Relatório Enzimas UEM por D.Petter.

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1.INTRODUÇÃO

As enzimas são catalisadores das reações que ocorrem nos sistemas biológicos. A

presença e manutenção de um conjunto completo e equilibrado sistema de enzimas

é essencial para a quebra de nutrientes para fornecer energia e construção de blocos

químicos como a montagem dos blocos de construção em proteínas, DNA,

membranas, células e tecidos. Como a exceção de alguns RNA catalítico chamado

ribozimas, a grande maioria das enzimas são proteínas. A característica que

distingue uma reação catalisada enzimaticamente é a de ela ocorrer no interior dos

limites de uma cavidade na enzima chamada sítio ativo. A molécula que se liga ao

sítio ativo e sítio ativo e sofre a ação da enzima é chamada substrato.

Deficiências nas quantidade ou atividade catalítica de enzimas como nas desordens

genéticas herdadas pode resultar em deficidade nutricionais ou toxinas. As enzimas

são moléculas de importância fundamental na biomédica, exemplo; a medida da

atividade de enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos ou amostras de tecido são

importantes no diagnóstico de várias doenças. Além disso muitas drogas exercem

seu efeito biológico por meio de interações com as enzimas. Também na indústria

química as enzima são utilizado no processamento de alimentos e na agricultura.

As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios. O mais

importante foi estabelecido pela União Internacional de Bioquímica e Biologia

Molecular(IUBMB), e estabelece 6 classes:

OXIDORREDUTASES:As enzimas que catalisam reações de transferências

de elétrons (ion hidretos ou átomos de H)

TRANSFERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de

grupos funcionais.

HIDROLASES:As enzimas que catalisam reações de hidrolise.

LIASES:As enzimas que catalisam reações de adição de grupos às duplas

ligações ou formação de duplas ligações por meio de remoção de grupos.

ISOMERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de

grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros.

LIGASES:As enzimas que catalisam reações de formação do tipo C - C,

C - S, C - O e C - N por meio de reações de condensação acopladas á quebra

do ATP.

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As enzimas como catalisadores aumentam a velocidade da reação reduzindo a

energia livre de ativação. A velocidade de uma reação pode aumentar na ordem de

106 a 1012 vezes mais do que a reação correspondente não-catalisada. Três

propriedades distintas das enzimas permitem que elas exerçam papel na promoção

e regulação dos processos celulares, caracterizando-as como componentes vitais

aos sistemas vivos:

1. Elevada especificidade da reação. Como regra geral, cada reação sob

condições apropriadas é catalisada por uma enzima especifica. Diante de

várias rotas potencialmente possíveis, a enzima escolhe a com menor energia

livre de ativação.

2. Condições reacionais mais limitada: A atividade de cada enzima é

dependente do pH, da temperatura, da presença de vários cofatores e das

concentrações de substratos e produtos.

3. Capacidade de regulação da concentração e da atividade: Permite o

ajuste fino do metabolismo em diferentes condições fisiológicas.

Ultimo, mas não menos importante as enzimas possui a propriedade distinta de

não ser consumida ou alterada ao participar da catálise. Esse propriedade é

muito importante para manter a composição celular no fim de cada uma reação

enzimática.

No corpo humano a enzima amilase saliva é a enzima que devido à sua

facilidade na obtenção, é mais usado nos estudos das atividade enzimática. Por

isso os objetivos deste relatório são baseados neste enzima.

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2.OBJECTIVO

2,1. GERAL.

Examinar a cinética da amilase salivar.

2,2. ESPECIFICO.

Analisar as diferença das absorbâncias antes e depois de adição de

amilase no amido.

Preparação da curva padrão.

Determinar com auxilo do gráfico de Lineweaver-Burk os valores Km e

Vmax e explique o seu significado.

3.PRINCÍPIO DO MÉTODO.

A amilase saliva digere o amido por catalisar a hidrólise, que é a divisão de

molécula de amido por meio da adição de moléculas de água.

A cinética da amilase salivar pode ser analisado usando espectrofotómetro na

técnica de espectrofotometria. A espectrofotometria é uma técnica analítica que

utiliza a luz para medir a concentração de uma solução. Esse método utiliza

propriedade de absorbância da solução. Absorbância (também

chamada densidade óptica ) de um material é a proporção da radiação que

incide sobre um material, para a radiação transmitida através da material.Com

a técnica de espectrofotometria a absorbância de uma solução pode ser

calculada usando a lei de Beer que diz ''a absorbância de uma solução é

diretamente proporcional à concentração da solução (A ∝ Cs )''

Portanto usando a técnica de espectrometria podemos observar as diferenças de

concentrações de amido antes de e depois de adicionar a enzima amilase. Neste

experiência precisamos solução de iodo que forma o complexo azul escuro com

amido. É este color( azul escuro) que é detectada por o espectrofotómetro que

nos dar os valores de absorbância.

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4.MATERIAS E REAGENTES.

1% solução de amido.

Água destilada.

Banho - maria.

Espectrofotómetro.

Solução de iodo.

Solução de saliva.

Gelo.

5.PROCEDIMENTOS.

EXPERIENÇIA 1.

Pegou-se 6 tubos e marcou-se P1 a P6. Em cada tubo colocou-se 2 gotas de

solução de iodo e adicionou-se soluções de amido e água destilada em acordo

com a tabela a baixo. Passou-se as misturas pelo o centrífugo e mediu-se as

absorbências no espectrofotómetro.

Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6

Solução de

amido(ml)

0 1,6 3,2 4,8 6,4 8

Água

destilada(ml)

9 7,4 5,8 4,2 2,6 1

Absorbência 0 0,531 0,841 0,717 1,428 0,737

EXPERIENÇIA 2.

Preparou-se cerca de 10ml de solução aquosa de saliva bochechando

intensamente durante 2 minutos, e de seguida filtrou-se a solução com gaze.

Numa série H1 a H6 de tubos contendo solução de amido e água com volumes

idênticos aos da tabela anterior, adicionou-se 1ml da solução de saliva em cada

tubo. Incubou-se cada amostra @ 35°C. Apos a incubação adicionou-se a 2

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gotas da solução de iodo. Depois colocou-se imediatamente os tubos num copo

com gelo.

Depois disso leu-se absorbência de cada tubo no espectrómetro:

Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6

Absorbâncias 0 0,053 0,210 0,267 0,290 0,310

6.CALCULOS E RESULTADOS.

Dados:

1.Concentração inicial de amido = 1%

Significa que 1 grama de amido foi dissolvido em 100 ml de agua.

∴Concentração padrão(g/litre) =10g /L

Molaridade inicial = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑖𝑑𝑜

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑖𝑑𝑜

= 10𝑔/𝐿

162,16𝑔/𝑚𝑜𝑙 = 0,062 mol/L

2.Volume final de solução de amido = 9 ml = 0,009 L

calculando concentração final do amido na experiencia 1.

Usando a Lei de diluição:

Numero de moles antes de diluição = Numero de moles pois diluição.

Concentração(molaridade) = 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑒

𝑣𝑜𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜

daí Numero de moles = molaridade × volume da solução (M × V)

Portanto a lei de diluição

Mi Vi = Mf Vf

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∴Mf = (Mi Vi)÷ Vf

Mi = Molaridade inicial

Vi = Volume inicial.

Mf = Molaridade final

Vf = Volume final

Usaremos a equação acima para calcular as contrações final do amido nos tubos

PS.:

Tubo P1

Concentração em % =0

Tubo P2

Mf = (Mi Vi)÷ Vf

= (0,062× 0,0016) ÷ 0,009

= 0,011 mol/L

∴ Concentração padrao = 1,78 g/L

Concentração em % = 0,178%

Tubo P3

Mf = (Mi Vi)÷ Vf

= ( 0,062 × 0,0032) ÷ 0,009

= 0,022 mol/L

Concentração padrão = 3,57 g/L

Contração em % = 0,357%

Tubo P4

Mf = (Mi Vi)÷ Vf

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= ( 0,062 × 0,0048) ÷ 0,009

= 0,033 mol/L



Tubo P5

Mf = (Mi Vi)÷ Vf

= (0,062 × 0,0064) ÷ 0,009

= 0,044 mol/L



Tubo P6

Mf = (Mi Vi)÷ Vf

= (0,062 × 0,008) ÷ 0,009

= 0,055 mol/L



TABELA DE ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÕES

Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6

Absorbânçia 0 0,455 0,788 1,003 1,040 1,282

Concentrações

do amido %

0 0,178 0,357 0,535 0,714 0,82

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Como vimos no principio do método que, a espectrofotometria segue a lei de

Beer, analisando a relação do lei concluirmos que o nosso deve ter a linha

estreita como a curva padrão:

Absorbência ∝ Concentração

A ∝ Conc

Introduzindo a sinal de igualdade em acordo de Beer

A = 𝜀bConc

Em que 𝜀 = absortividade molar (uma propriedade inerente de uma substância)

b = Comprimento de caminho cuveta ( sempre 1cm )

Portanto: 𝜀b = constante (m)

∴ A = m Conc

Como podemos ver a equação a cima é equação linear análogo ao y = mx. Daí

provamos que a nossa curva padrão é linha estreita.

A inclinação de gráfico é a constante (m) que é propriedade inerente de

amido(absortividade molar de amido).

A partir do gráfico:

Inclinação (m) = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎çã𝑜 𝑒𝑚 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎

𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎çã𝑜 𝑒𝑚 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑢𝑎𝑙

=1,2−0,8

0,0,72−0,48

=0,67

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Calculando a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise (CE)

usando a curva padrão:

Considerando que a inclinação de gráfico é a propriedade constante de amido,

podemos calcular a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise.

Desde que Absorbência = 𝑚 × 𝐶𝑜𝑛𝑐

∴ CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒

𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜

Tube H1

CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒


= 0%

Tube H2



=0,0531

1,67 = 0,032%

Tube H3



=0,210

1,67 = 0,13%

Tube H4



=0,267

1,67 = 0,16%

10

Tube H5



=0,290

1,67 = 0,17%

Tube H6



=0,31

1,67 = 0,19%

Calculando velocidade da reação para cada amostra:

Usando a formula v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce

10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠

V1

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce

10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 =

0−0%

10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0

V2

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce


0,18%−0,032%

10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠= 0,0148

V3

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce


0,4%−𝑜,13%


V4

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce

10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠=

0,54%−0,16%


V5

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce


0,71%−0,17%


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V6

v = ∆𝐶

∆𝑡 =

CO – Ce


0,82%−0,19%


TABELA DE VELOCIDADE E CONCENTRAÇÃO

Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6

Velocidade

(V)

0 0,0148 0,027

0,038 0,054 0,063

Concentrações

(Ce%)

0 0,032 0,13 0,16 0,17 0,19

1 𝑉⁄ 0 67,6 37 26,31 18,5 15,9

1 Ce⁄ % 0 31,3 7,7 6,3 5,9 5,3

7.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.

A partir do gráfico ӀӀ, o gráfico obedece a equação linear 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑐. Além disso

o gráfico obedece a equação de lineweaver-Burk, 1

𝑉𝑜 =

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥

1

[𝑠] +

1

𝑉𝑚𝑎𝑥 . Portanto a

equação de lineweaver-Burk e a equação linear são análogo.

Usando a equação de lineweaver-Burk , 1

𝑉𝑜 =

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥

1

[𝐶𝑒] +

1

𝑉𝑚𝑎𝑥

1.A inclinação = 𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥 =

∆1

𝑉

∆1

𝐶𝑒

=56−36

24−12 = 1,67

2.Em , 1

𝑉𝑜 – intercepto,

1

𝐶𝑒 = 0 ;

Daí , 1

𝑉𝑜 – intercepto =

1

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 16

∴ Vmax = 16-1 = 0,63. Este é velocidade atingida quando todas as moléculas da

enzimas estiverem na forma do complexo ES e a concentração da enzima livre E

for pequena. Nessa condições, a enzima está “saturada” com seu substrato e a

velocidade da reação não aumenta mais com novos aumentos da [S].

3.Em 1

[𝐶𝑒] – intercepto,

1

𝑉𝑜 = 0 ;

12

Daí 0 = 𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥

1

[𝐶𝑒] +

1

𝑉𝑚𝑎𝑥

− 1

𝑉𝑚𝑎𝑥 =

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥

1

[𝐶𝑒]

1

[𝐶𝑒] – intercepto = −

1

𝐾𝑚 = − 9,6

∴Km = 9,6-1 = 0,104. Este é a concentração de amido quando a velocidade máxima

de reação é metade.

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BIBLIOGRAFIA

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Voet, D. Voet, G, J. Biochemistry(4th ed). NewYork: John Wiley & Sons,

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