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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

LGN 5799 LGN 5799 -- SEMINÁRIOS EM GENÉTICA SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTASE MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Programa de PósPrograma de Pós--Graduação em Graduação em

Genética e Melhoramento de PlantasGenética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Aline Silva Romão

Orientador: Dr. Welington Luiz de Araújo

Aline Silva RomãoAline Silva Romão

Orientador: Dr. Welington Luiz de AraújoOrientador: Dr. Welington Luiz de Araújo

FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS MOLECULARES DE INFECÇÃO E ESTABELECIMENTO NA PLANTA

FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS MOLECULARES DE INFECÇÃO E MOLECULARES DE INFECÇÃO E ESTABELECIMENTO NA PLANTAESTABELECIMENTO NA PLANTA

Doenças Fúngicas em Plantas

Carvão

Ustilago maydis

Carvão

Ustilago maydis

Ferrugem

Puccinia sorghi

Ferrugem

Puccinia sorghi

Mofo Branco

Sclerotina sclerotiorum

Mofo Branco

Sclerotina sclerotiorum

Antracnose

Colletotrichum lindemuthianum

Antracnose


“Rice blast”

Magnaporthe grisea

“Rice blast”

Magnaporthe grisea

Ferrugem Asiática

Phakopsora pachyrhizi

Ferrugem Asiática

Phakopsora pachyrhizi

AmbienteSusceptibilidade do hospedeiro

Patogenicidade

Doença

Componentes da Interação Fungo-Planta

Fungo-Planta

Interações Genéticas

Interações Abióticas

Luz, água, nutrientes, fogo, CO2

Interações Bióticas

Competidores, micróbios, herbívoros, patógenos, inimigos naturais

modificado de Müller & Krauss, 2005

van Baarlen et al., 2006

Batalha - Fungo vs. Planta

FUNGOFUNGO PLANTAPLANTA

Mecanismos de Ataque – FUNGO


Reguladores de crescimento

Enzimascutinasespectinases celulaseshemicelulaseslignolíticas

ToxinasToxinasvictorina (Cochliobolus victoriae)tentoxina (Alternaria spp.)toxina HC (Cochliobolus carbonum)toxina AM (A. alternata f. sp. mali)

giberelinaácido indol acético (AIA)citocininas

DetoxificaçãofitoalexinasfitoanticipinasROS

Mecanismos de Defesa – PLANTA


Pós-infeccional

barreiras histológicas

deposição de calose e lignina

hipersensibilidade (HR)

quitinases, glicanases, proteases

fitoalexinas

ROS

detoxificação

mudanças no metabolismo

Pré-infeccionalcutícula e parede celular substâncias inibitóriasausência de nutrientes requeridos pelo fungopHpressão osmótica e efeitos de permeabilidade

disseminação

colonização

penetração

germinação

reprodução

adesão

Processo de Infecção

Sexton & Howllet, 2006

Adesão

• Contato hidrofóbico

• Matriz extracelular

- adesinas

- lectinas

- enzimas

• Interações iônicas

Enzimas (esterases, cutinases) presentes na mucilagem que cobre

esporos de Colletotrichum sp., Blumeria graminis, Uromyces viciae-

fabae e Erysiphe graminis alteram a superfície da planta produzindo

superfície com diferentes propriedades adesivas.

Breno Leite et al., 2001

Composição do material adesivo de fungos fitopatogênicos

Breno Leite et al., 2001


Germinação• Reconhecimento da superfície do hospedeiro

- hidrofobicidade

- dureza superfície

- componentes químicos

- propriedades topográficas

• Componentes sinalizadores (MAPk, proteínas G, histidina kinases) regulam germinação

Respostas tigmotrópicas direcionam tubos germinativos em superfícies foliares,

permitindo que patógenos reconheçam aberturas estomatais.

Macroconídios de Nectria haematococca (patógeno de ervilha) germinam em

resposta à adição de flavonóides.

Foster et al., 2003


PenetraçãoPassiva

- aberturas naturais

- ferimentos

Ex. ferrugens

Sheng et al., 2003Silva et al. 2006 Silva et al. 2006

Penetração

Ativa

- estrutura especializada (apressório)

- processo químico (degradação enzimática)

APRESSÓRIO

Estrutura especializada na penetração mecânica em tecidos

vegetais

Foster et al., 2003 Latijnhouwers et al., 2003


Ferreira & Monteiro, 2006

Apressório

↑↑ melaninamelanina na parede na parede

COMO?

↑↑ pressão de pressão de turgorturgor

PENETRAÇÃOPENETRAÇÃO

altas concentrações altas concentrações de glicerolde glicerol

↓↓ porosidade porosidade

Uromyces viciae-fabae

Magnaporthe grisea

Colletotrichum lindemuthiarum

Mendgen & Deising, 1993

Em M. grisea foi encontrada pressão de turgor de 8,0 MPa (pressão comum em pneus carro ~0,2 MPa)

(Howard et al., 1991).


Apressório


Melanina

• Pigmento escuro de alto peso molecular

• Formada a partir da polimerização oxidativa de compostos fenólicos

e indólicos

GENES

• PKS1, SCD1, THR1 – identificados em M. grisea e Colletotrichum

lagenarium

• Envolvidos na melanização do apressório

• C. lagenarium – genes sob regulação transcricional e pós-trascricional

Hidrofobinas

• Pequenas proteínas secretadas por fungos que se ligam à interfaces

hidrofóbicas/hidrofílicas

• Envolvidas na adesão dos fungos na superfície das plantas

� Gene hidrofobina – MPG1; MHP1

� Genes regulatórios de MPG1 – NPR1, NPR2, NPR3

� Gene proteína de membrana – PTH11

� Gene acropetal – ACR1

� Genes MAPk – PMK1; MPS1

GENES - M. grisea

Apressório



Degradação Enzimática

ENZIMAS ENZIMAS cutinasescutinases, pectinases, , pectinases, celulasescelulases, , xilanasesxilanases, ,

proteinases, proteinases, glicanasesglicanases, , ligninasesligninases..

•• PenetraçãoPenetração –– degradação de cutícula e parede celulardegradação de cutícula e parede celular

•• AdesãoAdesão

•• Diferenciação de hifas dentro do hospedeiroDiferenciação de hifas dentro do hospedeiro

•• Degradação de hifas velhas ou do inimigoDegradação de hifas velhas ou do inimigo

PRINCIPAIS FUNÇÕES



(www.euita.upv.es)

Cutícula CutinasesCutinases GenesF. solani f.sp. pisi – CUTA, CUT1, CUT2, CUT3

A. Brassicicola – CUTAB1



A presença de AMP cíclico e a fosforilação de fatores de transcrição parecem ter grande importância na regulação da expressão dos genes de cutinases(Kolattukudy et al., 1995).

A. brassicicola

- cutinases com expressão constitutiva

- cutinases induzidas por monômeros de cutina

* Mudança: crescimento parasítico para saprofítico *

McCann et al., 1990

membrana plasmática

parede primária

lamela média

pectina na lamela média

pectina

celulose

hemicelulose


Parede Celular Parede Celular Enzimas degradadoras da parede celular (CWDE)

Degradação Enzimática - CWDE

PectinasesPectinases


� Alternaria citri – Acpg1

� Botrytis cinerea – Bcpg1

� Colletotrichum gloeosporioides – pelB

� Colletotrichum lindemuthianum – CLPG1, CLPG2

� Nectria haematococca – pelA, pelD

• Importante papel na patogenicidade e virulência de vários fungos:

• Têm sido descritas como as primeiras enzimas extracelulares

produzidas pelos fungos durante o processo de infecção

Fusarium solani f. sp. pisi - mutantes duplos para os genes pelA ou pelD

têm a patogênese severamente comprometida no nível de penetração.

Famílias gênicas

endopoligalacturonases, pectina liases, pectinesterases


PectinasesPectinases


• A ação de endopoligalacturonases (EPGs) dá origem a formação de oligogalacturonídeos (OGAs)

• OGAs são rapidamente convertidos em fragmentos menores e biologicamente inativos pelas EPGs

O tratamento de folhas de videira com OGAs aumenta a proteção

contra Botrytis cinerea e induz respostas de defesa na planta:

• rápida geração de H2O2

• expressão diferencial de 9 genes relacionados com defesa

• estímulo da atividade de quitinases e β-1,3-glicanases

Aziz et al., 2004


CelulasesCelulases


celobioidrolases, endoglicanases, β-glicosidases

Trichoderma reesei - swolenina (SWOI) => capaz de quebrar as fibras de

celulose sem atividade hidrolítica.

• Têm sido isoladas de fungos patogênicos:

� Macrophomina phaseolina – egl1, egl2

� Fusarium oxysporum – Kfam1, Bfam1, Cfam1, Cfam2, Ffam1

� Cochliobolus carbonum – CEL1

Foi proposto que M. phaseolina utiliza uma forma de endo-β-1,4-glicanase

para patogenicidade e a outra para saprofitismo (Wang & Jones, 1995).


LigninasesLigninases


lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacases

•• Madeira atacadaMadeira atacada – torna-se encharcada, esponjosa, quebradiça e descolorida

• Têm grande importância em fungos que atacam madeira

• Maioria dos patógenos de madeira são Basidiomicetos

�“brown rot”- fungos degradam celulose e hemicelulose

� “white rot”- fungos degradam celulose e lignina

Fusarium solani f. sp. glycines (patógeno de soja) – produção de

ligninases tem papel importante no processo de infecção e colonização

do tecido hospedeiro


Colonização

Lidando com o Hospedeiro

• Reconhecimento – elicitores/supressores, genes Avr;

• Resposta ao ambiente hospedeiro – neutralizar mecanismos

de defesa da planta;

• Nutrição – transformar constituintes do citoplasma em

substâncias que possam ser absorvidas;

• Ataque – produção de toxinas e hormônios vegetais.

Reconhecimento do Hospedeiro


ElicitoresElicitores ligam-se a receptores específicos do hospedeiro e

desencadeiam resposta de defesa

• Gerais – compostos da parede celular fúngica (exógeno),

oligogalacturonatos (endógeno);

• Específicos – determinam espectro de hospedeiro do patógeno.

• Produzem necrose e desencadeiam SAR em tabaco e outras solanáceas e

também em cultivares de Raphanus sativus e Brassica campestris;

• Parecem ser elicitores genêro-específicos em solanáceas e cultivar-específicos

em brássicas;

• P. parasitica em tomate – família gênica (par A1).

Phytophthora spp. – elicitinas


SupressoresSupressores reprimem a resposta de defesa do hospedeiro


• Mecanismos de ação – hipóteses

� interferência na ligação do elicitor com receptor do hospedeiro;

� interferência na transdução de sinais;

� interferência na ativação gênica;

� interferência nos fatores de defesa da planta.

Mycosphaerella pinodes (patógeno de ervilha) – suprescinas A e B

• Suprescina B – inibe H+ATPase da membrana plasmática.


Genes de Genes de AvirulênciaAvirulência


• Modelo de relação gene-a-gene

�Flor (1956): demonstrou a complementariedade dos sistemas

gênicos do hospedeiro e do patógeno (linho-Melampsora lini)

FUNGOFUNGO

DOENÇA RESISTÊNCIA

• Determinam especificidade de hospedeiro: em nível de cultivar

em nível de espécie

Quando a planta possui gene de resistência R que corresponde ao

gene Avr do patógeno

Incompatibilidade Incompatibilidade

Modelo interação Rhynchosporium secalis (NIP1) – cevada (Rrs1)

Interação compatívelInteração compatível

Interação incompatívelInteração incompatível

Knogge, 1996

Melampsora lini

Peronospora parasitica Blumeria graminisCladosporium fulvum

Phytophthora sojae

M. grisea

Skamniot & Ridout, 2005

� Cladosporium fulvum – Avr2, Avr4, Avr4E, Avr49

� Rhynchosporium secalis – NIP1

� Fusarium oxysporum – SIX1

� Magnaporthe grisea – Avr-Pita, Avr-CO39, PWL1, PWL2, PWL4, ACE1, AvrPil5

� Phytophthora infestans – inf1, Avr3a, Avr3b, Avr10, Avr11

� Phytophthora sojae – Avr1b-1

� Hyaloperonospora parasitica – ATR13, ATR1NdWsB

� Melampsora lini – AvrL567, AvrM, AvrP123, AvrP4

� Blumeria graminis f. sp. hordei – Avr-a10, Avr-k1

� Família gênica PWL (M. grisea) – confere avirulência espécie-específica:

PWL1 – arroz

PWL2 – milheto

PWL4 – “weeping lovegrass”

Genes Avr



Genes Avr

• Análises moleculares mostraram que alelos Avr não-funcionais

originaram-se a partir de deleções ou mutações na ORF ou no

promotor do gene Avr;

• Deleções no gene Avr permitem que o fungo escape do

reconhecimento por plantas resistentes.

O que leva os patógenos a manter os genes Avr no curso da evolução?

Genes Avr


• Produtos AVR são substâncias necessárias ao patógeno:

� função “housekeeping”

� fatores de virulência

� enzimas degradadoras de substratos do hospedeiro

� toxinas

� supressores

• Ação como ELICITORES – ocorre devido à evolução de

mecanismos no hospedeiro que conseguem detectar e assim

responder à ação do patógeno.

• Quitina é o maior componente estrutural da parede celular dos fungos

• Avr4

� Fator de avirulência que induz resposta de hipersensibilidade em plantas Cf-4

� Lectina contendo domínio de ligação à quitina (CBM14)

� Interação Avr4 com quitina é específica pois ele não interage com outrospolissacarídeos da parede celular

Avr4 se liga à quitina da paredecelular dos fungos (C. fulvum, Trichoderma viride e Fusariumsolani f. sp. phaseoli) e protegecontra a ação das quitinases

liberadas pela planta

Função dos Produtos dos Genes Avr

� Avr2 (Cladosporium fulvum) – inibe a ação de proteases presentes no

apoplasto do hospedeiro;

� NIP1 (Rhynchosporium secalis) – toxina;

� Avr3a (Phytophthora infestans) – inibe resposta necrótica em Nicotiana;

� Avr-a10 e Avr-k1 (Blumeria graminis) – penetração do haustório;

� Avr-Pita (Magnaporthe grisea) – é uma metaloprotease (?);


Resposta ao Ambiente Hospedeiro

núcleo

H2O2

H2O2

H2O2

O2-

O2-

O2-

RESPOSTA FitoanticipinasFitoanticipinasFitoalexinasFitoalexinasROSROS

núcleo

Célula vegetalCélula vegetal

FungoFungo



FITOANTICIPINAS

FITOALEXINAS

Resposta do Fungo:Resposta do Fungo:

A) Degradação enzimática

B) Exclusão

C) Alteração do alvo da toxina

Vanetten et al., 2001



DETOXIFICAÇÃO - FITOANTICIPINAS

Avenacina A-1

Gaeumannomyces graminis var. avenae produz avenacinase

• Saponinas

• αααα-tomatina

• Glisosídeos cianogênicos

• Glicosinolatos

• Cianeto

Septoria lycopercisi produz tomatinase

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici degrada α-tomatina em tomatidina e lycotetraose (inibem HR)

Avenacina A-1 – em Gaeumannomyces graminis var. avenae a interrupção do

gene responsável pela produção de avenacinase impediu o ataque dos mutantes

em plantas de aveia, entretanto, não interferiu no ataque à plantas de trigo, um

hospedeiro que não produz avenacina A-1 .



DETOXIFICAÇÃO - FITOALEXINAS

• Pisatina (ervilha) - Nectria haematoccoca produz pisatina demetilase

� Gene PDA1

� Cluster PEP1, PEP2, PEP5

• Maakiaina (grão-de-bico) - Nectria haematoccoca -> MAK1

• Brassinina (crucíferas) - Sclerotinia sclerotiorum -> glucosil transferase induzível

• Sakuranetina (arroz) – Magnaporthe grisea -> ABC1 (cassete de ligação a ATP

do transportador ABC) é essencial para o efluxo da fitoalexina



ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO - ROS

Aguirre et al., 2005

Função de defesa na Planta

• sinalização

• atividade antimicrobiana

• biossíntese de metabólitosantimicrobianos

Causam danos no DNA, proteínas, lipídios e outros componentes celulares

• Enzimas- superóxido dismutase (SOD)- peroxidases- glutationa peroxidases- peroxiredoxinas- catalases

• Compostos não enzimáticos - glutationa- tioredoxinas- melanina- manitol- prolina- ácido oxálico

Aguirre et al., 2005



DETOXIFICAÇÃO - ROS


Nutrição

HAUSTÓRIO

Estrutura especializada na obtenção de nutrientes das células do hospedeiro sem provocar a morte celular


Mendgen & Hahn, 2002

Remanescentes de apressórioCOMO?

Células mãe do haustório

Hifas intercelulares

Hifa intracelular

Haustório


NutriçãoGENES - HAUSTÓRIO

Latijnhouwers et al., 2003

Latijnhouwers et al., 2003

• Blumeria graminis f. sp. hordei

� Genes para início da formação haustório – BIG1, BIG2, BIG3

• Uromyces fabae

� Gene biossíntese de tiamina – THI1, THI2 (~5% mRNA haustório)

� Gene de transportador de hexose – HXT1 (na membrana

plasmática haustorial)

� Transportador de aminoácidos – AAT1, AAT2, AAT3, PIG2

Papel central no metabolismo primário e importação de nutrientes

Importação de nutrientes (hipótese) – H+ATPases geram um gradiente de prótons na membrana plasmática haustorial, gerando energia para obtenção de nutrientes

Azinheira, 2005


Mecanismos de Ataque HORMÔNIOS

Fitopatógenos são capazes de produzir as principais classes de hormônios vegetais

• Giberelina

• Auxina

• Citocinina

• Giberelina

• Auxina

• Citocinina

Promovem divisão celular

Giberelina (GA3)

Gibberella fujikuroi

mais estudado

• Síntese é controlada por um cluster gênico

Crinipellis perniciosa – Vassoura-de-bruxa em cacaueiros

CITOCININA

• Fungo promove aumento nas quantidades de citocinina

• Alteração do balanço citocinina/auxina

• Indução de brotações laterais e formação de ramos

CITOCININA

• Fungo promove aumento nas quantidades de citocinina

• Alteração do balanço citocinina/auxina

• Indução de brotações laterais e formação de ramos

ETILENO

• Também relacionado à indução de sintomas

ETILENO

• Também relacionado à indução de sintomas


HORMÔNIOS


Mecanismos de Ataque

TOXINAS

• Metabólitos secundários de baixo peso molecular

• Interrompem processos bioquímicos => provocam morte celularprovocam morte celular

NãoNão--específicasespecíficas => causam danos em células de plantas hospedeiras

e não-hospedeiras

EspecíficasEspecíficas (HSTs) => determinam espectro de hospedeiro e

patogenicidade do fungo

• Genes são específicos

• Locos complexos


TOXINAS NÃO ESPECÍFICAS

• Possuem efeitos fitotóxicos relativamente suaves

• Afetam um grande espectro de espécies de plantas

• Não são essenciais para estabelecimento da doença

Fusicoccina (Fusicoccum amygdali) - afeta via de sinalização levando à

estimulação da H+ATPase através da regulação proteína kinase/atividade fosfatase.

Alternaria spp.

� Brefeldina A – provoca desmonte do complexo de Golgi e age como inibidor da secreção

� Curvularina – inibidor da divisão celular

� Ácido tenuazônico – inibe síntese de proteínas

� Zinniol – afeta permeabilidade da membrana

� Tentoxina – inibidor da fotofosforilação através da ligação específica à ATP sintase do cloroplasto


TOXINAS HOSPEDEIRO-ESPECÍFICAS (HST)

� PLANTAS – resistência/susceptibilidade => controlados por 1 gene

� FUNGOS – produção => controlada por vários genes

• Possuem efeitos fitotóxicos severos

• Afetam um pequeno número de espécies de plantas

• São indispensáveis para estabelecimento da doença

Gêneros mais produtores - Cochliobolus e Alternaria

Cochliobolus

� C. carbonum (raça 1) – toxina HC (tetrapeptídeo cíclico)

� C. Heterostrophus (raça T) – toxina T

� C. victoriae - victorina


TOXINAS HOSPEDEIRO ESPECÍFICAS (HST)

Markham & Hille, 2001

Alternaria

A. alternata f. sp. kikuchiana – toxina AK

A. alternata f. sp. mali – toxina AM

A. alternata f. sp. fragariae – toxina AF

A. alternata f.sp. citri tangerine – toxina ACT


Reprodução

• Hospedeiro: pH, disponibilidade de nutrientes

• Ambiente: luz, umidade

• Fungo: fatores genéticos

indução de vias regulatórias

Enzimas hidrolíticas – necessárias para disponibilização de nutrientes a

partir do tecido da planta

Hidrofobinas – necessárias para dispersão e sobrevivência

� Cladosporium fulvum – 5 genes de hidrofobina são superexpressos

durante a esporulação

� HCf-1: papel na dispersão dos conídios via água

Muitos ascomicetos sofrem meiose nos últimos estágios da doença, produzindo estruturas de resistência

Esporulação depende:

• Plantas geneticamente modificadas;

• Desenvolvimento de novas estratégias de controle;

• Desenvolvimento de marcadores moleculares para

monitoramento preciso da progressão da doença.

Considerações Finais

COMPREENSÃO DA INTERAÇÃO PATÓGENO-PLANTA

OBRIGADA PELA ATENÇÃO!OBRIGADA PELA ATENÇÃO!

Banco de dados Pathogen Host Interactions: http://www.phi-base.org

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