Regulação da expressão e caracterização de tiorredoxina ...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

Gisele Monteiro

Regulação da expressão e caracterização de

tiorredoxina peroxidase mitocondrial.

São Paulo 2005

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS –

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA EVOLUTIVA E GENÉTICA.

Regulação da expressão e caracterização de

tiorredoxina peroxidase mitocondrial.

Gisele Monteiro

Tese apresentada ao Departamento de Biologia Evolutiva e Genética do Instituto

de Biociências da Universidade de São Paulo para obtenção do título de doutor.

Orientador: Luis Eduardo Soares Netto

São Paulo 2005

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Monteiro, Gisele

“Regulação da expressão e caracterização de tiorredoxina peroxidase

mitocondrial.”

157 páginas

Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.

Departamento de Biologia Evolutiva - Genética.

1. Saccharomyces cerevisiae. 2. peroxirredoxinas. 3. defesa antioxidante. 4. tiorredoxina peroxidase mitocondrial I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Biologia/ Genética.

Comissão Julgadora:

Prof(a). Dr(a).

Prof(a). Dr(a).

Prof(a). Dr(a).

Prof(a). Dr(a).

Prof. Dr. Luis Eduardo Soares Netto

Orientador

4

Aos meus pais.

5

“A melhor maneira de ter uma boa idéia é ter muitas idéias.” Linus Pauling

6

AGRADECIMENTOS. Primeiramente aos meus pais (Vicente e Ivanir) por terem acreditado em mim e investido seus esforços na minha educação. Ao meu marido, amigo e companheiro de todas as horas, Horácio, pelo amor e paciência, vitais não só para completar meus estudos, mas também para minha felicidade plena. À minha irmã Liliana, que é única, não só pelo fato de sermos só 2 filhas, mas pelo seu exemplo de coragem, fé na vida e nas pessoas. Você deu à nossa família os dois mais lindos presentes: Nathália e Renan. Ao meu orientador Luis E. S. Netto, que apesar da pouca idade para isso, eu considero como meu pai de Ciência. Ao Prof. Gonçalo A.G. Pereira que me ensinou a amar minha profissão. Aos meus irmãos de Ciência: Marcos, Anderson, Victor, Carla, Ana Paula, Diana e Camila. Aos meus companheiros de luta uspiana: Simone, Bruno, Gustavo, José Renato, Karen, Ana Paula (Simoninha), Rafael, Miriam, Telma, Carol I (Ana Carolina), Carolzinha e Daniela (loura). Ao Vitor Hugo de Almeida e Silva (orgulho da mamãe) Aos Professores Maria Cristina Arias, Eduardo Gorab, Sérgio Mattioli, Shaker Chuck Farah, Alícia Kowaltowski e Ohara Augusto por terem gentilmente cedido equipamentos, reagentes, auxiliares e parte de seus tempos para ajudar, em grande parte, a realização dessa tese. À Suzy, técnica da Profa. Dra. Maria C. Arias, pela amizade e por ajudar no bom funcionamento do nosso Departamento. Ao meu amigo Linus Pauling que me ajudou a superar uma das fases mais difíceis da minha vida. À CNPq e principalmente à FAPESP pelo auxílio financeiro indispensável. À todos que direta ou indiretamente me ajudaram nessa longa jornada. Àquele que tem muitos nomes e um só significado, Deus.

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ABREVIATURAS:

AhpI = alquil hidroperóxido redutase (cTPxIII)

AO = ascorbato oxidase

ATZ = 3-amino-1,2,4-triazol – inibidor específico de catalase

cAMP = AMP cíclico

cTPxI = tiorredoxina peroxidase citossólica I de Saccharomyces cerevisiae

cTPxII = tiorredoxina peroxidase citossólica II de Saccharomyces cerevisiae

cTPxIII = tiorredoxina peroxidase citossólica III de Saccharomyces cerevisiae (AhpI)

Cysp = cisteína peroxidásica

Cysr = cisteína de resolução

1-Cys = peroxirredoxinas da classe 1-Cys

2-Cys = peroxirredoxinas da classe 2-Cys

DHA = ácido dehidroascórbico

DTNB = 5-5’-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) – reagente de Ellman’s

DTT = ditiotreitol

EGTA = etileno glicol-bis (beta-aminoetil éter)N,N,N’,N’, ácido tetra acético

EPR = ressonância paramagnética eletrônica

EROs = espécies reativas de oxigênio

ERNs = espécies reativas de nitrogênio

FCCP = carbonil cianide m-clorofenil-hidrazona

FOX2 = ensaio Fe+2 xylenol orange

GSH = glutationa reduzida

GSSG = glutationa oxidada

GS = enzima glutamina sintetase

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Hap1p = “heme activator protein I” ou proteína ativadora dependente de heme.

MPT = “mitochondrial permeability transition” ou permeabilidade transitória da mitocôndria.

mTPxI = tiorredoxina peroxidase mitocondrial I de Saccharomyces cerevisiae (PrxI)

NBD = (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol)

NEM = N-etilmaleimida

nTPxI = tiorredoxina peroxidase nuclear I de Saccharomyces cerevisiae (PrxQ, DOT5)

PKA= proteína quinase A

Prxs = peroxirredoxinas

rmTPxI = tiorredoxina peroxidase mitocondrial recombinante – cauda T7

rmTPxsnt = tiorredoxina peroxidase mitocondrial recombinante – sem os primeiros 48

aminoácidos, com cauda de histidina

rRNA = RNA ribossomal

SH = sulfidrila reduzida

SOH = ácido sulfênico, forma oxidada da sulfidrila

Srx = enzima sulfirredoxina

STRE = “stress transcription response element” ou elemento de resposta transcricional à

estresse.

TPxs = tiorredoxina peroxidases

t-BOOH = tert-butil hidroperóxido

Trr2p = tiorredoxina redutase mitocondrial

Trx3p = tiorredoxina mitocondrial

YBL064c = gene que codifica para mTPxI

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ÍNDICE

(I) INTRODUÇÃO GERAL 11

(I.1) Respiração celular – avanços e implicações na obtenção de energia. 11

(I.2) As Peroxirredoxinas. 15

(II) OBJETIVOS 24

(III) CAPÍTULO I –

Caracterização da Expressão Gênica de mTPxI.

25

(III.1) INTRODUÇÃO. 25

(III.1.1) Saccharomyces cerevisiae e a Repressão por glicose. 25

(III.1.2) Resposta de S. cerevisiae a agentes oxidantes. 33

III.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA

EXPRESSÃO GÊNICA.

38

(III.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO. 49

(III.3.1) Regulação da expressão de mTPxI durante a mudança diauxica –

envolvimento de Msn2/4p e sinalização por cAMP.

49

(III.3.2) Complexidade na regulação da expressão de mTPxI por peróxidos. 59

(IV) CAPÍTULO II –

Estudo da função celular de mTPxI – Efeito protetor na mitocôndria.

70

(IV.1) INTRODUÇÃO. 70

(IV.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA

PERMEABILIDADE DA MEMBRANA INTERNA MITOCONDRIAL EM

LEVEDURAS.

73

10

(IV.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO. 79

(V) CAPÍTULO III –

Análise da atividade e estrutura de mTPxI .

92

(V.1) INTRODUÇÃO 92

(V.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. 96

(V.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO 111

(VI) DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES. 132

(VII) RESUMO. 140

(VIII) ABSTRACT. 142

(IX) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 144

11

(I) INTRODUÇÃO GERAL

(I.1) Respiração celular – avanços e implicações na obtenção de energia.

Os organismos podem obter energia metabólica (na forma de ATP) através de diversos

processos. Dentre eles destacam-se a fermentação e a respiração, sendo uma importante

diferença entre esses processos a utilização ou não de oxigênio para metabolizar fontes de

carbono, além do saldo final na produção de ATP. Na fermentação não é necessária a presença

de O2 e 2 ATPs são produzidos por molécula de glicose; enquanto na respiração, o O2 é

responsável pela oxidação completa da glicose a CO2 e água, liberando de 36 a 38 ATPs por

molécula de glicose. Portanto, o aparecimento da respiração melhorou o rendimento energético,

resultando em maior produção de ATP por molécula de glicose consumida.

Contudo, o surgimento do O2 na atmosfera terrestre transformou o ambiente de redutor

para oxidante. O uso desse gás para obtenção de energia é enzimaticamente eficiente; mais de

99.9% do oxigênio é reduzido à água pela citocromo c oxidase (complexo IV) na cadeia

respiratória. Porém, em cerca de 0.01 a 0.1% das transferências eletrônicas, O2 tende a sofrer

redução monoeletrônica por outros componentes da cadeia respiratória (como semi-ubiquinona e

radicais livres derivados de flavinas), gerando o radical ânion superóxido (O2. -) (Korshunov et

al., 1997; St-Pierre et al., 2002).

Através de uma série de reduções incompletas do O2, podem ser produzidas espécies

radicalares e outros intermediários com propriedades físico-químicas diversas (reações I). Esses

intermediários têm sido denominados, inapropriadamente, de Espécies Reativas de Oxigênio

(EROs), porque somente o radical hidroxila é altamente reativo. Porém, para simplificação,

nessa tese utilizaremos o termo EROs devido ao fato dele ser amplamente empregado na

literatura. De qualquer forma, como ânion superóxido e peróxido de hidrogênio podem ser

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convertidos em radical hidroxila e outros oxidantes, perto de alvos críticos, essas moléculas

apresentam propriedades tóxicas. Um radical livre é definido como qualquer espécie que possui

elétrons desemparelhados em sua camada eletrônica mais externa (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Reações I:

1e- 1e- 1e- 1e-

O2 → O2. - → H2O2 → . OH → H2O

2H+

As chamadas EROs (O2. - - ânion superóxido; H2O2 – peróxido de hidrogênio; .OH–

radical hidroxila) são produzidas em organismos aeróbios sob diversas circunstâncias. A redução

incompleta do O2 durante a respiração, o metabolismo de lipídeos no peroxissomo (β - oxidação)

e processos como isquemia-reperfusão são algumas das fontes endógenas de EROs. Essas

espécies são conhecidas pela sua capacidade de danificar componentes celulares como DNA,

proteínas e lipídeos de membranas. A oxidação de lipídios de membrana pode iniciar reações em

cadeia de formação de radicais que alteram a permeabilidade da membrana e aumentam muito

outras espécies reativas como hidroperóxidos de lipídio, alcoxil e radicais peroxil, além de

epóxidos de lipídio e aldeídos (Fridovich, 1978 & Sies, 1993). Macrófagos e neutrófilos usam

essas propriedades destrutivas de EROs para atacar agentes invasores (Andrew et al., 1985).

Diversos estudos têm implicado a produção de EROs com alguns processos patológicos como

diabetes, arteriosclerose, doenças neurodegenerativas, câncer e envelhecimento. De fato, há

indícios de que ocorre um permanente, embora discreto, aumento de lesões oxidativas em

biomoléculas, que se acumulam ao longo dos anos, sendo uma das possíveis causas do

envelhecimento.

O . OH é a espécie mais reativa que se conhece, por isso reage muito perto do local onde é

produzido. Além disso, a especificidade do . OH é muito baixa, podendo reagir com praticamente

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qualquer biomolécula que esteja ao seu redor. Reações catalisadas por metais como as descritas

abaixo têm sido classicamente implicadas na formação do . OH (Reações II, III e IV) (revisão em

Stadtman e Berlett, 1991).

Reação II: O2. - + HO2

. → H2O2 + O2

Reação III: H2O2 + Fe2+ → . OH + OH- + Fe3+ (Fenton)

Reação IV: O2. - + Fe3+ → O2 + Fe2+

Com a descrição da formação de óxido nítrico (NO) em sistemas biológicos, uma nova

via de formação de . OH independente de metais tem sido amplamente investigada. A reação de

O2. - com NO (reação V) possui uma alta constante de segunda ordem (~1010 M-1 s-1), gerando

um potente oxidante, o peroxinitrito (revisado por Klotz e Sies, 2003). O peroxinitrito, por sua

vez, em pH fisiológico pode sofrer homólise com geração de . OH (reações VI-VII).

Reação V: O2. - + NO → ONOO-

Reação VI: ONOO- + H+ → ONOOH

Reação VII: ONOOH → . OH + NO2.

Em sistemas biológicos, CO2 está presente em altas concentrações e interfere, por

exemplo, na reatividade do peroxinitrito. Na presença de CO2, peroxinitrito gera CO3. –, além de

decair a . OH e NO2. (Revisado por Augusto et al., 2002).

Durante a evolução, organismos que se adaptaram ao meio aeróbio, desenvolveram

algumas frentes de defesas contra danos causados pelas chamadas EROs e também por espécies

reativas de nitrogênio (ERNs). De forma simplificada podemos descrevê-las:

Compostos que previnem a formação de radicais livres e espécies reativas. Nesse

subgrupo podemos incluir compostos que se ligam à metais de transição inibindo

assim a ocorrência das reações III e IV, sendo os complexos formados menos eficazes

na participação em reações de óxido - redução. Podemos citar como exemplos

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biológicos desses quelantes os sideróforos de bactérias, como a desferroxiamina, e

proteínas como a metalotioneína, a transferrina e a ferritina.

Sistemas envolvidos na desativação de radicais livres e outros intermediários.

Antioxidantes de baixo peso molecular como a vitamina C (ascorbato), a vitamina E

(alfa – tocoferol) e a glutationa são exemplos de compostos abundantes dentro da

célula responsáveis pela interação e redução de espécies oxidantes. Sistemas

antioxidantes compostos por enzimas, que serão amplamente discutidos nessa tese,

também fazem parte dessa linha de defesa. São exemplos desses últimos as catalases,

superóxido dismutases, peroxirredoxinas (alvo de nosso estudo), glutationa

peroxidases, dentre outras.

A terceira via de defesa compreende o reparo de lesões causadas pelos oxidantes que

escaparam às duas primeiras linhas de defesa. Os sistemas de reparo de lesões de

DNA são mais abundantes e também mais bem descritos. Contudo, há reparo também

em proteínas como a metionina sulfóxido redutase (MSOR) que repara a oxidação

desse aminoácido. As metioninas são alvos primários de oxidação, podendo proteger

assim resíduos cruciais para atividade de proteínas (Stadtman, 1992; Stadtman et al.,

2005; Moskovitz et al., 2001). A MSOR reduz metionina sulfóxido a metionina às

custas de elétrons provenientes de NADPH através do sistema tiorredoxina.

Todos os sistemas descritos acima, não agem de forma independente ou aleatória. Há um

complexo sistema regulatório capaz de tornar mais eficaz e menos dispendiosa a reposta

antioxidante. Daí a importância no estudo da regulação da expressão de genes de resposta ao

estresse oxidativo, a fim de compreender quando e em quais condições determinadas enzimas se

fazem necessárias.

15

(1.II) As Peroxirredoxinas.

Dentre os diversos sistemas antioxidantes conhecidos, nosso interesse está centrado na

compreensão da regulação da expressão gênica, estrutura e função das Prxs. Essas enzimas

foram recentemente descritas, em comparação com outras enzimas antioxidantes, e sua função

biológica ainda é pouco conhecida.

A primeira descrição de Prxs em S. cerevisiae se deu de uma forma curiosa. Os grupos

dos Drs. Stadtman e Rhee estavam enfrentando problemas na purificação de glutamina sintetase

(GS). Durante alguns passos da purificação de GS, esta enzima perdia a atividade enzimática em

tampões que continham DTT ou β-mercaptoetanol. Investigações desse fenômeno mostraram

que os danos à GS são causados pela reação química de espécies geradas pelo sistema contendo

Fe3+, O2 e tióis (Kim et al., 1985). Outras proteínas também são susceptíveis à degradação pelo

sistema oxidante descrito. Estudos do mesmo grupo mostraram que na presença de extrato

celular de leveduras, GS não sofria inativação causada por Fe3+/ O2 / DTT, indicando a presença

de um fator capaz de proteger GS contra danos causados pelo sistema. Em 1988, Kim et al.

isolaram uma proteína antioxidante em S. cerevisiae, cuja propriedade particular era o fato da

mesma só proteger GS na presença de tióis (por exemplo, ao se substituir DTT por ascorbato, ela

perdia seu efeito protetor).

Primeiramente, como hipótese de trabalho, foi sugerida que essa especificidade por tióis

seria devida a uma suposta capacidade de desativação de radicais livres centrados no enxofre,

portanto nos grupos sulfidrila (Yim et al., 1994). Devido a essa hipótese, a enzima recebeu o

nome de TSA (“thiol specific antioxidant”). No entanto, foi demonstrado posteriormente que

TSA é uma peroxidase dependente de tiól (Chae et al., 1994 –; Netto et al., 1996). Portanto, a

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especificidade de TSA por tióis se devia ao fato de que somente esses redutores são capazes de

regenerar a sua forma oxidada.

A levedura S. cerevisiae possui um sistema antioxidante abrangente e parcialmente

redundante capaz de decompor peróxidos orgânicos e H2O2. Esse sistema é composto de

moléculas de baixo peso molecular (como glutationa e eritroascorbato, por exemplo), além de

diversas enzimas distribuídas nos diferentes compartimentos celulares e reguladas de maneira a

participarem eficientemente na defesa antioxidante (Jamieson et al., 1998). Dentre essas

enzimas, encontram-se as tiorredoxinas peroxidases (pertencentes à família das Prxs) que

catalisam a seguinte reação, descrita por Netto et al. (1996):

R1OOH + 2R2SH → R2SSR2 + H2O + R1OH

Sendo que R1 pode ser igual a H (portanto, H2O2), a alquil (portanto, peróxido orgânico)

ou a NO (portanto, peroxinitrito). Dessa forma, as Tiorredoxinas Peroxidases (TPxs) são enzimas

antioxidantes capazes de decompor várias formas de peróxido (Bryk et al., 2000). Além da

abrangência de substratos, TPxs estão presentes em diversos compartimentos celulares como

mitocôndria, núcleo e citossol (Park et al., 2000).

As Prxs são enzimas conservadas, distribuídas nos mais diversos grupos taxonômicos,

como bactérias, protozoários, fungos, invertebrados, plantas e mamíferos. Dentre as 5 isoformas

de TPxs, a mais estudada em S. cerevisiae é a citossólica I (cTPxI); essa TPx é a mais abundante,

porém com expressão pouco indutível (Kim et al., 1989; Demasi et al., 2001). O sítio ativo de

cTPxI contém uma cisteína localizada na posição 47 (também chamada de cisteína peroxidásica),

diretamente responsável pela redução de peróxidos, sendo que a substituição desse resíduo por

uma serina (C47S) gera uma proteína inativa (Chae et al., 1994b). cTPxI possui outra cisteína

conservada, na posição 170, que não é essencial para a sua atividade enzimática (Chae et al.,

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1994b). Esse resíduo é chamado cisteína de resolução e é responsável pela formação da ponte

dissulfeto intermolecular com a cisteína peroxidásica (Netto et al., 1996).

Diversas proteínas que possuem alta similaridade com cTPxI (família TSA/AhpC) estão

relacionadas a processos como diferenciação, proliferação e sinalização celular em mamíferos.

Recentemente, tem sido demonstrado que algumas proteínas homologas à cTPxI são secretadas e

agem como sinalizadoras em outros tecidos (Peshenko et al., 1998 & Haridas et al., 1998). Em

humanos, a TPx (AOE372) define o caminho redox que regula especificamente a atividade de

NF-kappaB (Jin et al., 1997). Além disso, cTPxI de leveduras previne um processo celular

conhecido como transição da permeabilidade mitocondrial, o qual parece ser um dos primeiros

passos a desencadear a cascata de eventos que levam à apoptose (Kowaltowski et al., 1998).

cTPxII (a segunda isoforma citossólica de TPx em levedura) apresenta aproximadamente

80% de identidade com cTPxI; essa isoforma, apesar de pouco abundante, tem sua expressão

altamente indutível e é regulada por diversos fatores de transcrição de resposta à estresse como

Msn2/4p, Hap1p, yAP1p (que serão descritos posteriormente) (Hong et al., 2002; Wong et al.,

2003). Ambas, cTPxI e cTPxII, pertencem à classe de Prxs denominadas 2-Cys peroxirredoxinas

típicas, que possuem duas cisteínas conservadas, uma presente no sítio ativo e outra envolvida

com formação de ponte dissulfeto durante o ciclo catalítico (Rhee et al., 1999) (Esquema I-A).

Jang et al. (2004) realizaram estudos que nos abrem novas perspectivas na compreensão

da função e atividade das Prxs em leveduras. Esses autores descreveram uma nova atividade

ligada à cTPxI e cTPxII, que predomina em situações especiais. Essas Prxs têm dupla função:

peroxidase dependente de tiól (predominante em condições de baixo estresse oxidativo) e a

recentemente descrita atividade chaperona, ativada em condições de alto estresse oxidativo e/ou

de choque térmico (o que inativaria a atividade peroxidásica). Essa atividade chaperona de cTPxI

foi de 3 a 15 vezes mais eficiente do que a atividade descrita para conhecidas chaperonas como

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α-cristalina e HSP16.5 (Jang et al., 2004 e Kim et al., 1998). A mudança de atividade é regulada

através de uma reorganização estrutural, regida principalmente por oligomerização das proteínas

(Jang et al., 2004). Os aglomerados de alto peso molecular já anteriormente descritos em estudos

cristalográficos dessa família de proteínas (as estruturas mostravam decâmeros) foram agora

relacionados à atividade chaperona. A atividade chaperona das Prxs também foi observada em

mamíferos, mostrando a conservação da dupla função dessas enzimas nos diferentes grupos

(Moon et al., 2005).

Outra descoberta recente e surpreendente foi a possibilidade da redução de um estado

altamente oxidado de TPx, o ácido sulfínico (Cys-SO2), considerado, até então, como

irreversível (Woo et al., 2005; Jönsson et al., 2005). Biteau et al. (2003) identificaram em

leveduras a enzima sulfirredoxina (Srx) que é responsável pela redução de ácido sulfínico em

TPxs. Posteriormente, foi mostrado que existem sulfirredoxinas em mamíferos, além da

descrição das sestrinas como proteínas capazes de reduzir ácido sulfínico, novamente só em Prxs

(Jönsson et al., 2005; Budanov et al., 2004).

Esses recentes trabalhos têm mostrado uma grande versatilidade química na família das

Prxs. Devido a essas propriedades bioquímicas, a segunda função chaperona é ativada, quando a

enzima parecia ter sido irreversivelmente inativada por oxidação a ácido sulfínico. Em outras

palavras, em condições de baixo estresse, as Prxs ajudam a manter a homeostase redox

controlando os níveis de oxidantes; em condições onde os danos são maiores, elas assumem a

função de auxiliar no redobramento de proteínas que estão sofrendo lesões pelo estresse. Quando

a célula reassume níveis mais baixos de oxidantes elas retomam sua atividade peroxidásica com

a ajuda da Srx.

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Outra isoforma citossólica de S. cerevisiae conhecida como AhpIp (alquil

hidroperoxidase I ou cTPxIII) é pertencente à classe denominada tipo II de TPx, com maior

especificidade (menor Km) na decomposição de peróxidos orgânicos (Jeong et al., 1999; Lee et

al., 1999). Os fatores de transcrição yAP1p e Skn7p (que serão descritos posteriormente)

regulam a expressão de AhpIp. Como cTPxI, AhpIp é uma 2-Cys típica, citossólica e abundante

que usa o sistema tiorredoxina durante seu ciclo catalítico (Lee et al., 1999).

De forma semelhante à AhpIp, a isoforma nuclear (nTPxI) foi recentemente descrita

como possuindo maior atividade na decomposição de alquil hidroperóxidos (Cha et al., 2003).

Ao contrário das demais Prxs apresentadas até aqui, nTPxI é uma 2-Cys Prx atípica pelo fato de

apresentar um dissulfeto intramolecular , e não intermolecular, durante seu ciclo catalítico

(Esquema IA). Por outro lado, a regulação de nTPxI por níveis de glicose (Cha et al., 2003) é

mais semelhante a de cTPxII (Hong et al., 2002) e mTPxI (a isoforma mitocondrial de TPx)

reguladas pelas vias TOR / Ras / Msn2/4p (Cha et al., 2003).

Em levedura, mTPxI (ou PrxI) é a única isoforma mitocondrial e pertencente à classe das

1-Cys Prxs (já que apenas a cisteína do sítio ativo está numa posição conservada – Figura 1)

(Park et al., 2000). Ela reage com o sistema tiorredoxina específico da mitocôndria, composto

por Trx3p (tiorredoxina mitocondrial) e Trr2p (tiorredoxina redutase mitocondrial) (Pedrajas et

al., 2000). Sua eficiência enzimática (Vmax/Km) é 3 vezes maior com H2O2 do que com peróxidos

orgânicos (t-BOOH) (Pedrajas et al., 2000).

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YBL064c 1 MFSRICSAQLKRTAWTLPKQAHLQSQTIKTFATAPILCKQFKQSDQPRLR I NSDAPNFD--59

++ AP F TSA : ---------------------------------------------------------------------------------------------- QVQKQAPTFKK 11 YBL064: 60 ------ADTTVGKINFYDYLGDSWGVLFSHPADFTPVCTTEVSAFAKLKPE FDKRNVKLIGLS 116 D +++ Y G + VL P FT VC TE+ AF++ + F +++ +++ S TSA : 12 TAVVDGVFDEVSLDKYKG-KYV VLAF IPLAFTFVCPTE I I AFSEAAKKFEEQGAQVLFAS 73 YBL064: 117 VEDVESHEKWIQDIKE IAKVKNVGFP I IGDTFRNVAFLYD- MVDAEGFKNINDGSLKTVRSVFVI 180 + S W ++ + + P++ DT +++ Y + ++ EG +R +F+I TSA : 74 TDSEYSLLA WTNIPRKEGGLGP IN IPLLADTNHSLSRDYGVL I EE EGV-----------------ALRGLF II 129 YBL064: 181 DPKKKIRL IFTYPSTVGRNTS EV LRV IDALQL TDKEGVVTPI NWQPADDV I I PPSVSNDE 240 DPK IR I VGRN E LR+++ A Q TDK G V P NW P I P E TSA: 130 DPKGVIRHITINDLPVGRNVDEA LRLVEAFQWTDKNGTVLPCNWT PGAAT IKPTVEDSKE 188 YBL064: 241 AKAKFGQFNEIKPYLRFTKSK 261 TSA: 189 YFEAANK

Figura 1: Comparação entre a sequência de aminoácidos de YBL064c (mTPxI) e TSA (cTpxI) que apresentam 30% de identidade (57/189), 49% de homologia (92/189) e 7% de “gaps” (15/189). A sequência em azul representa a região N-terminal de YBL064c que deve sinalizar o transporte para a mitocôndria. A sequência em vermelho representa o sítio ativo das proteínas que pertencem à família peroxidorrexina. A seqüência em verde mostra a ausência em mTPxI da cisteína homóloga na posição 170 de cTpxI, o que justifica sua classificação como 1-Cys Prx.

O foco do meu estudo foi a isoforma mitocondrial, mTPxI, que parece ser a que possui

maior atividade nos ensaios de proteção à glutamina sintetase, um tradicional ensaio utilizado

para medir a atividade de isoformas de TPxs. A atividade dessa isoforma é altamente sensível a

mudanças de pH: em pH alcalino sua atividade é completamente abolida, sugerindo uma

regulação da atividade por pH (Park et al., 2000). Park et al. não observaram maior sensibilidade

nas células mutantes para YBL064c (gene que codifica para mTPxI) tratadas com H2O2, t-BOOH,

diamida, paraquato, 4-nitroquinolina N-óxido ou estresse por pH (tampão citrato de sódio - pH

5.0) (Park et al, 2000). Porém, num estudo mais acurado, Pedrajas et al. observaram maior

sensibilidade dos mutantes na presença de H2O2 (Pedrajas et al., 2000).

Estudos em escala genômica têm sido realizados e informações sobre a função e

regulação de mTPxI foram obtidas. Em um desses estudos foi mostrado que mTPxI não é

essencial para o crescimento de leveduras em meio rico (YEPD) a 30o C (Scherens et al., 1993).

Em outro estudo, de análise de expressão global por "microarray" de DNA, foi mostrado que a

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expressão do mRNA de mTPxI é induzido 8.5 vezes na presença de metilmetanosulfonato

(MMS), um agente alquilante que produz modificações em bases nitrogenadas do DNA

(Jelinsky e Samson, 1999). Outros experimentos de "microarray" de DNA mostraram que

YBL064c tem sua expressão induzida em condições de choque térmico (Roth et al., 1998) e é

aproximadamente 10 vezes induzida durante a mudança diauxica (DeRisi et al., 1997).

O fato da expressão de mTPxI ser maior em altas densidades ópticas (por volta de 6.0

em OD600), quando as leveduras se encontram na fase estacionária de crescimento, pode ser

explicado pelo fenômeno da transição diauxica. Em leveduras, ocorre uma reprogramação da

expressão gênica, conhecida como transição diauxica, entre as fases exponencial e estacionária.

Isso ocorre quando o meio não possui mais glicose e as células passam a utilizar fontes

alternativas de carbono, como etanol que foi produzido durante a fermentação da glicose. Nessa

fase, há um aumento da produção de mitocôndrias e maior utilização da respiração e,

consequentemente, há uma maior produção de EROs (Gancedo, 1998).

mTPxI é uma exceção na classe 1-Cys Prxs devido ao fato de S. cerevisiae possuir um

sistema tiorredoxina específico da mitocôndria, capaz de regenerar mTPxI. Na grande maioria

dos organismos, as 1-Cys são incapazes de utilizar o sistema tiorredoxina como redutor

biológico, sendo seus substratos redutores ainda desconhecidos (Esquema I-B) (Wood et al.,

2003). Outro exemplo interessante é a Prdx6 de mamíferos, uma 1-Cys que forma um

heterodímero com glutationa transferase no seu estado oxidado, tendo sua redução completa

através da reação com glutationa (Manevich et al., 2004).

A estrutura das 1-Cys é muito parecida com a das 2-Cys, com resíduos carregados

positivamente próximos à cisteína do sítio ativo (Cysp), diminuindo o pKa desse aminoácido e

permitindo a estabilização da forma desprotonada do grupo tiól, o tiolato, que é mais reativo.

Porém, uma diferença interessante pode ser observada nessas estruturas: as 1-Cys possuem a

22

cisteína do sítio ativo posicionada junto a um resíduo de histidina conservado na classe e que

está ausente nas 2-Cys. Isso torna o sítio ativo das 1-Cys uma estrutura protéica mais rígida que

estabiliza o ácido sulfênico (Cysp –SOH). Já as 2-Cys possuem sua cisteína do sítio ativo

posicionada numa estrutura mais móvel que se expõe ao solvente quando oxidada (Wood et al.,

2003). Essa característica pode explicar diferenças na atividade e na interação com os redutores

dessas duas classes de Prxs.

A atividade peroxidásica das Prxs sempre foi contestada como biologicamente relevante,

pois sua eficiência catalítica (~105 M-1 s-1), dada pela razão kcat/KM, quando comparada com a da

catalase (~107 M-1 s-1) ou da glutationa peroxidase (~108 M-1 s-1), é considerada moderada.

Contudo, cada vez mais trabalhos têm mostrado que as Prxs participam da regulação fina da

concentração de peróxidos (Wood et al., 2003). É importante enfatizar que no caso das

glutationa peroxidases, esses valores de constantes de segunda ordem se referem a proteínas que

possuem seleno-cisteína e que estão presentes somente em mamíferos. As glutationa peroxidases

que possuem cisteína no sítio ativo apresentam constantes de segunda ordem similares às de

Prxs.

Além disso, com a descrição de novos genomas, as Prxs têm se mostrado como as

principais enzimas na defesa antioxidante, pela ausência de catalase nesses organismos (caso de

Trypanosoma cruzi e Plasmodium falciparum). Interessantemente, Parsonage et al. (2005)

descreveram uma constante para AhpC de bactérias (uma 2-Cys Prx) por volta 107 M-1s-1, o que

mostra a relevância da atividade peroxidásica das Prxs. Esses resultados estão de acordo com

estudos prévios da literatura que indicam que Prxs são as principais responsáveis pela remoção

de peróxidos gerados endogenamente por bactérias (Seaver e Imlay, 2001).

23

Esquema I A – Mecanismo de redução de 2-Cys Peroxirredoxinas. A via da esquerda representa o mecanismo observado nas 2-Cys Prx típicas com formação de ponte dissulfeto intermolecular, enquanto o mecanismo da direita representa o mecanismo observado nas 2-Cys Prx atípicas com ponte dissulfeto intramolecular. Os redutores tiólicos são em sua maioria o sistema tiorredoxina.

2 –Cys Peroxirredoxina

SHSOH

S—S

S—S

S S

SHSH

Tiól (Trx/Trr/NADPH)

Típicas Atípicas

24

Esquema I B – Mecanismo de redução de 1-Cys Peroxirredoxina. Ácido sulfênico é diretamente reduzido por tiól, sem formação de ponte dissulfeto. Na maior parte dos organismos, o redutor biológico é ainda indeterminado.

(II) OBJETIVOS.

O sistema de defesas antioxidantes em células eucariontes é muito complexo. Vários

componentes estão envolvidos na quelação de metais de transição, na desativação de

espécies reativas e no reparo de biomoléculas. O funcionamento adequado deste sistema de

defesas depende também de uma regulação precisa dos níveis de cada componente.

O objetivo dessa tese é entender o papel de mTPxI nesse complexo sistema de defesas

antioxidantes através dos estudos da regulação de sua expressão gênica, caracterização do

mutante de levedura que apresenta deleção para esse gene, bem como caracterização

estrutural e funcional da proteína mTPxI, além da sua interação com diferentes redutores.

1 –Cys Peroxirredoxina

SOH SH Tiól

25

(III) CAPÍTULO I - Caracterização da Expressão Gênica de mTPxI.

(III.1) INTRODUÇÃO.

(III.1.1) Saccharomyces cerevisiae e a Repressão por glicose.

Estudos sobre a expressão gênica em procariotos (Escherichia coli) possibilitaram

uma caracterização muito detalhada da resposta antioxidante desses organismos (revisado

por Carmel-Harel e Storz, 2000). Por falta de compartimentalização celular, dentre outros

motivos, as respostas transcricionais se dão de maneira mais direta e menos complexa do

que em eucariotos (observação melhor discutida posteriormente). Essa tese apresentará

alguns dados que corroboram a complexidade e a fina regulação da expressão gênica na

resposta antioxidante de eucariotos, implicando diversos fatores transcricionais e

mensageiros para a ativação ou repressão de determinado promotor (região regulatória dos

genes), especialmente de nosso alvo de estudo a mTPxI.

Nosso trabalho utilizou-se do organismo S. cerevisiae, sendo uma das razões dessa

escolha o fato de que essa levedura se utiliza preferencialmente da fermentação como

forma de obter energia, mesmo na presença de O2. Com isso, podemos analisar e comparar

células em processo respiratório ativo (utilizando meio de cultura com fontes de carbono

não fermentáveis) com células respirando menos, com mitocôndrias pouco desenvolvidas e,

consequentemente, em menor estresse oxidativo (com a fonte de carbono preferida da

levedura, a glicose) (Gancedo, 1998).

No caso de S. cerevisiae, sabe-se que a glicose provoca um fenômeno conhecido

como repressão catabólica, que interfere no metabolismo e na velocidade de crescimento

desta levedura (Hortner et al., 1982; Lee et al., 1996; Gancedo, 1998). Estes efeitos se

devem tanto à indução de genes necessários ao crescimento rápido (por exemplo, genes

26

envolvidos na síntese de proteínas e RNA ribossomal) como à repressão de genes

envolvidos na respiração aeróbia e no metabolismo de fontes alternativas de carbono.

Genes induzidos por estresse como CTT1, o qual codifica para catalase citossólica

(Belazzi et al., 1991), e UBI4, o qual codifica para ubiquitina (Finley et al., 1987),

também são reprimidos por glicose (Werner-Washburne et al., 1993). Além disso, vários

genes antioxidantes são regulados por fatores de transcrição sensíveis à fonte de carbono

(Gancedo, 1998).

A glicose induz mudanças drásticas no padrão de expressão gênica da levedura. A

repressão por glicose (ou catabólica) é um fenômeno resultante da ação de diversas vias

sinalizadoras. A via Ras – cAMP - PKA tem sido considerada como um processo

sinalizador transitório, desde que o mesmo só opera durante o pico de AMP cíclico (cAMP)

causado pela exposição a altas concentrações de glicose. Esta via só é ativada durante a

adaptação da levedura a uma nova condição de crescimento; uma vez realizado o ajuste na

expressão gênica, as células passam a ser regidas pela via principal de repressão por glicose

(composto principalmente pelo complexo repressor Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1) e a via Ras-

cAMP é desativada (Thevelein, 1994 e Gancedo, 1998). Os esquemas II (a seguir) e III

(mais adiante) representam diagramas dessas vias.

27

Esquema II. Via principal de repressão por glicose. O transportador de hexose (glicose) ativa a

proteína quinase que fosforila a própria glicose consumida, que seguirá então na via glicolítica; essa quinase fosforila ainda o complexo Snf1 que seria responsável pela inibição do complexo repressor principal (Tup1-Ssn6-Mig1). Com Snf1 fosforilado o mesmo é inibido e Tup1-Ssn6-Mig1 agem na repressão de genes não necessários em condições favoráveis de crescimento para a levedura.

Em S. cerevisiae a sinalização por cAMP está envolvida numa grande variedade de

processos celulares e interferem com as respostas a variações ambientais. Um dos sinais que

ativam rapidamente essa via metabólica são os açúcares fermentáveis como glicose, frutose e

manose (Boy-Marcotte et al., 1996). Altos níveis de glicose provocam aumento dos níveis de

cAMP, o qual por sua vez induz aumento da atividade de PKA (proteína quinase dependente

ComplexoSnf1

Transportador dehexose (Hxt)

Glicose quinase

Fosforilação daglicose -metabolismo Tup1 Ssn6

Mig1

Genes deutilização defontes alternativasde carbono; genesde defesa

28

de cAMP) que age como repressora, através da fosforilação de fatores de transcrição de

resposta a estresse (Görner et al., 1998).

Os mais conhecidos fatores de transcrição que participam dessa via sinalizadora

dependente de cAMP são os ativadores Msn2p e Msn4p. Estes fatores de transcrição foram

primeiramente descobertos como supressores multicópia da mutação de SNF1 (uma das

principais quinases envolvidas na desativação da via principal de repressão por glicose - ver

Esquema II), sugerindo o envolvimento dos mesmos na regulação de genes que sofrem

repressão catabólica. Esses fatores são parcialmente redundantes e reconhecem seqüências

promotoras denominadas STREs (“stress trancription responsive element”) as quais

correspondem a elementos de resposta a diversos tipos de estresses como fome, choque

osmótico e estresse oxidativo, dentre outros. Msn2/4p regulam a indução de diversos genes

pertencentes ao metabolismo respiratório, bem como de genes que codificam para enzimas

importantes na proteção celular contra estresse oxidativo como CTT1 e SOD2 (que codifica

para superóxido dismutase mitocondrial).

A expressão de diversos genes é maior em altas densidades ópticas, fase de

crescimento denominada estacionária. Nessa fase as células sofrem um fenômeno de

reprogramação gênica, conhecido como mudança diauxica, que adapta as células para

ausência de glicose (DeRisi et al., 1997). Além disso, essa fase caracteriza um

“envelhecimento celular” e consequentemente uma maior produção de EROs. Msn2/4p são

requeridos na transição diauxica para ativar a transcrição de um grande número de genes

cujos produtos podem ser importantes para adaptação às novas condições de crescimento

(Boy-Marcotte et al., 1998).

Da via de sinalização repressora, que culmina por exportar Msn2/4p do núcleo,

podem participar intermediários como Ras e TOR (“target of rapamycin”). As proteínas

29

Ras (RAS1 e RAS2) são reguladoras do uso da energia celular, ou seja, elas reconhecem o

sinal nutricional (abundância ou ausência) e comandam diversas vias metabólicas de

utilização da energia disponível. Trabalhos recentes têm implicado principalmente Ras2p

na regulação do envelhecimento celular (Jazwinski, 1999).

As proteínas Ras são proteínas G envolvidas na via de sinalização cAMP - PKA.

Em condições favoráveis ao crescimento celular (abundância de glicose), ocorre

acidificação do meio intracelular ativando as proteínas Ras que por sua vez ativam a

Adenilato ciclase. Com isso, há um pico transitório de cAMP que resulta na ativação da

Proteína quinase A (PKA) que irá fosforilar diversos fatores de transcrição (dentre eles,

Msn2/4p) impedindo o acúmulo desses ativadores no núcleo (Esquema III, adaptado de

Thevelein e Winde, 1999).

30

Esquema III: Via de repressão por glicose transitória - adaptativa, regida por Ras - cAMP- PKA. Uma das vias de regulação da atividade de Msn2/4p por glicose. As setas indicam indução - ativação e o símbolo ⊥ indica inibição – repressão.

glicose Receptor Gpr1 Acidificação Intracelular

Proteínas Ras

Adenilato cliclase

↑ níveis de cAMP PKA

⊥ Msn2p Msn4p

31

As proteínas TOR (TOR1-1 e TOR2-1) foram originalmente identificadas por

mutações em leveduras que conferiam resistência às propriedades de inibição do

crescimento celular pelo complexo imunofílico – imunossupressor FKBP – rapamicina

(Esquema III) (Schmelzle e Hall, 2000). A inibição da via de sinalização por TOR se dá

pela exaustão de carbono fermentável no meio o que leva à indução de diversos genes

necessários à mudança diauxica (Barbet et al., 1996).

As proteínas TOR são quinases relacionadas à ativação da iniciação da tradução em

resposta a nutrientes. TOR controla a tradução de 5’TOP mRNA (“terminal

oligopyrimidine tract”), que são mRNAs que constituem uma pequena família de

transcritos abundantes (próximo a 20% do mRNA celular) que codificam para proteínas

ribossomais e componentes do aparato de tradução. Assim, TOR ativa a maquinaria de

tradução em condições favoráveis. Em leveduras, TOR reprime a transcrição de genes

específicos para “ausência de nutrientes” (ou genes de resposta à estresse), através da

inibição, por exemplo, de ativadores transcricionais como Msn2/4p. Em condições não

favoráveis, TOR é inativo, levando à redução da síntese protéica global e também à

ativação da degradação protéica e da síntese de proteínas de resposta ao estresse (revisão de

Schmelzle e Hall, 2000). Esquema IV adaptado de Hardwick et al., 1999 e Schmelzle e

Hall, 2000.

32

Esquema IV (A).

Esquema IV (B)

Esquema IV: Vias regidas por TOR (“target of rapamycin”). (A) Processos celulares controlados pelas proteínas TOR. (B) Processos e sinalizadores de TOR controlando Msn2/4p. As setas indicam indução/ativação e o símbolo ⊥ indica repressão.

TORTOR

Reciclagem detransportadores denutrientes

Tradução

autofagia

Fase estacionária(G0)

Sinalização da proteínaquinase C

Organização da actina

Biogênese de ribossomo etRNA

Transcrição

Nutrientes

TORTORrapamicina

Via de repressãopor glicose

Msn2/4p tradução

33

(III.1.2) Resposta de S. cerevisiae a agentes oxidantes.

A levedura S. cerevisiae possui oito fatores de transcrição que pertencem à família

AP-1, da qual são membros os protoncogenes jun e fos (Wu et al., 1993). Estes fatores

contêm um domínio básico “zíper de leucina” (bZIP) adjacente ao domínio de ligação ao

DNA, localizados na porção N-terminal das proteínas que estão envolvidos com sua

dimerização (Wu et al., 1993). yAP-1 (ou SNQ3, ou PAR1) e yAP-2 (ou CAD-1) são dois

membros da família AP-1 e têm sido relacionados com a resposta ao estresse oxidativo.

Células deficientes em yAP-1 são hipersensíveis à H2O2, a oxidantes de tióis, a

metais como cádmio e zinco e ao quelante de ferro orto-fenantrolina. yAP-1 regula a

expressão de GSH1, gene que codifica gama-glutamil-cisteína sintetase, a primeira enzima

envolvida na síntese de GSH (Wu e Moye-Rowley, 1994) e ainda liga-se diretamente ao

promotor e regula a expressão de TRX2, gene que codifica para tiorredoxina (Kuge e Jones,

1994). Células deficientes em yAP-2 apresentam fenótipo semelhante ao de células

deficientes em yAP-1, exceto que não são hipersensíveis a cádmio (Wu et al., 1993).

Recentemente, novos aspectos do mecanismo de ativação de yAP1 têm sido

descritos (Delaunay et al., 2002; Veal et al., 2003). As proteínas Ybp1 (yAP1 binding

protein) e Gpx3 (glutationa peroxidase 3) seriam oxidadas pelo excesso de peróxido no

citossol em condições de estresse oxidativo, sendo as responsáveis pela transmissão do

sinal redox para yAP1p. Essa transmissão se daria pela oxidação da região rica em cisteína

de yAP1p por Gpx3/Ybp1. yAP1p com essa região oxidada, muda de conformação e

esconde o domínio de interação com o exportador nuclear Crm1, acumulando no núcleo e

ativando os genes de resposta a H2O2 (ver esquema V, adaptado de Delaunay et al., 2002;

Veal et al., 2003).

34

Esquema V: Mecanismo de ativação de yAP1 durante estresse oxidativo. Ybp1 (yAP1 binding protein); Gpx3 (glutationa peroxidase 3); red = reduzido; ox = oxidado; TRX2 – gene que codifica para tiorredoxina; Crm1 = exportador nuclear de yAP1.

Skn7p é um fator de transcrição que tem sido implicado na biossíntese da parede e

no ciclo celular de leveduras. Foi demonstrado que a interrupção do gene SKN7 torna as

células mais sensíveis à H2O2 (Krems et al., 1996). A proteína Skn7p liga-se diretamente ao

promotor do gene TRX2 e coopera com a proteína yAP-1 para induzir a expressão deste

gene. Skn7p regula também a indução do gene que codifica tiorredoxina redutase

citossólica (Morgan et al., 1997), o que mostra a importância desse fator para o sistema

redutor tiorredoxina. Vido et al. (2001) mostraram numa análise proteômica que Skn7p e

yAP1p cooperam na indução de diversas proteínas de defesa contra exposição ao cádmio

(Vido et al., 2001). Recentemente, Tsuzi et al. (2004) mostraram que Skn7p está

Citoplasma Núcleo

35

diretamente envolvido na indução por estresse oxidativo de Gpx2p (glutationa peroxidase

2). Este mesmo grupo mostrou ainda que Skn7p é capaz de se ligar ao promotor de Gpx2p

na seqüência GGC(C/T)GGC e induzir a expressão desse gene durante exposição ao H2O2

(Tsuzi et al., 2004). Esse foi o primeiro trabalho que estabeleceu o elemento de ligação de

Skn7p.

Hap1p é um fator de transcrição que regula a expressão de genes envolvidos em

processos respiratórios, entre eles os codificadores das 2 catalases de leveduras (citossólica

e peroxissomal) e o gene SOD2 (que codifica para Mn-SOD - superóxido dismutase

mitocondrial) (Bunn e Poyton, 1996). É um fator dependente de heme, uma molécula

considerada como um sensor de oxigênio em leveduras (Kwast et al., 1999). O Esquema VI

mostra que a síntese de heme é dependente da concentração de oxigênio disponível, o que

corrobora a hipótese de que heme é uma molécula sensora de oxigênio (Esquema VI

adaptado de Zhang e Hach, 1999).

Hap1p é constitutivamente nuclear, portanto sua atividade não é regulada por

localização celular. A dependência de Hap1p por heme se dá pelo fato desse fator de

transcrição interagir com fatores inibitórios na ausência dessa molécula. Na ausência de

heme, as proteínas Hsp82, p70, p60 e Ydj1 interagem com Hap1p formando complexos de

alto peso molecular (denominado HMC –“high molecular weight complex”), onde Hap1p

está reprimido. Quando a concentração de heme aumenta, heme se complexa ao motivo de

ligação de Hap1 que muda de conformação, desfazendo o HMC e levando à dimerização e

conseqüente ativação de Hap1p que é capaz de se ligar aos promotores dos genes alvos

(revisado por Zhang e Hach, 1999, Esquema VII adaptado dos mesmos autores).

36

Esquema VI: Processo de síntese de heme em leveduras. ALA = ácido 5-aminolevulinico, PBG =

porfobilinogênio, preurogênio = hidroximetilbilano, urogênio = uroporfirinogênio, coprogênio = coproporfirinogênio, protogênio = protoporfirinogênio, proto = protoforfirina. O último passo citossólico e o primeiro primeiro passo mitocondrial são feitos por oxidases que usam o oxigênio como substrato durante sua reação.

Esquema VII: Via de regulação da atividade de Hap1p. Em baixas concentrações de heme Hap1p

interage com proteínas inibitórias e forma um complexo de alto peso molecular. Quando a concentração de heme aumenta, o complexo inibitório é desorganizado pela ligação de heme a Hap1p (domínio HRM7), e o mesmo se liga aos promotores dos genes alvos na forma de dímero. ACT = domínio de ativação; DD = domínio de dimerização; Zn = domínio “dedo de zinco” de ligação ao DNA.

mitocôndria

citossól

8 glicina +

8 succinil CoA

Urogê

nio I

II sin

tase (

Hem4)

8 ALA

ALA sintase(Hem1)

8 ALA 4PBG

PBG si

ntase

(Hem

2)PB

G deam

inase

(Hem

3)

Preurogênio Urogênio III

Urogê

nio de

scar

boxil

ase

(Hem

1 2)

Coprogênio III Protogênio IX

O2

Copr

ogên

io III

oxida

se

(Hem

1 3)

Protogênio IXProto

Prot

ogên

io o

xidas

e

(Hem

1 4) O2

Fe++

Ferr

oque

lstas

e(H

em1

5)

HEME

Hsp82

37

Ace1p foi um dos primeiros fatores de transcrição metalo-regulatórios descritos em

eucariotos. O domínio N-terminal contém 12 cisteínas com a configuração dos domínios de

ligação a metais encontrados nas metalotioneínas. Experimentos de “DNAse footprinting”

mostram que a ocupação desse ativador em promotores se dá de forma indutível por cobre.

Ace1p regula a indução de CUP1 (que codifica para a metalotioneína) e de SOD1 (que

codifica para a superóxido dismutase citossólica – Cu,Zn-SOD) (Liu e Thiele, 1997).

Recentemente, tem sido relatada a interação de Ace1p com óxido nítrico, com implicações

para o metabolismo de metais (Shinyashiki et al., 2000).

Ace2p foi inicialmente identificado por suprimir a hipersensibilidade ao cobre das

mutantes para ACE1, quando presente em multi – cópias (Butler e Thiele, 1991). Ace2p é

responsável pela expressão basal de CUP1 e sua região de ligação ao DNA (“zinc finger”)

é quase idêntica ao de SWI5 regulador de proteínas HO (“homothalic switching”). Swi5p e

Ace2p possuem transcrição e localização, dependentes do ciclo celular (Dohrmann et al.,

1996). Recentemente, esse fator tem sido relacionado à regulação de ciclo celular (Laabs et

al., 2003).

Mac1p é um ativador transcricional cuja região N-terminal possui alta homologia ao

domínio de ligação ao cobre e ao DNA de Ace1p de S. cerevisiae. Mac1p está envolvido na

expressão basal de FRE1 (gene que codifica para um componente da membrana plasmática

associado com a redução de Cu(II) e Fe(III)). Além disso, Mac1p regula a indução por

H2O2 do gene CTT1. Esses dados sugerem que Mac1p regula genes de utilização de cobre e

ferro e participa da resposta ao estresse oxidativo (Jungmann et al., 1993; Georgatsou et al.,

1997).

38

(III.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA EXPRESSÃO

GÊNICA.

(III.2.1) Linhagens de leveduras utilizadas.

• JD7-7C (MATα, ura3-52, leu2, trpA, K+) (Chae et al., 1993)

• ∆tsa (MATα, ura3-52, leu2, trpA, K+, tsa∆::LEU2) (Chae et al., 1993)

• FY1679 (MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his 3∆200, YBL064c (4,780)) – comprada do projeto

EUROSCARF. (European Saccharomyces cerevisiae archives for functional analysis - http://web.uni-

frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html).

• FMEY007-07C(A) (MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his 3∆200, YBL064c (4,780)::KanMX4/YBL064c)

comprada do projeto EUROSCARF

• SEY6210 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-)

• SM13 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-, yap1-∆1::HISG)

• PB1 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-, yap2-∆1::HISG)

• W303-1 a (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3) (Morgan et al., 1997)

• ∆ Skn7 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, skn7::HIS3) (Morgan et al.,

1997)

• ∆Yap1 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, yap1::TRP1) (Morgan et al.,

1997)

• ∆ Skn7∆Yap1 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, skn7::HIS3, yap1::TRP1)

(Morgan et al., 1997)

• HD93-15D (MATα, his3, leu2, trp1, ura3) (Pereira e Hollenberg, 1996)

• HD93-15DdB (MATα, his3, leu2, trp1, ura3, adr1::HIS3) (Pereira e Hollenberg, 1996)

• BWG (MATα, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1∆UAS2) (Winkler et al., 1988).

• LPY22 (MATα, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1∆UAS2, hap1∆::LEU2) (Winkler et

al., 1988).

• H9 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, CUP1R-3

)

39

• DTY59 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, ace1-∆225 CUP1R-3

)

• DTY91 (MATα,his6,leu2-3,112,ura3-52, ace2-∆439::URA3, ace1-∆225 CUP1R-3

)

• DTY93 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, ace2-∆439::URA3 CUP1R-3

)

• YJJ6 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, MAC1)

• YJJ1 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, mac1-1) - mutação do gene MAC1

por mudança no quadro de leitura.

• YJJ2 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, MAC1up1

)

• Linhagem selvagem para ∆ heme15- obtida após o cruzamento de G231 (MATα, his4, heme15-5) com

S150-2B (MATα, leu2-3, 112ura3-52,trp1-289, his ∆1), selecionando a linhagem com fenótipo (MATα,

leu2-3, 112ura3-52,trp1-289) (Labbe-Bois, 1990)

• GG231-4A (∆heme15) (MATα, leu2-3, 112ura3-52,trp1-289, heme15-5) (Labbe-Bois, 1990)

• OL556 (ura3/ura3, his3/his3/,leu2/leu2, cdc25-5/cdc25-5, pde2/pde2, trp1/TRP1) (Boy-Marcotte et al.,

1996)

• W303-1a – selvagem para ∆ msn2/4 (genótipo descrito acima) (Boy-Marcotte et al.,1998)

• ∆ msn2/4(MAT a, ade2,can1,his3,leu2,trp1,ura3,msn2D3::HIS3, msn4:: TRP1) (Boy-Marcotte et al.,1998)

• 207 SPI (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2) **(enviada por Jiang, J. pertencente ao grupo de

pesquisa de Jazwinski SM. – Sun et al., 1994)

• 208 SPI – ras1 (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2, ras1::LEU2)**

• 209 SPI – ras2 (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2, ras2:: LEU2)**

• JK9-3da (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa) ***

• MH349-3d (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa, tor1::LEU2-4) (Helliwell et al.,

1994)***

• JK350-18a (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa, ade2∆, tor2::ADE2-3/pJK5)

(Schmidt et al., 1996)***

*** enviadas por M. Hall.

• BY4741 (wt) (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0) comprada do projeto EUROSCARF.

• ∆yap1 (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YAP1::kanMX4) comprada do projeto EUROSCARF.

40

• ∆yap2 (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YAP2::kanMX4) comprada do projeto EUROSCARF.

(III.2.2) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994).

YEPD: 2% glicose, 2% peptona, 1% extrato de levedura.

LB: 1% triptona, 1% NaCl, 0,5% extrato de levedura.

YNB ou meio mínimo: 0,17% YNB-AA/AS, 0,5% sulfato de amônia, 2% glicose (YNB-

AA/AS =”Yeast Nitrogen Base without Amino Acids or Ammonium sulfate”

Meios seletivos: meio mínimo adicionado de mix de aminoácidos específicos, para marcas

de auxotrofia.

YPYE: 1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol, 2% etanol.

Meio para crescimento de células deficientes em heme: YEPD + Tween 80 (0.2%),

ergosterol (30mg/L) provendo assim ácidos graxos insaturados; e hemina (15mg/L em

0.1N de NaOH) (Labbe-Bois, 1990 & Galiazzo e Labbe-Bois, 1993).

Meios sólidos: preparados com adição de 2% de ágar.

Meio seletivo com X-gal: YNB-URA- (glicose 2% ou glicerol 2%), com tampão fosfato de

potássio 50mM, pH7,0 e X-gal 20ug/ml) (Ausubel et al., 1994).

(III.2.3) Estocagem de células:

As culturas de leveduras foram estocadas em meio sólido a 4o C e/ou em glicerol 15% a –

70o C.

(III.2.4) Linhagem de bactéria utilizada.

• DH5α;[endA1, hsdR17 (rk- mk

+), supE44, thi-1, recA1, gyrA (Na 1r), relA1, ∆ (lacZYA-argF)U169

(m80lacZ∆M15)]

41

(III.2.5) Plasmídeos utilizados:

PYCG – é um plasmídeo que contém: o gene YBL064c (que codifica para mTPxI), o

gene que confere resistência à ampicilina e origem de replicação em E. coli, permitindo assim

sua clonagem nessa bactéria. Esse plasmídeo foi utilizado para obtermos fragmentos para

sonda e para amplificação do inserto que foi utilizado na construção do plasmídeo repórter

com promotor de YBL064c (projeto EUROSCARF - http://web.uni-

frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html).

Yep357R – vetor utilizado para construção do plasmídeo repórter, que contém a parte

estrutural do gene que codifica para a β-galactosidase, origens de replicação de bactéria e de

levedura, gene de resistência à ampicilina para a clonagem em bactéria e o gene URA+ para

seleção de transformantes em levedura (Myers et al., 1986).

(III.2.6) Preparação de RNA e Northern blotting.

Células foram crescidas a 30o C, com agitação de 250rpm, por uma noite em meio

YEPD. No dia seguinte, as culturas foram então diluídas em YEPD fresco a uma densidade

óptica equivalente a 0.2, ou centrifugadas a 4000g e ressuspensas em YPYE. Em densidades

ópticas a 600nm correspondentes à fase exponencial tardia (em torno de 1,0), algumas

culturas foram tratadas como indicado nas figuras, enquanto outras, que serviram como

controles, não receberam tratamento algum. Para YPYE, as células foram incubadas por 8

horas e então tratadas ou não. As células foram coletadas por centrifugação a 4oC, 4000g,

lavadas com água gelada para remoção do meio de cultura e mantidas em freezer até a

extração do RNA (descrita adiante).

42

Células de todas as linhagens testadas foram coletadas por centrifugação a frio, com

os devidos ajustes de volume para obtenção da mesma quantidade de células de todas as

amostras. A extração do RNA das células se deu pelo método do fenol ácido quente (Ausubel

et al., 1994). As células foram rompidas com TES (Tris-HCl 10mM, EDTA 10mM, SDS,

0,5%) na presença de fenol ácido e clorofórmio e, em seguida, o RNA total foi precipitado

com etanol absoluto e acetato de sódio 3M (pH 5,3), lavado com etanol 70% e finalmente

isolado.

Foi realizada eletroforese com as amostras de RNA em gel de agarose 1,2% -

formaldeído.

O RNA foi transferido para membrana de nylon (Hybond-N, Amersham) por

capilaridade, utilizando-se solução SSC (cloreto de sódio 3M, citrato de sódio 0,3M). Após a

secagem da membrana por duas horas a 80o C para fixação do RNA, esta foi submetida à pré-

hibridação, em forno Hybridiser HB-2D (Techne) a 40o C, por 6 horas, em solução de

hibridação, contendo 5X SSPE (20X: NaCl 3,6M, fosfato de sódio 0,2M, EDTA 0,02M),

solução Denhardt’s 5X (100X: BSA 2%, Ficoll 2%, PVP 2%), SDS 0.5%, formamida 50% e

excesso de DNA de salmão denaturado. As hibridações com os fragmentos marcados

(descrito no item III.2.7) foram realizadas com a adição das sondas previamente denaturadas e

incubação a 400C por, no mínimo, 12 horas. A membrana foi então lavada (soluções com

SDS e SSPE em concentrações decrescentes) e exposta ao filme de raio-X. Para verificar se

todas as canaletas do gel foram carregadas com a mesma quantidade de RNA, as intensidades

das bandas de RNA ribossomal, coradas com brometo de etídio, foram comparadas através de

fotos dos géis. Em alguns casos foi utilizada sonda para actina como controle interno.

43

(III.2.7) Marcação radioativa de DNA por oligonucleotídeos iniciadores aleatórios

(“Random Primed Synthesis”) - Obtenção de sondas.

Foi preparada uma mistura de reação em gelo, contendo desoxirribonucleotídeos

exceto CTP, hexanucleotídeos iniciadores (Boehringer), DNA purificado previamente

denaturado a 100oC (molde para a polimerase), a enzima Klenow (Invitrogen), seu respectivo

tampão e [α32P] dCTP (Pharmacia). A reação de polimerização ocorreu a 25o C, por cerca de

30 minutos (Ausubel et al., 1994).

Foram obtidas sondas para YBL064c utilizando-se fragmentos de DNA

correspondentes extraídos do plasmídeo PYCG cortado com HindIII (Boehringer) por 1 hora.

Essa amostra foi aplicada em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídio. Após

eletroforese, a banda de interesse (correspondente ao fragmento contendo o gene YBL064c)

foi cortada do gel, que foi então isolada usando o kit wizard (Invitrogen), de acordo com

instruções do fabricante.

(III.2.8) Obtenção do vetor Yep357R + promotor de mTPxI – gene repórter.

Os plasmídeos foram extraídos de culturas de bactérias E. coli, incubadas em meio LB

com ampicilina, a 37o C, por uma noite, com agitação. A extração ocorreu adicionando-se às

células, coletadas por centrifugação, solução I (EDTA pH 8.0, 10mM, Tris.Hcl pH 8,0, 25mM,

RNAse 10 µg/ml), solução II (NaOH 10 N, SDS 10%) e solução III (acetato de potássio 3M,

ácido acético glacial 11.5%), com nova centrifugação e adição de etanol absoluto gelado para

precipitação do DNA.

O promotor de YBL064c foi digerido com as enzimas de restrição BclI e XhoI e o vetor

Yep357R foi cortado com as enzimas BamHI e SalI, sendo que BamHI cria terminal compatível

44

com BclI e SalI cria terminal compatível com XhoI. As digestões foram feitas a 37oC durante

uma noite. Foi realizada a eletroforese das amostras digeridas em gel de agarose 0.8% e TAE e

as bandas correspondentes ao promotor e ao vetor foram separadas de acordo com o tamanho

esperado da banda (o padrão de peso molecular usado foi λ hindIII da Invitrogen). Logo após,

foi efetuado o isolamento do fragmento do gel através do kit wizard (Invitrogen).

A reação de ligação foi feita a 4o C durante uma noite, com: 3:1 de fragmento

promotor/vetor, tampão da enzima, e 1U de ligase (Promega). Além disso, foi feito um controle

dessa reação utilizando-se no lugar do promotor, água para observar a taxa de ligação do vetor -

vetor o que daria um falso positivo, pois é no vetor que estão os genes marcadores (resistência à

ampicilina e URA+). As reações sem o promotor não transformaram nenhuma bactéria.

Bactérias E. coli (linhagem DH5α, DNAse deficiente), foram transformadas com a

adição de 1µl de ligação e depois sofreram eletroporação de 2.5V, sendo imediatamente

ressuspensas em 1ml de meio LB a 37oC e incubadas na mesma temperatura por 1 hora. Foram

então plaqueadas em meio LB + ampicilina sólido e deixadas uma noite a 37oC. Procedeu-se a

extração de plasmídeo, já descrita anteriormente.

Esses plasmídeos purificados foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e

HindIII (por 1 hora a 37oC), que possuíam sítios localizados lateralmente aos sítios de inserção

do promotor para confirmar, após eletroforese das amostras digeridas, quais continham bandas

de tamanhos correspondentes ao vetor e ao promotor de mTPxI.

(III.2.9) Preparação de leveduras competentes e transformação.

Células foram crescidas em 50ml de YEPD até OD600nm próxima a 0.8 e

centrifugadas (3000g, 5 minutos, 40C). O pellet foi lavado duas vezes com água milliQ

45

estéril e uma vez com sorbitol 1M gelado. As células foram ressuspensas em 200ul de

sorbitol 1M, gelado fresco, e mantidas em gelo. 100ul de células foram misturados à 500ng

de DNA (plasmídeo de interesse) e incubadas em gelo por 1 minuto. Foi adicionado então

200ul de sorbitol 1M gelado e a mistura foi eletroporada (cubeta de 0.2cm, voltagem de

1.25kV, capacitância de 25uF, resistência 200Ω e tempo de eletroporação entre 4 e 5

mseg). As células foram centrifugadas (1 minuto, 13000rpm, 40C), ressuspensas em 100ul

de sorbitol 1M, plaqueadas em meio seletivo (no caso, YNB – glicose – URA-) e incubadas

em estufa 300C por volta de 5 dias.

(III.2.10) Ensaio da atividade promotora de mTPxI, “β-galactosidase assay”.

As células foram crescidas em diferentes meios (descritos nas legendas das figuras

em “Resultados e Discussão”), centrifugadas e lavadas com 1ml de PBS (1.7mM KH2PO4

+ 5mM Na2HPO4 + 150mM NaCl). O pellet foi pesado e a mesma quantidade em bolinhas

de vidro foi adicionada, junto com 100ul de tampão de lise (250mM Tris-HCl, pH 8.0). As

células foram rompidas usando vórtex (dois ciclos de agitação 1400rpm, 10 minutos, 40C).

O extrato foi centrifugado (14000g, 15 minutos, 40C) e o sobrenadante recuperado. A

concentração de proteína total foi estimada por Bradford (Biorad), usando como padrão

uma curva de albumina bovina. A mesma concentração de proteína total de cada amostra

(volume final de 30ul) foi misturada a 0.9mg/ml de ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D-

galactopyranoside, substrato da enzima repórter, β-galactosidase) + 200ul de tampão de

clivagem (60mM Na2HPO4-7H2O + 40mM NaH2PO4- H2O + 10mM KCl + 1mM MgSO4-

7H2O, pH 7.0 + 38.6mM β-mercaptoetanol). As reações foram incubadas por diferentes

46

tempos (indicados nas legendas das figuras) e a absorbância das mesmas foi lida em A420nm.

A atividade específica é calculada com a seguinte fórmula:

nmoles de ONPG hidrolisado = (OD420nm) (8x105nL)/(4500nl/nmoles-cm)(1cm) dividido

pelo tempo e pela quantidade de proteína.

(III.2.11) Construção do gene repórter com o promotor de mTPxI contendo mutação no

elemento STRE (sítio de ligação dos ativadores transcricionais Msn2/4p).

O promotor de YBL064c foi clonado a partir do DNA genômico de S. cerevisiae

usando os iniciadores: 5’GGCGTCGACTTGCCAACCTCAAAGAAG3’ forward e

5’GTCGTGGATCCCTACTAAACATC3’ reverso, onde SalI corta no iniciador forward e

BamHI corta no iniciador reverso (sítios em destaque, para clonagem posterior em

Yep357R). Para realizar a mutação sítio dirigida no promotor de YBL064c, utilizamos a

técnica conhecida como “overlap extension PCR”. Essa técnica se baseia em desenhar

iniciadores internos (na região que se quer mutar) que se sobreponham e contenham a

mutação. Dessa forma, usa-se o iniciador forward externo (seqüência acima) combinado ao

iniciador reverso interno (que contém a mutação e anela com o forward interno -

5’GCAACATCCGGAACATTGTTTCTTTACG3’); da mesma forma, usa-se para o outro

pedaço, o iniciador forward interno (que contém a mutação e sobrepõe com o reverso

interno - 5’CGTAAAGAAACAATGTTCCGGATGTTGC3’) combinado ao reverso

externo (seqüência acima). Esses PCRs foram feitos com o seguinte ciclo:

1 ciclo de 5 minutos 950C; 30 ciclos de 1 minuto 950C, seguido de 50 segundos

550C e 1 minuto 720C; terminando com 1 ciclo de 4 minutos a 720C.

Os dois produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 0.8% e

isolados do mesmo com o kit wizard. Assim, temos duas partes que posteriormente foram

47

usadas no segundo PCR, onde os pedaços serviram tanto de iniciador como de molde (ver

Esquema VIII). As seqüências dos iniciadores internos possuem a seqüência AGGGG da

posição -116, -112 do promotor de mTPxI substituída pela seqüência ATGTT, mutando

assim o possível elemento STRE (stress transcription reponsive element) de ligação dos

ativadores Msn2/4p. Essa reação de PCR foi realizada com o seguinte ciclo:

1 ciclo de 5 minutos 950C; 30 ciclos de: 1 minuto 950C, seguido de 50 segundos

620C e 1 minuto 720C; terminando com 1 ciclo de 4 minutos a 720C.

O produto foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0.8% e isolada. O

fragmento purificado foi reamplificado com os iniciadores externos, utilizando o primeiro

ciclo. Novamente o produto foi isolado do gel, cortado com SalI e BamHI, isolado

novamente do gel e ligado ao vetor Yep357R previamente cortado com as mesmas

enzimas. O produto da ligação foi clonado em DH5α, o plasmídeo recuperado por mini

preparação de DNA e as respectivas linhagens de leveduras foram transformadas segundo

descrito no item III.2.9.

Para o sequenciamento da construção com o vetor Yep357R foi desenhado um

iniciador interno à região codificadora do gene que codifica para a enzima β-galactosidase

(β-gal reverso: 5’GAAACCAGGCAAAGCG3’). A construção foi confirmada por

sequenciamento e apenas a região de mutação sofreu modificações durante todo o processo.

48

Esquema VIII: Representação da técnica “overlap extension PCR”. Os primeiros PCRs são para obter as duas regiões do promotor, que depois irão se sobrepor criando uma extremidade 3’OH livre para que a Taq polimerase extenda as fitas. Como os iniciadores internos contêm a mutação desejada, o produto final é o promotor com a mutação sítio dirigida. (Ho et al., 1989).

Parte I Parte II STRE

Fw. externo Rev. externo

Fw. e Rev. Internos contendo a mutação

Parte I STRE mutada

PCRs

Parte II STRE mutada

PCR

Parte I STRE MUT

Parte II STRE MUT

Parte I Parte II STRE mutada

3’OH

3’OH

Produto final

49

(III.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.

(III.3.1) Regulação da expressão de mTPxI durante a mudança diauxica –

envolvimento de Msn2/4p e sinalização por cAMP.

S. cerevisiae e muitas outras leveduras utilizam diversas fontes de carbono, mas

glicose e frutose são as preferidas. Quando um desses açúcares está presente no meio, as

enzimas requeridas para utilização de fontes alternativas de carbono ou que participam do

metabolismo respiratório são sintetizadas em baixas proporções ou sequer são produzidas.

Esse fenômeno é conhecido como repressão catabólica. O principal efeito desse fenômeno

se dá em nível transcricional e afeta diversas enzimas antioxidantes (Gancedo, 1998).

Nossos estudos utilizando Northern blotting e gene repórter mostraram que YBL064c

(o gene que codifica para mTPxI) é preferencialmente expresso em meio sem glicose (Figura

2). Em meios fermentativos (2A - bandas 2, 3 e 5 e 2B, placa com glicose) há menor

expressão desse gene quando comparado a meios respiratórios, no caso o glicerol/etanol

(bandas 1 e 4 e 2B, placa com glicerol), o que condiz com sua função antioxidante, já que

nesse último a produção de EROs é maior. Outro aspecto importante é que a sonda é

específica para YBL064c já que nenhuma banda foi detectada nas linhagens deficientes nesse

gene (amostra 6 em glicerol). Para compararmos a expressão de YBL064c, levamos em

consideração as bandas referentes ao RNA ribossômico (rRNA); esses genes são constitutivos

e servem como padrões internos da eletroforese.

50

Figura 2: Análise da expressão por Northern blotting (I) e por atividade de beta galactosidase (II)

onde as leveduras foram crescidas sobre condições fermentativas (glicose -YEPD) e sobre condições respiratórias (glicerol/ etanol - YPYE). 1, 2, 3, C = JD7-7C (selvagem isogênica à linhagem ∆Tpx1); 4, 5 = FY1679 (selvagem isogênica a linhagem ∆YBL064c); 6, B = FMEY007-07C(A) (linhagem deficiente em YBL064c =∆YBL064c ); A = JD7-7C-∆Tpx1 (linhagem deficiente em Tpx1=∆Tpx1). A, B e C foram transformadas com Yep357R + promotor de YBL064c; D, E e F foram controles da placa: D = controle negativo (levedura transformada somente com vetor Yep357R); E = controle positivo para ambas as placas (levedura deficiente em Tpx1 transformada com Yep356R + promotor de Tpx1- constitutivo ); F = controle positivo para a placa de glicerol (linhagem HD93D com promotor do gene metanol oxidase ativo em glicerol e menos expresso em glicose). O gráfico representa a relação entre a quantidade de mRNA de YBL064c e a quantidade de rRNA (que representa a quantidade de RNA total aplicada no gel) – dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).

Estudos recentes têm mostrado que há uma diminuição nos níveis intracelulares de

cAMP durante o consumo de glicose e que essa queda é necessária para subsequente

crescimento em etanol após a mudança diauxica (a reprogramação gênica para novas

condições ambientais). Se os níveis de cAMP são mantidos altos artificialmente a mudança

diauxica é fortemente prevenida, mesmo com a exaustão da glicose no meio. Esse efeito de

repressão através de sinalização por cAMP tem sido mostrado para diversos genes

induzidos por estresse como CTT1, UB14, SSA3, SSA1, HSP12, HSP104 e SOD2 dentre

vários outros (Boy-Marcotte et al., 1998). Testamos então a linhagem OL556, uma

linhagem de levedura permeável ao cAMP adicionado ao meio. Isso mantém,

artificialmente, altos os níveis de cAMP, mesmo quando os níveis de glicose já estão

0

0,5

1

1,5

2

2,5

JD7-7C 0%

JD7-7C 2%

JD7-7C 10%

WT 0%

WT 2%

ybl064c

0%

YB

L064

C /

rRN

A

rRNA

YBL064C

AB

C

D

EF

BA C

DE

F

Glicose Glicerol

I

II

1 2 3 4 5 6 0 2 10 0 2 0 Glicose no meio (%)

1 2 3

4

5

6

51

baixos (por exemplo, na fase estacionária de crescimento da levedura). Observamos um

claro efeito repressor na expressão de YBL064c provocado pela adição de cAMP nessa

linhagem, o que sugere a participação de cAMP como segundo mensageiro na via de

repressão por glicose que rege a expressão de mTPxI (Figura 3).

Figura 3: Estudo do efeito de cAMP na expressão de YBL064c. Uso da linhagem OL556, permeável ao cAMP (4mM) adicionado exogenamente no meio de cultura. Na fase midlog o gene está reprimido, portanto não sofre influência do cAMP adicionado; já na fase estacionária, mTPxI é induzida pela ausência de glicose e sofre repressão de sua expressão quando cAMP é adiconado no meio. O gráfico corresponde aos valores obtidos através de densitometria, aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).

Diversos estudos têm comprovado que a via sinalizadora do cAMP se dá através de

PKA (proteína quinase dependente de cAMP). PKA de S. cerevisiae tem sido implicada na

coordenação de vários eventos celulares essenciais como crescimento, entrada no ciclo de

divisão celular e reprogramação gênica para utilização de fontes de carbono não

fermentáveis para fermentáveis. Essa quinase agiria como um poderoso repressor de genes

que têm sua transcrição mediada por STRE (“stress trancriptional responsive element”),

cuja completa indução é dependente de ambos fatores de transcrição, proteínas “zinc

fingers” Msn2p e Msn4p. PKA é um regulador negativo desses fatores de transcrição, pois

0

5

10

15

20

25

30

sem cAMP com cAMP

YBL0

64c

/ rR

NA

midlog

estacionária 1 2 3 4

rRNA

YBL064c

Midlog + + - -Estacionária - - + +Adição de - + - +cAMP

1

3

2

4

52

impede a localização nuclear ao fosforilar os mesmos, e, consequentemente, suas ações

sobre os promotores dos genes alvos (Görner et al., 1998).

Diferentes situações de estresse ativam um sistema comum de resposta cuja parte

central é composta por esses dois fatores de transcrição, Msn2/4p. Diversos sinais de

estresse como fome, danos oxidativos, choque osmótico, mudança de temperatura, bem

como danos no DNA convergem em mecanismos que determinam a concentração nuclear

de Msn2/4p (Görner et al., 1998).

Visando que estes eram importantes reguladores de um fenômeno que observamos

ocorrer na expressão de YBL064c, a indução na ausência de glicose, resolvemos testar uma

linhagem que contém dupla mutação para esses genes (∆ msn2∆ msn4 – a dupla mutação é

necessária, pois esses fatores são aparentemente redundantes e a deleção de um único não

provoca fenótipo detectável) e analisar a expressão de YBL064c. A figura 4 mostra o

resultado da análise via Northern blotting em diversas fontes de carbono quanto à

expressão de YBL064c na presença ou ausência de Msn2/4p.

53

Figura 4: - Efeito da deleção de MSN2/4 na expressão de YBL064c. 1, 3, 5 e 7 - linhagens selvagens (W303-1a); 2, 4, 6 e 8 - linhagens deficientes em MSN2 e MSN4 (duplo mutante). 1 e 2 células crescidas em glicose 2%; 3 e 4 células crescidas em galactose 2%; 5 e 6 células crescidas em rafinose 2%; 7 e 8 células crescidas em glicerol/ etanol 2%. As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.

Como pode ser claramente observado pelos dados descritos na figura 4, a derepressão de

mTPxI foi mediada pelos fatores de transcrição Msn2/4p. No entanto, nossos experimentos não

nos davam informações suficientes para afirmarmos se esses ativadores tinham influência

direta na atividade promotora ou se eles atuariam na estabilidade do mRNA de YBL064c. Outra

questão ainda nesse contexto seria analisar se Msn2/4p são ativadores transcricionais diretos (se

ligando a elementos no promotor de YBL064c) ou indiretos (regulando outro ativador, que se

ligaria no promotor) de YBL064c.

Para responder a primeira questão, transformamos as linhagens selvagem (WT) e mutante

para MSN2/4 com a construção Yep357R+promotor de YBL064c, para analisarmos a atividade

promotora (através de gene repórter) na presença e ausência desses ativadores, excluindo assim a

rRNA

YBL064C

1 2 3 4 5 6 7 8

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

WT msn2/4 WT msn2/4 WT msn2/4 WT msn2/4YB

L064

C/rR

NA

4 6 1 2 3 8

7

5

Glicose + + - - - - - -Galactose - - + + - - - -Rafinose - - - - + + - -Glicerol - - - - - - + +MSN2/MSN4 + - + - + - + -

54

possibilidade da regulação ser através da manutenção da estabilidade do mRNA (Figura 5). Como

esperado, os fatores Msn2/4p atuam regulando a atividade promotora (pois o método é específico

para nossa finalidade), desde que, na ausência desses fatores não ocorre a indução da expressão do

gene repórter por fonte respiratória de carbono, (Figura 5).

A segunda questão a respeito da ligação direta de Msn2/4p no promotor de YBL064c,

pôde ser respondida utilizando-se o fato de conter um possível elemento de ligação desses

ativadores (de seqüência AGGGG), chamado de STRE, no promotor de YBL064c na

posição –112, -116. Com isso, nossa estratégia foi mutar esse elemento e observar o

comportamento desse promotor na presença de Msn2/4p e em meio indutor. Para isso,

usamos a técnica denominada “overlap extension PCR” (descrita em Procedimentos

experimentais – Esquema III), que nos permitiu obter o promotor com 3 substituições na

região que contém a STRE (de AGGGG para ATGTT). A figura 6 mostra o resultado dessa

análise. Observamos a incapacidade do promotor de YBL064c, contendo mutação no

Glicose Glicero l Figura 5: Atividade promotora de YBL064c. As linhagens foram transformadas com o vetor Yep357R+ 530pbs do promotor de YBL064c contendo ± 100bps da região codificadora para mTPxIp em fusão com o gene da β-galactosidase (gene repórter). “Patches” de duas colônias transformantes de cada linhagem. Placas com 24 horas a 30 0C.

WT

∆MSN2/4 ∆MSN2/4

WT

55

elemento STRE, de ser ativado pela ausência de glicose no meio, mesmo na presença de

Msn2/4p. Dessa forma foi possível mapear a região de ligação desses fatores no promotor e

garantir que a atuação dos mesmos na indução é de forma direta.

Figura 6: Efeito da mutação do elemento STRE na atividade promotora de YBL064c. pmTPxI = plasmídeo Yep357R com promotor selvagem de mTPxI; pmTPxI – MutSTRE = plasmídeo Yep357R com promotor de mTPxI mutado no elemento STRE. Placas de YNB-URA- + X-gal.

Além das questões abordadas acima, nosso interesse na via de regulação da

expressão de YBL064c se estende à identificação dos mediadores que compõem a via de

sinalização, que se inicia com a presença ou ausência de glicose no meio e culmina com a

repressão ou indução desse gene. Como abordado na introdução, a expressão de YBL064c

poderia obedecer a pelo menos duas vias de repressão: uma dependente de Ras-cAMP e

outra das proteínas TOR. Os pesquisadores Michael N. Hall (University of Basel, Suécia) e

Jiang J. (do grupo de S. Michal Jazwinski – Louisiana State University Health Sciences

Glicose

W303-1a ∆ msn2/4 W303-1a

pmTPx1 pmTPx1 pmTPx1 - MutSTRE

Glicero l

A

Linhagem:

Plas mídeo:

56

Center, Estados Unidos) gentilmente nos forneceram mutantes para os genes RAS1, RAS2,

TOR1 e TOR2. Com essas linhagens em mãos, pudemos investigar se as respectivas

proteínas faziam parte da via de regulação de YBL064c. Transformamos essas linhagens

com o plasmídeo repórter e analisamos a expressão do mRNA de YBL064c através de

experimentos de Northern blotting. Dessas análises, pudemos concluir que as proteínas

Ras2p e Tor1p são responsáveis pela repressão por glicose exercida no promotor de

YBL064c (Figura 7). Nossos dados sugerem que Ras2p e Tor1p cooperam na regulação da

expressão de YBL064c, através da repressão da atividade de Msn2/4p, pois a atuação desses

repressores é dependente da presença de STRE no promotor de YBL064c.

rRNA

YBL064c

JK9- ∆ tor13da

B

ACT1

rRNA

A

YBL064c

207 ∆ ras1 ∆ ras2SPI

ACT1

Figura 7: Efeito da deleção de RAS2 e TOR1 na expressão de YBL064c. As linhagens foram crescidas em YEPD até a fase midlog (fase em que esses repressores atuariam na expressão de mTPxI). ACT1 = sonda para actina, controle interno da expressão global e da quantidade de RNA aplicada no gel. Experimentos de gene repórter também foram feitos nessas linhagens corroborando os resultados aqui apresentados. Além disso, resultados com pmTPxI-MutSTRE mostram que esses repressores atuam através de Msn2/4p. Ver detalhes no anexo II.

57

Nossos resultados em conjunto mostram quão complexa pode ser a resposta celular

para regular a expressão de um gene (Esquema IX). Apenas na repressão catabólica

conseguimos relacionar diretamente com a expressão de mTPxI pelo menos 4 diferentes

agentes ativadores (Msn2/4p) e repressores (cAMP, Ras2p e Tor1p). Veremos mais adiante

que outros fatores estão envolvidos com a resposta a peróxidos, diferentes dos já descritos

até aqui. Além disso, ainda há algumas vias de indução com fatores indeterminados.

58

Esquema IX: Via de regulação de mTPxI por glicose. A discussão detalhada de cada fator representado no esquema acima está na discussão do anexo II. As setas indicam indução e o símbolo ⊥ indica repressão.

Tor1p

↑ Nutrientes ↑ Glicose acidificação intracelular

Ras2pAdenilato ciclase

↑ cAMP PKA

Ras1p

STRE

Msn2/4p

-112 -116 ATG

Snf1p ativo

↓ Nutrientes

Bmh2p

ATP

P

P

59

(III.3.2) Complexidade na regulação da expressão de mTPxI por peróxidos.

Com exceção de anaeróbios estritos, todos os organismos dependem de oxigênio

para obter energia. Como EROs são geradas como subprodutos da respiração, sistemas

sensores e de resposta à quantidade de oxigênio presente no ambiente e no meio celular

evoluíram em paralelo nos seres vivos. Dessa forma, a disponibilidade de oxigênio afeta

os níveis celulares, e freqüentemente a atividade, de um grande número de proteínas. O

aumento da utilização do oxigênio ou exposição direta a agentes oxidantes pode provocar

alterações no padrão de expressão de diversas proteínas que participam da defesa

antioxidante. Diversos genes antioxidantes respondem à presença de H2O2 com o

aumento de sua expressão.

Começamos então por testar se a expressão de mTPxI sofria alguma modificação

quando as células são expostas ao H2O2. A figura 8 mostra a indução da expressão de

YBL064c respondendo de maneira tempo dependente à exposição por peróxido. Essa

resposta é também dependente da fonte de carbono no qual a levedura cresceu, pois

podemos observar que em glicerol a resposta é maior e mais rápida (Figura 8). A indução

por peróxido se mostrou também dose dependente com relação ao peróxido adicionado

no meio. Novamente, a resposta é maior em glicerol e menos limitada, ou seja, quanto

mais peróxido adicionado, mais YBL064c foi expresso (testamos até 3mM de H2O2). Já

em glicose a indução por peróxido atinge seu máximo com 0.5mM de H2O2, decaindo

quando as células são expostas a maiores concentrações (Ver Figura 3 no anexo I e texto

detalhado).

60

Figura 8: Análise da expressão de YBL064c por Northern blotting. As colunas vermelhas representam as células crescidas em glicose e as colunas azuis representam as células crescidas em glicerol. A linhagem utilizada nessa análise foi FY1679 (linhagem selvagem isogênica a ∆YBL064c - com exceção da canaleta 7 que corresponde `a linhagem FMEY007-07C(A)- ∆YBL064c, utilizada como controle para verificar a especificidade da sonda). Foram coletadas, tanto em glicose como em glicerol, células com 0, 15, 30 e 60 minutos de tratamento com 1mM de H2O2. 1 - WT0’, 2 – WT15’, 3 – WT30’, 4 – WT60’ – todos em glicose; 5 – WT0’, 6 – WT15’, 6 – WT30’, 7 – WT60’ - todos em glicerol. O gráfico representa a relação entre a quantidade de mRNA de YBL064c e a quantidade total de RNA – representada pelo rRNA. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech). As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% e sem adição de peróxido (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.

Não está ainda estabelecido se existe um “sensor” universal de O2 nos grupos

taxonômicos. Existe, porém, uma molécula que tem sido freqüentemente envolvida nesse

processo na maioria dos organismos, o heme. Em vertebrados, heme comumente funciona

como o componente redox de várias hemoproteínas, algumas das quais podem atuar como

sensores de O2. Portanto, grupos heme são grupos prostéticos de enzimas e globinas, porém

heme também faz parte de muitos processos moleculares envolvendo utilização e sensibilidade

ao O2 (Zhang et al., 1998).

02468

101214161820

WT 0

WT 15

'

WT 30

'

WT 60

'

ybl06

4cWT 0

WT 15

'

WT 30

'

WT 60

'

YB

L064

C/rR

NA

rRNA

YBL064c

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3

4

5

6

7

8

9

Glicose Glicerol 0’ 15’ 30’ 60’ 0’ 15’ 30’ 60’

61

Em S. cerevisiae, o heme tem sido sugerido como uma molécula sensora de O2. Nessa

levedura, heme é a molécula que sinaliza a ativação de Hap1p (“Heme Activator Protein”). Na

ausência de heme, Hap1p forma complexos de alto peso molecular (1000 kDa), ao interagir com

fatores inibitórios (Esquema VII) (Zhang et al., 1998). O grupo "zinc-finger" de Hap1p se liga a

seqüências CGG e uma região N-terminal que reconhece 5 pares de base de timina; portanto

Hap1p reconhece sítios degenerados do tipo CGGNNNTANCGGNNNTA (Vuidepot et al.,

1997).

Hap1p regula a transcrição de diversos genes relacionados à defesa celular contra danos

oxidativos causados pela respiração aeróbia. Dentre eles se encontram a catalase citossólica

(CTT1), as 2 superóxido dismutases (SOD1 - citosólica e a SOD2 – mitocondrial) (Bunn e Poyton,

1996) e diversos genes relacionados com a cadeia respiratória (CYC7- iso – 2- citocromo c), com

a síntese de heme, esteróis e síntese de ácido graxo (HEM13 – coproporfirinogênio III oxidase,

HMG1 – 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase e ERG11 – citocromo P450 lanosterol 14 α-

demetilase), além de fatores traducionais (TIF51a) e transcricionais (ROX1). Essa intrincada rede

regulatória ativada monta um sistema de defesa antioxidante forte em diversos níveis e

compartimentos celulares (Kwast et al, 1999). Por isso, decidimos testar a expressão de YBL064c

em linhagens deficientes para HAP1 durante a indução por peróxidos (Figura 9). Na figura 9

observamos um forte efeito da ausência do ativador Hap1p, causando a incapacidade do aumento

de expressão do gene YBL064c na presença de H2O2.

62

Figura 9: Envolvimento de HAP1 na indução da expressão de YBL064c na presença de H2O2 (1mM) por 15 minutos. As barras laranja representam as células que foram crescidas em glicose 2% e as barras verde, células que cresceram em glicose 10%. 1 e 5=WT sem tratamento; 2 e 6= WT tratada; 3 e 7= ∆HAP1 sem tratamento; 4 e 8= ∆HAP1 tratada. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech). As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.

Para corroborar os resultados obtidos a respeito do envolvimento de Hap1p na indução de

YBL064c por H2O2 em glicose, testamos a expressão desse gene em linhagens mutantes para a

síntese de heme, molécula sinalizadora essencial para completa ativação de Hap1p. Como

esperado, na ausência de heme a indução da expressão de YBL064c não ocorreu, corroborando

nossa hipótese de que a molécula heme é o sinalizador necessário a essa indução (Figura 10) e que

a mesma se dá através da ativação de Hap1p.

02468

101214

wt(HAP1)

wt(HAP1)

H2O2

hap1

hap1

H2O

2

wt(HAP1)

wt(HAP1)

H2O2

hap1

hap1

H2O

2

1 2 3 4 5 6 7 8

rRNA

YBL064c

1

2

3 4 5

6

7 8

Glicose 2% Glicose 10% H2O2 - + - + - + - + HAP1 + - + - + - + -

63

Figura 10: Efeito da ausência de heme na indução da expressão de YBL064c por exposição ao H2O2 (1mM por 15 minutos). Células crescidas em YEPD até a fase midlog. Na primeira linha, o sinal (+) indica a presença do gene HEME15 (linhagem selvagem GG231-4A), um dos genes que codificam para a enzima ferroquelatase que participa da última etapa da síntese de heme e o sinal (–) indica a deleção desse gene (linhagem ∆heme15). Na segunda linha, o sinal (+) indica adição de peróxido e o sinal (-) indica não adição de peróxido. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).

Há diversas enzimas antioxidantes reguladas por heme. Hap1p é responsável pela

regulação das 2 superóxido dismutases (MnSOD e Cu,ZnSOD) (Bunn e Poyton, 1996) e da

catalase citossólica (White, M. F. e Lilley, 1996), sendo que todas são sensíveis a concentração de

heme na célula. Com isso, podemos imaginar que pode haver um caminho metabólico comum de

sinalização intracelular que começa com o “sensor” representado pelo heme (cujos primeiro e

últimos passos da síntese se realizam na mitocôndria sendo 1 deles dependente de O2, além de

outro passo citossólico também dependente de heme – ver Esquema VI) que se liga em fatores de

transcrição como Hap1p que, por sua vez, ativam a transcrição de importantes genes antioxidantes

para a detoxificação das chamadas EROs na célula. Como vimos através da análise de expressão,

podemos sugerir que mTPxI é um alvo dessa via regulatória de resposta ao estresse oxidativo

mediado por heme e Hap1p.

rRNA

YBL064c

1 2 3 4

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

WT WT H2O2 heme heme H2O2

1

2

3 4HEME15 + + - -H2O2 - + - +

64

A primeira idéia que tivemos ao ver que Hap1p era o regulador da indução da expressão

gênica de mTPxI, foi testar se o mesmo era também um regulador global para diferentes

condições fisiológicas da levedura, como a indução por peróxido em meio respiratório. Para nossa

surpresa, o resultado foi negativo e nem mesmo Msn2/4p, que também participam de respostas a

estresse oxidativo, foram responsáveis por essa indução (A Figura 4 do anexo I mostra que

Msn2/4p não participam da indução por peróxido). Até o presente momento, não conseguimos

relacionar nenhum fator de transcrição a essa resposta.

Esses dados são compatíveis aos observados na análise da expressão de mTPxI tempo e

dose dependente de peróxido. Já foi citado antes, (pode ser observado na Figura 3 do anexo I) que

as respostas nos diferentes meios de cultura são muito distintas, o que sugere a participação de

reguladores diferentes em cada uma delas.

Em outras análises, já havíamos detectado uma forte indução da expressão de YBL064c

quando as células são expostas ao t-BOOH (tert-butil hidroperóxido), um mimético de peróxido

orgânico celular. Contudo, Hap1p não teve efeito regulador nessa resposta (Figura 11). Dessa

forma, voltamos a fazer uma busca entre os fatores de transcrição citados na introdução, a fim de

relacionarmos algum ativador a essa resposta transcricional.

1 2 3 4

rRNA

YBL064c

Figura 11: Efeito de Hap1p na indução por t-BOOH. 1- linhagem selvagem, 2- linhagem selvagem tratada com 1mM de t-BOOH, 3- linhagem deficiente no fator de transcrição HAP1, 4- linhagem deficiente no fator de transcrição HAP1 tratada com 1mM de t-BOOH, 15 minutos. Todas crescidas em glicose 2%.

65

Foram testadas 11 linhagens com deficiência em 1 ou mais fatores de transcrição

envolvidos com a resposta celular ao estresse oxidativo, no caso testado, exposição ao peróxido

orgânico t-BOOH. Dentre eles, encontramos resposta significativa na ausência de yAP1p e

Skn7p (Figura 12, C e E), nas quais há uma queda na indução da expressão de YBL064c. Duas

linhagens com “background” genético diferentes foram avaliadas quanto a indução da expressão

de YBL064c por t-BOOH na ausência de yAP1p. Em ambas pudemos observar a queda na

indução por esse peróxido, contudo, na linhagem proveniente de W303-1a, a perda na

capacidade de indução foi maior (Figura 12, quadro E). Outros experimentos de Northern

blotting foram realizados para confirmar esses dados e o resultado obtido foi o mesmo,

implicando assim, pelo menos em parte, yAP1p e Skn7p na resposta à t-BOOH de YBL064c.

66

Figura 12: Análise da expressão de YBL064c por Northern blotting nas linhagens com deleção nos fatores de transcrição envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (indução por t-BOOH). As linhagens foram crescidas em YEPD até OD600nm próxima à 0.8 sofrendo ou não (controles) exposição à 1mM de t-BOOH por 15 minutos.

Wt ∆HAP1

t-BOOH

rRNA

YBL064c

- + - +

Wt ∆ACE1 ∆ACE2 ∆ACE1/2

t-BOOH

rRNA

YBL064c

- + - + - + - +

Wt ∆yAP1 ∆yAP2

t-BOOH

rRNA

YBL064c

- + - + - + t-BOOH

rRNA

YBL064c

Wt ∆MSN2/4

- + - +

Wt ∆yAP1 ∆SKN7 ∆yAP1/∆SKN7

t-BOOH

rRNA

YBL064c

- + - + - + - +

Wt ∆MAC1

t-BOOH

rRNA

YBL064c

- + - +

A B

C

E

D

F

H9BW G

SEY6210

W303-1a

W303-1aYJJ1

67

Em 2004, o grupo de Viladevall analisou através da técnica de gene repórter a indução

por H2O2 de mTPxI mediada por yAP1p. Nesse trabalho, mostra-se uma clara participação de

yAP1p e Skn7p na indução da expressão de mTPxI em células expostas ao H2O2 (Viladevall et

al., 2004). Nós havíamos feito essa análise e não obtivemos o mesmo resultado. Porém, nós

havíamos utilizado a linhagem W303-1a que foi posteriormente cartacterizada como mutante

para uma importante proteína de ligação ao yAP1p, a yBP1 (de “yAP1 binding protein” – ver

Esquema V) (Veal et al., 2003). Dessa forma, nessa linhagem o fator yAP1p apresenta

problemas na indução da expressão de genes alvos. Com isso, testamos a mesma linhagem

selvagem utilizada no trabalho de Viladevall et al. (2004), a BY4741 e suas isogênicas com

mutação em YAP1, SKN7 e YAP2 para analisar a expressão de mTPxI em células expostas tanto

ao t-BOOH (que já havíamos detectado efeito mesmo com a mutação para YBP1) quanto ao

H2O2 cuja participação desses fatores nós não havíamos detectado.

Figura 13: Análise da expressão de YBL064c em células ∆YAP1, ∆SKN7 ou ∆YAP2 expostas ao H2O2 ou ao t-BOOH (1mM, por 15 minutos, células crescidas em YEPD até a fase midlog e então tratadas).

rRNA

YBL064c

BY4741 ∆yAP1 ∆SKN7 ∆yAP2

H2O2 - + - - + - - + - - + - t-BOOH - - + - - + - - + - - +

68

A figura 13 confirma a observação feita por Viladevall et al. (2004) mostrando a clara

participação de yAP1p na regulação de YBL064c por H2O2. Apesar do efeito ser mais discreto do

que a ausência de Hap1p ou heme, não podemos excluir yAP1p dessa via de indução de mTPxI.

Contudo, numa observação cuidadosa, yAP1p e Skn7p parecem participar também da expressão

basal desse gene. Quanto a regulação por t-BOOH, confirmamos também nessa linhagem o claro

envolvimento de yAP1p e Skn7p nessa resposta.

Curiosamente, há poucos trabalhos que reportam o envolvimento dos fatores de

transcrição yAP1p e Skn7p na resposta a peróxido orgânico. Ambos são muito descritos na

literatura como agentes de resposta ao H2O2 e oxidantes de tiól. yAP1p já foi estudado em

respostas à diamida, dietilmaleato e cádmio (Kuge et al., 1997). yAP1p tem sua localização

celular regulada por oxidação de cisteínas em sua região sinalizadora para o núcleo. Essa

oxidação causa mudanças na interação com seu exportador nuclear Crm1/Xpo1, fazendo com

que yAP1p se acumule por mais tempo no núcleo (ver Esquema V - Delaunay et al., 2000 e

Kuge et al., 1998). Delaunay et al. (2000) observou que a resposta conformacional de yAP1p é

parecida em células tratadas com H2O2 e com t-BOOH, mas diferente da observada em células

expostas à diamida, o que sugere maneiras diferentes de ativação por esses oxidantes (Delaunay

et al., 2000). Contudo, o estudo não avaliou a capacidade indutora e nem a localização celular

desse fator de transcrição durante a exposição à t-BOOH (Delaunay et al., 2000).

Novamente, podemos formar um complexo quadro de regulação da expressão de mTPxI

frente ao estresse oxidativo. Mais quatro reguladores foram envolvidos: Hap1p, o sinalizador

heme, yAP1p e Skn7p. O esquema X mostra um quadro dessas regulações.

69

Esquema X: Via de regulação de mTPxI por peróxidos. A maior parte dos resultados apresentados gerou duas publicações que foram citadas no texto como anexos I e II, presentes no final da tese. As setas indicam indução e o símbolo ⊥ indica repressão.

↑ [heme]?

Glicose +

t-BOOH

Glicerol + peróxidos = ????

Glicose +H2O22 2

Skn7

70

(IV) CAPÍTULO II - Estudo da função celular de mTPxI – Efeito protetor na

mitocôndria.

(IV.1) INTRODUÇÃO.

Estudo do envolvimento das peroxirredoxinas na transição da permeabilidade

mitocondrial.

Dados de diversos laboratórios indicam que o desequilíbrio na homeostase de Ca+2 e/ou

tióis exerce grande influência em patogêneses causadas por injúrias celulares associadas com

estresse oxidativo. É bem conhecido que a mitocôndria pode perder sua habilidade de

fosforilar ADP, sofrer diminuição do potencial de membrana e inchar quando incubada na

presença de cálcio. Isto se deve a uma permeabilização da membrana interna mitocondrial,

dependente de Ca+2, que é denominada de transição da permeabilidade mitocondrial (MPT)

(Reed, 1990). O aumento de Ca+2 leva à abertura do poro de transição com conseqüente

aumento da permeabilidade da membrana interna mitocondrial. Existem evidências de que

essa permeabilização induzida por Ca+2 é mediada por EROs. Essas espécies agiriam através

da oxidação de tióis das proteínas de membrana, levando à abertura do poro de transição

(Castilho et al., 1995). Esse estímulo por cálcio poderia ser ainda explicado pela ativação da

fosfolipase A2 por este cátion. Fosfolipase A2 é reconhecida por causar profundos danos na

cadeia respiratória em condições de isquemia e reperfusão (Nakamura et al., 1991; Turrens et

al., 1991).

A estimulação de MPT depende além de Ca+2, de uma grande variedade de compostos

com diferentes características químicas, denominados indutores, incluindo fosfato inorgânico

71

(Pi), agentes oxidantes, protonóforos e ligantes do translocador do nucleotídeo adenina,

apesar do Pi ser o mais provável indutor de MPT in vivo (Zoratti e Szabò, 1995).

Disfunções mitocondriais relacionadas a estresse oxidativo e MPT têm sido relacionadas

com a promoção de necrose celular sob condições de isquemia /reperfusão ou exposição ao fator

de necrose tumoral (TNF). Mais recentemente, tem sido proposto que MPT pode também ser um

evento inicial na morte celular apoptótica. Nesse caso a apoptose, como conseqüência de MPT,

poderia ocorrer por dois mecanismos:

1. Através da liberação de citocromo c da mitocôndria durante o MPT, podendo

induzir a ativação de caspases citossólicas, resultando na fragmentação do DNA

nuclear (Zhivotovski et al., 1998).

2. Através da liberação de proteínas mitocondriais intermembranares (como AIF –

“apoptosis inducing factor”) causando fragmentação do DNA nuclear (Zamzami

et al., 1997).

Em 2000, Kowaltowski et al. caracterizou um fenômeno de permeabilização da

membrana interna da mitocôndria de leveduras. O mesmo, assim como em mamíferos,

mostrou-se dependente de cálcio e de estresse oxidativo, estimulado por oxidantes de tióis e

inibido pela adição de catalase ou cTPxI. Porém, um potente e conhecido inibidor do poro de

transição mitocondrial em mamíferos, a ciclosporina A, mostrou ser ineficiente na inibição

da permeabilização da mitocôndria em leveduras (Jung et al., 1997). Além disso, a

manutenção da integridade mitocondrial das leveduras é dependente de Pi; em mamíferos, Pi

é um dos ativadores da abertura do poro de transição mitocondrial. Outra diferença

importante entre mitocôndrias de leveduras e mamíferos é a captação de cálcio; em

mamíferos existem canais de cálcio presentes na membrana mitocondrial que estão ausentes

72

em leveduras. Há várias diferenças entre MPT (em mamíferos, que possui um poro de

transição inibido pela ciclosporina A) e o fenômeno de permeabilização da membrana interna

mitocondrial em leveduras, que é ainda pouco caracterizada. Dados obtidos até agora

mostram que a permeabilização da membrana interna da mitocôndria tem como característica

conservada o fato de ser dependente de cálcio e, pronunciadamente em leveduras, dependente

de estresse oxidativo.

O fato de agentes pró-oxidantes estimularem a permeabilização da membrana interna

de mitocôndrias de leveduras e o fato de tiorredoxina peroxidase citossólica I (cTPxI) e

catalase inibirem esse fenômeno (Kowaltowski et al., 1998 e 2000), nos levou a investigá-lo

nas linhagens mutantes para os genes que codificam mTPxI, cTPxI (como controle), cTPxII e

cTPxIII a fim de estabelecer um quadro comparativo da importância das diferentes isoformas

na prevenção à permeabilização da membrana interna de mitocôndrias de leveduras.

73

(IV.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA

PERMEABILIDADE DA MEMBRANA INTERNA MITOCONDRIAL EM LEVEDURAS.

(IV.2.1) Linhagens de levedura utilizadas (todas compradas do projeto EUROSCARF):

• BY4741 (wt) (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0)

• YBL064c (mTPxI) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YBL064c::kanMX4)

• YML028w (cTPxI) (BY4742, MATα, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YML028w::kanMX4)

• YDR453c (cTPxII) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YDR453c::kanMX4)

• YLR109w (cTPxIII) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YLR109w::kanMX4)

(IV.2.2) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994):

YPGAL: (2% galactose, 2%peptona, 1%extrato de levedura).

YPYE: 1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol, 2% etanol.

(IV.2.3) Isolamento de mitocôndrias.

Um pré-inóculo em YPGAL foi crescido por 24 horas e então diluído para OD600nm = 0.2

em 300ml de YPGAl fresco; esse inóculo cresceu uma noite e as células foram coletadas por

centrifugação por 10 minutos a 40C, 4000g. Para células com inibição de catalase, foi adicionado

ao meio 5mM de inibidor específico ATZ (3-amino-1,2,4-triazol – Sigma). Para células em

glicerol o pré-inóculo foi incubado a 300C por 48 horas e inoculadas em meio fresco por 36

horas. O pellet foi lavado com 40ml de sorbitol 1.2M, pesado e ressuspenso no tampão de

digestão pH 7.5 contendo 1.2M sorbitol, 75mM fosfato de sódio, 1mM de EDTA, 300µl de β-

mercaptoetanol, liticase (Sigma) 400µg/ml. As células foram incubadas no tampão de digestão

por 2 horas a 370C. Os esferoblastos foram lavados 2 vezes com sorbitol 1.2M gelado, seguido

de centrifugação 5000g, 10 minutos, 40C. O pellet foi ressuspenso no tampão de lise contendo

74

sorbitol 0.5M, Tris-HCl 10mM pH 7.5, EDTA 1mM. A homogeneização foi feita em potter

provido de homogeinizador por 10 vezes. Centrifugou-se 2000g, 40C, 10 minutos. Coletou-se o

sobrenadante e repetiu-se a centrifugação. Coletamos novamente o sobrenadante e centrifugamos

12000g, 40C, 10 minutos. Ressuspendemos o pellet em 10ml de tampão de lise e repetiu-se a

centrifugação. Ressuspendemos o pellet em tampão adequado ao experimento a ser realizado

com a mitocôndria e medimos concentração protéica.

(IV.2.4) Medida do Potencial de Membrana Mitocondrial em mitocôndrias isoladas.

O potencial de membrana mitocondrial foi avaliado fluorimetricamente através da

determinação da concentração de safranina O (5uM) no meio extramitocondrial em tampão

contendo sacarose 250mM, HEPES 10mM pH 7.2, fosfato de sódio 2mM, além de suplementos

com substratos para a mitocôndria como glutamato 5mM, succinato 2.5mM e 2.5mM etanol. O

potencial foi monitorado continuamente a 300C, com agitação. Ex = 495 nm e Em = 586 nm

(Fiskum et al., 2000). Para todos os experimentos foram realizadas curvas de calibração com

concentrações conhecidas KCl e adição de 1µg/ml de valinomicina. Utilizando a equação:

∆Ψ= 60log[K+out] / [K+

in], foi possível estabelecer uma curva para se determinar o potencial da

membrana mitocondrial em função da fluorescência da safranina O. A reação foi parada com

1µM de FCCP.

(IV.2.5) Determinação da concentração de proteínas pelo Ensaio de Bradford.

Foi o método colorimétrico empregado para determinar o conteúdo protéico de extratos e

soluções através da A595nm, utilizando BSA (albumina sérica bovina) como padrão externo.

Para as determinações foi utilizado um espectrofotômetro UV/Vis Hitachi modelo U-2001.

75

(IV.2.6) Medida de consumo de oxigênio.

Linhagens de S. cerevisiae crescidas em YPGAL foram incubadas em tampão contendo

125mM de sacarose, 65mM de KCl, 2.5 mM de etanol, 5mM glutamato e 2.5mM succinato em

HEPES 10mM pH.7.2. A respiração mitocondrial foi acompanhada utilizando-se um eletrodo de

Clark.

(IV.2.7) Atividade de remoção de peróxidos em extratos celulares.

Extratos de leveduras foram obtidos através da lise de esferoblastos com tampão Tris-

HCl 10mM pH. 7.5 e EDTA 0.5mM (TE). Depois de incubar 0.5mg/ml de extrato recente (< 3

horas) com 2mM de H2O2 por 3 minutos, uma alíquota de 1ul foi diluída em 2ml de tampão (TE)

contendo 50uM de Amplex Red e 1.0U/ml de peroxidase de raiz forte (HRP). Uma leitura única

foi tirada com excitação a 563nm e emissão a 587nm (Zhou et al., 1997).

(IV.2.8) Medida da quantidade de cálcio na matriz mitocondrial.

As frações enriquecidas em mitocôndrias (650ug/ml) foram incubadas com o indicador

fluorescente de cálcio fura-2/AM (10uM – Sigma) em tampão Hepes 10mM pH.7.5, contendo

240mM de sacarose, 0.1mM de EGTA e 1mg/ml de BSA, durante 30 minutos a 370C. A

suspensão foi diluída 10 vezes e lavada 2 vezes a 40C para eliminar o excesso de fura-2/AM

extramitocondrial. A emissão fluorescente a 510nm foi monitorada com excitações de 300nm a

400nm e o consumo de cálcio foi determinado como indicado pelo fabricante. Máximo e mínimo

de cálcio intramitocondrial foi medido em cada tipo celular tratando as amostras com 10uM de

ionomicina e 1mM de EGTA, respectivamente.

76

(IV.2.9) Medida da quantidade de tiól total.

Frações enriquecidas em mitocôndrias frescas foram solubilizadas com 1% SDS em

tampão Tris-HCl 85mM e EDTA 4mM pH. 8.1, na presença de 520uM de 5-5’-ditiobis (ácido 2-

nitrobenzóico), (DTNB – ou reagente de Ellman’s). As suspensões foram homogeneizadas e

incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente no escuro. A quantidade de tiól foi

determinada espectrofotometricamente em A412nm e calculada usando o coeficiente de extinção

do (TNB) = 13600 M –1cm-1 (Riddles et al., 1983).

(IV.2.10) Determinação de GSH e GSSG.

Células de leveduras ou frações enriquecidas em mitocôndrias foram rompidas em 1

volume de bolinhas de vidro e 2 volumes de ácido sulfosalicílico. A suspensão foi vortexada por

20 minutos a 40C e centrifugada a 14000g. Este procedimento foi repetido 2 vezes e os

sobrenadantes foram misturados. A glutationa total foi determinada espectrofotometricamente

em A412nm após a reação com DTNB (76uM) na presença de glutationa redutase (0.12U/ml) e

NADPH (0.27mM). Para determinar a glutationa oxidada (GSSG), amostras foram previamente

incubadas com N-etilmaleimida (NEM-5mM) por 1 hora em pH 7.0 ajustado com adição de

NaOH e o mesmo procedimento para dosar glutationa total foi adotado. Glutationa reduzida

(GSH) foi determinada pela diferença entre glutationa total e a glutationa oxidada. Amostras

foram normalizadas pela quantidade de proteína total (para frações enriquecidas em mitocôndria)

ou pelo peso seco de pellet (para as células).

(IV.2.11) Expressão e purificação de tiorredoxina peroxidases recombinantes.

mTPxI (na verdade mPrx-Ser38), uma enzima recombinante sem os primeiros 20

aminoácidos e com mutação na cisteína 38 para serina, sem modificar sua atividade (Pedrajas et

77

al., 2000) cedida gentilmente por Spyrou et al. e de nosso laboratório: cTPxI e cTPxIII= todas

foram clonadas nos sítios NdeI e BamHI do vetor de expressão pET15b da Novagen. cTPxII foi

clonada nos mesmos sítios de restrição porém no vetor pPROEX (Gibco).

Para a superexpressão das proteínas, transformantes de BL21(DE3) foram crescidas em

100ml de LB + ampicilina (150ug/ml) até a OD600 0.6 – 1.0 e induzidas por 3 horas com 1mM

de IPTG. O pellet de células foi sonicado a 30% de amplitude com 8 ciclos de 40 segundos de

sonicação (em gelo) + 40 segundos de descanso. Centrifugamos por 20 minutos 40C 16.000 g.

Os extratos protéicos foram submetidos à purificação na coluna de afinidade por His – tag. Os

vetores pET15b e pPROEX produzem uma enzima recombinante que possui uma cauda de 6

histidinas na porção N-terminal da proteína, o que permite sua purificação por colunas de

níquel. Primeiramente colocou-se o níquel (0.1M) na resina e equilibrou-se com 10 volumes de

tampão (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, Imidazol 50mM pH 7.4). Passamos então a

amostra e lavamos com tampão (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, Imidazol 150mM

pH 7.4). Para obtermos essa condição ótima de purificação fizemos um gradiente de tampões

com diferentes concentrações do competidor pelo níquel (Imidazol) variando de 100mM a

500mM. A respectiva enzima foi então eluída com 500mM de imidazol. A coluna é lavada com

tampão de lavagem (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, EDTA 50mM) e guardada a

40C. A verificação da pureza da amostra é feita por análise em gel SDS-PAGE. As

concentrações das proteínas são medidas à A280nm, usando o respectivo coeficiente de extinção

de cada proteína (ε) determinado de acordo com o conteúdo de tirosina, triptofano e cisteína

utilizando o software protparam (http://ca.expasy.org/protparam).

78

(IV.2.12) Gel SDS-PAGE.

O gel de separação é feito com 10% de poliacrilamida e o de empacotamento com 5%.

O tampão de corrida utilizado foi: MES SDS 1X (a solução estoque 20X continha MES 1M,

SDS 69.3mM, 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid Tris Base 1M, EDTA 20.5mM, pH 7.3).

As condições da corrida foram: voltagem 100V, corrente 110 - 125 mA, 60 minutos. O corante

usado foi o comassie blue em metanol e ácido acético e o descorante foi a mesma solução sem o

comassie blue.

(IV.2.13) Northern blotting para análise da expressão do gene GSH1 (gama-

glutamilcisteína sintetase)

As mesmas condições descritas no capítulo I, item III.2.6. O fragmento usado para

marcação da sonda radioativa foi clonado usando DNA genômico de levedura e iniciadores

específicos:

forward 5’CGCGGATCCCATATGGGACTCTTAGCTTTGGG3’ e reverso

5’CGCAAGCTTGGATCCTTAACATTTGCTTTCTATTGA3’. O produto de PCR foi

purificado do gel usando o kit wizard (Invitrogen).

79

(IV.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.

É conhecido que a ocorrência de MPT é mediada pela oxidação de grupamentos tiólicos de

proteínas da membrana mitocondrial interna, e prevenida ou revertida por redutores ditiólicos

(revisado por Kowaltowski e Vercesi, 1999). Com isso, MPT induzido por Ca2+ pode ser

aumentado na presença de agentes pró-oxidantes. Esses compostos levam a mitocôndria a uma

condição de estresse oxidativo, devido à depleção do poder redutor mitocondrial na forma de

NAD(P)H e, consequentemente, glutationa reduzida. O grupo do Dr. Vercesi e pesquisadores

associados, além de outros grupos, têm proposto que MPT ocorreria devido à oxidação de

grupamentos sulfidrilas de proteínas da membrana mitocondrial interna, promovidas por espécies

reativas de oxigênio (EROs) geradas pela própria mitocôndria (Kowaltowski e Vercesi, 1999).

Além disso, esses autores mostram que o acúmulo de Ca2+ leva a um aumento da geração

mitocondrial de EROs que seria um passo anterior ao MPT (Kowaltowski et al., 1995; 1998).

A remoção de EROs por antioxidantes (como catalase e cTPxI) previne a oxidação de

proteínas da membrana mitocondrial e a permeabilização da organela (Kowaltowski et al., 1998

e 2000). Baseados nesses dados e no fato de cTPxI ser comprovadamente um inibidor de MPT,

resolvemos estudar o papel de mTPxI e comparar o efeito com outras isoformas de TPxs no

fenômeno de permeabilização da membrana interna mitocondrial de leveduras, em colaboração

com a Profa Dra. Alicia J. Kowaltowski (IQ - USP).

Contudo, por que estudar o efeito de enzimas citossólicas num fenômeno mitocondrial? A

primeira causa é o fato de que H2O2 ser capaz de atravessar membranas, portanto, alterações na

homeostase redox do citossol podem afetar o compartimento mitocondrial. Segundo, e não

menos importante, é que deleções de um único gene podem afetar vias metabólicas inteiras,

causar efeitos compensatórios, além de provocar danos celulares pela ausência da atividade

enzimática perdida. Um exemplo claro desse efeito, é o aumento da expressão de genes

80

regulados pelo fator de transcrição yAP1p em células mutantes para cTPxI, incluindo diversas

enzimas antioxidantes além de maior síntese de glutationa (Inoue et al., 1999 e resultados

abaixo). Portanto, alterações podem ocorrem na mitocôndria como decorrência de efeitos

externos a essa organela.

A ocorrência de MPT só foi claramente descrita em mamíferos, no entanto Kowaltowski et

al., 2000 mostraram que mitocôndrias de leveduras sofrem permeabilização induzida por cálcio e

essa é inibida pelos mesmos fatores como EGTA, DTT e ADP, mas insensível à ciclosporina A

(um imunossupressor que interage com ciclofilinas presentes na membrana interna da

mitocôndria de mamíferos). Porém, um fato muito interessante e particular das mitocôndrias de

leveduras é que só na ausência de alguma enzima antioxidante (cTPxI ou catalase) essa

permeabilização ocorre. Em mitocôndrias de células selvagens não se observa esse fenômeno

mesmo na presença de cálcio sozinho ou em conjunto com outros indutores (Kowaltowski et al.,

2000; Jung et al., 1997).

A análise de mutantes é muitas vezes complicada, pois a célula possui diversos

mecanismos compensatórios para a ausência de uma proteína. Um exemplo clássico em S.

cerevisiae é o fato de proteínas envolvidas na síntese e no metabolismo de glutationa estarem

aumentados em mutantes ∆cTPxI (Inoue et al., 1999 e Figura 1B do anexo III). Com essa

premissa, iniciamos nossos estudos com uma caracterização geral do estado redox dos diferentes

mutantes. A figura 14 mostra o resultado da análise da atividade peroxidásica total dos extratos

de células das diferentes linhagens, o que nos ajuda a ter uma idéia do potencial peroxidásico das

mesmas.

Como podemos observar, as menores capacidades de remoção de peróxido foram

encontradas em células com catalase inibida (wt+ATZ) e na ∆cTPxI. Esse resultado está dentro

81

do esperado, já que catalase é uma enzima que degrada peróxidos muito rapidamente e cTPxI é

uma das mais abundantes (quase 0.8% do total de proteínas solúveis) (Kim et al., 1989).

Figura 14: Medida de remoção de peróxidos por extratos totais de leveduras. O gráfico representa a

média e o desvio padrão de três diferentes experimentos. O asterisco indica que as diferenças são estatisticamente

significantes com p< 0.01 (de acordo com o teste t). Foi considerado como 100% a remoção total de 2mM de H2O2

em 3 minutos.

Outra análise recentemente muito usada como medida de estresse oxidativo nas células é

a razão glutationa reduzida / glutationa oxidada. Isso porque, em células com metabolismo

aérobico esse tiól é muito abundante chegando a concentrações citossólicas da ordem de 10mM e

atua como um tampão do estado redox (Schafer e Buettner, 2001 ). A tabela I mostra essa análise

nas células totais.

0

20

40

60

80

wt wt + ATZ mTPxI cTPxI cTPxII

H2O

2 con

sum

ed (%

)

∆ ∆ ∆

* *

*

*

H2O

2co

nsum

ida

(%)

0

20

40

60

80


H2O

2 con

sum

ed (%

)

∆ ∆ ∆

* *

*

*

0

20

40

60

80


H2O

2 con

sum

ed (%

)

∆ ∆ ∆0

20

40

60

80


H2O

2 con

sum

ed (%

)

∆ ∆ ∆

* *

*

*

H2O

2co

nsum

ida

(%)

82

Tabela I – Medida de GSH e GSSG em células totais mutantes para tiorredoxina peroxidases.

Resultados provenientes de 3 experimentos independentes feitos em triplicata. SD = desvio padrão. *

Significa que as diferenças encontradas entre as amostras das linhagens mutantes comparadas com a linhagem

selvagem são estatisticamente significantes com valores de p < 0.01 (determinado pelo test t pareado).

Os resultados descritos na tabela I e na figura 14 indicam que todas as mutantes estão em

maior grau de estresse oxidativo do que a linhagem selvagem. Um fator interessante a ser

ressaltado, que corrobora nossa hipótese inicial de efeitos compensatórios é a quantidade de

glutationa total nas mutantes. Todas elas possuem quase 80% mais glutationa do que a linhagem

selvagem, o que sugere que a célula está tentando minimizar os efeitos da perda das peroxidases.

Como estudamos um fenômeno mitocondrial, fizemos também uma análise do estado dos

componentes tiólicos totais (protéicos e não protéicos) das frações enriquecidas em mitocôndrias

que iríamos utilizar nos testes posteriores. A tabela II mostra a quantidade de GSH e GSSG

nessas frações (ver também tióis totais na Figura 2 do anexo III).

Linhagem Glutationa Total (pmol/g de pellet)

± SD

GSSG (pmol/g de pellet)

± SD

GSH (pmol/g de pellet) ± SD

GSH/GSSG

WT 5840 ± 275 30 ± 1.1 5810 ± 280 194 ± 13.4

∆mTPxI 8540 ± 20 * 50 ± 1 * 8490 ± 10 * 170 ± 4.0 *

∆cTPxI 9230 ± 20 * 73 ± 0.5 * 9160 ± 20 * 126 ± 1.1 *

∆cTPxII 8400 ± 60 * 67 ± 8 * 8330 ± 50 * 124 ± 7.3 *

83

Tabela II- Quantidade de GSH e GSSG nas frações mitocôndriais.

Resultados provenientes de 3 experimentos independentes feitos em triplicata. SD = desvio padrão. *

Significa que as diferenças encontradas entre as amostras das linhagens mutantes comparadas com a linhagem

selvagem são estatisticamente significantes com valores de p < 0.01 (determinado pelo test t pareado).

Ao analisarmos a tabela II observamos que ∆mTPxI e ∆cTPxII estavam com o dobro de

GSSG em suas mitocôndrias com relação à linhagem selvagem (resultado também observado na

Fig.2 do anexo III, que mostra a dosagem de tióis totais), ou seja, estavam com suas

mitocôndrias sofrendo cronicamente maior estresse oxidativo. Outro dado muito claro foi a

quantidade baixa de GSSG na mitocôndria da ∆cTPxI. Isso poderia refletir de maneira direta um

maior poder redutor dessa mitocôndria, devido a um aumento na atividade de glutationa redutase

nessa linhagem (efeito compensatório), que preservaria os tióis mitocondriais.

Com essa prévia caracterização dos mutantes e da mitocôndria dos mesmos, iniciamos

nosso estudo sobre a permeabilização da membrana interna mitocondrial com a medida de perda

de potencial de membrana, um dos primeiros efeitos característicos desse fenômeno.

Fração Mitocondrial

Glutationa Total (pmol/mg de

proteína) ± SD

GSSG (pmol/mg de

proteína) ± SD

GSH (pmol/mg de proteína)

± SD

GSH/GSSG

WT 870 ± 24 20 ± 3 850 ± 30 43 ± 7.2

∆mTPxI 1140 ± 34 * 56 ± 8 * 1084 ± 42 * 19 ± 3.32 *

∆cTPxI 870 ± 26 12 ± 2 * 858 ± 28 72 ± 1.42 *

∆cTPxII 660 ± 12 * 46 ± 3 * 614 ± 15 * 13 ± 1.06 *

84

A figura 15A mostra uma cinética representativa de um dos experimentos que foi usado

nos cálculos e na construção do gráfico 15B. Como já havia sido descrito, a adição de cálcio não

teve efeito sobre a mitocôndria da linhagem selvagem, porém provocou uma queda muito

significativa no potencial de membrana da mitocôndria proveniente da linhagem ∆mTPxI. Do

gráfico 15B observamos que qualquer depleção de uma enzima antioxidante causou em maior ou

menor grau uma perda de potencial mitocondrial, que foi mais pronunciado na linhagem tratada

com inibidor de catalase. Quando as células foram crescidas em glicerol, o efeito foi aumentado

cerca de 50% na perda de potencial das mitocôndrias de células ∆mTPxI e ∆cTPxI, o que condiz

com o aumento da expressão dessas proteínas nesse meio (anexo I e Demasi et al., 2001),

indicando que suas ausências nessas condições causaram maiores danos, pelo menos no

compartimento mitocondrial (Figura 4 no anexo III).

85

Figura 15: Medida de potencial de membrana mitocondrial, dependente de cálcio. (A) Curva representativa indicando a perda por adição de cálcio (500uM). (B) Comparação gráfica das perdas de potencial nas diferentes linhagens mutantes para TPxs ou com catalase inibida – ATZ. As barras representam deltas da queda de potencial, ou seja, potencial antes da adição de cálcio subtraído pelo potencial 25 minutos após a adição desse cátion divalente.

0 5 10 15 20 250

50

100

150

200

Ca2+

mitochondria

wt

∆mTPxI

∆Ψ (m

V)

T ime (min)

A

0

50

100

150

200

wt m TPxI cTPxI cTPxII ATZMit

och

on

dri

al M

em

bra

ne

P

ote

nti

al L

os

s (

mV

)

B

∆ ∆ ∆

*

*

*

*

Tempo

mitocôndria

Perd

a de

Pot

enci

al d

e m

embr

ana

mito

cond

rial (

mV

)

86

Para corroborar nossa hipótese de que o fenômeno de permeabilização interna da

mitocôndria em leveduras é estritamente dependente das chamadas EROs, especialmente H2O2,

observamos o efeito de catalase adicionada no meio de reação nas diferentes mitocôndrias das

linhagens mutantes para TPxs e analisamos a perda de potencial de membrana dependente de

cálcio. Como esperado o efeito foi completamente inibido em todas as frações mitocondriais (ver

Figura 5 do anexo III).

Ainda nesse contexto, estudamos o efeito do cálcio na razão GSH / GSSG mitocondrial

para termos uma medida de estresse oxidativo causado após a adição desse composto.

Observamos uma queda significativa (teste t com p<0.01) na razão GSH / GSSG após a adição

de cálcio em todas as amostras analisadas (Figura 16). Houve uma queda também significativa

dessa razão na linhagem selvagem, apesar de seu potencial de membrana mitocondrial ser

insensível a esse estresse.

Porém, numa análise mais cuidadosa dos dados vemos que, com exceção da ∆cTPxI, as

frações mitocondriais das células mutantes para TPxs possuem em condições basais uma razão

GSH / GSSG mais baixa do que a correspondente à linhagem selvagem após tratamento com

cálcio. Assim, sugerimos duas possíveis explicações para esses dados:

• A deficiência em alguma enzima antioxidante, leva a um estresse oxidativo crônico,

que por sua vez, causa maior oxidação dos tióis da mitocôndria tornando essas

organelas mais susceptíveis aos danos causados pela exposição ao cálcio (dados

corroborados pelas Figuras 14 – mostrando menor capacidade peroxidásica; tabela II

e Figura 2 do anexo III– mostrando que com exceção de ∆cTPxI, as outras mutantes

possuem menos tióis reduzidos em suas mitocôndrias).

87

• A razão GSH / GSSG possui um mínimo valor capaz de manter o potencial da

membrana mitocondrial intacto. Abaixo desse limiar, que deve ser uma razão

GSH/GSSG entre 15 e 28, os sistemas antioxidantes mitocôndriais não seriam

capazes de previnir a permeabilização da membrana interna mitocondrial. Mesmo a

linhagem ∆cTPxI que possui uma alta razão GSH/GSSG em condições basais, sofre

uma queda maior do que a linhagem selvagem após adição do cálcio (essa queda foi

estatisticamente significante, de acordo com o teste t). Essa grande queda pode estar

relacionada com a ausência de uma enzima antioxidante que é bastante abundante

(cTPxI).

Figura 16: Razão GSH / GSSG das frações enriquecidas em mitocôndrias das linhagens selvagem e mutantes para TPxs sem (barras brancas) e com (barras cinzas) adição de cálcio (500uM). As frações foram incubadas por 15 minutos a 300C com cálcio e substratos respisratórios, sob agitação. O mesmo procedimento foi feito com as frações controles (sem adição de cálcio). Média de três experimentos independentes feitos em triplicata.

w t m T P xI cT P xI cT P xII

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

7 0

8 0

GSH

/ G

SSG

ratio

∆ ∆ ∆

X

*

*

*

X*

X*

X*

Raz

ão G

SH /

GSS

G

88

Essa hipótese está de acordo com todos os dados por nós obtidos, desde que o grau

da perda de potencial correlaciona diretamente com esses fatores analisados nas linhagens

utilizadas durante nosso estudo.

Como última análise comparativa entre as TPxs, utilizamos mitocôndrias isoladas de

∆mTPxI (que mostrou uma grande queda de potencial dentre as TPxs e assim evitamos um

artefato causado pela presença dessa enzima mitocondrial) e adicionamos no meio

quantidades iguais de TPxs purificadas para observarmos a inibição da perda de potencial

causada por cálcio (assim como o experimento da Figura 5 do anexo III, com a adição de

catalase exógena purificada). A figura 17 mostra que, como esperado, mTPxI mostrou

maior efeito protetor mitocondrial contra permeabilização da membrana interna

mitocondrial quando adicionada exogenamente. A figura 18 a seguir mostra um resumo de

nossos resultados nesse trabalho e nossa hipótese para explicá-los.

89

Figura 17: Efeito inibitório na perda de potencial da membrana da mitocôndria pela adição de TPxs

puras no meio de reação. As proteínas recombinantes foram adicionadas na concentração final de 5uM.

mTP xIp

0 5 10 15 20 250

50

100

150

200

∆Ψ

(mV)

T ime (min)

↑ Ca2+

mitocôndria

Se m adição de proteína

cTP xIp

cTP xIIp

Tempo (min)

90

Figura 18: Representação esquemática dos danos mitocondriais em cada linhagem deficiente para 1 TPx. Setas para cima e sinal (+) indicam maior intensidade/efeito positivo e seta para baixo significa efeito negativo maior. Setas horizontais significam conseqüência e ativação, e o símbolo ⊥ indica repressão.

Delta mTPxI

Menor atividade deremoção de H2O2 +

↓ GSH/GSSG razão

mitocôndrial

DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ ++

↓ GSH/GSSG razão celu lar

Alta o xidação de tióis

Delta -cTPxI

Menor atividade deremoção de H2O2 ++

↑↑ GSH/GSSG razão

mitocôndrial

DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ +

↓ ↓ GSH/GSSG razão celu lar

Delta -cTPxII

Menor atividade deremoção de H2O2 +

↓↓ GSH/GSSG razão

mitocôndrial

DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ ++

↓↓ GSH/GSSG razão celu lar

Alta o xidação de tióis

91

O esquema representado na figura 18 ilustra a complexidade da resposta de leveduras a

danos induzidos por Ca+2. Nossos resultados sugerem que pelo menos dois fatores são muito

importantes na defesa de mitocôndrias contra esse estresse: níveis de glutationa mitocondrial e

níveis de peroxidases dependentes de tiól. Como já amplamente discutido, na linhagem

selvagem, mesmo sofrendo perda de poder redutor na forma de glutationa com a exposição ao

cálcio, essa mitocôndria mantém plenamente suas funções. Já na ausência de alguma enzima

antioxidante, a célula fica mais exposta aos agentes oxidantes e a mitocôndria acaba sofrendo

oxidações de seus tióis o que a torna mais susceptível à perda de sua integridade quando um fator

indutor de danos se faz presente, como o cálcio. Não podemos esquecer dos efeitos

compensatórios que podem tornar difícil a interpretação dos dados obtidos quando analisamos

um mutante. A conclusão que podemos chegar é que a permeabilidade da membrana interna

mitocondrial é um fenômeno com causa multifatorial, complexa e que responde de forma e

intensidade diferentes de acordo com a condição fisiológica imposta a célula (como, por

exemplo, as diferentes mutações e inibições de enzimas antioxidantes por nós estudadas – Figura

18).

Nossos dados corroboram a hipótese de que grupos tióis reduzidos são um dos fatores

essenciais para a prevenção da permeabilidade mitocondrial, desde que em leveduras a proteção

dos mesmos pelas enzimas antioxidantes e manutenção da homeostase redox celular leva a uma

menor probabilidade de perda da função dessa organela. Esses dados geraram uma publicação

citada no texto como anexo III e apresentada no final da tese.

92

(V) CAPÍTULO III - Análise da atividade e estrutura de mTPxI .

(V.1) INTRODUÇÃO.

Tiorredoxinas peroxidases são enzimas capazes de catalisar a remoção de H2O2 e

peróxidos orgânicos às custas de doadores de elétrons tiólicos. Em S. cerevisiae há 5 isoformas

dessas proteínas distribuídas nos mais diversos compartimentos celulares. Dessas, apenas uma

pertence à classe das 1-Cys peroxirredoxinas (1-Cys Prxs) (a isoforma mitocondrial - mTPxI)

que é o objeto de estudo dessa tese. Essa classe tem como propriedade particular o fato de ter

apenas uma cisteína conservada (a que pertence ao sítio ativo de mTPxI), enquanto as 2-Cys

peroxirredoxinas (2-Cys Prxs) possuem, além da cisteína do sítio ativo - ou cisteína peroxidásica,

uma outra carboxiterminal, conhecida como cisteína de resolução.

A presença da cisteína de resolução das 2-Cys Prxs leva a uma diferença crucial no

mecanismo de ação entre essa classe e as 1-Cys Prxs. Isso se dá porque durante a oxidação da

cisteína do sítio ativo, todas as Prxs (1-Cys e 2-Cys) são oxidadas à ácido sulfênico (SOH). No

entanto, o fato das 2-Cys possuírem a cisteína de resolução, leva à formação rápida de uma ponte

dissulfeto entre a cisteína peroxidásica e a de resolução, que será posteriormente reduzida por

compostos tiólicos (na maior parte dos casos, pelo sistema tiorredoxina).

As 1-Cys Prxs não possuem cisteínas de resolução. Além disso, elas mantêm sua cisteína

peroxidásica num ambiente mais protegido e rígido dentro da estrutura terciária, o que permite

maior estabilização do ácido sulfênico, que será diretamente reduzido por um tiól. Porém, com

exceção de mTPxI de S. cerevisiae e 1-Cys Prx de mamíferos, a maior parte dos substratos

fisiológicos das 1-Cys são ainda desconhecidos (Pedrajas et al., 2000; Manevich e Fisher, 2005).

Em 1998, Choi et al. obtiveram a estrutura da hORF6, uma Prx humana. Assim como

mTPxI, essa enzima é uma 1-Cys Prx, que tem sua atividade regulada por pH. Esses autores

descrevem diversas características muito interessantes que só foram possíveis de serem

93

observadas devido à determinação da estrutura dessa enzima. Por exemplo, hORF6 (com 224

aminoácidos) pode ser subdividida em dois domínios: um domínio grande correspondente à

região N-terminal (1-174) e um domínio pequeno correspondente à região C-terminal (175-224).

O domínio grande contém um dobramento tipo tiorredoxina composto de quatro folhas β-

pregueadas e três α- hélices. O domínio pequeno é composto de três folhas β-pregueadas e uma

α- hélice. O domínio pequeno de uma subunidade se dobra sobre o domínio grande da outra

subunidade. Os autores sugerem que a cisteína do sítio ativo está dentro de um “bolso” rodeada

por aminoácidos carregados positivamente, incluindo uma histidina e uma arginina que são

altamente conservadas em 1-Cys Prxs. A interação entre os átomos desses aminoácidos propicia

um ambiente que favorece a diminuição do pKa da cisteína do sítio ativo, aumentando sua

reatividade (Choi et al., 1998).

Esses dados estruturais nos permitem fazer algumas análises. A hipótese de que a cisteína

do sítio ativo esteja mais protegida do meio externo e que mantém o ácido sulfênico estável é

corroborada por diversos fatores citados acima:

• A cisteína peroxidásica está no domínio grande (posição 47), que é protegido pelo

dobramento do domínio pequeno sobre ele.

• Aminoácidos carregados positivamente rodeiam o sítio ativo, o que limita a entrada

de moléculas carregadas positivamente e atrai moléculas com carga negativa.

• A estrutura cristalina foi obtida com a hORF6 na forma oxidada e apresentava o

ácido sulfênico na sua cisteína peroxidásica (o mesmo foi obtido com a estrutura da

1-Cys de Plasmodium falciparum, PfAOP por Sarma et al., (2005), o que está de

acordo com a sugestão de que o ácido sulfênico é estável nas 1-Cys Prxs.

94

Temos grande interesse na estrutura de mTPxI devido ao fato dessa enzima ser uma 1-Cys

que usa especificamente o sistema tiorredoxina de mitocôndria. Pedrajas et al. (2000) mostraram

que na presença do sistema tiorredoxina de humanos ou de Esccherichia coli a atividade

peroxidásica de mTPxI é reduzida pela metade quando comparada com o sistema mitocondrial

de levedura (Pedrajas et al., 2000). Esses autores mostraram ainda que mesmo na ausência da

cisteína 38 (substituída por uma serina) da região N-terminal, a atividade peroxidásica e a

interação com o sistema tiorredoxina mitocondrial não são prejudicadas. Isso está de acordo com

a classificação de mTPxI como uma 1-Cys, pois apesar dessa enzima possuir 3 cisteínas (Figura

1), apenas a da posição 91, na região conservada do sítio ativo, é crucial para atividade e

interação com substratos (seja ele o peróxido ou o redutor). Portanto, a Cys-91 de mTPxI é a

cisteína peroxidásica .

Estudos de atividade antioxidante mostraram que mTPxI é capaz de proteger glutamina

sintetase (GS) contra o sistema oxidante DTT/Fe+3/O2, sendo a Prx de levedura com maior

eficiência nessa atividade (Park et al., 2000). Esses resultados estão de acordo com descrições de

que Prxs só apresentam atividade antioxidante na presença de tióis (revisado por Rhee et al.,

2005). Por exemplo: cTPxI de leveduras só protege biomoléculas contra sistemas oxidantes que

contenham tióis (Netto e col., 1996). Essa especificidade pode ser explicada porque as formas

oxidadas de Prxs só seriam regeneradas por redutores que possuem grupos sulfidrilas (revisado

por Rhee et al., 1999).

Estudando propriedades enzimáticas de mTPxI, observamos um fato curioso, que de

início pareceu-nos um artefato: mTPxI também protegeu GS contra a inativação induzida por

ascorbato/Fe+3/O2. As Prxs são conhecidas por sua especificidade quanto ao uso de redutores

tiólicos, porém esses dados indicavam que proteínas da classe 1-Cys poderiam também utilizar o

ascorbato como agente redutor.

95

Essa atividade nunca foi descrita para nenhuma TPx, porém nossos dados mostram que

mTPxI apresenta atividade dependente de ascorbato comparável à reação utilizando DTT como

doador de elétrons. A determinação da estrutura de mTPxI poderia ajudar a esclarecer as razões

dessa proteína ser tão diferente das outras Prxs de levedura e das outras 1-Cys Prxs, sendo capaz

de usar ascorbato como agente redutor e interagir com tiorredoxina mitocondrial.

96

(V.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.

(V.2.1) Linhagens de bactéria utilizadas.

• DH5α;[endA1, hsdR17 (rk- mk

+), supE44, thi-1, recA1, gyrA (Na 1r), relA1, ∆ (lacZYA-

argF)U169 (m80lacZ∆M15)]

• BL21(DE3); [F-, amp T, hsdSb (rB- mb

-), gal, dcm (DE3) (Novagen)

• Origami; [ara–leu7697 araD139 lacX74 galE galK rpsL phoAPvuII phoR

F'[lac+(lacIq)pro] gor522::Tn10 (TcR) trxB::kan] (Novagen)

(V.2.2) Plasmídeos e Vetores utilizados:

PYCG – é um plasmídeo que contém o gene YBL064c, o gene que confere resistência à

ampicilina e origem de replicação em E. coli, permitindo assim sua clonagem nessa bactéria.

Esse plasmídeo foi obtido através da EUROSCARF (“European Saccharomyces cerevisiae

Archives for Functional Analysis”) e foi utilizado para obtermos fragmentos para sonda e para

construção do vetor de super expressão de mTPxIp.

pET3a- vetor de super expressão com um promotor viral (T7), desreprimido pelo açúcar

IPTG e que produz uma proteína recombinante com cauda T7-tag na região N-terminal que

auxilia na purificação, por coluna de imuno-afinidade (Novagen). mTPxI clonada nos sítios

BamHI e HindIII do vetor.

pET15b- vetor de super expressão com um promotor viral (T7), desreprimido pelo

açúcar IPTG e que produz uma proteína recombinante com cauda com His-tag que auxilia na

purificação, por coluna de afinidade a metais (Pharmacia). mTPxI clonada nos sítios NdeI e

BamHI do vetor.

pGEX-6P-1+Pf1-Cys-Prx – vetor pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences) que produz uma

proteína recombinante com fusão de GST-tag (cauda de glutationa S-transferase), com

97

expressão induzida por IPTG + proteína Pf1-Cys-Prx de Plasmodium falciparum, clonada no

sítio EcoRI do vetor, gentilmente cedido por Kawazu et al. (2005).

pETBlue-1+Prdx6 – vetor pETBlue-1 (Novagen) para super expressar a 1-Cys Prx de

mamífero (rato) em E. coli, clonada no sítio EcoRV do vetor. Expressão induzida por IPTG,

produzindo proteína nativa (sem fusão). Gentilmente cedido por Fisher (Manevich et al., 2004).

PinPoint Xa3+AtPER1 – vetor PinPoint Xa3 (Promega), com expressão induzida por

IPTG, produz a proteína 1-Cys Prx AtPER1 de Arabidopsis thaliana em fusão com

estreptoavidina na região N-terminal, clonada nos sítios BamHI e SmaI do vetor. Gentilmente

cedido por Aalen (Haslekas et al., 2003).

pDEST17+AhpE – vetor pDEST17 (Invitrogen), com expressão induzida por NaCl (0.3M),

produz a 1-Cys Prx AhpE de Mycobacterium tuberculosis em fusão com 6 histidinas na

região N-terminal. Gentilmente cedida por Beatriz G. Guimarães (LNLS).

pPROEX HT+Dp2540 / pPROEX HT+Dp6005 - vetor pPROEX HT (Gibco BRL), com

expressão induzida por IPTG, produz as 1-Cys Prxs de Drosophila melanogaster em fusão

com 6 histinas na região N-terminal. Gentilmente cedida por Svetlana N. Radyuk (Radyuk et

al., 2001).

(V.2.3) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994):

LB (1% triptona, 0.5% cloreto de sódio, 0.5% extrato de levedura e 2% ágar quando sólido).

(V.2.4) Construção do vetor de super expressão da proteína mTPxI – pET3a.

O vetor pET3a e o vetor PYCG foram clonados em bactérias DH5α, através de

transformação por eletroporação. Foi feita uma mini - preparação de DNA para purificar os

98

plasmídeos. A região estrutural de mTPxI foi amplificada por PCR utilizando-se pYCG como

molde, iniciador desenhado e comprado da Operon (com sítio de BamHI) para amplificar a região

5’ do gene (seqüência : CGC GGA TCC ATG TTT AGT AGA ATT TGT AG) e para região 3’

utilizou-se o iniciador comercial reverso.

O produto de PCR e o vetor pET3a foram cortados com as enzimas HindIII e BamHI

durante uma noite a 370C. Um gel de 0.7% agarose foi utilizado para separação dos fragmentos,

que foram cortados do mesmo e purificados utilizando-se o kit glass - max da GIBCO BRL. Após

esse procedimento, foi feita uma reação de ligação, utilizando a enzima ligase 1U, tampão 1X,

vetor pET3a e fragmento mTPxI, a 160C por 3 horas. A bactéria DH5α foi transformada com o

produto da ligação, o qual foi posteriormente purificado por mini - preparação de DNA (pelo

método de hidrólise alcalina); uma alíquota foi cortada novamente com as enzimas HindIII e

BamHI e aplicadas em gel de agarose 0.8% para confirmar a presença do inserto de mTPxI. Além

disso, foi realizado o sequenciamento da construção. A linhagem BL21(DE3) foi transformada

com os plasmídeos contendo a construção correta.

(V.2.5) Purificação de mTPxI por coluna de afinidade T7-Novagen.

Essa é uma coluna de afinidade para construções que utilizam o vetor pET3a. A

expressão da proteína referente ao gene inserido entre os sítios BamHI e HindIII desse vetor,

resulta em uma proteína recombinante com uma fusão do peptídeo T7 na porção N-terminal,

denominado T7-tag. Dessa forma, é possível purificar a proteína recombinante por imuno-

afinidade, utilizando coluna que possui um anticorpo contra a seqüência N-terminal T7-tag.

Além disso, o kit utilizado para purificação possui um “binding/wash buffer” (Na2PO4 4.3mM,

KH2PO4 1.5mM, KCl 2.7mM, NaCl 137mM, Tween-20 0.1%, azida 0.002%, pH 7.3) para

99

equilibrar a coluna; possui ainda “elute buffer” (0.1M ácido cítrico, pH 2.2) para eluição da

proteína que se ligou especificamente à coluna e um “neutralization buffer” (Tris base 2M, pH

10.4) para neutralizar a proteína eluída, já que a eluição é feita por pH ácido (pH 2,2). Com

esse kit da Novagen, primeiro equilibra-se a coluna com o “binding/wash buffer”; depois se

carrega a coluna com o extrato protéico total de bactéria (obtido por crescimento das bactérias

em meio rico LB (1L-OD600 = 0,6-0,8) e indução por 3 horas com 1mM de IPTG, com posterior

sonicação das células - 5 ciclos de 1 minuto, com parada de 40 segundos e amplitude de 40%).

Lava-se a coluna com 10ml de “binding/wash buffer”, coletando-se essa fração de proteínas não

ligadas à coluna; lava-se, então, a coluna com 5ml de “elute buffer” e coleta-se a fração de

proteína ligada na coluna que imediatamente é neutralizada com 150ul de “neutralization

buffer” para cada 1ml de eluído. Isso permitiu-nos a purificação de mTPxI em grandes

quantidades utilizando apenas um passo.

(V.2.6) Construção do vetor de super expressão de mTPxI sem a região N-terminal +

pET15b.

O gene que codifica para mTPxI sem a região N-terminal (sem os 48 primeiros

aminoácidos) foi amplificado a partir do plasmídeo pYCG usando os iniciadores: região 5’com

sítio para enzima de restrição NdeI (ATACATATGAGAATAAACTCTGATG) e região 3’ com

sítio para enzima de restrição BamHI (ATTGGATCCTTATTTCGACTTGGTGAATC).

O produto de PCR foi clonado no vetor pGEM-T Easy da Promega. Bactérias DH5α

foram transformadas com o produto de ligação. O vetor de clonagem + mTPxI sem N-terminal foi

selecionado por placas de LB+ ampicilina (100µg/ml) + 0.5mM de IPTG + X-Gal (80µg/ml).

Duas colônias brancas foram crescidas e o plasmídeo foi recuperado através de mini preparação

100

de DNA utilizando o Kit Concert Rapid Plasmid Purification Systems - Centrifugation Protocol

(GibcoBRL). O vetor de super expressão pET15b foi obtido através de mini preparação de DNA

usando o mesmo Kit e posteriormente cortado com NdeI e BamHI. Ambos, vetor pET15b e

fragmento mTPxI cortados, foram separados em gel de agarose 0.7% e purificados utilizando o

Kit Concert Gel Extraction Systems – Centrifugation Protocol (GibcoBRL). pET15b + mTPxI

sem N-terminal foram colocados na proporção de 1 : 3, respectivamente na reação de ligação, à

temperatura ambiente por 2 horas (ligase da Promega, 1U). Bactérias DH5α foram transformadas

com o produto de ligação e plaqueadas em LB + ampicilina (100µg/ml). Duas a quatro colônias

foram utilizadas para recuperação do plasmídeo cuja inserção do gene foi confirmada através de

PCR usando os iniciadores descritos acima. Bactérias BL21(DE3) foram transformadas com os

plasmídeos que possuíam o inserto. A confirmação da construção foi feita por sequenciamento.

(V.2.7) Purificação de mTPx sem N-terminal por coluna de afinidade His-tag -

Pharmacia.

Para super expressar pET15b+mTPxI sem N-terminal, colônias isoladas de BL21(DE3)

foram crescidas em 1L de LB + ampicilina (150ug/ul) até a OD600 0.6 – 1.0 e induzidas por 3

horas com 1mM de IPTG. O pellet de células foi sonicado a 30% de amplitude com 8 ciclos 40

segundos (em gelo) + 40 segundos de descanso. Centrifugamos por 20 minutos 40C 16.000g. O

extrato protéico foi submetido à purificação na coluna de afinidade por His – tag. A expressão

de mTPxI em bactérias que contém o plasmídeo pET15b+mTPxI sem N-terminal resulta em

uma proteína recombinante com uma cauda de 6 histidinas na porção N-terminal da proteína o

que permite sua purificação por colunas de afinidade ao níquel. Primeiramente adiciona-se o

NiSO4 (0.1M) na resina, equilibra-se com 10 volumes de tampão (Tris-HCl 50mM pH 8.0,

101

NaCl 0.5M, Imidazol 50mM pH 7.4). Passamos então a amostra e lavamos com tampão (Tris-

HCl 50mM pH 8.0, NaCl 0.5M, Imidazol 150mM pH 7.4). Para obtermos essa condição ótima

de purificação fizemos um gradiente de tampões com diferentes concentrações do competidor

pelo níquel (Imidazol) variando de 100mM a 500mM. A enzima foi então eluída com 500mM

de imidazol. A coluna é lavada com tampão de lavagem (Tris-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 0.5M,

EDTA 50mM) e guardada a 40C.

(V.2.8) Gel SDS-PAGE.

O gel de separação foi feito com 10% de poliacrilamida e o de empacotamento com 5%.

O tampão de corrida utilizado foi: MES SDS 1X (a solução estoque 20X continha MES 1M,

SDS 69.3 mM, 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid Tris Base 1M, EDTA 20.5mM, pH 7.3).

As condições da corrida foram: voltagem 100V, corrente 110 - 125 mA, 60 minutos.

(V.2.9) Determinação da atividade antioxidante de mTPxI.

Ensaio de proteção à glutamina sintetase (GS).

Inicialmente a atividade tiól peroxidásica foi medida indiretamente através de ensaios de

proteção à glutamina sintetase em sistemas contendo Fe3+/ DTT/O2 (Kim et al., 1988; Netto et

al., 1996). O ensaio consiste na medida de atividade da glutamina sintetase que não foi

inativada pelo sistema oxidante contendo tiól como agente redutor. Tem sido descrito que Prxs

somente protegem biomoléculas quando um tiól é adicionado na mistura de reação, o que tem

sido atribuído ao fato de somente componentes com grupos sulfidrilas conseguirem regenerar a

forma reduzida de 2-Cys Prxs. Quando se faz o mesmo ensaio na presença de ascorbato como

agente redutor, 2-Cys Prxs não protegem glutamina sintetase ou outras biomoléculas da

inativação (revisado por Rhee et al., 1999).

102

Para medir a atividade protetora de mTPxI, colocamos em "eppendorfs" os componentes

da tabela III (pela ordem da esquerda para a direita, sem contudo colocar o DTT). A essa

mistura aplica-se o DTT e imediatamente incuba-se a mistura de reação a 370C por 15 minutos.

Damos um intervalo de 15 segundos entre cada amostra para que todas tenham o mesmo tempo

de reação enzimática. Ao final da incubação, retiramos as amostras do banho e colocamos em

gelo; adicionamos 1ml de mistura de ensaio da gama-glutamiltransferase (150mM glutamina,

100mM Hepes K+ pH 7.4, 10mM Na2HA5O4, 0.4mM ADP, 20mM NH2OH-HCl, 0.4mM

MnCl2, pH 7.57) e incubamos por 20 minutos à 370C. Depois da incubação colocamos 0.2 ml

de mistura de parada (FeCl3 e HCl 6M), agitamos no vórtex e realizamos a leitura em

espectrofotômetro a 540nm. Todas as medidas foram realizadas em triplicata (Kim et al., 1988;

Netto et al., 1996).

Tabela III: Ensaio para medir atividade da Tiorredoxina peroxidase mitocondrial.

Amostra Água Hepes

(1M, pH 7.4)

Glutamina sintetase

(1mg/ml)

Fe3+

(30uM)

mTPxI DTT

(0.1M)

Controle + 42µl 5µl 5µl 0µl 0µl 0µl

Controle - 25µl 5µl 5µl 5µl 0µl 5µl

Amostra 42-x µl 5µl 5µl 5µl xµl 5µl

O controle negativo prova que na mistura de reação, sem adição de mTPxI, a glutamina sintetase é intensamente inativada. O controle positivo é utilizado para se determinar a atividade de GS no tempo zero, antes do início do processo de inativação. Em alguns ensaios, o DTT foi substituído por ascorbato em igual concentração. A concentração de mTPxI usada no ensaio variou, mas normalmente foi de 3uM.

103

Ensaio de consumo de peróxido – Xylenol Orange.

Para medir diretamente a atividade peroxidásica de mTPxI utilizamos o método do

Xylenol Orange (Jiang et al., 1992). Esse método se baseia na oxidação de Fe+2 a Fe+3 por

hidroperóxidos (alquil ou de hidrogênio) em meio ácido. O Fe+3 gerado desta forma se complexa

ao quelante Xylenol Orange produzindo um composto de coloração roxa que pode ser

determinado a 560nm (ε = 4,52 X 104 M -1 cm -1). Incubações de mTPxI com DTT ou Ascorbato e

peróxidos foram feitas em diferentes tempos e condições para determinarmos a velocidade de

decomposição de peróxidos. A concentração de H2O2 de soluções estoque foi determinada a partir

de sua absorbância a 240 nm (ε = 43,6 M-1 cm-1).

O reagente FOX2 contém: Sulfato ferroso (25mM), Xylenol orange (100uM), BHT

(4mM) e Ácido sulfúrico (250mM). O BHT é adicionado para inibir processos oxidativos que

possam ocorrer durante as diferentes incubações.

A concentração de enzima utilizada variou em cada ensaio, mas o ensaio padrão conteve

10uM de mTPxI. O volume final de todas as reações era de 100ul e as mesmas foram incubadas a

37oC, sendo que frações foram coletadas nos tempos indicados nas legendas e nas figuras. As

reações foram paradas com ácido clorídrico (concentração final de 200mM) e posteriormente

acrescidas de 900ul do reagente FOX2, sendo então incubadas à 37oC por 30’ e realizada a leitura

em A540nm.

(V.2.10) Ensaios de cristalização de mTPxI.

As amostras de mTPxI – sem N-terminal foram purificadas como descrito no V.2.7 e

concentradas em Centricom YM10, até chegar a uma concentração de 15mg/ml de proteína. A

104

atividade foi verificada através de ensaio de Xylenol Orange (descrito no item anterior) para

confirmar a integridade da enzima. A amostra foi então dialisada por 24 horas com três litros de

tampão Tris-HCl 5mM pH7.5 (3 trocas de 8 em 8 horas para tirar o imidazol e diminuir a força

iônica do tampão). Foi utilizada a técnica de “hanging drop” como descrito por Oliveira et al.

(2004). Os ensaios de cristalização foram realizados no Centro de Biologia Molecular Estrutural

do Laboratório Nacional de Luz Sincronton (LNLS) e contaram com o apoio da equipe de

cristalógrafos, especialmente do Dr Francisco Javier (LNLS). Inicialmente, dois ensaios de

cristalização foram realizados, um a 220C (câmara com temperatura constante) e outro a 40C

(manipulação da amostra em gelo e manutenção das placas em câmara fria), com os Kits Crystal

Screen I e II da Hampton – cada um deles contendo 48 soluções diferentes. Com os Kits Wizard I

e II (também com 48 soluções diferentes cada um) apenas o ensaio a 220C foi feito. Com isso,

fizemos um total de 288 condições diferentes. Após 24 horas as placas foram observadas em lupa

e observações periódicas foram feitas uma vez por semana.

Tentamos ainda cristalizar mTPxI sem N-terminal após tratamento com N-etilmaleimida

(NEM), um agente alquilante de cisteínas. O tratamento com NEM (5mM, 2 horas, temperatura

ambiente, seguida de diálise para retirada do excesso) foi feito porque cisteínas muito reativas

(como é o caso das cisteínas do sítio ativo das TPxs) facilitam a formação de agregados protéicos

via pontes dissulfeto. Testamos 384 condições de cristalização, dessa vez utilizando diferentes

Kits (Jena de I a X, Crystal Screen I e II e Wizard I).

O pesquisador Giannis Spyrou (Karolinska Institute – Suécia) gentilmente nos enviou o

vetor (pET15b+ Ser38-m-Prx1p) que seu grupo construiu, no qual mTPxI está sem a cauda

sinalizadora para mitocôndria (sem os primeiros 20 aminoácidos) e com a cisteína na posição

38 mutada para serina, denominada Ser38-m-Prx1p (Pedrajas et al., 2000). O pesquisador

Spyrou ainda nos forneceu a linhagem de BL21(DE3) que super expressava essa versão de

105

mTPxI. Essa versão mutada de mTPxI, possui apenas a cisteína do sítio ativo e os parâmetros

enzimáticos são muito semelhantes aos da enzima nativa (Pedrajas et al., 2000). No entanto, foi

difícil obter essa proteína em concentrações necessárias aos experimentos de cristalização (10

mg/ml), pois a mesma era pouco solúvel e de fácil agregação (acima de 5mg/ml de

concentração enzimática, iniciava-se o processo de precipitação). Mesmo assim, com a ajuda do

pós-doutor Marcos A. Oliveira, nós realizamos 384 condições de cristalização utilizando o Kit

Crystal Screen I e II (Hampton); essas condições incluíram: Ser38-m-Prx1p oxidada com H2O2,

Ser38-m-Prx1p oxidada com t-BOOH, Ser38-m-Prx1p reduzida com DTT e Ser38-m-Prx1p sem

tratamento, todas com 5mg/ml.

(V.2.11) Estequiometria da atividade peroxidásica de mTPxI.

A reação padrão foi composta de: mTPxI (50uM) + DTPA (500uM) + Tris-HCl 100mM -

pH 7.5 + 1mM de hidroperóxido (H2O2 ou t-BOOH) + 1mM de Ascorbato. O controle consiste

da reação padrão na ausência de mTPxI, para quantificarmos a reação espontânea do peróxido

com o ascorbato.

O consumo de peróxidos foi analisado pelo ensaio FOX2 como descrito no item V.2.9.

Para eliminar o excesso de ascorbato que poderia reagir não enzimaticamente com o peróxido e

com componentes do ensaio FOX2, tratamos as amostras (antes da adição do Xylenol orange)

com 1U de ascorbato oxidase (Sigma) por 30 minutos a temperatura ambiente. A utilização de

ascorbato oxidase foi crucial para a análise do consumo de peróxidos, pois a reação espontânea

entre o ascorbato e o Fe+2 do ensaio FOX2 provocava um artefato que tornava impossível a

determinação de quanto peróxido restava na reação. Com a ascorbato oxidase foi possível

eliminar o excesso de ascorbato que não foi usado pela mTPxI e não reagiu espontaneamente

com o peróxido, reduzindo muito a interação desse composto com o reagente FOX2.

106

O consumo de ascorbato e a formação de DHA foram determinados por CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência) de fase reversa. Diferentes reações (sem ascorbato

oxidase) foram incubadas a 370C por 15 minutos (H2O2) ou 45 minutos (t-BOOH), ultrafiltradas

em microcon YM-10 para a retirada da proteína (mTPxI) e diluída em tampão Tris-HCl 10mM -

pH 7.5 + 10% acetonitrila (que correspondeu à fase móvel). A coluna utilizada foi Luna C-18-

5u, Phenomenex. Para detecção do ascorbato foi utilizado o detector PDA (ultravioleta) com

A265nm e para detecção de dehidroascorbato, utilizamos o detector de fluorescência (excitação

350nm e emissão 430nm). O dehidroascorbato foi medido utilizando um procedimento de

derivatização com o composto fluorescente 1,2-OPD (O- phenyldiamine - Sigma) como descrito

em Kall e Andersen (1999) e Simoes et al. (2003). Após a reação de mTPxI com ascorbato e

peróxido o OPD (1:1) foi imediatamente adicionado e a reação incubada em gelo por 1 hora;

após ultrafiltração em YM-10, a amostra foi aplicada no CLAE. Curvas padrões de ascorbato e

de DHA foram obtidas com concentrações conhecidas de reagentes obtidos comercialmente da

Sigma.

(V.2.12) Ensaio de proteção ao DNA.

10ng de plasmídeo pBR322 foi incubado com 1uM de mTPxI + 1,5uM de FeCl3 + 10mM

DTT ou Ascorbato a 370C por 10 minutos e analisados em gel de agarose 0.8%. Os controles

correspondem a reação sem mTPxI (negativo) e sem o sistema oxidante Fe+3/DTT ou Ascorbato/

O2 (positivo). As reações foram paradas pela adição de 500uM de DTPA.

(V.2.13) Detecção do consumo de ascorbato pela atividade da ascorbato oxidase (Sigma).

A enzima ascorbato oxidase catalisa a seguinte reação:

2 L- ácido ascórbico + O2 → 2 L-dehidroascorbato + 2H2O

107

A atividade peroxidásica de mTPxI consome ascorbato. Dessa forma, podemos verificar

o consumo de ascorbato que restou em solução, através do consumo de oxigênio (no oxígrafo -

eletrodo Clark) pela atividade da ascorbato oxidase. Portanto, inicialmente realizamos a

incubação padrão de mTPxI, a amostra foi ultrafiltrada no microcon YM-10 e o filtrado foi

incubado com 1U de ascorbato oxidase; a atividade foi acompanhada no oxígrafo a 250C. Assim,

cada molécula de oxigênio reage com 2 de ascorbato que ainda estavam no meio de reação, de

acordo com a estequiometria da reação catalisada pela ascorbato oxidase.

(V.2.14) Determinação de radical ascorbil por EPR (ressonância paramagnética

eletrônica).

Os experimentos de EPR foram feitos à temperatura ambiente no espectrômetro Bruker

EMX, operando a 9.85 GHz e 100 KHz de freqüência de modulação. As misturas de reação

(reação padrão) foram transferidas para uma cela de 200uL imediatamente após a adição de

H2O2. Os espectros foram coletados em vários tempos de incubação.

(V.2.15) Purificação de Gst-PRX1 de Plasmodium falciparum.

Para lisar as células, utilizamos o tampão de extração (50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA,

4 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10% glicerol, 1 M NaCl,, 1mM PMSF, pH 7,5) e sonicamos com 10

ciclos de 45 segundos, seguidos do mesmo tempo de descanso, potência 35%. Ao extrato

protéico, após clareamento por centrifugação (40 minutos, 16000g), adicionou-se volume igual

de tampão de extração sem NaCl ajustando a concentração de NaCl para 0,5 M. A amostra foi

purificada em um só passo através de cromatografia de afinidade à glutationa sefarose. Utilizou-

se o sistema de purificação ÄKTATM FPLC com Frac-900TM (Amersham Pharmacia Biotech) e

coluna de afinidade GSTrapTM FF 5 ml (empacotadas com Gluthatione Sepharose 4 Fast FlowTM

108

e capacidade total de ligação de 10 mg proteína de fusão a Gst recombinante por ml de gel,

Amersham Pharmacia Biotech). As amostras foram purificadas utilizando as soluções: tampão

de ligação (50 mM Tris HCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10% glicerol, 0,5 M NaCl, pH 7,5) e

tampão de eluição (50 mM Tris HCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10% glicerol, 0,5 M NaCl, 25

mM glutationa reduzida, pH 8,2).

Na coluna de afinidade GSTrapTM FF 5 ml: a coluna foi equilibrada com 15 ml de tampão

de ligação com fluxo 5,0 ml/min. O extrato foi aplicado, usando fluxo 0,5 ml/min, seguido de

lavagem com 25 ml de tampão de ligação a 0,5 ml/min e 30 ml a 5,0 ml/min. A eluição foi

realizada com 20 ml de tampão de eluição a 5 ml/min, coletando-se o eluente em frações de 1

ml.

(V.2.16) Purificação de Prdx6 (1-Cys de Ratus rattus).

Essa 1-Cys de rato foi clonada no vetor pETBlue-1 (Novagen) o que faz com que a

proteína expressa seja sem fusão com nenhuma cauda para purificação por afinidade. Por isso,

células origami (Novagen) foram crescidas em LB + ampicilina (150ug/ml) + canamicina

(15ug/ml) + tetraciclina (12.5ug/ml) até OD600nm 0.8, induzidas com 0.5mM de IPTG por 4

horas. As células foram centrifugadas e lavadas com água para posterior extração de proteínas

solúveis usando o reagente BugBuster Protein Extraction adicionado de 25U/ml de Benzonase

(Novagen). O lisado foi centrifugado 30 minutos, 16.000g e o sobrenadante foi diluído 10

vezes em Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM e glicerol 5% - pH 5.0. O extrato diluído foi aplicado

na coluna DEAE (Amersham Biosciences) e Prdx6 foi encontrada no volume não ligado na

coluna. O pH da amostra foi ajustado para 8.0 e aplicada agora em sefarose carboximetil (CM -

Amersham Biosciences). O volume não ligado foi novamente recolhido e concentrado em

Centricon (Millipore) YM-10. Após a concentração a amostra foi purificada na coluna de

109

afinidade GSTrap (Amersham Biosciences) para sua separação da proteína GST, pois ambas

co-purificam pelos métodos utilizados e descritos acima (Manevich et al., 2004).

(V.2.17) Purificação das 1-Cys de Drosophila melanogaster.(Dpx-2540 e Dpx-6005 em

vetor pPROEX) e AhpE 1-Cys de Mycobacterium tuberculosis.

Em todas essas construções, as proteínas estavam em fusão com cauda de Histidina o que

permite purificação por afinidade ao níquel descrita no item V.2.7.

(V.2.18) Purificação de AtPER1 1-Cys de Arabidopsis thaliana

Essa proteína é expressa pelo vetor PinPoint Xa3 (Promega) e purificada por coluna de

afinidade à estreptoavidina. Células JM109 (Promega) foram crescidas em LB + ampicilina

(150ug/ml) + 2uM de biotina até Od600nm 0.8 e induzidas com 0.1mM de IPTG por 4 horas. As

células foram centrifugadas e lavadas com água. O pellet foi resssuspenso em Tris-HCl 50mM

pH 8.0, NaCl 150mM e glicerol 5% e sonicado com potência 30%, por 8 vezes 40 segundos

intercalados com 40 segundos de descanso, em gelo. A amostra foi centrifugada 30 minutos,

16.000g, 40C. O sobrenadante foi misturado à resina Soft Link – Soft Release (Promega)

previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 150mM e glicerol 5% e

incubado a 40C, sob agitação leve, por 4 horas. A resina foi decantada e o sobrenadante foi

descartado. A resina foi lavada 2 vezes com o mesmo tampão, por 10 minutos sob agitação

leve à 40C. A resina foi novamente decantada e o sobrenadante foi descartado. A proteína

AtPER1 foi eluída com 6ml de Tris-HCl 50mM pH 8.0 e 5mM de biotina. A amostra foi

concentrada em Centricon YM-10 e passada na coluna PD-10 (Amersham Biosciences) para

retirar a biotina (instruções do fabricante).

(V.2.19) Ensaio NBD para dosar oxidação de cisteínas em mTPxI.

110

O composto chamado NBD (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) é capaz de se ligar

em grupos sulfidrilas (SH livre, cujo aduto tem absorção no espectro visível, com pico por volta

de A420nm) e também em ácido sulfênico (forma oxidada -SOH, cujo aduto tem absorção no

espectro ultravioleta, com pico por volta de A340nm), (Ellis e Poole, 1997). As proteínas foram

previamente tratadas com DTT (100mM) temperatura ambiente, 1 hora. O excesso de DTT foi

removido por gel-filtração (PD-10 - Amersham). Cada amostra foi oxidada com 5mM de H2O2

por 5 minutos, novamente o excesso de H2O2 foi removido com a PD-10 e depois tratada com

10mM de ascorbato por 1 hora; todas as reações à temperatura ambiente. Alíquotas foram

retiradas para reação com NBD (100uM, 30 minutos temperatura ambiente). O excesso de NBD

foi retirado por ultrafiltração no microcon YM-10. Todas as amostras possuem a mesma

concentração protéica.

111

(V.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.

Uma das formas de se compreender o papel biológico de proteínas é através de estudos

relacionando estrutura e função. Muitos mecanismos enzimáticos são esclarecidos pelas

estruturas de proteínas, além de possíveis interações com outras biomoléculas e/ou seus próprios

substratos. Esses estudos podem levar, em longo prazo, a aplicações práticas, através do desenho

racional de drogas para inibir o sítio ativo de enzimas muitas vezes essenciais em dados

organismos patogênicos.

Como descrito na introdução, mTPxI é uma enzima muito peculiar sob vários aspectos.

Ela apresenta características únicas dentre as Prxs desse organismo. Primeiro, ela é a única 1-Cys

Prx da levedura S. cerevisiae, o que implica um mecanismo de ação particular que envolve a

estabilização do ácido sulfênico (ver Esquema I). Segundo, ela é a única isoforma mitocondrial,

sendo outras 3 citossólicas e uma quinta nuclear (Park et al., 2000), sugerindo o papel dessa

enzima na proteção da mitocôndria. Terceiro, recebe elétrons do sistema tiorredoxina

mitocondrial, portanto, mTPxI é uma exceção entre as 1-Cys Prxs, que, de forma geral, não

interagem com tiorredoxinas. Quarto, mTPxI é reduzida por ascorbato (como será amplamente

discutido nesse capítulo). Todos esses fatores nos levaram a ter um grande interesse na resolução

da estrutura dessa enzima, na tentativa de podermos compreender melhor o porquê de tantas

particularidades.

Foi realizado um total de 1056 ensaios de cristalização, com modificações na proteína

(sem região N-terminal, com a cisteína 38 mutada para serina, com tratamento com o composto

NEM para alquilar as cisteínas) e diferentes estados de oxidação (tratamento com DTT, H2O2, t-

butil hidroperóxido). Infelizmente, nenhuma dessas tentativas resultou num cristal de mTPxI

capaz de difratar raios X e nos permitir o estudo de sua estrutura. Como perspectiva futura,

pretendo realizar outras mutações, na tentativa de obter o cristal (Mateja et al., 2002), ou ainda

112

tentar resolver a estrutura por NMR (ressonância magnética nuclear, em colaboração com o

grupo do Dr. Fabio C.R. Almeida e Ana Paula Valente da UFRJ, que já trabalham em

colaboração com nosso grupo).

Paralelamente, investimos esforços para compreender alguns mecanismos e propriedades

catalíticas de mTPxI. A atividade dependente de ascorbato foi descoberta, durante a realização

de um experimento controle da atividade de proteção à GS, onde se procura provar que a

proteína que estávamos estudando era realmente dependente de reagentes tiólicos, ou seja, que a

mesma trata-se de uma proteína “antioxidante específica para tióis”. No entanto, o que de início

nos pareceu um artefato, tornou-se uma linha de pesquisa bastante promissora, pois ascorbato

mostrou ser um novo substrato para, não somente mTPxI, mas também outras 1-Cys Prxs

provenientes de outros organismos, como será descrito a seguir.

A primeira sugestão de que essa proteção à GS dependente de ascorbato por mTPxI não

se tratava de um artefato, foi o fato desses resultados serem bastante reprodutíveis, em diversas

preparações da enzima e dose dependente (Figura 19A). Para corroborarmos a hipótese de que

mTPxI é realmente capaz de proteger biomoléculas contra danos causados pelo sistema Fe+3 / O2

/ DTT ou Ascorbato, fizemos o ensaio de proteção a outra biomolécula: DNA plasmidial (Figura

19B). Esse ensaio está baseado na medida da proporção de DNA super enrolado que não sofreu

quebra de fita induzida pelo sistema oxidante, devido à remoção das chamadas EROs pelas

enzimas antioxidantes.

113

0

20

40

60

80

100

120

0 0,2 0,4 0,6

Concentração de mTPxI completa

Porc

enta

gem

de

prot

eção

DTTASC

Figura 1: Ensaio de proteção à glutamina

sintetase. mTPxI em diferentes

concentrações (eixo X em ug/ul)

utilizando DTT ou ascorbato (20mM de

concentração final) como agente redutor.

1 2 3 4 5 6 7

pBR322 + mTPxI +mTPxI+DTPA

+DTT+Fe+3

+mTPxI+DTT+Fe+3

Ascorbate+ Fe+3

+mTPxI+Ascorbate+Fe+3

OC

SC

DB

(B) Ensaio de proteção à quebra do DNA.

Plasmídeo utilizado pBR322 (10ng), FeCl3

1.5uM, ascorbato/DTT 10mM, mTPxI 1uM.

Volume final da reação: 10ul.

A

B

(ug/ul)

Circular aberto

Super enrolado

Quebra dupla

Figura 19:

114

Analisando os dados, concluímos que mTPxI também foi capaz de proteger DNA na

presença de ascorbato. Interessantemente, a quebra de DNA pelo sistema dependente de ascorbato

parece ser mais drástica do que pelo sistema dependente de DTT (Figura 19B, canaletas 4 e 6).

Isso porque somente o sistema dependente de ascorbato gera quebras de fita dupla (quebra dupla).

Em ambos os casos, a adição de mTPxI resulta em banda referente a forma super enrolada mais

intensa, com conseqüente diminuição das bandas referentes às quebras de fita simples e dupla.

Devido a interferências do ascorbato nos controles de outros ensaios (ver discussão a

seguir), durante muito tempo, só conseguíamos analisar atividades dependentes desse redutor

pelo ensaio de proteção à GS. Dessa forma, decidimos comparar construções que expressam

formas diferentes de mTPxI (Esquema XI): a primeira denominada rmTPx, é a enzima

recombinante completa, expressa pelo vetor pET3a (que produz uma proteína em fusão com

cauda T7, o que permite a purificação por coluna de imuno-afinidade); a segunda denominada de

rmTPxsnt (ou seja, tiorredoxina peroxidase mitocondrial sem região N-terminal), é expressa pelo

vetor pET15b (que produz uma proteína em fusão com cauda de histidina e permite a purificação

por coluna de afinidade a metais - como níquel, cobalto). Essas duas construções nos permitiram

analisar alguns fatores importantes como, por exemplo, se a região N-terminal é importante para

a atividade da enzima. Além disso, rmTPxsnt possui somente a cisteína do sítio ativo, localizada

na posição 91 da proteína completa, o que nos permitiu analisar a influência das outras cisteínas

nessa atividade (Esquema XI).

115

rmTPx

cauda T7 1 6 38 91 261

mTPx

rmTPxsnt

cauda His 48 91 261

mTPx

Ser38-m-Prx1

cauda His 20 C38S 91 261

mTPx

m-Prx1 cauda His 20 38 91 261

mTPx Esquema XI: Construções de mTPxI usadas nessa tese. A primeira (rmTPx) é a ORF (“open

reading frame”) completa expressa pelo vetor pET3a em fusão com cauda T7 para purificação. A segunda (rmTPxsnt) não possui os 48 primeiros aminoácidos sendo a mais solúvel de todas as proteínas recombinantes; é expressa pelo vetor pET15b em fusão com cauda de histidina (His). A terceira (Ser38-m-Prx – cedida por Giannis Spyrou) não possui os primeiros 20 aminoácidos, tem a cisteína da posição 38 mutada para serina, é expressa pelo vetor pET15b em fusão com cauda de histidina. A quarta é mTPx sem os primeiros 20 aminoácidos, tem cauda de histidina e é expressa pelo vetor pET15b.

SH SH SH

SH

SHOH

SHSH

116

Na figura 20 podemos observar dois fatos importantes:

• A cauda T7 adicionada durante a expressão de mTPxI em células que contém o

vetor de super expressão pET3a, não é essencial à atividade protetora à GS

dependente de ascorbato, já que rmTPxsnt (e mPrx com a mesma eficiência de

rmTPx – dado não mostrado) têm cauda de histidina e também foram capazes de

proteger GS na presença desse redutor, o que diminui uma possibilidade de artefato.

• A região N-terminal e as cisteínas presentes nela (posições +6 e +38) não foram

essenciais para a atividade antioxidante, mas pareceram ser importantes para a

eficiência de rmTPx na sua atividade dependente de ascorbato, mas não na

dependente de tiól.

Com esses dados, passamos então a analisar a possível importância das cisteínas de mTPxI

para essa atividade dependente de ascorbato. Para isso, utilizamos o composto alquilante de

grupos sulfidrilas N-etilmaleimida (NEM).

Figura 20: Atividade de rmTPx e rmTPxsnt. O controle (+) representa a atividade de GS sem a exposição ao sistema oxidante; o controle (-) representa a inativação de GS pelo sistema oxidante, sem adição de nenhuma TPx. rmTPx = proteína recombinante completa; rmTPxsnt = proteína recmbinante sem a região N-terminal. Fe+3 3uM, DTT ou Ascorbato 10mM, GS 0.1ug/ug. Reações de inativação foram incubadas a 370C por 15 minutos.

020406080

100120

contr

ole +

contr

ole -

r mTP

x 3uM

r mTP

xsnt 3

uM

r mTP

xsnt 1

0uM

r mTP

xsnt 7

0uM

% d

e pr

oteç

ão à

GS

DTTAscorbato

117

Figura 21: Dependência das cisteínas de rmTPx para a atividade dependente de ascorbato. As enzimas (concentração final de 200uM) foram previamente reduzidas com 10mM de DTT, por 1 hora a 250C; dialisadas e tratadas com 5mM de NEM por 30 minutos a 250C. Após purificação por coluna de gel filtração (PD-10 desalting - Amersham Pharmacia), foram realizados os ensaios de proteção à GS (condições iguais às descritas para Figura 20).

A alquilação prévia das cisteínas de mTPxI pelo composto NEM inibe completamente a

proteção à GS (Figura 21), indicando que esses aminoácidos são importantes não só para a

atividade dependente de tiól, como também para a dependente de ascorbato. Portanto, a

atividade dependente de ascorbato, assim como a dependente de tiól, utiliza-se dos grupos

sulfidrilas de mTPxI.

Ainda para mostrar que essa atividade dependente de ascorbato não tratava-se de um

artefato, comparamos a proteção de GS por mTPxI e por outras Prxs. Para isso, testamos as 4

Prxs recombinantes disponíveis em nosso laboratório: cTPxI, cTPxII e cTPxIII (todas 2-Cys

citossólicas) e mTPxI.

020406080

100120

contr

ole +

contr

ole -

r mTP

x 3uM

r mTP

x-NEM 3u

M

r mTP

x-NEM 70

uM

% d

e pr

oteç

ão à

GS

DTTAscorbato

118

Somente mTPxI (construção rmTPx) dentre as Prxs foi capaz de proteger GS utilizando

ascorbato como doador de elétrons. Mesmo utilizando altas concentrações (60uM), as enzimas

com 2 cisteínas conservadas só conseguiram proteger GS na presença de redutores tiólicos.

O ensaio de proteção à GS é um ensaio indireto que, entre outros reagentes, contém ferro

capaz de catalisar várias reações de óxido-redução, o que dificulta a análise do mecanismo de

ação de mTPxI. Dessa forma, passamos a utilizar um ensaio "mais limpo", onde pudemos

examinar com mais clareza, se o fato de mTPxI proteger biomoléculas na presença de ascorbato

era realmente devido a uma atividade peroxidásica dependente de ascorbato. Como descrito

anteriormente, os resultados apresentados na figura 21 sugeriram que as cisteínas de mTPxI,

provavelmente a Cys 91 seria a responsável por essa atividade. Por isso, começamos por

examinar se o ascorbato seria capaz de regenerar as cisteínas oxidadas de mTPxI através de um

020406080

100120

contro

le +

contro

le - mTPx

cTPxI

cTPxI 6

0uMcT

PxII

cTPxIII

% d

e pr

oteç

ão à

GS

DTTAscorbato

Figura 22: Comparação da

atividade dependente de

ascorbato entre as

peroxirredoxinas. Exceto

quando indicado, a

concentração de enzima

utilizada foi de 5uM.

Concentração de reagentes: Fe+3

3uM, DTT ou Ascorbato

10mM, GS 0.1ug/ug. Reações

de inativação forma incubadas a

370C por 15 minutos. (rmTPxI).

119

composto chamado NBD (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) (Ellis e Poole, 1997). Esse

composto é capaz de se ligar em grupos sulfidrilas (SH livre, absorvendo no espectro visível, por

volta de A420nm) e também em ácido sulfênico (forma oxidada -SOH, absorvendo no espectro

ultravioleta, por volta de A340nm).

Figura 23: Redução de ácido sulfênico de mTPxI por ascorbato. rmTPxI (1.3mg/ml) em hepes 10mM pH 8.0, foi incubada por 5 minutos com 5mM H2O2, 370C. Após lavagem, para remoção do excesso de peróxidos, uma alíquota foi retirada e reagida com NBD (100uM) e o restante da proteína foi incubada por 1 hora com 10mM de ascorbato, temperatura ambiente. O excesso de ascorbato também foi retirado para incubação com NBD. O excesso de reagentes foi removido por gel filtração (PD-10) ou por lavagens em microcon YM-10 (Millipore). O quadrado refere-se a proteína tratada com H2O2 e o círculo à proteína tratada com H2O2 + seguido de tratamento com ascorbato.

Os nossos resultados indicaram que mTPxI formou ácido sulfênico (RSOH) na cisteína

de seu sítio ativo após tratamento com peróxido (Figura 23, --) e que essa forma de cisteína

oxidada pôde ser reduzida por ascorbato (Figura 23, --).

300 350 400 450 500 550 600

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30 S(O)-NBD S - NBD

wavelenght (nm)

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

mTPxI –H2O2

mTPxI - DTT

λ

Abs

orbâ

ncia

R-S

(O)-

NB

D (A

.U.)

Absorbância R

-S -NB

D (A

.U.)

mTPxI -Ascorbato

300 350 400 450 500 550 600

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30 S(O)-NBD S - NBD

wavelenght (nm)

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

mTPxI –H2O2

mTPxI - DTT

λ

Abs

orbâ

ncia

R-S

(O)-

NB

D (A

.U.)

Absorbância R

-S -NB

D (A

.U.)

mTPxI -Ascorbato

120

Iniciamos então a análise da estequiometria da reação dependente de ascorbato catalisada

por mTPxI na tentativa de melhor compreender o mecanismo dessa atividade dependente de

ascorbato. Utilizamos para isso, o ensaio FOX2 (que determina a concentração de peróxidos no

meio de reação, consequentemente seu consumo por mTPxI) e estudos do consumo de ascorbato

e formação de dehidroascorbato por análise em coluna C-18 no CLAE com os detectores de UV

(ascorbato) e fluorescência (dehidroascorbato), como descrito em Procedimentos experimentais.

A figura 24 mostra os cromatogramas referentes aos padrões (10uL de uma solução 1mM de

ascorbato no cromatograma superior e 10ul de uma solução 100uM de DHA no cromatograma

inferior); às reações controles (todos os reagentes exceto mTPxI) e à mistura de reação completa

contendo mTPxI, peróxido e ascorbato. Para o cálculo de ascorbato consumido e DHA gerado na

reação enzimática, foram descontadas as áreas dos picos referentes às misturas de reação

controle das misturas de reação completas, que continham mTPxI. O gráfico superior mostra o

consumo de ascorbato e o gráfico inferior a produção de dehidroascorbato. A curva de calibração

representada (Figura 25) foi construída utilizando soluções de ascorbato com concentrações

conhecidas.

121

Figura 24: Cromatogramas das amostras aplicadas e analisadas por CLAE (coluna C-18, Luna). Representação gráfica de 3 cromatogramas independentes que foram deslocados para melhor visualização, porém todos têm o mesmo tempo de retenção, já que tratam do mesmo composto detectado. Primeiros picos de ambos os gráficos: soluções padrão com concentrações conhecidas de ascorbato e dehidroascorbato. Segundos picos: consumo de ascorbato e produção de dehidroascorbato na reação espontânea entre H2O2 e ascorbato (controle = reação sem adição de mTPxI). Terceiros picos: consumo de ascorbato e produção de dehidroascorbato na presença da reação completa: 50uM rmTPxI, 1mM H2O2, 1mM ascorbato, 0.5mM DTPA, 50mM Tris-HCl pH 7.4, azida 1mM. Amostras diluídas na fase móvel antes da aplicação (como descrito em Procedimentos experimentais III.2.11).

Controle mTPxIDHA100uM

Ascorbato1mM

Controle mTPxI

122

Figura 25: Curva padrão obtida pela análise das áreas dos picos resultantes dos cromatogramas do CLAE (exemplificado na figura 24), para calibração das concentrações de ascorbato. Representativo de três experimentos independentes. O mesmo foi feito para obter as concentrações de dehidroascorbato (gráfico não apresentado).

A tabela IV é o resultado final dessa análise mostrando que a estequiometria de reação é: 1

mol de peróxido (H2O2 ou t-BOOH) consumido : 1 mol de Ascorbato consumido : 1 mol de

dehidroascorbato gerado. Podemos notar ainda que a reação foi mais eficiente com H2O2 do que

com t-BOOH, o que está de acordo com outros trabalhos que estudaram a atividade de mTPxI

com redutores tiólicos (Pedrajas et al., 2000). Uma ressalva importante nesse ponto é o fato de

que o ensaio Xylenol Orange só pôde ser feito devido à utilização da enzima ascorbato oxidase

que consumiu o excesso de ascorbato que não foi utilizado na reação catalisada por mTPxI e que

interferia muito na detecção do peróxido restante na reação.

y = 7127,1x - 98658R2 = 0,9965

0

2000000

4000000

6000000

8000000

0 200 400 600 800 1000 1200

[Ascorbate uM]

Pea

k ar

ea

[Ascorbato uM]

Áre

a d

o P

ico

(A

.U.)

123

Tabela IV: Estequiometria de reação entre mTPxI / peróxido / Ascorbato.

Tempo de

reação

[peróxido

inicial]

peróxido

consumido

Ascorbato

consumido

DHA

Produzido

Peróxido /

ascorbato

Ascorbato/

DHA

15 min 1mM H2O2 156 uM ± 10 150uM ± 20 150uM ± 20 1,04 ± 0,14 1 ± 0,1

45 min 1mM

t-BOOH

90 uM ± 15 98 uM ± 10 85 ± 25 0,92 ± 0,2 1,2 ± 0,26

Médias e desvios calculados a partir de 3 experimentos independentes, usando análise em CLAE (para determinar ascorbato e dehidroascorbato) e o ensaio FOX2 para determinar H2O2. A quantidade de ascorbato consumido foi confirmada através de 2 ensaios independentes do consumo de oxigênio pela ascorbato oxidase. As reações foram compostas de: Hepes 50mM pH.7.0, Azida 1mM, DTPA 0.5mM, rmTPxI (50uM), peróxidos (H2O2 ou t-BOOH) 1mM e ascorbato 1mM. Cada mistura de reação foi incubada no tempo indicado na legenda a 370C, ultrafiltrada em microcon YM-10 (Millipore) e analisada. Os valores mostrados correspondem aos valores obtidos da subtração da reação espontânea (entre peróxido e ascorbato) da enzimática.

Utilizamos ascorbato oxidase para corroborarmos nossa hipótese de que mTPxI consome

ascorbato durante sua reação peroxidásica, já que essa enzima catalisa a seguinte reação:

2L-Ascorbato + O2 → 2L-dehidroascorbato + 2H2O

Portanto, quanto menor o consumo de O2, menor a quantidade de ascorbato não

consumida após a reação de mTPxI/ascorbato/peróxido. Na figura 26 observamos uma clara

diferença de consumo de O2 entre a reação controle (sem mTPxI/PrxI) e a reação em que mTPxI

está presente. Após a reação entre mTPxI / peróxido / ascorbato, a ascorbato oxidase (AO)

consome muito menos oxigênio do que na reação controle (peróxido / ascorbato), o que mostra

uma menor concentração de ascorbato disponível para AO após a reação de mTPxI. Essa é outra

evidência, através de um ensaio diferente, de que o ascorbato é consumido durante a reação de

redução do peróxido por mTPxI.

124

Figura 26: Ensaio de consumo de oxigênio pela ascorbato oxidase (AO – de Cucurbita sp. - Sigma) após as reações entre peróxido / ascorbato (control) e rmTPxI / peróxido / ascorbato. As amostras foram previamente ultrafiltradas em microcon para retirada de mTPxI do meio de reação. O filtrado foi analisado no oxígrafo na presença de 1U/ml de ascorbato oxidase em tampão: 91mM fosfato de potássio, 0.5mM EDTA, 4mM fosfato de sódio e 0.005% de BSA – pH 5.6, como recomendado pelo fabricante.

Para esclarecermos melhor o mecanismo enzimático de mTPxI utilizando ascorbato,

realizamos alguns estudos de EPR (ressonância paramagnética eletrônica), a fim de detectarmos

se o radical ascorbil é um intermediário da reação. A figura 27 mostra os resultados ao longo de

10 minutos de análise de EPR. O controle, realizado na presença de DTPA, produz baixo sinal

característico do radical ascorbil, no entanto, na presença de mTPxI (mTPxI + DTPA) há maior

produção do radical ascorbil que vai decaindo ao longo do tempo. Isso mostra a clara

0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

10

Oxy

gen

rele

ase

(A.U

.)

T im e (m in)

control mTPxIPrx1

Oxyg

en u

ptak

e

mTPxI

Con

sum

ode

O2

(A.U

.)

Tempo (min)0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

10

Oxy

gen

rele

ase

(A.U

.)

T im e (m in)

control mTPxIPrx1

Oxyg

en u

ptak

e

mTPxI

0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

10

Oxy

gen

rele

ase

(A.U

.)

T im e (m in)

control mTPxIPrx1

Oxyg

en u

ptak

e

mTPxI

Con

sum

ode

O2

(A.U

.)

Tempo (min)

125

dependência de mTPxI para uma maior produção do radical, outro indício que corrobora o uso

de ascorbato por mTPxI.

Figura 27: Estudo por EPR da formação de radical ascorbil. Controle + DTPA = H2O2 (1mM) + ascorbato (1mM) + DTPA (500 uM); mTPxI + DTPA = Controle + DTPA + rmTPxI (50uM). Ambos os espectros foram obtidos imediatamente após adição de todos os reagentes e sintonia da mistura. Tempol 36uM foi usado como padrão para quantificação dos radicais.

No entanto, ao quantificarmos a produção de radical livre utilizando a área do radical

Tempol como referência, observamos que ascorbil foi gerado na ordem de nM. Dessa forma, a

formação de radical ascorbil representou cerca de 0,1% de DHA formado e 0,1% de ascorbato

consumido (tabela IV), indicando que a geração desse radical livre deve ser um processo

secundário. Assim, parece que a transferência de elétrons do ascorbato para mTPxI se dá através

de dois elétrons. Porém a reatividade do ascorbato e suas formas oxidadas não é simples; há

reações de dismutação do radical ascorbil, reações de desproporcionamento entre

mTPxI+ DTPA controle + DTPA

126

dehidroascorbato e ascorbato e reações entre ascorbato e peróxido (não enzimáticas) entre outras

(revisado por Bors e Buettner, 1997). Para corroborar que a redução de mTPxI pelo ascorbato se

dá por dois elétrons realizamos estudos na tentativa de detectar o radical tiila na proteína, o que

nos sugeriria uma redução monoeletrônica. Porém, utilizando condições onde este radical é

detectado em albumina (Bonini et al., 2004), nenhum radical tiila pôde ser observado em nosso

estudo de EPR. Estudos de radical tiila em proteínas são de difícil interpretação, pois

normalmente não é fácil a detecção dos mesmos. Contudo, a análise de nossos dados em

conjunto (a estequiometria de reação, a baixa concentração observada de radical ascorbil e a

ausência de detecção do radical tiila) nos levam a propor que a transferência de elétrons do

ascorbato para mTPxI oxidada é via dois elétrons.

Através de nossos resultados obtidos até agora, propomos como hipótese de trabalho que

mTPxI catalisa a seguinte reação:

1 Ascorbato + 1 H2O2 → 1 Dehidroascorbato + 1 H2O, o que estaria de acordo com os dados

da tabela IV. A reação se daria pela transferência de dois elétrons e a formação do radical

ascorbil poderia ser explicada como uma reação secundária, talvez o desproporcionamento entre

DHA e ascorbato que gera radical ascorbil (Bielski, 1982; Bors e Buettner, 1997).

Outra abordagem realizada foi o estudo dessa possível atividade peroxidásica dependente de

ascorbato em proteínas 1-Cys presente em outros organismos. Diversos pesquisadores de várias

partes do mundo gentilmente nos cederam vetores de expressão (III.II.2) com os quais

conseguimos realizar nossos estudos com 1-Cys Prxs de Mycobaterium tuberculosis,

Plasmodium falciparum, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, Ratus rattus. A tabela

V mostra que, surpreendentemente, o uso de ascorbato como redutor não é uma particularidade

127

de mTPxI de S. cerevisiae, mas uma propriedade das 1-Cys Prxs amplamente conservada

evolutivamente nos mais diversos grupos taxonômicos.

Tabela V: A atividade peroxidásica dependente de ascorbato é uma propriedade conservada dentro da classe das 1-Cys peroxirredoxinas.

Proteína 1 – Cys Prx Espécie Atividade com DTT (uM H2O2/ 15 min)

Atividade com ascorbato (uM H2O2/ 15 min)

MTPxI S. cerevisiae 280 150

AhpE M. tuberculosis 292 393

rPf1-Cys-Prx P. falciparum 330 322

AtPER1 A. thaliana 360 392

Dpx-2540 D. melanogaster 237 296

Dpx –6000 D. melanogaster 333 297

Prdx6 R. rattus 300 370

O ensaio FOX2 foi realizado com as seguintes condições: hepes 50mM pH.7.5, azida 1mM, DTPA 0.5mM, H2O2 0.5mM, ascorbato ou DTT 0.5mM e 50uM de 1-Cys Prx dos diferentes organismos. Incubação por 15 minutos a 370C.

Sabemos que em S. cerevisiae há pouco ascorbato (acredita-se que a principal molécula de

baixo peso molecular na defesa antioxidante dessa levedura seja a glutationa, presente em

concentrações na ordem de mM), mas há eritroascorbato, que possui propriedades muito

semelhantes ao ácido ascórbico (Spickett et al., 2000). Contudo, em mamíferos e plantas é bem

conhecido que o ascorbato tem função antioxidante primordial nesses organismos.

Para testar se a atividade peroxidásica dependente de ascorbato poderia ser secundária em

relação à dependente de tiól, resolvemos comparar as eficiências catalíticas de mTPxI e Prdx6 de

rato no uso dos redutores tiólicos (DTT) e não tiólicos (ascorbato). A figura 28 mostra o

128

resultado da análise do consumo de H2O2 por mTPxI e Prdx6 usando ascorbato ou DTT como

agente redutor.

Figura 28: Eficiências catalíticas de rmTPxI e Prdx6 de rato, usando DTT ou ascorbato como agente redutor. Ensaio FOX2 usando AO nas amostras com ascorbato. Foram variadas as concentrações das enzimas e analisou-se o consumo de peróxido em vários tempos. Gráfico representativo de três experimentos independentes. H2O2 concentração final de 500uM e ascorbato / DTT 500uM para Prdx6; H2O2 800uM e ascorbato 1mM para mTPxI

mTPxI - DTT

0225450675900

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

H2O

2 [u

M]

10uM

20uM

30uM

50uM

100uM

mTPxI - Ascorbato

0225450675900

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

H2O

2 [u

M]

10uM

20uM

30uM

50uM

100uM

0

20

40

60

10 35 60 85 110

mTPxI [uM]

H2O

2 con

sum

ido

(uM

/min

)

DTT

Ascorbato

Prdx6 - DTT

0

200

400

600

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

H2O

2 [u

M]

20uM

30uM

40uM

Prdx6 - Ascorbato

0

200

400

600

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

H2O

2[uM

] 20uM

30uM

40uM

0

20

40

60

80

10 20 30 40

Prdx6 [uM]

H2O

2 co

nsum

ido

(uM

/min

)

DTT

AscorbateAscorbato

129

Os nossos resultados indicaram que as atividades dependentes de DTT e ascorbato estão

na mesma escala de grandeza. No caso de mTPxI, a reação dependente de DTT é de 1.3-1.9

vezes mais eficiente do que a reação dependente de ascorbato. Já Prdx6 não apresenta diferença

significativa quanto ao uso dos dois redutores. Portanto, em ambos organismos as diferenças

entre os dois processos são pequenas o que sugere que ascorbato pode ser biologicamente

importante como redutor das 1-Cys Prxs.

Outra observação interessante é a baixa eficiência catalítica de mTPxI comparada com

Prdx6. Essa diferença pode ter relação com o fato de mTPxI utilizar um sistema enzimático para

a regeneração de sua forma reduzida (o sistema Trx3/Trr2/NADPH), o que não deve acontecer

com outras 1-Cys. No caso de Prdx6 não houve diferença entre os redutores, o que nos leva a

especular que o ascorbato (presente em mamíferos em altas concentrações) poderia ser o

substrato fisiológico, o que explicaria a maior eficiência catalítica. Talvez, 1-Cys teriam sido

selecionadas a utilizar ascorbato como redutor na ausência de um sistema enzimático específico.

Muito pouco se sabe sobre mecanismos catalíticos e principalmente redutores biológicos

das 1-Cys Prxs. Nós testamos ainda a capacidade de mTPxI usar outros redutores não tiólicos

(trolox – análogo da vitamina E e urato) e tiólicos (glutationa e β-mercaptoetanol) como

doadores de elétrons durante sua atividade peroxidásica. Nenhum dos redutores citados possui

eficiência comparável ao DTT ou ao ascorbato.

Dessa forma, as 1-Cys não são capazes de utilizar qualquer agente redutor, mas possuem

especificidade para alguns tióis e ascorbato. O fato da cisteína peroxidásica das 1-Cys estar mais

protegida tem sido relacionado com a estabilização do ácido sulfênico. Nesse ponto, é importante

ressaltar que pouco se sabe sobre a reatividade de ascorbato com ácidos sulfênicos e dissulfetos.

Fizemos uma busca em vários livros de referência, na tentativa de obter constantes de reação

130

envolvendo esses reagentes, mas não encontramos nenhum valor. De qualquer forma, temos

evidências de que ascorbato reduz dissulfetos muito lentamente em termos cinéticos, apesar de

seu alto potencial termodinâmico como redutor. Sabemos através de estudos de SDS-PAGE que

ascorbato não reduz, à velocidades apreciáveis, as pontes dissulfeto que mantêm cTPxI como

dímero e que a redução de DTNB (um dissulfeto de baixo peso molecular) pelo mesmo é muito

lenta. Nossa hipótese é que a reação de ascorbato com ácidos sulfênicos seja mais rápida. De

fato, resultados de nosso grupo mostraram que ascorbato é capaz de reduzir acido sulfênico de

proteassoma e, como mostrado nessa tese, de mTPxI (Figura 23).

O mutante C170S de cTPxI que teve a cisteína de resolução substituída por uma serina

tem um ácido sulfênico estável durante seu ciclo catalítico (Chae et al., 1993). Analisamos,

então, a possibilidade da isoforma C170S de cTPxI proteger GS contra a inativação induzida

por ascorbato/Fe+3/O2. C170S não protegeu GS de inativação, indicando que o fato de 1-Cys

Prx aceitar ascorbato como redutor não se deve somente ao fato dessas enzimas terem ácido

sulfênico estabilizado.

Essa característica das 1-Cys Prxs poderia ser também explicada por alguma

característica estrutural do sítio ativo dessas enzimas. Usando como exemplo, a estrutura de

hORF6 (uma 1-Cys Prx humana, cuja estrutura foi descrita por Choi et al., 1998), vemos que o

sítio catalítico é bem fechado, principalmente no dímero, forma biologicamente mais provável.

Outra evidência que mostra que o sítio ativo das 1-Cys é mais carregado positivamente do que

o das 2-Cys é a presença de um resíduo de histidina conservada somente em 1-Cys Prx,

localizado próximo à cisteína peroxidásica dessa classe. Com todos esses fatores e os dados

apresentados acima, podemos especular que a atividade das 1-Cys Prxs com ascorbato se deve

a três principais fatores: (I) à manutenção do ácido sulfênico estável como forma oxidada da

cisteína peroxidásica nas 1-Cys Prxs (II) à proteção do sítio ativo (II que auxilia I) que permite

131

somente a entrada de moléculas pequenas e (III) aminoácidos com cargas positivas circundando

o sítio ativo, já que ascorbato em pH fisiolófico é um ânion. Esses fatores estão de acordo com

o fato da maior parte das 1-Cys Prxs não interagir com tiorredoxina e de seus substratos

fisiológicos serem desconhecidos, pois até o presente momento ninguém testou a possibilidade

desses substratos não serem reagentes tiólicos.

Nosso trabalho mostra uma quebra de paradigma: as enzimas peroxidases tiól

específicas podem usar ascorbato como agente redutor, uma propriedade específica das 1-Cys

Prxs e amplamente conservada na história evolutiva dessa classe, desde que observamos essa

atividade em bactérias, mamíferos e plantas. Como perspectiva dessa linha de pesquisa,

estamos realizando experimentos de espectrometria de massa no sentido de mostrar

inequivocamente que ascorbato é capaz de reduzir o ácido sulfênico formado na cisteína

peroxidásica de mTPxI.

132

(VI) DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES.

A utilização do oxigênio pelos organismos durante a respiração resultou em melhor

aproveitamento da energia obtida através da oxidação da glicose. Porém, esse processo implicou

em um gasto energético adicional relativo à proteção contra intermediários reativos desse

metabolismo. Em alguns casos, organismos são capazes de utilizarem compostos secundários da

fermentação para se adaptar e competir melhor no meio onde vivem. Por exemplo, leveduras

fermentam a glicose liberando etanol no meio, inibindo o crescimento dos competidores naturais

que são menos resistentes do que elas ao álcool. Ainda nesse contexto, podemos citar os

anaeróbios facultativos, que possuem vantagem adaptativa em ambientes sem oxigênio,

ocupando um nicho ecológico menos competitivo (Pfeiffer et al., 2001).

Aqueles que conseguiram desenvolver eficientes respostas antioxidantes, foram capazes

de ocupar mais ambientes, desenvolver a multicelularidade, crescer em tamanho e complexidade,

manter a temperatura de seus corpos independente da do meio externo (num dado ramo

evolutivo), dentre outros vários aspectos que só foram possíveis devido à respiração, pois

dependem de muita energia metabólica (Pfeiffer et al., 2001).

Nesse contexto, quanto mais complexo o organismo, mais complexas são suas defesas

contra estresses. Tomemos como exemplo a resposta transcricional ao estresse oxidativo de E.

coli e Salmonella typhimurium. A resposta ao estresse oxidativo dessas bactérias é simples e

rápida: os fatores de transcrição são oxidados pelo excesso de EROs, mudam sua afinidade pelos

promotores dos operons alvos e ativam a transcrição dos genes necessários a sua defesa.

Dando um exemplo mais específico, podemos citar o fator OxyR, um dos ativadores

transcricionais de resposta ao estresse oxidativo mais bem estudado em procariotos. Os níveis da

proteína OxyR não são drasticamente alterados durante a resposta ao estresse oxidativo. Esse

133

fator já está presente em níveis basais na célula podendo sofrer modificação em seu estado

redox. OxyR possui dois resíduos de cisteína que são especificamente oxidadas para a forma

dissulfeto (Cys199-Cys208) pelo excesso de EROs. Somente a forma oxidada é capaz de se ligar

a promotores de genes alvos (como catalases e peroxirredoxinas) e ativar a resposta antioxidante

da bactéria (Bunn e Poyton, 1996; Carmel-Harel e Storz, 2000). Dessa forma, o sinal para a

ativação de OxyR age diretamente no fator de transcrição, portanto, uma única proteína sente o

estresse oxidativo e ativa a resposta transcricional.

Já os eucariotos possuem uma resposta muito mais complexa, compreendendo diversos

receptores, transdutores de sinal (Ex.: quinases, fosfatases, proteínas G), reguladores

transcricionais. Além disso, a regulação pode envolver alterações na localização em

compartimentos celulares e na modulação da compactação da cromatina, dentre outros

processos. Assim como OxyR em bactérias, a maior parte dos fatores de transcrição em

eucariotos, não possuem grandes mudanças quanto a sua síntese. Porém, a ativação se dá de

forma bem mais complexa e acaba por regular principalmente a acumulação desses ativadores no

núcleo. Um exemplo que iremos discutir são os fatores Msn2/4p.

Msn2/4p são reguladores gerais de resposta a estresse incluindo escassez de nutrientes,

calor, danos oxidativos, choque osmótico, dentre outros. Há muitos fatores relacionados com sua

regulação, como ilustrado no esquema IX. Contudo, todas convergem à fosforilação ou

defosforilação de Msn2/4p permitindo ou não sua acumulação no núcleo. Se essa regulação não

é eficiente, as células sofrem problemas de crescimento, acumulação excessiva de reservas e são

resistentes a diversos tipos de estresse. Isso implica num gasto desnecessário de energia,

diminuindo o potencial competitivo das leveduras, pois as mesmas crescem mais lentamente

devido ao alto gasto transcricional acarretado pela ativação indevida de Msn2/4p, caso de

mutantes para PKA (Smith et al., 1998).

134

Com esses exemplos e outros descritos na introdução notamos que leveduras possuem

intrincadas vias de resposta celular ao estresse oxidativo, como pode ser observado pela alta

redundância nas enzimas antioxidantes. Isso parece contraditório na perspectiva da seleção

natural, pois células devem gastar muita energia com a conservação de genes e produção das

respectivas proteínas com funções parecidas ou idênticas. Em S. cerevisiae, há 2 catalases (uma

citossólica e outra peroxissomal), 2 superóxido dismutases (uma citossólica e outra

mitocondrial), 3 glutationa peroxidases, 1 citocromo c peroxidase, 5 peroxirredoxinas (2

citossólicas, 1 provavelmente citossólica (Ahp1), 1 mitocondrial e 1 nuclear) dentre outras

enzimas, todas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo. Essa redundância, principalmente

das peroxidases, chamou nossa atenção e de diversos outros grupos que estudam resposta

antioxidante.

Contudo, cada vez mais estudos mostram que cada enzima tem uma função específica

dentro da célula. Com a compartimentalização celular e com eficiências enzimáticas diferentes a

diferentes substratos, a regulação transcricional tomou papel fundamental na resposta específica

dependente de diversos fatores ambientais em conjunto.

Como discutido no capítulo I, mTPxI pode ser usada como um claro exemplo disso.

Somente nossos estudos já envolveram pelo menos 8 diferentes fatores transcricionais e

sinalizadores responsáveis pela regulação da expressão de uma única enzima antioxidante (I-

heme, II-Hap1p, III-yAP1p, IV-Skn7p, V-cAMP, VI-Tor1p, VII-Ras2p, VIII-Msn2/4p). Essa

análise transcricional nos ajuda a compreender a possível função biológica de mTPxI, em

diferentes situações fisiológicas e em diferentes tipos de estresse.

O fato de mTPxI estar sujeita a múltiplas vias de regulação e por ser uma enzima

mitocondrial, uma das principais fontes endógenas das chamadas EROs, indica um papel central

dessa Prx no sistema de defesas antioxidantes de leveduras (Pedrajas et al., 2000; Gasch et al.,

135

2000). Dessa forma, o metabolismo energético está intimamente ligado à necessidade de maior

ou menor concentração de mTPxI. Em fontes fermentáveis de carbono (como a glicose), a

levedura produz menos mitocôndrias e essas têm cristas pouco desenvolvidas, sendo grande

parte do ATP obtido através da fermentação. Na ausência de glicose, a levedura é obrigada a usar

açúcares não fermentáveis, o que desencadeia a transição diauxica, culminando num aumento de

mitocôndrias respirando ativamente. Nessas condições, a presença de uma enzima como a

mTPxI, que pode prevenir localmente um aumento das chamadas EROs, deve ser muito

importante para homeostase redox.

Além disso, sabemos que o DNA mitocondrial se encontra “nu” (sem a proteção das

histonas) e não está protegido por nenhum envoltório (como o nuclear) o que nos leva a crer que

está mais sujeito às lesões oxidativas. Recentemente, doenças degenerativas do sistema nervoso

e dos músculos, além de infertilidade masculina têm sido relacionadas a mutações nesse DNA

(revisão –Wei e Lee, 2002). mTPxI pode fazer parte, junto com a citocromo c peroxidase, a

superóxido dismutase mitocondrial e a glutationa, de um grande arsenal antioxidante da

mitocôndria que ajuda a prevenir danos irreversíveis nesse DNA, cujo reparo de lesões é muito

restrito.

A importância de mTPxI na manutenção da integridade mitocondrial é corroborada pelos

nossos estudos da permeabilização da membrana interna da mitocôndria, um fenômeno

semelhante a MPT de mamíferos que tem sido associado com morte celular por necrose ou

apoptose. Esse fenômeno é regido pelo estado redox de grupos sulfidrilas presentes em proteínas

da membrana interna mitocondrial, que ao serem oxidadas formam agregados protéicos e abrem

o poro de transição mitocondrial, desencadeando o processo (revisão em Kowaltowski et al.,

2000). Nosso trabalho mostrou que, principalmente em levedura, a manutenção da homeostase

redox de grupos sulfidrilas mitocondriais pelas enzimas antioxidantes, ressaltando o importante

136

papel de mTPxI nesse contexto, é um evento necessário à prevenção contra permeabilização da

membrana interna da mitocôndria (Capítulo II; anexo III; Jung et al., 1997; Kowaltowski et al.,

2000).

Nesse trabalho podemos destacar ainda o fato da ausência de mTPxI causar danos

oxidativos aos tióis mitocondriais (tióis totais e razão GSH / GSSG) e provocar respostas

compensatórias como o aumento na síntese de GSH1, a enzima que catalisa a etapa que

determina a velocidade da síntese de glutationa. Diversos estudos têm sugerido que a

manutenção da quantidade de glutationa reduzida mitocondrial é primordial para as células. Em

condições normais, as concentrações de GSH no citossol e na mitocôndria são as mesmas; no

entanto, sob estresse oxidativo, os níveis mitocondriais de GSH são preservados, enquanto os

níveis citossólicos caem (Griffith e Meister, 1985; Hall, 1999; O’Donovan e Fernandes, 2000).

Esses dados sugerem que os níveis de GSH devem ser essenciais para a função mitocondrial e

sua conservação é fortemente controlada pela célula, sendo mTPxI uma enzima com importante

participação nessa função celular.

A permeabilização da membrana interna da mitocôndria é um fenômeno dependente de

cálcio. Diversos trabalhos têm demonstrado que o aumento da exposição celular ao cálcio

provoca estresse oxidativo. Em 2004, Viladevall et al. estudaram o efeito da resposta mediada

por cálcio ao estresse alcalino. Esse grupo mostrou que a alcalinização do meio provoca a

entrada na célula de cálcio do meio externo, levando a um aumento de respostas ao cálcio. Esse

trabalho observou a indução de mTPxI durante esse estresse, o que está de acordo com nossos

resultados quanto à proteção exercida por essa enzima no fenômeno da permeabilização interna

da mitocôndria. A transcrição de mTPxI é induzida durante o aumento de cálcio intracelular,

sendo esse um passo anterior à permeabilização, o que relaciona diretamente o aumento da

137

síntese (observada por Viladevall et al., 2004) com a função protetora da mitocôndria exercida

por essa enzima (Capítulo II; anexo III).

Nossos dados com relação à regulação da transcrição e aos efeitos celulares causados pela

deleção do gene que codifica para mTPxI indicam uma importante função antioxidante. Porém,

esses fenótipos observados devem refletir pelo menos em parte a atividade bioquímica de mTPxI

durante o metabolismo celular. Por isso, também voltamos nosso interesse para a compreensão

da estrutura e dos mecanismos bioquímicos de atuação de mTPxI.

Como descrito no capítulo III, apesar de inúmeros esforços, não conseguimos obter ainda

a estrutura de mTPxI, porém continuaremos tentando, pois essa informação poderá fornecer

importantes contribuições para o entendimento da função dessa 1-Cys Prx.

mTPxI foi primeiramente descrita como uma peroxirredoxina em 2000 por Park et al.

Esse grupo estudou comparativamente as 5 isoformas de tiorredoxina peroxidases presentes em

S. cerevisiae. Foi um trabalho importante de descrição e caracterização geral dessas enzimas,

porém um estudo mais acurado da atividade e da sensibilidade do mutante para mTPxI, só foi

publicada meses depois (Pedrajas et al., 2000). Esse último trabalho, fez uma caracterização da

atividade peroxidásica de mTPxI, de suas afinidades pelos substratos e interação com o sistema

tiorredoxina específico da mitocôndria, descrito 1 ano antes pelo mesmo grupo (Pedrajas et al.,

1999). Portanto, estudos que se propõem a caracterizar mTPxI são ainda poucos e recentes.

Consequentemente, muitos aspectos de seus mecanismos e funções celulares ainda são

desconhecidos. Nesse sentido, nossos estudos contribuíram para um melhor entendimento da

função de mTPxI.

Como discutido no capítulo III, caracterizamos uma nova atividade peroxidásica, não só

para mTPxI, mas para as 1-Cys Prxs. Essa atividade mostra a capacidade das 1-Cys Prxs serem

reduzidas por um composto não tiólico, o ascorbato. O ascorbato, também conhecido como

138

vitamina C, é um importante antioxidante de baixo peso molecular, presente em abundância nos

mais diversos grupos taxonômicos. A maioria dos organismos que não são capazes de sintetizar

ascorbato consome essa vitamina durante sua alimentação. A importância do ascorbato em

plantas e mamíferos é indiscutível. Doenças associadas à falta dessa vitamina são descritas em

humanos, como o escorbuto (Bors e Buettner, 1997).

Mostramos que as 1-Cys Prxs de organismos patogênicos para o homem como

Plasmodium falciparum (causador da malária) e Mycobacterium tuberculosis (agente causador

da tuberculose) também possuem a atividade dependente de ascorbato. Esse fenômeno poderia

ser um novo caminho para o desenho racional de drogas para essas doenças (cujas drogas atuais

já perderam grande parte do efeito), que ainda são motivo de preocupação para saúde pública,

principalmente em países em desenvolvimento, como o Brasil.

Além dessa possível importância prática, nossos estudos representam uma nova

descoberta no uso de redutores dessa família de enzimas recentemente descritas (Kim et al.,

1988). As Prxs são sempre referidas como sendo estritamente dependentes de redutores tiólicos

(Rhee et al., 2005). Nosso trabalho traz uma visão diferente, mostrando que as 1-Cys Prxs são

capazes de usar tióis e também ascorbato durante seu ciclo catalítico. Nossos dados podem trazer

diversas contribuições para o estudo das 1-Cys, cujos redutores biológicos em sua maioria são

ainda desconhecidos. Finalmente, existe ainda a perspectiva, que precisa ser investigada, de que

o par redox ascorbato/ácido sulfênico esteja envolvido em outros processos bioquímicos.

Em suma, mTPxI é uma importante defesa antioxidante localizada, com regulação de sua

expressão fortemente regulada e importante para a manutenção da integridade mitocondrial e

suas funções. Além disso, representa uma enzima ímpar na sua classe, diferente das

peroxirredoxinas em geral, por possuir propriedades enzimáticas diferenciadas como a utilização

139

do ascorbato e por interagir com um sistema tiorredoxina específico da mitocôndria para sua

regeneração, uma exceção na classe 1-Cys.

140

(VII) RESUMO. Existe uma grande redundância de enzimas antioxidantes em Saccharomyces cerevisiae.

Leveduras possuem 5 peroxirredoxinas (Prxs) distribuídas em diferentes compartimentos

celulares, além de diversas outras peroxidases. As Prxs são peroxidases dependentes de

tióis que possuem uma cisteína altamente reativa no sítio ativo e são amplamente

conservadas nos mais diversos grupos taxonômicos. A compreensão do papel específico de

cada enzima na resposta antioxidante pode esclarecer alguns aspectos dessa família de

enzimas que tem sido implicada em sinalização celular, proteção antioxidante e assistência

no enovelamento de proteínas. Nessa tese, apresentamos dados sobre a regulação, função,

atividade e estrutura da isoforma mitocondrial de Prx de levedura (mTPxI). mTPxI pertence

ao subgrupo das Prxs denominado 1-Cys Peroxirredoxina, pelo fato de possuir uma única

cisteína conservada. mTPxI é regenerada por um sistema tiorredoxina específico da

mitocôndria. Nossos dados mostraram que essa enzima foi mais expressa quando a

levedura cresceu em meios sem glicose e que essa indução foi mediada pelos ativadores

Msn2/4p. A repressão da expressão de mTPxI por glicose envolveu as vias cAMp-Ras2p e

Tor1p. Sua expressão foi induzida também pela exposição celular a peróxidos, sendo os

fatores Hap1p e yAP1p responsáveis pela resposta ao peróxido de hidrogênio e yAP1p e

Skn7p atuaram na resposta a peróxido orgânico. Quanto à função, mostramos o efeito

protetor de mTPxI na permeabilização da membrana interna da mitocôndria, dependente de

cálcio e estresse oxidativo. A ação protetora de mTPxI foi também associada aos níveis de

glutationa mitocondrial reduzida. Estudando a atividade de mTPxI, observamos que a

mesma e outras 1-Cys Prxs (de organismos como plantas, insetos, mamíferos e

protozoários) foram capazes de utilizar ascorbato como agente redutor. Esses resultados são

extremamente relevantes e representam uma mudança no paradigma de que Prxs são

141

peroxidases estritamente dependentes de tiól. Como ascorbato está presente em altas

concentrações nas células, o par redox ácido sulfênico (Cys-SOH)/ascorbato pode

representar aspectos ainda não explorados de bioquímica in vivo, com implicações na

defesa antioxidante e na sinalização celular, dentre outros processos.

142

(VIII) ABSTRACT.

There is high redundancy among antioxidant enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast

possess 5 peroxiredoxins (Prxs), among other peroxidases, distributed in different cellular

compartments. The Prxs are peroxidases thiol – dependent that possess a highly reactive

cysteine in their active site and are ubiquitously conserved in several taxonomic groups.

The comprehension of specific role of each enzyme in the antioxidant response can clarify

some aspects about this enzyme family that has been implicated in cell signaling,

antioxidant protection and assistance to proteins folding. In this work, we showed data

about regulation, function, activity and structure of yeast mitochondrial Prx isoform

(mTPxI). mTPxI belongs to 1-Cys peroxiredoxin subgroup, since it possesses only one

conserved cysteine. mTPxI is regenerated by an specific mitochondrial thioredoxin system.

Our data showed that this enzyme was more expressed when the yeast grow in the absence

of glucose into the media in a process mediated by Msn2/4p activators. The effect of

glucose on mTPxI repression involved the pathways dependent on cAMp-Ras2p and

Tor1p. Expression of mTPxI was also induced by peroxides and the response to hydrogen

peroxide was regulated by Hap1p and yAP1p and the response to organic peroxide was

mediated by yAP1p and Skn7p. In regard to mTPxI function, we showed the protector

effect of this peroxidase on the inner mitochondrial membrane permeabilization induced by

calcium. mTPxI cooperated with mitochondrial glutathione in the protection of inner

membrane permeabilization. During characterization of mTPxI activity, we observed that

this and other 1-Cys Prxs (from plants, insects, mammals and protozoa) were able to use

ascorbate as reductant. These results were extremely relevant and present a change in

peroxiredoxin paradigm that these are enzymes strictly dependent on thiols. As ascorbate is

present in high amounts into the cells, the sufenic acid (Cys-SOH) / ascorbate redox pair

143

can represent not yet explored aspects of biochemistry in vivo, with implications in the

antioxidant response and cell signaling, among other processes.

144

(IX) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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Anexo I

Original Contribution

REGULATION OF MITOCHONDRIAL THIOREDOXIN PEROXIDASE IEXPRESSION BY TWO DIFFERENT PATHWAYS: ONE DEPENDENT ON

cAMP AND THE OTHER ON HEME

GISELE MONTEIRO,* GONCALO AMARANTE GUIMARAES PEREIRA,* and LUIS EDUARDO SOARES NETTO†

*Departamento de Gene´tica e Evoluçao, Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas, Saõ Paulo, Brazil; and†Departamento deBiologia, Instituto de Biocieˆncias, USP, Saõ Paulo, Brazil

(Received 2 October 2001;Accepted 28 November 2001)

Abstract—Mitochondrial isoform of thioredoxin peroxidase (mTPx I) is an antioxidant protein recently described inSaccharomyces cerevisiae. Here we characterized pathways that lead to mTPx I induction in two situations: growth inmedia containing low glucose concentrations and treatment with peroxides. The induction of mTPx I by growth on lowglucose concentrations was dependent on cAMP and on the transcription factors Msn2p/Msn4p as demonstrated bynorthern blot experiments using yeast strains with deletion ofMSN2 andMSN4 genes and also using a strain permeableto cAMP. mTPx I expression was also induced by peroxides in a time- and dose-dependent manner and varied with thecarbon source present in the media. Deletion ofHAP1 or inhibition of heme synthesis abolished induction of mTPx Iby H2O2 on cells which were grown in media containing glucose, indicating that Hap1p is involved in the regulationof this process. mTPx I was induced by H2O2 on glycerol/ethanol-containing media, but we could not associate anytranscription factor with this phenomenon. Finally, mTPx I also induced byt-butyl hydroperoxide in a Hap1p-independent manner. In conclusion, mTPx I expression is under a complex regulatory network, which involves, at least,two signaling pathways: one sensing the carbon source (which is signalized by cAMP) and the other sensing theintracellular redox state (which is signalized by heme). © 2002 Elsevier Science Inc.

Keywords—Mitochondrial thioredoxin peroxidase, Expression regulation, Transcription activation, Msn2p and Msn4pactivators, cAMP and glucose repression, HAP1p activator, Heme, Free radicals

INTRODUCTION

Peroxiredoxins are thiol-dependent peroxidases involvedin many processes in mammalian cells such as differen-tiation, proliferation, cellular signaling, apoptosis, andmitochondrial permeability transition [1–5]. InSaccha-romyces cerevisiae there are five peroxiredoxin isoformslocated in different cell compartments [6]. Because all ofthem can utilize thioredoxin as substrate, they are knownas thioredoxin peroxidases (TPx)1 [6,7]. Yeast peroxire-doxins are also involved in several biological processes.As an example, cTPxI prevents mitochondrial permeabil-ity transition and calcium-induced cell death [8]. In ad-dition, cTPxI is essential for the full induction of geneswhose products are required for its own reduction by

NADPH: TRX2 (that encodes the thioredoxin 2 gene)and TRR1 (that encodes the thioredoxin reductase 1gene) [9]. Peroxiredoxins are also distributed in bacteria,plants, and mammals, including humans, in which vari-ous isoforms were identified ([4] and references citedherein).

mTPxI is the yeast peroxiredoxin with highest thiol-dependent peroxidase activity [6]. This enzyme interactswith a specific mitochondrial system, comprising a thi-oredoxin protein (TRX3) and a thioredoxin reductase(TRR2) [7,10]. Moreover, mTPxI activity is sensitive topH changes. Its activity is completely abolished on al-kaline conditions, suggesting that the activity of thisprotein could be regulated by cellular pH [6]. mTPxI canreduce both H2O2 and t-butyl hydroperoxide (t-BOOH),however mTPxI null strain is more sensitive to H2O2, butnot to t-BOOH, compared with the respective isogenicwild-type strain [7]. The null mTPxI phenotype alsoshows more sensitivity to heat shock. These results sug-

Address correspondence to: Dr. Luis Eduardo Soares Netto, Institutode Biociencias, USP, Rua do Mataõ 277, CEP05508-900, Saõ Paulo,Brazil; Tel: 55 (11) 38187589; Fax:55 (11) 38187553; E-Mail:[email protected].

Free Radical Biology & Medicine, Vol. 32, No. 3, pp. 278–288, 2002Copyright © 2002 Elsevier Science Inc.Printed in the USA. All rights reserved

0891-5849/02/$–see front matter

PII S0891-5849(01)00801-2

278

gest that mTPxI is important to protect cells from oxi-dative stress [7].

The specific role of peroxiredoxins in response tooxidative stress is not completely understood. Responseto oxidative stress is a very complex phenomenon wherevarious low molecular weight compounds, antioxidantenzymes, and signaling molecules participate [11,12].Glucose plays a key role in the response of S. cerevisiaeto oxidative stress, inducing genes necessary for rapidgrowth (e.g., genes involved in protein synthesis andribosomal RNA and glycolysis) and repressing genesinvolved in aerobic respiration and alternative carbonsource metabolism. Several signaling pathways are in-volved in the regulation of gene expression mediated byglucose. The main pathway by which glucose repressestarget genes involves the Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1 com-plex. Another pathway is the RAS-adenylate cyclasepathway (or RAS-cAMP) [13]. This pathway utilizescAMP as a messenger, regulating PKA activity thatmodulates the activity of some transcription factors, suchas Msn2p and Msn4p. These Cys2His2 zinc finger tran-scription regulators, responsible for induction of diversestress-responsive genes, have their nuclear localizationregulated by PKA [14,15].

Another important factor that affects the response tooxidative stress in yeast is oxygen concentration. Theoxygen sensing mechanism is not well established butheme has been often related to this function [16,17].Heme is involved in transcription regulation of redoxresponsive genes in part through its binding to transcrip-tion factors such as Hap1p [17]. The activity of Hap1p isdirectly controlled by heme. In the absence of heme,Hap1p binds to a high molecular weight complex and ishindered to bind DNA. When heme concentration rises,

this high molecular weight complex is disrupted andHap1p is activated [18].

Therefore, the participation of peroxiredoxins in yeastoxidative stress response should be dependent on severalexternal factors such as glucose and cellular redox state.Besides peroxiredoxins, yeast possesses several enzymescapable of decomposing peroxides, such as catalases(peroxisomal and cytosolic), cytochrome c peroxidase,and glutathione peroxidases [11]. It is reasonable to thinkthat each enzyme has particular importance in a specificcompartment and/or in a specific situation. Therefore, theregulation of mTPxI was investigated in order to gaininsights about its specific role in the response of yeast tooxidative stress. The results presented here show thatmTPxI expression is regulated by a complex signalingnetwork that involves at least two pathways: one depen-dent on Hap1p and sensitive to hydrogen peroxide ex-posure, and the other dependent on Msn2p and Msn4pactivators and sensitive to glucose concentration.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Chemicals

Hydrogen peroxide 30%, 5-Bromo-4-chloro-3-in-dolyl-D-galactoside (X-gal), t-butyl hydroperoxide, he-min, and cAMP were purchased from Sigma Chemical.Most of the other chemicals used were also obtainedfrom Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).

Yeast strains and growth conditions

Saccharomyces cerevisiae yeast strains used in thisstudy are listed in Table 1. Cells were grown at 30°C on

Table 1. Saccharomyces Cerevisiae Strains

Strain Genotype Source

JD7-7C* MAT, ura3-52, leu2, trpA, K [24]tsa* MAT, ura3-52, leu2, trpA, K, tsa::LEU2 [24]FY1679 MATa/MAT, ura3-52/ura3-52, trp163/TRP1, leu21/LEU2, his3200/HIS3, YBL064c (4,780)/YBL064c

(4,780)

a

FY1679b* MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his3200, YBL064c (4,780) b

FMEY007-07C(A)* FY, Mata, ura3-52, his3200, LEU2, LYS2, TRP1, YBL064c (4,780)::kanMX4 a

HD93-15D* MAT, his3, leu2, trp1, ura3 [25]HD93-15DdB MAT, his3, leu2, trp1, ura3, adr1::HIS3 [25]W303-1A MATa, ade2, can1, his3, leu2, trp1, ura3 [26]MSN2 and MSN4 MATa, ade2, can1, his3, leu2, trp1, ura3, MSN2D3::HIS3, MSN4::TRP1 [26]OL556 ura3/ura3, his3/his3, leu2/leu2, cdc25-5/cdc25-5, pde2/pde2, trp1/TRP1 [20]BWG1-7A MAT, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1UAS2 [27]LPY22 MAT, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1UAS2, hap1::LEU2 [27]GG231-4A MAT, leu2-3, 112ura3-52, trp1-289 [22]GG231-4A MAT, leu2-3, 112ura3-52, trp1-289, heme15-5 [22](heme15)

* These strains were used for transformation with reporter plasmid.a Strains obtained from EUROSCARF.b This strain was obtained from sporulation of FY1679 and selection of spores with the described markers.

279mTPxI expression is regulated by cAMP and heme

YP medium (1% yeast extract, 2% bacto-peptone) with2% glucose (YPD) or 2% galactose or 2% glycerol plus2% ethanol (YPYE) or 2% raffinose. For most analysiswhen yeast strains were grown on glucose or galactose,cells were harvested by centrifugation at midlogarithmicphase, which corresponds to an A600 between 0.8 and1.4. To obtain high amounts of cells grown under non-repressing carbon sources (such as raffinose or glycerol),precultures were grown overnight in glucose, then wereharvested and changed to respective media.

Plates with complete synthetic medium (YNB with0.5% ammonium sulphate and all aminoacids excepturacil, agar 2%, glucose 2%, or glycerol 2%) were sup-plemented with X-gal (in potassium phosphate buffer 50mM, pH 7.0, and X-gal at 20 mg/ml concentration) [19]to perform gene reporter experiments.

The intracellular level of cAMP was modulated indiploid strain OL556 homozygous for cdc25-5 and rca1/pde2 mutations. In this strain, high temperature (37°C)abolishes cAMP synthesis due to cdc25-5 mutation andgrowth arrest can be rescued by exogenously addedcAMP as a consequence of the rca1/pde2 mutation,which affects the high-affinity phosphodiesterase [20].When the high affinity phosphodiesterase is inactivatedby mutation of gene pde2/rca1, as in OL556, the intra-cellular level of cAMP is increased from 1–3 M to 50M when 4 mM of cAMP is added exogenously [21]. Anovernight preculture was grown at 26°C in glucose me-dium in the absence of cAMP and was used to inoculatethe culture at 106 cells. ml1. Growth was maintained at28°C in the absence or presence of 3mM cAMP either inmidlogarithmic or stationary phase.

Cells deficient in heme syntheses were grown in YPDplus Tween 80 (0.2%), ergosterol (30 mg/l), and hemin(15 mg/l plus NaOH) [22,23].

Plasmids and DNA manipulation

The plasmid pYCG (obtained from EUROSCARF,Frankfurt, Germany), containing the YBL064c ORF thatencodes mTPx I, was used to obtain the probe for North-ern blot experiments. Plasmidial DNA preparation, gelelectrophoresis, and purification were all carried out us-ing standard methods as described by Ausubel et al. [19].The resulting purified fragment was utilized to constructthe YBL064c 32P-labeled probe, by random primed la-beling [19].

Yep357R was used to construct a plasmid for genereporter experiments. The YBL064c promoter region wasobtained from pYCG plasmid digested by BclI and XhoIrestriction enzymes (GIBCO-BRL, Rockville, MD,USA) producing a promoter fragment that was ligated tothe Yep357R vector previously digested with BamHI andSalI restriction enzymes (GIBCO-BRL). This resulting

plasmid (Yep357R YBL064c promoter) was used totransform yeast strains marked with asterisks in Table 1,using standard methods as described by Ausubel et al. [19].

RNA isolation and analysis

Northern blot analyses were conducted on total yeastRNA, extracted from cells under distinct growth condi-tions by the hot acid phenol method [19], and separatedby electrophoresis on formaldehyde-agarose gels. Thefractionated RNAs were transferred to a positivelycharged nylon membrane (Amersham, Uppsala, Sweden)by capillary blotting and fixed. Prehybridization wascarried out for at least 2 h, at 40°C, including formamideat a final concentration of 50%. The YBL064c probe wasadded and hybridization was performed for approxi-mately 14 hs at 42°C. Blots were washed and exposed toKodak films (X-OMAT). Autoradiograms were quanti-fied against the levels of rRNA (ethidium bromide),whose abundance does not vary with growth conditionsor among the various strains derivatives, with the ImageMaster VDS software. The same was carried out usingACT1 gene as control and we could not detect anydifference. All the proceedings are according to themembrane manufacturer’s protocol and as described byAusubel et al. [19].

RESULTS

YBL064c transcription is repressed by high glucoseconcentration

Because glucose inhibits respiration in yeast, ROSproduction is decreased when this sugar is present inhigh amounts. As a consequence, the expression of sev-eral antioxidant genes is inhibited by glucose [11,28].Therefore, the expression of mTPxI under different car-bon sources was analyzed by Northern blot in cellscultured in the following glucose concentrations: 0 (inthis case the glycerol 2%/ethanol 2% mixture was usedas a carbon source), 2 and 10% (Fig. 1, I). As expectedfor an antioxidant enzyme, the expression of mTPxI islower when cells were cultured on fermentative carbonsource than in cells growing under respiratory condi-tions. This variation ranged from 4- (Fig. 1, I, wells 1–3)to 10-fold (Fig. 1, I, wells 4–5), depending on the strainanalyzed.

The glucose effect on mTPxI expression was con-firmed by gene reporter experiments using the structural-galactosidase gene fused to mTPxI promoter (Fig. 1,II). The letters A, B, and C in Fig. 1, II represent differentyeast strains transformed with Yep357R YBL064cpromoter. In all cases, the YBL064c promoter showedhigher activity in glycerol/ethanol than in glucose con-

280 G. MONTEIRO et al.

taining media. The activity of the YBL064c promoter wascomparable to positive controls (letter F for glycerolplates and E for both plates), whereas its low activity onglucose plates was comparable to negative controls (let-ter F for glucose plates and D for both plates). Interest-ingly, deletion of TSA1 gene (coding for cytosolic thi-oredoxin peroxidase I) did not affect YBL064c promoteractivity (Fig. 1, IIA, C). These results show that mTPxIis induced during adaptation of cells to low glucoseconcentrations.

Msn2p and Msn4p activators are essential to theremoval of YBL064c repression by glucose

Msn2p and Msn4p are involved in the regulation ofseveral genes responsive to glucose such as CTT1,SOD2, HSP104 and HSP26 [26]. These transcriptionregulators recognize STRE on target promoters. STREpossesses the core consensus AGGGG and is implicatedin transcription control by multiple stress conditions[29]. Because the YBL064c promoter contains a STREelement 112 nucleotides upstream from the start codonand because YBL064c expression is dependent on glu-cose concentration (Fig. 1), the involvement of Msn2pand Msn4p in mTPxI regulation was investigated using astrain in which both MSN2 and MSN4 genes were de-leted. Msn2p and Msn4p are partially redundant proteinsand, in consequence, single deletions of their respectivegenes do not result in any clear phenotypic change [30].The expression of YBL064c in the MSN2 and MSN4 nullstrain was highly dependent on the carbon source (Fig.2A). When these cells were grown on glucose, YBL064cexpression does not suffer changes in comparison to the

respective wild-type strain (Fig. 2A, wells 1 and 2). Thiswas expected because the nuclear localization of Msn2pand Msn4p are inhibited by this sugar [14]. In the sameway, when cells were grown on galactose (another re-pressing carbon source) there is little difference inYBL064c expression between wild type and MSN2/MSN4 mutant strains (Fig. 2A, wells 3 and 4).

On the other hand, when cells were cultivated withnonrepressing carbon sources such as raffinose and glyc-erol/ethanol (Fig. 2A, wells 5 and 6, 7 and 8, respec-tively) there is a considerable decrease of YBL064c ex-pression in MSN2/MSN4 mutant cells in relation to therespective wild-type cells, indicating that the inductionof YBL064c is mediated by Msn2p and Msn4p.

The level of intracellular cAMP decreases during theconsumption of glucose and is required for subsequentgrowth on ethanol after the diauxic transition [20,26].The repressing effect of the cAMP for several stress-induced genes is mediated by protein kinase A (PKA).PKA is implicated in the coordination of several cellularevents such as cell growth, regulation of cell cycle, andreprogramming of transcription during the switch from afermentable to nonfermentable carbon sources. Theseprocesses are regulated in part by STRE and PKA. Whenthe intracellular content of cAMP is high (this occurswhen glucose content is also high), PKA is activated andMsn2p and Msn4p are exported from nucleus to cyto-plasm. Contrarily, when glucose is exhausted, cAMPlevels decrease, provoking PKA deactivation and theaccumulation of Msn2p and Msn4p in the nucleus [14].

Since Msn2p and Msn4p are inhibited by cAMPthrough PKA activity (possibly involving others ki-nases), we decided to investigate YBL064c expression in

Fig. 1. Effect of carbon source on mTPxI expression. (I) Northern blotting analysis of mTPxI. RNA was isolated from yeast strainsJD7-7C (lanes 1, 2, and 3), FY1679b (lanes 4 and 5), and FMEY007-07C(A) (lane 6). FMEY007-07C(A) has the mTPxI gene disruptedand was used as a negative control for the probe. Cells were grown in media with the carbon sources described above. O% of glucoserefers to a carbon source of 2% glycerol/2% ethanol (lanes 1, 4, 6). (II) Gene reporter analysis of the YBL064C promoter activity. Theability of -galactosidase to decompose X-gal in the agar plates was used as a reporter for YBL064C promoter activity. Left platecontains glucose as carbon source and right plate contains ethanol/glycerol as carbon source. Strains: (A) TSA1, (B) FMEY007-07C(A); and (C) JD7-7C were transformed with the plasmid Yep357R YBL064C promoter. D, E, and F were controlplates. D negative control (strain FY1679b was transformed with Yep357R vector with no insert); E positive control for bothplates, (yeast strain TSA1 gene transformed with Yep356R TSA1 promoter, which has high activity in both carbon sources); F positive control only for glycerol plate (strain HD93-15D with methanol oxidase promoter, which suffers catabolite repression).


the OL556 strain. This strain has cdc25-5 and rca1/pde2mutations that allow the modulation of cAMP intracel-lular levels by external additions of this nucleotide [20,21]. In the midlogarithmic phase (Fig. 2B, wells 1 and2)—OD600 0.8—where glucose is still present in theculture media, the presence or the absence of exog-enously added cAMP did not affect YBL064c expression.This was expected because intracellular cAMP is alreadyhigh at high glucose concentrations. However, whencells were in stationary phase (OD600 6.0), the inductionof YBL064c during the diauxic shift was diminished byan external addition of cAMP (Fig. 2B, wells 3 and 4). Inthe stationary phase, glucose and cAMP contents arelow, therefore PKA activity is inhibited and Msn2p andMsn4p accumulate into the nucleus. However, whenexternal cAMP was added to the medium, PKA wasactivated and, consequently, the nuclear localization ofMsn2p and Msn4p was inhibited. Therefore the removalof YBL064c repression by glucose is mediated byMsn2p/Msn4p and by cAMP.

Oxidative stress induction of mTPxI

mTPxI has been implicated in antioxidant cell defenseamong other reasons because deletion of its gene renderscells more sensitive to H2O2 and to heat shock [6,7].Therefore, we tested if mTPxI expression is induced byoxidative stress. Since mTPxI possesses thiol-dependentperoxidase activity, treatments of cells with H2O2 andt-BOOH were performed.

Initially, the expression of YBL064c as a function ofH2O2 concentration was studied. The pattern of YBL064cinduction by H2O2 was dependent on the culture mediumthat yeast grew (Fig. 3A). Under glucose-containing me-

dia, the level of YBL064c transcripts was maximal at 0.5mM concentration (Fig. 3A), which is in agreement withWestern blot studies that showed maximal inductionbetween 0.25 and 0.5 mM H2O2 [7]. When cells weregrown on glycerol/ethanol, the maximal transcription ofYBL064c was observed at the highest H2O2 concentra-tion employed (3 mM) (Fig. 3A).

The carbon source also affected the time-dependentinduction of YBL064c expression by H2O2 (Fig. 3B).Under fermentative culture media (glucose as carbonsource) the transcription response is slower than underrespiratory growth conditions (glycerol/ethanol as car-bon source). The higher induction using glucose wasobserved 60 min after H2O2 treatment; whereas on glyc-erol/ethanol the higher effect occurred 15 min after cellswere treated with H2O2 and then declined (Fig. 3B).These results suggest that there are, at least, two differentmodes of induction of YBL064c expression by H2O2

depending on the carbon source utilized by yeast.The possible involvement of Msn2p and Msn4p on

the YBL064c induction by H2O2 was tested based on thefact that these proteins mediated the induction of mTPxIexpression by transition to low glucose concentrationconditions (Fig. 2). Furthermore, DNA microarray stud-ies suggest the involvement of Msn2p and Msn4p in theYBL064c induction by heat and acid stress [31,32]. In theMSN2/MSN4 double mutant strain, the induction ofYBL064c by H2O2 was not abolished when cells weregrown on glycerol/ethanol, suggesting that this process isnot mediated by Msn2p and Msn4p (Fig. 4). This resultis consistent with microarray data performed by Gasch etal. [31]. As a matter of fact, the induction of mTPxI inthe wild-type strain (Fig. 4, wells 1 and 2) seems to belower than in the MSN2/MSN4 double mutant strain (Fig.

Fig. 2. Effect of MSN2/MSN4 deletion and high cAMP level on mTPxI induction during the diauxic transition. (A) Northern blottinganalysis of RNA isolated from wild-type (odd lanes) and MSN2 and MSN4 null (even lanes) yeast strains. Cells were grown in mediacontaining the indicated carbon sources. (B) Northern blotting analysis of RNA isolated from yeast OL556 with the rca1/pde2mutation, that allows maintenance of high cAMP levels at 28°C with exogenously added cAMP (3 mM) in the culture media. Lanes1 and 2 correspond to RNA from yeast grown until mid-log phase—OD600 0.8; lanes 3 and 4 correspond to RNA from yeast grownuntil stationary phase—OD600 6.0.


4, wells 3 and 4). This should be related to the fact thatMsn2p and Msn4p affect the basal level of YBL064cexpression depending on the carbon source used (Fig. 2).Indeed, a decrease in YBL064c transcript abundancefrom well 1 to well 3 was observed (Fig. 4).

A fast search for transcription factors involved in theperoxide-dependent induction of mTPxI was performed.Yeast strains with disrupted genes for Yap-1p, Yap-2p,Hap-1p, Ace1p, Ace2p, Mac1p, Skn7p, and Adr1p wereemployed. These factors were selected because they areinvolved in the response to oxidative stress of yeast

[11,12]. Only Hap1p seems to affect the induction ofYBL064c by H2O2 (Fig. 5A). In the HAP1 null strain,H2O2-dependent induction of YBL064c was abolished,whereas in the respective wild-type strain, the inductionwas still observed (Fig. 5A). These results were obtainedwith cells grown in media with high glucose concentra-tions. Under nonrepressing conditions (low glucose con-tent), Hap1p did not affect the expression of mTPxI (datanot show).

Because heme is a signaling molecule that activatesHap1p factor [18], YBL064c expression was evaluated

Fig. 3. Effect of H2O2 on mTPxI expression. (A) Northern blotting analysis of RNA isolated from yeast strain FY1679b that sufferedH2O2 exposure for 15 min at different concentrations. Lanes 1–4: cells were grown in 2% glucose and lanes 5–8 cells were grown in2% glycerol/2% ethanol. H2O2 was added at the indicated concentrations. (B) Northern blotting analysis of RNA isolated fromFY1679b strain, which suffered different times of 1 mM H2O2 exposure, except for lane 5 that corresponds to FMEY007-07C(A) straingrown under glycerol/ethanol. FMEY007-07C(A) strain has the YBL064C gene disrupted and was used as a negative control for theprobe. Lanes 1 to 4 correspond to cells grown in 2% glucose; lanes 5–9 were grown in 2% glycerol/2% ethanol. H2O2 was added atthe indicated time. The expression level was quantitated by dosimetry using Image Master equipment of Amershan-Pharmacy Biotech.


in a heme-deficient strain. A clear influence of thismolecule on the YBL064c mRNA levels was detected(Fig. 5B, wells 3 and 4). When heme is absent in thecell, the induction of YBL064c by H2O2 does notoccur. Heme interacts with several molecules, there-fore its absence can affect the expression of genes byother means than Hap1p-mediated processes. For ex-ample: since heme is the prosthetic group for cyto-chromes, its absence in the respiratory chain can leadto an energy deficiency that can affect the expressionof several genes. To test this possibility, the mRNAlevels of two additional genes were analyzed: ACT1

(that codifies to actin) and TSA1 (that codifies tocTPxI). These genes are highly expressed in severalsituations [33]. The mRNA levels for ACT1 and TSA1in wild-type and heme-deficient cells are about thesame (data not shown), indicating that the decrease ofmTPxI induction by impairment of heme synthesis(Fig. 5B) is due to a process specific to YBL064c geneand not to a global transcription problem. The resultsabout the deletion of HAP1 (Fig. 5A) together with thedependence of YBL064c induction on heme (Fig. 5B)indicate that the expression of mTPxI is also regulatedby a redox pathway.

The induction of YBL064c by other peroxides, suchas t-BOOH, was also tested. This compound causescellular damages and can be decomposed by mTPxI[7]. The induction of YBL064c expression by t-BOOHtreatment was observed under fermentative growthconditions. YBL064c has an induction of 9-fold com-pared with nontreated cells (Fig. 6). However, thepresence or absence of Hap1p activator barely affectsthis t-BOOH induction (Fig. 6), suggesting a differentregulatory control.

In summary, the results presented here indicate acomplex regulatory network for expression of mTPxI. Atleast four different pathways seems to exist: one depen-dent on glucose concentration (Figs. 1 and 2); anotherdependent on H2O2 concentration, when cells are culti-vated on fermentative conditions (Figs. 3 and 5); anotherdependent on H2O2 concentration, when cells are culti-vated on respiratory conditions (Figs. 3 and 4); andfinally, one dependent on t-BOOH, when cells are culti-vated on fermentative conditions (Fig. 6). In two cases,the transcription factors were identified. First, the induc-tion dependent on glucose concentration is signalized bydecrease in cAMP content that inhibits PKA activity,leading to Msn2p and Msn4p action (Fig. 7, I). In theother case, the pathway seems to be redox-sensitive andis dependent on the presence of heme and on the tran-scription factor Hap1p (Fig. 7, II).

Fig. 4. Effect of Msn2p and Msn4p depletion on H2O2-mTPxI induc-tion. Northern blotting analysis of RNA isolated from W303-1a (lanes1 and 2) and MSN2 and MSN4 null (lanes 3 and 4) yeast strains. Cellswere grown in 2% glucose containing media. Lanes 2 and 4 correspondto cells exposed to 1 mM H2O2 for 15 min.

Fig. 5. Effect of Hap1p transcription factor depletion and heme deple-tion on mTPxI H2O2-induction. H2O2 was added to the cells at 1 mMconcentration for 15 min. (A) Northern blotting analysis of RNAisolated from BWG1-7A (lanes 1, 2, 5, and 6) and HAP1 null-LPY22(3, 4, 7, and 8) yeast strains. Cells were grown in glucose at theindicated concentrations. (B) Northern blotting analysis of RNA iso-lated from GG231-4A (lanes 1 and 2) and heme15 mutant (lanes 3and 4) strains. Cells were grown in 2% glucose.

Fig. 6. Effect of t-BOOH on mTPxI expression. Northern blottinganalysis of RNA isolated from wild type BWG1-7A (lanes 1 and 2) andHAP1 null-LPY22 (lanes 3 and 4) yeast strains. Cells were grown in2% glucose. The odd lanes did not suffer t-BOOH exposition and theeven lanes were exposed to 1 mM t-BOOH for 15 min.


DISCUSSION

Response to oxidative stress in eukaryotic cells is verycomplex when compared with bacteria. Most knowledgeabout the eukaryotic system came from studies usingyeast as a model. Considerable attention has been givento Yap1p and Skn7p as important regulators in the oxi-dative stress response of Saccharomyces cerevisiae [29,34]. These regulators mediated the induction of severalantioxidant enzymes by H2O2 on glucose containingmedia [35]. However, response to oxidative stress in-volves several other transcription regulators [11,12]. Re-cently, Msn2p and Msn4p were found to mediate part ofthe induction of STRE-controlled genes by a variety ofstress conditions, including oxidation [36]. BesidesYAP1, SKN7, MSN2, and MSN4, the deletion of othergenes coding for transcription regulators leads to decreasein the induction of oxidative stress responsive genes and toincreased sensitivity to oxidative stress [11,12].

Our results indicate that the regulation of mTPxIexpression is dependent on the interplay of several sig-naling pathways, which is consistent with the complexityof the response to oxidative stress in eukaryotes. Variousfactors such as carbon source in the media and redoxstate of the cell appear to influence the pattern of geneexpression. The identification of components of two ofthese pathways are reported here, one sensitive to glu-cose concentrations and the other sensitive to H2O2 con-centrations when cells were grown in glucose.

Glucose induces drastic changes in the pattern of geneexpression. This occurs because fermentable carbonsources (such as glucose) cause catabolite repression,where several genes responsible for stress defense andutilization of alternative carbon sources have low rates ofexpression or no expression at all [37]. The repression byglucose is a phenomenon signalized by several pathways.The RAS-adenylate cyclase pathway (which involvesRas proteins, cAMP, and PKA) has been considered as atransition signaling process, since it is only operative toadapt cells to a new condition. Once the adjustment hasbeen made and the cells have become glucose-repressedthrough the action of the main repression pathway (com-posed by Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1 repression complex),the Ras-cAMP pathway is turned off [13].

mTPx I is highly expressed in low glucose concen-trations compared to high levels of this sugar (Fig. 1).These results are in agreement with DNA microarraydata [38]. The mechanism of mTPxI repression by glu-cose is unknown. An analysis of the promoter region ofmTPxI shows that no Mig target elements were found in3200 nucleotides upstream from the initiation codon.However, the participation of Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1complex in mTPxI regulation by glucose cannot be ex-cluded since TUP1 deletion leads to a slight increase inYBL064c transcription [38]. Our data indicate that therelief of mTPxI repression by glucose is mediated, atleast in part, by a pathway that involves cAMP, PKA,

Fig. 7. A proposed regulatory network for mTPxI expression. (I) Schematic representation of the regulatory pathway responsible formTPxI induction during diauxic transition. cAMP signaling is mediated by PKA activity that regulates the nuclear export of Msn2pand Msn4p activators. IA corresponds to high glucose concentration and IB corresponds to low glucose concentration. (II) Schematicrepresentation of the regulatory pathway signaling by redox state that modulates heme concentration. IIA corresponds to low H2O2

concentration and IIB to high H2O2 concentration. The up and low orientations of arrows represent increase or decrease inconcentration, respectively.


Msn2p, and Msn4p. PKA appears to stimulate nuclearexport and cytoplasmic localization of Msn2p andMsn4p [14], although other kinases besides PKA shouldalso be involved [15]. A few reports indicate that Yap1pand Skn7p are also negatively regulated by PKA [39,40],but the inhibitory mechanism is not known. In the otherhand, the connection between Msn2p/Msn4p and cAMP-PKA is well established [36].

Msn2p and Msn4p recognize STREs such as an ele-ment present in the mTPxI promoter 112 nucleotidesupstream from the start codon (Fig. 8). These transcrip-tion activators mediate yeast defense against severalstress conditions, being frequently associated with thegeneral stress response of the cell. mTPxI is inducedduring several adaptive processes, which are mediated byMsn2p and Msn4p ([31,32,41] and Fig. 2). Together,these results suggest mTPxI should be an importanteffector of the general stress response controlled byMsn2p and Msn4p.

In spite of the repression of mTPxI expression byglucose, an induction of its gene by H2O2 was achievedunder conditions of high glucose concentrations (Fig. 3).In this case, it seems that the pathway responsible formTPxI induction by H2O2 overcomes the glucose repres-sion. Hap1p and heme are components of this H2O2-responsive pathway. Hap1p is a zinc finger transcriptionfactor that recognizes an element that contains two CGGtriplets [18]. In spite of the fact that this consensussequence is very weak, potential elements for Hap1p onmTPxI promoter were found at 207 and 455 nucleotidesupstream from the start codon (Fig. 8). This is consistentwith the Hap1p-dependent regulation of mTPxI (Fig. 5).

Hap1p is not as frequently associated with OxidativeStress Response as Yap1p and Skn7p, although the nullmutant for HAP1 displays increased sensitivity to oxida-tive stress induced by H2O2 [42]. Moreover, Hap1pmediates the regulation of the expression of genes en-coding antioxidant proteins such as cytosolic catalase T(CTT1), cytosolic cupper,zinc superoxide dismutase(SOD1), mitochondrial manganese superoxide dismutase(SOD2) [12,18], and mTPxI (Fig. 5). Furthermore,Hap1p mediates part of the adaptation of yeast to con-ditions of high oxygen tension [18].

The reasons for the existence of multiple transcription

regulators in the response to oxidative stress are notknown. One possible explanation is that there are severalkinds of oxidative stresses. In fact, Gasch et al. [31] havesuggested that Yap1p and Skn7p mediate the response tomilder stresses, whereas Msn2p and Msn4p would beinvolved in the signaling of the response to more severestresses. mTPxI shows different kinds of induction de-pendent on the different transcription regulators. The factthat the induction of mTPxI by t-BOOH is independentof Hap1p (Fig. 6) corroborates the idea that severaltranscription regulators take place in the response tooxidative stress.

Yap1p could also participate in the regulation of mT-PxI expression. In fact, genomic-wide studies show thatmTPxI induction by H2O2 at high glucose concentrationsis partially abolished by YAP1 deletion [31] and a po-tential element recognizable by Yap1p is present in mT-PxI promoter (Fig. 8). Besides, mTPxI transcript level isincreased in cells overexpressing Yap1p during treat-ment with cadmium [43]. We are investigating the pos-sible involvement of Yap1p and Skn7p in mTPxI induc-tion by t-BOOH (Fig. 6) and in the induction by H2O2 inglycerol/ethanol (Figs. 3 and 4).

Eukaryotic cells possess a high redundancy of en-zymes capable of decomposing peroxides. Each enzymecould play a specific function. For example: becausecatalase has a high Vmax and high Km, it is accepted thatthis enzyme would be suitable for the removal of poolscontaining high concentrations of H2O2 [44]. On theother side, thiol-dependent peroxidases, such as glutathi-one peroxidases and thioredoxin peroxidases, would bemore adapted to the removal of peroxides generated bymilder situations such as a continuous flow of peroxide.mTPxI could be involved in the protection of yeastmitochondria from oxidative stress provoked by variousmeans, each one activated by a different pathway. Oneintriguing observation is that the mitochondrial proteinsmTPxI and SOD2 share the same regulators Hap1p andMsn2p/Msn4p for their genes transcription [26,45].Moreover, H2O2, which is the product of the reactioncatalyzed by SOD2, can be decomposed by mTPxI toH2O at the expense of thiol reducing equivalents. mTPxIand SOD2 may act together in the protection of yeast.This antioxidant system may also be relevant in mam-malian cells because their mitochondria also contain aspecific thioredoxin system and a SOD enzyme ([7] andreferences cited herein).

Acknowledgements — We thank Ana P. Demasi and Victor G. Faria forhelping us with Northern blotting analysis; Vitor H. de Almeida e Silvafor his help in several tests; Marcos A. Oliveira, who participated inYep357R YBL064c promoter construction; and Dr. Alicia J. Kowal-towski for revising the manuscript. We are in debt to R. Labbe-Bois,H. Z. Chae, S. G. Rhee, E. Boy-Marcotte, and K. Pfeifer, cited in Table1, who kindly provided us yeast strains, and with Luis Humberto

Fig. 8. Diagram of mTPxI promoter showing the relative positions ofputative transcription factors binding sites. The adenilate position ofATG codon is indicated by number 1 and the other positions arerelative to it. The diamond, square, and circle symbols represent bind-ing sites of Yap1p, Hap1p, and Msn2p/Msn4p, respectively.


Gomes for micromanipulation of yeast strain FY1679. We thank alsoFundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo, FAPESP forfinancial support.

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oxidase IYBL064C—gene that codifies to mitochondrial thiore-

doxin peroxidase


Anexo II

www.fems-microbiology.org

FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228

Glucose repression of PRX1 expression is mediated by Tor1p andRas2p through inhibition of Msn2/4p in Saccharomyces cerevisiae

Gisele Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto *

Departamento de Biologia – Genetica, Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo, Rua do Matao 277, CEP05508-900 Sao Paulo, SP, Brazil

Received 27 July 2004; received in revised form 28 September 2004; accepted 12 October 2004

First published online 27 October 2004

Edited by Derek J. Jamieson

Abstract

Expression of mitochondrial thioredoxin peroxidase (Prx1p) from Saccharomyces cerevisiae is subjected to complex transcriptional

regulation and is responsive to the levels of several compounds such as glucose and peroxides. We have previously shown that glucose

represses the expression of mitochondrial thioredoxin peroxidase gene (PRX1) in a process mediated by cAMP/protein kinase A

(PKA) andMsn2/4p. Here, we show by northern blot and reporter gene (b-galactosidase) assays that deletion of genes encoding Tor1pand Ras2p resulted in increased PRX1 expression, indicating that these proteins are also mediators of the glucose repression effect. We

also identified the position of the stress transcription responsive element (STRE) in thePRX1 promoter, which is recognized byMsn2p

and Msn4p activators. Mutation of AGGGG sequence at position 116 to 112 caused a high drop in PRX1 expression under

respiratory conditions and in strains containing deletions of TOR1 or RAS2, confirming the finding that this sequence is a STRE.

2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Federation of European Microbiological Societies.

Keywords: Yeast; Mitochondrial thioredoxin peroxidase; PRX1; Msn2/4p; Glucose repression; Ras2p; Tor1p; Expression regulation; Mitochondrial

thiol peroxidase

1. Introduction

Reactive oxygen species (ROS) are produced mainlyas byproducts of respiration in the mitochondrial elec-

tron transport chain [1]. Cells possess a wide variety of

antioxidant molecules, including different kinds of en-

zymes. Mitochondrial thioredoxin peroxidase (Prx1p)

is one of the Saccharomyces cerevisiae enzymes involved

in protection against oxidative stress insult. It is capable

to remove both organic and hydrogen peroxides in a thi-

oredoxin-specific manner [2]. Recent findings haveimplicated Prx1p as one of the most important enzymes

0378-1097/$22.00 2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Feder

doi:10.1016/j.femsle.2004.10.024

* Corresponding author. Tel.: +55 11 30917589; fax: +55 11

30917553.

E-mail address: [email protected] (Luis Eduardo Soares Netto).

protecting mitochondrial integrity during normal cell

growth and from calcium-mediated oxidative stress [3].

Cells reconfigure their pattern of gene expressiondepending on nutrient availability or in response to dif-

ferent stress conditions as a mechanism of protection

against environmental insults. Glucose repression is

one of the most important of these processes in S. cere-

visiae, since this sugar regulates a large number of genes,

mainly those involved in respiratory metabolism and cell

growth [4–8]. There are some well-studied metabolic

pathways that take part in glucose repression. The moststudied pathways are: the Ras–cAMP pathway; the

main glucose repression pathway (mediated by Mig1–

Ssn6/Cyc8–Tup1 complex); hexose transporter induc-

tion and finally the TOR pathway [4,8,9].

The Ras–cAMP pathway participates in an adaptive

and transitory response to glucose. Ras is a G-protein

ation of European Microbiological Societies.

mailto:[email protected]

222 G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228

that has been implicated in the activation of cAMP

dependent protein kinase (PKA) through the product

of adenylate cyclase activity: cAMP (reviewed by [9]

and by [10]). PKA is responsible for the phosphoryla-

tion of several proteins [11,12], preparing the cellular

ambient to maintain catabolite repression by the mainpathway. In contrast to the Ras–cAMP pathway, the

Mig1–Ssn6/Cyc8–Tup1 complex acts as long as glucose

is present in the media [4,6,10].

TOR-dependent pathway is another process involved

in glucose repression [13]. TOR proteins are phosphati-

dylinositol kinases that participate in cell signaling proc-

esses depending on the nutrient availability and on the

presence of the immunosupressant rapamycin, an antibi-otic with antiproliferative properties (reviewed in

[13,14]). Inactivation of TOR elicits a variety of re-

sponses characteristic of nutrient-deprived cells [15]. In

yeast, TOR depletion results in growth arrest and phys-

iological changes that resemble the cell in stationary

phase. These changes include repression of genes neces-

sary for rapid growth and induction of a defined set of

stress responsive genes [14,16].The general stress transcription activators Msn2p and

Msn4p (Msn2/4p) are targets of both cAMP/PKA and

TOR signaling pathways. The regulation of Msn2/4p

activity involves the exportation of these activators from

the nucleus to cytoplasm [11,17,18]. Msn2/4p are zinc

finger proteins that bind to target promoters in the stress

transcription responsive element (STRE), whose consen-

sus sequence is AGGGG [19].We have previously shown that expression of mitoch-

ondrial thioredoxin peroxidase gene (PRX1) is regulated

by cAMP and Msn2/4p in a carbon source-dependent

way [20]. We observed that, in the absence of Msn2/4p

activators, glucose exhaustion did not lead to induction

of PRX1 expression. In addition, exogenously added

cAMP resulted in the loss of this induction, which was

attributed to the participation of PKA [20].The aim of the present work was to further character-

ize the regulation of PRX1 expression by glucose

exhaustion. In this regard, we identified here the posi-

tion of STRE element in the PRX1 promoter, which

indicated a direct effect of the Msn2/4p transcriptional

regulators. Furthermore, we demonstrated the involve-

Table 1

Yeast strains used in this work

Strain description Genotype

W303-1A MATa, ade2, can1, his3, leu

Dmsn2/4 W303-1A, msn2D3::HIS3, m

207 SPI MATa, leu2, ura3, trp1, ade

Dras1 or 208 SPI 207 SPI, ras1::LEU2

Dras2 or 209 SPI 207 SPI, ras2::LEU2

JK9-3da MATa, leu2-3, 112, ura3-52,

Dtor1 or MH349-3d JK9-3da, tor1::LEU2-4

Dtor2 or JK350-18a JK9-3da, ade2D, tor2::ADE

ment of other regulators (Ras2p and Tor1p) in the

mechanisms by which glucose represses PRX1

expression.

2. Materials and methods

2.1. Yeast growth conditions

Yeast cells (Table 1) were grown in YPD (1% yeast

extract, 2% peptone and 2% dextrose) or synthetic med-

ium (SD) (0.17%YNB, 0.5% ammonium sulfate plus 2%

glucose or 2% glycerol, without uracil – the auxotrophic

aminoacid to select the reporter plasmid). Plates weredone with SD plus 2% agar, 50 mM potassium phos-

phate buffer – pH 7.0 and 20 lg/ml of X-gal [25].

Except where indicated, chemicals were purchased

from Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).

2.2. Reporter plasmids construction

The reporter plasmid Yep357R [26] was digested withSalI and BamHI restriction enzymes, electrophoresed in

an agarose gel and then isolated (Wizard SV Gel Clean-

Up System – A9281 Promega – Madison, WI, USA).

PRX1 promoter containing 500 bp was amplified from

yeast genomic DNA using the following primers:

forward (5 0GGCGTCGACTTGCCAACCTCAAAGA-

AG3 0) and reverse (5 0GTCGTGGATCCCTACTAA-

ACATC3 0); the underlined bases correspond to SalIand BamHI restriction sites, respectively. The PCR

product was sequenced, digested with SalI and BamHI,

electrophoresed in an agarose gel and isolated. The frag-

ments were used in the ligation reaction and the final

plasmid Yep357R + pPRX1 was transformed in a

DH5a E.coli strain. The plasmid was obtained using

standard plasmid extraction technique [25].

The plasmid Yep357R + MutSTRE containing theSTRE modificated was obtained using the PCR product

described above as template. Site-directed mutagenesis

was carried out using an overlap extension PCR method

[27,28]. The primers described above were used as exter-

nal primers; two internal primers: MutSTREfwin (5 0-

CGTAAAGAAACAATGTTCGGATGTTGC3 0) and

Reference

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sn4::TRP1 [21]

8, can1, his3, gal2 [22]

[22]

[22]

rme1, trp1, his4, GAL +HMLa [23]

[23]

2-3/pJK5 [24]

G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228 223

MutSTRErevin (5 0GCAACATCCGGAACATTGTTT-

CTTTACG3 0) were designed to introduce substitutions

(AGGGG to ATGTT). The plasmid Yep357R +

pPRX1 – MutSTRE was constructed in the same way

as described for Yep357R + pPRX1.

2.3. b-galactosidase assay

Yeast strains were transformed using standard proto-

cols to S. cerevisiae [25]. Cells were harvested, washed

with phosphate buffered saline (PBS ) and disrupted

by vortexing with glass beads in 100 ll of Tris–HCl

0.25 M, pH 8.0. Different growth conditions were stud-

ied (indicated in the legend of the figures) and b-galac-tosidase activity was measured using b-Gal Assay Kit

(K1455-01 Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA). b-galactosidase activity was expressed as Unit (nmoles of

O-nitrophenyl-b-DD-galactoside hydrolyzed by b-galac-tosidase min1 lg of protein1). Protein concentrations

in cell extracts were determined using the Bradford pro-

tein assay kit (BioRad) and bovine serum albumin as

standard.Northern blot studies were carried out as described in

[20].

3. Results

3.1. Involvement of STRE on PRX1 activation

We have previously shown that the repressing effect

of glucose upon PRX1 expression is mediated by

Msn2/4p and cAMP [20]. In this work we sought to

characterize the mechanism by which Msn2/4p regulates

PRX1 expression. Our previous data did not establish if

the involvement of Msn2/4p transcription factors is di-

rect (through interaction with regulatory elements pre-

sent in PRX1 promoter) or indirect (throughregulation of mRNA stability or acting through another

regulatory factor).

To answer these questions, we transformed the

MSN2/MSN4 null strain with a plasmid containing a

reporter construction (Yep357R + pPRX1) with 500

bp of PRX1 promoter fused to b-galactosidase struc-

tural gene and compared the promoter activity in this

strain with the wild-type strain. As expected, activationof PRX1 promoter occurred in wild-type cells in the

absence of glucose (Fig. 1(A)). The depletion of

Msn2/4p caused the insensitivity of PRX1 promoter

to glucose absence, showing the importance of these

regulators to carbon-dependent activation of this pro-

moter (Fig. 1(A), compare glucose and glycerol plates

and Fig. 1(B)).

Msn2/4p recognize a highly conserved promoter ele-ment, called STRE (stress transcription responsive ele-

ment) whose consensus sequence is AGGGG [19]. The

PRX1 promoter possesses this sequence at position

116, 112 relative to start codon [20]. To experimen-

tally demonstrate that this sequence is, in fact, the STRE

in PRX1 promoter, we constructed a reporter plasmid

(Yep357R + pPRX1 – MutSTRE) in which the STRE

was replaced by the sequence ATGTT and transformedthe wild-type strain with it. As shown in Fig. 1, the sub-

stitution of STRE caused a high drop in PRX1 promoter

activity in respiratory carbon source, despite the pres-

ence of Msn2/4p in the cell. It is important to note that

the drop in PRX1 promoter activity was higher in the

absence of Msn2/4p activators than in the wild-type

strain containing mutated STRE (Fig. 1(B)). Mutation

of STRE could have caused just a decreased affinity be-tween Msn2/4p activators and the PRX1 promoter,

since the STRE was not deleted but mutated. Alterna-

tively, it is possible that part of Msn2/4p activation oc-

curs in a STRE-independent way. Depletion of Msn2/

4p and mutation of STRE decreased also PRX1 pro-

moter activity when cells were grown under glucose-con-

taining media (Fig. 1(B), inset). Again the effect was

higher in the strain with deletion of MSN2/4 genes thanin cells containing mutation in STRE. It is important to

emphasize here the difference in the y-axis scale referent

to data from cells grown under glycerol (Fig. 1(B)) and

under glucose (Fig. 1(B), inset). In summary, the results

presented so far indicated that Msn2/4p acted directly in

the PRX1 promoter through interaction with the STRE

element present at position 116, 112.

3.2. Characterization of glucose repressive pathway

To further characterize the regulatory mechanisms

involved in the repression of PRX1 by glucose, we ana-

lyzed the pattern of PRX1 expression and its promoter

activity in the RAS1 and RAS2 null strains. Even in

the presence of glucose, the absence of Ras2p caused a

high derepression effect on PRX1 promoter (Fig.2(A)). We observed also a minor effect on PRX1 expres-

sion in the absence of Ras1p, when compared with

Ras2p depletion effect (Fig. 2(B)). However, when cells

were grown in glycerol containing media, Ras1p showed

a more pronounced effect (data not shown). These data

suggest the involvement of the Ras proteins, especially

Ras2p, in the repression effect exerted by glucose on

PRX1 promoter. Ras1p seems to be an importantrepressor of PRX1 expression under respiratory growth

conditions.

As mentioned early, another important pathway to

sense nutrient availability (including glucose which is

the preferred carbon source of yeast) is through TOR

proteins. TOR proteins are kinases that promote vari-

ous levels of control, including stability and sorting of

nutrient permeases, translation initiation and also tran-scription regulation. It is well described that TOR pro-

teins inhibit Msn2/4p activity (reviewed in [13]). Thus,

Fig. 1. PRX1 promoter activity is dependent on Msn2/4p and STRE. PRX1 promoter activity was measured by reporter gene (b-galactosidase). Thestrains (wild-type = wt and Dmsn2/4) and reporter plasmids are indicated in the figure. (A) SD-URA plates containing glucose or glycerol as carbon

source were incubated for 36 h at 30 C. This figure is representative of three similar experiments. (B) b-galactosidase activity assay. The promoter

activity was measured from cells grown overnight on SD-URA glucose media, harvested and shifted to SD-URA glycerol/ethanol media for at least 8

h. The minor graph inserted in the figure represent the basal promoter activity in the same strains (glucose media). Standard deviation presented in

the graph was calculated from triplicates of three independent experiments.


we decided to test if TOR proteins also participate of the

signaling pathway that regulates PRX1 expression. A

significant increase in both PRX1 promoter activity

and mRNA level was observed in the absence of Tor1p

Fig. 2. PRX1 expression and promoter activity analyses on Rasp null strain

media (mid-logarithmic phase, OD600nm around 0.8) or from cells grown on

analyses from cells grown under glucose in the same conditions as described

was used as loading control and ACT1 probe was used as general transcrip

calculated from triplicates of three independent experiments.

(Fig. 3(A) and (B)), suggesting the involvement of this

protein in the regulation of PRX1 expression. Tor2p

was also tested, but its relation with PRX1 expression

regulation was not clear (data not shown).

s. (A) b-Galactosidase activity from cells grown on SD-URA glucose

SD-URA glycerol media (as described in Fig. 1). (B) Northern blotting

to A. This figure is representative of three similar experiments. rRNA

tion activity control. Standard deviation presented in the graphs was

Fig. 3. PRX1 expression and promoter activity analyses on Tor1p null strain. (A) b-Galactosidase activity from cells grown on SD-URA glucose

media (mid-logarithmic phase, OD600nm around 0.8) or from cells grown on SD-URA glycerol media (as described in Fig. 1). Standard deviation

presented in the graph was calculated from triplicates of three independent experiments. (B) Northern blotting analyses from cells grown under

glucose in the same conditions as described to A. rRNA was used as loading control and ACT1 probe was used as general transcription activity

control. This figure is representative of three similar experiments.


To establish the direct influence of the Ras2p and

Tor1p under the STRE controlled PRX1 expression,

we transformed null strains for these genes (RAS2 and

TOR1) and respective wild-type strains (207SPI and

JK9-3da) with the reporter plasmid containing the mu-

tated STRE (Yep357R + pPRX1 – MutSTRE). In both

cases, Ras2p and Tor1p only exerted their effect on

PRX1 promoter in the presence of the STRE (Figs.2(A) and 3(A)). The levels of b-galactosidase activities

in mutant and respective wild-type strains were very

similar (Figs. 2(A) and 3(A)). These data indicate that

Tor1p and Ras2p regulate pPRX1 induction by glucose

starvation through STRE.

We could expect that mutation of STRE in RAS2 or

TOR1 null strains would result in b-galactosidase activ-ity similar to the basal condition (wild-type strains withpPRX1). However, promoter activity in RAS2 or TOR1

null strains, transformed with Yep357R + pPRX1 –

MutSTRE, was considerably lower in comparison to

that observed in the wild-type transformed with

Yep357R + pPRX1 (Figs. 2(A) and 3(A)). This result

could be explained by the fact that several pathways reg-

ulate Msn2/4p activators, therefore the mutation of

STRE causes a drastic decrease in PRX1 promoteractivity probably because all these pathways would be

inactivated at once. Besides, our results also suggest

the involvement of Msn2/4p in the basal promoter activ-

ity of PRX1 (Fig. 1(B)). The levels of pPRX1 activation

by glucose absence varied considerably among the re-

sults showed in Figs. 1–3. These differences are probably

related to the fact that different genetic backgrounds

were utilized.

4. Discussion

Prx1p is an important antioxidant defense of yeast

for several reasons. First, Prx1p is located in mitochon-

dria, the main source of ROS. In addition, PRX1 is in-

cluded in a set of genes that participate in several stress

defenses that constitute ‘‘environmental stress response’’

[7]. The relevance of Prx1p can also be inferred by the

fact that deletion of its gene caused an increase in

GSH1 expression as a compensatory effect [3]. GSH1 en-

codes c-glutamylcysteine synthetase, the enzyme that

catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis,

one of the most abundant thiol present in the cell. Finally,thiols present in the yeast mitochondria from DPRX1cells are in a more oxidized condition [3]. All these find-

ings suggest the physiological importance of Prx1p in

the cellular redox homeostasis.

In S. cerevisiae, the main effect of glucose takes place

at the transcriptional level [6], therefore it is important

to study regulation of gene expression at this point. Sev-

eral pathways are involved in this regulation and herewe define two of them that participate in the synthesis

of PRX1 mRNA. Both pathways comprise Msn2/4p

transcription factors, which are considered as ‘‘stress

global activators’’, since their activities are triggered

by different kinds of stress, including osmotic shock,

heat shock, starvation, oxidative stress, among others.

Therefore, PRX1 expression was increased in most of

these stress conditions because of their dependence onMsn2/4p [7,19,29,30].

Msn2/4p are activators mainly regulated through

their cellular location. The phosphorylation of Msn2p

results in cytoplasmic retention of this transcription fac-

tor [11,17,18,21]. It was early observed that PKA pro-

tein phosphorylates Msn2/4p activators increasing

their nuclear export [11,17].

PKA activation is sensitive to the levels of glucose.The presence of glucose in the media leads to an acidifi-

cation of the cytosol, which results in the activation of

Ras proteins. Ras proteins are responsible for activating

adenylate cyclase, which increases the levels of cAMP.

High cAMP amounts result in the activation of PKA.

PKA is not only regulated by Ras–cAMP, but also by

TOR proteins. TOR regulates cell location of Tpk1p,

Fig. 4. Proposed model for the pattern of PRX1 transcriptional regulation. The symbols ! and a indicate activation/induction and repression/

inhibition, respectively. Adenine of start codon (ATG) is considered as position zero.


the catalytic subunit of PKA, in a manner similar to

cAMP increase [31].

Once in the cytosol, phophorylated Msn2/4p tran-scription factors bind to cytosolic protein anchor

Bmh2, forming a stable complex. TOR proteins have

been implicated in the stabilization of this complex

[32]. Therefore, there are several points of cross-talk in

the TOR and PKA pathways.

In addition, Mayordomo et al. [33] have shown a mu-

tant form of Snf1 kinase (which is permanently active)

that also lead to cytoplasmatic retention of Msn2p. Inthis case, cytoplasmatic retention only occurs in re-

sponse to carbon starvation. All these findings suggest

that several kinases (PKA, TOR and Snf1) are involved

in the regulation of Msn2/4p activity through cell loca-

tion. A summary of the complex network involved in

Msn2/4p regulation is presented in Fig. 4. Besides the

fact that Msn2/4p regulation is very complex, our data

presented here showed the involvement of Ras2p andTor1p in PRX1 expression.

Ras proteins have been implicated in the control of

yeast longevity [22,34]. Overexpression of RAS2 in yeast

led to a 30% increase in the life-span and delayed the

senescence-related augment in generation time observed

during yeast aging. However, deletion of RAS1 pro-

longed the life-span. These results suggest that Ras iso-

forms play different roles in the regulation of yeast aging[22]. Accordingly, deletion of RAS1 or RAS2 resulted in

a high induction of PRX1 expression in different growth

conditions (glycerol or glucose – media; Fig. 2) and data

not shown. Therefore, it is reasonable to think that

PRX1 and other antioxidant proteins regulated by

Ras2p could also be implicated in the regulation of yeast

longevity.TOR pathway is one of the most important nutrient

signaling mechanisms in yeast [8,13,35–37]. The ab-

sence of TOR proteins resulted in growth arrest, syn-

thesis of glycogen and trehalose, repression of

translation and general transcription [38]. In the pres-

ence of high amounts of nutrients, the waste of energy

with the production of various protective enzymes,

such as PRX1, might impair the rapid growth of yeast.Here, we have shown that Tor1p inhibits the PRX1

expression (Fig. 3). However, it is known that TOR-de-

pendent pathway is involved not only in the response

of yeast to carbon starvation, but also to nitrogen star-

vation [13,32]. Therefore, it is possible that Tor1p can

also negatively regulate PRX1 expression in response

to nitrogen.

The results presented here provided a very detaileddescription of the mechanisms involved in the regulation

of PRX1 expression (Fig. 4). In addition to PRX1, the

expression of other antioxidant genes, such as TSA2,

SOD2 and CTT1 are also regulated by Msn2/4 proteins

[21,28,30]. These antioxidant proteins might be members

of the same regulon stimulated by common stressful

conditions. The findings described here can be useful

in the study of higher eukaryotes, since peroxiredoxinsare highly conserved enzymes [39]. In fact, mammalian

thioredoxin peroxidases have been implicated in several

signaling process important to homeostasis and mainte-

nance of the cell stability [40–42].


Acknowledgments

We thank Victor Genu, Marcos Antonio Oliveira and

Walter S. Sheppard for revising the paper. We are in

debt with Ana Paula Dias Demasi that provide us

ACT1 probe. We especially thank Emmanuelle Boy-Marcotte, James C. Jiang and S. Michal Jazwinski,

and Michael N. Hall for kindly providing us with

DMSN2/4; DRAS1 and DRAS2; and DTOR1 and

DTOR2, respectively. We thank also Fundacao de Am-

paro a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) and

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientıfico e

Tecnologico (CNPq) for financial support.

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Anexo III

Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24

ABBwww.elsevier.com/locate/yabbi

Glutathione and thioredoxin peroxidases mediate susceptibilityof yeast mitochondria to Ca2þ-induced damage

Gisele Monteiro,a Alicia J. Kowaltowski,b Mario H. Barros,b and Luis E.S. Nettoa,*

a Departamento de Biologia—Genetica, Instituto de Biociencias, Universidade de S~ao Paulo, Rua do Mat~ao 277, CEP05508-900, S~ao Paulo, SP, Brazilb Departamento de Bioquımica, Instituto de Quımica, Universidade de S~ao Paulo, Brazil

Received 29 December 2003, and in revised form 27 February 2004

Abstract

The effect of thioredoxin peroxidases on the protection of Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane permeabilization was

studied in the yeast Saccharomyces cerevisiae using null mutants for these genes. Since deletion of a gene can promote several other

effects besides the absence of the respective protein, characterizations of the redox state of the mutant strains were performed. Whole

cellular extracts from all the mutants presented lower capacity to decompose H2O2 and lower GSH/GSSG ratios, as expected for

strains deficient for peroxide-removing enzymes. Interestingly, when glutathione contents in mitochondrial pools were analyzed, all

mutants presented lower GSH/GSSG ratios than wild-type cells, with the exception of DcTPxI strain (cells in which cytosolic

thioredoxin peroxidase I gene was disrupted) that presented higher GSH/GSSG ratio. Low GSH/GSSG ratios in mitochondria

increased the susceptibility of yeast to damage induced by Ca2þ as determined by membrane potential and oxygen consumption

experiments. However, H2O2 removal activity appears also to be important for mitochondria protection against permeabilization

because exogenously added catalase strongly inhibited loss of mitochondrial potential. Moreover, exogenously added recombinant

peroxiredoxins prevented inner mitochondrial membrane permeabilization. GSH/GSSG ratios decreased after Ca2þ addition,

suggesting that reactive oxygen species (ROS) probably mediate this process. Taken together our results indicate that both mito-

chondrial glutathione pools and peroxide-removing enzymes are key components for the protection of yeast mitochondria against

Ca2þ-induced damage.

2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: Calcium; Oxidative stress; Mitochondria; Thioredoxin peroxidase; Yeast; Thiol; Glutathione

Sulfhydryl groups are important components of cel-lular defense against oxidative stress and for the main-

tenance of the redox homeostasis of cells (review in [1]).

In eukaryotes, the major thiol compound is the peptide

glutathione (GSH)1 [2], whereas thioredoxin and glut-

aredoxin are important protein sources of sulfhydryl

* Corresponding author. Fax: +55-11-30917553.

E-mail address: [email protected] (L.E.S. Netto).1 Abbreviations used: cTPxI, cytosolic thioredoxin peroxidase I

protein also known as Tsa1p; DTNB, 5-50-dithiobis(2-nitrobenzoic

acid); TSA1, cytosolic thioredoxin peroxidase I gene (ORF:

YML028w); cTPxII, cytosolic thioredoxin peroxidase II protein also

known as Tsa2p; TSA2, cytosolic thioredoxin peroxidase II gene

(ORF: YDR453c); cTPxIII, cytosolic thioredoxin peroxidase III also

known as Ahp1, type II TPx or TSA II (ORF: YLR109w); mTPxI

mitochondrial thioredoxin peroxidase I also known as Prx1 (ORF:

YBL064c); nTPxI, nuclear thioredoxin peroxidase I protein also known

0003-9861/$ - see front matter 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

doi:10.1016/j.abb.2004.03.005

groups in the cell. Both glutathione and thioredoxin canfunction as electron donors for thiol-dependent peroxi-

dases. In the case of Saccharomyces cerevisiae, at least

three glutathione phospholipid peroxidases and five

thioredoxin peroxidase isoforms are expressed [3–5].

Glutathione and thioredoxin systems are closely linked

[1]. In fact, disruption of CTPXI gene (also named

TSA1) leads to increase in de novo synthesis and recy-

cling of glutathione [3].

as DOT5 (Disruptor Of Telomeric silencing) (ORF: YIL010w), GSH,

glutathione; GSSG, oxidized glutathione; GSH/GSSG, ratio between

reduced and oxidized form of glutathione; RNS, reactive nitrogen

species; ROS, reactive oxygen species; TNB, 2-nitro-5-thiobenzoic-

acid; TRR1, thioredoxin reductase I gene (ORF: YDR353w); Trr1,

thioredoxin reductase I protein; TRX2, thioredoxin 2 gene (ORF:

YGR209c); Trx2, thioredoxin 2 protein.

mail to: [email protected]

G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 15

Among the five yeast thioredoxin peroxidases, cyto-solic thioredoxin peroxidase I (cTPxI) is the most

studied. It is very abundant, even under basal conditions

[6]. As expected from its enzymatic activity, deletion of

the TSA1 gene (that codifies for cTPxI protein) slightly

increases the sensitivity of cells to peroxides [5,7], espe-

cially when mitochondria are not functional [8]. Inter-

estingly, besides its antioxidant role, cTPxI is also

involved in the regulation of the expression and activityof several other genes such as GSH1 (c-glutamylcysteine

synthetase), GPX2 (glutathione peroxidase), GLR1

(glutathione reductase), TRX2 (thioredoxin), TRR1

(thioredoxin reductase), and YAP1 (transcriptional

regulator) [3,9].

cTPxI belongs to a family of proteins named perox-

iredoxins [10]. The other yeast peroxiredoxins are less

studied. Cytosolic thioredoxin peroxidase II (cTPxII)shares 86% of identity with cTPxI and therefore they are

expected to behave similarly. However, the peroxidase

activity of cTPxI is about sixfold higher than the activity

of cTPxII [5]. On the other hand, in vivo studies indi-

cated that cTPxI and cTPxII are equally important in

the defense of yeast against reactive oxygen species

(ROS) and reactive nitrogen species (RNS) [11]. Con-

trary to cTPxI, cTPxII expression level is undetectableunder basal conditions, but is highly inducible by per-

oxides [12]. The only mitochondrial peroxiredoxin in

yeast, named mitochondrial thioredoxin peroxidase I

(mTPxI), shares about 30% of identity with the other

two peroxidases and has only one cysteine involved in

the catalytic cycle [13]. The expression level of mTPxI is

very low in fermentative supporting media and increases

about tenfold in respiratory supporting media [14].There are two other peroxiredoxin proteins in S. ce-

revisiae: cytosolic thioredoxin peroxidase III (cTPxIII)

and nuclear thioredoxin peroxidase I (nTPxI). These

two proteins also possess thioredoxin-dependent per-

oxidase activity, but they have very low similarity with

cTPxI, cTPxII, and mTPxI [5]. cTPxIII is abundant as

cTPxI, but it is at least one order of magnitude more

efficient in the removal of organic peroxide than in thedecomposition of H2O2 (because of this, cTPxIII is also

named alkyl hydroperoxidase—AhpI) [15]. nTPxI also

has higher peroxidase activity towards alkyl peroxides

and is preferentially expressed during the stationary

phase [16].

Besides the levels of antioxidant proteins, mitochon-

drial activity is also important for the maintenance of

redox balance of eukaryotic cells since this organelle is aconstant source of free radicals. Mitochondrial activity

can be impaired by processes such as oxidative stress

and increases in the content of cytosolic Ca2þ. In

mammalian mitochondria, Ca2þ induces permeabiliza-

tion of the inner mitochondrial membrane through a

process known as mitochondrial permeability transition

(MPT) [17,18], a phenomenon that has been implicated

in processes such as cell injury and death [19]. MPTpromotes swelling, a loss of the inner mitochondrial

membrane potential, and the ability to produce ATP

among other factors. Another important aspect related

to MPT is that oxidation of thiol groups in proteins

present in the inner mitochondrial membrane has been

implicated as a major cause of this permeabilization

[20,21]. Thiol oxidation causes protein cross-linkage,

formation of large protein aggregates, and opening of anon-selective pore in the inner mitochondrial membrane

[17,22,23].

Because thiols are important in both peroxiredoxin

enzymatic activity and mitochondrial integrity, we are

interested in the role of these proteins in the physiology

of this organelle. We have shown before that yeast

cTPxI and catalase cooperate in the protection of

mammalian mitochondria against MPT induced byCa2þ and oxidant agents [18]. Interestingly, cTPxI seems

to use mitochondrial thiols as electron donors to de-

compose peroxides [18]. Similarly, endogenous cTPxI

and catalase also protect yeast mitochondria from Ca2þ-promoted membrane permeabilization [24]. The experi-

ments reported in this paper were designed to determine

the relative importance of different thioredoxin peroxi-

dase isoforms in the maintenance of mitochondrial in-tegrity and function. Emphasis was given to cTPxII and

mTPxI since these proteins share high similarity with

cTPxI. The possible effect of cTPxIII was also investi-

gated, but because mitochondria from the DcTPxIIIstrain were not more sensitive to Ca 2þ-induced injury

than wild-type mitochondria, cTPxIII was not further

considered. nTPxI was not studied here because it is

located farther away from mitochondria (separated bytwo membranes: nuclear and outer mitochondrial) and

because this protein has low specific activity [5].

Interestingly, we also show in this report that deletion

of genes encoding peroxiredoxins altered the metabo-

lism of glutathione, which is in agreement with the close

relationship between glutathione and thioredoxin sys-

tems [1,3].

Experimental procedures

Yeast strains and growth conditions

Yeast strains used here were obtained from EURO-

SCARF:

Wild type (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0; met15D0;ura3D0); DmTPxI (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0;met15D0; ura3D0;YBL064c::kanMX4);DcTPxI (BY4742;Mata; his3D1; leu2D0; lys2D0; ura3D0; YML028w::

kanMX4); DcTPxII (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0;met15D0; ura3D0; YDR453c::kanMX4); and DcTPxIII(BY4741; Mata; his3D1; leu2D0; met15D0; ura3D0;YLR109w::kanMX4).

16 G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24

Yeast was pre-inoculated in 10ml YPGAL (2% ga-lactose, 2% peptone, and 1% yeast extract) for 24 h, at

30 C, with 250 rpm shaking. One milliliter of the culture

was then inoculated in 150ml of fresh media and incu-

bated overnight under the same conditions. When cells

were grown in YEPG (2% glycerol, 2% ethanol, 2%

peptone, and 1% yeast extract), the pre-inoculated cul-

ture was incubated at 30 C, 250 rpm for 48 h and the

inoculated culture was incubated for 36 h. Yeast catalaseT (cytosolic) and/or catalase A (peroxisomal) were spe-

cifically inhibited in the wild-type strain by addition of

3-amino-1,2,4-triazole (ATZ—5mM) in the pre-inocu-

lation and inoculation media. After this procedure, cells

reached OD600 nm around 6.0, therefore they were con-

sidered to be in stationary growth phase.

Determination of protein concentration

Protein concentration was determined with the

Bradford reagent from BIORAD, using bovine serum

albumin as a standard.

H2O2 removal activity

Total protein extracts from yeast cells were obtainedby lysing spheroblasts previously digested with lyticase

(Sigma—Lyticase from Arthrobacter luteus—L4025),

with a buffer containing 10mM Tris–HCl, pH 7.5, and

0.5mM EDTA (TE buffer). Fluorimetric assays were

conducted using the spheroblast samples to determine

total H2O2 removal activity. After incubating 0.5mg of

recently (<3 h) lysed spheroblast protein in 100 ll TEbuffer for 3min with 2mM H2O2, a 1 ll aliquot wastaken and diluted in 2ml of suspension buffer with

50 lM Amplex Red and 1.0U/ml horseradish peroxi-

dase [25]. A single reading was taken at 563 nm excita-

tion and 587 nm emission.

Preparation of mitochondrially-enriched fractions

Yeast cultures were harvested and washed with 30mlof 1.2M sorbitol. Cells were then incubated with 3ml/g

of digestion buffer (1.2M sorbitol, 75mM sodium

phosphate, 1mM EDTA, 0.01 volume b-mercap-

toethanol, and 0.4mg/ml lyticase) and after 2 h of in-

cubation at 37 C, the obtained spheroblasts were

harvested and washed twice with 30ml of 1.2M sorbitol.

Pellets were then suspended in 3ml/g lyses buffer (0.5M

sorbitol, 10mM Tris–HCl, pH 7.5, and 1mM EDTA)and homogenized with a potter. The suspension was

harvested twice (3500g, 10min, 4 C) to precipitate the

cellular debris and the supernatant was then harvested

(14,000 g, 10min, 4 C) to obtain the mitochondrially

enriched fraction. This fraction was washed once with

10ml of lyses buffer and the final fraction was suspended

in 10mg/ml protein in lyses buffer. The procedure de-

scribed here is the same as that developed by Faye et al.[26], except for the fact that glusulase was replaced by

lyticase. Quality of our mitochondrial preparations was

verified by determinations of respiratory control ratio.

Besides, the integrity of our mitochondrial preparations

could also be demonstrated by the fact that they can

mount a potential in the inner membrane and because

they consume oxygen.

Measurement of mitochondrial matrix Ca2þ content

The procedure was carried out as described by Ko-

waltowski et al. [27], with some modifications. Mitoc-

hondrially enriched fractions (650 lg/ml) were loaded

with the fluorescent Ca2þ indicator fura-2/AM (10 lM—

Sigma) in buffer containing 240mM sucrose, 10mM

Hepes buffer, pH 7.4, 0.1mM EGTA, and 1mg/ml bo-vine serum albumin, for 30min at 37 C. The suspensionwas diluted 10-fold and washed twice at 4 C to elimi-

nate free extramitochondrial fura-2/AM. Fluorescence

emission at 510 nm was monitored with excitations be-

tween 300 and 400 nm, and Ca2þ uptake was determined

ratiometrically as indicated by the supplier. Maximal

and minimal intramitochondrial levels were measured in

each cell type by treating samples with 10 lM ionomycinplus Ca2þ and with 1mM EGTA.

Measurement of thiol content

Fresh mitochondrially enriched fractions were solu-

bilized with 1% SDS in a buffer containing 87mM Tris

and 4mM EDTA, pH 8.1, in the presence of 520 lM 5-

50-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), (DTNB—also knownas Ellmans reagent). These suspensions were homoge-

nized and incubated for 30min at room temperature in

the dark. Thiol content was determined spectrophoto-

metrically at 412 nm and calculated taking into account

that 2-nitro-5-thiobenzoic-acid (TNB) possesses

e412 nm ¼ 13,600M1 cm1 [28].

Determination of GSH and GSSG

Yeast cell or mitochondrially-enriched fractions were

disrupted in 1 volume of glass beads and 2 volumes of

3.5% sulfosalicylic acid. The suspension was vortexed

for 20min at 4 C in a multifold vortex and harvested at

13,000 rpm. This procedure was repeated twice and the

supernatants were combined. Total glutathione as well

as GSSG were assayed as previously described [29].Briefly, total glutathione was determined by reaction

with DTNB (76 lM) in the presence of glutathione re-

ductase (0.12U/ml) and NADPH (0.27mM). For GSSG

determination, samples were incubated for 1 h with N-

ethylmaleimide (NEM—5mM) after adjusting the pH to

7 with NaOH. GSH concentration was determined by

the difference between total glutathione and GSSG.


Samples were normalized by mitochondrial proteinconcentration (for analyses of the mitochondrially en-

riched fractions) or by weight of cell pellet (for analyses

of the whole cell).

Mitochondrial membrane potential (DW) measurements

Mitochondrial DW was determined through fluores-

cence changes of safranin O (5 lM), recorded on aHitachi F-4010 fluorescence spectrophotometer (Hit-

achi, Tokyo, Japan) operating at excitation and emis-

sion wavelengths of 495 and 586 nm, with a slit width

of 5 nm [30]. The fluorescence data were transformed

into DW using a Kþ distribution curve exactly as de-

scribed by Kowaltowski et al. [31]. Mitochondrially-

enriched fractions were incubated in buffer 1 (0.25M

sucrose, 10mM Hepes, pH 7.5, and 2mM Pi) con-taining 2.5mM ethanol, 5mM glutamate, and 2.5mM

succinate. DW was continuously monitored at 30 Cwith stirring. In the experiments where exogenous

catalase was added, the enzyme was obtained from

Sigma (C9322).

Western and Northern blot analyses

Immunoblot analysis was performed using rabbit

polyclonal antibodies against cTPxI. Transfer of protein

from 12% SDS–PAGE gels to nitrocellulose and pro-

cessing of nitrocellulose blots were carried out in the

NOVEX system. The HRP-luminol based system from

ECL (RPN 2108—Amersham–Pharmacia Biotech) was

used to detect cTPxI bands. Northern blot studies were

carried out exactly as described by Monteiro et al. [14].The GSH1 fragment was obtained from yeast genomic

DNA using the specific primers forward (50-CGCGGATCCCATATGGGACTCTTAGCTTTGGG-30)and reverse (50-CGCAAGCTTGGATCCTTAACATT

TGCTTTCTATTGA-30). The PCR product was puri-

fied from agarose gel (0.7%) and sequenced.

Oxygen consumption measurements

Oxygen concentration was measured using a Clarke-

type electrode in a glass cuvette equipped with magnetic

stirring. The mitochondrially enriched fractions were

incubated in buffer 2 in the presence of 2.5mM ethanol,

5mM glutamate, and 2.5mM succinate and in the ab-

sence or in the presence of 500 lM Ca2þ.

Expression and purification of recombinant thioredoxin

peroxidases

Recombinant cTPxI, which possesses a N-terminal

His-tag, was expressed in Escherichia coli BL21(DE3)

strain transformed with pET15b-cTPxI plasmid (CTPXI

gene was cloned into NdeI and BamHI restriction sites

of expression vector pET15b from Novagen). Re-combinant mTPxI was expressed in the same E. coli

BL21(DE3) strain from a construct kindly provided by

Spyrou and co-workers [13]. In summary, MTPXI gene

without the first 20 codons (supposedly the mitochon-

drial target peptide) and with a substitution of codon

corresponding to Cys-38 for a codon encoding for Ser-

38 was cloned into NdeI and BamHI restriction sites of

pET-15b (Novagen). Therefore, the protein expressed inthis way also possesses a N-terminal His-tag. Finally,

the entire CTPXII gene was cloned into NdeI and

BamHI restriction sites of expression vector pPROEX

(Gibco) E. coli DH5a strain was utilized as the host for

expression.

Cells were cultured (50ml) overnight in LB+ampi-

cillin (100 lg/ml) medium, transferred to 1L of fresh

LB+ampicillin medium, and cultured further until theOD600 reached 0.6–0.8. IPTG was then added to a final

concentration of 1mM. After 3 h of incubation, cells

were harvested by centrifugation. The pellet was washed

and suspended in the start buffer: 20mM phosphate

buffer, pH 7.4 (for cTPxI and cTPxII) or 20mM Tris–

HCl buffer, pH 8.0 (for mTPxI). Two cycles of 15 s of

sonication (25% amplitude) following 30 s over ice were

applied to cell suspension. Cell extracts were kept on iceduring 1% streptomycin sulfate treatment (20min) and

the suspension was centrifuged at 31,500g for 30min to

remove nucleic acid precipitates. Finally, extracts were

applied to a nickel-affinity column (Hi-trap from

Amersham–Pharmacia Biotech). The conditions for

protein purification were optimized using the gradient

procedure for imidazole concentration described by the

manufacturer.

Results

Redox state of yeast mutants for thioredoxin peroxidase

genes

Phenotypic analysis of null mutants is sometimesdifficult because compensatory effects may occur. As an

example, the deletion of CTPXI gene in S. cerevisiae

leads to an increase in the levels of glutathione-depen-

dent proteins [3]. Therefore, a characterization of the

redox state of yeast mutants for thioredoxin peroxidase

was performed. Initially, the total H2O2 removal activity

of yeast cells was analyzed. In all cases, the consumption

of H2O2 dropped significantly in the mutant cells rela-tive to control, and cTPxI mutant cells (DcTPxI cells)

showed the most pronounced effect (Fig. 1A). These

results were expected since cTPxI is very abundant,

representing almost 1% of total cytosolic protein [6].

H2O2 removal in yeast extracts in which catalase activity

was inhibited by 3-amino-1,2,4-triazole (ATZ) also

dropped significantly (Fig. 1A).

Fig. 1. (A) H2O2 removal activity measurement in whole cells. H2O2

removal activity in the different cell homogenates (wt +ATZ ¼ wild-

type cells treated with catalase inhibitor ATZ) was determined as de-

scribed in Experimental procedures. The graph represents the average

and standard deviation (SD) from three independent experiments.

The value 100% represents total H2O2 (2mM) removal during 3min.

The differences between mutants and wild type were statistically sig-

nificant for p values 6 0.01 (determined from paired t test) as indicatedby *. (B) GSH1 expression. Northern blot analyses were carried out in

cells grown in galactose-containing media, until their density reached

around 4.0 (OD600nm). The graph represents the expression level

quantified by dosimetry using Image Master equipment of Amersham–

Pharmacia Biotech. Results are representative data of two similar ex-

periments. Wild-type level was considered 100% of GSH1 expression.

Fig. 2. Total mitochondrial thiol (protein and non-protein) content.

Thiol content was determined in mitochondrially-enriched fractions,

which were diluted to a concentration equal to 0.5mg protein/ml of a

solution described in Experimental procedures. The differences in total

thiol content between DcTPxII and DmTPxI relative to wild-type cells

were statistically significant for p values 6 0.01 (determined from

paired t test) as indicated by *. The difference between DcTPxI and

wild-type cells was not statistically significant for p values 6 0.01

(determined from paired t test).


To further analyze the redox state of the mutants,GSH/GSSG ratios were determined. All mutants had

lower GSH/GSSG ratios than wild-type (wt) cells, al-

though mTPxI mutant cells (DmTPxI cells) had lower

decrease than the other two strains (Table 1). This effect

can be attributed to oxidation of GSH, since the con-

tents of total glutathione and GSH were higher in

the mutant strains (Table 1). In agreement with the

higher content of GSH that we observed in all mutants(Table 1), an increase in the expression of GSH1 gene

was also detected in these cells (Fig. 1B). Therefore,

considering H2O2 removal activity, the GSH/GSSG ra-

tios, and GSH1 expression in whole cell, all the mutants

appeared to be in more oxidizing conditions than the

wild-type strain.

Table 1

Measurement of GSH and GSSG in whole cells depleted of thioredoxin per

Cell strain Total glutathione (pmol/g

of cell pellet)SD

GSSG (pm

of cell pel

WT 5840 275 30 1.1

DmTPxI 8540 20 50 1

DcTPxI 9230 20 73 0.5

DcTPxII 8400 60 67 8

Standard deviations (SD) were calculated from three values obtained from

GSSG (from Sigma). GSH values were obtained by subtracting GSSG conc*Denotes that the differences between mutant and wild-type strains were

test).

Next, the redox state of mitochondria was evaluated,

since this organelle is the main endogenous source of

free radicals in eukaryotic cells. Initially, the total

sulfhydryl content (protein and non-protein) of mitoc-

hondrially-enriched fractions was measured. Interest-

ingly, only mitochondria from DcTPxI cells did not

show a decrease in reduced thiol content in comparisonwith wild type, whereas DmTPxI and DcTPxII had

about the same amount of sulfhydryl groups, about 20%

less than controls (Fig. 2). To further understand this

phenomenon, levels of GSH and GSSG were also de-

termined in these mitochondrially-enriched fractions. As

expected from the results of Fig. 2, only mitochondria

from DcTPxI did not show decrease in the GSH/GSSG

ratio in comparison with wild type (Table 2). In fact,mitochondria from DcTPxI cells had higher GSH/GSSG

ratios compared to controls, which is in agreement with

the suggestion that glutathione system works as a

backup for cTPxI [3]. This increase in GSH/GSSG ratios

appears to be related to an enhancement of glutathione

recycling, because GSSG contents in mitochondria from

oxidases

ol/g

let) SD

GSH (pmol/g

of cell pellet)SD

GSH/GSSG

5810 280 194 13.4

8490 10 170 4.0

9160 20 126 1.1

8330 50 124 7.3

two independent experiments. Calibration was done with commercial

entration from total glutathione.

statistically significant for p values 6 0.01 (determined from paired t

Table 2

Measurement of mitochondrial pools of GSH and GSSG

Mitochondrial

samples

Total glutathione (pmol/mg

of protein)SD

GSSG (pmol/mg

of protein)SD

GSH (pmol/mg

of protein)SD

GSH/GSSG

WT 870 24 20 3 850 30 43 7.2

DmTPxI 1140 34 56 8 1084 42 19 3.32

DcTPxI 870 26 12 2 858 28 72 1.42

DcTPxII 660 12 46 3 614 15 13 1.06

Standard deviations (SD) were calculated from three values obtained from two independent experiments. Calibration was done with commercial

GSSG (from Sigma). GSH values were obtained by subtracting GSSG concentration from total glutathione.*Denotes that the differences between mutant and wild-type strains were statistically significant for p values 6 0.01 (determined from paired

t test).


DcTPxI cells were approximately half the GSSG content

in mitochondria from wild-type (Table 2).

Contrary to DcTPxI, mitochondria from DcTPxIIcells presented very low GSH/GSSG ratios (Table 2),

which was due to both low levels of total glutathione

and high amounts of GSSG. These results can account,at least in part, for the reduced amount of total sulf-

hydryl groups in their mitochondria (Fig. 2). In DmTPxI

mitochondria, the amounts of total glutathione and

GSH measured were slightly increased in comparison

with wild-type (Table 2). Therefore, the reduced amount

of sulfhydryl groups observed in mitochondria from

these mutants (Fig. 2) must reflect a lower content of

thiols from proteins. DmTPxI mitochondria also showedan increase in the levels of GSSG, indicating that the

recycling of glutathione is not functioning properly in

these organelle (Table 2). In any case, the very low GSH/

GSSG ratios observed for DcTPxII and DmTPxI indi-

cated that the mitochondria of these strains were under

more oxidizing conditions than DcTPxI and wild-type

mitochondria. It is important to note that although

GSSG values were always very low in comparison withtotal glutathione, we confirmed the results through three

independent experiments performed in triplicate.

Moreover, the differences between wild-type and mu-

tants were statistically significant with p value 6 0.01.

In summary, our data indicated that DcTPxII and

DmTPxI cells are under a more oxidizing condition than

wild-type cells. In the case of DcTPxI, whole cells ap-

peared to be in a more oxidizing condition, whereas theirmitochondria are at least equally reduced as wild-type

mitochondria. As described below, the amount of thiols

measured in these mitochondrially-enriched fractions

and peroxidase activity seem to be important factors

involved in yeast susceptibility to Ca2þ-induced damage.

Mitochondrial susceptibility to stress induced by calcium

After a characterization of the redox state of whole

cells and their mitochondria, the sensitivity of this or-

ganelle to inner membrane permeabilization by Ca2þ

was studied. We have shown before that cells deficient in

cTPxI and catalase are more prone to loss of mito-

chondrial function by Ca2þ [24]. Initially, the ability of

mitochondria from wild-type, ATZ-treated wild-type,

and mutant cells to keep inner membrane potential was

analyzed from mitochondrially-enriched fractions of

cells grown in galactose-containing media. As described

previously, mitochondria from wild-type cells were re-sistant to Ca2þ-induction of inner membrane permea-

bilization [24,32,33] whereas mitochondria from DcTPxIcells and from ATZ-treated cells did suffer loss of po-

tential [24]. Once again, the loss of potential was more

pronounced in cells depleted of catalase than in DcTPxIcells (Fig. 3). Now, we describe for the first time that

cells deficient in mTPxI and cTPxII were also susceptible

to Ca2þ-induced permeabilization (Fig. 3). As a matterof fact, DmTPxI and DcTPxII cells are even more sen-

sitive to loss of potential than DcTPxI cells, which ap-

pears to be related to the low content of thiol groups in

the mitochondria of these cells (Fig. 2, Table 2). Inter-

estingly, cells with disruption in the gene for cytosolic

thioredoxin peroxidase III (DcTPxIII cells) did not

present a Ca2þ-induced drop in DW and behaved similar

to wild-type mitochondria (data not shown). It is im-portant to note that mitochondrially-enriched fractions

obtained from all yeast strains analyzed here were ca-

pable to uptake the same amount of Ca2þ, reaching

intramitochondrial concentrations of approximately

400 lM (as measured using mitochondrial loaded with

fura-2/AM [27], data not shown).

As described before, the experiments shown in Fig. 3

were performed in mitochondrially-enriched fractionsobtained from cells grown in galactose. Galactose, like

glucose, is a fermentative supporting carbon source in-

volved in the signaling of several biochemical pathways

[34,35] and was used in most of the experiments of this

work. When the yeast S. cerevisiae is grown in the

presence of high levels of glucose, mitochondrial bio-

genesis and the expression of several antioxidant pro-

teins, including some isoforms of thioredoxinperoxidases, is inhibited [8,14,34]. These processes are

collectively called catabolite repression and involve

several signaling pathways [35,36]. Galactose also re-

presses several processes, but not mitochondrial prolif-

eration [34,37].

Fig. 3. Effect of thioredoxin peroxidase and catalase depletion on

mitochondrial membrane potential (DW) decrease promoted by Ca2þ.DW was measured in mitochondrial-enriched fractions whose protein

concentration was equal to 0.5mg/ml. (A) A representative DW curve

obtained from wild type and mTPxI null strain in the presence of Ca2þ

(500 lM), whose addition is indicated. (B) Loss of potential in wild

type (wt), in the null strains for mTPxI, cTPxI, cTPxII or in catalase-

depleted cells (treated with ATZ). The values presented are averages

and standard deviation from three independent experiments and rep-

resent the loss in DW caused by Ca2þ addition (500 lM). The values

were obtained by subtracting DW in the absence of Ca2þ from the final

DW in the presence of Ca2þ. The differences between mutants and wild-

type cells were statistically significant for p values 6 0.01 (determined

from paired t test) as indicated by *.

Fig. 4. Effect of thioredoxin peroxidase depletion on DW from cells

grown in respiratory conditions. The conditions in this experiment

were the same as those described for Fig. 3, except that mitochondrial-

enriched fractions were extracted from cells grown in glycerol/ethanol-

containing media. The differences between mutants and wild type were

statistically significant for p values 6 0.01 (1) (determined from paired

t test) as indicated by *.


Catalase T (cytosolic) and/or catalase A (peroxi-somal) protected yeast mitochondria from Ca2þ-inducedinjury (Fig. 3 and [24]), in spite of the fact that they

suffer catabolite repression [38]. It is important to ob-

serve, however, that yeast have catalase activity in cells

cultured in media containing high levels of glucose [39],

indicating that catabolite repression is not total in fer-

mentative conditions.

In the specific case of mTPxI expression, galactosepossesses a repressing effect that is similar to that ex-

erted by glucose [14]. Therefore, the effect of thioredoxin

peroxidase gene disruptions when cells were cultured in

glycerol/ethanol media (which does not support fer-

mentation and has no repressor effect) was also ana-

lyzed. In this case, the loss of potential was more intense

in DmTPxI cells (Fig. 4), which can be related with the

cellular location and abundance of mTPxI in respiratoryadapted yeast [14].

The loss of membrane potential for DcTPxI mito-

chondria was also more intense in glycerol/ethanol than

in galactose containing media (Figs. 3 and 4), which

again is correlated with the fact that cTPxI is slightly

more abundant in respiratory conditions [8]. It is

important to note that cTPxI was present in the mitoc-

hondrially-enriched fractions analyzed here, as deter-mined by Western blot analysis of cTPxI in different cell

fractions (data not shown). Finally, in the case of

DcTPxII cells, the loss of potential was about the same

in both growth conditions (galactose or glycerol/ethanol

as carbon sources) (Figs. 3 and 4). In this case, loss of

membrane potential is probably related to other factors

than cTPxII abundance because this protein has very

low expression levels under basal conditions [12].

Involvement of ROS in yeast inner membrane mitochon-

drial permeability

ROS are involved in the MPT process in mammalian

mitochondria [18] and in the Ca2þ-induced permeabili-

zation of yeast mitochondria from cells deficient in cTPxI

and catalase [24]. In agreement with these previousobservations, addition of catalase to themitochondrially-

enriched fractions strongly inhibited the loss of mem-

brane potential induced by Ca2þ (Fig. 5), indicating that

in all cases, H2O2 is involved in the loss of mitochondrial

function. Moreover, mitochondrial GSH/GSSG ratios

decreased sharply after Ca2þ exposure, which indicates

that these mitochondria suffered oxidative stress after the

addition of this cation (Fig. 6). In wild-type mitochond-rially-enriched fractions, the GSH/GSSG ratio was also

reduced during Ca2þ exposure, but to a level that was

significantly higher than GSH/GSSG ratios of mutant

cells. Therefore, the drop in GSH/GSSG ratio in wild-

type mitochondria appears to be not enough to promote

inner membrane permeabilization (Fig. 3).

As shown in Table 2, mitochondria from DmTPxI

and DcTPxII presented low basal GSH/GSSG ratios in

Fig. 5. Inhibitory effect of exogenously added catalase on the loss of

DW promoted by Ca2þ. Bovine catalase was added to the reaction

medium at final concentration of 2lM (gray bars). Empty bars rep-

resent samples with no catalase addition. Mitochondrially-enriched

fractions were obtained from yeast that were grown on galactose-

containing media. The conditions of this experiment were the same as

those described for Fig. 3. Results are representative of series of three

similar experiments.


the absence of Ca2þ, indicating that they are in a chronicoxidative state and decreased even more after Ca2þ

addition. These data suggest that redox status of yeast

mitochondria seems to be a very important factor for

the sensitivity of yeast mitochondria to Ca2þ, althoughother systems, such as peroxide-removing enzymes or

other GSH pools, should cooperate in this process.

Besides loss of membrane potential and decrease in

GSH/GSSG ratios, mitochondria from DmTPxI and

Fig. 6. Mitochondrial GSH/GSSG ratios after Ca2þ treatment. Mito-

chondrial-enriched fractions were incubated for 15min at 30 C with

controlled stirring in buffer 2 (with respiratory substrates) in the ab-

sence (empty bars) or in the presence of 500lMCa2þ (gray bars). GSH

and GSSG were determined as described in Experimental procedures.

GSH/GSSG ratios represent averages of three independent experi-

ments done in triplicate and were normalized by protein concentra-

tions equal to 1mg/ml. The differences between mutants and wild type

(*) and the differences between mitochondrially enriched fractions

treated and non-treated with Ca2þ (X) were statistically significant for

p values 6 0.01 (determined from paired t test).

DcTPxII, but not from DcTPxI and wild-type cells,suffered a decrease in oxygen consumption after Ca2þ

treatment (data not shown), probably because of cyto-

chrome c release secondary to non-selective inner

membrane permeabilization promoted by Ca2þ [24].

Once again, the sensitivity of mitochondrial function to

Ca2þ treatment correlates very well with the amount

of thiol groups that this organelle possessed (Fig. 2,

Table 2). In DcTPxI mitochondria, the loss of mem-brane potential (Fig. 3) and the decrease in GSH/GSSG

ratios (Fig. 6) after Ca2þ were smaller, and respiratory

rate differences were non-significant.

Not only GSH/GSSG ratios but also the lack of

peroxiredoxins in mutant cells should be involved in

the sensitivity of mitochondria to Ca2þ-induced per-

meabilization. Therefore, we decided to check if dif-

ferent recombinant peroxiredoxins could also preventyeast mitochondria from membrane potential loss.

These recombinant proteins were expressed and puri-

fied from E. coli and added to DmTPxI mitochondri-

ally-enriched fractions (that suffered large membrane

potential drop and do not possess any TPxI isoform to

interfere with the assay). All of the thioredoxin per-

oxidase isoforms studied protected mitochondria from

permeabilization induced by Ca2þ. mTPxI was themost protective and cTPxI the least efficient enzyme

(Fig. 7). Therefore, our results indicated that mito-

chondrial susceptibility to loss of function induced by

Ca2þ is very dependent on both thiol contents and on

peroxide-removing enzymes.

Discussion

Eukaryotic cells possess several pathways to decom-

pose peroxides. As an example, yeasts have two catalases,

Fig. 7. Inhibitory effect of exogenously added TPxs on the loss of DWpromoted by Ca2þ. Conditions of this experiment were the same as

described for Fig. 3. Recombinant thioredoxin peroxidases were added

to the reaction medium at final concentration of 5lM. Mitochondri-

ally-enriched fractions were obtained from DmTPxI cells that were

grown on galactose-containing media. These results are representative

of three similar experiments performed in similar conditions.

Fig. 8. Effects of deletions of TPx genes on yeast cells. Schematic

representation of alterations in yeast redox status that appear to be

involved in the sensitivity of strains to Ca2þ promoted damage in

mitochondria. The signal (+) denotes the intensity of the phenomena

observed. The symbols ! and a indicate induction and inhibition,

respectively.


five peroxiredoxins, three phospholipid glutathioneperoxidases, and one cytochrome c peroxidase [40]. It is

reasonable to think that each of these enzymes may have

a particular role in distinct cell compartments or under

different conditions. Previously, cTPxI as well as per-

oxisomal and/or cytosolic catalases were implicated in

the defense of yeast mitochondria against Ca2þ-pro-moted mitochondrial membrane permeabilization [24].

Here, we compared the protection of yeast mitochondriafrom Ca2þ-induced damage by catalase and by other

peroxiredoxin isoforms.

Before the beginning of the analysis on mitochondrial

function, a characterization of cellular and mitochon-

drial redox state was performed. The reason for this

strategy is that several processes are affected in null

mutants besides the absence of the gene. As a matter of

fact, deletion of CTPXI gene promotes: (1) an inductionof the GSH1 gene (Fig. 1B), [3]; (2) an increase in glu-

tathione reductase and glutathione peroxidase activities

[3]; (3) an increase in the ability of yeast to induce cy-

tosolic catalase expression by H2O2 [9]; and (4) a de-

crease in the ability to induce the expression of

thioredoxin (TRX2) and cytosolic thioredoxin reductase

by H2O2 exposure [9].

Our data showed that all TPxs mutant presentedlower capacity to decompose H2O2 (Fig. 1A), which

could increase oxidation of glutathione and conse-

quently lead to lower GSH/GSSG ratios (Table 1). Be-

sides, in all mutants studied here we observed an

increase in the expression of the GSH1 gene (that en-

codes c-glutamylcysteine synthetase, the enzyme that

catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis),

which could represent an attempt of mutant strains tocope with the absence of TPx isoforms. Taken together,

our results indicated that mutants are in chronic oxi-

dative stress (Fig. 1, Table 1).

After the characterization of the whole yeast cells, an

analysis of the redox state of mitochondria from mutant

strains was also made. In parallel to the cellular redox

state, mitochondria from DmTPxI and DcTPxII cells

were more oxidized than wild-type countertypes. Incontrast, mitochondria from DcTPxI cells were at least

equally reduced compared to wild-type mitochondria,

since they showed the same level of total sulfhydryl

groups (Fig. 2) and higher GSH/GSSG ratios (Table 2).

Our data indicated that the higher level of sulfhydryl in

mitochondria of DcTPxI cells could be attributed at

least in part to the high capacity of these cells to recycle

glutathione (Table 2). In fact, DcTPxI cells have higherGSSG reductase activities than the parental strain [3]

and part of glutathione reductase protein (GLR1) is also

located inside mitochondria [41]. An alternative expla-

nation for the high GSH/GSSG ratio observed in

DcTPxI cells (Table 2) could be related to the presence

of a GSH transporter from cytosol to mitochondria,

according to studies using mice [42].

The sensitivity of yeast mitochondria to membranepotential loss induced by Ca2þ appeared to be the result

of the interplay of several factors. Our results identified

two of them: (1) level of peroxide removing enzymes and

(2) sulfhydryl levels in mitochondria. All the mutants

analyzed here (and also catalase-depleted cells) were

more sensitive than wild-type cells to Ca2þ-induced in-

ner membrane permeabilization (Figs. 3 and 4). Inter-

estingly, our results indicated that the sensitivities of theperoxiredoxin mutants appeared to be a consequence of

different mechanisms (Fig. 8) as is discussed below. The

biochemical pathways responsible for the differential

effects of peroxiredoxin genes deletions on thiol redox

status and total H2O2 removing activity are unknown.

In any case these results indicate that peroxiredoxins are

not totally redundant among themselves. In this regard,

it is noteworthy to point out that deletion of CTPXIII(cytosolic thioredoxin peroxidase III gene) did not alter

the sensitivity of yeast to Ca2þ (data not shown). In spite

of these variations in mitochondrial redox status, in all

cases Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane

permeabilization appeared to be mediated by ROS,

since catalase and TPxs strongly inhibited damage to


this organelle (Figs. 5 and 7) and GSH/GSSG ratiodecreased sharply after Ca2þ addition (Fig. 6).

In the case of DcTPxI mutant cells, the levels of mi-

tochondrial GSH were about the same as the wild-type

cells (Table 2) and, therefore, should not contribute

significantly to the susceptibility of this strain to loss of

membrane potential induced by Ca2þ (Figs. 3 and 4). In

all cases, a large decrease of GSH/GSSG ratio occurred

after Ca2þ treatment (Fig. 6). Since whole cellular GSH/GSSG ratios were decreased in DcTPxI (Table 1), we

cannot exclude the possibility that other pools of GSH

are also important for the maintenance of mitochondrial

integrity. It is noteworthy to observe that DcTPxI cells

possessed the lowest peroxidase activity of the all strains

analyzed (Fig. 1A), indicating that the absence of the

very abundant cTPxI protein should be a very important

factor for the increased sensitivity to mitochondrialpermeabilization in DcTPxI cells (Fig. 8).

Deletion of the MTPXI gene promotes different ef-

fects compared to CTPXI deletion. In this case, both

mitochondrial and cytosolic GSH/GSSH ratios, as well

as the total sulfhydryl content, decreased sharply

(Tables 1 and 2 and Fig. 2), indicating that DmTPxI cells

are under chronic oxidative stress (Fig. 8). Since mito-

chondria are highly dependent on GSH for the preven-tion of oxidative damage [42], the low levels of this thiol

in DmTPxI mitochondria should be a crucial factor for

the high susceptibility of these cells to Ca2þ. However, it

is important to note that the total H2O2 removal activity

is also decreased in DmTPxI cells (Fig. 1A). Moreover,

the drop in inner membrane potential is higher in mi-

tochondria derived from cells grown in glycerol/ethanol

than in cells grown in galactose-containing media (Figs.3 and 4), which correlates with the expression levels of

MTPXI gene [14]. Therefore, our data indicate that both

low sulfhydryl levels and mTPxI absence contribute

significantly to the high sensitivity of DmTPxI cells to

Ca2þ-induced loss of mitochondrial function (Fig. 8).

As in DmTPxI cells, the levels of sulfhydryl com-

pounds in DcTPxII were very low in both mitochondria

and in whole cells (Tables 1 and 2 and Fig. 2), whichagain should be related to the high sensitivity of this

strain to Ca2þ treatment (Figs. 3 and 4). The lack of

cTPxII protein would not be expected to be important in

this process, since this protein is present in undetectable

amounts under basal conditions [12]. In any case, it is

interesting to note that cTPxII cells presented lower

capacity to decompose H2O2 (Figs. 1A and 8). This

result could directly reflect the absence of DcTPxIIprotein or the down regulation of other antioxidant

enzymes. In this regard, it is important to observe that

deletion of other peroxiredoxin gene, namely CTPXI,

promotes a down regulation of TRX2 and TRR1 that

encode other antioxidant proteins [9]. Besides, expres-

sion of GSH1 gene in DcTPxII is increased in compar-

ison to levels in wild-type cells (Fig. 1B).

As shown above, the levels of thiols in the mito-chondria of peroxiredoxin mutants are an important

factor in the sensitivity of yeast strains to Ca2þ-induceddamage. In fact, several reports have highlighted the

importance of depletion of mitochondrial rather than

cytosolic pools of GSH in pathological processes [42–

44]. Under normal conditions, the concentration of

GSH within the organelle is the same as in cytoplasm,

but under oxidative stress conditions, the level in themitochondria is preserved although the cytoplasmic le-

vel is decreased [43]. Interestingly, this was the case for

DcTPxI cells (Tables 1 and 2). Besides, GSH efflux from

mitochondria is very slow even under conditions where

cytoplasmic GSH contents are depleted [42]. This means

that GSH may be essential for mitochondrial function

and its concentration is strongly controlled in the cell

[42–44].The maintenance of mitochondrial GSH pool in

DcTPxI cells seems to be related to the fact that their

mitochondria did not lose the ability to respire, although

it suffered drop of potential (Fig. 3) and had lower GSH/

GSSG ratios after Ca2þ treatment (Fig. 6). It is impor-

tant to emphasize here that the decrease of potential in

DcTPxI cells was significantly lower than in the other

two mutants (Fig. 3). Probably the loss of potential inDcTPxI mitochondria was not sufficient to alter oxygen

consumption.

Although GSH levels are important for the mainte-

nance of mitochondrial integrity, they are not the only

factor. In fact, the importance of thiol-dependent per-

oxidase activity on mitochondrial protection against

Ca2þ-induced permeabilization can be demonstrated by

the exogenous addition of recombinant peroxiredoxinsto mitochondrially-enriched fractions (Fig. 7). In all

cases, significant protection was observed. Interestingly,

all peroxiredoxins protected mitochondria, but not

equally. mTPxI was the most effective, which can be

related with its high enzymatic activity [5,13]. Accord-

ingly to Park et al. [5] cTPxI is more active than cTPxII,

but our results indicated that other properties rather

than their enzymatic activities interfere with their pro-tective effects. A possible hypothesis could be the dif-

ferential capability to use mitochondrial thiols as

electrons donors.

Thioredoxin could be another important compo-

nent to maintain mitochondrial activity intact. This is

because it is known that oxidative stress and de-

creases in glutathione content lead to the oxidation

of thioredoxin in vivo [45,46]. In the absence ofthioredoxin peroxidases, it is expected that thiore-

doxin would be oxidized slower and this could have

a consequence in cell signaling. In this regard, it is

important to mention that thioredoxin, but not glu-

tathione, is involved in regulation of yAP1p (a key

transcription regulator of yeast response to oxidative

stress) [3,9,45,47].


Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane per-meabilization in yeast possesses several similarities with

MPT in mammalian mitochondria [24]. Therefore, the

studies presented here may have implications in the

regulation of processes that occur in higher eukaryotes,

such as cell death. In fact, it has been shown before that

mammalian thioredoxin, which is the substrate of TPxs,

is involved in the regulation of mitochondrial membrane

potential and apoptosis [48,49]. Moreover, yeast hasbeen considered a good model for studies of human

mitochondrial disorders [50]. Our results presented here

indicated the existence of unknown signaling pathways

that coordinate the levels of thiol compounds and per-

oxidases that may also be relevant to higher eukaryotes.

Acknowledgments

We thank Marilene Demasi and Gustavo Monteiro

Silva for helping us with glutathione measurements,

Simone Vidigal Alves for providing us with pure thio-

redoxin peroxidase proteins, and Victor Genu for re-

vising the paper. We especially thank Giannis Spyrou

for kindly providing us with the Ser38-mPrx1p construct.

We also thank Fundac~ao de Amparo a Pesquisa do

Estado de S~ao Paulo (FAPESP) and Conselho Nacionalde Desenvolvimento Cientıfico e Tecnologico (CNPq)

for financial support.

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