UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA AGROALIMENTAR

UNIDADE ACADÊMICA DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

CAMPUS DE POMBAL - PB.

Curso: Engenharia de Alimentos

Disciplina: Tecnologia de Produção de Bebidas

Professora: Adriano Sant'Ana Silva

PRÁTICA 4-CONTAGEM DE CÉLULAS POR GRAVIMETRIA

Anna Claudia Juca de Araujo

Flávia Izabely Nunes Moreira

Flávia Simone Gomes

Clara Santana

Katiane Pereira

POMBAL26 de agosto de 2014

PRÁTICA 4-CONTAGEM DE CÉLULAS POR GRAVIMETRIA

Relatório apresentado ao doutor Adriano Sant'Ana Silva da disciplina Tecnologia de Produção de Bebidas como exigência para obtenção parcial de nota.

POMBAL26 de agosto de 2014

1. INTRODUÇÃO

A análise gravimétrica ou gravimetria, é um método analítico quantitativo cujo processo envolve a separação e pesagem de um elemento ou um composto do elemento naforma mais pura possível.

O elemento ou composto é separado de uma quantidade conhecida da amostra ou substância analisada. A gravimetria engloba uma variedade de técnicas, onde a maioria envolve a transformação do elemento ou composto a ser determinado num composto puro e estável e de estequiometria estequiometria definida, definida, cuja massa é utilizada utilizada para determinar determinara quantidade do analito original.

A análise gravimétrica está baseada na medida indireta da massa de um ou mais constituintes de uma amostra.

Por medida indireta deve-se entender converter determinada espécie química em uma forma separável do meio em que esta se encontra, para então ser recolhida e, através decálculos estequiométricos, determinada a quantidade real de determinado elemento ou composto químico, constituinte da amostra inicial. A separação do constituinte pode ser efetuada por meios diversos: precipitação química, eletrodeposição, volatilização ouextração.

A análise gravimétrica consiste na análise quantitativa que permite saber a quantidade de uma substância em determinada mistura. Também conhecida como Gravimetria, esta análise se baseia no cálculo da porcentagem das espécies envolvidas em uma reação através da determinação da massa dos reagentes.É de fácil utilização, suas principais vantagens são o fato de ser simples tanto em questão de aparelhagem quanto em cálculos finais e extremamente precisa quando realizada com cuidado, mais porem sua realização é demorada e com possíveis erros acumulativos (um erro vai acumulando juntamente com outro, formando uma cadeia de erros).

A análise gravimétrica tem por finalidade a obtenção de substâncias mais puras possíveis de uma mistura, através de vários processos de transformação da mistura, assim podendo separar os constituintes da mistura, e deixar qualquer um deles o mais puro possível, utilizando-se a massa da substancia pura para determinar quanto desta tinha na amostra.A análise gravimétrica é um nome geral para esse tipo de separação de misturas, podendo ser usadas varias técnicas para realização desta análise.

Em Tecnologia das Fermentações ou qualquer outra especialidade que trabalhe com células, de qualquer tipo, talvez seja necessário em algum dos ensaios quantificar o número de células, ou mesmo ser imprescindível para o dia-a-dia de laboratórios como de cultura de células.

Em especial para técnicas fermentativas a quantificação é necessária em cada um dos ensaios, tendo em vista de que normalmente o objetivo final da fermentação é um produto industrial em larga escala, e erros quanto ao número de células poderiam causar prejuízos a indústria. Além do controle de custos a quantificação é necessária para medir a rapidez de um processo, visando otimizar o rendimento ou escolher melhores opções que sejam adequadas a necessidade de produção.

O acompanhamento da técnica normalmente é necessário para entender passo a passo como a fermentação ocorre, portando tem a pesquisa como objetivo, e a quantificação é necessária em muitas etapas do processo.

Entre as técnicas de quantificação temos os métodos diretos e os métodos indiretos. O primeiro, como diz o próprio nome, tem como produto de quantificação as células em si, enquanto que o segundo se apropria da quantificação de componentes celulares (organelas, proteínas e ácidos nucléicos) ou mesmo da atividade celular (processos enzimáticos, formação de produto, consumo de substrato).

A determinação de volume centrifugado se baseia no fato de que, células semelhantes entre si terão tamanhos parecidos, e portanto através da centrifugação de uma suspensão contendo essas células podemos chegar a porcentagem de volume celular em relação a suspensão. Se em adicional soubermos o raio médio dessas células podemos chegar a um número aproximado do número de células nesta suspensão.

A determinação de matéria seca tem como princípio a desidratação das células, sendo que todas as células possuem uma quantidade de água em seu interior. Através dessa técnica podemos saber o peso das células quando desidratadas, quando comparamos com o peso total antes do aquecimento. Essa técnica possui algumas limitações, pois não é possível quantificar o número de células através de seu peso, porém tendo essa informação podemos calcular a média de peso de uma célula na suspensão.

A contagem em câmara de Neubauer é o método mais direto de contagem, em que, através da contagem de células em um microscópio ótico dentro de um volume conhecido podemos estipular por regras de três simples a quantidade aproximada de células no volume total de suspensão com uma sensibilidade alta, podendo inclusive saber a viabilidade das células através de um corante vital.

Turbidimetria é um método óptico, com a utilização de um espectrofotômetro, que tem como princípio o fato de que células, em meio líquido, ficam em suspensão, por terem volumes elevados. Sendo assim, quanto mais turva a amostra, maior é a quantidade de células que ela contem, e com os valores de absorbância é possível saber, com grande sensibilidade, a quantidade exata de células no volume total. A possibilidade de se fazer uma curva de eficiência de crescimento celular através do tempo, ajuda em técnicas fermentativas a escolher o melhor método a se utilizar.

2. OBJETIVOS

Determinar por gravimetria a quantidade de levedura (g/L) durante um processo

fermentativo

3. MATERIAIS E MÉTODOS

12 tubos Eppendorff (1,5 mL até 10 mL)

4 tubos Eppendorf de 40 mL (tubos de centrífuga)

Micro pipetador de 1mL ou 5mL

Pipeta graduada de 10mL

Balança analítica (4 casas decimais)

Centrífuga para tubos

3.2 Métodos

Lavar os tubos de Eppendorf com água destilada e secar em estufa a 70ºC ou a 100ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo retirar os tubo e deixar resfriar em dessecador. Uma vez frio, pesa em balança analítica e registrar como massa “A”.

Agitar levemente o mosto de forma a suspender as células presentes. Coletar uma alíquota (1 a 5 mL) com o pipetador automático ou com a pipeta e colocar no tubo de Eppendorf previamente frio e tarado. Centrifugar por 10 minutos a 3000 RPM. Desprezar o sobrenadante, adicionar entre 1 a 3 mL de água destilada e centrifugar novamente nas mesmas condições. Desprezar o sobrenadante e colocar para secar em estufa a 70ºC ou 100ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo retirar os tubo e deixar resfriar em dessecador. Uma vez frio, pesar em balança analítica e registrar como massa “B”.

Fórmula

Concentração decélula (g /L )= massa seca(g)Vol . alíquota(L)

=(B−A)

Vol .alíquota (L)

4 – RESULTADO E DISCUSSÕES

A densidade está relacionada com a concentração de sacarose. Ao passo que o teor de sacarose, aumenta, a densidade também aumenta. Na análise de teor alcoólico a presença desses parâmetros podem influenciar no resultado da leitura, podendo apresentar um valor subestimado. Nesse caso, o que poderia ser feito para que tal erro não ocorresse, seria a realização da destilação da amostra analisada.

Contagem de células por gravimetria

5 g /L 10 g/L

Massa= 0,7457 A1R1 A2R1=0,7631

A1R2 0,7542 A2R2=0,7289

A1R3 0,7462 A2R3=0,7760

15 g/L 20 g/L

A3R1= 0,7318 A4R1= O,7354

A3R2=0,7736 A4R2=0,75551

A3R3=0,7304 A4R3=0,7370

PESOS DOS TUBINHOS

A1R1- 0,7485 ; A1R2- 0,7578; A1R3-0,7488

A2R1- 0,7706; A2R2- 0,7380; A2R3- 0,7835

A3R1- 0,7430; A3R2- 0,7864; A3R3-0,7423

A4R1-0,7495; A4R2- 0,7694; A4R3- 0,7514

Temos que para 5g/L,

Para A1R1

0,7485−0,74570,001

= 2,8

Para A1R2

0,7578−07542,0,001

= 3,6

Para A1R3

0,7488−0,74620,001

= 2,6 Média =3

Temos pra 10 g/L

Para A2R1

0,7706−0,76310,001

= 7,5

Para A2R2

0,7380−0,72890,001

= 9,1

Para A2R3

0,7835−0,77600,001

= 7,5 Média=8

Para 15 g/L

Para A3R1

0,7430−0,73180,001

= 11,2

Para A3R2

0,7864−0,77360,001

= 12,8

Para A3R3

0,7423−0,73040,001

= 11,9 Média =12

Temos pra 20 g/L

Para A4R1

0,7495−0,73540,001

= 14,1

Para A4R2

0,7694−0,75510,001

= 14,3

Para A4R3

0,7514−0,73700,001

= 14,4 Média =14,3

Gráfico

4 6 8 10 12 14 16 18 20 220

2

4

6

8

10

12

14

16

f(x) = 0.758 x − 0.15R² = 0.97492788543116

Concentração de Levedura (g/L)

Conc

entr

ação

de

Célu

las (

g/L)

Onde,

x y5 310 815 1220 14,3

Calculando o erro

X−YX

= 5−3

5= 0,4 X 100% =40%

10−810

= 0,2 X100%=20%

15−1215

= 0,2 X100%= 20 %

20−14,320

= 0,3X100% =30 %

Verificou-se que o método não é eficiente a 5% de probabilidade.