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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Genética e Melhoramento para Isoflavonóides em soja
Pós-Graduando: Walter Fernando BernardiOrientador: Prof. Dr. Natal Antonio Vello
Roteiro
� Introdução
� Estrutura da molécula
� Influência do Ambiente
� Estudos de Parâmetros Genéticos
� Correlações com óleo e proteína
� Análise de Isoflavonas em Soja tipo Hortaliça
� Estudos de QTLs
� Perspectivas Futuras
� Considerações Finais
Introdução
� Pertencem a família dos polifenois, poderosos antioxidantes.
� Importante papel na prevenção de doenças: câncer mama,
prostata, osteoporose, cardiovasculares;
� Compostos químicos reconhecidos como estrógenos.
� Existe evidencia, que as isoflavonas (genisteina), afeta o nível
total de colesterol.
O que são Isoflavonóides:
Introdução
� São compostos bioativos e não nutricionais, e apresentam
estrutura química similar ao estradiol, por isso se encaixam nos
receptores de estrógenos
� Estudo clínicos e epidemiológicos mostram que as populações
asiáticas, apresentam menos sintomas de síndrome do climatério,
menos problemas cardiovasculares, osteoporose e certos tipo de
câncer (colo, mama e prostata).
Introdução
Tipos de Isoflavonóides:
Aglicones: daidzeina, genisteina e gliciteina;
Glucosídeos: daidzina, genistina e glicitina
Acetilglucosídeos: 6’’-O-acetildaidzina, 6’’-O-acetilgenistina e
6’’-O-acetilglicitina;
Malonilglucosídeos: 6’’-O-malonildaidzina, 6’’-O-malonilgenistina e
6’’-O-malonilglicitina
Introdução
Distribuição das Isoflavonas nas Sementes de soja:
Cotilédone 80 – 90%
Tegumento
10 – 20%
Eixo Embrionário
Efeito Significante do ambiente sobre os isoflavonóides
Temperatura afeta a concentração nas sementes
cotilédones Altera
Tegumento constante
Eixo Embrionário constante
Influência do Genótipo e Ambiente no Conteúdo de Isoflavonas em Soja.Joseph A. Hocck, Walter R. Fehr, Patricia A. Murphy and Grace A. Welke
Crop Science, 40:48-51, 2000.
• O ambiente tem influênciado significativamente o conteudo de isoflavonas
• Tsukamoto (1995) - influência da Tº
• Variação entre anos de uma cultivar: 1176 a 3309 µg/g
• Variação entre Locais no mesmo ano: 1176 a 1749 µg/g
Influência do Ambiente
Objetivo
Avaliar a relativa importância do genótipo,
anos, locais e suas interações com o conteúdo de
isoflavonóides, testando vários cultivares no mesmo
local durante diferentes anos.
Material e Método
� 6 cultivares avaliadas
� Anos 1995 e 1996
� 8 locais
� 3 repetições
Concentração de Isoflavonas: HPLC
Resultados e Discussão
� Existe diferença significativa entre locais em um ou mais anos
� Houve diferença entre locais em um ou mais anos para conteúdo
individual e total.
GxAxL9695GxA9695AxL9695Isoflavona
**NS****************Total Isoflavonas
NSNS*************NSGenisteina
****NS******NS*NSNSGiciteina
NSNS**************NSDaidzeina
********************Malonilgenistina
*NSNSNS********NS**Malonilglicitina
********************Malonildaidzina
********************Genistina
*******************Glicitina
***NS**************Daidzina
GxLGenotipoLocaisAnos
Tab. 1 Significância do efeito e suas interações para conteudo de isoflavona individual e total de seis cultivares em oito locais e dois anos
24982128244129532689205927171996
148413921341147414521322192419958
22822085216925472520197123971996
145813381402143014791382171919957
19941830188023542153176219861996
106479411621266939844137719956
24522100221625502451284225511996
182817631770155518881636235819955
26012595241526492671220530701996
127711431025127314851181155519954
21471854205525142311166424831996
104081310961147939883136519953
24232198218926392756216025981996
175116211678173517901568211519952
19631803188721722004160823051996
107184811821326949879124119951
µg/gµg/gµg/gµg/gµg/gµg/gµg/g
MédiaIA2016IA2013IA2012IA2011VintonKenwoodAnosLocais
Cultivar
Tab. 2 Média do Conteúdo Total de Isoflavonas de seis cultivares em oito locais nos anos de 1995 e 1996.
Conclusões
�A significância da interação entre Locais x Anos reflete o impacto da
variabilidade da condição climática na concentração de isoflavonas;
� Dificultdade em se prever o conteudo a ser obtido em diferente anos;
� Essa dificuldade dificulta o contrato antes do plantio;
� Sementes que maturam no campo a baixas temperaturas, tem
maiores concentrações de isoflavonas;
� A diferença de genótipos para conteúdo total e individual de
isoflavonas, indica ser possível selecionar genótipos para
desenvolvimento de um programa de melhoramento.
Hoock et al, Crop Science, 40:48-51, 2000.
Parâmetros Genéticos Relacionados com Conteúdo de Isoflavonas e Proteínas em Sementes de Soja. Luciana Chiari; Newton D. Piovesan; Lucas K. Naoe; Inês C. José; José M.S Viana; Murilo A. Moreira andEveraldo G. de Barros
Euphytica 138: 55-60, 2004.
Objetivo
Determinar a herdabilidade de sentido amplo do
conteúdo de isoflavonóides em sementes soja e estimar a
correlação entre várias formas de isoflavonas e entre
estas e o conteúdo de proteína.
Material e Método
Híbrido F1 – confirmado por análise não destrutiva das sementes
F1 F2 F3 derteminação de proteina e isoflavona
Isoflavona µg/g Proteína %
BARC-8 428 (Baixo) 45 (Alto)
IAC-100 966 (Alto) 35 (Baixo)
Resultados e Discussão
Seis formas de isoflavonas foram Avaliadas:
� Daidzina
� Genistina
� Glicitina
� Malonildaidzina
� Malonilgenistina
� Malonilglicitina
De acordo com Griffith & Collison (2001) sementes de soja “in natura” contem as formas malonil.
As formas 6”-O-acetil e agliconeas são formadas durante processamento.
-0,47----ISOF
-0,440,92---MGEN
-0,370,880,80--MDAID
-0,510,890,940,82-GEN
-0,400,890,830,980,87DAID
ProtISOFMgenMdaidMGen
Coeficiente de Correlação
Tab. 1 Estimativa do coeficiente de correlação fenotípica entre as formas de isoflavonas e proteína
Tab. 2 Estimativa do coeficiente de correlação fenotípica entre as formas de isoflavonas e proteína
0.370.990.960.900.980.96h2b
ProtIsofMgenMDaidGenDaidHerdabil.
Características
Resultados e Discussão
� Estudos mostram que sementes de soja com alto conteúdo de
proteína tende a acumular baixa soma de isoflavonóides.
� Melhoristas tomam decisão de seleção baseados nas previsões
entre correlações de diferentes características
�Devido a correlação negativa é difícil reunir em uma única cultivar
alto teor de Isoflavonas e proteína;
� Vário programas tendem a diminuir a quantidade de isoflavonas nas
variedades, pois sua presença está associada ao sabor amargo e
adstringente.
� O estudo indicou influência do ambiente no conteúdo de isoflavonas.
ConclusãoChiari et al, Euphytica 138: 55-60, 2004.
Correlação de Óleo e Proteína com Concentração de Isoflavonas em Soja. Craig S. Charron, Fred, L. Allen, Richard D. Johnson, Vicente R. Pantalone and Carl E. Sams.
Journal Agricultural and Food Chemistry, 53: 7128-7135, 2005.
Objetivo
� Determinar se o conteúdo de óleo e proteína em soja está
correlacionado com conteúdo total e individual de isoflavonas.
Material e Método
� 17 cultivares avaliadas do grupo de maturação 4 e 5
11 RR
6 convencionais
� Análise de proteína – Espectofotometro (infravermelho)
� Análise de Isoflavona – Grifftith & Collison modificado
� Estatística - SAS
71880052464278328331082831803151043.018.217RR
693242823452654293692207169181040.819.316RR
6321024328022052834732062051131843.217.615RR
52390135332216518661051361191151038.719.314RR
3474002123112541420831229915843.019.013RR
31500426307122510439712279210641.619.812RR
39830142342163713311041629537640.120.811RR
5869013630620732555932191590192340.619.210RR
369604373681358127910516011759942.119.79 RR
5261044760018151948170199151291038.821.58 RR
44510148457180413581372221073191040.721.17 RR
7020025928225793034972482355191839.819.76
79410059342297933391053042351222138.020.05
64110175355250424441082711882322040.219.84
434500422861836149188162952211441.219.63
78820148379266338571262712430141541.618.52
67810167346275525931032891842191440.318.91
TIsoAgti
Agti
Adid
Mgti
MgtiMdziglicitigenisti
daidzina
Glictei
geniste
daidze
Prot.ÓleoCult
Concentração de isoflavona (µg/g)
Tab. 1 Média de Óleo, Proteína e concentração de de isoflavonas de 3 locais
NSNSNSAcetilglicitina
NSNSNSAcetilgenistina
NS***Acetildaidzina
NS****Malonilglicitina
NS****Malonilgenistina
******Malonildaidzina
NS***Glicitina
*****Genistina
*****Daidzina
NSNSNSGliciteina
******Genisteina
*****Daidzeina
*****Isoflavona Total
******Produção
******Proteína
******Óleo
Cultivares x LocaisLocaisCultivaresCaracteres
Tab. 2 Interações entre cultivares e locais para óleo, proteína e conteúdo individual de isoflavonas, de 17 cultivares e 3 locais.
Proteína, Iso
0,31-0,45Todas Cultivares
0,85-0,3417 RR
0,36-0,1316 RR
-0,140,2715 RR
0,56-0,6714 RR
0,30-0,7313 RR
0,68-0,7312 RR
0,78-0,8211 RR
-0,590,2910 RR
0,67-0,799 RR
0,77-0,628 RR
0,37-0,477 RR
-0,270,256
0,09-0,505
0,04-0,484
0,75-0,923
0,07-0,352
0,04-0,551
Óleo, Iso
Tab. 3 Coeficiente de correlação para conteúdo de isoflavona com óleo e Proteína
r
Conclusões
� É possíveL selecionar cultivares com alto e baixo conteúdo de
isoflavonas para o programa de melhoramento
� É possível se fazer seleção indireta para o carater
� Predominou as formas Malonildaidzina e Malonilgenistina
� Genisteina e formas acetil representam menos de 1%, mas
após processamento chegam a 25%.
Charron et al, J. Agricul. and Food Chemistry, 53: 7128-7135, 2005.
Análise de Conteúdo de Isoflavonas em Soja Tipo Hortaliça. T. Mebrahtu, A. Mohamed, C.Y. Wang & T. Andebrhan
Plant Food for Human Nutrition 59: 55-61, 2004.
Material e Método
� 31 genótipos avaliados
GM: III – VI
� 3 repetições
� 3 anos
� Genótipos foram avaliados em R6 – R7 com 80-90% vagem cheia
� HPLC – quantificação de isoflavonas
Resultados e Discussão
As condições climáticas foram diferentes nos 3 anos.
1996 e 1998 – estresse
1997 - condições favoráveis
112.45b27.6759.30b25.49bVI
134.75ab27.7474.28ab32.73abV
138.65ab27.8771.72b39.06ªIV
159.83ª34.4288.87ª36.55ªIII
Isof. TotalGliciteinaDaidzeinaGenisteinaGM
µg/g
Tab. 1 Média dos isoflavonóides para grupo de maturação
Resultados e Discussão
Genisteina Gliciteina
Cultivar µg/g Cultivar µg/g
Aoda 80.80 Aoda 61.92
Pella 54.00 Pella 56.98
D71-9806 10.59 Verde 07.29
Daidzeina Isoflavona Total
Cultivar µg/g Cultivar µg/g
PI 248.511 127.62 Aoda 257.69
Aoda 115.01 Pella 219.01
PI 507.415 22.65 PI 507.415 55.44
Conclusões
� Especial atenção deve ser dada as cultivares nos programas de melhoramento para isoflavonóides: Aoda, Pella, Houjaku, Kenrich e Shangroa;
� Conteúdo individual de isoflavonas pode ser considerado como característica quantitativa;
� Forte associação entre conteúdo total de isoflavona com genisteina e daidzeina, sugere que a seleção para um pode incrementar o outro;
� GM precoces tende a ter mais isoflavonóides do que os tardios;
� Herdabilidade para genisteina (54%), daidzeina (45%), gliciteina(58%) e isoflavona total (64%), são influênciadas pelo ambiente e variação genética
Mebrahtu et al, Plant Food for Human Nutrition 59: 55-61, 2004.
Mapeamento de QTL para Conteúdo Individual e Total de Isoflavonas em Sementes de Soja.
Valerio S. Primoto, Vaino Poysa, Gary R. Ablett, Chung-Já Jackson, Mark Gijzen e Istvan Rajcan.
Crop Science, 45: 2454-2464, 2005.
� QTLs tem sido reportados nos GL A1, B1, B2, D1a, H, K e N
� O Uso de QTL pode ser vantajoso no desenvolvimento de uma estratégia eficiente de melhoramento para seleção de alto ou baixo conteúdo de isoflavona em soja.
� Epistasia tem contribuindo para variação quantitativa.
� Não há informações precisas de interações epistáticas associadas com o conteúdo de isoflavonas em soja.
� Muitos estudos têm tido pouco sucesso de mapeamento devido ao tamanho da população, tipo da população, análise limitada de software, além de um nível de significância pouco confiável.
Introdução
Objetivo
O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar QTL
que afeta daidzeina, genisteina, gliciteina e conteúdo total de
isoflavonas por meio de recombinação de uma população derivada
do cruzamento AC756 x RCAT, cultivadas em 2 ambientes. A
possibilidade de interação epistática foi investigada.
Material e Método
AC756 ~ 1417 µg.g-1
RCAT ~ 2246 µg.g-1
F1 F2 F4 (SSD)
F5 foram utilizados para extração de DNA genômico das 207 RILs
Coleta dos dados agronômicos
Extração Isoflavonas: HPLC
Resultados
0.50857-3472166921251337Talbotville
0.401061-3365209032061495HarrowTotal
0.4515-137697870Talbotville
0.3552-1308812982HarrowGliciteina
0.50418-16058371118612Talbotville
0.39500-189310271709664HarrowGenisteina
0.48345-1715756929655Talbotville
0.40465-16409751368748HarrowDaidzeina
µg.g-1
HerdabilidadeVariaçãoMédia Pop.RCATAC756AmbienteTratamento
Resultados
Mapa de Ligação
458 SSR primers utilizados
86 SSR foram designados em 19 grupos de ligação
Diferenças encontradas
1ª Distância entre Satt 387 e Satt 521 no GL N foi de ~ 50cm, enquanto que no mapa público de soja a distância é ~ 12cm;
2ª Marcas Satt 512 e AT 21 no GL E, o que não está incluído no mapa público
Resultados
� Os QTLs estão locados nos 11 GL, e não foi identificado
um único QTL para conteúdo total de isoflavonas.
� Identificou-se grande número de QTLs com poucos efeitos.
� Somente um loco significativo foi detectado para gliciteina
e isoflavona total em Talbotville.
Resultados
� Os dois métodos identificaram 2 distintos picos no GL M
� Sugerindo que 2 diferentes QTLs podem estar locados no GL M
� O método CIM identificou QTL nos GL A1, C2, D1a, F e G, que
não foram identificados por IM.
� O método IM identificou QTL no GL K, que não foi identificado
por CIM.
Resultados
Interações Epistáticas
� Interações epistáticas foram testadas entre todos os locos;
� 23 interações significativas foram detectadas;
� Interações detectadas em Harrow foram diferentes das de
Talbotville;
� Algumas interações foram comuns entre daidzeina, genisteina e
isoflavona total para os dois ambientes;
Conclusões
� O mapa para AC756 x RCAT cobriu aprox. 39% do genoma da soja;
� Foi suficiente para descobrir novos QTLs associados com isoflavonas;
� Somente 17 marcadores mostraram-se eficiente para isoflavonas;
� Eles explicam de 3,5 a 10,5% da variação fenotípica;
� O baixo nível de variação explicado pelos QTLs é um indicativo de
herança quantitativa;
� Especial atenção devem ser dadas aos GL J, K e M, foram detectados
nos diferente ambiente e permaneceram siginificativos no modelos de
múltiplos locos com e sem epistasia;
Primoto et al,Crop Science, 45: 2454-2464, 2005.
Conclusões
� 5 QTLs do LG A1, D1a, H, K e N foram identificados em diferentes
populações e ambientes;
�Sat_135 não significativo, mas se tornou quando incluído no modelo
com epistasia;
� Com epistaisa pode-se explicar de 15,8 a 35,8% da variação
fenotípica;
Perspectivas Futuras
� Estudo envolvendo resistência das plantas – Plantas inoculadas com
fusarium solani f.sp. glycines aumentaram o nível de fenilpropanoide,
precursor de isoflavonóides;
� Plantas inoculadas com fusarium solani f.sp. glycines aumentam o nível
de gliceolin, precursor de daidzeina;
Perspectivas Futuras
� A inoculação de Phytophthora sojae aumentou o nível de daidzeina,
precursor do pterocarpo fitoalexina gliciolina, suportanto o hipotético
papel das isoflavonas na resposta de defesa a doenças
� Isoflavonas são essenciais para nodulação de Bradyhizobium –
quando a expressão de isoflavona sintetase é inibida, há uma redução
no nodulação.
Perspectivas Futuras
� Isoflavonas não trás somente benefícios a saúde humana. Estudos
mostram que daidzeina e genisteina induzem mutagnese em glândulas
mamárias de ratos transgênicos;
� Estudos apontam que genisteina tem um beneficio para uso em
células cancerosas, mas podem ser problemáticas para células normais.
Considerações Finais
� Os estudos indicam ser um carater quantitativo;
� O ambiente, especialmente a temperatura, afeta significativamente o
conteúdo de isoflavonas;
� Trabalhos adicionais são necessários para elucidar a herdabilidade do
carater e as correlações com óleo e proteínas.