Aula 1 – Introdução a Química Analítica Instrumental Parte 3 - Calibração

Prof. Julio C. J. Silva

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas

Depto. de Química

Juiz de Fora, 1o Semestre, 2020

QUI 093 – Métodos Instrumentais de Análise

Padronização e Calibração

• Métodos absolutos ???

• Métodos relativos ???

https://ipemsp.files.wordpress.com/2010/05/tira-taxi.jpg

Métodos de Calibração

Gráficos De Calibração Em Análise Instrumental

“Calibração é um conjunto de operações que estabelece, sob condições especificadas, a relação entre valores indicados por um instrumento de medição ou sistema de medição ou valores representados por uma

medida materializada ou um material de referência, e os valores correspondentes estabelecidos por padrões”

ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, 2004.

Resposta x concentração

Determinação da Concentração

Determinação da Concentração

Correlação e Regressão • Em análise instrumental normalmente é necessário calibrar o instrumento

• A maneira usual para realizar calibração é submeter porções conhecidas da quantidade (p. ex. usando-se um padrão de medida ou material de referência) ao processo de medição e monitorar a resposta da medição

• Curva de calibração gráfico da resposta do instrumento (eixo y) em relação a concentração dos padrões (eixo x)

• Curva e amostra desconhecida devem estar nas mesmas condições experimentais para que a concentração da amostra desconhecida seja determinado por interpolação gráfica da curva

• Condições a serem verificadas:

– Encontrar a melhor curva que se ajusta aos pontos

– Quais são os erros para a inclinação e intercepto da linha?

– Quais erros para a concentração determinada?

– O gráfico é linear ou não?

– Qual é o limite de detecção (LD/LQ)?

Regressão Linear (Métodos dos Mínimos Quadrados)

• Análise de regressão: estabelecer a melhor reta que passa pelos pontos (modelo de regressão)

• Exigências:

1. Relação linear

• Equação da reta (modelo matemático) y = bx + a – b = inclinação da reta (slope)

– a = interseção no eixo x (coeficiente linear)

– y = variável dependente (resposta [ordenada])

– x = variável independente (concentração [abscissa])

2. O erro em x é considerado desprezível

Regressão Linear (métodos dos mínimos quadrados)

Método dos mínimos quadrados

“Método estatístico de obtenção dos parâmetros de um modelo matemático (tal como a equação de uma linha reta) pela minimização da soma dos quadrados das diferenças entre os pontos experimentais e os

pontos previstos pelo modelo”

Parâmetros da equação da reta (modelo matemático)

Resíduos (Diferença dos pontos medidos em relação a regressão)

• Resíduo = yi – (bxi + a)

• Soma dos quadrados dos resíduos

• Desvio padrão da regressão (Sy/x)

• Desvio padrão da inclinação (b)

• Desvio padrão da interseção da reta (a)

Erros (desvios padrões)

Erro na estimativa da concentração (sXo)

• sXo = Desvio padrão dos resultados a partir da curva

• b = Inclinação da curva

• Sy/x = Desvio padrão da regressão

• Yo = resposta de y para a concentração desconhecida (xo)

• m = número de replicatas

• n = número de pontos as curva

(IC):

Correlação e Regressão • Coeficiente de correlação (r) mede a fração da variação observada em y

que é explicada pela relação linear :

• Quanto mais próximo r está da unidade, melhor o modelo linear explica as variações de y

Regressão Linear (Parâmetros do Método dos Mínimos Quadrados)

Métodos de Calibração

Erros no Coeficiente Angular e no Intercepto

• Branco - Evitar contaminação de três fontes primárias:

• Aparelhos (Branco instrumental)

• Reagentes (Branco de calibração)

• Laboratório (Branco da amostra)

• Principais erros sistemáticos no preparo das amostras:

• Contaminação

- Ambiente de trabalho (ar)

- Impurezas nos reagentes

- Materiais

• Perdas de elementos

- Volatilização

- Adsorção

• Decomposição incompleta da amostra

• Amostragem

• Erros aleatórios derivados da curva

Erros na Análise

Erros na Análise - Métodos Analíticos

Solos Minério

Água Plantas Frutos Animais

Poeira (PTS) Insetos Clínica

PM10 PM2,5

PM1,0

Balança

Erros na Análise - Métodos Analíticos

1960 – 1 ppm: Pb (gasolina): 1º fio de cabelo branco

1970 – 1 ppb (composto policíclicos aromáticos): agulha no palheiro

1980 – 1 ppt (dioxina em leite): lente de contato numa praia de 150 Km

Nobrega, J.A. I Escola de Química UFAM, 2013.

Erros na Análise

• Ambiente de trabalho (ar) • Teores de alguns elementos no ambiente de trabalho

Erros na Análise - Fontes de contaminação

• Ambiente de trabalho (ar) • Teores de alguns elementos no ambiente de trabalho

Richter, R. Clean Chemistry. Techniques for Modern Laboratories. Monroe, Milestone Press, 2003.

Erros na Análise - Fontes de contaminação

Erros na Análise - Fontes de contaminação

http://www.francodoamaral.med.br/upload/imagens/a20.jpg

Nobrega, J.A. I Escola de Química UFAM, 2013.

Erros na Análise - Fontes de contaminação

“O objetivo da amostragem é coletar uma porção representativa para análise, cujo resultado fornecerá uma imagem mais

próxima do universo estudado”

“Não importando que a amostragem seja simples ou complexa,

todavia, o analista deve ter a certeza de que a amostra de laboratório é representativa do todo antes de realizar a

análise”

“Frequentemente, a amostragem é a etapa mais difícil e a fonte

dos maiores erros. A confiabilidade dos resultados finais da análise nunca será maior que a confiabilidade da etapa de

amostragem”

Erros na Análise - Amostragem

Erros de Análise - AMOSTRAGEM

Erros na Análise - Amostragem

Unidades de amostragem

Erros na Análise - Amostragem

http://www.scielo.br/img/fbpe/rem/v55n3/3a11f1.gif

Erros na Amostragem - Amostragem

• Os erros aleatórios também podem influenciar a exatidão dos resultados obtidos a partir de curvas de calibração.

• Pode-se observar que o desvio padrão (Sx0) na concentração do analito, obtido de uma curva de calibração, é mínimo quando a resposta (previsão de y0) da amostra se aproxima do valor médio (previsão média de y).

• O ponto x(média), y (média) representa o centro da reta de regressão. Os pontos próximos desse valor são determinados com mais certeza que aqueles mais distantes da região central.

Erros na Análise - Calibração

Erros na estimativa da concentração

Exemplo 1: Na determinação de um fármaco por fluorescência em meio ácido foram obtidos os seguintes resultados:

a) Calcule o valor de r e a equação da reta;

b) Considerando que o sinal de uma amostra desconhecida foi de 16,1 (n = 1), calcule o valor estimado de quinina na amostra;

c) Calcule os desvios padrões da inclinação e da interseção da reta;

d) Calcule o erro da concentração Sxo para a concentração de [x] e seu IC (95%);

• Resposta: r = 0,9987; b = 48,3; a = 0,24; [x] = 0,328 mg L-1; Sb = 1,427; Sa = 0,3496; Sxo = 0,016 e IC(xo) = 0,328 0,05 mg L-1

Concentração de quinina (mg L-1) 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40

Valores de fluorescência 0,00 5,20 9,90 15,30 19,10

Minimização de Erros

• Separações

• Modificação de matriz e mascaramento

• Diluição e equiparação de Matriz (matrix matching)

• Método das adições de padrão

• Método do padrão interno (PI)

Método de determinação da concentração de um analito em solução. Pequenas quantidades conhecidas do analito são adicionadas à

solução da amostra e as leituras do instrumento são registradas após uma ou mais adições.

O método de adição padrão é trabalhoso, mas é especialmente importante quando a amostra é muito complexa, quando as interações com a matriz são significativas e quando houver

dificuldade de encontrar um padrão interno adequado ou uma matriz isenta da substância de interesse

MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO

[Xi]/([S]f + [X]f) = Ix/Is+x

[X]f = [X]i x (V0/V)

[S]f = [S]i x (Vs/V)

[X]i = conc. do analito na solução inicial

[X]f = concentração do analito na solução final

[S]f = concentração do padrão na solução final

Ix = sinal da solução inicial

Ix+s = sinal da solução final

[S]i = concentração do padrão na solução inicial

Vo = Volume inicial da amostra

Vs = volume do padrão

V = Volume total

MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO

MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO (Adições múltiplas - Método Gráfico)

y = b.xE + a, y = 0 → xE = - a/b

Cx

Cx

Um soro contendo Na+ fornece um sinal de 4,27 mV em uma análise de emissão atômica. Então 5,00 mL de uma solução de NaCl 2,08 mol L-1 foram adicionados a 95,00 mL de soro. Esse soro contaminado fornece um sinal de 7,98 mV. Considerando os dados acima encontre a [Na] na amostra de soro.

R: 0,113 mol L-1

Exemplo 3

R: 17,3 g mL-1

Exemplo 2

“Amostra gravimetricamente contaminada”

Método do Adição e Recuperação (Spike)

Elementos Nível 1

Nível 2

Nível 3

75As 87,5 ± 6,7 91,7 ± 6,7 93,8 ± 7,6

137Ba 134,1 ± 31,8 117,3 ± 13,4 112,6 ± 7,7

114Cd 99,3 ± 6,6 99,3 ± 7,7 100,7 ± 8,3

59Co 87,1 ± 7,1 87,8 ± 8,1 89,2 ± 8,3

52Cr 87,6 ± 14,0 86,2 ± 11,0 86,3 ± 9,9

133Cs 104,6 ± 3,5 104,6 ± 4,2 105,4 ± 4,7

63Cu 100,2 ± 8,1 97,8 ± 6,7 97,9 ± 6,8

69Ga 97,6 ± 5,3 96,4 ± 5,1 97,3 ± 6,2

113In 96,4 ± 7,6 96,5 ± 6,2 98,1 ± 8,1

7Li 83,6 ± 9,0 82,6 ± 8,6 83,5 ± 8,2

60Ni 89,6 ± 8,4 90,4 ± 8,8 91,5 ± 7,9

206Pb 114,6 ± 5,3 113,4 ± 5,1 114,1 ± 5,5

109Ag 85,3 ± 31,1 87,2 ± 30,8 88,8 ± 31,1

86Sr 91,5 ± 2,5 95,7 ± 5,2 97,8 ± 6,8

203Tl 112,2 ± 4,3 112,8 ± 5,0 113,5 ± 5,4

51V 79,3 ± 8,1 81,6 ± 8,2 83,3 ± 8,5

64Zn 116,2 ± 10,5 101,8 ± 8,2 99,4 ± 5,4

Método do Padrão Interno (PI)

• No método do padrão interno, uma quantidade conhecida da espécie que atua como referência é adicionada a todas as amostras, padrões e brancos. Então o sinal de resposta não é aquele do próprio analito, mas sim da razão entre o sinal do analito e o da espécie de referência.

• É preparada, como de maneira usual, uma curva de calibração na qual o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x, a concentração do analito nos padrões.

• Adição de quantidade conhecida de elemento nos padrões e na amostra

• Corrige variações no sinal analítico devido a mudanças nas condições de análise

• O padrão interno deve ser semelhante ao analito para “sofrer” os mesmos efeitos !

Método do Padrão Interno (PI)

Método do Padrão Interno (PI)

Ax /[ X ] = F x As/[ S ]

Ax = área do sinal do constituinte

[X] = concentração do constituinte

As = área do sinal do padrão interno (PI)

[S] = concentração do padrão interno

F = Fator de resposta

Exemplo 4: Em um experimento preliminar, uma solução contendo 0,0837 mol L-1 de X e 0,0666 mol L-1 de S (padrão interno) fornece picos com área de Ax = 423 e As = 347. Para analisar a amostra desconhecida, 10,0 mL de uma solução de 0,146 mol L-1 de S foram adicionados a 10 mL da amostra desconhecida, e a mistura foi diluída a 25 mL. A mistura forneceu um cromatograma com Ax = 553 e As = 582. Encontre [X] na amostra.

R = 0,143 mol L-1

Figuras de Mérito • Validação

– Sensibilidade

– Limites de detecção (LD) e Quantificação (LQ)

– Faixa dinâmica linear

– Adição e recuperação (spike, tendência)

– Precisão

Sensibilidade Sensibilidade da calibração • A sensibilidade da calibração reflete o quanto de medida observada

é aumentada após o acréscimo de uma unidade em concentração da espécie de interesse.

• Numericamente, ela é determinada pelo coeficiente angular da curva analítica.

Y = bx + a ( b = inclinação = sensibilidade)

• Essa medida não é capaz de informar as diferenças de

concentrações que podem ser detectadas. Sensibilidade analítica • É definida como a razão entre a inclinação da curva analítica e o

desvio padrão do sinal analítico em uma determinada concentração.

• Esse parâmetro leva em consideração o ruído presente nos sinais de resposta.

• g = b/s (desvio padrão do sinal)

Faixa dinâmica de trabalho (Faixa Linear)

• LOQ – Limite de Quantificação

• LOD – Limite de Detecção

• LOL – Limite de linearidade

https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.slideser

ve.com%2Fdieter-spence%2Fcalibration-

methods&psig=AOvVaw1phB7jPFy4KSnwQvl92Zmd&ust=158830285

6170000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCODI6bqXj-

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Limites de Detecção

Limite de detecção (LD) e Quantificação (LQ): é a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de confiança. Toda técnica analítica tem um limite de detecção. LD = Ybco + K . Sbco em termos de sinal LD = limite de detecção (em termos de sinal)

Ybco = sinal do banco intercepto (estimativa) Sbco = desvio padrão do branco (n= 10 no mínimo) Sy/x (estimativa)

LD = (K . Sbco) / S em termos concentração S = Sensibilidade (coef. angular da curva analítica (b))

LQ = (10 . Sdbco)/S em termos concentração LQ = limite de quantificação LQ (INMETRO): usar o primeiro ponto da curva analítica de calibração

Limites de Detecção (sinal)

• Um valor de k de 3 corresponde a um nível de confiança de 98%

Limites de Detecção • Exemplo 5: Usar os dados do exemplo 2 para calcular o

LD e o LQ.

Controle de Qualidade dos Resultados (Gráficos de Controle)

• Um gráfico de controle é um gráfico sequencial de alguma característica que é importante na garantia de qualidade.

• O gráfico também mostra os limites estatísticos da variação que são permissíveis para a característica que está sendo medida.

• = média da população

• = Desvio padrão da população

• N = no de replicatas

• LSC =limite superior de controle

• LIC = limite inferior de controle

Controle de Qualidade dos Resultados (Gráficos de Controle)

Ensaio de Proficiência

• Determinação de Metais em matriz de Água por ICP-MS - PEP 002/2007 (SENAI-CETIND-BA)

• Resultados – Arsênio (z-scores)

Lab/ICP-MS

Exemplo 6: Construa um gráfico de controle para “Total de óbitos”. Considere N = 1. Obs.: no site tem um exercício modelo.

Validação de métodos (INMETRO)

• Validação – Seletividade – Faixa de trabalho (curva analítica) – Linearidade (r) – Sensibilidade – Limite de detecção (LD) – Limite de quantificação (LQ) – Exatidão (CRM) – Teste de hipótese (teste t = 95%) – Adição e recuperação (spike, tendência) – Precisão – Registro de validação – Robustez – Ensaio interlaboratorial – Incerteza de medição

Referências

-Cadore, S. Notas de aula. IQ, UNICAMP, 2004.

-Santos, M., Notas de aula. Depto Química, UFJF. 2009

-D. A. SKOOG, D. M. WEST, F. J. HOLLER e S. R. CROUCH –

Fundamentos de Química Analitica, 1a ed., Thomson, 2006.

- Baccan, N., Química Analítica Quantitativa Elementar. 3a Ed.

Edgard Blucher LTDA

- James N. Miller & Jane C. Miller. Statistics and Chemometrics for

Analytical Chemistry, fourth edition. Person Education.

-ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, 2004.

- Lowinsohn, D., Notas de aula. Depto. de Química, UFJF. 2009.