; JIRSAK, O. Influence of solution properties on the
roller electrospinning of poly(vinyl alcohol). Polymer Engineering & Science, vol. 50
(5), p. 936-943, mai. 2010.
[112] KOLSKI, A.; SHIVKUMAR, S.; YIM, K. Effect of molecular weight on fibrous
PVA produced by electrospinning. Materials Letters, vol. 58 (3-4), p. 493-97, jan. 2004.
72
[113] LIN, T. et al. Using chitosan as a thickener for electrospinning dilute PVA
solutions to improve fibre uniformity. Nanotechnology, vol. 17, p. 3718, jun. 2006.
[114] COSTA JR, MANSUR, S.M. Preparação e caracterização de blendas de
quitosana/poli(álcool vinílico) reticuladas quimicamente com glutaraldeído para
aplicação em engenharia de tecidos. Quím. Nova vol.31(6), p. 1460-1466, 2008.
[115] PADIL, V.V.T. et al. Fabrication, Characterization, and Antibacterial Properties of
Electrospun Membrane Composed of Gum Karaya, Polyvinyl Alcohol, and Silver
Nanoparticles. Journal of Nanomaterials, ID 750726, out. 2014.
[116] ZHANG, Y. et al. Preparation of electrospun chitosan/poly(vinyl alcohol)
membranes. Colloid Polym Sci., v. 285, p. 855-863 (8), mai. 2008.
[117] JUNG, K-H., et al. Preparation and antibacterial activity of PET/chitosan
nanofibrous mats using an electrospinning technique. Journal of Applied Polymer
Science, vol. 105 (5), p. 2816–2823, set. 2007.
[118] NGUYEN, T.T.T., et al. Coaxial electrospun poly(lactic acid)/chitosan (core/shell)
composite nanofibers and their antibacterial activity. Carbohydrate Polymers, vol 86 (4),
p. 1799–1806, out. 2011.
[119] NAEBE, M., et al. Electrospun single-walled carbon nanotube/polyvinyl alcohol
composite nanofibers: structure–property relationships. Nanotechnology, vol. 19 (30),
305702, 2008.
[120] MANSUR, S. H., et al. FTIR spectroscopy characterization of poly (vinyl
alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with
glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C, vol. 28 (4), p. 539-548, mai.
2008.
73
