Glaucia Pereira Alves - Pós-Graduação...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA

Glaucia Pereira Alves

INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA:

IDENTIFICAÇÃO DE FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E

CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

Santo André-SP

2016

Glaucia Pereira Alves

INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA:

IDENTIFICAÇÃO DE FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E

CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

Área de Concentração: Biotecnologia

Orientadora: Prof°.Dra. Marcella Pecora Milazzotto

Santo André-SP

2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnociências da Universidade

Federal do ABC, como requisito final para

obtenção do título de mestre em Biotecnociências.

Este exemplar foi revisado e alterado em relação a versão

original, de acordo com as observações levantadas pela banca

no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor e com a

anuência de seu orientador.

Santo André,____de_________________de 20___.

Assinatura do autor: ____________________________________

Assinatura do orientador:________________________________

“Ostras felizes não fazem pérolas… Pessoas

felizes não sentem a necessidade de criar. O

ato criador, seja na ciência ou na arte, surge

sempre de uma dor. Não é preciso ser uma dor

doída… Por vezes a dor aparece como aquela

coceira que tem o nome de curiosidade.”

Rubens Alves

AGRADECIMENTOS

Á Deus pela saúde e por ter me mantido no caminho todas as vezes que pensei em

desistir.

À minha orientadora Profª. Dra. Marcella Milazzotto pela confiança, amizade,

paciência, puxões de orelha, compreensão e credibilidade dispensados ao longo do período de

mestrado. Foi um período muito importante de crescimento e amadurecimento pessoal.

Aos meus pais, irmãos, sobrinhos e todos familiares pela compreensão por minha

ausência durante toda essa longa jornada.

Aos meus tios (Wanderley e Vera Lúcia) e primas (Carol e Bárbara) pelo apoio em

todos os momentos. Sem vocês esta etapa não poderia ser vencida. Muito obrigada.

Ás meninas do laboratório 502-3, Karine, Mayra, Fernanda, Carol, Juliana, pela

amizade e convívio agradável.

Ao meu grupo de pesquisa Érika, Jéssica, Camila, Roberta, Aline e em especial a

Kelly que teve a paciência de me ensinar e me ajudou no árduo trabalho de produção das

amostras, sem a qual não seria possível a execução.

Às amigas Silvia e Graziele pela amizade, pelo apoio, pelos momentos de

descontração e muitas risadas. Também pelas longas conversas que tanto amenizavam a

distância de casa.

Às amigas de república Hellen e Rebecca pelo convívio, pela amizade e por tudo que

passamos juntas.

Agradeço a Universidade Federal do ABC pela oportunidade de realização da pós-

graduação em Biotecnociência.

À FAPESP pelo apoio financeiro que possibilitou a realização desse trabalho.

A todos que não foram aqui mencionados, mas que direta ou indiretamente

contribuíram para esta pesquisa.

Os meus sinceros agradecimentos.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AngII AngiotensinaII

AngII AT1 Receptor de AngiotensinaII tipo1

AngII AT2 Receptor de AngiotensinaII tipo2

ATP Adenosina trifosfato

BLL Blastocisto lento

BLR Blastocisto rápido

CIV Cultivo in vitro

CL Clivados

CLL Clivados lentos

CLR Clivados rápidos

CLBL Clivados que chegaram a blastocistos

CLNBL Clivados que não chegaram a blastocistos

CLNBLL Clivados que não chegaram a blastocistos lentos

CLNBLR Clivados que não chegaram a blastocistos rápidos

COCs Complexos cumulus oophorus

CO2 Dióxido de Carbono

DNA Ácido desoxirribonucleico

EGF Fator de crescimento epidermal

EFG-R Receptor do fator de crescimento epidermal

FF Fluido folicular

FIV Fecundação in vitro

FSH Hormônio folículo estimulante

FSH-R Receptor de hormônio folículo estimulante

GSH Glutationa

GVBD Quebra da vesícula germinativa

HBP Via biossintética hexosamina

hCG Gonadotrofina coriônica

IETS International Embryo Transfer Society

LH Hormônio luteinizante

LH-R Receptor de hormônio luteinizante

MIV Maturação in vitro

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NCL Não clivados

PIV Produção in vitro

PKA Proteína quinase A

PPP Via das pentoses fosfato

PRPP Fosforibosilpirofosfato

P450arom Aromatase

P450scc Cholesterol side-chain cleavage

RNA Ácido ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

ROS Espécies reativas de oxigênio

SFB Soro fetal bovino

SOF Synthetic Oviductal Fluid

TCA Ciclo do ácido tricarboxílico

3βHSD 3β- desidrogenase

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Biossíntese de estradiol a partir de colesterol

Figura 2: Esquema representativo do modelo de duas células: célula da teca e célula da granulosa.

Nas células da teca o colesterol é transportado pela StAR para dentro da matriz mitocondrial onde

é convertido a pregnenolona pela enzima side chain cleavage (P450scc) que em seguida é

convertida a androgênios (androstenediona). Os androgênios da teca difundem-se para as células

da granulosa, onde são convertidos pela aromatase (P450arom) em estradiol. A síntese de

P450arom é estimulada via núcleo (seta vermelha) por AngII AT2 e também através de FSH/FSH-

R via AMPc/PKA que é produto da oxidação de glicose e piruvato. A síntese de FSH-R é

estimulada via núcleo por EGF/EGF-R , e este estímulo induz aumento do antro, proliferação e

diferenciação das células da granulosa.

Figura 3: Esquema representativo do mapa de localização dos oócitos em uma placa de MIV. Cada placa de

MIV contém cinco gotas de meio de maturação. Em cada gota foram feitos cinco poços e em cada

poço foi alocado um oócito proveniente de um folículo pré identificado. O liquido folicular

referente a este oócito foi congelado até o momento da análise.

Figura 4: Produção embrionária A) Índice de clivagem total (CLT) e clivados rápidos (CLR) e lentos

(CLL), B) Índice de blastocistos do grupo rápido (BLR), grupo lento (BLL) e blastocistos totais

(BLT) em relação aos oócito clivados totais e C) Índice de blastocistos em relação aos embriões

clivados por grupo – CLBLR – blastocistos rápidos/ CLBLL blastocistos lentos.

Figura 5: Concentração de glicose referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e

Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e

Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E)

Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos.** Indica grupo com tendência a ter maior

concentração.

Figura 6: Concentração de colesterol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados (NCL) e

Clivados (CL), B) Clivados Rápidos (CLR) e Clivados Lentos (CLL), C) Não Blastocistos (NBL)

e Blastocistos (BL), D) Clivados Não Blastocistos (CLNBL) e Clivados Blastocistos (CLBL) e E)

Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito.

Figura 7: Concentração de piruvato referente ao fluido folicular que derivaram:: A) Não Clivados(NCL) e



Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do

metabólito.**Indica grupo com tendência a ter maior concentração do metabólito.

Figura 8: Concentração de estradiol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e



Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito

Figura 9: Expressão relativa do gene FSHR em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não

clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não

blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados

blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior

expressão relativa do gene.

8

10

17

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28

Figura 10: Expressão relativa do gene CYP19A em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não

clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não

blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados



Figura 11: Expressão relativa de RNAm para receptores de angiotensina II do tipo 2 (AT2) em células da

granulosa que derivaram os grupos: : A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados

rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados

não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e

blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.

Figura 12: Expressão relativa de RNAm para receptores de EGF em células da granulosa que derivaram os

grupos: A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos

(CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e

clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica

maior expressão relativa do gene.

29

30

31

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Moléculas que foram avaliadas neste projeto e sistema de avaliação

Tabela 2: Dados utilizados na padronização dos kits de quantificação das moléculas

que foram avaliadas.

Tabela 3: Genes avaliados e seus respectivos códigos no fabricante e no GenBank.

Tabela 4: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram embriões Não

Clivados.

Tabela 5: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram embriões

Clivados.

Tabela 6: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados

Rápidos


Lentos

Tabela 8: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Não

Blastocistos

Tabela 9: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Blastocistos

Tabela 10: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados não

Blastocistos


Blastocistos


Lentos


Rápidos

19

19

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33

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34

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Sumário

1. Revisão de Literatura .......................................................................................... 5

2. Objetivo .............................................................................................................. 15

3. Metodologia ....................................................................................................... .16

3.1 Local dos procedimentos .................................................................................... .16

3.2 Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos .................................. 16

3.2.1 Coleta e maturação in vitro de oócitos ............................................................. .16

3.2.2 Fecundação e cultivo in vitro ........................................................................... .17

3.3 Análise da produção e morfocinética embrionária .............................................. .18

3.4 Análise dos componentes do fluido folicular ...................................................... .18

3.5 Análise de expressão gênica das células da granulosa ......................................... .20

3.6 Análise estatística ............................................................................................... .21

4. Resultados ........................................................................................................ .23

4.1 Desenvolvimento embrionário ............................................................................ .23

4.2 Análises dos componentes do fluido folicular ...................................................... 23

4.3 Análises da expressão gênica das células da granulosa ........................................ 27

4.4 Correlação entre moléculas do fluido folicular ..................................................... 32

5. Discussão ............................................................................................................ 38

6. Conclusão .......................................................................................................... .42

7. Referências ........................................................................................................ .43

ANEXO .................................................................................................................... .51

1

INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA: IDENTIFICAÇÃO DE

FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO

Resumo

A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta

mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No

entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração

podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O

objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e

transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e

sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a

blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e

respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As

moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por

fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II

(AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG

por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices

de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as

186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em

função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não

clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4

células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL),

clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e

blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados

foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de

significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e

25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos

analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que

foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de

BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e

8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e

colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R

2

quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e

BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram

diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais

relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito

negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem

concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver

a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da

capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da

mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade

esteroidogênica distinta.

Palavras-chave: fluido folicular, células da granulosa, biomarcadores, capacidade

esteroidogênica, capacitação oocitária.

3

FOLLICULAR FLUID INFLUENCE IN THE OOCYTE COMPETENCE: IDENTIFICATION OF

FACTORS INVOLVED IN OOCYTE QUALITY AND EMBRYONIC DEVELOPMENT OF KINECT

Abstract

Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible

for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte

complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from

slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol

were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to

oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r),

angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine

embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured

individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi).

Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and

blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in

function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs.

slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached

blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from

fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and

transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering α=5%.

Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%,

respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their

respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did

not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF

and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and

cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL,

respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL,

suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity.

Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and

estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of

steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels

of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this

hormone. In summary, our results show that follicular status is directly related to the oocytes

4

ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and

steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise,

embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct

steroidogenic activity.

Keywords: follicular fluid, granulosa cells, biomarkes, steroidogenic capacity, oocyte

capacitation

5

1. Revisão de literatura

A pecuária bovina é um dos setores mais importantes do agronegócio brasileiro e

consequentemente da economia nacional, sendo responsável pela arrecadação de 30% do PIB

nacional (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2014). O Brasil possui o maior rebanho

comercial de bovinos e é referência mundial na produção de embriões tanto in vivo, quanto in

vitro (INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER SOCIETY –IETS 2012 ). O número total

de embriões bovinos transferidos produzidos in vitro (PIV) em todo o mundo em 2013 foi de

517.587 sendo o Brasil responsável por 366.451 (70,8%) deste montante (PERRY, 2013).

Sendo assim, a PIV de embriões bovinos é importante tanto comercialmente quanto para

pesquisa. Comercialmente, a técnica se propõe a melhorar a produção de embriões com

finalidade de ampliar o potencial reprodutor de touros de alto valor comercial, bem como as

fêmeas de várias idades e estados fisiológico-reprodutivos distintos. Na pesquisa, atua como

mecanismo no auxilio de outras novas biotecnologias na área de reprodução animal, sendo

utilizada em estudos da fisiologia da maturação e fecundação dos oócitos, capacitação

espermática, cultivo de embriões, clonagem, sexagem de espermatozoides, preservação de

oócitos e embriões, entre outras (GONÇALVES ET AL. 2008). No entanto, apesar de

amplamente difundida, a PIV ainda não chega ao máximo de sua eficiência, tornando o estudo

de cada uma das suas etapas de fundamental importância.

As etapas da produção in vitro de embriões consistem em maturação (MIV),

fecundação (FIV) e cultivo (CIV) que dependem largamente da qualidade e competência dos

gametas. Dentre estas etapas, a maturação é referida como o conjunto de processos que

ocorrem a partir da fase de vesícula germinativa para a conclusão da segunda divisão meiótica

com a formação do primeiro corpúsculo polar (HYTTER ET AL., 1997). Durante a

maturação, os oócitos sofrem várias alterações nucleares e citoplasmáticas que os equipam

com toda a maquinaria celular necessária para permitir a entrada do espermatozoide, e

consequente sucesso da fecundação e do desenvolvimento embrionário inicial (HYTTER ET

AL., 1997). Dessa forma, o objetivo primordial da MIV é tentar mimetizar ao máximo o

microambiente folicular in vivo permitindo o adequado desenvolvimento do oócito.

In vivo, ao termino do período de crescimento e anterior ao período de maturação, os

oócitos passam por um período chamado de capacitação ou pré-maturação, que é muito

importante para o desenvolvimento completo de sua competência (HYTTEL ET AL., 1997).

Durante esse período específico ocorrem modificações ultraestruturais e moleculares no

6

oócito importantes para a retomada da meiose (maturação final) e desenvolvimento pós-

fecundação. É nesta etapa de maturação que ocorrem mudanças nucleares e citoplasmáticas

essenciais que influenciam na qualidade do futuro embrião. As mudanças nucleares incluem

quebra da vesícula germinativa (GBVD), desaparecimento do nucléolo, condensação da

cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do segundo fuso meiótico

(MEINECKE ET AL., 2001). As mudanças citoplasmáticas abrangem síntese de proteínas,

modificações moleculares, redistribuição das organelas intracelulares e maturação dos

mecanismos de liberação do Ca2+

(FERREIRA ET AL., 2009). Estas modificações fazem o

oócito progredir do estádio inicial em que estão bloqueados, diplóteno da prófase I da

primeira divisão meiótica para o estádio de metáfase II (MINGOTI ET AL., 1995). Estes

processos vêm sendo estudados juntamente com os mecanismos envolvido na regulação da

maturação de oócitos e desenvolvimento embrionário.

Sabe-se que a remoção do oócito do meio folicular, uma prática feita para obtenção de

oócitos para a MIV, resulta na retomada espontânea da meiose nos oócitos, interrompendo o

período de capacitação que tenta ser retomado in vitro (HYTTEL ET AL., 1997). Dessa

forma, acredita-se que as condições a que estes oócitos foram submetidos até o momento da

aspiração folicular podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas posteriormente

no fenótipo embrionário visto que, após a remoção do oócito do folículo ovariano para a PIV

todos são submetidos às mesmas condições ambientais no laboratório. Por essa razão, a

investigação dos componentes presentes no ambiente folicular é sugerida para esclarecer

quais seriam as moléculas fundamentais para capacitação do oócito e consequente aumento da

competência embrionária.

Diversas moléculas são descritas como importantes para o processo de maturação,

sendo uma delas o colesterol. O colesterol é um importante precursor da esteroidogênese

ovariana que ocorre pela interação das duas células que compõem o folículo ovariano, células

da teca e da granulosa. Intracelular, o colesterol pode ter múltiplos destinos como ser

incorporado em membranas celulares determinando sua fluidez, pode ser esterificado e

armazenado, além de ser subtrato para síntese de esteroides (GÉVRY ET AL., 2005). Deste

modo, quantidades substanciais de colesterol precisam ser transportadas para as células

foliculares e, por fim, para o oócito. Em estudos realizados por PFEIFER ET AL. (2009),

foram avaliados os níveis de colesterol sérico e relacionados com a qualidade dos oócitos. Foi

verificado que os animais com níveis de colesterol superior a 50 mg/dl apresentaram um

7

maior número de folículos aptos à punção folicular e consequentemente melhor qualidade

oocitária provavelmente devido a maior capacidade esteroidogênica em nível folicular.

A via de biossíntese de estradiol nos folículos ovariano é conhecida como o modelo de

duas células, sendo as células da granulosa responsável pela produção de estrógenos e as da

teca pelos andrógenos. (HILLIER ET AL., 1994). O LH estimula a biossíntese de andrógenos,

principalmente, Androstenediona (BERGH ET AL., 1993) que é um precursor da biossíntese

de estradiol, nas células da teca, que expressam o receptor de LH. A partir de células da teca,

andrógenos atravessam a membrana basal para as células da granulosa vizinhas, que

expressam o receptor de FSH. Caracteristicamente, a granulosa não contém vasos, assim toda

sua produção de esteroides é limitada aos precursores que recebe, portanto, recebendo

somente andrógenos da teca não pode produzir nada mais do que estrógenos. E nas células da

granulosa a Androstenediona é catalisada a estradiol pela P450Arom sob o estimulo de FSH

(HILLIER ET AL., 1994). Sendo assim, as células da teca não sintetizar estrógenos, uma vez

que não expressam P450arom (HILLIER ET AL., 1994). As células da granulosa por sua vez,

não são capazes de produzir andrógenos, uma vez que não expressam P450c17 que é uma

enzima conversora de pregnenolona em andrógenos. No entanto, ambos os tipos de células

expressam P450scc (HILLIER ET AL., 1994) (Figuras 1 e 2).

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Figura 1: Biossíntese de estradiol a partir de colesterol. (Adaptado de NAUFAL ET. AL., 2013)

A enzima aromatase, também conhecida como P450arom, é um membro da

superfamília de enzimas do citocromo p450, sendo um produto do gene CYP19. Este gene é

transcrito em células da granulosa no ovário, estando ausente nas células da teca (BAO E

GARVERICK, 1998). A P450arom pode ainda ser produzida na placenta, no tecido adiposo e

na pele (LIMA-VERDE ET AL., 2011). Em todos estes locais de produção, os precursores de

esteroides servem como substrato para a aromatase, sendo sintetizados por diferentes células

no organismo. A atividade esteroidogênica da P450arom em folículos pré-antrais bem como

as ações de esteroides sobre o crescimento folicular pré-antral também têm sido amplamente

estudadas. A atividade ovariana da P450arom é evidente nos folículos pré-antrais pois são

capazes de produzir estradiol já no início do seu desenvolvimento no estágio de folículo

primordial (OLIVEIRA ET AL. 2011). O crescimento do folículo pré-antral é, portanto,

9

caracterizado pelo aumento da atividade da P450arom e síntese de andrógenos, que culmina

na produção de estrogênio folicular. O folículo pré-ovulatório tem os maiores níveis de

estradiol intrafoliculares, principalmente devido ao tamanho da população de células da

granulosa e a sua capacidade para promover a aromatização dos androgênios (DRUMMOND,

2006).

O estradiol age através de dois tipos de receptores de estrogênio: o receptor de

estrogênio alfa (ERα) e o receptor de estrogênio beta (ERβ) (NOKELAINEN, 2000). Nas

células da granulosa, expressam-se principalmente o ERβ responsável pela modulação da

ação do FSH e estimulação do crescimento folicular induzido pelo estradiol. O ERα está

presente, predominantemente, nas células da teca dos ovários (NOKELAINEN, 2000).

Observa-se que tanto o estradiol quanto os andrógenos, são importantes para o

desenvolvimento normal do folículo ovariano. A produção local de progesterona, juntamente

com a ação do LH, é essencial para a ovulação. Assim sendo, observa-se a importância do

estudo das vias de sinalização fisiológica na produção de esteroides ovarianos, para melhor

compreender sua relação com a competência embrionária. O estradiol pode estar envolvido no

mecanismo de desvio folicular pois o folículo dominante produz e o libera, aparentemente, no

momento aproximado de desvio e ao longo da sua fase de crescimento. Desvio começa

quando o futuro folículo dominante é de 8,5 mm de diâmetro (GINTHER ET AL., 1997). As

concentrações de estradiol e de fluido folicular do maior folículo são elevadas quando o seu

diâmetro médio é de 8-9 mm. GUINTHER ET AL.(1997) mediu as concentrações de estradiol

em fluido folicular de bovinos em diversos tamanhos variando de 6 mm a 12 mm de diâmetro.

Folículos pequenos (6,7-6,9mm de diâmetro) possuíam em media 42 ng/mL de estradiol,

folículos médios (7-8,8mm) possuíam de 110- 313ng/mL e folículos grandes (8,9-12mm) >

544ng/mL. Sendo assim, as concentrações de estradiol aumentam de acordo com o

crescimento folicular. Segundo BEKER ET AL. (2002), durante a MIV de oócitos de bovino,

a presença de estradiol aumenta a velocidade de maturação na presença de FSH.

10

Figura 2: Esquema representativo do modelo de duas células: célula da teca e célula da granulosa.

Nas células da teca o colesterol é transportado pela StAR para dentro da matriz mitocondrial onde é

convertido a pregnenolona pela enzima side chain cleavage (P450scc) que em seguida é convertida a

androgênios (androstenediona). Os androgênios da teca difundem-se para as células da granulosa,

onde são convertidos pela aromatase (P450arom) em estradiol. A síntese de P450arom é estimulada

via núcleo (seta vermelha) por AngII AT2 e também através de FSH/FSH-R via AMPc/PKA que é

produto da oxidação de glicose e piruvato. A síntese de FSH-R é estimulada via núcleo por EGF/EGF-

R, e este estímulo induz aumento do antro, proliferação e diferenciação das células da granulosa.

Nos primeiros estágios da foliculogênese as células da granulosa já expressam

receptores de FSH (FSH-R). O FSH-R é uma proteína transmembrânica pertencente à família

de receptores acoplados à proteína G, caracterizado por sete hélices hidrofóbicas inseridas na

membrana plasmática e domínios intracelulares e extracelulares. Após a ativação do receptor

pela interação hormonal do FSH com o domínio extracelular inicia-se a cascata de eventos

que conduz finalmente para os efeitos biológicos específicos da gonadotropina (SIMONI ET

AL., 1997). O FSH induz aumento no número de células da granulosa, acarretando a

formação do antro folicular e a maior produção da aromatase. Assim, mutações inativadoras

no gene do receptor do FSH são caracterizadas pela baixa produção de estrógeno e

infertilidade em virtude da ausência de maturação folicular, como na falência ovariana

prematura (KOHEK ET AL., 2001). Em estudo realizado por BAO E COLABORADORES

(1997), verificou-se que a expressão de RNAm para FSH-R nas células da granulosa foi

11

superior no folículo dominante quando comparado aos recrutados obtidos no dia dois da onda

de crescimento folicular. Assim, pode-se especular que essa maior disponibilidade de FSH-R

pode ser importante na divergência, uma vez que possibilitaria que esses folículos

selecionados continuassem respondendo ao FSH mesmo quando este está em baixas

concentrações, mantendo a alta produção de estradiol.

Em um folículo dominante, o FSH no fluido folicular induz atividade de P450arom

que metaboliza substrato andrógeno ao estradiol. Nesses folículos, o estradiol e

androstenediona acumulam-se em concentrações muito elevadas no fluido folicular. Um

ponto importante é que o estradiol produzido pelo folículo dominante inibe o aumento

secundário de FSH por um mecanismo de feedback negativo e isso acredita-se reduzir os

níveis de FSH que chegam nos folículos não dominantes levando-os a atresia (FORTUNE ET

AL., 2004).

Outro receptor importante para esteroidogênese é o receptor de fator de crescimento

epidermal (EGF-R). O EGF-R é uma glicoproteína transmembrânica com um domínio ligante

extracelular, um domínio lipofílico transmembranar e um domínio intracelular com atividade

de tirosina-quinase intrínseca (ULLRICH E SCHLESSINGER, 1990). A síntese de transcritos

de EGF-R foi identificada no oócito e nas células da granulosa de folículos iniciais e em

estádios mais avançados de desenvolvimento, em diferentes espécies como ratas,

camundongos fêmeas, porcas, cabras, mulheres e vacas (CELESTINO ET AL., 2012).

Estudos realizados in vitro mostraram que o EGF pode promover a ativação folicular em

ovinos (ANDRADE ET AL., 2005) e estimular a proliferação das células da granulosa de

suínos (MORBECK ET AL., 1993). O EGF aumenta o diâmetro folicular em suínos (MAO

ET AL., 2004), promove o crescimento de oócitos em folículos primários de caprinos (SILVA

ET AL., 2004) e regula a expressão da conexina 43 em suínos e coelhos, essenciais para o

estabelecimento das junções gap (BOLAMBA ET AL., 2002; Kennedy et al., 2003). Além

disso, o EGF parece agir localmente no ovário controlando a expressão de receptores para

FSH e LH (LUCIANO ET AL., 1994; HATTORI ET AL., 1995). A importância do EGF na

fase antral também é observada na maturação e na ovulação, como foi observado em

camundongo fêmea, em que uma mutação no receptor EGFR com baixa atividade quinase

leva a um comprometimento desses processos (HSIEH ET AL., 2007).

Outro hormônio envolvido no crescimento folicular e com a esteroidogênese é a

Angiotensina II (AngII) (NIELSEN ET AL.,1994; ACOSTA ET AL., 2000; GIOMETTI ET

AL., 2005). A AngiotensinaII (AngII) é um hormônio ativo no sistema renina-angiotensina,

12

com ação bastante conhecida em vasoconstrição arterial, angiogênese e síntese de aldosterona

(PAUL ET AL., 2006). Seu papel na regulação ovariana ainda não é claro, mas tem sido

estudado devido a presença de seus receptores nas células foliculares de várias espécies

(HUSAIN ET AL., 1987; YOSHIMURA ET AL., 1994; ACOSTA ET AL., 2000;

AGUILERA ET AL., 1989). A Ang II age através de receptores que são classificados em

dois tipos: AGTR1 (AT1) que é conhecido em vasoconstrição arterial, angiogênese e secreção

de aldosterona; AGTR2 (AT2), relacionado principalmente com a indução de apoptose e a

mediação de funções reprodutivas (CHIU ET AL., 1989; WHITEBREAD ET AL., 1989).

Em folículos pré-antrais de suínos, a AngII tem importante ação na formação do antro,

proliferação celular e secreção de esteroides (SHUTTELEWORTH ET AL., 2002). Já in

vitro, a AngII atua como um intermediário na ovulação induzida por gonadotrofinas em

coelhas, ratas e vacas (KUO ET AL., 1991; YOSHIMURA ET AL., 1992; PETERSON ET

AL., KOTANI ET AL., 1999; FERREIRA ET AL., 2007). Em bovinos a presença de

receptores para AngII nas células foliculares e o aumento nas concentrações de AngII no

fluido folicular após a liberação pré-ovulatória de gonadotrofinas sugerem uma uma atividade

biológica desse peptídeo também nessa espécie. A AngII participa da maturação nuclear de

oócitos bovinos (GIOMETTI ET AL., 2005) e a aplicação de bloqueadores dos receptores de

AngII em bovinos resulta no bloqueio da ovulação nessa espécie (FERREIRA ET AL., 2007).

Além do controle hormonal, o processo de maturação oocitária também é dependente

de substratos energéticos indispensáveis para o crescimento folicular, síntese de proteínas e

proliferação celular. Dentre estes substratos, a glicose tem sido relatada como uma importante

molécula estimulando o aumento da glicólise no oócito (IWATA ET AL., 2004). Grande

parte da glicose captada pelo complexo cumulus-oócito é convertida em piruvato ou lactato

através da glicólise. Esses substratos podem ser facilmente oxidados pelo oócito para a

energia na forma de ATP (DOWNS & UTECHT, 1999, KHURANA & NIEMAN, 2000,

CETICA ET AL, 2002). Uma proporção de glicose pode também pode ser convertida durante

a MIV em glucosamina, um substrato que junto com FSH estimula a síntese de matriz

extracelular e expansão do cumulus (SUTTON-MCDOWALL ET AL., 2004). A maturação

induzida pelo FSH parece estimular enzimas que aumentam o metabolismo da glicose e a

quebra da vesícula germinativa (CHAVES ET AL., 2010). No entanto, o metabolismo da

glicose é dependente tanto da tensão de oxigênio utilizada para o cultivo como da

concentração de espécie reativas de oxigênio no oócito. Oócitos bovinos precisam de baixas

concentrações de glicose para diminuir as espécies reativas de oxigênio, aumentar a

13

concentração de glutationa (GSH) e assim manter a sua competência para o desenvolvimento

(HASHIMOTO AT AL., 2000). Em estudos realizados por ORSI ET AL.(2005) traçaram os

perfis fisiológicos nas concentrações de glicose e piruvato em fluido folicular bovino de

folículos dominantes (7,49-11,52mm de diâmetro) e não dominantes (5,30-7,68mm de

diâmetro) na tentativa de formular meios de maturação in vitro mais fisiológicos. Verificaram

que as concentrações de glicose flutuam entre 4,25-5,05mmol/l em folículos não dominantes

e 4,84mmol/l em dominantes. E as concentrações de piruvato em folículos dominantes e não

dominantes não tiveram diferença ficando em 0,03 mmol/l.

O piruvato por sua vez é um subtrado energético originado ao fim da glicólise e pode

seguir duas vias metabólicas para geração de energia: a via aeróbia pelo ciclo do ácido

tricarboxílico e a via anaeróbica pela fermentação láctica ou alcoólica (SUTTON-

MCDOWALL ET AL., 2010). Em ratas foi verificado que durante o processo de maturação

oocitária em sistema de cultivo contendo glicose como única fonte de energia os oócitos

envolvidos pelas células do cumulus sofrem quebra da vesícula germinativa, reiniciando a

meiose (DOWNS ET AL., 2002). No entanto, sabe-se que o oócito também utiliza o piruvato

metabolizado a partir da glicose pelas células do cumulus e transferido pelas junções gap.

Corroborando com estes dados, foi descrito que oócitos desnudos podem completar a

maturação meiótica utilizando o piruvato como fonte energética, o que não acontece se o

substrato energético for a glicose ou lactato. Neste mesmo estudo, in vivo, foi bloqueada a

síntese de uma das subunidades do complexo piruvato desidrogenase. Mesmo após essa

inativação, os oócitos foram capazes de se desenvolver normalmente, ser ovulados e

fertilizados, contudo eles foram prejudicados na sua capacidade de suportar o

desenvolvimento embrionário além de zigoto de uma célula (JOHNSON ET AL., 2007).

Com base nos dados apresentados, fica evidente a importância de moléculas presentes

no fluído e nas células foliculares na capacitação e desenvolvimento oocitários. A presença e

atividade dessas moléculas pode levar a produção de gametas melhor preparados que levarão

a formação de embriões de características distintas após os procedimentos in vitro para a

produção embrionária. Neste sentido, além dos índices de desenvolvimento, a morfocinética

embrionária é um método que pode auxiliar a identificação de embriões de características

distintas. A morfocinética propõe avaliar o tempo de divisões das células embrionárias como

previsão do potencial de desenvolvimento e a probabilidade de um embrião ser competente no

estabelecimento da prenhez. Em humanos foi descrito que embriões que clivam primeiro (2

14

células a 25 - 27h pós inseminação ou ICSI) apresentam maior taxa de gestação após a

transferência do que aqueles que não clivaram neste período (FENWICK ET AL, 2002,

SALUMETS ET AL., 2004). Em estudos de time-lapse também se correlacionou a

capacidade de um embrião em gerar gravidez com alguns intervalos específicos do ciclo

celular e morfologia blastômeros (RAMSING, 2011).

BAUMMANN E COL. (2007) propuseram que um embrião metabolicamente mais

ativo pode ser um sinal de danos no DNA que levam a ativação prematura do genoma e

diminuição de qualidade do embrião. Além disso, LEESE E COL (2002) também propuseram

que os embriões mais viáveis são os que apresentam menor metabolismo, menor índice

glicolítico, menor turnover de aminoácidos e altos níveis de enzimas antioxidantes. Estas

características são sugeridas como sendo derivadas do oócito, uma vez que durante as

primeiras divisões (usadas para a classificação da cinética) o embrião utiliza principalmente o

estoque materno de mRNAs e proteínas (SCHULTZ, 2005). Nosso grupo vem trabalhando

com modelo já estabelecido de morfocinética embrionária em bovinos e de fato embriões

bovinos que clivam primeiro apresentam características metabólicas distintas em relação ao

metabolismo energético, de lipídeos, estresse celular, transcriptoma e metaboloma.

Sendo assim, a hipótese deste trabalho é de que o ambiente folicular ao qual o oócito

foi submetido anteriormente a MIV confere características as células foliculares e oocitária

que serão refletidas na qualidade e cinética embrionária. Além disso, os perfis obtidos dos

fluidos foliculares em relação à quantificação de colesterol, estradiol, glicose e piruvato e o

padrão de síntese de transcritos de genes relacionados à capacidade esteroidogênica das

células da granulosa possam predizer o padrão metabólico do gameta e consequentemente o

padrão metabólico do futuro embrião. Dessa forma, tais moléculas podem ser usadas como

biomarcadores da qualidade oocitária e futura qualidade embrionária.

15

2. Objetivo

Objetivo geral:

Quantificar biomarcadores metabólicos e moleculares presentes no fluido folicular e

células da granulosa e investigar sua possível relação com a qualidade embrionária.

Objetivos específicos:

Quantificar individualmente no fluído folicular de bovinos as moléculas de colesterol,

estradiol, glicose e piruvato.

Quantificar nas células da granulosa os transcritos referentes aos genes FSH-R,

CYP19, EGF-R, AT1 e AT2.

Relacionar os dados obtidos com os índices de produção e cinética de

desenvolvimento embrionário.

16

3. Metodologia

3.1. Local dos experimentos

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Biologia Celular e Molecular

do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC.

3.2. Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos

3.2.1. Coleta e maturação in vitro de oócitos

Os oócitos foram coletados de ovários obtidos em abatedouro comercial por aspiração

folicular com auxílio de um capilar de vidro acoplado a um cateter. Na seleção dos ovários,

tomou-se cuidado para que todos possuíssem corpo lúteo em sua morfologia. Foram

selecionados cinco ovários para cada placa de MIV (ovário 1, ovário 2, ovário 3, ovário 4,

ovário 5) e de cada ovário foram aspirados separadamente cinco folículos de 7-8mm. Evitou-

se a aspiração de folículos de tamanho distintos para que as possíveis alterações encontradas

não fossem relativas ao estágio de desenvolvimento do folículo. Após aspiração de cada

folículo, o oócito foi recuperado e lavado individualmente três vezes no meio de lavagem (M-

199 com HEPES - 90%, Soro fetal bovino – 10%, piruvato – 0,2mM, Gentamicina –

1,25ug/mL) e três vezes no meio de maturação (M-199 sem HEPES - 90%, Soro fetal bovino

– 10%, piruvato – 0,2mM, Gentamicina – 1,25ug/mL, FSH (Foltropin) 0,25ug/mL, hCG

(Chorulon) – 25UI, estradiol (Sigma) – 10ug/mL), sendo em seguida colocados para MIV em

uma gota de 50ul do meio de maturação, sob óleo mineral contendo cinco poços, onde cada

oócito foi acomodado dentro do poço que foi identificado de acordo com o folículo em que

foi aspirado. A identificação dos poços foi realizada conforme o mapa de localização (fig.3).

A maturação foi realizada em incubadora a 38,5oC; 5% de CO2 em ar e alta umidade

por 24horas. O fluido folicular retirado de cada folículo foi depositado em tubo de 0,2mL e

centrifugado à 1000 g por 5 minutos para separação do fluido folicular e das células

foliculares, sendo que o fluido folicular e as células da granulosa foram então transferidos

para tubos distintos devidamente identificado. O fluido folicular e as células foram

congelados em freezer a -80°C até o momento da análise.

17

Figura 3: Esquema representativo do mapa de localização dos oócitos em uma placa de MIV. Cada placa de

MIV contém cinco gotas de meio de maturação. Em cada gota foram feitos cinco poços e em cada

poço foi alocado um oócito proveniente de um folículo pré identificado. O liquido folicular referente a

este oócito foi congelado até o momento da análise.

3.2.2. Fecundação e cultivo in vitro

Para a fecundação in vitro, palhetas de sêmen de, no mínimo, dois touros diferentes

foram descongeladas em banho-maria a 37ºC, durante 30 segundos e seu conteúdo

centrifugado em gradiente Percoll (45% e 90%) para separar os espermatozóides móveis,

remoção do diluidor e do plasma seminal, além da separação de células não espermáticas. O

sobrenadante foi descartado, e feita avaliação da motilidade e concentração espermática por

microscopia ótica e os espermatozoides vivos foram diluídos na concentração de 1x106

espermatozoides/mL.

Os oócitos maturados foram fecundados in vitro nas mesmas gotas/poços da

maturação. Para isso, o meio de maturação foi lavado e substituído por 50µl do meio FIV

gota. Para a inseminação, 2uL do sêmen preparado foram adicionados em cada gota,

permanecendo em atmosfera com 5% de CO2 em ar, 38,5°C e alta umidade por 18 horas.

Após este período, os embriões foram desnudados com auxílio de micropipeta e retornaram

aos poços para cultivo em meio SOF acrescido de 5% de SFB, aminoácidos essenciais e não

essenciais, em estufa a 38,5oC, 5% de CO2 em ar e alta umidade onde permaneceram até o

momento das análises.

18

3.3. Análise da produção e morfocinética embrionária

Para análise da morfocinética embrionária foi utilizada uma lupa binocular para

avaliar a clivagem dos prováveis embriões que foram classificados em grupos. Para a

determinação dos grupos a clivagem embrionária foi avaliada 22 horas após o início da CIV

(40hpi). Neste momento, embriões clivados com quatro ou mais células foram considerados

pertencentes ao grupo de rápidos (CLR) e embriões clivados com duas ou três células foram

considerados pertencentes ao grupo de lentos (CLL). CLR corresponde aos grupos ()Esta

classificação é usada de rotina pelo nosso grupo levando a geração de embriões que se

desenvolvem diferencialmente e apresentam características metabólicas e moleculares

distintas. Após 168 horas do início do CIV (186hpi - dia 7) os embriões que permaneceram no

cultivo foram novamente avaliados. Aqueles que estavam no estádio de blastocisto ou

posterior foram classificados como blastocistos rápidos (BLR - derivados do grupo de

clivagem rápida) e blastocistos lentos (BLL - derivados do grupo de clivagem lenta). Para as

análises estatísticas os grupos foram renomeados conforme o esquema a seguir:

3.4. Análise dos componentes do fluido folicular

Os componentes do fluido folicular: glicose, colesterol, piruvato e estradiol foram

analisados utilizando kits comerciais baseados em reações enzimáticas com detecção

realizada por fluorimetria. Na tabela 1 encontram-se as especificações para cada um dos kits,

bem como a empresa fabricante:

19

Tabela 1: Moléculas que foram avaliadas neste projeto e sistema de avaliação

Molécula Sistema Fabricante

Glicose AmplexRed Glucose Life Technologies

Colesterol Total Cholesterol Assay Kit BioAssay Systems

Piruvato EnzyChrom™ Pyruvate Assay BioAssay Systems

Estradiol Estradiol EIA Cayman Chemical

A padronização dos kits de avaliação bioquímica foi realizada previamente a análise

das amostras. Para isso, uma amostra de um pool de fluidos foliculares foi usada como

referência para determinação da sensibilidade da avaliação e dos pontos da curva padrão.

Essas amostras foram diluídas até o limite mínimo de detecção de cada kit visando o uso do

menor volume possível de cada amostra, permitindo seu uso no maior número de avaliações

possível. As curvas padrão foram obtidas de uma regressão polinomial até que R2 fosse igual

ou muito próximo a 1. Para cada kit, então, a curva padrão e a diluição das amostras foram

aplicadas conforme tabela 2:

Tabela 2: Dados utilizados na padronização dos kits de quantificação das moléculas que

foram avaliadas.

Molécula N° de Pontos na

Curva Padrão Pontos da Curva Padrão Diluição R

2

Glicose 6 1µM, 2,5µM, 5µM, 10µM,

15µM e 20µM 50x 1

Colesterol 6 2µM, 4µM, 8µM, 16µM,

32µM e 64µM 50x 0,999

Piruvato 5 10µM, 20µM, 30µM, 40µM

e 50µM 10x 0,999

Estradiol 8

6,6pg, 16,4pg, 41pg,

102,4pg, 256pg, 640pg,

1600pg e 4000pg

10x 0,988

20

3.5. Análise de expressão gênica das células da granulosa

Para esta análise foram utilizados pools de células foliculares, onde cada pool foi

referente a dois folículos cujo desenvolvimento embrionário posterior havia sido o mesmo.

Foram avaliadas quatro amostras biológicas de cada grupo analisado e duas replicatas

técnicas.

O RNA total das células da granulosa foi extraído com o auxílio do RNaspin Protect

Mini Kit RNA Isolation® (GE Healthcare UK Limited), seguindo instruções do fabricante e

quantificado pelo sistema NanoDrop. Resumidamente, as células foram descongeladas e

incubadas com tampão de estabilização para RNA e posteriormente com solução de lise. A

solução foi acrescida de Etanol e aplicada à coluna contendo membrana para separação do

RNA. Contaminantes foram removidos por sucessivas centrifugações com solução de

lavagem e o RNA eluído da membrana. As amostras foram imediatamente submetidas à

quantificação do RNA total pelo sistema NanoDrop® e congeladas em freezer a -80ºC até a

análise.

Do RNA total obtido foi utilizado 8µL em que foi adicionado 1µL de oligo dT e a

mistura incubada por 65°C por 5 minutos e resfriada no gelo por 1 minuto. Para a reação de

síntese da primeira fita de cDNA foi adicionada 2 µL de 10x RT Buffer,4 µL de 25mM

MgCl2, 2 µL de 0,1M de DTT, 1 µL de RNase Out e 1 µL de SuperScript III RT®

(Invitrogen). Essa reação aconteceu por 50 minutos a 50°C que foi seguida de reação terminal

por 5 minutos a 85°C . Em seguida, para remoção do RNA foi adicionado 1 µL de RNase H a

37°C por 20 minutos. Os cDNAs foram submetidos a reação de PCR em tempo real pelo

sistema TaqMan® (Life Technologies, Inc.) que permitiu a amplificação dos genes candidatos

FSH-R, CYP19, EGF-R, AT1 e AT2 e o controle endógeno, beta-actina. Todas as reações

foram realizadas em 20µL de volume total e 40 ciclos. Os sistemas (primer + sonda) usados

foram adquiridos já padronizados para espécie bovina. O desenho dos primers e das sondas

podem se encontrados no site do fabricante (www.lifetechnologies.com).

http://www.lifetechnologies.com)/

21

Tabela 3: Genes avaliados e seus respectivos códigos no fabricante e no GenBank.

Gene COD (Life Technologies, Inc.) GENE ID RefSeq

FSH-R Bt03212674_m1 281172 NM_174061.1

CYP19A Bt03213774_m1 281740 NM_174305.1

EGF-R AJT96D7 * NC_007310.5

AT1 Bt03213473_m1 281607 NM_174233.2

AT2 AIY9Z3D * NW_001502154.2

ACTB Bt03279174_g1 280979 NM_173979.3

*Primers + Sondas foram customizados para espécie bovina. Foi utilizado o software File Builder para fazer os

desenhos dos primers que foram sintetizados pela Life Tecnologies,Inc.

3.6. Análise estatística

Foram realizadas seis manipulações para coleta de dados de desenvolvimento e

morfocinética embrionária que resultaram em um n= 266 folículos derivados de 6 replicatas.

Dados dos componentes do fluido folicular e expressão gênica foram avaliados

retrospectivamente aos dados de desenvolvimento embrionário sendo considerados os

seguintes grupos e análises:

1a análise – NCL x CL

2a análise – CLR x CLL

3a análise – NBL x BL

4a análise – CLNBL x CLBL

5a análise – BLR x BLL

Os dados de desenvolvimento embrionário (índice de clivagem, blastocisto e

cinética) foram analisados pelo software GraphPad Prism 5.0 com o teste Mann-Whitney. Os

índices de clivagem total, clivagem de embriões rápidos e embriões lentos foram calculados

sobre o número total de oócitos. O índice de blastocisto total foi calculado sobre o número de

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_174061.1


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/355477181?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WRF69FS8014


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/355475663?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WRDRG39G014

22

oócitos clivados. O de blastocistos rápidos e lentos sobre o número de clivados rápidos e

lentos, respectivamente.

Os dados de quantificação das moléculas do fluido folicular foram analisados pelo

programa SAS System for Windows (SAS, 2000). Através do aplicativo Guided Data

Analisys, os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos (distribuição normal) e

homogeneidade das variâncias. Os casos que não obedeciam a estas premissas foram

transformados (logaritmo na base 10 - Log10X; Raiz quadrada - RQ X; Quadrado - X2). Foram

realizados testes para saber se os dados eram paramétricos ou não paramétricos. Os dados não

paramétricos foram convertidos a paramétricos e foi realizado o teste t de Student. Para

descrição dos resultados, foram empregadas as médias, seus respectivos erros-padrão. Os

níveis de significância (p) utilizados foram dos dados originais, quando obedecerem às

premissas, dos dados transformados, quando necessária à transformação. As variáveis

resposta foram submetidas aos testes de correlação de Pearson e o nível de significância

utilizado para rejeitar foi de 5%, isto é, para um nível de significância menor que 0,05,

considerou-se que ocorreram diferenças estatísticas entre os diferentes grupos. Esta análise é

uma medida que varia no intervalo de -1 até +1 que visa quantificar o grau de relacionamento

linear entre variáveis quantitativas. Os valores próximos de +1 indicam forte correlação direta

entre as variáveis enquanto os valores próximos de -1 indica forte correlação inversa e valores

em torno de zero indicam ausência de correlação. Todos os resultados foram expressos em

média e erro padrão.

A análise estatística da diferença de expressão dos genes nas diferentes fases

analisadas foi avaliada mediante a estimativa da eficiência de amplificação após a submissão

dos dados ao software REST2005 (Pfaffl et al., 2005) e a variação da expressão. As reações

foram normalizadas pela frequência de expressão do controle endógeno utilizado que foi o

ACTB (delta Ct). Uma amostra aleatória foi escolhida como normalizador para determinação

do delta delta Ct. Foi realizado teste t , para dados amostrais não paramétricos o teste Kruskal-

Wallis. Para as análises foi considerado o valor de p< 0.05.

23

4. Resultados

4.1. Desenvolvimento embrionário

Na figura 4A é apresentado o índice de clivagem dos embriões rápidos e lentos e clivagem

total. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL, sendo que o índice de clivagem

total foi de 50.9±0.94% (p<0.05). Na figura 4B são apresentados os dados de índice de

Blastocistos (rápidos e lentos e blastocistos totais) e em 4C são apresentados os índices de

blastocistos rápidos e lentos calculados sobre os oócitos clivados dos seus respectivos grupos.

É possível evidenciar uma maior conversão a blastocisto dos embriões derivados de CLBLR

quando comparado com CLBLL (p<0,05).

Figura 4: Produção embrionária A) Índice de clivagem total (CLT) e clivados rápidos (CLR) e lentos (CLL), B)

Índice de blastocistos do grupo rápido (BLR), grupo lento (BLL) e blastocistos totais (BLT) em

relação aos oócito clivados totais e C) Índice de blastocistos em relação aos embriões clivados por

grupo – CLBLR – blastocistos rápidos/ CLBLL blastocistos lentos. (barras representam média de

erros baseados nas manipulações)

4.2. Análise dos componentes do fluido folicular

As aferições das concentrações de glicose, colesterol, piruvato e estradiol foram realizadas

individualmente para cada folículo e seguem descritas.

24

Quantificação da Glicose no Fluido Folicular

Os resultados das avaliações das concentrações de glicose no fluido folicular das

amostras estão representados na Figura 5. Em BL, houve maior concentração de glicose em

relação aos NBL (médias±SE BL=0,0656±0,0131mM; NBL=0,0504±0,0095mM, p=0,0652).

Nos outros grupos analisados a concentração de glicose não diferenciou.

Figura 5: Concentração de glicose referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e



Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos.** Indica grupo com tendência a ter maior concentração.

Quantificação Colesterol no Fluido Folicular

Os resultados das avaliações das concentrações de colesterol no fluido folicular das

amostras estão representados na Figura 6. A Figura 6C mostra que houve maior concentração

de colesterol no grupo de BL em relação ao NBL (médias±SE BL 1,657±0,099mM; NBL

25

1,437±0,051mM; p=0,048). O mesmo ocorreu no grupo de CLBL em relação ao CLNB

(médias±SE CLBL 1,657±0,099mM; CLNBL 1,443±0,066mM; p=0,035), dados mostrados

na Figura 6D. Nos outros grupos analisados não houve diferença na concentração de

colesterol.

Figura 6: Concentração de colesterol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados (NCL) e

Clivados (CL), B) Clivados Rápidos (CLR) e Clivados Lentos (CLL), C) Não Blastocistos (NBL) e

Blastocistos (BL), D) Clivados Não Blastocistos (CLNBL) e Clivados Blastocistos (CLBL) e E)

Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito.

Quantificação de Piruvato no Fluido Folicular

Os resultados das avaliações das concentrações de piruvato no fluido folicular das

amostras estão representados na Figura 7. No grupo BL houve maior concentração de

26

piruvato em relação ao grupo de NBL (médias±SE BL 0,351±0,026mM; NBL

0,289±0,0183mM; p=0,050), Figura 7C. No grupo CLBL houve tendência deste metabólito

ter maior concentração em relação ao grupo CLNBL (médias±SE CLBL 0,351±0,026mM;

CLNBL 0,291±0,022mM; p=0,072), dados apresentados na Figura 7D. Entre os outros grupos

analisados, a concentração de piruvato não se diferenciou.

Figura 7: Concentração de piruvato referente ao fluido folicular que derivaram:: A) Não Clivados(NCL) e



Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do

metabólito.**Indica grupo com tendência a ter maior concentração do metabólito.

Quantificação de Estradiol no Fluido Folicular

Os resultados das avaliações das concentrações de estradiol no fluido folicular das

amostras estão representados na Figura 8. O grupo CLR apresentou maior concentração de

estradiol em relação ao grupo CLL (médias±SE CLR 1836±343pg/mL; CLL 1072±322

pg/mL; p=0,041) (Figura 8B). Concentração de estradiol também foi maior no grupo BLR em

relação ao grupo BLL (médias±SE BLR 1920±405 pg/mL; BLL 594±63 pg/mL; p=0,005).

27

Em relação aos outros grupos analisados não houve diferença na concentração deste

metabólito.

Figura 8: Concentração de estradiol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e



Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito

4.3. Análise da expressão gênica das células da granulosa

Neste experimento, primeiramente foi realizada a amplificação do transcrito referente

ao receptor de IGF-II, um marcador específico de células teca e ausente nas células da

granulosa (Armstrong et al., 2000). De fato, o transcrito estava ausente em todas as amostras.

Do mesmo modo, não foi evidenciada amplificação do transcrito para AT1.

Os resultados da quantificação dos transcritos para FSH-R, CYP19A, AT2 e EGF-R

nas células da granulosa estão apresentados em termos da expressão relativa observada.

28

Receptor de FSH

Os resultados das expressões relativas de FSH-R em relação ao controle endógeno (β-

actina) nas células da granulosa estão representados na Figura 9. A expressão de FSH-R nas

células da granulosa referentes ao grupo NCL foi maior em relação ao grupo CL (médias±SE

NCL 5,26±0,49; CL 2,24±0,20; p=0,009), o mesmo ocorreu com o grupo NBL onde a

expressão foi maior em relação ao grupo BL (médias±SE NBL 3,59±0,31; BL 1,66±0,23;

p=0,023) (Figura 9C). No grupo CLNBL a expressão de FSH-R foi maior em relação ao

grupo CLBL (médias±SE CLNBL 2,78±0,30; CLBL 1,66±0,23; p=0,005) (Figura 9D) e no

grupo BLL a expressão também foi maior em relação a BLR (médias±SE BLL 2,73±0,40;

BLR 1,00±0,11; p=0,004) (Figura 9E).

Figura 9: Expressão relativa do gene FSHR em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não clivados

(NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e

blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E)

blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.

29

CYP19A - codificador de P450arom

Os resultados das expressões relativas do gene codificador de aromatase (P450arom)

em relação ao controle endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 10. A

expressão de CYP19A nas células da granulosa referentes ao grupo BL foi maior em relação

ao grupo NBL (médias±SE NBL 1,49±0,11; BL 2,08±0,22; p=0,024) (Figura 10C). Foi

encontrada também maior expressão no grupo CLBL em relação ao CLNBL (médias±SE

CLNBL 1,40±0,16; CLBL 2,53±0,27; p=0,0008) (Figura 10D) e maior expressão em BLL em

relação ao BLR (médias±SE BLR 1,53±0,22; BLL 4,04±0,31; p<0,0001)(Figura 10E). Não

houve diferença na expressão entre os outros grupos analisados.

Figura 10: Expressão relativa do gene CYP19A em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não

clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos

(NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E)

blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.

30

Receptor de AngII AT2

Os resultados das expressões relativas do receptor de angiotensina II tipo2 (AT2) em

relação ao controle endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 11. A

expressão de AT2 nas células da granulosa referente ao grupo CLR foi maior em relação ao

grupo CLL (médias±SE CLR 34.74±6,00; CLL 4,94±0,46; p=0,003) (Figura 11B). Foi maior

a expressão relativa no grupo de CLBL em relação à CLNBL (médias±SE CLNBL 2,78±0,30;

CLBL 21,74±5,61; p=0,0023) (Figura 11D) e maior em BLR em relação a BLL (médias±SE

BLR 34.52±8,57; BLL 4,70±0,70; p=0,0035). No restante dos grupos analisados não houve

diferença na quantificação relativa.

Figura 11: Expressão relativa de RNAm para receptores de angiotensina II do tipo 2 (AT2) em células da

granulosa que derivaram os grupos: : A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos

CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não

blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos

lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.

31

Receptor de EGF

Os resultados das expressões relativas do receptor de EGF em relação ao controle

endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 12. No grupo de CLBL foi

encontrada maior expressão relativa em relação à CLNBL (médias±SE CLNBL 1,40±0,16;

CLBL 2,08±0,22; p=0,0169) (Figura 12D). A expressão relativa também foi maior no grupo

de BLL em relação à BLR (médias±SE BLR 1,64±0,17; BLL 2,53±0,38; p=0,0488) (Figura

12E). Não houve diferença na expressão relativa nos outros grupos analisados.

Figura 12: Expressão relativa de RNAm para receptores de EGF em células da granulosa que derivaram os

grupos: A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL),

C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados



32

4.4. Correlação entre moléculas do fluido folicular

Nas tabelas 4 a 13 são representados os resultados de correlação encontrados entre as

moléculas do fluido folicular referentes às estruturas analisadas, consideramos significativo

p≤ 0.05.

Na tabela 4, estão os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido

folicular de onde derivaram as estruturas que não clivaram. Foi observada correlação negativa

entre glicose e piruvato.

Tabela 4: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram

embriões Não Clivados.

Colesterol

P

Glicose Piruvato Estradiol

0.08398

0.7325

0.06369

0.8288

0.50899

0.4910

Glicose

P

-0.63384

0.0112

0.63286

0.2518

Piruvato

P

0.29932

0.6247

Em relação os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular

das estruturas que clivaram (Tabela 5), foram observados correlações positivas entre glicose e

colesterol, e também entre piruvato e estradiol.

33


embriões Clivados.

Colesterol

p


0.29093

0.0187

-0.17395

0.1763

-0.16397

0.3541

Glicose

p

0.13054

0.3201

0.03403

0.8533

Piruvato

p

0.38418

0.0249

Nos resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular de clivados

rápidos (Tabela 6), clivados blastocistos (Tabela 9) e blastocistos rápidos (Tabela 11) foi

observada correlação positiva entre piruvato e estradiol.


Clivados Rápidos

Colesterol

p


0.22361

0.1772

-0.24036

0.1643

-0.18151

0.4438

Glicose

p

0.10333

0.5547

0.17374

0.4638

Piruvato

p

0.64631

0.0021

Semelhante o que ocorreu com clivados, houve correlação positivas ente glicose e

colesterol nos fluidos foliculares que derivaram clivados lentos (Tabela 7) e clivados não

blastocistos (Tabela 8).

34


Clivados Lentos

Colesterol

p


0.41719

0.0304

-0.14621

0.4668

0.08170

0.7813

Glicose

p

0.16665

0.4259

-0.21036

0.5117

Piruvato

p

0.27645

0.3387


Não Blastocistos

Colesterol

p


0.32974

0.0140

-0.14373

0.3245

-0.16706

0.5076

Glicose

p

-0.07973

0.5942

0.04693

0.8580

Piruvato

p

0.29425

0.6247

35


Blastocistos

Colesterol

p


-0.05858

0.7628

-0.29739

0.1319

-0.11889

0.6176

Glicose

p

0.06384

0.7469

-0.03714

0.8765

Piruvato

p

0.44308

0.0504


Clivados não Blastocistos

Colesterol

p


0.43312

0.0083

-0.20353

0.2409

-0.26331

0.3630

Glicose

p

0.11288

0.5385

0.04262

0.8954

Piruvato

p

0.28435

0.3245

36


Clivados Blastocistos

Colesterol

p


-0.05858

0.7628

-0.29739

0.1319

-0.11889

0.6176

Glicose

p

0.06384

0.7469

-0.03714

0.8765

Piruvato

p

0.44308

0.0504

Para os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular de

blastocistos lentos (Tabela 11), foi observada correlação negativa entre glicose e estradiol.


Blastocistos Lentos

Colesterol

p


0.09651

0.8049

-0.44601

0.2289

-0.03373

0.9368

Glicose

p

0.03745

0.9238

-0.71440

0.0465

Piruvato

p

0.25496

0.5423

37


Blastocistos Rápidos

Colesterol

p


-0.10925

0.6466

-0.26632

0.2854

-0.01758

0.9568

Glicose

p

0.08584

0.7268

0.12629

0.6957

Piruvato

p

0.70300

0.0108

38

5. Discussão

Durante o crescimento folicular, a concentração de metabólitos, enzimas, hormônios e

a capacidade de as células responderem aos estímulos causados por eles são fatores

importantes para o desenvolvimento normal do folículo e consequentemente produção de um

oócito melhor preparado para ser fecundado e suportar as primeiras clivagens até a ativação

do genoma embrionário (FERREIRA ET AL., 2008). Assim, é possível supor que o fluido

folicular e as células foliculares influenciam diretamente a qualidade do oócito e

consequentemente o futuro embrião.

Neste trabalho, foram avaliados individualmente metabólitos presentes no FF e

transcritos presentes nas CGs e sua relação com potencial dos oócitos derivados destes

folículos de clivarem, desenvolverem-se a blastocisto e sua cinética de desenvolvimento. O

índice de clivagem total deste experimento foi de 50.9±0.94%. Não houve diferença entre os

índices de clivagem de embriões rápidos e lentos. Da mesma forma, nenhum dos metabólitos

e transcritos analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do

FSHR, que foi menos expresso em CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e

CLNBL, respectivamente.

O FSH é responsável por estimular o crescimento folicular, a proliferação e

diferenciação das células da granulosa e induzir a formação do antro (SARAIVA ET AL.,

2010). Essa interação do FSH com FSH-R ativam vias de sinalizações intracelulares

essenciais para proliferação das células da granulosa e consequentemente maior produção de

estrógenos. Em teoria, os oócitos derivados de folículos com maior quantidade destes

transcritos estariam sintetizando um maior número de receptores, estando melhores

preparados para concluir sua maturação. De fato, em estudos realizados em mulheres com

diferentes respostas a estimulação por gonadotrofinas, foi demonstrado por CAI ET AL.

(2007) que houve uma menor expressão de FSH-R nas células da granulosa de folículos

antrais que possuíam menor concentração de estradiol no FF, oócitos com menores taxas de

maturação e consequente fertilidade reduzida. Nesse mesmo estudo, foi visto que os FFs

originados desses folículos possuíam maior concentração de FSH. Esse aumento na

concentração de FSH folicular poderia estimular por feedback positivo a expressão de RNAm

para FSH-R para que esse folículo conseguisse responder ao FSH. No caso deste trabalho, em

39

que maior quantidade de transcritos foi encontrada em CGs de oócitos que não se

converteram a blastocisto, é possível sugerir que o aumento da expressão RNAm para FSH-R

seja uma tentativa do folículo com menor quantidade de FSH no FF maximizar sua resposta

ao hormônio.

O índice de BL total foi de 27,3±3,9% e maior índice de blastocisto foi obtido no

grupo derivado de CLR do que CLL (25,1±3,8% e 19,2±3,8%, respectivamente). BL e CLBL

apresentaram maiores níveis de piruvato no FF e BL ainda apresentou maiores níveis de

glicose quando comparados aos seus respectivos NBL e CLNBL. De fato, substratos

energéticos são essenciais para o adequado desenvolvimento do folículo e capacitação do

gameta. A capacidade do oócito de utilizar a glicose como metabólito energético, no entanto,

é pequena. As células da granulosa metabolizam a maior parte da glicose consumida para

fornecer intermediários metabólicos para o oócito (BIGGERS ET AL. 1967). O intermediário

mais comumente transferido para o oócito é o piruvato, que chega a célula via junções do tipo

gap (SUTTON-MCDOWALL ET AL. 2010; WANG ET AL. 2012). Este piruvato

transportado ao oócito é essencial para o desenvolvimento pós-fecundação, em especial na

transposição da fase de ativação do genoma embrionário (JOHNSON ET AL., 2007). Dessa

forma, a maior conversão a blastocistos nos grupos com maiores níveis de glicose e piruvato

se devem, provavelmente, ao maior aporte energético transferido ao oócito.

Além do efeito direto das concentrações de piruvato no oócito, essa molécula tem

efeito no próprio metabolismo das células da granulosa. A produção de piruvato pelas células

da granulosa ocorre pela via glicolítica, e este metabólito pode ser adicionalmente

metabolizado através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), seguido pela fosforilação

oxidativa para produção de energia na forma de ATP. A ativação do receptor de FSH pela

ação de seu ligante promove a conversão do ATP em AMPc/ PKA que age no núcleo,

estimulando a síntese de CYP19A (LUO & WILTBANK, 2006). Corroborando com este

dado, CL e CLBL também apresentaram maior síntese de CYP19A, além de aumento da

quantidade de colesterol no FF quando comparados a NCL e CLNBL.

Por ser um precursor da síntese de andrógenos e estrógenos no ovário, a concentração

de colesterol disponível no FF pode ser um fator limitante da esteroidogênese

(MONTFOORT ET AL., 2014). O colesterol presente no fluido folicular é transportado para

dentro da mitocôndria das células foliculares pela proteína StAR, onde se localizam a maioria

das enzimas envolvidas na esteroidogênese (AIRES, 2008). O colesterol folicular chega às

40

células da teca interna e lá encontra todo o aparato celular necessário para sua conversão em

androstenediona. A androstenediona, por sua vez, é transportada para as células da granulosa,

onde depende da ação da P450arom, produto de CYP19A, para sua conversão final a

estrogênio (AIRES, 2008). Em bovinos, o estrogênio desempenha funções fundamentais ao

desenvolvimento final do folículo pré-ovulatório estimulando a liberação do pulso pré-

ovulatório de LH, que causa a ovulação (BINELLI ET AL., 2009). Assim, maiores

concentrações de colesterol em folículos com maior conversão a blastocisto podem sugerir

uma maior capacidade esteroidogênica que, já na fase de crescimento, conferiram ao oócito

maior competência.

Reiterando a maior capacidade esteroidogênica dos folículos de CLBL, maiores níveis

de EGF-R e ANGII também foram encontrados. O EGF é um importante regulador da

esteroidogênese ovariana, pois medeiam StAR (JAMNONGJIT ET AL. 2005), fundamental

para o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria. No caso das células da

granulosa, o aumento do transporte de colesterol para a mitocôndria é um indicativo duma

maior síntese de progesterona, uma vez que as células da granulosa não apresentam a

maquinaria necessária para a conversão de colesterol a androgênios, precursores dos

estrogênios (HILLIER ET AL., 1994). Apesar disso, a maior atividade de StAR nas células da

granulosa aumenta a expressão de EGF-R devido a uma sinalização de modificação pós-

traducional, a fosforilação (JAMNONGJIT ET AL. 2005). O EGF-R, por sua vez, estimula a

proliferação das células da granulosa, aumenta o diâmetro folicular, promove o aumento dos

oócitos e regula a expressão da conexina 43, essencial para o estabelecimento das junções gap

(MORBECK ET AL., 1993; MAO ET AL., 2004; SILVA ET AL., 2004; BOLAMBA ET

AL., 2002; KENNEDY ET AL., 2003). Além disso, o EGF age controlando a expressão de

receptores para FSH e LH, essenciais para a síntese de CYP19A na granulosa (LUCIANO ET

AL., 1994; HATTORI ET AL., 1995).

O aumento de AT2 nestes folículos também indica uma maior atividade

esteroidogênica. BERISHA ET AL., (2002) relataram um aumento da síntese de AT2 em

folículos altamente estrogênicos. Essa alta atividade se dá pela ação de AT2 em estimular a

síntese de transcritos de CYP19A (GONÇALVES ET AL., 2010). Além da atividade de

síntese destes estrogênios, AngII, via AT2, tem importante ação na formação do antro,

proliferação celular e, em especial, secreção de esteroides (SHUTTELEWORTH ET AL.,

2002). Dessa forma, com base nos dados de folículos que deram origem a BL e CLBL, é

41

possível sugerir que os mesmos não só apresentavam uma maior capacidade de síntese de

esteroidogênica, mas também uma maior capacidade de secretar estas moléculas para o

ambiente extracelular, formado pelo antro folicular.

Em relação à cinética de desenvolvimento, CG de onde derivaram BLR apresentaram

maiores níveis de estrógeno no FF e maior síntese de AT2, mas diminuição de CYP19A e

EGF-R quando comparados aos níveis de BLL. Estes dados sugerem que embriões de

desenvolvimento rápido derivam de folículos cuja capacidade esteroidogênica está mais

voltada a secreção do estrógeno para o antro, enquanto BLL estaria mais direcionado a

conversão da androstenediona a estrogênio, mantendo ainda altos níveis do seu precursor

(colesterol) no fluido folicular.

Nas análises de correlações entre as moléculas no fluido folicular e os grupos

analisados, nos FFs que derivaram os grupos de CL, CLR, BL, CLBL e BLR foi encontrada

correlação positiva entre piruvato e estradiol. Como o piruvato é um precursor energético de

mais rápido acesso para geração de energia (DOWNS ET AL., 2002), e como para a síntese

de estradiol o folículo requer ATP para conversão a AMPc/PKA estimulando a síntese de

CYP19A (JAMNONGJIT ET AL. 2005), a concentração de piruvato possibilita que haja um

estoque energético essencial para a síntese de estradiol pelas células foliculares. Isso permite

que esses folículos possam gerar oócitos mais aptos a se desenvolverem a blastocistos caso

haja a fecundação.

42

6. Conclusão

Com base nos resultados do presente estudo podemos concluir que folículos que

derivaram blastocistos (BL e CLBL) apresentam maior atividade esteroidogênica, o que

confere ao oócito maior potencial de desenvolvimento a blastocisto. Em relação à cinética de

desenvolvimento, os resultados sugerem que embriões de desenvolvimento rápido se

desenvolvem a partir de folículos com maior atividade secretora de estrogênio para o

ambiente folicular, enquanto que embriões de desenvolvimento lento parecem derivar de

folículos com incremento da síntese de estrogênios.

43

7. Referências

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52

ANEXO

Meios para maturação in vitro – MIV

Meio de lavagem MIV (Pré-MIV)

Reagente Fabricante Catálogo Volume

M-199 com HEPES Gibco 12380-028 4,5 ml

Soro Fetal Bovino 10% Gibco 16140-014 0,5 ml

Pyruvato 0,2mM Sigma P-4562 10 l

Gentamicina 50g/ml Sigma G-1264 25 l

Filtrar em 0,22 m

Meio de maturação in vitro


M-199 com BICARBONATO Gibco 11150-026 4,5 ml

Soro Fetal Bovino 10% Gibco 16140-014 0,5 ml

Piruvato 0,2mM Sigma P-4562 10 l


FSH 0,5g/ml Bioniche Folltropin-V 5 l

hCG 7UI/ml Intervet Chorulon 50 l

Filtrar em 0,22 m

Estradiol 1g/ml Sigma E-4389 5 l

53

Soluções estoques e meio para FIV

Soluções estoque para FIV (Parrish et al., 1988)

Reagente

Fabricante

Catálogo

TALP STOCK (50 ml)

TALP SÊMEN (50 ml)

NaCl Sigma S-5886 0,3330g 0,2910g

KCl Sigma P-5405 0,0120g 0,0115g

MgCl2 Sigma M-2393 0,0050g 0,0040g

NaH2PO4 Sigma S-0876 0,00205g 0,00175g

NaHCO3 Sigma S-8875 0,1050g 0,1050g

CaCl2H2O Sigma C-5670 0,0150g 0,015g

Ác.Lactico syr. Sigma L-7900 71,5 l 155 l

Hepes Sigma H-0891 ********** 0,1190g

pH = 7,4 OSM=295 – 300

Filtrar em 0,22µm

Solução de Gentamicina

Aliquotar e manter a -20 C.

Reagentes Fabricante Catálogo 100ml

Sulfato de

Gentamicina

Sigma G-1264 50mg

Solução fisiológica 100ml

54

Solução de Piruvato


Ácido Pirúvico Sigma P-3662 22mg

Água Destilada 10ml

Aliquotar e manter a -20 C.

Solução pH 4.0

Reagente Fabricante Catálogo 50ml

Na Lactato Sigma L-7900 165mg

Na metabisulfito Sigma S-1516 0,050g

Água Milli-Q (q.s.p) 50ml

pH = 4,0

Componentes da solução PHE

Reagente Fabricante Catálogo

Penicilamina 2M Sigma P-40-3 3mg/10ml salina 0,9%

Hipotaurina 1M Sigma H-1384 1,09mg/10ml salina 0,9%

Epinefrina 0,25M Sigma 21,930-4 1,83mg/40ml sol. pH 4,0

55

Solução PHE


Penicilamina Sigma P-40-3 2,5ml

Hipotaurina Sigma H-1384 2,5ml

Epinefrina Sigma 21,930-4 2ml

Solução salina 0,9% 4ml

Meio FIV


TL – Stock 10 ml

BSA – Livre de Ácidos Graxos Sigma A-7511 0,060 g

Piruvato 0,2mM Sigma P-4562 20 l


Filtrar em 0,22 m

Meio FIV gotas


Meio – FIV 3.640 ml

Heparina 140usp/mg Sigma H-9399 40 l

PHE 160 l

Filtrar em 0,22 m

56

PERCOLL

90%

Percoll 3,6mL

Solução 10X 0,4mL

CaCl2 2H2O 1M (0,7350g/5mL de água Milli Q) 8L

MgCl2 6H2O 0,1M (0,1015g/5mL de água Milli Q) 15,6L

Ácido Lático (Lactado de Na) 14,8L

NaHCO3 0,0084g

Para fazer o Percoll 45%, diluir 1mL de Percoll 90% em 1mL de TL sêmen.

PERCOLZINHO

90%

Percoll 0,9mL

Solução 10X 0,1mL

CaCl2 2H2O 1M (0,7350g/5mL de água Milli Q) 2L

MgCl2 6H2O 0,1M (0,1015g/5mL de água Milli Q) 3,9L

Ácido Lático (Lactado de Na) 3,7L

NaHCO3 0,0021g

Para fazer o Percoll 45%, diluir 300ul de Percoll 90% em 300ul de TL sêmen.

57

Meio para cultivo (SOFaa)

Solução SOFaa estoque


NaCl Sigma S-5886 0,6294g

KCl Sigma P-5405 0,0534g

KH2PO4 Sigma P-5655 0,0162g

NaHCO3 Sigma S-5761 0,2106g

Na Lactato Sigma L-7900 0,0370g

Ácido Pirúvico Sigma P-3662 0,0034g

L-glutamina Sigma G-8540 0,0146g

MgCl2 7H2O Sigma M-2393 0,0098g

CaCl2 Sigma C-5670 0,0252g

Filtrar em 0,22 m

Meio SOFaa (Uso)


Meio SOF estoque 4,6ml

Aminoácidos essenciais Sigma M-5550 0,100ml

Aminoácidos não essenciais

Sigma M-7145 0,050ml

Soro Fetal Bovino Gibco 16140-014 0,250ml

Preparar na hora do uso

Glaucia Pereira Alves - Pós-Graduação...

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