Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor MAYSA DE SOUZA CAMPOS Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas tratadas com terapia por vibração Ribeirão Preto 2016
Transcript of Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao...
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor
MAYSA DE SOUZA CAMPOS
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas tratadas
com terapia por vibração
Ribeirão Preto
2016
MAYSA DE SOUZA CAMPOS
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas tratadas
com terapia por vibração
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho
Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências Médicas.
Área de concentração: Reabilitação do Aparelho Locomotor
Orientadora: Dra. Ariane Zamarioli
Ribeirão Preto
2016
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Campos, Maysa de Souza
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em
ratas diabéticas tratadas com terapia por vibração, 2016.
107 f.: Il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Reabilitação.
Orientadora: Zamarioli, Ariane.
1. Diabetes mellitus. 2. Fratura óssea. 3. Calo ósseo. 4.
Terapia por vibração.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maysa de Souza Campos
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas tratadas com
terapia por vibração
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Médicas.
Área de concentração: Reabilitação do Aparelho Locomotor
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________________________
Dedicatória
A Deus,
A Deus, por ter guiado nesta trajetória e possibilitou chegar até
aqui. Agradeço pela sua misericórdia, compaixão, graça e amor
que estão sempre presentes, sustentando-me nos momentos mais
difíceis.
Aos meus pais,
Joaquim e Maria José, presentes em todos os momentos de
minha vida, meu porto seguro, minha fonte inesgotável de
fortaleza, a quem devo tudo que sou.
Ao meu irmão,
Mateus, pelo amor e amizade que nos une.
Aos meus avós,
Hamilton e Alzira, que com amor, carinho e dedicação, sempre
me apoiaram em todas as etapas da minha vida.
Dedico este trabalho
Agradecimentos
À Dra. Ariane Zamarioli, pela orientação que me propiciou o conhecimento necessário para o
desenvolvimento deste estudo, além da contribuição para meu crescimento pessoal, acadêmico e
científico. Muito obrigada pela receptividade, pela paciência, as acuradas leituras, os acertados
comentários e inúmeras sugestões feitas durante o desenvolvimento da pesquisa e a escrita da
dissertação e do artigo.
Ao Prof. Dr. José Batista Volpon, chefe do Laboratório de Bioengenharia da FMRP-USP e co-
orientador desta Tese de Mestrado, pela disponibilidade do laboratório, pela contribuição direta
e indireta no enriquecimento deste estudo e por todo o conhecimento oferecido, tanto no âmbito
pessoal, como profissional, durante o período de convivência no laboratório. Muito obrigada por
transmitir parte de seu conhecimento e experiência, além da confiança depositada em mim
durante todos esses anos.
Ao Prof. Dr. Manoel Damião de Sousa Neto, pela disponibilidade do Laboratório de
Morfologia do Departamento de Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto (FORP-USP) para realização das análises microtomográficas e à Pós-Graduanda
Graziela Bianchi Leoni pelo auxílio durante as análises.
Ao Prof. Dr. José Francisco Albuquerque de Paula do Laboratório de Metabolismo e
Endocrinologia da FMRP-USP, pelo auxílio na execução e escolha dos kits ELISA de
marcadores bioquímicos de formação e reabsorção óssea e à técnica Marta Nakao pelo auxílio
na execução das dosagens e análises dos kits.
À Prof. Raquel Assed Bezerra Segato pela disponibilidade do Laboratório de Histologia do
Departamento de Clínica Infantil da FORP e aos técnicos Marco Antônio, Nilza Letícia e
Fátima Aparecida, pelo auxílio na confecção das lâminas histológicas, que não mediram
esforços e sempre tão solícitos desde o início até o fim das análises histológicas. Muito
obrigada!
Aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia: Carlos Alberto Moro, Ismar Ribeiro,
Luiz Henrique Alves Pereira, Maria Teresinha de Morais, Reginaldo Trevilatto Silva pelo
auxílio e disponibilidade para a conclusão desta dissertação de mestrado.
À secretária do Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho
Locomotor da FMRP-USP Rita de Cássia S. Cossalter, pela atenção e orientação prestadas
desde o início até a conclusão do mestrado. Obrigada pelo zelo e preocupação em informar
todas as etapas da defesa e entrega de documentos.
À amiga Ana Paula Franttini, que me auxiliou durante a execução dos meus experimentos,
pela paciência, zelo e companheirismo, serei sempre grata pela sua ajuda.
Às alunas de pós-graduação e amigas de laboratório Ana Paula Franttini, Larissa Azevedo,
Mariana Butezloff, Patrícia Sena, Iara Botega, Patrícia San Gregório, Beatriz Trani e, ao
técnico do Laboratório de Bioengenharia responsável pelo Biotério Francisco Carlos
Mazzocato, pelo auxílio na realização dos experimentos e pelo constante apoio. Sem vocês este
trabalho jamais teria sido concluído.
Ao amigo Felipe D'Aloia, pelo auxílio gráfico para a confecção da capa desta dissertação e para
a formatação das figuras.
Às minhas amigas Bruna Soares, Marina Devicaro e Rafaela Andrião pelo companheirismo,
apoio e incentivo durante toda fase do mestrado.
À FAPESP e à CAPES, pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de mestrado.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Resumo
RESUMO
CAMPOS, M.S. Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas
diabéticas tratadas com terapia por vibração. 2016. 107 f. Dissertação (Mestrado) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,
2016
A diabetes mellitus é uma doença sistêmica que afeta o metabolismo como um todo e
pode interferir de maneira significativa na saúde do indivíduo. Sabe-se que a diabetes
pode causar atraso na consolidação óssea e alterar a qualidade do tecido ósseo. A terapia
por vibração é um método terapêutico com potencial para acelerar e melhorar a
consolidação óssea pós-fratura. Neste estudo, a qualidade do tecido e do calo ósseo dos
fêmures foi analisada em ratas normais e diabéticas, tratadas pela terapia por vibração.
Foram utilizadas 150 ratas Wistar, aleatoriamente divididas em 5 grupos experimentais:
(1) CON+FRAT: ratas normais submetidas à fratura óssea; (2) DM: ratas diabéticas; (3)
DM+FRAT: ratas diabéticas submetidas à fratura óssea; (4) CON+FRAT+TV: ratas
normais submetidas à fratura óssea e tratadas com terapia por vibração; (5)
DM+FRAT+TV: ratas diabéticas submetidas à fratura óssea e tratadas com terapia por
vibração. Para avaliação do calo ósseo todos os grupos foram divididos em 2 subgrupos
(n=15/subgrupo), de acordo com o período de acompanhamento pós-fratura: 14 e 28
dias, correspondente às fases de calo mole e calo duro, respectivamente. A diabetes foi
induzida por meio de aplicação única de estreptozotocina. A fratura foi causada na
diáfise do fêmur pelo método fechado e fixada por implante ortopédico intramedular. A
terapia por vibração foi iniciada 3 dias após a realização da fratura experimental, com
frequência de 50 Hz, três vezes por semana, por 20 minutos. Ao término do período
experimental, os ossos foram submetidos às análises macroscópia, microtomografia
computadorizada (avaliação qualitativa e quantitativa da microestrutura óssea),
densitometria óssea (DXA), microscopia óptica (caracterização dos tecidos) e
bioquímica para avaliar os níveis de formação e reabsorção óssea. O nível de
significância estatística foi de 5%. Com base nos resultados obtidos foi possível
observar que a diabetes resulta em deterioração significativa da microarquitetura óssea,
com redução expressiva na densidade óssea e remodelação. Além disso, foi possível
constatar que esses efeitos estão diretamente relacionados e dependentes do tempo de
exposição à diabetes e ao controle glicêmico, ou seja, quanto maior o nível glicêmico,
pior será a qualidade do tecido e do calo ósseo. Concluiu-se que a diabetes causou
efeitos prejudiciais na qualidade do tecido ósseo intacto e na consolidação óssea após
fratura. No entanto, a terapia por vibração mostrou-se eficaz em amenizar
significativamente as deteriorações causadas tanto no osso intacto como no calo ósseo,
mas não melhorou a cicatrização da fratura em ratos do grupo controle. O estímulo
mecânico não apenas melhorou a qualidade do calo ósseo, mas também restaurou
parcialmente os níveis séricos de IGF-1 e RANK, induzindo a formação e mineralização
óssea, criando condições para o adequado reparo da fratura.
Palavras-chave: Diabetes mellitus, fratura óssea, calo ósseo, terapia por vibração.
Abstract
ABSTRACT
CAMPOS, M.S. Vibration therapy as an effective approach to improve and
accelerate bone healing in diabetic rats. 2016. 107 s. Dissertation (Master) – School
of Medicine of Ribeirão Preto - University of São Paulo, Brazil, 2016.
A total of 150 female Wistar rats were assigned to five groups: (1) CON+FRAT: control
rats submitted to bone fracture; (2) DM: diabetic rats; (3) DM+FRAT: diabetic rats
submitted to bone fracture; (4) CON+FRAT+TV: control rats submitted to bone fracture
and treated with vibration therapy; (5) DM+FRAT+TV: diabetic rats submitted to bone
fracture and treated with vibration therapy. Diabetes was induced with a single
intravenous injection of streptozotocin. Thirty days after diabetes induction, animals
underwent bone fracture at the right mid-femur, followed by surgical stabilization of
bone fragments. Three days after bone fracture, rats began vibration therapy (VT). On
days 14 and 28 post-fracture, the rats were euthanized, blood was collected for serum
bone marker analysis, and the femurs were collected for macroscopic analysis, dual-
energy X-ray absorptiometry (DXA), micro-computed tomography (μCT), histological
analysis and biochemistry to evaluate levels of bone formation and resorption. The level
of statistical significance was 5%. Based on the results obtained, it was possible to
observe that diabetes results in significant deterioration of the bone microarchitecture,
with significant reduction in bone density and remodeling. In addition, it was possible to
verify that these effects are directly related and dependent on the time of exposure to
diabetes and glycemic control, that is, the higher the glycemic level, the worse the
quality of the tissue and the callus. It was concluded that diabetes caused detrimental
effects on the quality of intact bone tissue and on bone healing after fracture. However,
vibration therapy proved to be effective in significantly alleviating deteriorations in both
intact bone and bone callus, but did not improve fracture healing in rats in the control
group. The mechanical stimulus not only improved bone callus quality, but also
partially restored serum IGF-1 and RANK levels, inducing bone formation and
mineralization, creating conditions for adequate fracture repair.
Key words: Diabetes mellitus, fracture healing, vibration, bony callus.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Acompanhamento dos animais: Dia -3 (chegada e alojamento dos animais);
Dia 0 (indução de diabetes por meio da administração de estreptozotocina ou placebo
por meio da aplicação de solução de citrato); Dia 30 (fratura óssea); Dia 33 (início da
terapia por vibração); Dia 44 ou 58 (eutanásia de acordo com o subgrupo experimental
em análise).......................................................................................................................41
Figura 2. Figura esquemática da alavanca inter-resistente confeccionada no laboratório
que foi utilizada para produzir a fratura fechada do terço médio dos fêmures direitos dos
animais.............................................................................................................................43
Figura 3. Aspectos cirúrgicos da exposição e fixação da fratura. (A) Incisão lateral na
coxa direita com visualização da fratura. (B) Aspecto da fratura após fixação
intramedular. (C) Radiografia em perfil do membro posterior direito realizada após
fratura mostrando o alinhamento adequado dos fragmentos e a fixação intramedular
com fio de Kirschner.......................................................................................................44
Figura 4. Figura da plataforma vibratória confeccionada no laboratório de
Bioengenharia da FMRP utilizada na terapia por vibração.............................................45
Figura 5. Imagem radiográfica obtida imediatamente após a fratura e sua redução com
fio de Kirschner intramedular para confirmar a adequação e redução da fratura (A:
perfil; B: ântero-posterior)...............................................................................................45
Figura 6. Posicionamento dos ossos na plataforma do densitômetro..............................47
Figura 7. Análise densitométrica dos fêmures para avaliação da DMO, CMO e área do
calo...................................................................................................................................47
Figura 8. Ilustração de cegueira causada pela diabetes...................................................53
Figura 9. Gráfico representando a evolução da massa corpórea dos animais durante o
período experimental. Não foi observada diferença estatística entre a massa corpórea
dos animais no início dos experimentos, dia 0 (A). Embora todos os animais tenham
apresentado ganho de massa corpórea durante o seguimento longitudinal do estudo (B=
30 dias; C= 44; D= 58 dias após indução de diabetes/placebo), esse ganho foi superior
(e tempo-dependente) nos animais do grupo controle que nos animais
diabéticos.........................................................................................................................54
Figura 10. Gráfico de dispersão correlacionando massa corpórea e nível de glicemia nos
dias 30 (A), 44 (B) e 58 (C) após indução de diabetes ou placebo. É possível observar
que quanto maior o nível de glicemia, menor a massa corpórea do
animal..............................................................................................................................55
Figura 11. Comparação da densidade mineral óssea (DMO) e do conteúdo mineral óssea
(CMO) entre os grupos. O período de 58 dias de diabetes resultou valores
significativamente inferiores de DMO e CMO em comparação aos animais controle. A
presença de asterisco indica diferença estatística (p<0,05).............................................58
Figura 12. Comparação da DMO, CMO e área do calo ósseo entre os grupos. A diabetes
reduziu tanto a densidade (DMO e CMO) como a área do calo ósseo neoformado no
período de 14 das após a fratura óssea. No período de 28 dias após a fratura a DMO e o
CMO persistiram reduzidos nos animais diabéticos em comparação aos controles. A
terapia por vibração foi eficaz em aumentar o CMO e a área do calo ósseo dos animais
diabéticos tratados. A presença de asterisco indica diferença estatística (p<0,05).........58
Figura 13. Microarquitetura trabecular da metáfise femoral mostrando redução
expressiva de tecido trabecular nos ratos diabéticos não tratados (DM+FRAT) em
comparação com animais controle (CON+FRAT), tanto no período de 44 como 58 dias
pós-indução. No período de 58 dias após indução de diabetes, a terapia por vibração foi
eficaz em minimizar as alterações deletérias decorrentes da hiperglicemia. No entanto, a
terapia por vibração exerceu efeito negativo na microarquitetura trabecular dos ossos
dos animais controle........................................................................................................60
Figura 14. Análise quantitativa da microarquitetura óssea trabecular. A diabetes resultou
em deterioração dos parâmetros quantitativos referentes à microestrutura trabecular,
sendo mais expressiva no período de 58 dias (tempo-dependente). Embora a terapia por
vibração tenha exercido efeito positivo na microarquitetura trabecular dos animais
diabéticos, ela resultou em efeito negativo nos ossos de ratos controle tratados. Os
asteriscos indicam diferença estatística significativa (p<0,05).......................................60
Figura 15. Microarquitetura cortical da diáfise femoral mostrando redução de tecido
cortical nos ratos diabéticos não tratados (DM+FRAT) em comparação com animais
controle (CON+FRAT). Diferente do tecido trabecular, as alterações na microestrutura
do osso cortical não foram amenizadas pela terapia por vibração (DM+FRAT+TV)....60
Figura 16. Análise quantitativa da microestrutura do osso cortical. Diferente do
observado no tecido trabecular, a diabetes não alterou a microarquitetura cortical na
mesma magnitude que afetou as rabéculas ósseas. Além disso, a terapia por vibração
exerceu efeito negativo no córtex de ratos diabéticos e controle. Os asteriscos indicam
diferença estatística significativa (p<0,05)......................................................................60
Figura 17. Imagens do calo ósseo obtidas pelo µCT, tanto no plano sagital, como
transversal. No período de 14 dias após a fratura, a diabetes (DMO) induziu redução da
neoformação óssea, com calo ósseo de menor volume e mineralização que nos grupos
controle. Embora a terapia por vibração tenha se mostrado parcialmente eficaz em
aumentar o volume do calo ósseo nos animais diabéticos, ela reduziu o volume do calo
nos animais controle........................................................................................................61
Figura 18. Análise quantitativa da microestrutura do calo ósseo. A diabetes reduziu o
volume e a mineralização do calo ósseo. A terapia por vibração parece ter exercido
efeito positivo em aumentar o volume e mineralização do calo ósseo de animais
diabéticos, mas não nos animais controle. Os asteriscos indicam diferença estatística
significativa (p<0,05).......................................................................................................61
Figura 19. Lâminas histológicas de fêmures fraturados corados com HE em ampliações
de 12,5; 50 e 200x. A diabetes induziu atraso na proliferação e diferenciação celular
durante a cicatrização da fratura. Aos 14 dias pós-fratura, os ratos controle apresentaram
calo ósseo formado por trabéculas, enquanto os ratos diabéticos apenas apresentavam
tecido conjuntivo. O atraso persistiu na fase posterior da cicatrização (28 dias pós-
fratura), em que os ratos controle apresentavam trabéculas compactadas formando calo
ósseo maduro, e os ratos diabéticos apenas apresentavam trabéculas finas e espaçadas.
A terapia por vibração acelerou a diferenciação celular durante a cicatrização de fraturas
em ratos diabéticos em ambos os estágios, mas não provocou alterações na cicatrização
óssea normal....................................................................................................................62
Figura 20. Lâminas histológicas de fêmures fraturados coradas com solução Picro-
Sirius, com ampliação de 12,5x. A deposição de colágeno nos calos ósseos de ratos
diabéticos foi significativamente menor que nos ratos controle. A terapia por vibração
aumentou a deposição de colágeno em calos ósseos de ratos diabéticos, mas não em
ratos não diabéticos.........................................................................................................63
Figura 21. Lâminas histológicas de fêmures fraturados coradas com solução TRAP, com
ampliação de 12,5x. A diabetes induziu aumento na atividade osteoclástica 14 dias após
a fratura e a reduziu no período de 28 dias. A terapia de vibração aumentou a atividade
osteoclástica nos calos ósseos de ratos diabéticos 28 dias pós-fratura...........................63
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Medidas macroscópicas dos fêmures esquerdos (intactos): massa,
comprimento e perímetros (diáfise e metáfise distal). As letras indicam diferenças
significativas (p<0,05).....................................................................................................57
Tabela 2. Medidas macroscópicas dos fêmures direitos (com fratura óssea): massa,
comprimento e perímetros (diáfise e metáfise distal)......................................................57
Tabela 3. Níveis séricos de IGF-1, RANK e CTX-I. A diabetes induziu redução
expressiva no nível sérico de IGF-1 (formação óssea), mas foi parcialmente revertida
pela terapia por vibração. Quanto aos marcadores de reabsorção óssea), a debates
induziu aumento expressivo nos níveis de CTX-I. As letras indicam diferenças
significativas (p <0,05)....................................................................................................64
Lista de Quadro
LISTA DE QUADRO
Quadro 1. Grupos experimentais.....................................................................................40
Lista de Abreviaturas e
Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TGF-β Fator de transformação do crescimento beta
IL-1 Interleucinas 1
IL-6 Interleucinas 6
TNF-α Fator de necrose tumoral
BMP-2 Proteína morfogenética óssea
RANK-L Ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa B
CON Grupo controle
FRAT Fratura óssea
DM Diabetes mellitus
TV Terapia por vibração
NaCl Cloreto de sódio
FMRP-USP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
DXA Densitometria óssea com dupla emissão de raios X
DMO Densidade mineral óssea
CMO Conteúdo mineral ósseo
μCT Microtomografia computadorizada
ASBMR American Society for Bone and Mineral Research
BV Volume ósseo total
BV/TV Volume ocupado pela medula e trabéculas ósseas
TbN Número de trabéculas ósseas por milímetro de tecido
TbTh Espessuras das trabéculas ósseas
TbSp Espaçamento entre as trabéculas ósseas
ConnD Densidade de conexão entre múltiplas trabéculas ósseas
DTT Densidade tecidual trabecular
Ct.V Volume cortical total
Ct.BV/TV Volume ocupado pela cortical
Ct.Th Espessura cortical
FORP Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
HE Hematoxilina-Eosina
TRAP Tetrade Resistant Acid Phosphatase
RPM Rotação por minuto
IGF-1 Fator de Crescimento Similar à Insulina Tipo 1
CTX-I C-terminal telopeptide of type I collagen
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
DP Desvio-padrão
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Lista de Símbolos e
Unidades
LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES
% Porcentagem
mm Milímetro
mg Miligrama
g Grama
cm Centímetro
cm² Centímetro quadrado
ms Milissegundo
g/cm³ Grama por centímetro cúbico
Hz Hertz
°C Graus Celsius
µL Microlitro
Mp Megapixel
mg/kg Miligrama por quilograma
pH Potencial hidrogeniônico
mg/dl Miligrama por decilitro
mA Miliampere
kV Kilovolt
n°/mm Número por mililitro
mm³ Milímetro cúbico
µm Micrômetro
ml Mililitro
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................32
1.1 Reparo ósseo normal.................................................................................32
1.2 Reparo ósseo na diabetes..........................................................................34
1.3 Indução diabética em animais experimentais.........................................36
1.4 Efeitos osteogênicos da terapia por vibração na consolidação óssea....36
2 OBJETIVOS ............................................................................................................38
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................40
3.1 Animais experimentais..............................................................................40
3.2 Grupos experimentais...............................................................................40
3.3 Procedimento experimental – indução farmacológica à diabetes.........41
3.4 Procedimento experimental – fratura óssea............................................42
3.5 Procedimento experimental – tratamento com terapia por vibração...44
3.6 Análise radiográfica ..................................................................................45
3.7 Análise da estrutura óssea ........................................................................46
3.7.1 Análise macroscópica...................................................................46
3.7.2 Densitometria óssea (DXA)..........................................................46
3.7.3 Microtomografia computadorizada (µ-CT).................................47
3.7.3.1 Análise da microarquitetura trabécular....................................48
3.7.3.1.1 Análise da densidade tecidual trabecular (DTT).....49
3.7.3.2 Análise da microarquitetura cortical........................................49
3.7.3.3 Análise da microarquitetura do calo ósseo...............................49
3.7.3.4 Análise da densidade tecidual óssea........................................49
3.7.4 Microscopia óptica.......................................................................49
3.7.5 Análise bioquímica dos marcadores de formação e reabsorção
óssea (ELISA)........................................................................................50
3.8 Análise dos resultados...............................................................................50
4 RESULTADOS........................... .............................................................................53
4.1 Massa corpórea..........................................................................................53
4.2 Relação entre massa corpórea e glicemia................................................54
4.3 Análise macroscópica................................................................................55
4.4 Análise densitométrica..............................................................................57
4.5 Análise da microarquitetura óssea µCT..................................................58
4.5.1 Análise da microarquitetura trabecular...................................58
4.5.2 Análise da microarquitetura do osso cortical..........................59
4.5.3 Microarquitetura do calo ósseo................................................60
4.6 Microscopia ótica.......................................................................................61
4.7 Análise dos marcadores de formação e reabsorção óssea (ELISA)......64
5 DISCUSSÃO..........................................................................................................67
5.1 Relação entre diabetes, qualidade óssea e terapia por vibração...........67
5.2 Relação entre diabetes, consolidação óssea e terapia por vibração......68
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................74
ANEXOS......................................................................................................................79
Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais FMRP-USP..................80
MANUSCRITO............................................................................................................82
Introdução
Introdução - 32
1 INTRODUÇÃO
Apesar dos avanços ortopédicos para obtenção da consolidação óssea normal
após fratura, aproximadamente 10% delas ainda apresentam atraso na consolidação ou
se desenvolvem em pseudoartroses que podem causar incapacidade funcional (Azad et
al., 2009). Considerando os Estados Unidos isoladamente, em que o número anual de
fraturas ósseas chega a 8 milhões, o impacto clínico e financeiro das alterações da
consolidação óssea no sistema de saúde é significante (Assiotis et al., 2012). Múltiplos
fatores podem ser considerados como de risco para interferências no reparo ósseo, como
idade, tabagismo, doenças osteometabólicas, agentes farmacológicos e algumas
condições sistêmicas como a diabetes (Urabe et al., 2003; Diniz et al., 2008; Ogasawara
et al., 2008; Azad et al., 2009).
Estima-se que cerca de 16 milhões de pessoas, aproximadamente 4% da
população, sejam portadoras de diabetes nos Estados Unidos; aproximadamente 1,4
milhões de americanos são diagnosticados por ano (Association, 2005), sendo
responsável por mais de 40.000 mortes e 20.000 amputações anualmente (Diniz et al.,
2008). De acordo com estatísticas da World Health Organization, em 2014 o número de
pessoas com diabetes foi de 422 milhões. Em 2040, estima-se um aumento de 52%, ou
seja, cerca de 642 milhões de indivíduos com diabetes. Além disso, cerca de 1,5
milhões de mortes foram causadas diretamente pela diabetes em 2012 (Federation,
2006; Organization, 2016b). No Brasil, há previsão de que haverá 12 milhões de
indivíduos diabéticos no ano de 2025 (Diniz et al., 2008).
A relação entre distúrbio da consolidação óssea e diabetes tem sido referida em
humanos (Montagnani et al., 2011a; Kim et al., 2012a) e investigada em animais de
laboratório desde a década de 60 (Herbsman et al., 1968). Embora o assunto tenha sido
abordado em diversos estudos (Herbsman et al., 1968; Macey et al., 1989; Beam et al.,
2002; Urabe et al., 2003; Follak et al., 2004; Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008;
Al-Zube et al., 2009; Azad et al., 2009; Kidder et al., 2009; Wang et al., 2012), os
mecanismos e em que grau a qualidade óssea é afetada pela diabetes ainda não estão
completamente elucidados na literatura científica.
1.1 Reparo ósseo normal
Introdução - 33
A fratura de um osso longo apresenta duas principais consequências: perda da
integridade mecânica e da continuidade do tecido ósseo (Merloz, 2011), que deverão ser
recuperados pela consolidação óssea, um processo complexo e multifásico, envolvendo
a atividade coordenada de diversos tipos de células (Diniz et al., 2008; Kayal et al.,
2009; Fazzalari, 2011).
O processo tem início por um hematoma formado em resposta à lesão dos
tecidos. Células progenitoras são recrutadas e chegam ao local da lesão, onde se
proliferam e diferenciam-se em condrócitos e osteoblastos. Esse sistema de cascata que
é desencadeado após a fratura contribui para o remodelamento das extremidades dos
ossos fraturados, que ocorre pela combinação da ossificação endocondral e
intramembranosa (Fazzalari, 2011), garantindo a formação do calo ósseo, que consiste
em tecido regenerado de preenchimento do espaço entre dois fragmentos ósseos e
recupera a integridade mecânica desfeita pela fratura.
Na cascata de eventos que ocorre após a fratura, no hematoma, há liberação de
fatores de crescimento da matriz extracelular, incluindo a regulação de citocinas e
migração de células inflamatórias e endoteliais para a região da fratura, que estão
envolvidas na consolidação óssea, e que podem ser classificadas em três grupos;
citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento (TGF-β) e fatores angiogênicos. A
fase inflamatória está associada à formação do hematoma, recrutamento de células
tronco mesenquimais, proliferação celular e início da condrogênese. Interleucinas 1 e 6
(IL-1 e IL-6) e fator de necrose tumoral (TNF-α) iniciam a cascata de eventos da
cicatrização óssea. A expressão dos fatores de crescimento derivados de tumor (TGF-β),
das plaquetas e da proteína morfogenética óssea (BMP-2) aumenta para prosseguir a
formação do calo ósseo. A contínua expressão de BMP-5, BMP-6 e TGF-β sugerem
efeitos reguladores, tanto na ossificação endocondral, como na intramembranosa.
A fase primária de formação óssea está relacionada com a rápida osteogênese,
envolvendo o recrutamento de células ósseas, apoptose de condrócitos, recrutamento de
osteoclastos, absorção de cartilagem mineralizada e contínua neoangiogênese. Estas
ocorrências estão associadas ao aumento do TNF-α, do ligante do receptor ativador do
fator nuclear kappa B (RANK-L) e do fator estimulante de colônias de macrófagos
(MCSF). Os níveis de BMP-3, BMP-4, BMP-7 e BMP-8 aumentam com a absorção de
cartilagem calcificada e promovem o recrutamento de células osteoblásticas.
Os condrócitos produzem cartilagem, formando o calo ósseo mole, e em seguida
sofre calcificação, tornando-se mais resistente e protegendo o local fraturado. Segue-se
Introdução - 34
a apoptose dos condrócitos e, simultaneamente, os osteoclastos começam a absorver
tecido cartilaginoso mineralizado, caracterizando a fase de formação óssea endocondral
executada pelos osteoblastos. A formação óssea secundária e remodelagem estão
relacionadas com a atividade normal da medula óssea, em que a expressão de IL-1 e de
IL-6 aumenta com a remodelagem óssea, enquanto que RANK-L, MCSF e TGF-β
apresentam níveis reduzidos de expressão, nesta fase do reparo ósseo (Fazzalari, 2011).
Por último, o tecido ósseo sofre remodelação cujo objetivo é recuperar a
anatomia e a função original do osso antes da fratura. A remodelação óssea é o
resultado de um processo dinâmico de formação e reabsorção do tecido ósseo, em que a
reabsorção causa a deterioração desse tecido enquanto a formação do mesmo é
responsável pela reconstrução e fortalecimento do tecido deteriorado (Kayal et al.,
2009; Fazzalari, 2011).
1.2 Reparo ósseo na diabetes
Sabe-se que a diabetes afeta a qualidade do tecido ósseo, causando osteopenia e
déficit no processo de reparo ósseo. Alguns fatores são considerados responsáveis pelo
elevado risco de fratura óssea no diabético, dentre eles se destacam a perda global de
massa óssea e a redução na capacidade de absorver energia (Korres et al., 2013). A
maioria dos estudos concentra-se na relação entre a diabetes e a reduzida taxa de
formação óssea, que está alterada, com redução da densidade mineral óssea e dos níveis
de osteocalcina e fosfatase alcalina. Diversos mecanismos são sugeridos como causas
da alteração óssea na diabetes, como modificações nas sinalizações celulares causadas
pela hiperglicemia, exacerbação da fase inflamatória, alterações circulatórias dos fatores
de crescimento e hormônios endócrinos, além do aumento do estresse oxidativo e morte
celular (Kayal et al., 2009). Krakauer et al. relataram que pacientes com diabetes
apresentam redução na taxa de formação óssea durante o crescimento, enquanto que a
longo prazo, devido à hiperglicemia, há aumento da reabsorção óssea e osteopenia
(Krakauer et al., 1995).
Evidências recentes sugerem que a diabetes esteja relacionada com a perda de
massa óssea devido ao aumento da atividade osteoclástica. Em animais experimentais,
os resultados mostram que a diabetes acarreta desenvolvimento de calos ósseos
pequenos e com formações óssea e cartilaginosa reduzidas, redução da proliferação e
diferenciação de células osteoblásticas e condrócitos, além da redução expressiva na
resistência mecânica do osso durante o processo de reparo ósseo (Kayal et al., 2009).
Introdução - 35
O conteúdo genético responsável pela formação óssea do osso diabético em
processo de reparo pós-fratura óssea apresenta-se reduzido em 40%, quando comparado
com o osso normal, indicando baixa celularidade do calo ósseo diabético devido à
redução da proliferação celular associada à baixa produção de fatores de crescimento
(Kayal et al., 2009). Além disso, o calo ósseo na diabetes apresenta conteúdo
cartilaginoso reduzido, devido à redução nas taxas de diferenciação e proliferação dos
condrócitos (Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008; Kayal et al., 2009).
Apesar da relação entre diabetes e distúrbios osteometabólicos, como perda de
massa óssea, aumento da fragilidade óssea e alterações na consolidação do osso
fraturado ser conhecida na literatura científica, a fisiopatologia dos eventos envolvidos e
a resposta a tratamentos ainda não estão completamente elucidadas (Follak et al., 2004).
Neste contexto, vários mecanismos têm sido usados para explicar a maior incidência de
atraso, ou não consolidação óssea em indivíduos diabéticos, incluindo redução da
circulação sanguínea e angiogênese, resposta inflamatória exagerada, redução da síntese
de colágeno e desequilíbrio osteometabólico entre as atividades entre osteoblastos e
osteoclastos (Diniz et al., 2008). Estudos experimentais com animais de laboratório têm
sido muito utilizados com a finalidade de executar procedimentos que permitam
identificar mecanismos responsáveis pela relação entre diabetes e alterações de
consolidação óssea.
1.3 Indução diabética em animais experimentais
Diversos métodos podem ser utilizados para indução da diabetes em ratos, como
criação de variedades com pré-disposição genética para desenvolver a doença (Beam et
al., 2002; Follak et al., 2004; Al-Zube et al., 2009) ou indução farmacológica por meio
de estreptozotocina (Macey et al., 1989; Ogasawara et al., 2008; Kidder et al., 2009;
Johansen et al., 2013) e aloxana (Herbsman et al., 1968; Diniz et al., 2008).
A indução diabética por meio da estreptozocina atualmente é considerada um
dos melhores modelos para o estudo dos efeitos da diabetes no tecido ósseo de animais
experimentais (Ogasawara et al., 2008), sendo o mais utilizado na literatura científica
(Follak et al., 2004). A estreptozotocina causa destruição de células β pancreáticas,
hipoinsulinismo e hiperglicemia, características clínicas comuns no indivíduo com
diabetes tipo 1. Estudos mostraram redução da densidade mineral óssea e dos níveis
séricos de osteocalcina em ratos induzidos à diabetes por meio da estreptozotocina
(Ogasawara et al., 2008).
Introdução - 36
Conscientes da perda de massa óssea decorrente da diabetes, diversos estudos
têm sido desenvolvidos com o objetivo de identificar recursos profiláticos e terapêuticos
para amenizar e até reverter os danos ósseos causados pela hiperglicemia (Follak et al.,
2004; Al-Zube et al., 2009). O uso recente da plataforma vibratória, com efeito
osteogênico, tem se mostrado promissor na melhora da qualidade óssea e,
possivelmente, na melhora da consolidação do calo ósseo (Leung et al., 2009; Shi et al.,
2010).
1.4 Efeitos osteogênicos da terapia por vibração na consolidação óssea
A terapia por vibração é um recurso que vem sendo estudado e mostra que a
baixa magnitude da vibração de alta frequência proporciona estímulos mecânicos não
invasivos utilizados como recurso para acelerar o processo de consolidação óssea,
formação de calo ósseo, remodelação, mineralização e restauração mecânica (Rubin et
al., 2004; Gilsanz et al., 2006; Leung et al., 2009; Shi et al., 2010). A vibração exerce
efeito osteogênico sobre a qualidade óssea, melhorando a densidade mineral óssea
(Rubin et al., 2004; Gilsanz et al., 2006). Efeitos positivos e benéficos também foram
observados decorrentes do aumento na circulação sanguínea dos membros e na área
transversa da fibra muscular (Murfee et al., 2005; Xie et al., 2008). Atualmente, é
reconhecida a importância da mecanotransdução, fenômeno que consiste em
transformar estímulos mecânicos em respostas biológicas positivas que contribuem para
o trofismo dos tecidos (Xie et al., 2008). Alguns estudos observaram que a terapia por
vibração apresentou melhora na consolidação de fraturas em ossos de ratos (Stuermer et
al., 2010; Komrakova et al., 2013). No entanto, os autores utilizaram o modelo de
perfuração óssea, em que não há formação de calo ósseo por ossificações endocondral e
intramembranosa. A terapia por vibração acelera o processo de consolidação óssea
(Leung et al., 2009; Shi et al., 2010). Por outro lado, outros autores não observaram
resultados positivos da terapia por vibração na consolidação do defeito ósseo (Wolf et
al., 2001).
Objetivos
Objetivos - 38
2 OBJETIVOS
Avaliar as alterações do tecido e calo ósseos de fêmures de ratas diabéticas
submetidas à terapia por vibração.
Analisar a influência da diabetes e terapia por vibração na consolidação óssea
em diferentes fases da cicatrização tecidual.
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos - 40
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais experimentais
Foram utilizadas cento e cinquenta ratas da raça Rattus Norvegicus albinus,
variedade Wistar, com massa corpórea inicial de 190 a 200 gramas.
Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Prefeitura do Campus de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e alojados no Biotério do Laboratório de
Bioengenharia. Antes do período de experimentação as ratas passaram por ambientação
durante três dias, sem qualquer intervenção. Durante todo o período experimental foram
mantidas sem restrição de acesso à água e ração, em temperatura ambiente de 20 a
24°C, com controle de luminosidade (claro/escuro: alternância de 12 horas) e controle
da umidade relativa de 45 a 55%, podendo aumentar de 3 a 5°C no interior da gaiola.
Todos os procedimentos experimentais envolvidos nesse estudo foram
aprovados Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (processo nº 201/2014) e seguem as
recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA (Andersen
et al., 2004).
3.2 Grupos experimentais
Os animais foram aleatoriamente divididos em cinco grupos experimentais, com
dois subgrupos cada (Quadro 1).
Quadro 1 – Grupos experimentais
Grupos Subgrupos
CON+FRAT
Grupo controle com fratura óssea
CON+FRAT1 (n=25) – ratas não diabéticas observadas por 30
dias sem qualquer intervenção experimental, realização de
fratura óssea e seguidas por 14 dias pós-fratura (total de 44 dias)
CON+FRAT2 (n=20) – ratas não diabéticas observadas por 30
dias sem qualquer intervenção experimental, realização de
fratura óssea e seguidas por 28 dias pós-fratura (total de 28 dias)
DM DM1 (n=31) – ratas diabéticas em seguimento de 44 dias
Materiais e Métodos - 41
Grupo com diabetes mellitus DM2 (n=30) – ratas diabéticas em seguimento de 58 dias
DM+FRAT
Grupo com diabetes e fratura
óssea
DM+FRAT1 (n=18) – ratas diabéticas observadas por 30 dias,
realização de fratura óssea e seguidas por 14 dias pós-fratura
(total de 44 dias)
DM+FRAT2 (n=18) – ratas diabéticas observadas por 30 dias,
realização de fratura óssea e seguidas por 28 dias pós-fratura
(total de 58 dias)
CON+FRAT+TV
Grupo controle com fratura óssea
e terapia por vibração
CON+FRAT+TV1 (n=17) – ratas não diabéticas observadas por
30 dias, realização de fratura óssea e terapia por vibração por 14
dias pós-fratura (total de 44 dias)
CON+FRAT+TV2 (n=20) – ratas não diabéticas observadas por
30 dias, realização de fratura óssea e terapia por vibração por 28
dias pós-fratura (total de 58 dias)
DM+FRAT+TV
Grupo com diabetes, fratura
óssea e terapia por vibração
DM+FRAT+TV1 (n=38) – ratas diabéticas observadas por 30
dias, realização de fratura óssea e terapia por vibração por 14
dias pós-fratura (total de 44 dias)
DM+FRAT+TV2 (n=30) – ratas diabéticas observadas por 30
dias, realização de fratura óssea e terapia por vibração por 28
dias pós-fratura (total de 28 dias)
Todos os procedimentos experimentais envolvidos no estudo serão abordados
individualmente neste capítulo e a Figura 1 esquematiza resumidamente o desenho do
estudo.
Figura 1. Acompanhamento dos animais: Dia -3 (chegada e alojamento dos animais); Dia 0 (indução de
diabetes por meio da administração de estreptozotocina ou placebo por meio da aplicação de solução de
citrato); Dia 30 (fratura óssea); Dia 33 (início da terapia por vibração); Dia 44 ou 58 (eutanásia de acordo
com o subgrupo experimental em análise).
3.3 Procedimento experimental – indução farmacológica à diabetes
Materiais e Métodos - 42
A indução da diabetes foi realizada por meio de única aplicação intravenosa de
40 mg/kg de estreptozotocina (dissolvida em solução tampão de citrato 0.1M, pH 4.9).
Nos animais controle foi realizada aplicação de solução de citrato, com mesma dosagem
e seguindo os mesmos procedimentos para injeção de estreptozotocina.
Os animais com taxa glicêmica superior a 250 mg/dl, avaliados uma semana
após a aplicação da estreptozotocina, foram diagnosticados como diabéticos e incluídos
no estudo. Durante o período experimental, a taxa glicêmica foi avaliada, três vezes por
semana por meio de coleta de sangue obtida por punção venosa da cauda. Valores
inferiores a 250 mg/dl, obtidos por meio de tiras teste e medidor para glicemia, em duas
medidas consecutivas determinaram a exclusão do animal do estudo, segundo critérios
usados por Follak et al., 2004 (Follak et al., 2004). A taxa glicêmica também foi
mensurada nos animais não diabéticos seguindo o mesmo protocolo.
3.4 Procedimento experimental – fratura óssea
A fratura óssea pelo método fechado foi provocada 30 dias após a indução de
diabetes (ou injeção placebo) na região diafisária do fêmur direito.
Os animais foram anestesiados por meio da combinação (1:1; 0,1 mg/100g) de
xilazina (6 mg/kg) e quetamina (60 mg/kg), aplicada por via intramuscular na região
glútea. Todo o membro pélvico direito foi tricotomizado e recebeu antissepsia com
solução alcoólica de clorexedina a 10%. A fratura foi realizada de forma fechada por
meio de alavanca inter-resistente (Figura 2) confeccionada para este propósito e ocorreu
no terço médio do fêmur direito. A coxa do animal foi apoiada nas extremidades de
suporte da alavanca inter-resistente e por acionamento manual, o seu terço médio
recebeu carga pela parte romba da alavanca, até sentir a queda da resistência do osso,
geralmente acompanhada de um ruído típico do osso quebrando. Este modelo de fratura
(Urabe et al., 2003; Ogasawara et al., 2008) tem a vantagem de mimetizar as fraturas
ósseas clinicamente.
Materiais e Métodos - 43
Figura 2. Figura esquemática da alavanca inter-resistente confeccionada no laboratório que foi utilizada
para produzir a fratura fechada do terço médio dos fêmures direitos dos animais.
Em seguida, o animal foi retirado da alavanca inter-resistente e colocado em
mesa cirúrgica, onde foi feita a antissepsia de todo o membro pélvico direito com
solução alcoólica polivinil-pirrolidona-iodo. Com técnica de assepsia foi feito um mini
acesso lateral na coxa, pelo septo intermuscular, na região da fratura, que foi exposta
(Figura 3A). Este passo tem a finalidade de confirmar a adequação da fratura
(localização diafisária, completa e transversal). O deslocamento das partes moles foi
mínimo. Em seguida, fio de Kirschner de 1 mm de espessura, previamente esterilizado,
foi introduzido pelo canal medular do fragmento proximal até sair pela raiz da coxa
(Figura 3B). A fratura foi reduzida por observação direta e o fio de Kirschner avançado
pelo canal medular do fragmento distal até ser sentido pela palpação da pele entre os
côndilos do joelho. Houve um pequeno recuo. Depois foi conferida a redução e
estabilização da fratura e o excesso do fio de Kirschner que saiu pela coxa foi retirado.
As incisões na região pélvica e lateral da coxa foram suturadas com fios absorvíveis e
aplicado iodo para impedir autofagia. Logo após, foi realizada radiografia digital do
fêmur com o objetivo de comprovar as adequações da fratura e da fixação (Figura 3C).
Os animais se recuperaram da anestesia em cama térmica para evitar a perda de
temperatura corpórea e receberam dipirona (80µL de uma diluição 1:5 em solução
estéril de 0,9% de NaCl), por via subcutânea. Uma vez recuperados, os animais foram
mantidos em gaiolas individuais, de acordo com as normas técnicas do biotério e foi
aplicado iodo e substância antimutilante para impedir a autofagia.
Foram excluídos os animais que apresentaram fraturas altamente cominutivas
(fragmentadas), mal localizadas (não-diafisárias), incompletas ou fixadas
inadequadamente observadas por via direta durante o procedimento cirúrgico ou pela
Materiais e Métodos - 44
radiografia. Da mesma forma, foram excluídos animais que apresentaram perda da
redução da fratura, migração (soltura) do fio de Kirschner, alterações expressivas na
saúde geral (incompatível com a vida) e autofagias.
Os animais dos subgrupos 1 foram acompanhados por 14 dias pós-fratura,
totalizando 44 dias de seguimento experimental (somados aos 30 dias pós-indução
diabética). E, os animais dos subgrupos 2 acompanhados por 28 dias pós-fratura,
totalizando 58 dias.
Figura 3. Aspectos cirúrgicos da exposição e fixação da fratura. (A) Incisão lateral na coxa direita com
visualização da fratura. (B) Aspecto da fratura após fixação intramedular. (C) Radiografia em perfil do
membro posterior direito realizada após fratura mostrando o alinhamento adequado dos fragmentos e a
fixação intramedular com fio de Kirschner.
3.5 Procedimento experimental – tratamento com terapia por vibração
Os animais do grupo CON+FRAT+TV e DM+FRAT+TV foram submetidos à
terapia por vibração por meio da plataforma vibratória confeccionada com apoio da
Oficina de Precisão do Campus de Ribeirão Preto – USP, Brasil para o Laboratório de
Bioengenharia da FMRP-USP (Zamarioli, 2012). A plataforma vibratória é composta
por um compartimento de acrílico com abertura superior (base de 20 cm x 25 cm e 10
cm de altura) com o fundo formado por uma plataforma que vibrava verticalmente na
frequência de 50 Hz e amplitude de 1 mm. Duas divisórias em acrílico no interior da
caixa permitiam o treinamento simultâneo de quatro animais.
A terapia por vibração foi iniciada três dias após a fratura óssea. Os animais
ficaram em compartimentos individuais na plataforma vibratória (Figura 4) e foram
submetidos aos efeitos mecânicos da vibração associada à descarga mecânica três vezes
Materiais e Métodos - 45
por semana, por vinte minutos. A reabilitação foi realizada durante 14 ou 28 dias, de
acordo com o subgrupo.
Figura 4. Figura da plataforma vibratória confeccionada no laboratório de Bioengenharia da FMRP
utilizada na terapia por vibração.
3.6 Análise radiográfica
Para seguimento in vivo da consolidação óssea os animais foram submetidos à
avaliação radiológica do calo ósseo semanalmente por meio do equipamento Simens-
Unimax 2B (Rio de Janeiro, Brasil) e chassi digital Kodak View (24x30cm). Os animais
foram submetidos à anestesia superficial por meio da combinação das drogas xilasina e
quetamina (1:1; 0,05ml/100g) e posicionados em decúbito ventral com membros
posteriores em abdução e flexão de quadril e joelhos (90°) sobre o chassi (Figura 5) a
uma distância de 115 cm do foco. Os parâmetros utilizados foram de 5 mA, 44 kVp e 1
segundo de exposição.
Figura 5. Imagem radiográfica obtida imediatamente após a fratura e sua redução com fio de Kirschner
intramedular para confirmar a adequação e redução da fratura (A: perfil; B: ântero-posterior).
Materiais e Métodos - 46
3.7 Análise da estrutura óssea
Após o período experimental os animais foram submetidos à eutanásia com dose
excessiva do anestésico Tiopental. O sangue foi coletado para análise bioquímica de
marcadores de formação e reabsorção óssea e os fêmures foram dissecados e
armazenados para realização das análises macroscópica, densitométrica,
microtomográfica e histológica.
3.7.1 Análise macroscópica
Após a dissecção foi retirado o fio de Kirschner e realizada avaliação
morfométrica dos ossos. Os ossos foram pesados em balança de precisão da marca
Marte, modelo AC-2000 com precisão de 0,01 g. Em seguida, foram avaliados o
comprimento e o diâmetro das metáfises distais e região central das diáfises dos
fêmures. Todas as medidas foram realizadas por meio de paquímetro digital da marca
Mitutoyo, com precisão de 0,01 mm.
3.7.2 Densitometria óssea (DXA)
A densitometria óssea com dupla emissão de raios X foi realizada no
Laboratório de Bioengenharia da FMRP-USP, no densitômetro Lunar DPX-IQ (Lunar;
software version 4.7e, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom), através do
método por absorciometria bitofônica de raio-X (DXA, abreviação em inglês: Dual-
energy X-ray absorptiometry). Os ossos foram posicionados em um recipiente (Figura
6) imersos em etanol 70% com 2,0 cm de profundidade. A densidade global foi
analisada por meio de software específico para análise densitométrica do esqueleto
apendicular de animais de pequeno porte (Figura 7).
A análise foi realizada na metáfise distal dos fêmures direito e esquerdo e no
calo ósseo. Para isso, foram utilizados como região de interesse quadrados de 0,90 cm²
nas metáfises distais, posicionados imediatamente proximal à cartilagem de crescimento
distal. Na região diafisária dos fêmures fraturados foram utilizados como região de
interesse figuras geométricas de tamanhos e formas variáveis que pudessem conter todo
o calo ósseo. Os valores de DMO (densidade mineral óssea), CMO (conteúdo mineral
ósseo) e área do calo ósseo foram analisados com base nas regiões de interesse
avaliadas. O coeficiente de variância foi de 4,5%.
Materiais e Métodos - 47
Figura 6: Posicionamento dos ossos na plataforma do densitômetro.
Figura 7: Análise densitométrica dos fêmures para avaliação da DMO, CMO e área do calo.
3.7.3 Microtomografia computadorizada (μCT)
O Microtomógrafo é composto por um tubo de raios-X de microfoco com fonte
de alta tensão (100kV), um porta amostras onde um osso foi posicionado e um detector
baseado em uma câmera CCD de 11Mp conectados a um computador para controle a
aquisição de dados com software para reconstrução, visualização e análise quantitativa
de imagens em 2D e em 3D.
Este método tridimensional permite a caracterização da microgeometria e
densidade tecidual óssea. Além disso, analisa a microarquitetura trabecular e cortical
independentemente (Burghardt et al., 2011) e permite a análise quantitativa do calo
ósseo formado pós-fratura.
Após a análise densitométrica, os fêmures conservados em etanol a 70% foram
utilizados na análise por microtomografia computadorizada (μCT) utilizando
microtomógrafo SkyScan 1174v2 (Bruker-microCT, Bélgica) do Laboratório de
Materiais e Métodos - 48
Endodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP, Brasil. Os espécimens
foram escaneados utilizando os parâmetros 50 kV e 800 mA, com filtro de alumínio
com espessura de 0,5 mm para otimizar o contraste. Foi adotada rotação de 1º com
média de três quadros e resolução isotrópica de 26,7 µm. As imagens de cada
espécimen foram reconstruídas por meio de software específico (NRecon versão 1.6.3;
Bruker-microCT) que permite a visualização e análise das estruturas internas das
amostras.
As análises microtomográficas foram realizadas no osso fraturado (fêmur
direito) para avaliação do calo ósseo e no osso contralateral (fêmur esquerdo) para
avaliação dos tecidos trabecular (na metáfise distal) e cortical (na região diafisária).
Inicialmente, foi utilizado o software Data Viewer (Bruker-microCT, versão
1.5.1.2) para adequação do posicionamento do osso analisado. Em seguida, a análise
morfométrica foi realizada por meio do software CTAn (Bruker-microCT, versão
2.2.1).
Todas as medidas morfométricas dos ossos e as nomenclaturas utilizadas
seguiram as recomendações da American Society for Bone and Mineral Research
(ASBMR) (Bouxsein et al., 2010).
3.7.3.1 Análise da microarquitetura trabecular
A região metafisária foi selecionada manualmente por uma extensão de 3,0 mm,
iniciando imediatamente proximal à cartilagem de crescimento distal do fêmur
esquerdo. O osso trabecular foi isolado manualmente do osso cortical através do
software CTAn. Por meio deste software foi possível determinar o melhor treshold, a
fim de excluir tecido mole e incluir tecido mineralizado. O mesmo treshold foi utilizado
para todas as amostras, mas diferentes tresholds foram utilizados na avaliação do osso
trabecular, cortical e calo ósseo. Para o osso trabecular foi utilizado treshold de 255-60.
A microarquitetura trabecular da metáfise distal do fêmur foi caracterizada pela
determinação do volume ósseo total (BV), em mm3; volume ocupado pelo osso
trabecular, expresso como porcentagem do volume ocupado pela medula e trabéculas
ósseas (BV/TV), em %; número de trabéculas ósseas por milímetro de tecido (TbN), em
n°/mm; espessuras das trabéculas ósseas (TbTh), em µm; espaçamento entre as
trabéculas ósseas (TbSp), em µm e; densidade de conexão entre múltiplas trabéculas
ósseas (ConnD), em mm3.
Materiais e Métodos - 49
Quanto maior os valores de BV, BV/TV, TbN, TbTh e ConnD, melhor a
qualidade da estrutura do tecido ósseo. Por outro lado, quanto maior o volume de TbSp,
pior a qualidade óssea.
3.7.3.1.1 Análise da densidade tecidual trabecular (DTT)
A densidade tecidual das trabéculas ósseas foi avaliada por meio da
microtomografia computadorizada. Para cálculo preciso da DTT foi necessário calibrar
o analisador Skyscan com moldes (phantoms) de hidroxiapatita de densidades
conhecidas (0,25 e 0,75 g/cm3).
3.7.3.2 Análise da microarquitetura cortical
A microarquitetura cortical foi analisada na diáfise do fêmur esquerdo; 8mm
proximal à cartilagem de crescimento distal, por uma extensão de 2mm. Para o osso
cortical foi utilizado treshold de 255-120. Os parâmetros avaliados foram volume
cortical (Ct.V, em mm³, Ct.BV/TV, em %) e espessura cortical (Ct.Th, em m).
3.7.3.3 Análise da microarquitetura do calo ósseo
A análise tridimensional do calo ósseo foi obtida por meio da avaliação do
volume total do calo ósseo. Para isso, o calo ósseo foi selecionado em sua totalidade
como região de interesse e o volume e a mineralização do calo do calo foram
mensurado, em mm³ e em % respectivamente. Para o calo ósseo trabecular foi utilizado
treshold de 255-50.
3.7.4 Microscopia ótica
Os fêmures destinados ao estudo histológico foram processados no Laboratório
de Histologia do Departamento de Clínica Infantil da FORP, Ribeirão Preto, Brasil.
Imediatamente após a dissecção, os ossos foram fixados em paraformaldeído 4%,
descalcificados com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA – ethylenediamine
tetraacetic acid) 10% e submetidos a diferentes concentrações alcoólicas para fixação e
subsequente secção histológica. Toda a região do fêmur direito ocupada pelo calo ósseo
foi isolada e utilizada para montagem das lâminas.
Materiais e Métodos - 50
Os cortes foram realizados no plano coronal com espessura aproximada de 5 μm.
Após preparo dos blocos, as lâminas foram coradas com Hematoxilina-Eosina (HE), o
que permite observar as trabéculas e a medula óssea; com Tetrade Resistant Acid
Phosphatase (TRAP), corante específico para marcar osteoclastos, que ficam
avermelhados após a coloração; e com solução Picro-Sirius, que permite a identificação
das fibras colágenas. As secções foram analisadas sob microscopia de campo brilhante
(Axiovert, Carl Zeiss, Alemanha), e as imagens foram capturadas com uma câmara
CCD (AxioCam MRc, Carl Zeiss, Alemanha) na região do calo ósseo, com ampliações
de 12,5; 50 e 200x.
3.7.5 Análise bioquímica dos marcadores de formação e reabsorção
óssea (ELISA)
Para a realização da análise bioquímica, foi realizada coleta de sangue através de
punção cardíaca imediatamente após a eutanásia, sendo retirado cerca de 5-6 ml de
sangue por animal.
O sangue foi centrifugado para isolar o soro na Microcentrífuga Hettich®
Universal 320R do Laboratório de Bioengenharia da FMRP-USP, a 3500 RPM com
aceleração 4g por 10 minutos. O soro foi armazenado em freezer a -80°C para análise
futura dos marcadores ósseos com a finalidade de avaliar a osteogênese e a reabsorção
óssea (Pereira et al., 2009). Foram dosadas as concentrações séricas dos marcadores
ósseos de formação [Fator de Crescimento Similar à Insulina Tipo 1 (IGF-1)] e de
reabsorção [receptor activator of nuclear factor-kappa B (RANK) e C-terminal
telopeptide of type I collagen (CTX)], pelo método Enzyme-Linked Immunoabsorbent
Assay (ELISA) em duplicata utilizando os kits comerciais da Boster Immuno Leader e
MyBioSource, USA. O erro calculado intra-ensaios de IGF-1 a partir de seis amostras
de pool controle, com média de foi 5.3% e entre ensaios, <15% para o CTX-I e 5.5%
para RANK-L. As análises foram realizadas no Laboratório de Bioengenharia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
3.8 Análise dos resultados
As variáveis contínuas foram expressas como médias e desvios-padrão (DP). Os
resultados obtidos nos cincos grupos foram comparados utilizando a análise de
Materiais e Métodos - 51
variância unidirecional de Kruskal-Wallis, seguida do teste post hoc de Dunn. Os
valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas
as análises estatísticas foram realizadas com RStudio 0,99.902 (RStudio, Inc., USA).
Resultados
Resultados - 53
4 RESULTADOS
Os resultados apresentados neste capítulo foram obtidos do total de 150 ratas
que concluíram os experimentos envolvidos neste estudo. No entanto, as taxas de
mortalidade e exclusão foram de 39% e as principais causas foram: falha na indução de
diabetes, morte durante indução anestésica, eutanásia devido à cominuição óssea,
eutanásia no pós-operatório devido à migração do fio de Kirschner e complicações de
saúde.
Dos 165 animais submetidos à indução de diabetes por estreptozotocina, 33
(20%) não foram diagnosticados como diabéticos e foram descartados do estudo. 5%
dos animais diabéticos morreram ou foram descartados por complicações associadas à
diabetes, como perda acentuada de peso, cegueira (Figura 8) ou má saúde em geral.
Figura 8. Ilustração de cegueira causada pela diabetes.
Dos animais que foram submetidos à fratura óssea, 28% morreram ou foram
mortos em decorrência do procedimento cirúrgico; 6% morreram durante a anestesia,
14% foram descartados por cominuição excessiva dos fragmentos da fratura, e 8%
sofreram eutanásia no período pós-operatório devido migração do fio de Kirschner.
4.1 Massa corpórea
Os valores médios da massa corpórea dos grupos experimentais estão
apresentados na Figura 8, semanalmente. No início dos experimentos (dia 0) não foi
observada diferença na massa corpórea entre os grupos (homegeneidade amostral
inicial; p>0,05) (Marcação A; Figura 8). Em todos os grupos foi observado aumento da
Resultados - 54
massa corpórea durante o seguimento dos animais. No entanto, esse ganho foi diferente
para cada grupo analisado sendo que, os animais diabéticos não ganharam massa na
mesma proporção que os animais controle (p<0,05). No trigésimo dia (Marcação B;
Figura 8) após administração de estreptozotocina ou solução de citrato os animais
diabéticos apresentaram massa corpórea inferior a dos animais controle (p<0,05). Ao
término dos experimentos, nos dias 44 (Marcação C; Figura 8) e 58 (Marcação D;
Figura 8) a diferença de massa corpórea entre os animais diabéticos e não diabéticos foi
ainda mais expressiva, mostrando a relação tempo-dependente entre diabetes e ganho de
massa corpórea [o ganho de massa corpórea dos animais não diabéticos foi muito maior
que dos animais diabéticos (82% versus 77%, respectivamente, p<0,05)]. Embora sem
diferença estatística, a terapia por vibração parece ter exercido influência no ganho de
massa corpórea nos animais diabéticos tratados, mas não nos animais do grupo controle.
A massa corpórea final do grupo DM+FRAT+TV apresentou um aumento de 7% (dia
44) e 16% (dia 58) quando comparado ao grupo DM sem tratamento.
Figura 9. Gráfico representando a evolução da massa corpórea dos animais durante o período
experimental. Não foi observada diferença estatística entre a massa corpórea dos animais no início dos
experimentos, dia 0 (A). Embora todos os animais tenham apresentado ganho de massa corpórea durante
o seguimento longitudinal do estudo (B= 30 dias; C= 44; D= 58 dias após indução de diabetes/placebo),
esse ganho foi superior (e tempo-dependente) nos animais do grupo controle que nos animais diabéticos.
4.2 Relação entre massa corpórea e glicemia
A Figura 10 apresenta gráficos de dispersão demonstrando a relação entre
glicemia e massa corpórea nos dias 30 (A), 44 (B) e 58 (C) após indução da diabetes ou
placebo. É possível observar que quanto maior o nível de glicemia, menor a massa
corpórea do animal.
Resultados - 55
Figura 10: Gráfico de dispersão correlacionando massa corpórea e nível de glicemia nos dias 30 (A), 44
(B) e 58 (C) após indução de diabetes ou placebo. É possível observar que quanto maior o nível de
glicemia, menor a massa corpórea do animal.
4.3 Análise macroscópica
As tabelas 2 e 3 apresentam medidas morfométricas de massa, comprimento e
perímetros (metáfise distal e diáfise) dos fêmures esquerdo (sem fratura óssea) e direito
(com fratura), respectivamente. É possível observar que a diabetes causou alterações
Resultados - 56
macroscópicas em fêmures com e sem fratura óssea, tanto no período de 44 como 58
dias.
Nos fêmures intactos (Tabela 1), a diabetes induziu redução dos parâmetros
massa, comprimento (apenas dia 44) e perímetro das metáfises e diáfises (p<0,05),
evidenciando possível perda de conteúdo mineral com alterações estruturais. A terapia
por vibração foi eficaz em aumentar a perimetria na metáfise distal dos fêmures de
animais diabéticos no dia 58 (p<0.05).
Tabela 1 – Medidas macroscópicas dos fêmures esquerdos (intactos): massa, comprimento e perímetros
(diáfise e metáfise distal). As letras indicam diferenças significativas (p<0,05).
Medidas macroscópicas dos fêmures esquerdos (média ± DP)
CON+FRAT DM DM+FRAT CON+FRAT+TV DM+FRAT+TV
44 dias
Massa óssea (g)
Comprimento (mm)
P. diáfise (mm)
P. metáfise (mm)
1,2±0,1
35,9±0,7
14,6±0,9
17,7±1,2
0,9±0,1a
33±1,5a
13±0,7a
17,1±1,8a
1±0,2a
33,8±1,7a
13,5±0,7a
17,2±1,9a
1,3±0,1
35,5±1,3
14,7±0,6
19,1±0,8
1,0±0,2
34,1±1,7
13,9±1,2
18,2±1,6
58 dias
Massa óssea (g)
Comprimento (mm)
P. diáfise (mm)
P. metáfise (mm)
1,4±0,18
36,4±2,37
15,1±1,05
18,2±2,10
1,0±0,17a
34,5±1,8
13,1±0,8a
15,2±1,4a
1,0±0,1a
34,4±2,1
13,4±0,1a
15,7±1,1a
1,4±0,35
36,4±1,33
15,5±2,15
17,6±2,30
1,3±0,3
35,1±2,0
14,1±1,2
17,9±1,9b
ap<0.05 vs CON+FRAT bp<0.05 vs DM+FRAT
Nos fêmures com fratura (Tabela 2), a diabetes parece ter induzido à formação
de calos ósseos com menor massa e perímetro embora sem diferença estatística
(p>0,05).
Tabela 2 – Medidas macroscópicas dos fêmures direitos (com fratura óssea): massa, comprimento e
perímetros (diáfise e metáfise distal).
Medidas macroscópicas dos fêmures direitos (média ± DP)
CON+FRAT DM DM+FRAT CON+FRAT+TV DM+FRAT+TV
44 dias
Massa óssea (g)
Comprimento (mm)
P. diáfise (mm)
1,8±0,2
34,8±1,3
23,9±2,0
1,0±0,3
32,9±1,4
12,8±0,9
1,3±0,1
34,1±2,4
20±0,5
1,6±0,3
33,5±2,4
25,1±3,6
1,3±0,3
32,9±2,7
23,4±4,2
Resultados - 57
P. metáfise (mm) 19,4±2,9 16,2±1,7 18,7±1,7 20,2±1,5 20,0±2,2
58 dias
Massa óssea (g)
Comprimento (mm)
P. diáfise (mm)
P. metáfise (mm)
1,8±0,4
35,2±2,1
25,1±4,7
18,7±2,4
1,1±0,2
34,5±1,7
13±1,0
15±1,6
1,4±0,4
33,6±1,9
23,5±4,9
17,9±2,1
1,7±0,4
33,5±3,4
25,2±3,2
21,1±3,0
1,5±0,4
34,6±2,5
22,6±4,3
19,3±2,2
4.4 Análise densitométrica
A figura 11 mostra a comparação da densidade mineral óssea (DMO) e conteúdo
mineral ósseo (CMO) nas metáfises distais dos fêmures esquerdo (intactos, sem fratura).
É possível observar que os animais diabéticos (58 dias) sem tratamento (DM e
DM+FRAT) apresentaram menores valores de DMO e CMO que os animais controle
(CON+FRAT) (p<0,05). Não houve diferença entre os grupos DM e DM+FRAT
(p>0,05). Embora a terapia por vibração não tenha exercido efeito na massa óssea dos
animais diabéticos, ela exerceu efeito negativo na densidade óssea (DMO) dos animais
controle observados por 58 dias (p<0,05).
Figura 11: Comparação da densidade mineral óssea (DMO) e do conteúdo mineral óssea (CMO) entre os
grupos. O período de 58 dias de diabetes resultou valores significativamente inferiores de DMO e CMO
em comparação aos animais controle. A presença de asterisco indica diferença estatística (p<0,05).
A figura 12 mostra a comparação da DMO, CMO e área do calo ósseo em cada
grupo, nos dois períodos de segmento pós-operatório de estabilização dos fragmentos
ósseos. Aos 14 dias de pós-operatório, o CMO e a área dos calos ósseos dos animais
diabéticos foram significativamente inferiores aos valores observados nos animais do
grupo controle (p<0,05). Por outro lado, a terapia por vibração aumentou
significativamente o CMO e a área nos ratos diabéticos (p<0,05), mas não no grupo
Resultados - 58
controle tratado. No período de 28 dias pós-fratura, a DMO e o CMO diminuíram
significativamente nos animais diabéticos em relação ao grupo controle (p<0,05).
Figura 12: Comparação da DMO, CMO e área do calo ósseo entre os grupos. A diabetes reduziu tanto a
densidade (DMO e CMO) como a área do calo ósseo neoformado no período de 14 das após a fratura
óssea. No período de 28 dias após a fratura a DMO e o CMO persistiram reduzidos nos animais
diabéticos em comparação aos controles. A terapia por vibração foi eficaz em aumentar o CMO e a área
do calo ósseo dos animais diabéticos tratados. A presença de asterisco indica diferença estatística
(p<0,05).
4.5 Análise da microarquitetura óssea µCT
4.5.1 Análise da microarquitetura trabecular
As figuras 13 e 14 mostram que, no período de 44 dias de diabetes sem
tratamento foi observada deterioração importante da microarquitetura trabecular
(p>0,05), com redução de 67% em BV, 71% em BV/TV, 49% em Tb.N, 20% em Tb.Th
e 65% em Conn.D, além do aumento de 35% em Tb.Sp. A terapia por vibração não
exerceu efeito sobre a microarquitetura trabecular dos ossos dos animais diabéticos. No
entanto, a terapia apresentou resultado negativo (p<0,05) nos animais controle (redução
de 84% em BV, 85% em BV/TV e de 25% em TbTh, além do aumento de 51% em
TbSp). No período de 58 dias de diabetes sem tratamento foi observada redução de 23%
na DTT, 70% em BV, 69% em BV/TV, 49% em Tb.N, 9% em Tb.Th e 59% em
Conn.D, além de aumento de 49% em Tb.Sp (p<0,05). A terapia por vibração exerceu
efeito positivo nos ossos de animais diabéticos tratados por 28 dias (p<0,05), com
aumento de 625% em BV, 1016% em BV/TV e 171% em Conn.D, além de diminuição
de 38% em TbSp. Por outro lado, os efeitos negativos da terapia por vibração em ratos
controle persistiram no período de 58 dias de acompanhamento dos animais, com
redução de 70% em BV e de 69% em BV/TV (p<0,05).
Resultados - 59
Figura 13: Microarquitetura trabecular da metáfise femoral mostrando redução expressiva de tecido
trabecular nos ratos diabéticos não tratados (DM+FRAT) em comparação com animais controle
(CON+FRAT), tanto no período de 44 como 58 dias pós-indução. No período de 58 dias após indução de
diabetes, a terapia por vibração foi eficaz em minimizar as alterações deletérias decorrentes da
hiperglicemia. No entanto, a terapia por vibração exerceu efeito negativo na microarquitetura trabecular
dos ossos dos animais controle.
Figura 14: Análise quantitativa da microarquitetura óssea trabecular. A diabetes resultou em deterioração
dos parâmetros quantitativos referentes à microestrutura trabecular, sendo mais expressiva no período de
58 dias (tempo-dependente). Embora a terapia por vibração tenha exercido efeito positivo na
microarquitetura trabecular dos animais diabéticos, ela resultou em efeito negativo nos ossos de ratos
controle tratados. Os asteriscos indicam diferença estatística significativa (p<0,05).
4.5.2 Análise da microarquitetura do osso cortical
As figuras 15 e 16 mostram que a diabetes não exerceu efeito significativo na
microarquitetura cortical durante os seguimento de 44 e 58 dias. No entanto, a terapia
por vibração resultou em redução do volume cortical (Ct.V e Ct.BV/TV) tanto nos
Resultados - 60
animais controle como nos animais diabéticos (p<0,05) seguidos por 44 dias. No
período de 58 dias não houve diferença estatística entre os grupos experimentais.
Figura 15: Microarquitetura cortical da diáfise femoral mostrando redução de tecido cortical nos ratos
diabéticos não tratados (DM+FRAT) em comparação com animais controle (CON+FRAT). Diferente do
tecido trabecular, as alterações na microestrutura do osso cortical não foram amenizadas pela terapia por
vibração (DM+FRAT+TV).
Figura 16: Análise quantitativa da microestrutura do osso cortical. Diferente do observado no tecido
trabecular, a diabetes não alterou a microarquitetura cortical na mesma magnitude que afetou as rabéculas
ósseas. Além disso, a terapia por vibração exerceu efeito negativo no córtex de ratos diabéticos e controle.
Os asteriscos indicam diferença estatística significativa (p<0,05).
4.5.3 Microarquitetura do calo ósseo
A diabetes afetou negativamente a formação do calo ósseo reduzindo o volume
do calo em 81% (p<0,05) quando comparado ao grupo controle no período de 14 dias
pós-fratura (Figuras 17 e 18). Além disso, não só o CV foi menor nos ratos diabéticos,
como também a mineralização (69%, p<0,05). Contudo, a terapia por vibração parece
ter sido eficaz em minimizar os efeitos deletérios da diabetes na formação do calo
ósseo, aumentando o volume em 52% (p>0,05). Quanto aos animais controle, a terapia
Resultados - 61
por vibração reduziu o volume do calo ósseo em 50% (p<0,05). No período de 28 dias
pós-fratura não foi observada diferença estatística entre os grupos.
Figura 17: Imagens do calo ósseo obtidas pelo µCT, tanto no plano sagital, como transversal. No período
de 14 dias após a fratura, a diabetes (DMO) induziu redução da neoformação óssea, com calo ósseo de
menor volume e mineralização que nos grupos controle. Embora a terapia por vibração tenha se mostrado
parcialmente eficaz em aumentar o volume do calo ósseo nos animais diabéticos, ela reduziu o volume do
calo nos animais controle.
Figura 18: Análise quantitativa da microestrutura do calo ósseo. A diabetes reduziu o volume e a
mineralização do calo ósseo. A terapia por vibração parece ter exercido efeito positivo em aumentar o
volume e mineralização do calo ósseo de animais diabéticos, mas não nos animais controle. Os asteriscos
indicam diferença estatística significativa (p<0,05).
4.6 Microscopia ótica
Resultados - 62
Após 14 dias da fratura óssea, os ratos controle apresentaram calo ósseo formado
por tecido cartilaginoso e trabéculas recém-formadas (Figura 19), abundante deposição
de colágeno (Figura 20), e baixa atividade osteoclástica (Figura 21). Os ratos diabéticos,
no entanto, mostraram apenas tecido conjuntivo com fibroblastos (Figura 19), pouca
deposição de colágeno (Figura 20), e intensa atividade osteoclástica (Figura 21). Esse
atraso no processo de consolidação óssea persistiu até o período de 28 dias pós-fratura.
Os animais do grupo controle apresentaram calo ósseo composto de trabéculas muito
organizadas, espessas e compactadas (Figura 19), associadas à atividade osteoclástica
durante fase de remodelação da consolidação óssea (Figura 21). Nos ratos diabéticos foi
possível observar apenas trabéculas finas, desorganizadas e dispersas (Figura 19), com
pouca atividade osteoclástica (Figura 21).
A terapia por vibração foi um meio importante para acelerar a consolidação
óssea nos ratos diabéticos. No período de 14 dias pós-fratura, os ratos diabéticos
treinados apresentaram calo ósseo com tecido cartilaginoso, trabéculas recém-formadas
e deposição de colágeno ao invés de apenas tecido conjuntivo, como nos animais
diabéticos sem tratamento. Esse efeito osteogênico persistiu até o período de 28 dias
após a fratura. As trabéculas dos ratos diabéticos tratados são mais espessas,
organizadas e compactadas que nos ratos diabéticos sem tratamento. Além disso, foi
observada maior deposição de colágeno e atividade osteoclástica nesses animais. No
entanto, o efeito osteogênico da terapia por vibração não foi observado nos animais
treinados do grupo controle. Ao contrário, a terapia por vibração nos animais controle
induziu aumento na atividade osteoclástica no período de 14 dias pós-fratura, o que é
uma característica indesejada e corrobora os achados microtomográficos.
Resultados - 63
Figura 19: Lâminas histológicas de fêmures fraturados corados com HE em ampliações de 12,5; 50 e
200x. A diabetes induziu atraso na proliferação e diferenciação celular durante a cicatrização da fratura.
Aos 14 dias pós-fratura, os ratos controle apresentaram calo ósseo formado por trabéculas, enquanto os
ratos diabéticos apenas apresentavam tecido conjuntivo. O atraso persistiu na fase posterior da
cicatrização (28 dias pós-fratura), em que os ratos controle apresentavam trabéculas compactadas
formando calo ósseo maduro, e os ratos diabéticos apenas apresentavam trabéculas finas e espaçadas. A
terapia por vibração acelerou a diferenciação celular durante a cicatrização de fraturas em ratos diabéticos
em ambos os estágios, mas não provocou alterações na cicatrização óssea normal.
Figura 20: Lâminas histológicas de fêmures fraturados coradas com solução Picro-Sirius, com ampliação
de 12,5x. A deposição de colágeno nos calos ósseos de ratos diabéticos foi significativamente menor que
nos ratos controle. A terapia por vibração aumentou a deposição de colágeno em calos ósseos de ratos
diabéticos, mas não em ratos não diabéticos.
Resultados - 64
Figura 21: Lâminas histológicas de fêmures fraturados coradas com solução TRAP, com ampliação de
12,5x. A diabetes induziu aumento na atividade osteoclástica 14 dias após a fratura e a reduziu no período
de 28 dias. A terapia de vibração aumentou a atividade osteoclástica nos calos ósseos de ratos diabéticos
28 dias pós-fratura.
4.7 Análise dos marcadores de formação e reabsorção óssea (ELISA)
A Tabela 3 mostra a comparação dos níveis séricos sistêmicos dos marcadores
de formação (IGF-1) e reabsorção óssea (RANK e CTX-I). O nível sérico de IGF-I
circulante foi significativamente inferior nos ratos diabéticos (-93%, p<0,05) quando
comparado ao controle. No entanto, a terapia por vibração foi eficaz em elevá-lo em
839% (p<0,05). O nível sérico de CTX-I aumentou em 1385% nos animais diabéticos
(p<0,05). A terapia por vibração diminuiu o nível de RANK em 19% nos animais
diabéticos e em 20% nos animais do grupo controle (p>0,05).
Tabela 3 – Níveis séricos de IGF-1, RANK e CTX-I. A diabetes induziu redução expressiva no nível
sérico de IGF-1 (formação óssea), mas foi parcialmente revertida pela terapia por vibração. Quanto aos
marcadores de reabsorção óssea, a diebates induziu aumento expressivo nos níveis de CTX-I. As letras
indicam diferenças significativas (p<0,05).
Nível circulante de IGF-1, RANK and CTX-I (pg/ml) (média ± DP)
CON+FRAT DM+FRAT CON+FRAT+TV DM+FRAT+TV
IGF-1 3014.35±826.48 246.04±181.38a 1822.56±962.34 1889.54±652.13b
Resultados - 65
RANK
CTX-I
445.35±126.89
149.19±49.12
453.01±98.37
623.29±170.71a
346.46±48.86a
419.56±91.49a
366.43±79.73b
692.89±158.73
ap<0.0001 vs CON+FRAT bp<0.03 vs DM+FRAT
Discussão
Discussão - 67
5 DISCUSSÃO
Diabetes e osteoporose são duas condições de grande interesse mundial que se
inter-relacionam. Além disso, a incidência de ambas condições tem aumentado
significativamente em todo o mundo nas últimas décadas. Em 2015, 442 milhões de
pessoas foram diagnosticadas com diabetes. Além disso, 1,5 milhões de indivíduos
diabéticos morrem a cada ano diretamente devido às complicações da diabetes
(Organization, 2016a).
Nosso estudo abordou os efeitos da diabetes na qualidade óssea de fêmures
intactos, sem fratura e também na qualidade da consolidação de fêmures fraturados.
Além disso, a terapia por vibração foi utilizada como recurso terapêutico para
minimizar e até reverter as perdas tanto na qualidade do tecido ósseo intacto como na
qualidade do processo de consolidação após fratura.
5.1 Relação entre diabetes, qualidade óssea e terapia por vibração
A relação entre diabetes e deterioração da qualidade óssea tem sido largamente
estudada na literatura científica mundial (Herbsman et al., 1968; Macey et al., 1989;
Beam et al., 2002; Urabe et al., 2003; Follak et al., 2004; Diniz et al., 2008; Ogasawara
et al., 2008; Al-Zube et al., 2009; Azad et al., 2009; Kidder et al., 2009; Wang et al.,
2012). Diversos autores observaram redução da massa óssea (Korres et al., 2013),
resistência mecânica (Kayal et al., 2009; Korres et al., 2013), além de alterações
celulares e genéticas (Diniz et al., 2008; Kayal et al., 2009; (Krakauer et al., 1995) em
ossos de indivíduos e animais diabéticos.
No presente estudo verificamos o efeito da diabetes nas medidas macroscópicas
do fêmur, na densidade óssea e na microarquitetura trabecular e cortical. Por meio das
análises experimentais desenvolvidas observamos que a diabetes resultou em redução
significativa tanto na densidade como no conteúdo mineral óssea, além de deterioração
óssea macroscópica (massa, comprimento e perimetria) e microscópica tanto do osso
trabecular (volume, espessura, espaçamento trabecular, conectividade intertrabecular e
densidade tecidual trabecular). O osso cortical, por outro lado, não foi afetado pela
diabetes na mesma intensidade em que o osso trabecular. Além disso, observamos que
essas alterações são tempo e glicemia-dependentes. Ou seja, quanto maior o tempo de
diabetes pior será a qualidade do tecido ósseo. Da mesma forma, quanto menor o
Discussão - 68
controle glicêmico, ou seja, quanto maior o valor de glicemia, maior será a deterioração
óssea.
Por outro lado, há diversos recursos para minimizar as alterações ósseas
decorrentes da diabetes, desde controle glicêmico com insulina, até medicamentos
estimuladores da formação óssea e recursos físicos e mecânicos com o objetivo de
reduzir a perda de massa óssea e estimular o trofismo ósseo (Follak et al., 2004; Al-
Zube et al., 2009).
Atualmente, é reconhecida a importância da mecanotransdução como
coadjuvante na prevenção de perda de massa óssea (Xie et al., 2008). Stuermer et al.
observaram que a terapia por vibração resultou em melhoras expressivas na qualidade
de ossos osteopênicos de ratas ovariectomizadas (Stuermer et al., 2010). No entanto,
resultados semelhantes não foram observados nos ossos dos animais do grupo controle.
Ou seja, a ação osteogênica da terapia por vibração parece ser dependente da qualidade
óssea, ou seja, ela ocorre em situações onde a perda de massa óssea está instalada. Neste
estudo utilizamos a terapia por vibração como recurso terapêutico para contra-atacar os
efeitos da diabetes na qualidade óssea. Estudos prévios observaram resultados positivos
com relação à prevenção e tratamento da perda de massa (Rubin et al., 2004) em
diferentes condições osteometabólicas, como osteopenia após ovariectomia bilateral
(Shi et al., 2010), osteoporose por desuso devido lesão completa da medular espinhal
(Zamarioli et al., 2013; Zamarioli et al., 2014) e suspensão do rato pela cauda (Falcai et
al., 2015). No entanto, nenhum estudo foi encontrado no qual a terapia por vibração foi
utilizada como método preventivo e terapêutico da perda de massa óssea pós-diabetes.
Em nosso estudo observamos que a terapia por vibração foi eficaz em aumentar
a massa óssea e parâmetros microestruturais, como volume trabecular e
interconectividade entre as trabéculas, além de reduzir o espaçamento entre as
trabéculas. Por outro lado, a terapia por vibração não apresentou o mesmo potencial
osteogênico nos ossos de animais controle, corroborando os achados de outros autores.
(Stuermer et al., 2010). Em algumas análises o tratamento com terapia por vibração teve
efeito contrário ao desejado e piorou a qualidade óssea, reduzindo a densidade mineral
óssea, o volume e a espessura trabecular, além de ter aumentado o espaçamento entre as
trabéculas.
5.2 Relação entre diabetes, consolidação óssea e terapia por vibração
Discussão - 69
Vários estudos em humanos (Montagnani et al., 2011b; Kim et al., 2012a) e
investigações experimentais (Herbsman et al., 1968; Macey et al., 1989; Follak et al.,
2004; Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008; Al-Zube et al., 2009; Azad et al.,
2009; Wang et al., 2012) têm documentado a associação entre diabetes e o atraso na
consolidação óssea. Na consolidação óssea normal, quatro fases distintas são
imprescindíveis para que o reparo do tecido ósseo seja concluído: inflamação, formação
calo ósseo mole, formação calo ósseo duro e remodelação (Fazzalari, 2011; Junqueira e
Carneiro, 2013; Sathyendra e Darowish, 2013) (Elias, 2013). Durante a fase
inflamatória, há a formação de hematoma entre os fragmentos ósseos, que libera
múltiplos fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF) e fator de transformação do crescimento beta (TGF-b) (Al-Zube et al., 2009;
Sathyendra e Darowish, 2013).
Embora o mecanismo exato responsável pelo atraso da consolidação ou pela não
união de fraturas em animais e humanos diabéticos ainda não esteja completamente
elucidado, a diabetes está associada à redução na proliferação celular, deposição de
colágeno, e propriedades mecânicas (Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008; Kayal
et al., 2009; Chen e Wang, 2014). Estudos recentes em ratos diabéticos mostraram
respostas biológicas inadequadas na fase inicial da consolidação óssea, com diminuição
dos níveis de PDGF, TGF-b, IGF-1 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
no local da fratura (Al-Zube et al., 2009). Tais distúrbios na cascata de sinalização dos
fatores de crescimento resultam em proliferação e diferenciação prejudicada das células
mesenquimais em osteoblastos, bem como diminuiu a angiogênese (Diniz et al., 2008).
Em nosso estudo, observamos que os ratos diabéticos apresentaram diminuição dos
níveis de IGF-1 associado a aumento dos níveis de CTX-I circulante, o que pode ter
resultado em diminuição na deposição de colágeno e atraso na diferenciação de células
ósseas que formam o calo ósseo 14 dias após a fratura. Nessa fase era esperado que o
calo ósseo fosse formado por tecido cartilaginoso e osso trabecular imaturo. No entanto,
o calo ósseo nos animais diabéticos foi formado principalmente por tecido conjuntivo.
Esse atraso na diferenciação celular também foi observado 28 dias após a fratura. Na
consolidação normal, o calo ósseo deveria ser formado principalmente por trabéculas
espessas e compactadas. Em nosso estudo observamos que a diabetes resultou em
formação de calos ósseos como menor densidade óssea, além de menor volume e
mineralização. Consequentemente, o calo ósseo dos animais diabéticos são menos
densos e mais fracos. Deste modo, a busca por modalidades terapêuticas com
Discussão - 70
capacidade de reverter o comprometimento na consolidação óssea tem sido muito
almejada por pesquisadores do mundo todo.
Estudos recentes avaliaram os efeitos da terapia por vibração na melhora da
consolidação óssea em ratos com severos distúrbios osteometabólicos (Shi et al., 2010;
Stuermer et al., 2010; Chow et al., 2011; Komrakova et al., 2013; Chung et al., 2014;
Chow et al., 2016; Komrakova et al., 2016; Wei et al., 2016). Alguns estudos
observaram que a terapia por vibração apresentou melhora na consolidação de fraturas
em ossos de ratos (Stuermer et al., 2010; Komrakova et al., 2013). No entanto, os
autores utilizaram o modelo de perfuração óssea, em que não há formação de calo ósseo
por ossificações endocondral e intramembranosa. Até agora nenhum estudo foi
realizado investigando os efeitos da terapia por vibração na consolidação de ratos
diabéticos. Weinheimer et al. observou um importante efeito angiogênico da terapia por
vibração na cicatrização de feridas em camundongos com diabetes (Weinheimer-Haus
et al., 2014). Com isso, nós hipotetizamos que esse estímulo mecânico associado aos
distúrbios sensório-motor devido às ondas de vibração pode não apenas acelerar a
consolidação óssea em ratos controle, mas também melhorar e até mesmo normalizar a
consolidação óssea em ratos diabéticos.
No presente estudo, observamos que as células proliferativas no calo ósseo
foram significativamente superiores nos ratos diabéticos tratados com terapia por
vibração do que nos animais diabéticos sem tratamento. A terapia por vibração
aumentou o nível de IGF-1 circulante; associado à redução nos níveis de RANK, o que
pode explicar o aumento de células proliferativas na condrogênese, formação trabecular,
e deposição de colágeno no calo ósseo dos ratos diabéticos, que estão associados com
aumento da mineralização e volume. Ao contrário, a terapia por vibração parece não ter
acelerado e pode até ter prejudicado a consolidação óssea em ratos controle.
É do nosso conhecimento que esse estudo é o primeiro a investigar os efeitos da
terapia por vibração tanto na qualidade de ossos intactos como na consolidação óssea de
ossos fraturados de ratos diabéticos. Nossos resultados indicaram que a terapia por
vibração amenizou significativamente os efeitos deletérios da diabetes na qualidade do
tecido ósseo e na consolidação óssea. No entanto, efeitos osteogênicos não foram
observados nos ossos e calos ósseos de ratos controle.
Conclusões
Conclusões - 72
6 CONCLUSÕES
Todas as análises realizadas neste estudo demonstraram redução significativa da
qualidade óssea dos fêmures intactos (sem fratura) de ratas diabéticas. Da mesma forma,
a consolidação óssea também foi negativamente afetada pela diabetes, com atraso na
formação de calo ósseo pós-fratura.
A terapia por vibração foi parcialmente eficaz em minimizar os efeitos deletérios
da diabetes tanto no osso intacto como na formação do calo ósseo. Resultado
semelhante não foi observado nos ossos de animais controle submetidos ao mesmo
tratamento.
Conclui-se que a diabetes em ratas causou intensa deterioração da estrutura e do
metabolismo ósseo, que foram minimizados e até revertidos por meio da terapia por
vibração.
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Anexo
Anexo - 80
Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais FMRP-USP
Manuscrito
Manuscrito - 82
Vibration therapy as an effective approach to improve and accelerate bone healing
in diabetic rats
Maysa de Souza Campos¹, PT; José Batista Volpon¹, PhD; Ana Paula Franttini¹, PE;
João Paulo Bianchi Ximenez2, MSc; Manoel Damião Sousa-Neto², PhD; Raquel
Assed Silva², PhD; Ariane Zamarioli¹, PhD.
¹ School of Medicine of Ribeirão Preto - University of São Paulo, Brazil.
² School of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto - University of São Paulo,
Brazil.
3 School of Dentistry of Ribeirão Preto of Ribeirão Preto - University of São Paulo,
Brazil.
Short title: Vibration improves bone calluses in diabetic rats
Correspondence: Ariane Zamarioli, School of Medicine of Ribeirão Preto
Av. Bandeirantes, 3900. Ribeirão Preto, SP, Brazil. 14049-900.
Telephone: +55 16 33153272, Fax: +55 16 33153272.
E-mail: [email protected]
Keywords: Diabetes Mellitus, Vibration, Fracture healing, Bony callus.
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Abstract: Objective: to investigate the effects of vibration therapy on fracture healing
in diabetic and control rats.
Design: Experimental study.
Methods: A total of 112 female Wistar rats were assigned to four groups: (1) SHAM,
(2) sham with vibration therapy (SHAM+VT), (3) diabetes mellitus (DM), and (4)
DM+VT. Diabetes was induced with a single intravenous injection of streptozotocin.
Thirty days after diabetes induction, animals underwent bone fracture at the right mid-
femur, followed by surgical stabilization of bone fragments. Three days after bone
fracture, rats began vibration therapy (VT). On days 14 and 28 post-fracture, the rats
were euthanized, blood was collected for serum bone marker analysis, and the femurs
were collected for dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), micro-computed
tomography (μCT) and histological analysis.
Results: Diabetes led to a dramatic impairment of bone healing, causing a delay in cell
proliferation; reductions of 17% in bone mineral density (BMD), 81% in callus volume
(CV), 69% in the mineralization of the bone callus, and 93% in insulin-like growth
factor I (IGF-1); and a 1385% increase in serum C terminal telopeptide of type 1
collagen (CTX-I) levels. VT augmented osteogenic and chondrogenic cell proliferation
at the fracture callus; increased circulating IGF-1 by 839%, receptor activator of nuclear
factor kappa beta (RANK)-L by 19%, CV by 52%, bone mineral content (BMC) by
90%, and callus area by 72%; and was associated with a 19% reduction in circulating
RANK-L.
Conclusions: Diabetes had detrimental effects on bone healing. Vibration therapy was
very effective at counteracting the significant disruption in bone repair induced by
diabetes but did not improve fracture healing in control rats. The mechanical stimulus
not only improved bone callus quality but also partially restored the serum levels of
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IGF-1 and RANK, inducing bone formation and mineralization, thus creating conditions
for adequate fracture repair.
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1. Introduction
Diabetes is a chronic metabolic disease, with a high prevalence worldwide, that
leads to several systemic complications (Kayal et al., 2009). Recently, strong
relationships between diabetes and poor bone quality have been reported in
experimental animals (Korres et al., 2013). Diabetes decreases bone formation due to
reductions in the expression and differentiation of genes and proteins, such as
osteocalcin, alkaline phosphatase, and osteoprotegerin (OPG) (Motyl e Mccabe, 2009).
Moreover, diabetes has also been associated with increased bone resorption by
augmenting tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), receptor activator of nuclear
factor kappa beta (RANK), serum C terminal telopeptide of type 1 collagen (CTX),
sclerostin, and cathepsin K levels (Motyl e Mccabe, 2009; Fazzalari, 2011).
Diabetic individuals have a high risk of bone fracture due to imbalanced bone
metabolism (Krakauer et al., 1995). Bone fracture is an event that heals physiologically
but requires a normal bone microenvironment. Thus, it is not surprising that diabetes
leads to disruption in bone healing (Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008). Several
authors have reported delayed bone healing in diabetic humans (Montagnani et al.,
2011b; Kim et al., 2012b) and animals (Al-Zube et al., 2009; Azad et al., 2009; Wang
et al., 2012). The main mechanism is yet to be determined; however, several pathways
have been proposed to explain the higher incidence of delayed or non-healing in
diabetic individuals, including reduced blood flow and angiogenesis, an exaggerated
inflammatory response, reduced collagen synthesis, and metabolic imbalance between
the activity of osteoblasts and osteoclasts in bone (Diniz et al., 2008).
Several strategies are used to treat bone healing disorders. Non-invasive
techniques based on mechanotransduction principles may be of great importance in
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improving bone cell activity. The recent description of the osteogenic effect of vibration
therapy has shown it to be a promising avenue for improving bone callus formation in
osteoporotic rats (Leung et al., 2009; Shi et al., 2010). Some authors have studied the
effects of vibration therapy on bone loss (Rubin et al., 2004; Gilsanz et al., 2006; Leung
et al., 2009; Shi et al., 2010), but to our knowledge, the present study is the first
conducted in diabetic rats with bone fracture. The purpose of this study was to
investigate the effects of vibration therapy on the bone healing of experimental fractures
in control and diabetic rats. We hypothesize that vibration therapy can not only
accelerate bone healing in control rats but also improve and even normalize the union in
diabetic rats.
2. Methods
2.1 Animals and experimental groups
The experimental protocol was approved by the Institutional Animal Care and
Use Committee of the School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
(protocol 201/2014).
All animals were obtained from the central animal facility of the institution.
Female Wistar rats weighting approximately 200 g were housed in cages in a room with
controlled conditions of humidity, temperature (23±1°C) and an artificial light/dark
cycle of 12 hours. The experimental procedures were started after a three-day-interval to
allow adaptation to the laboratory environment. Animals had free access to tap water
and pellet chow.
A total of 112 rats were assigned to four groups (n=28/group): (1) SHAM:
weight-matched control rats, (2) SHAM+VT: control rats treated with vibration therapy,
(3) DM: type 1 diabetic rats, and (4) DM+VT: diabetic rats treated with vibration
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therapy. Each group was subdivided into two subgroups according to the post-operative
follow-up (14 and 28 days), which represented two distinct phases of normal bone
healing, soft and hard bone callus formation, respectively (Kayal et al., 2009; Fazzalari,
2011).
2.2 Diabetes induction
DM and DM+VT rats received a single intravenous injection of streptozotocin to
induce diabetes. Control rats were injected with citrate buffer alone. Diabetes was
diagnosed based on blood glucose concentrations (≥250 mg/dL on two consecutive
days) (Follak et al., 2004).
2.3 Closed femoral fracture
Thirty days after diabetes induction (or buffer injection), the animals were
anesthetized, and a closed bone fracture was produced in the right mid-femur. Then, a
surgical procedure with a 1-mm-diameter Kirschner wire introduced in the
intramedullary space was conducted to stabilize the bone fragments. The status of the
fracture fixation was radiographically confirmed immediately after surgery and then
followed-up weekly (Urabe et al., 2003; Ogasawara et al., 2008).
2.4 Whole-body vibration therapy
Three days after bone fracture, DM+VT rats and their age-matched controls
(SHAM+VT) were subjected to whole-body vibration therapy. For this therapy, rats
were placed in a single, special cage on a vibrating platform with a peak-to-peak
vertical displacement of 1 mm at a frequency of 50 Hz. Therapy was performed three
days per week for 20 minutes for 14 and 28 days, depending on the experimental
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follow-up period.
On days 14 or 28 post-fracture, the rats were euthanized, blood was collected for
serum bone marker analysis, and the fractured femurs were harvested in preparation for
dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) assessment, micro-computed tomography
(μCT), and histological analysis.
2.5 Serum marker assessment (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
Serum samples stored at -80°C were used for the determination of insulin-like
growth factor I (IGF-1), RANK and CTX-I levels by ELISA as indicated by the
manufacturer (Boster Immuno Leader and MyBioSource, USA). The intra-assay
variation coefficients were 5.3% for IGF-1, 5.5% for RANK, and <15% for CTX-I.
2.6 DXA
Analysis was performed immediately following sacrifice using DXA with a
Lunar DPX-IQ densitometer (Lunar; software version 4.7e, GE Healthcare, United
Kingdom). The entire femur was scanned, but the bone mineral density (BMD), bone
mineral content (BMC), and area were only assessed over the full extent of the callus.
The scanning reproducibility (4%) was assessed by the root mean square coefficient of
variation.
2.7 μCT
After DXA assessment, femurs were scanned using a μCT device (SkyScan
1174v2; Bruker-microCT, Belgium) at 50 kV using a 0.5-mm-thick aluminum filter to
optimize the contrast, a 360° rotation step of 1°, three-frame averaging, and an isotropic
resolution of 26.7 μm. Images of each specimen were reconstructed with specific
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software (NRecon v.1.6.3). The fracture callus was analyzed using CT scan software
(CTAn v.1.15.4) to determine the total callus volume (CV, in mm3), and the woven
bone fraction, which was expressed as a percentage of the callus volume and interpreted
as the callus mineralization.
2.8 Histological analysis
Seven femurs from each group were casually selected for histological analysis.
The entire fractured femur with a small quantity of adherent soft tissue was fixed in cold
4% paraformaldehyde, decalcified in cold 10% EDTA, embedded in paraffin, sectioned
at 5 μm, and placed on charged slides (Manco Inc., USA). Coronal sections were
stained with hematoxylin and eosin (HE). Adjacent sections were stained with TRAP to
identify mature osteoclasts and with Sirius red solution for collagen identification.
Sections were analyzed under bright field microscopy (Axiovert; Carl Zeiss, Germany),
and images were captured with a CCD camera (AxioCam MRc; Carl Zeiss, Germany)
in the region of the bone callus, with magnifications of 12.5, 50, and 200x.
2.9 Statistical analysis
Continuous variables were expressed as the means and standard deviations (SD).
The results obtained in the four groups were compared using Kruskal-Wallis one-way
analysis of variance, followed by Dunn’s post hoc test, and the results are shown as the
geometric mean and 95% confidence interval. p values less than 0.05 were considered
statistically significant. All statistical analyses were performed with RStudio 0.99.902
(RStudio, Inc., USA).
3. Results
Manuscrito - 90
3.1 Complications and mortality
After the streptozotocin injection, 18% of the animals were not diagnosed with
diabetes and were discarded. Seven percent of diabetic animals died or were euthanized
due to complications from diabetes (i.e., accentuated weight loss, vision deterioration,
and poor general health). Of the total number of animals subjected to bone fracture,
40% died or had to be euthanized due to the surgical procedure; 8% were euthanized
during anesthesia, 16% were euthanized due to the excessive comminution of fracture
fragments, and 16% were euthanized in the post-operative period due to K-wire
loosening.
3.2 Reduction in body mass after diabetes
Upon study entry (day 0), the body mass was similar among all groups (p>0.05).
All rats gained weight during the observation period. However, diabetic rats gained less
weight than sham rats. Thus, the final body weight of the diabetic rats was significantly
lower than sham rats (p<0.05). Vibration seemed to influence body mass gain in
diabetic trained rats, but not in sham animals; the final body masses of the diabetic
trained rats were 7% and 16% higher than in non-trained diabetic rats at 14 or 28 days
after fracture, respectively (p<0.05) (Figure 1).
3.3 Serum marker assessment
The level of circulating IGF-1 was significantly reduced in diabetic rats (-93%,
p<0.05). However, vibration therapy significantly increased the IGF-1 level by 839%
(p<0.05). The CTX-I level was increased by 1385% in diabetic rats. Vibration therapy
significantly decreased the RANK-L level by 19% in diabetic rats. Vibration therapy
Manuscrito - 91
also decreased the RANK-L level by 20% in the sham rats, but without statistical
significance (Table 1).
3.4 Diabetes decreased bone callus density, content and area (DXA assessment)
Figure 2 shows a comparison of BMD (2A), BMC (2B), and area (2C) of the
bone callus for each group in both post-operative follow-ups. At 14 days post-fracture,
diabetic animals had significantly lower BMC and area than sham animals (p<0.05).
Vibration therapy significantly increased the BMC and area in diabetic rats (p<0.05),
but not in controls. At 28 days post-fracture, diabetic animals had significantly lower
BMD and BMC than sham animals (p<0.05).
3.5 Bone callus microarchitecture is severely impaired by diabetes (μCT assessment)
Diabetes negatively affected bone callus formation by reducing its volume by
81% compared to the callus in control rats at 14 days after fracture (Figure 3).
Furthermore, not only was the CV smaller in diabetic rats, but it was also less
mineralized (69%) (although p=0.2). However, vibration therapy seemed to be effective
in mitigating the deleterious effects of diabetes on bone callus formation by increasing
its volume by 52% (p>0.05). Such osteogenic effects of vibration therapy were not
observed in the trained control rats.
3.6 Bone callus formation is delayed by diabetes (histology)
At 14 days after bone fracture, control rats showed a bone callus formed by
cartilaginous tissue and newly formed trabeculae (Figure 4), abundant collagen
deposition (Figure 5A), and low osteoclastic activity (Figure 5B). Diabetic rats,
however, exhibited only connective tissue with fibroblasts (Figure 4), little collagen
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deposition (Figure 5A), and intense osteoclastic activity (Figure 5B). This delay in the
healing process persisted at 28 days after bone fracture. Control rats displayed a bone
callus composed of very organized, thick, and dense trabeculae (Figure 4), which are
associated with high osteoclastic activity and represent the remodeling phase of bone
healing (Figure 5B). Diabetic rats only showed thin, unorganized, and disperse
trabeculae (Figure 4), with little osteoclastic activity (Figure 5B).
Vibration therapy was an important path to accelerate bone healing in diabetic
rats. Within 14 days of bone fracture, trained diabetic rats exhibited a bone callus with
cartilaginous tissue, newly formed trabeculae, and collagen deposition (Figures 4 and
5A) instead of only connective tissue (diabetic rats with no treatment). This osteogenic
effect persisted at 28 days after fracture. Trabeculae in the trained diabetic rats were
thicker, more organized, and denser than in the non-trained diabetic rats (Figure 4).
Furthermore, higher collagen deposition and osteoclastic activity were observed in these
animals (Figure 5). However, the osteogenic effects of vibration therapy were not
observed in the trained control rats; although vibration therapy increased osteoclastic
activity 14 days after bone fracture (Figure 5B), which is an undesirable feature.
4. Discussion
Diabetes and osteoporosis are two related conditions of great interest, and their
incidence is currently increasing worldwide. In 2015, 422 million people across the
world were diagnosed with diabetes. Additionally, 1.5 million diabetic individuals die
every year directly due to diabetes (Organization, 2016a).
Several human studies (Montagnani et al., 2011b; Kim et al., 2012b) and
experimental investigations (Herbsman et al., 1968; Macey et al., 1989; Follak et al.,
2004; Diniz et al., 2008; Ogasawara et al., 2008; Al-Zube et al., 2009; Azad et al.,
Manuscrito - 93
2009; Wang et al., 2012) have documented the association between diabetes and
disruption in bone healing. In normal bone healing, four distinct phases are required to
heal bone tissue: inflammation, soft callus formation, hard callus formation, and
remodeling (Fazzalari, 2011; Junqueira e Carneiro, 2013; Sathyendra e Darowish, 2013)
(Elias, 2013). During the inflammatory stage, a hematoma forms between bone
fragments, which releases multiple growth factors, including platelet-derived growth
factor (PDGF) and transforming growth factor b (TGF-b), into the fracture site (Al-
Zube et al., 2009; Sathyendra e Darowish, 2013).
Although the exact mechanism leading to delayed bone healing or non-union in
diabetic humans and animals is yet to be determined, diabetes is associated with a
reduction in cellular proliferation, collagen deposition, and mechanical properties (Diniz
et al., 2008; Ogasawara et al., 2008; Kayal et al., 2009; Chen e Wang, 2014). Previous
studies in diabetic rats have demonstrated inadequate biological signals in an early
phase of bone healing (2, 4, and 7 days), with decreased levels of PDGF, TGF-b, IGF-1
and vascular endothelial growth factor (VEGF) at the fracture site (Al-Zube et al.,
2009). Such disturbances in the growth factor signaling cascade result in the impaired
proliferation and differentiation of mesenchymal cells into osteoblasts as well as
decreased angiogenesis (Diniz et al., 2008). In our study, we observed that diabetic rats
showed decreased IGF-1 levels associated with increased circulating CTX-I levels,
which may have resulted in decreased collagen deposition and a delay in the
differentiation of bone cells to form a bone callus at 14 days after fracture. At this stage,
the bone callus was expected to be formed by cartilaginous tissue and immature
trabecular bone. However, the bone callus of diabetic rats was mainly formed by
connective tissue. Such a delay in cell differentiation was also observed at 24 days after
bone fracture. In normal healing, the bone callus should be mainly formed by thick and
Manuscrito - 94
dense trabeculae. However, diabetic rats showed a bone callus composed of thin and
disperse trabeculae. Consequently, the bone callus of diabetic rats was less dense and
weaker. Therefore, therapeutic modalities with the ability to reverse compromised
fracture healing should be determined and used as coadjutants in the treatment of
diabetics.
Previous studies have examined the effects of vibration therapy on improving
bone healing in rats with several osteometabolic disturbances (Shi et al., 2010; Stuermer
et al., 2010; Chow et al., 2011; Komrakova et al., 2013; Chung et al., 2014; Chow et
al., 2016; Komrakova et al., 2016; Wei et al., 2016). Although no studies have
investigated the effects of such therapy on bone healing in diabetic rats, Weinheimer et
al. determined an important angiogenic effect of vibration therapy on wound healing in
diabetic mice (Weinheimer-Haus et al., 2014). Thus, we hypothesized that such
mechanical stimuli associated with sensory-motor disturbances due to wave vibration
might not only accelerate bone healing in control rats but also improve and even
normalize the consolidation in diabetic rats.
In the present study, we found that cell proliferation at the bone callus was
significantly higher in diabetic rats treated with vibration therapy than in non-treated
diabetic rats. Vibration therapy increased the level of circulating IGF-1; this was
associated with a reduction in RANK, which may explain the increased cell
proliferation in chondrogenesis, trabecular formation, and collagen deposition in the
bone callus of diabetic rats, which are associated with increased mineralization and
volume. Conversely, vibration therapy does not seem to accelerate bone healing in
control rats.
To the best of our knowledge, this study is the first to investigate the effects of
vibration therapy on bone healing in diabetic rats. Taken together, our results indicate
Manuscrito - 95
that vibration therapy significantly counteracted the deleterious effects of diabetes on
bone healing.
5. Declaration of interest
The authors have no relevant conflicts of interest to disclose.
6. Funding statements
This study was funded by the São Paulo Research Foundation (FAPESP) and
Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES).
7. Author contributions
Maysa Campos, José Volpon, and Ariane Zamarioli designed the experiments.
Maysa Campos and Ana Franttini performed the experiments.
Maysa Campos, José Volpon, Manoel Sousa-Neto, Raquel Silva, João Ximenez, and Ariane
Zamarioli analyzed the data and revised the manuscript.
Ariane Zamarioli composed the research proposal, conceived and designed the experiments,
discussed all of the results, and wrote the manuscript.
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Manuscrito - 102
Tables
Table 1. The levels of circulating IGF-1, RANK, and CTX-I. IGF-1 was significantly decreased in
diabetic rats and was increased by vibration therapy. CTX-I levels were significantly increased by
diabetes. Letters indicate significant differences (p<0.05).
Circulating levels of IGF-1, RANK and CTX-I (pg/ml) mean ± SD
SHAM SHAM+VT DM DM+VT
IGF-1 3014.35±826.48 1822.56±962.34 246.04±181.38a 1889.54±652.13b
RANK
CTX-I
445.35±126.89
149.19±49.12
346.46±48.86a
419.56±91.49a
453.01±98.37
623.29±170.71a
366.43±79.73b
692.89±158.73
ap<0.0001 vs SHAM
bp<0.03 vs DM
Manuscrito - 103
Figure legends
Figure 1. Comparison of body mass (in grams) among groups. A: Upon study entry (day 0,
diabetes/sham induction), body mass was similar among all groups (p>0.05). B: Closed femoral fracture
procedure. C: Final observation period of 14 days post-fracture. Body mass was lower in diabetic rats
than in sham rats (p<0.05). D: Final observation period of 28 days post-fracture. Diabetic rats exhibited
lower body mass than sham rats (p<0.05). Trained diabetic rats displayed higher body mass than non-
trained diabetic rats.
Figure 2. Comparison of BMD, BMC, and the area of the bone callus between each group at both 14 and
28 days post-fracture (DXA assessment). Asterisks indicate significant differences (p<0.05).
Figure 3. Coronal and axial tridimensional μCT images of fractured femurs. Diabetes impaired bone
healing, and bone calluses were smaller and less mineralized than in sham rats during both follow-up
periods. Vibration therapy significantly increased bone callus volume and mineralization on both follow-
ups, but only in diabetic rats.
Figure 4. Histological slides of fractured femurs stained with HE at magnifications of 12.5, 50, and 200x.
Diabetes induced a delay in cell proliferation and differentiation during fracture healing. At 14 days after
fracture, sham rats exhibited a bone callus formed by trabeculae, while diabetic rats only showed
connective tissue. The delay persisted in the later stage of healing, where sham rats had dense trabeculae
forming a bone callus, and diabetic rats only showed thin and well-spaced trabeculae. Vibration therapy
accelerated cell differentiation during fracture healing in diabetic rats in both stages but did not cause
changes in normal bone healing.
Figure 5. Histological slides of fractured femurs stained with Sirius red solution (A) and TRAP (B), with
a magnification of 12.5x. A: Collagen deposition in the bone calluses of diabetic rats was significantly
lower than in sham rats. Vibration therapy increased collagen deposition in bone calluses of diabetic rats
but not in sham rats. B: Osteoclastic activity in diabetic rats was higher than in sham animals on day 14
Manuscrito - 104
after fracture but lower on day 28. Vibration therapy increased osteoclastic activity in bone calluses of
diabetic rats on day 28 post-fracture.
Figures
Figure 1.
Manuscrito - 105
Figure 2.
Figure 3.
Manuscrito - 106
Figure 4.
Manuscrito - 107
Figure 5.
