UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO – Campus Recife

CURSO DE MEDICINA

BIOQUÍMICA

1º PERÍODO - TURMA 139

ISABELLA BENIGNO NINO SILVA

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE PROTEÍNAS

RECIFE

2015

1. INTRODUÇÃO

PROTEÍNAS

As proteínas são macromoléculas muito abundantes na natureza, ocorrem em todas as

células e em grande variedade de tipos, desde peptídeos pequenos até grandes polímeros, com

elevado peso molecular e diferentes funções biológicas. São polímeros formados por

aminoácidos, unidades monoméricas relativamente simples que se ligam umas as outras por

meio de ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um

aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma

amida.

Os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na

funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais, dessa forma, podemos classificar

os aminoácidos quanto ao seu grupo funcional como não polares (alifáticos), polares não

carregados, polares positivamente carregados, polares negativamente carregados e aromáticos.

As proteínas, mesmo tendo variadas funções e propriedades, são constituídas por um grupo de

20 aminoácidos, chamados aminoácidos padrão, que se arranjam em variadas sequências a fim

de conferir conformação e função de uma determinada proteína. Os aminoácidos possuem

propriedades ópticas, apresentando estereoisômeros D e L, uma vez que todos os aminoácidos,

exceto a glicina, possuem quatro ligantes diferentes ligados ao carbono α. A maioria das

proteínas encontradas nos seres vivos são formadas por L-aminoácidos. Os D-aminoácidos

aparecem somente em certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de

algumas bactérias.

As proteínas podem se apresentar em conformação primária (linear), secundária (formando

α-hélices e folhas β), terciária (enovelamento por interação entre sequências polipeptídicas de

uma proteína com estrutura secundária) e quaternária (arranjo de mais de uma subunidade

protéica), como pode ser visto na Figura 1. As proteínas que apresentam uma ou mais cadeias

polipeptídicas formando estruturas compactas, mais ou menos esféricas e que geralmente são

solúveis denominam-se proteínas globulares. As proteínas fibrosas possuem forma alongada,

geralmente insolúveis, que em meio aquoso e desempenham um papel basicamente estrutural

nos sistemas biológicos. Ao contrário das globulares, as fibrosas são formadas pela repetição de

módulos, o que possibilita a construção de grandes estruturas, com organização que origina

fibras.

Figura 1 – Formação estrutural das proteínas. Esquema mostra o enovelamento da sequência

de aminoácidos para a formação de proteínas nas conformações primária, secundária, terciária e

quaternária.

Uma perda da estrutura tridimensional suficiente para causar perda de função é denominada

desnaturação. O estado desnaturado não necessariamente corresponde a um desenovelamento

completo da proteína, mas sob a maioria das condições, as proteínas desnaturadas consistem

num estado parcialmente enovelado. As proteínas podem ser desnaturadas pelo calor, que afeta

principalmente as ligações de hidrogênio; por extremos de pH, que alteram a carga líquida da

proteína; por solventes orgânicos miscíveis com água, que promovem rompimento de interações

hidrofóbicas; etc.

PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS COM DESNATURAÇÃO

Uma perda da estrutura tridimensional suficiente para causar perda de função é denominada

desnaturação. O estado desnaturado não necessariamente corresponde a um desenovelamento

completo da proteína, mas sob a maioria das condições, as proteínas desnaturadas consistem

num estado parcialmente enovelado. A desnaturação envolve alterações nas estruturas

quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária.

As proteínas podem ser desnaturadas pelo calor, que afeta principalmente as ligações de

hidrogênio; por extremos de pH com adição de ácidos ou álcalis, que alteram a carga líquida da

proteína; por solventes orgânicos miscíveis com água, que promovem rompimento de interações

hidrofóbicas; soluções concentradas de uréia e guanidina; detergentes; sais de metais pesados,

etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se

citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação

enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica,

alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc.

A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da

solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que

prejudiquem a interação da proteína com a água e favoreçam a interação entre proteínas. A

desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes

são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das

alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.

As reações de precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a

presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos

biológicos para análise de componentes não protéicos.

PRINCÍPIOS TEÓRICOS

- Precipitação pelo Ácido Tricloroacético: A solubilidade de uma molécula depende da

interação entre os grupos polares dos radicais –R e as moléculas de água através de pontes de

hidrogênio. Grandes variações de pH modificam a ionização destes grupos e, portanto, a

interação da proteína com o meio. Nos seres vivos, as proteínas estão em contínua modificação

de sua conformação, uma vez que as concentrações locais de íons, o pH e o poder redutor

sofrem pequenas variações, alterando a interação dos vários grupos reativos das proteínas entre

si e com o meio. Valores extremos de pH afetam bruscamente estas interações, causando uma

desnaturação. Ânions de ácidos complexos, como o tricloroacético, o túngsnico e o pícrino,

formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion.

- Precipitação com sais de metais pesados: A adição de sais de metais pesados, tais como

mercúrio, chumbo, cobre e zinco, levam à formação de sais chamados "quelatos", são

denominados de acordo com o elemento formador entre os aminoácidos ácidos e estes metais,

como por exemplo, o proteinato de mercúrio e o proteinato de chumbo A proteína precipita

porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas,

os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Essa precipitação é mais

intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga

líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal.

- Precipitação por saturação salina e com solvente orgânico: A solubilidade de uma proteína

pode variar de acordo com a concentração de sal a que ela é submetida. Em baixa concentração

de sal, observamos um aumento na solubilidade das proteínas com a presença de íons. Este

fenômeno é chamado de salting in, onde ocorre uma interação entre os íons salinos e os

grupamentos carregados das proteínas diminuindo as interações eletrostáticas intermoleculares

proteína-proteína (responsáveis pela diminuição da solubilidade protéica). Por outro lado, em

elevada concentração salina, observamos uma redução na solubilidade das proteínas. Este

processo é chamado de salting out, aonde alguns sais, ao interagir com a água, removem a

camada de solvatação das proteínas, o que facilita a formação de agregados e leva à sua

precipitação. A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso

acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada

solvente. Numa solução contendo, exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação

água - proteína e interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o

primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui grande capacidade

de separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada). O solvente orgânico

apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, o que leva a interação proteína-

proteína a ser superior, em competição com o poder de solvatação da água (interação água-

proteína). A proteína precipita. Essa precipitação é reversível pela adição de mais água. A

precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos,

quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de

proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por

rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na

manutenção da conformação protéica.

- Precipitação isoelétrica: As proteínas são muito sensíveis à variação de pH, podendo adquirir

uma forma aniônica, catiônica ou zwitteriônica, o que altera propriedades como sua solubililade

e atividade catalítica. Quanto maior o grau de ionização de uma proteína, maior será sua

tendência à solvatação. No ponto isoelétrico (pI), a proteína tem carga líquida igual a zero, o

que diminui a repulsão entre as moléculas protéicas e o grau de solvatação provocando a

agregação e floculação das moléculas. Esse fenômeno é chamado de precipitação isoelétrica.

As cadeias laterais de alguns aminoácidos possuem a capacidade de se ionizar em condição

ácida ou básica. Desta forma, proteínas com composição de aminoácidos diferentes poderão ter

cargas distintas de acordo com a condição a que forem submetidas. Os aminoácidos apresentam

propriedades características quando isolados, mas formando um polipeptídeo eles podem

interferir uns nos outros e consequentemente no comportamento total da proteína. As proteínas,

assim como os peptídeos e aminoácidos, possuem pontos isoelétricos característicos, nos quais

elas possuem carga líquida (soma das cargas positivas e negativas) igual à zero. O ponto

isoelétrico de cada proteína é específico e pode servir como método de separação de proteínas

em solução, por exemplo, ao submeter uma solução com várias proteínas a um pH tal que seja

equivalente ao ponto isoelétrico de uma delas, só esta precipitará, podendo ser separada das

demais.

2. MÉTODOS EXPERIMENTAIS

PRECIPITAÇÃO PELO ÁCIDO ACÉTICO

Foram utilizados três tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles

foram colocados 2 mL de ovoalbumina com a utilização de uma pipeta graduada e um

auxiliador de pipetagem (pêra). Posteriormente foi adicionado 1 mL de solução de ácido acético

20% no primeiro tubo, 1 mL de solução de ácido clorídrico 20% no segundo tubo e 1 mL de

solução de ácido tricloroacético no terceiro; os três tubos foram agitados para misturar bem os

reagentes.

PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS

Foram utilizados três tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles

foram colocados 2 gotas de NaOH com a utilização de uma pipeta graduada de 5 mL.

Posteriormente foi adicionado 1 mL de ovoalbumina no primeiro tubo, 1 mL de ovoalbumina e

5 gotas de solução de acetato de chumbo 10% no segundo tubo e 1 mL de água e 5 gotas de

solução de acetato de chumbo 10% no terceiro; os três tubos foram agitados levemente para

misturar bem os reagentes e após 10 minutos foram observados os resultados.

PRECIPITAÇÃO POR SATURAÇÃO SALINA E COM SOLVENTE ORGÂNICO

Foram utilizados dois tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles foi

colocado 1 mL de ovoalbumina com a utilização de uma pipeta graduada e um auxiliador de

pipetagem (pêra). Posteriormente foram adicionados 3 mL de solução saturada de sulfato de

amônio no primeiro tubo e 3 mL álcool no segundo tubo; os dois tubos foram agitados para

misturar bem os reagentes e deixados em repouso para que os resultados fossem anotados.

Depois de 5 minutos, adicionou-se 5 mL a cada um dos tubos, que foram agitados e

posteriormente deixados em repouso afim de perceber os resultados.

PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA

Foram utilizados três tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles foram

colocados 2 mL de soluções tampão; no primeiro, tubo foi colocada uma solução tampão de pH

6; no segundo, uma de pH 4,7 e , no terceiro, uma de pH 3. Posteriormente foi adicionado 1 mL

de ovoalbumina e 4 mL de álcool em todos os tubos, os três tubos foram agitados para misturar

bem os reagentes.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

PRECIPITAÇÃO PELO ÁCIDO TRICLOROACÉTICO

TUBO RESULTADO

1 -

2 + +

3 + + + +

QUESTÕES:

Explique a eficiência dos diferentes ácidos para precipitar a proteína.

Existe relação entre a molaridade do ácido e o seu efeito sobre a ovoalbumina?

RESPOSTAS:

Observa-se, portanto, que quanto mais forte é um ácido, mais eficiente é a precipitação

da proteína quando reage com ele. A força de um ácido é medida a partir do seu grau de

ionização, dessa forma, é possível explicar por que o ácido acético não foi capaz de provocar

precipitação da proteína, isso porque seu grau de ionização é baixo e ele é classificado como um

ácido fraco, enquanto o acido acético é considerado forte e tem alto grau de ionização, sendo

capaz de provocar precipitação. O ácido tricloroacético é capaz de promover maior precipitação

porque, além de ter alto grau de ionização, é capaz de atacar os centros hidrofóbicos das

proteínas, sendo um agente de precipitação mais eficiente.

A molaridade dos ácidos utilizados na aula prática em questão não tem relação direta

com o efeito deles sobre a ovoalbumina, visto que os ácidos com maior molaridade não são os

que provocam maior precipitação da proteína. Calculando a molaridade dos ácidos usados a

partir da seguinte fórmula:

Molaridade=% x10Massa Molar do ácido

Obteremos as molaridades:

Molaridade do Ác . Acético 20 %=3,33 molar

Molaridade do Ác . clorídrico 20 %=5,48molar

Molaridade do Ác .Tricloroacético 20 %=1,22 molar

PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS

TUBO RESULTADO

1 -

2 + + + +

3 + +

QUESTÕES:

Explique a natureza do precipitado no tubo nº 2.

Qual a influência do pH do meio (alcalino ou ácido) neste processo de precipitação de

proteínas?

RESPOSTAS:

O primeiro tubo não apresentou precipitado porque a base forte adicionada não é capaz

de formar um precipitado sozinha. No segundo tubo, observa-se intensa formação de

precipitado, o proteinato de chumbo. O grupo hidroxila da água reage com o sal de metal

pesado formando um hidróxido de chumbo, sal insolúvel constituinte do precipitado observado

no terceiro tubo.

O pH é importante para esse tipo de reação porque essa precipitação é mais intensa

quando o pH está acima do ponto isoelétrico. Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a

proteína é negativa favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Em pH abaixo

do ponto isoelétrico, não é possível provocar precipitação com sais, mas com ácidos fortes.

PRECIPITAÇÃO POR SATURAÇÃO SALINA E COM SOLVENTE ORGÂNICO

TUBO 1ª PRECIPITAÇÃO 2ª PRECIPITAÇÃO

1 + + + + -

2 + + + + + +

QUESTÕES:

Explique a reversibilidade das precipitações nos tubos 1 e 2?

Como se dá a relação das moléculas de água com o sal e com o solvente orgânico?

RESPOSTAS:

A camada de solvatação é retirada pela solução saturada de (NH4)2SO4 e pelo álcool,

fazendo a proteína se associar e precipitar.

As moléculas de água presente na solução de ovoalbumina apresentam maior tendência

de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons do sulfato de amônio). As moléculas de

água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Dessa forma,

há maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e,

consequentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno de precipitação da proteína em

decorrência de um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome de salting out. A

adição de mais água à solução possibilita a reversibilidade da precipitação porque, como há

mais moléculas de água para interagir com as proteínas, a “competição” entre a solvatação dos

íons e da proteína diminui, uma vez que existem moléculas de água suficientes para solvatar

esses dois elementos e relação água-proteína é favorecida.

Os solventes orgânicos que têm uma porção hidrofóbica e uma porção polar são capazes

de precipitar proteínas porque os grupos polares interagem com os grupos polares da proteína,

competindo com as moléculas de água, e os grupos hidrofóbicos alteram as interações

hidrofóbicas dentro da estrutura proteica. O volume de solvente orgânico reduz a concentração

efetiva da água, havendo menos moléculas para a relação água-proteína, favorecendo a relação

proteína-proteína, fazendo com que haja precipitação. A proteína não volta a se solubilizar

completamente com adição de mais água porque as interações apolares da molécula da proteína

são atingidas pelo solvente orgânico, novas interações são estabelecidas e algumas partes da

proteína não são capazes de voltar à conformação inicial. Consequentemente, a precipitação é

apenas reduzida com a adição de água, uma vez que a competição entre solvente e proteína é

eliminada pelo aumento da concentração efetiva de água, mas ainda resta precipitado por causa

da desnaturação protéica causada pelo solvente orgânico.

PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA

TUBO RESULTADO

1 -

2 + + +

3 -

QUESTÕES:

Qual o ponto isoelétrico (aproximação) da ovoalbumina?

Quais aminoácidos ionizáveis são mais abundantes nesta proteína?

Faça uma curva de ionização (aproximada) para a lisina:

RESPOSTAS:

Quando uma proteína se encontra em meio com pH igual a seu ponto isoelétrico, ou

seja, quando apresenta carga líquida nula, a repulsão eletrostática entre partículas diminui,

possibilitando interações proteína-proteína, gerando uma condição favorável para que as

moléculas de proteína se aproximem, agreguem e precipitem. O ponto isoelétrico aproximado

da ovoalbumina é no pH 4,7, pois é nesse pH em que há precipitação da proteína.

A ovolbumina de galinha é composta por 385 aminoácidos, possui os 20 aminoácidos

padrão, e sua massa molecular relativa é 45 kDa. A ovoalbumina também tem várias

modificações, como a acetilação N-terminal (G1), fosforilação (S68, S344), e glicosilação

(N292). É rica em aminoácidos com enxofre como a cisteína e metionina, apresenta 4 sulfidrilas

e forma duas pontes dissulfeto; estas pontes aumentam quando se armazena a proteína. Como

contém fósforo e glicídios unidos é uma fosfoglicoproteína, que é composta por três fracções

(A1, A2 e A3 na proporção 85: 12: 3) com diferente teor de fósforo. Os aminoácidos ionizáveis

mais abundantes são cisteína, metionina, histidina, ácido glutâmico, arginina e lisina.

A curva de ionização da lisina pode ser observada na Figura 2.

Figura 2 – Curva de ionização para a lisina.

4. CONCLUSÕES

Diante do observado com a realização da prática, é possível perceber experimentalmente as

propriedades das proteínas através de suas reações de precipitação. As reações de precipitação

podem ser provocadas por diversos tipos de agentes precipitantes, são úteis para a separação

das proteínas e podem ser também agentes desnaturantes, alterando a função original de uma

determinada proteína.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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