FACULDADE MAURÍCIO DE NASSAUDISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR

Profa. Patrícia Haver

PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE

1. Identifique dois eppendorfs (microtubos) de 1,5 ml.

2. Em um tubo, acrescente 500µl de sangue venoso.

3. Acrescente 800µl de tampão de lise de hemácias.

4. Tampe o tubo e misture gentilmente, por inversão.

5. Centrifugue por 3 minutos a 13.000 rpm.

6. Descarte o sobrenadante em local apropriado, sem deixar que o pellet se desprenda do fundo do

tubo, e seque a borda do tubo com papel higiênico.

7. Acrescente ao pellet 1 ml de água ultra-pura.

8. Ressuspenda o pellet com o auxílio da micropipeta ao adicionar a água, tomando o devido cuidado

para evitar a contaminação da mesma.

9. Tampe o tubo e misture gentilmente por inversão a mistura.

10. Centrifugue por 3 minutos a 13.000 rpm.

11. Descarte o sobrenadante em local apropriado, sem deixar que o pellet se desprenda do fundo do

tubo, e seque a borda do tubo com papel higiênico.

12. Ressuspenda o pellet em 370µl de solução de digestão de proteinase K.

13. Homogeneizar gentilmente o tubo, sem deixar formar espuma, e incubar por 30 minutos em

banho-maria a 55ºC.

14. Retire do banho-maria e deixe esfriar a temperatura ambiente.

15. Acrescente 100µl de NaCl 6M e agite vigorosamente o tubo durante 20 segundos.

16. Centrifugue o tubo por 6 minutos a 13.000rpm.

17. Transfira o sobrenadante para o outro microtubo identificado.

18. Adicione vagarosamente 900µl de etanol absoluto gelado.

19. Homogenize a solução, por inversão, para que ocorra a precipitação do DNA. A precipitação será

observada através da visualização da formação de um enovelado esbranquiçado (semelhante a fios

de algodão).

20. Centrifugue o tubo por 3 minutos a 13.000 rpm.

21. Descarte o sobrenadante e acrescente 1ml de etanol a 70% gelado.

22. Centrifugue o tubo por 3 minutos a 13.000 rpm.

23. Descarte o sobrenadante e acrescente 35µl de água ultra-pura.

24. Ressuspenda o pellet utilizando um vórtex durante 20 segundos.

25. Armazene o tubo contendo o DNA em geladeira, caso seja utilizado rapidamente, ou a -20ºC, caso

demore a ser utilizado. Neste caso, o tubo de DNA deverá ser descongelado, deixado em banho-

maria por 15 minutos e homogeneizado no vórtex por 20 segundos antes de ser utilizado.

SOLUÇÕES UTILIZADAS

TAMPÃO DE LISE DE HEMÁCIA

Sacarose – 1,6MTris- 60mMMgCl2 - 25 mMTriton X-100 - 5%pH 7,5

SOLUÇÃO DE DISGESTÃO DE PROTEINASE K

240µl – água ultra-pura20µl - SDS 20%80µl – tampão de proteinase K30µl – proteinase K 10mg/ml

TAMPÃO DE PROTEINASE K

10mM Tris HCl0,2mM EDTA

NaCl 6M (saturado)

ETANOL 70%

70 ml de etanol absoluto30 ml de água ultra-pura

FÓRMULAS UTILIZADAS

m (g) = M . PM . V (l)

1 Molar = 1000 miliMolar

1 Litro = 1000 mililitro

PM = peso molecular (obtido na embalagem do produto)

M = massa em gramas

V = volume em litro