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Escola de Cincias e Tecnologia Departamento de Qumica

MESTRADO EM BIOQUMICA STRESSE E MORTE CELULAR

Rui Manuel Alves Ferreira (Professor Associado)

Isabel Alves-Pereira (Professora Auxiliar)

vora, 2014

MBQ Setresse e Morte Celular Estudos de stresse e morte celular em leveduras

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira 2014/15 2

Estudos de stresse e morte celular em leveduras Local: Lab. Bioqumica Analtica CLAVerney, Dep. de Qumica, Universidade de vora Descrio: Objectivos: Estudos in vivo de exposio a agentes de stresse. Quantificao de marcadores fisiolgicos de morte celular em leveduras. Extraco, deteco e quantificao de marcadores moleculares de stresse e morte celular em leveduras. Trabalhos prticos a executar: 1. Estabelecer ensaios in vivo de exposio a diferentes factores de stresse 2. Avaliar a sobrevivncia celular na exposio a diferentes factores de stresse 3. Obter extractos e fraces celulares 4. Avaliar a importncia de alguns marcadores moleculares na sobrevivncia de leveduras em condies de stresse 5. Discusso dos resultados obtidos. Elaborao do relatrio.



1- Preparao de material e meios de cultura para microbiologia.

A cultura assptica A prtica da asspsia essencial para obter culturas puras ou identificveis.

Preparao e esterilizao de material de vidro com o qual se podem iniciar trabalhos de Microbiologia.

pipetas graduadas caixas de Petri bales de erlnmeyer tubos de ensaio

Agente de esterilizao: calor seco

Colocar o material preparado numa estufa a 180 C durante 3:00 h.

Preparao e esterilizao de meios de cultura (lquidos e slidos) Meio YPD (lquido)

Extracto de levedura 1 % Peptona 2 %

Glucose 2 % Dissolver em 100 mL de gua destilada, tapar com rolha de algodo e gaze.

Meio YPD (slido) Adicionar ao meio anterior agar 2 %

frascos de 100 mL contendo gua destilada Pontas de micropipetas (P200 e P1000)

Agente de esterilizao: calor hmido Esterilizar em autoclave, a 1,2 atm, a 120 C, durante 20-45 min.



2- Obteno de culturas de Saccharomyces cerevisiae em meio lquido - Exposio ao indutor de stresse

Inoculao em meio lquido 1) Colocar os erlnmeyer (250 mL) A, B, C e D no banho termoestabilizado a 28 C, 150 rpm A YPD B YPD + H2O2 0,2 mM

C YPD + CH3COOH 80 mM D YPD + NH4VO3 25 mM 2) Inocular 100 mL de meio A, B, C e D com 3 mL da cultura M 3) Recolher amostras para:

A600

4) Deixar incubar durante 12 h, ao final deste tempo passe ao ponto 3.

3- Obteno fraco ps-perxissomal de leveduras 5) Recolher amostras da cultura para:

A600

Clulas viavis (clorao com azul de metileno) Clulas viavis (cfu)

6) Distribuir as culturas em meio liqudo por tubos de centrfuga 7) Centrifugar a 5000 g durante 10 min 8) Resuspender o sedimento em 25 mL de H2O 9) Centrifugar a 5000 g durante 10 min 10) Resuspender o sedimento em 5 mL de tampo de lise 11) Lisar as clulas por ultra-sons 12) Centrifugar o lisado a 5000 g durante 10 min 13) Recolher o sobrenadante e centrifugar a 12000 g durante 30 min 14) Recolher o sobrenadante e guardar em alquotas a -20 C, para utilizar nos pontos 4, 5 e 6.



4- Quantificao de protenas por espectrometria de absoro molecular.

Obteno de uma curva de calibrao para doseamento de protena total

Quantificao da protena total presente nas amostras

1) Tomar 0,5 mL do reagente B e 0,5 mL do reagente C para um balo de 50 mL e preencher o restante volume do balo com a soluo A (reagente de Lowry).

2) Diluir 5 mL de reagente de Folin Ciocalteau com 5 mL de gua destilada, agitar no vortex (reagente de Folin Ciocalteau diluido).

3) Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com o quadro:

[BSA] (g/mL) Xx? 0 50 75 100 125 150 175 200 amostra (L) 50 -------------------------------------------------------------------------- BSA (500g/mL) (L) ----------------- 25 38 50 63 75 88 100 NaOH 0,5M (L) 200 250 225 212 200 187 175 162 150 reag.Lowry (L) 1250

Agitar no vrtex. Aguardar 10 min. reag Flolin dil. (L) 125

Agitar no vrtex. Aguardar 30 min. Ler e registar a A720 nm

5- Deteco da actividade CAT T p/ espectrometria de absoro molecular

Obteno das curvas de reaco (A/tempo) Quantificao da actividade enzimtica CAT T (nmol.min-1/ mg) presente na fraco

ps-peroxissomal de S. cerevisiae crescida em diferentes meios de cultura.

1) Preparar, em clulas de 1 cm3, a mistura de reaco de acordo com o quadro seguinte:

amostra branco t. fosfato 50 mM pH 7,0 (mL) 0,6 0,6 H2O2 (30 mM ) (mL) 0,3 0,3 t lise (mL) - 0,1 amostra biolgica (mL) 0,1 -

2) Registar a variao da A240 nm durante 120 s a 25 C.



6- Quantificao de marcador no-enzimtico de stresseGlutationo (GSH)

Obteno de uma curva de calibrao para quantificao de glutationo total Quantificao do glutationo total presente na fraco ps-peroxissomal

1) Preparar, solues padro de GSH em tampo fosfato de sdio 0,1 M com EDTA 0,005 M, pH 8,0.

2) Preparar em tubos de ensaio de vidro as seguintes misturas:

Volume 1 2 a 7 8

amostra -fraco ps-peroxissomal (L) 60

solues padro (GSH) (L) 60

H2O ultra-pura (L) 60

tampo fosfato 0,1 M, EDTA 0,005 M , pH 8 (mL) 1,84

OPT (100 g/100 L) (L) 100

3) Deixar reagir durante 15 min T ambiente e ler PF a ex350nm e de em420nm.



Stresse e Morte Celular - SMC 18T+30PL+4S

8 novembro (sab. 10h)

1- Preparao de material e meios de cultura para microbiologia

4h T + 6h PL

22 novembro (sab. 10h)

2- Obteno de culturas de Saccharomyces cerevisiae em meio

lquido - Exposio ao indutor de stresse

3- Obteno fraco ps-perxissomal de leveduras

4h T + 6h PL

28 novembro (6f 6h)

4- Quantificao de protenas por espectrometria de absoro

molecular

6h PL

6 dezembro (sab. 10h)

5- Deteo da atividade CAT T por espectrometria de absoro

molecular

4h T + 6h PL

12 dezembro (6f 6h)

6- Quantificao de marcador no-enzimtico de stresse

Glutationo (GSH)

6h PL

20 dezembro (sab. 10h)

Apoio ao trabalho de projeto (artigo)

Realizao e apresentao do relatrio

6h T + 4h S

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