PRP e Fatores de Crescimento

Fatores de Crescimento

Rogério Gonçalves VelascoCoordenador dos cursos de Pós-graduação em Implantodontia do Instituto Velasco

‣ Doutor em Implantodontia pela Faculdade São Leopoldo Mandic, Campinas‣ Mestre em Medicina - área de Concentração em Ciências da Saúde/Cirurgia de Cabeça e Pescoço, pelo Hospital Heliópolis - São Paulo, 2004.‣ Especialista em Prótese Bucomaxilofacial através da Associação Brasileira de Ensino Odontológicos, São Paulo, 2003‣ Especialista em Prótese Dentária pela Universidade São Marcos, 2009‣ Especialista em Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial pela Universidade São Marcos, São Paulo, 2009

[email protected] www.rogeriovelasco.com.br

mailto:[email protected]


http://www.rogeriovelasco.com.br


Cursos com credenciamento no MEC, sob portaria nº 1.342 de 10 de novembro de 2008, seguindo diretivas do CFO para cursos de especialização em odontologia.

Transformando conhecimento em saúde

Centro de Estudos Práticos e Pesquisa dedicado aos cursos de atualização em

Implantodontia, Cirurgia e Prótese ministrados pelo Instituto Velasco.


Derivados das Plaquetas

PRPPDGFTGBbeta



PRPPDGFTGBbeta



Derivados daMatriz Óssea

PRPPDGFTGBbeta

BMPsCélulas

Osteogênicas




PRPPDGFTGBbeta

BMPsCélulas

Osteogênicas




Terapias Genéticas

PRPPDGFTGBbeta

BMPsCélulas

Osteogênicas

Células Tronco




Terapias Genéticas

Fatores de crescimentoDerivados das Plaquetas

hemáceas

PRP

hemáceas

camada leucocitária

PRP

hemáceas


PRP / CP

PRP

hemáceas


PRP / CP

PPP ou PRFPRP

PPP ou PRF

PRP


PRP / CP

PPP ou PRF

PRP


PRP / CP

material de enxertia


PRP / CP

PPP ou PRF

PRP

Fatores de Crescimento Presentes nas Plaquetas

Fatores de Crescimento Presentes nas Plaquetas

• PDGF: Fator de Crescimento derivado das plaquetas

• VEGF: Fator de Crescimento vascular endotelial

• TGF β1 e β2: Fator de Crescimento Transformador

• PDEGF: Fator de Crescimento Celular Endotelial derivado das Plaquetas

• IL-1: Interceucina 1

• bFGF: Fator de Crescimento Fibroblastico básico

• PAF-4: Fator de Ativação Plaquetária 4

• IGF: Fator de Crescimento similar à Insulina

• EGF: Fator de Crescimento Epidermal

Fatores EfeitosBMPs

(Bone Morphogenetic Proteins)Induzem a expressão de Cbfa-1(fator de transcrição exclusivo das células da linhagem osteoblástica).

IGF(Insulin-like Growth Factor)

Fator local que atua de diversas maneiras nas células ósseas.Atua também na regulação sistêmica da remodelação óssea.

GH(Growth Hormone)

Estimula o metabolismo ósseo em crianças e adultos. Aumenta o numero e a atividade dos osteoblastos. Atua na regulação sistêmica da remodelação.

FGF(Fibroblast Growth Factor)

Fatores locais que atuam na reabsorção óssea. Atuando precocemente na esqueletogênese; FGF-2 controla a diferenciação das células progenitoras mesenquimais em osteoblastos maduros.

TGF-ß(Transforming Growth Factor ß)

Inibe a expressão de Cbfa-1, controlando o estado de diferenciação do osteoblastos maduros. Fatores locais que atuam na reabsorção óssea.

Stein, G.S. et al (1996) “Transcriptional contral of osteoblast growth and diffeentiation”. Physiol Rev 76:593-629.Boyle, B.F. et al (1999) “Recent advances in bone biology provid insight into the pathogenesis of bone diseases”. Lab. Invest.

• Doses crescentes de TGF-β (Fator de Crescimento Transformador) podem inibir a cicatrização óssea e alguns fatores de crescimento podem agir antagonicamente.

Plasma Rico em Plaquetas: Evidências que Justificam o UsoRobert E. Marx, J Oral Maxillofac Surg 62:489-496, 2004

Introdução

Introdução• O PRP não é coletado por aparelhos adequados, nem sua

obtenção é eficiente para evitar ruptura das plaquetas = perda de eficiência.



• Aparelhos regulamentados pelo FDA são eficientes.




• Modelos animais utilizam um pool de doadores, sendo portanto homólogo, e não autógeno = reação imune -

• “não é PRP”




• Modelos animais utilizam um pool de doadores, sendo portanto homólogo, e não autógeno = reação imune -

• “não é PRP”

• Observar nos trabalhos onde o PRP efetivo foi utilizado

www.institutovelasco.org.br

Oferece cursos com credenciamento no MEC, sob portaria nº 1.342 de 10 de novembro de 2008 e aprovação do CFO

http://www.institutovelasco.org.br


Obtenção de PRPSistemas Padronizados

Comparativo entre Sistemas

1 grama 1mg1ng

1g = 1000mg = 1000000ng

Quantas plaquetas são necessárias?


• Curva dose-dependente: mais plaquetas, mais fatores de crescimento, maior poder mitogênico


• Curva dose-dependente: mais plaquetas, mais fatores de crescimento, maior poder mitogênico

• Início de resposta adequada de 4 a 5 vezes a concentração sanguínea

• Quantidades de plaquetas de 3 a 5 vezes a concentração sanguínea, parece estimular neoformação óssea

• Quantidades de 6 a 11 vezes funciona como um inibidor da regeneração

• Quantidades de 0 a 2 vezes, não influenciam no crescimento ósseo.

Como o PRP funciona?


• Liberação de fatores de crescimento através da liberação de grânulos α-plaquetários (início 10 minutos após formação do coágulo, 1 hora depois da formação 95% dos fatores de crescimentos foram liberados)



• Sangue coletado e associado a anti-coagulantes



• Sangue coletado e associado a anti-coagulantes

• Depois de processado, o PRP é associado a um coagulante (CaCl e/ou Trombina)OBS: Trombina tem sido questionada pois pode causar problemas auto-imunes e coagulopatias

Plaquetas

Plaquetas

Angiogênese Mitogênese Quimiotaxia

Catalizadoras para as fases iniciais da remodelação óssea

Plaquetas


Catalizadoras para as fases iniciais da remodelação óssea

Plaquetas


Não age na diferenciação das células osteoprogenitoras ≠ BMPs

PRP Funciona?

PRP Funciona?

• Relação de artigos que sugerem metodologias falhas, muitas variáveis, dificultando uma análise correta dos dados.

• Realmente efetivo em cicatrização de tecidos não-ósseos: cirurgia plástica

Estudo comparativo da Osseointegração em Implantes Avana sobre Osso Fresco Congelado Sozinho e associado com PRP

Su-Gwan Kim et al. J Oral Maxillofac Surg 60:1018-1025, 2002

Objetivos

• Verificar a eficácia de osso fresco congelado e osso fresco congelado+PRP para a obtenção da interface de osseointegração de implantes dentários em cachorros

Metodologia

• 10 cachorros

• Fixação de 30 implantes, cada um com 3 expiras expostas, recobertas com:

• Nada (grupo controle)

• Enxerto de osso fresco congelado (OFC)

• Enxerto de OFC + PRP

Metodologia

• 6 gupos, sacrificados com 6 e 12 semanas

• Análise Histológica, Histomorfométrica e Estatística

• PRP: aumento 4 vezes a concentração sanguínea de plaquetas

Resu

ltado

sH

istol

ogia

tecido osteóide cercando o implante, espiras expostas apresentavam tecido conectivo fibrosogrupo controle, 6 semanas

Resu

ltado

sH

istol

ogia

tecido ósseo lamelar, espiras expostas apresentam tecido conectivo fibrosogrupo controle, 12 semanas

Resu

ltado

sH

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ogia

tecido osteóide cercando o implantegrupo ofc, 6 semanas

Resu

ltado

sH

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ogia

tecido ósseo lamelar, presença de osso medular e irrigaçãogrupo OFC, 12 semanas

Resu

ltado

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tecido osteóide cercando o implantegrupo ofc+prp, 6 semanas

Resu

ltado

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tecido ósseo lamelar com sistema harvesiano (cortical)grupo OFC+prp, 12 semanas

ResultadosHistomorfometria

Regeneração Óssea Em Defeitos Ósseos Padronizados Com Enxertos Autógenos Ou Substitutos Ósseos Em Combinação

Com Concentrado De PlaquetasUm Estudo Histológico E Histomorfométrico Em Mandíbulas de Porco

Jensen et al. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants, v.20, n.5, 2005

Objetivos

Objetivos

• Avaliar o impacto do PRP na regeneração óssea desde o momento da formação do coágulo sanguíneo até a completa cicatrização óssea

Objetivos


• Avaliar se a presença de células osteoprogenitoras num enxerto autógeno é um pré-requisito para o efeito benéfico do PRP

Objetivos



• Analizar o conteúdo de plaquetas, leucócitos e PDGF-ab e TGF-β no PRP utilizado

Objetivos



• Analizar o conteúdo de plaquetas, leucócitos e PDGF-ab e TGF-β no PRP utilizado

• Correlacionar o conteúdo do PRP com a regeneração óssea observada quantitativamente e qualitativamente.

Materiais e Métodos

• 12 porcos Gottingen• Formação de 4 grupos com 3

animais em cada• Sacrifícios em 1, 2, 4 e 8

semanas a partir da data da cirurgia


• 3 preparos em cada lado da mandíbula, padronizados com trefinas, criando defeitos de 9x5mm, região de ramo e corpo

• Defeitos não-críticos, contidos


• Materiais de enxertia:


• Materiais de enxertia:• Osso autógeno particulado em grânulos de 1-2mm (proporção

1:1 - osso cortical/osso medular)




• Osso bovino inorgânico em grânulos de 1-2mm




• Osso bovino inorgânico em grânulos de 1-2mm• Tricalciofosfato tipo beta (beta-TCP) em grânulos de 0,7 a

1,4mm


osso autógeno


osso autógeno

tricalciofosfato


osso autógeno

tricalciofosfato

osso bovino inorgânico


osso autógeno

tricalciofosfato

osso bovino inorgânico

Recobrimento com Membrana Gore-Tex de e-PTFE


• Análise laboratorial do sangue suíno



• Contagem de Plaquetas




• Quantificação de Leucócitos






• TGF-β: Fator de Crescimento Transformador


• Após sacrifício, remoção de bloco ósseo contendo os defeitos cicatrizados



• Preparo Histológico




• Fixação em formalina tamponada 10%





• Radiografia para localização exata dos defeitos






• Cortes de 80 μm






• Cortes de 80 μm

• Coloração com azul de toluidina


• Avaliação histomorfométrica

• Quantificação do osso neoformado, material de enxertia e medula através de padrão milimetrado em microscopia ótica

ResultadosAnálise Laboratorial

ResultadosHistologia - 1ª semana

• Todas áreas com presença de coágulo sanguíneo



• Tecido de granulação originado das paredes da lesão, deixando na região central o material de enxerto junto a uma rede de fibrina




• Do assoalho do defeito crescimento pequeno de osso medular




• Do assoalho do defeito crescimento pequeno de osso medular

• Não houve sinais de revascularização ou avanço de tecido mole onde o PRP foi colocado


Resu

ltado

sH

istol

ogia

- 1ª

sem

ana

Mm-masseter, M-membrana, C-coágulo, A-autógeno, G-granulação

• Substituição do coágulo por tecido de granulação até a membrana



• Alguns defeitos com acesso ao osso medular foram preenchidos com tecido osteóide




• Defeitos revestidos somente de osso cortical tiveram formação óssea limitada.





• Nas áreas que utilizaram substitutos ósseos tiveram menor formação óssea





• Nas áreas que utilizaram substitutos ósseos tiveram menor formação óssea

• Os processos relatados não foram influenciados pela presença do PRP


Resu

ltado

sH

istol

ogia

- 2ª

sem

ana

M-membrana, W-tecido osteóide, A-autógeno, V-vasos sanguíneos

Osso autógeno com PRP - contato medular

Resu

ltado

sH

istol

ogia

- 2ª

sem

ana

M-membrana, A-autógeno, G-granulação

Osso autógeno com PRP - contato cortical

• Todos defeitos preenchidos com osso autógeno apresentaram formação óssea até a membrana



• Todas as partículas do enxerto já apresentavam-se revestidas de osso




• Defeitos preenchidos com substitutos ósseos também tiveram formação óssea, em menor quantidade que o os autógenos





• Partículas pequenas de tricalciofosfato e de substitutos ósseos foram reabsorvidas






• Osteoclastos puderam ser observados sobre as superfícies dos grânulos maiores






• Osteoclastos puderam ser observados sobre as superfícies dos grânulos maiores

• Os processos relatados não foram influenciados pela presença do PRP


Resu

ltado

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- 4ª

sem

ana

M-membrana, W-tecido osteóide, A-autógeno, P-osso lamelarOsso autógeno sem PRP

Resu

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- 4ª

sem

ana

M-membrana, W-tecido osteóide, B-osso bovino inorgânico, P-osso lamelar

osso bovino inorgânico com PRP

Resu

ltado

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istol

ogia

- 4ª

sem

ana

M-membrana, W-tecido osteóide, T-tricalciofosfato, P-osso lamelartricalciofosfato

• Todos defeitos foram preenchidos por osso medular e medula óssea



• Próximo à membrana houve uma corticalização óssea



• Próximo à membrana houve uma corticalização óssea• Poucas partículas de tricalciofosfato e de substitutos ósseos

foram preservadas



• Próximo à membrana houve uma corticalização óssea• Poucas partículas de tricalciofosfato e de substitutos ósseos

foram preservadas• Os processos relatados não foram influenciados pela presença

do PRP


Resu

ltado

sH

istol

ogia

- 8ª

sem

ana

M-membrana, NC-cortical óssea, A-autógeno,Osso autógeno sem PRP

Resu

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- 8ª

sem

ana

M-membrana, T-tricalciofosfato

tricalciofosfato com PRP

Resu

ltado

sH

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ogia

- 8ª

sem

ana

B-osso bovino inorgânico, W-tecido osteóide, P-osso lamelarosso bovino inorgânico

• Os volumes quantificados de osso, osso bovino inorgânico e tricalciofosfato não foram influenciados pela presença do PRP de maneira significativa


ResultadosHistomorfometria - Comparativo PRPxSem PRP

Discussão

Discussão• Escolha de modelo suíno foi pela similaridade na contagem e

medidas plaquetárias, formação de coágulo sanguíneo e estrutura óssea



• As lesões foram não-criticas, com preservação de paredes




• A obtenção de PRP utilizou um sistema padronizado





• Não se quantificou a presença de PDGF-ab/TGF-beta total no sangue





• Não se quantificou a presença de PDGF-ab/TGF-beta total no sangue

• A mistura de 1:1 visou simular o tecido ósseo bucal

Conclusões

Conclusões

• Não houve efeito do PRP sobre o crescimento ósseo nem na degradação do material de enxertia

Conclusões

• Não houve efeito do PRP sobre o crescimento ósseo nem na degradação do material de enxertia

• Não se pode relacionar a presença de PDGF-ab e de TGF-beta com a contagem de plaquetas no PRP

Conclusões

• Não há ainda técnicas padronizadas de obtenção de PRP que seja confiável para uma boa relação de plaquetas e fatores de crescimento (revisão de literatura)

Conclusões

• Uso de enxertos autólogos é mais previsível e seguro que o uso de enxertos alógenos ou xenógenos

Conclusões

• Resultados consistentes não podem ser obtidos até a concentração ideal de fatores de crescimento ser identificada e que métodos confiáveis para obtenção de PRP seja desenvolvido.

Investigação do PRP em defeitos cranianos de Coelhos: Estudo piloto.

Tara L. Aghaloo, Peter K. Moy, Earl G. Freymiller. J Oral Maxillofac Surg 60:1176-1181, 2002

Objetivo

• Avaliar a efetividade do PRP na cicatrização óssea


• 15 coelhos Nova Zelândia

• 4 preparos padronizados com trefinas, criando defeitos de 8x3mm, região coronal

• Defeitos não-críticos, contidos


• Osso autógeno, PRP e asociações

• 3 grupos de 5 coelhos, sacrificados com 1, 2 e 4 meses

• Avaliação Radiográfica, Histológica e Histomorfométrica

• Comparação estatística

ResultadosConcentração do PRP

ResultadosAvaliação Radiográfica

• Subtração digital entre as radiografias através de software específico

• Proporção de áreas radiolúcidas/radiopacas

ResultadosAvaliação Radiográfica

p 〉0.05 = não significante

ResultadosAvaliação Histológica

• Aumento da densidade óssea em todos os defeitos

• Osso e Osso+PRP tiveram maior densidade óssea

ResultadosAvaliação Histomorfométrica


Discussão Conclusão


• A maior parte da regeneração aconteceu no primeiro mês.



• Nas amostras histológicas com Osso e PRP mostraram uma boa vascularização, formação de osso lamelar e atividade osteoblástica, assim como na amostra somente com Osso



• Nas amostras histológicas com Osso e PRP mostraram uma boa vascularização, formação de osso lamelar e atividade osteoblástica, assim como na amostra somente com Osso

• Não houve diferenças significativas entre as amostras osso+prp e osso somente

Efeitos do PRP com Enxertos Ósseos Autógenos para Levantamento de Seio Maxilar em Coelho

Kevin J. Butterfield, Jeffrey Bennett, Gloria Gronowicz,Douglas Adams. J Oral Maxillofac Surg 63:370-376, 2005

Introdução

• Seio Maxilar está sujeito a muitos fatores que influenciam na cicatrização de enxertos:

• Pressão intra-antral

• Vascularização

• Perfuração da Membrana de Schneider

Objetivo

• Avaliar a efetividade do PRP na cicatrização de enxertos no seio maxilar


• 12 coelhos divididos em 3 grupos• Sacrifício com 2, 4 e 8 semanas• Osso autógeno da crista ilíaca• Um seio com osso (1cc) e outro com osso

+prp (1cc+0,5cc)• Aplicação de marcador nos grupos com 10

pós intervenção e novamente 2 dias antes do sacrifício

• Avaliação quantitativa (TC), histológica e histomorfométrica

ResultadosConcentração do PRP

Imagem coronal em TC com 4 semanas Detalhe: área utilizada para determinar densidade óssea

ResultadosTC Quantitativa


Estática

ResultadosAvaliação Histológica

PRP+osso osso

mag

nific

ação

de

4x


Dinâmica

ResultadosAvaliação Formação Óssea

PRP+osso osso

mag

nific

ação

de

10x


• PRP: 4,4 vezes a concentração de plaquetas maior que o sangue

• O estudo não apresentou diferenças significativas para aumento da área óssea histológica, densidade óssea ou formação óssea

Comparativo

Catalizador para as fases iniciais da remodelação óssea

Retenção Diferencial de Fatores de Crescimentos para Compostos de PRP

Rick C. Tsay et al. J Oral Maxillofac Surg 63:521-528, 2005

Introdução

• Liberação dos fatores de crescimento devem ter uma ordem de atividade:

• PDGF e TGFbeta no início do processo

• TGFbeta na fase intermediária

• IGF-1 e BMP nas fases finais

Objetivos

• Procurar um substrato adequado para uso do PRP e determinar qual seria o momento ideal de liberação dos fatores de crescimento.

Metodologia

• Pesquisa in vitro

• Aglutinar o PRP+Trombina bovina ou PRP+TRAP (trombina sintética) diferentes substitutos ósseos:

• AlloGro (biocerâmica)

• Bioglass (biocerâmica)

• Bio-Oss (Osso bovino liofilizado)

• Avaliar com 1, 3, 7 e 14 dias

Metodologia

• Mensurado a qde de liquido liberado para cada amostra

• Sobrenadante foi congelado a -70ºC para avaliar a presença dos fatores de crescimento através de imuno-ensaio (uso de anticorpos específicos)

• Substituição do sobrenadante por solução específica (dinâmica circulatória?)

• Análise estatística

Resultados

Resultados

• Os biomateriais mostraram uma liberação dos fatores de crescimento mais lenta, com destaque para o BioGlass

• Com 14 dias, o grupo só com trombina já havia liberado todos seus fatores de crescimento

• O grupo 1, que não teve seu meio alterado, teve mais liberação de fatores de crescimento que o grupo 2

• O uso de TRAP mostra-se mais seguro, já que elimina riscos de imunopatias

Resultados

• O grupo com TRAP + substitutos ósseos mostrou 60% maior retenção dos fatores de crescimento comparado com trobina bovina + substitutos ósseos

• PRP com trombina cria um supernadante muito grande que é perdido no líquido intersticial in vivo, o uso de um condutor substituto ósseo é interessante para uma liberação mais lenta.

Efeito do Bio-Oss com e sem PDGF (Fator de Crescimento Derivado da Plaqueta) na formação óssea através da Regeneração Óssea Guiada: Estudo piloto em ratos

Lioubavina-Hack N, et al. J Clin Periodontol 2005; 32: 1254–1260.


• 8 ratos• Capsulas de teflon preenchidas

Sangue+Bio-oss (controle) ou Sangue+Bio-Oss+rhPDGF (20μg), uma em cada lado da mandíbula

• 2 grupos, sacrificados com 3 e 5 meses

• Análise histomorfométrica e histológica

ResultadosHistologia - 3 meses

• Em ambas amostras foram encontrados osso lamelar (maduro) com sinais de remodelação (bioatividade) envolvendo grânulos do enxerto (próximo à cortical óssea)

• O restante da capsula apresentava grânulos de enxerto envoltos com tecido conectivo (osteocondução???

• Aparente maior formação óssea no grupo controle (sem PDGF)

Resu

ltado

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- 3

mes

es

B-O:bio-oss, NFB: osso neo-formado, CT:tecido conectivobio-oss e pdgf

Resu

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- 3

mes

es

B-O:bio-oss, NFB: osso neo-formado, CT:tecido conectivobio-oss

Resu

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- 3

mes

es

r: ramo, B-O:bio-oss, NFB: osso neo-formado, CT:tecido conectivo

ResultadosHistologia - 5 meses

• Achados semelhantes ao 3º mês

• Maior quantidade de osso, sobretudo próximo ao ramo

Resu

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- 5

mes

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B-O:bio-oss, NFB: osso neo-formado, CT:tecido conectivobio-oss e pdgf

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- 5

mes

es

B-O:bio-oss, NFB: osso neo-formado, CT:tecido conectivobio-oss

Resu

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- 5

mes

es

Revestimento de tecido conectivobio-oss

Discussão

• Amostra não permitiu análise estatística

• rhPDGF mostra adequada regeneração periodontal: funciona para ROG?

• PH do fator de crescimento pode não ser adequado ao crescimento ósseo (PDGF diluido em solução ácida)


• Trabalho experimental com o mesmo método, utilizando somente cápsula apresentou preenchimento total da cápsula após 4-6 meses, neste estudo o preenchimento não chegou a 50%: Nem o Bio-Oss nem a associação com PDGF melhorou a formação óssea

Derivados de Plaquetas:

funciona?

Fatores de crescimentoDerivados da matriz óssea

• Proteínas com propriedades osteoindutivas

bmps


• Está presente na ossificação endocondral e intramembranosa

bmps



• Atua nas células mesenquimais (diferenciação de células osteoprogenitora em osteoblastos)

bmps




•Uma substância é denominada de BMP se ela for capaz de induzir á formação ectópica de tecido ósseo

bmps




•Uma substância é denominada de BMP se ela for capaz de induzir á formação ectópica de tecido ósseo

•Obtenção: • Xenóloga: 10 Kg de osso bovino originam 20µg de BMP• Genética: produção de fatores de crescimento recombinantes humanos (rh)

permite obter fatores em maior quantidade, menor custo, menor risco de reação imune ou contaminação.

bmps

Sub-tipos Nome Alternativo Funções principaisBMP-1 −

Não pertence a superfamília de TGF-β;induz formação de cartilagem e osso ; não é tecnicamente uma BMP

BMP-2 BMP-2aAtua na formação de cartilagem e osso duranta a embriogênese, osteoindutiva, atua na diferenciação de osteoblastos,atua na apoptose, expressada no pulmão,baço e colon

BMP-3 osteogeninaOsteoindutiva; promove o fenótipo condrogênico; função quimiotática;induz síntese e secreção de TGF-β pelos monócitos;

BMP-3b GDF-10Atua na formação óssea endocondral em animais adultos;expressada no pulmão,ovário,e intestino delgado

BMP-4 BMP-2bOsteoindutiva; embriogênese; reparo de fraturas e desenvolvimento dentário; pulmão e rins; formação do sistema límbico

BMP-5 − Osteoindutiva; embriogênese; fígado

BMP-6 Vgr-1Formação óssea e cartilagens; embriogênese; maturação neuronal; regula a diferenciação de condrócitos.

Sub-tipos Nome Alternativo Funções principaisBMP-8

BMP-8aProteína osteogênica 2 Osteoindutiva; embriogênese; espermatogênese (rato)

BMP-8B Proteína osteogênica 3 Iniciação e manutenção da espermatogênese do rato(só em ratos)

BMP-9 GDF-2 Osteoindutiva; estimula a proliferação e crescimento de hepatócitos;sistema nervoso;atua na hematopoiese

BMP-10 − atua no desenvolvimento cardíaco

BMP-11 GDF-11 Atua na embriogênese no desenvolvimento mesodermico e tecido neuronal

BMP-12 GDF-7, CDMP-3 Envolvida na condregênese; reparo e formação de tendão e ligamento

BMP-13 GDF-6, CDMP-2Envolvida na condregênese ; reparo e formação de tendão e ligamento; desenvolvimento embrionário de ossos longos

BMP-14 GDF-5, CDMP-1 Envolvida na condregênese ;atua como neurotrófico ; promove a sobrevida dos neuronio dopaminérgico

BMP-15 GDF-9b atua no desenvolvimento ovariano e sua função

estímu

lo

estímu

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estímulo

estímu

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estímulo

estímulo

Efeito da BMP-7 associado a Biomateriais na estimulação de Cultura de Osteoblastos

Yahya Acil et al. J. Cell. Biochem. 86: 90 – 98, 2002

Objetivos

• Mostrar que culturas celulares de osteoblastos sob estimulação de BMP-7 associado a Bio-Oss, Tutoplast ou PepGen15 produzem o mesmo tipo de colágeno e associações que as amostras não estimuladas, mas com maior quantidade.

Metodologia

• Células osteoblásticas coletadas de crista ilíaca de crianças (palato-fendidas): potencial mitótico grande

• Associação de BMP-7 no meio de cultura

• Análise da diferenciação através da fosfatase alcalina e osteocalcina

Metodologia

• Associação da cultura a:

• Bloco de Bio-Oss (osso bovino inorgânico)

• Bloco de Tutoplast (osso bovino inorgânico com matriz óssea acelular)

• Bloco de PepGen15 (osso bovino inorgânico com peptídeo agragador celular)

• Avaliação da presença de 3 tipos de colágeno que indicam potencial para formação de matriz óssea acelular

Resultados

Discussão

• Meio de cultura viável em 3D

• Matriz criada com potencial para agregação celular

• Efeito efetivo do BMP-7 no aumento das proteínas da matriz óssea

Levantamento de Seio Simultaneo com instalação de implante dentário na presença de PRP ou rhBMP-7

J. Camilo Roldan et al. Clin. Oral Impl. Res. 15, 2004; 716–723

Objetivos

• Avaliar e comparar a quantidade de osso formado através de PRP+enxerto versus rhBMP-7 + enxerto em modelo suíno.

Metodologia

• 5 porcos

• Levantamento de seio:

• Seio direito: 3ml Bio-Oss, 15%volume Osso autógeno, 600 μl PRP

• Seio esquerdo: 3ml Bio-Oss, 420 μl rhBMP-7 em solução tamponada

• PRP seguiu indicações de Marx, 1998: contagem de plaquetas ativas

Metodologia• Análise Policromática: injeção de contraste para acompanhar

crescimento ósseo

• Análise radiográfica, histológica, histomorfométrica e estatística

• Contato Osso-implante

• Área de osso neoformado na porção mais cervical do implante

• Altura óssea

• Sacrifício com 6 semanas

Metodologia

rhBMP-7 PRP

ResultadosRadiografia

PRP

Crescimento pequeno da baseósse autógena

Crescimento ósse por toda área enxertada.

rhBMP-7

ResultadosHistológico

PRP

Crescimento ósseo “subindo” pelo implante, mas sem osseointegração efetiva.Muitas partículas envolvida por tecido conectivo.

Tecido ósseo medular em toda área do implante, osseointegração plena.

rhBMP-7


Formação óssea depois da 5ª semana do contraste


PRP rhBMP-7

Formação óssea irregular já na 2ª semana do contraste

ResultadosEstatística

Discussão

PRP rhBMP-7x

Indução Óssea De Novo através de rhBMP-2 no Enxerto de Levantamento de Seio

Philip J. Boyne et al. J Oral Maxillofac Surg 63:1693-1707, 2005

Objetivo

• Avaliar a quantidade ideal de rhBMP-2 para induzir crescimento de seio maxilar adequado

• Avaliar o índice de sucesso dos implantes fixados sobre o enxerto

Metodologia

• 48 pacientes com levantamento bilateral

• 12 com osso autógeno, 15 com 0,75mg de rhBMP-2 e 15 com 1,50mg de rhBMP-2 embebidos em colágeno de origem bovina (“gel-foam”)

• Acompanhamento de 36 meses com carga funcional.

• Avaliação através de TC, análise histológica

Metodologia

ResultadosDensidade Óssea

rhBMP-2Autógeno +

Osso congelado

ResultadosHistologia

Discussão

• Procedimento seguro: reação imunológica mínima, sem implicações clínicas

• Todo arcabouço de colágeno foi absorvido

• Maior dose, maior formação óssea

Carga funcional a longo prazo sobre osso formado através de rhBMP-2

Sascha A. Jovanovic et al. Clin. Oral Impl. Res, 14, 2003; 793–803

Objetivos

• Avaliar a formação óssea e a osseointegração a longo prazo no osso alveolar reconstruído com arcabouço reabsorvível de colágeno e rhBMP-2 de implantes submetidos a cargas funcionais

Metodologia

• Defeito ósseo criado em 6 cães adultos, e imediatamente reconstruidos com gel-foam e rhBMP-2

• 3 meses depois, implantes foram instalados sobre os defeitos

• 4 meses depois os implantes foram ativados e próteses colocadas sobre os pilares

• Animais sacrificados depois de 12 meses de função para análise histomorfométrica

Metodologia

Metodologia

Criação do Defeito 2 meses pós-cirurgia

Metodologia

3 meses pós-cirurgia instalação de 3 implantes: 2 nos defeitos e 1 no osso restante

Metodologia

4 meses depois dos implantes, abertura e remoção de 1 implante do defeito

Implantes restante com prótese apoiada

Metodologia

7 meses de carga. 12 meses de carga.

Metodologia

Resu

ltado

s

células osteogênicas

transplante autógeno

Grande quantidadeNão-patogênica

Bioatividade uniforme

BioSeed-Oral Bone

transplante autógeno

Meios de transporte

Meios de transporte

• Distribuição homogênea das células

Meios de transporte

• Distribuição homogênea das células

• Importante para manter a função celular: osteoblastos preferem superfícies lisas, caso contrário se diferenciam em outras células.

Meios de transporte

Meios de transporte

• Substrato revestido com peptideos biomiméticos (simulação do tecido vivo)

Meios de transporte


• Reabsorvível ou não: Ácido Poliglicólico, Bio-Oss, Biocerâmicas

Meios de transporte


• Reabsorvível ou não: Ácido Poliglicólico, Bio-Oss, Biocerâmicas

• Permite formação de matriz extracelular: vantajoso na formação óssea

Meios de transporte

Meios de transporte

• Mais adequada para formação de cartilagens

Meios de transporte

• Mais adequada para formação de cartilagens

• Colágeno, fibrina, agarose (agar-agar), hidrocolóides, etc.

Meios de transporte

Meios de transporte

• Arcabouços de origem celular

Meios de transporte


• Pequena resistência mecânica (mas muito maior que o PRP)

Meios de transporte


• Pequena resistência mecânica (mas muito maior que o PRP)

• Fácil manipulação.

Análise Histológica comparativa da engenharia de tecidos utilizando células mesenquimais da medula óssea, células

ósseas do osso alveolar, e células periostaisShi-Jiang Zhu et al. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2006;101:164-9

Objetivos

• Comparar a eficácia e eficiência de cada grupo de células como base para a formação óssea

Metodologia

• 6 cães

• Células da medula coletadas do ílio, Células do periósteo da lateral do corpo da mandíbula, Células do osso alveolar...

• Depois de isoladas, mais de 90% de viabilidade

• Mesmo meio de cultura

Metodologia

• Veiculadas em cola de fibrina associada a BMP-2 (2 μg para estimular a diferenciação)

• Injetado subcutaneamente em ratos atímicos (3 grupos, um para cada tipo de cultura de célula)

• 12 semanas depois, sacrificados

• Análise histológica, histomorfomética e estatística

Resultados

• 12 semanas depois, os nódulos estavam resistentes à compressão, bem delimitados

• Maior nódulo de células periostais, menor de células do alvéolo

• Encontrato osso e matriz óssea calcificada em todos os grupos

• Sem reação de corpo-estranho

Resultadoscélulas mesenquimais da

medula óssea

Resultadoscélulas ósseas do

osso alveolar

Resultadoscélulas periostais

Resultados

Discussão

• Cola de fibrina é efetiva para preservar células

• O potencial de osteoblastos variam de acordo com a área doadora

Engenharia de tecidos baseado na cultura de células periostais em arcabouço de polímeros

Redlich A et al. J Mat Science 10:767-772, 1999

Objetivos

• Testar o potencial de formação óssea dos arcabouços em defeitos críticos em calvária de coelhos

MetodologiaIsolando as células

• Coleta de periósteo da tíbia (coelhos)

• Células isoladas:

• Periósteo digerido com Colagenase 0,25% (matriz extracelular)• Células remanescentes passaram por filtro 100μm• Células colocadas em suspensão para cultura (nutrição), com

viabilidade maior que 90%

MetodologiaMeio de cultura “camada única”

• Solução nutritiva associada a antibióticos e vitaminas (anti-oxidantes)

• Troca do meio a cada 2 dias

• Tratamento com meio osteogênico (estímulo)

• Análise nos dias 4, 8, 12 e 16 para conferir expressão da osteocalcina e fosfatase alcalina

MetodologiaMeio de cultura tridimensional

• Células colocadas em arcabouços de Ácido Poliglicólico/Poliláctico

• “embebimento”

• Tratamento com meio osteogênico (estímulo)

• Análise nas semanas 1, 2, 3 e 4 para conferir expressão da osteocalcina e fosfatase alcalina

ResultadosCultura em camada única

Controle

Fosfatase

osteocalcina


• Culturas celulares causa desdiferenciação, estímulo da diferenciação causa perda de proliferação: estímulo

Controle

Fosfatase

osteocalcina


• Culturas celulares causa desdiferenciação, estímulo da diferenciação causa perda de proliferação: estímulo

• Nas culturas, em todas os dias de análise, as células estavam ativas: imunohistoquímica

Controle

Fosfatase

osteocalcina

ResultadosCultura no meio tridimensional

Controle

osteocalcina


• Células não proliferaram dentro do arcabouço

Controle

osteocalcina


• Células não proliferaram dentro do arcabouço

• Apresentavam a diferenciação correta

Controle

osteocalcina

ResultadosCicatrização do Defeito Ósseo

controle com arcabouço

ResultadosCicatrização do Defeito Ósseo

• No controle, a cicatrização veio das bordas da lesão, no grupo tratado, houve formação de ilhotas de neoformação óssea

Terapias genéticas

Fecundação

Fecundação

Mitoses

mórula blástula

mórula blástula

Célula Tronco

estímulo

estímulo

estímulo

estímulo

estímulo

estímulo

Célula troncoGrande quantidade

Não-patogênicaBioatividade uniforme

Célula tronco

Origem da célula



Célula tronco

Origem da célula



Embrionária

Célula tronco

Origem da célula



Embrionária

adulta

Limitações

Rápido envelhecimento: telômeros

Limitações

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc

o

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc

o• Quantidade enorme de células: clínicas de reprodução

assistida, cultura in vitro

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc



• Campo extremamente promissor: Clonagem terapeutica (tecidos sobretudo)

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc




• Recuperação de tecido nervoso (Parkinson, lesões cervicais), pele, rim, etc...

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc





• Campo mais avançado: formação dentária

EmbrionáriaC

élu

la t

ro

nc





• Campo mais avançado: formação dentária

• Lobby Religioso (EUA proibiram pesquisas)

Medula ÓsseaC

élu

la t

ro

nc

o

Medula ÓsseaC

élu

la t

ro

nc

o

• Menor capacidade de diferenciação

Medula ÓsseaC

élu

la t

ro

nc

o

• Menor capacidade de diferenciação• Qde. limitada:

• Criança: 1:10.000

• Adulto: 1:400.000

Medula ÓsseaC

élu

la t

ro

nc

o

• Menor capacidade de diferenciação• Qde. limitada:

• Criança: 1:10.000

• Adulto: 1:400.000

• Difícil seleção (processo caro, não aplicado comercialmente)

Cordão UmbilicalC

élu

la t

ro

nc

o

Cordão UmbilicalC

élu

la t

ro

nc

o• Fonte de células progenitoras hematopoéticas

Cordão UmbilicalC

élu

la t

ro

nc


• Indicação para pacientes com doenças sanguíneas (leucemia)

Cordão UmbilicalC

élu

la t

ro

nc



• Pouco risco de rejeição quando transplantado: “mutação in vitro”

Cordão UmbilicalC

élu

la t

ro

nc



• Pouco risco de rejeição quando transplantado: “mutação in vitro”

• Doenças genéticas no doador?

Células Locais ProgenitorasC

élu

la t

ro

nc

o


élu

la t

ro

nc

o

• Presente em todos os tecidos de interesse


élu

la t

ro

nc

o

• Presente em todos os tecidos de interesse• Não aplicável quando tecido está alterado (doença

genética, por ex.)


élu

la t

ro

nc

o


genética, por ex.)• Fácil obtenção, qde. grande


élu

la t

ro

nc

o


genética, por ex.)• Fácil obtenção, qde. grande• Diferenciação limitada, menor estímulo

Limitações atuais

Limitações atuais

• Células tronco originam tecidos, não orgãos

Limitações atuais

• Células tronco originam tecidos, não orgãos

• Dente:

• Polpa• Dentina• Esmalte• Cemento• Fibras Periodontais• Osso Alveolar

fatos

• Células progenitoras dentárias da polpa de dentes descíduos e permanentes podem gerar dentina e osso alveolar

fatos

• Células progenitoras dentárias da polpa de dentes descíduos e permanentes podem gerar dentina e osso alveolar

• Célular originadas dos dentes imaturos (germes) são capazes de formar coroas com esmalte, dentina e polpa, com resquícios anatômicos

vamos perder o emprego?

quando vamos perder o emprego?


quando vamos perder o emprego?


quando a implantodontia vai ficar obsoleta?

limitações

limitações

• Pouco conhecimento do processo de diferenciação dentária

limitações


• Pouca capacidade de regeneração dos tecidos dentários adultos

limitações


• Pouca capacidade de regeneração dos tecidos dentários adultos

• Dificuldade em selecionar células adequadas

Proliferação no

epitélio dental

Proliferação no

epitélio dental

fase de botão

Proliferação no

epitélio dental fase de capuz

fase de botão

Proliferação no


fase de campânulafase de botão

Proliferação no


fase de campânula

formação de

esmalte e dentina

fase de botão

Proliferação no


fase de campânula

formação de

esmalte e dentina

fase de botão mineralização

Terapias regenerativas


• Recuperação do complexo pulpar sem pulpectomia: uso de fatores de crescimento e/ou células progenitoras



• Estímulos diferentes para cada grupo de células




• Criação de dentes anatomicamente corretos usando arcabouços absorvíveis: ácido polilático/poliglicólico/hialurônico, fibrina




• Criação de dentes anatomicamente corretos usando arcabouços absorvíveis: ácido polilático/poliglicólico/hialurônico, fibrina

• Dificuldades na formação radicular

estudos atuais

estudos atuais

• Uso de modelos animais para estudo da diferenciação dentária: roedores, peixes

estudos atuais


• Identificar quais grupos de células são mais efetivas para formação dentária

estudos atuais


• Identificar quais grupos de células são mais efetivas para formação dentária

• Regeneração radicular adequada

Quando?

Os artigos estão relacionados em cada slide.

PRP e Fatores de CrescimentoMarco Pontual e Ricardo Magini, Livraira Santos, Curitiba, 2004

Histologia BásicaJunqueira e Carneiro, 2003

Bib

lio

gr

afi

a

Centro de Estudos Práticos e Pesquisa dedicado aos cursos de atualização em

Implantodontia, Cirurgia e Prótese ministrados pelo Instituto Velasco.

Cursos com credenciamento no MEC, sob portaria nº 1.342 de 10 de novembro de 2008, seguindo diretivas do CFO para cursos de especialização em odontologia.

Transformando conhecimento em saúde

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PRP e Fatores de Crescimento

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