Abreu Rivero José Nelson

Eficacia de la melatonina en un modelo de isquemia y reperfusión en ratas

Universidad de Los Andes-Facultad de Medicina-Postgrado en Cardiología. 2001. p. 42

Venezuela

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE MEDICINA

INSTITUTO AUTÓNOMO

HOSPITAL UNIVERSITARIO DE LOS ANDES

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES

"Dr. Abdel Fuenmayor"

EFICACIA DE LA MELA TONINA EN UN MODELO DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN EN RATAS

Dr. JOSÉ NELSON ABREU RIVERO

MÉRIDA- VENEZUELA 2001

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE MEDICINA

INSTITUTO AUTONOMO

HOSPITAL UNIVERSITARIO DE LOS ANDES

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES

" Dr. Abdel Fuenmayor"

EFICACIA DE LA MELA TONINA EN UN MODELO DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN EN RATAS

MÉRIDA- VENEZUELA 2001

ASESOR Dr. Dumar Durán D

Título: Eficacia de la melatonina en un modelo de isquemia y reperfusión en ratas

Autor: José Nelson Abreu Rivero. Residente de post- grado de cardiología Departamento de cardiología. l. A. H. U.L.A. Mérida- Venezuela

Asesor Académico: Dr. Dumar Durán D. Profesor Facultad de Medicina. U.L. A. cardiólogo.

titular de la cátedra de farmacología. Farmacólogo cardiovascular. Médico

AGRADECIMIENTO

Al Dr. Dumar Durán por su valiosa orientación en la realización del presente trabajo.

DEDICATORIA

A MI PADRE, DIOS, TODO PODEROSO

A MI VIRGEN COROMOTO

A MI DIOSA ISIS

A MI MADRE VIRGEN DEL ROSARIO

A MI PADRE SAN CIPRIANO

TRABAJO PRESENTADO ANTE EL HONORABLE CONSEJO DE LA

FACULTAD DE MEDICINA COMO CREDENCIAL DE MÉRITO PARA OPTAR

AL GRADO DE ESPECIALISTA EN CARDIOLOGÍA

INDICE

l. Introducción .................................................................................. 1 - 3

II. Antecedentes ................................................................................. 4- 8

III. Materiales y Métodos................................................................... 9 - 17

IV. Resultados ..................................................................................... 18 - 24

V. Discusión ....................................................................................... 25- 29

VI. Conclusión .................................................................................... JO

VII. Bibliografia .................................................................................... 31 - 34

RESUMEN

Compuestos químicos, altamente reactivos, conocidos como radicales libres, son

producidos continuamente a nivel celular como moléculas citotóxicas. Estas sustancias

reactivas se producen en las mitocondrias, como derivadas de las prostaglandinas y de la

xantina-oxidasa. También se forman cuando se produce infiltración de leucocitos en el

miocardio lesionado y por la oxidación de las catecolaminas. Se sabe que causan

peroxidación lipídica de la membrana celular, sobrecarga de calcio intracelular y, por

consiguiente, alteraciones metabólicas, electrofisiológicas, morfológicas y funcionales del

miocardio expuesto. Recientemente, se le ha reportado a la melatonina (ML T), una

hormona sintetizada en la glándula pineal, un efecto barredor de radicales libres. Los más

recientes hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la

ML T, como responsable de dichas acciones. Para evaluar la eficacia antiisquémica de la

ML T, a través de su efecto barredor de radicales libres, realizamos un estudio experimental

utilizando ratas expuestas a un evento agudo de isquemia y reperfusión. Metodología: 30

ratas Sprague- Dawley del sexo masculino fueron divididas en tres grupos de 10 animales

cada uno: Un grupo sham ( toracotomía sin ligadura), un grupo control y un grupo tratado

con ML T. Al Wl!PO control y de estudio se les sometió a ligadura coronaria por 15 min. y

dos horas de reperfusión. Se evaluó el tamaño del infarto, la liberación de CK total, la

incidencia de arritmias ventriculares y la producción de peroxidación lipídica en el

miocardio. Resultados La ML T al compararse con el grupo control no mostró diferencia

significativa en reducir el tamaño del infarto ( 28,16 ± 2,55 Vs 30,7 ± 8,45%, p = NS). Los

niveles plasmáticos de CK total fueron menores en el grupo con ML T respecto al control (

496/o ) ( p < 0.05 ). La incidencia de extrasistoles ventriculares ( EV ) durante la fase de

isquemia fueron menores con la MLT al compararse con el grupo control ( p < 0.05 ). No

se encontró significancia con la Taquicardia ventricular ( TV ) en ninguno de los tres

grupos. La ML T mostró un efecto antioxidante potente, superior a los grupos de estudios

Conclusión: La ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg 1 IP administrada 15 min. antes del

procedimiento redujo marcadamente los productos de peroxidación lipídica y en menor

grado, aunque de forma significativa, los niveles séricos de CK total y las EV durante la

isquemia, sin embargo no tuvo efecto en reducir el tamaño del infarto.

INTRODUCCION

El infarto agudo del miocardio genera un estrés fisiológico y psicológico intenso que está

asociado a una actividad simpática generalizada aumentada. Esto produce una serie de efectos

adversos sobre el sistema cardiovascular que incluye taquicardia, arritmogénesis,hipertensión,

lipólisis y un incremento de la contractilidad cardiaca. 1

El tamaño del infarto es un factor determinante del pronóstico en sujetos con la forma

aguda. Las personas que mueren en choque cardiovascular a menudo tienen un solo infarto

masivo o uno de tamaño pequeño o moderado, añadido a múltiples infartos previos. A menudo,

las personas que viven después de grandes infartos tienen afección ulterior de la función

ventricular, y la mortalidad a largo plazo es más alta que en aquellos que sobreviven a infartos

pequefios. 2

Dada la importancia pronóstica del tamaño del infarto, se ha dedicado gran atención

experimental y clínica al concepto de que es posible modificar el tamaño de la zona lesionada.

Los esfuerzos por limitar el tamaño de la lesión se dividen en tres estrategias diferentes: 1)

reperfusión temprana, 2) disminución de las necesidades energéticas del miocardio ( oxígeno,

reposo, betabloqueantes, etc. ) y 3) manipulación de las fuentes de energía de dicha capa. 2

En algunos pacientes se produce espontáneamente la reanudación del riego sanguíneo

( reperfusión ). La reperfusión oportuna del miocardio en peligro constituye el medio más eficaz

de restaurar el equilibrio entre el aporte y la demanda de oxígeno del miocardio.

El proceso de reperfusión, aunque beneficioso en el salvamento del miocardio,puede

implicar cierto costo, por el fenómeno denominado daño por reperfusión. 3 Kloner ha resumido

los datos de los cuatros tipos de lesión por reperfusión observados en animales de

experimentación, 4 como sigue: 1) lesión mortal, término que denota la muerte de células que

eran viables para el momento en que se reanudó el flujo coronario, 2) lesión vascular por

2

reperfusión, que es el daño progresivo de vasos finos, de modo que hay una zona creciente sin

flujo nuevo y, con ello pérdida de la reserva vasodilatadora coronaria, 3) miocardio con

reperfusión funcional~ que comprende miocitos salvados cuyo periodo de disfunción contráctil

es duradero , después de reanudar el flujo sanguíneo, por anormalidades de la bioquímica

intracelular que ocasiona una menor producción de energía. 4) arritmias por reperfusión, que

son episodios de taquicardia y a veces fibrilación ventricular que surgen en un término de

segundos de reanudarse la circulación.

Ha atraído atención considerable la toxicidad de radicales libres derivados de oxígeno

mediada por lo menos en parte por los leucocitos estimulados, y su posible participación en la

extensión de la lesión miocárdica. 5 Estos compuestos químicos, altamente reactivos, conocidos

como radicales libres, son producidos continuamente a nivel celular como moléculas citotóxicas.

Se considera que estos radicales citotóxicos participan como mediadores del daño tisular en un

gran número de estados patológicos del miocardio. 6 Estas sustancias reactivas se producen en las

mitocondrias, como derivadas de las prostaglandinas y de la xantina-oxidasa. También se forman

cuando se produce infiltración de leucocitos en el miocardio lesionado y por la oxidación de las

catecolaminas. 7-

8

Últimamente, se ha considerado que el anión superóxido, los radicales hidróxilos y el

peróxido de hidrógeno, como radicales libres que son, producen daño celular cardíaco que se

presenta en la fonna de injuria por isquemia y reperfusión. 9 Estas sustancias reactivas se generan

intra y extracelularmente en el miocardio y en el endotelio vascular durante los eventos

isquémicos. Se sabe que causan peroxidación lipídica de la membrana celular, sobrecarga de

calcio intracelular y, por consiguiente, alteraciones metabólicas, electrofisiológicas, morfológicas

y funcionales del miocardio expuesto 10-

11

La célula cardíaca para defenderse de la producción y citotoxicidad de estos compuestos

intermediarios, se vale de mecanismos como la producción de enzimas antioxidantes entre las

que se encuentran la superóxido dismutasa, la catalasa y la peroxidasa. 12 Las mismas, se

distribuyen ampliamente en todos los téjidos y producen un efecto protector contra los radicales

libres.

3

Recientemente, Sugden 13 y Reiter 14 , le reportan a la melatonina (ML T), una hormona

sintetizada en la glándula pineal, un efecto barredor de radicales libres. Los más recientes

hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la ML T.

El mismo Sugden a través de estudios in vitro 13 , demostró que la ML T protege el ADN

del daño inducido por sustancias químicas carcinogénicas . Pierrefiche y col. 15 y Chuang y col. 16 compararon el efecto antioxidante de la melatonina con el que produce el glutation, el manitol

y las vitaminas E y C. Se sabe que la mela tonina es aproximadamente 100 veces más potente

como depurador de radicales libres que estos antioxidantes bien conocidos. 1s- 16

Así, la ML T ha demostrado ser útil en varias enfermedades degenerativas del SNC,

trastornos del sueño, retrazo psicomotor, trastorno inmunológicos, distrofia muscular, hepatitis,

enfermedades renales y ciertos tipos de cancer. 17•

18.

19• 20

Y 21

Los conocimientos de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es incipiente y existe

escasa literatura que mencionan los resultados de estudios experimentales en animales y clínicos

sobre la posible importancia de su uso en esta afección. Por eso ha despertado nuestra curiosidad

comprobar su eficacia como hormona en una preparación experimental in vivo que reproduce

fisiopatológicamente el papel de los radicales libres como citotóxicos.

4

ANTECEDENTES

La ML T es la principal hormona secretada por la glándula pineal, producida en humanos

con un ritmo circadiano y caracterizada por elevar sus niveles sanguíneos durante la

noche. Aunque su papel en procesos patológicos y fisiológicos en el humano no está

completamente entendido, la ML T cumple un número de funciones a concentraciones

fisiológicas y/o farmacológicas. Los mecanismos involucrados en las acciones de la ML T

incluye interacción con receptores de membranas , recientemente clasificados como mt 1 1 MT2 1

MT3 y a nivel del núcleo con receptores RZR 1 ROR ( 22 ). La ML T no es solamente producida

por la glándula pineal, sino también por la retina y otras células y tejidos de: vertebrados,

invertebrados, hongos, plantas, algas multicelulares y unicelulares.

Recientemente a la ML T se le atribuyen propiedades antioxidantes. 22•23

•24

•25

•26

•27

•28

y29 Se

cree que esta hormona trabaja vía donación de electrones para directamente detoxificar radicales

libres tales como los altamentes tóxicos radicales hidróxilos. Adicionalmente , tanto in vitro

como in vivo, la ML T ha demostrado proteger células, tejidos y órganos contra el daño

oxidativo inducido por una variedad de agentes que generan radicales libres tales como: Safrole,

lipopolisacáridos, ácido Kainic, agentes fentónicos, etc. Otras circunstancias, isquemia y

reperfusión , ejercicio excesivo y radiaciones iónicas también han demostrado ser productores de

radicales libres. La facilidad para ser barredora de sustancias citotóxicas, es probablemente

debido a su facilidad para cruzar las barreras morfofisiológicas, ejemplo: hematoencefálica,

compartimientos celulares y sub- celulares.

Maestroni en 1995 demostró, además de las propiedades antioxidante de la MLT,

propiedades inmunoestimulantes. Parece evidente que citoquinas derivadas de linfocitos T

constituye el principal mediador de los efectos inmunológicos de la MLT. También la

administración de esta hormona resultó en niveles elevados de interleukina - 4. 30

Bartsch en 1999 en un artículo publicado en Adv Exp Med Biol; 467: 247-64 hace

una revisión detallada del comportamiento de los niveles de ML T y su principal metabolito 6 -

Sulphatoxymelatonin en pacientes con diversos tipos de tumores primarios. El encontró una

5

reducción de dichos niveles de ML T y su metabolito, especialmente en los primarios de próstata

y mama. no evidenciandose mejoría de los niveles de la hormona aún después de la remoción de

estos tumores, lo que demuestra que la reducción de los niveles circulantes de esta honnona se

acompaña de cambios neuroendocrinos que afectan el ritmo circadiano de otras hormonas de la

adenohipofisis tales como la prolactina, somatotropina y estimulante del tiroide. 31

Kogan AK y col., determinaron en un modelo experimental de isquemia en ratas que la

severidad de la lesión isquémica puede ser reducida por la inhibición de la peroxidación lipídica

por radicales libres usando agentes antioxidantes de diferentes naturaleza química. Los autores

concluyen que la peroxidación lipídica por radicales libres juegan un papel intensi:ficador en la

patogénesis de la isquemia miocárdica y el infarto, y se recomiendan incluir drogas antioxidantes

en la protección cardíaca. 32

Debido a su potente efecto antioxidante ha crecido el interes en los últimos años en el

efecto protector de la ML T en estados patológicos debidos a la liberación de radicales libres. Sin

embargo, los estudios en isquemia miocárdica son muy escasos.

En modelos de isquemia y reperfusión en corazones aislados de ratas Kaneko y col.,

encontraron que la ML T favoreció de una manera significativa la recuperación de la función

ventricular y disminuyó la duración de episodios de taquicardia ventricular y fibrilación

ventricular. 33

Igualmente, Lagneux y col., en igual tipo de preparación, utilizando ML T en ratas a la

dosis de 1 ó 10 mg 1 Kg 1 IP, como pretratamiento, demostraron que las dosis máximas ( 10 mg 1

Kg 1 ) redujo de manera muy marcada la incidencia y duración de las arritmias de reperfusión,

así como el tamaño del infarto. 34

Dave RH y col., estudiaron el efecto de la MLT sobre parámetros hemodinámicos, flujo

sanguíneo y tamaño del infarto en un modelo de isquemia - reperfusión en conejos, encontrando

un efecto neutro sobre las variables estudiadas sin exacerbación de la isquemia nüocárdica o la

6

necrosis, lo cual lo llevó a concluir que la ML T no posee efectos sobre el sistema cardiovascular,

al menos en este modelo. 35

Sin embargo, Bosman y col., estudiando los mismos parámetros en monos( Baboons ),

encontraron un aumento del gasto cardíaco y de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo

con la administración de ML T por vía endovenosa. 36

Además, en diversos estudios en animales se ha encontrado que la ML T reduce la actividad simpática . 37

Por otro lado, estudios en pacientes con enfermedad isquémica coronaria han reportado disminución en la producción de MLT. 38

Finalmente un estudio por Salie y col., realizado en miocitos ventriculares adultos de ratas

sujetas a hipoxia química y reoxigenación reportó que la ML T reduce el daño, probablemente por

su efecto barredor de radicales libres y la acumulación de calcio intracelular. 39

7

OBJETIVOS E HIPOTESIS

GENERAL

Se evaluó la eficacia antüsquémica de la ML T en un modelo experimental " in vivo" de isquémia y reperfusión en ratas

ESPECÍFICOS

l. Se evaluó el tamaño del infarto en los grupos control y tratados con ML T

2. Se evaluó la integrida de la célula miocárdica por medio de la cuantificación de

enzimas cardíacas en los grupos control, sham y tratados con ML T

3. Se evaluó la incidencia de arritmias cardíacas en los grupos control, sham y tratados conMLT

4. Se evaluó el efecto antioxidante de la MLT mediante la detenninación de los productos de peroxidación lipídica

HIPOTESIS

La administración de ML T , a dosis de 1 O mg 1 kg IP le brinda al corazón de la rata,

expuesta a un evento isquémico y de reperfusión, una protección mayor que el grupo control.

VARIABLES

DEPENDIENTE.

Cambios enzimáticos en ambos grupos experimentales

Incidencia de arritmias cardíacas en ambos grupos experimentales

Cuantificación de el área infartada en ambos grupos experimentales

Cuantificación de productos de peroxidación lipídica en ambos grupos experimentales

INDEPENDIENTE

Administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 kg IP

INTERVJNIENTE

Peso de las ratas en los grupos control y tratados con ML T Sexo de las ratas en los grupos control y tratados con ML T

8

9

MÉTODOS DE PROCEDIMIENTO

~LESDEEXPE~NTACIÓN

El protocolo se realizó en un total de 30 ratas sanas Sprague - Dawley, del sexo

masculino con una edad entre 14 y 16 semanas y un peso entre 300 y 350 gramos, obtenidas del

vivario de la Facultad de Medicina. Las mismas fueron trasladadas al Departamento de

Fannacología y Toxicología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes y se

alimentaron con Ratarina comercial y agua " ad - libitum " en jaulas compartidas por cinco de

ellas.

DISEÑO EXPERIMENTAL

El total de 30 ratas fue dividido al azar antes de provocar el infarto experimental en tres grupos a saber:

Grupo 1: "Sham" experimental ( toracotomía sin ligadura, n= 10)

Grupo ll: Control. Solución salina vía IP , 15 min. previos al procedimiento ( n= 1 O )

Grupo ID: ML T 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento ( n= 1 O )

MODELO EXPERIMENTAL DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN

El modelo utilizado se basó en la técnica descrita por Pfeffer y coL, modificada 40 . Las

rata fueron anestesiadas con Pentobarbital a 60 mg 1 Kg IP, diluido en solución salina al 0,90/o.

Se mantuvo la temperatura con la utilización de una lampara a 3 7 o C. Posteriormente, se canuló

la traquea y fueron conectadas a un ventilador con aire de ambiente a un volumen de 1 a 1 ,5 ce

1 100 gr. de peso. Inmediatamente, se procedió a realizar una toracotomía izquierda, disección del

pericardio y exteriorización del corazón mediante presión ligera de las partes laterales del tórax.

Luego con la utilización de una seda cardiovascular 4 -0 se colocó una ligadura en la arteria

coronaria descendente anterior izquierda entre el tracto de salida de la arteria pulmonar y la

aurícula izquierda. Se constató la isquemia por el cambio de coloración del miocardio, la

10

elevación del segmento ST en el ECG y la aparición de arritmias. Luego el corazón fue

colocado en su posición normal y el tórax fue cerrado con seda 2 - O. Transcurrido 15 min. (

fase de isquemia ) se procedió a reabrir el tórax y liberar la arteria previamente ocluida. Se

colocó de nuévo el corazón en su posición nonnal, se cerró el tórax mediante sutura ya descrita y

se mantuvo el animal en estas condiciones durante 120 min. (fase de reperfusión). Fig. 1 A- B

TAMAÑO DEL INFARTO

Al finalizar la fase de reperfusión , se sacrificó al animal, se removió el corazón y se lavó

con solución salina fria Se separaron las auriculas y el ventrículo derecho del ventrículo

izquierdo. El ventriculo izquierdo se pesó y se cortó desde el ápex hasta la base en tres cortes

transversales. Cada corte fue lavado de nuevo en solución salina e incubado en una solución al

1% de cloruro de triphenyl tetrazolium ( TTC ) amortiguado con tris buffer al 0,2 M y a un pH de

7,8 durante 10 min. Posteriormente cada corte fue escaneado con una resolución de 6000 dpí y

almacenado en la memoria de un PC en formato de imagen JPG. Dichas imágenes fueron

proyectadas a través de un video vin a una distancia fija y fueron caligrafiadas por ambas caras de

cada corte en un block de dibujo. Se realizó planimetría del área epicárdica y endocárdica. El área

del VI se obtuvo con la resta del área epicárdica menos la endocárdica. También se realizó

planimetría de la porción infartada, la cual se correlacionó con el área del VI, obteniendo así el

porcentaje de área infartada. El téjido miocárdico necrótico ( infarto ) se reconoce por la falta de

captación del colorante TTC, mientras que el área no infartada toma una coloración rojo ladrillo 41

. Fig • 2 A - B

Figura. 1., Bje.ij1plo elec:trocat"dipgráfico (ECG< ·· :Dll) de A: Ritrno .sm'u:sal nor.tnál previo a. la 1igad1..1.1::a c ,o:ronaric:L B .: Eievacion. marcada: del seg:rt:tento ST dura::tt:te la fase de isquemia_

'! ..

14

DETERMINACIÓN DE CPK TOTAL

A todos los grupos se le tomaron muestras de sangre de aprox. 2 ce de la vena cava

inferior para la determinación enzimática a las dos horas de iniciado el procedimiento. La

determinación enzimática de la CK total se efectuó mediante la técnica de inmunoinhibición y

espectrofotometría UV descrita por Wuerzburg y col., y Gerhardt y col. 42

•43

•44

•45

•46

Y 47

DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE PEROXIDACION LIPÍDICA

A todos los grupos se le tomó muestras de téjido miocárdico de la base del corazón, las

cuales fueron congeladas. El stress oxidativo fue estudiado mediante la determinación de

productos de peroxidación lipídica basado en la determinación de las concentraciones del ácido

malón dialdehido usando como reactivo al ácido tiobarbitúrico ( TBARS). El día de la

determinación, se descongeló en un bailo de maria. Se cortó un trozo de aprox. 100 mg, se

trituró y se homogeneizó en 5 ce de solución fria salina. Del homogeneizado, se tomaron 100

microlitros para la determinación de los productos de peroxidación lipídica basado en la

determinación de las concentraciones del ácido malón dialdehido usando como reactivo al ácido

tiobarbitúrico ( TBARS ). El TBARS se analizó por espectrofluorometria. 48

INCIDENCIA DE ARRITMIAS

Para la detección de arritmias, se obtuvo de cada animal un registro electrocardiográfico

continuo durante la fase de isquemia y durante la reperfusión mediante la utilización de

electrodos sub- cutáneos insertados en las cuatros extremidades del animal, los cuales fueron

conectados a través de un preamplificador a un aparato de registro polígrafo Grass modelo 7. Se

cuantificó el número de episodios de arritmias ventriculares tales como taquicardia ventricular (

TV ) sostenida, definida como aquella con más de 15 latidos y TV no sostenida, igualmente se

cuantificó el número de extrasistoles ventriculares. Fig. 3 A - B

17

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados fueron expresados para cada grupo en valores promedios± error estándar.

Para la comparación intergrupo de las variables tamaño del infarto, incidencia de arritmias

cardíacas, niveles enzimáticos y productos de peroxidación lipídica se aplicó el análisis de

varianza ( ANOVA) y cuando hubo diferencias significativas entre ellas, estas se analizaron por

el test de Student ( prueba de "t" ) para datos no apareados. Se consideró significativo a todo

valor de p < 0,05.

Todo el análisis estadístico fue procesado con un sofware STATGRAPHICS PLUS 2

18

RESULTADOS

DATOS MORFOMÉTRICOS

La tabla 1 muestra los datos morfométricos de los 3 grupos experimentales utilizados en

nuestro trabajo. Como es de notar, el peso promedio de las ratas controles fue de 423 ± 10.3 grs,

el del grupo tratado con MLT de 352.9 ± 17.9 grs y el grupo sham de 305 ± 9.8 gr. En relación al

peso de los corazones y del VI notamos homogeneidad en los tres grupos ya que no hubo

significancia estadística al aplicarse la prueba correspondiente. (Tabla 1 )

TAMAÑO DEL INFARTO

La administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento,

disminuyó el área infartada de 30.70 ± 8.45% (Grupo control) a 28.16 ± 2.55% (Grupo tratado

con ML T ), lo que equivale a un porcentaje de reducción muy bajo de aproximadamente 3%,

siendo la misma no significativa estadísticamente. Gráfico 1

CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE ENZIMA CARDÍACA: CPK- TOTAL

La concentración plasmática de enzimas cardíacas, en este caso de CPK - TOTAL

muestra significancia estadística ( p < O. 04 ) entre los grupos control y tratado con ML T al

obtenerse valores plasmáticos de 3969.6 U/Len el grupo control y de 2006.2 U/Len el grupo

tratado. Así mismo, esta relación fue de mayor significancia ( p< 0.001 ) entre los grupos con

MLT y sham, siendo los valores de este último de 962.5 U/ L. Gráfico 2

INCIDENCIA DE ARRITMIAS CARDÍACAS

La incidencia de arritmias cardíacas, en este caso de taquicardia ventricular y extrasístoles

ventriculares a nivel del grupo control y tratado con ML T durante la fase de isquemia encontró

significancia estadística solamente con la presencia de extrasístoles ventriculares, al presentarse

esta última con un promedio de 62.5 ± 30.02 en el grupo control y de 32.8 ± 28.68 en el grupo

con MLT., lo que equivale a un porcentaje de reducción de un 470/o. Gráfico 3

19

PRODUCTOS DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA

Los productos de peroxidación lipídica evaluados mediante la determinación del TBARS

fue menor en el grupo tratado con W...T ( 22,49 ± 9,95 nmol 1 mg de proteína ) en comparación

con el grupo control ( 61,24 ± 33,44 nmol 1 mg de proteína ) siendo esta diferencia

estadísticamente significativa ( p< 0.001 ). Esta misma tendencia se mantuvo con el grupo sham

cuya concentración fue de 35,58 ± 7,74 nmol 1 mg de proteina. GráfiCO 4

TABLA 1

DATOS MORFOMÉTRICOS

Peso de la rata (gr) Peso del corazón (gr) Peso del U I (gr) Media E.E Media E.E * Media E.E *

CONTROL 423 10,3 1169 25,2 742 17,63

MLT 352,9 17,9 1148 62,1 710 29,0

Sham 305 9,8 1053 60 689 35,2

* NS

50

40 ~ o ca

"C 30 ca t:: ~ S::

ca 20 Q) lo.

<(

10

o

Gráfico 1

Area Infartada en grupos de ratas sham, controles y tratadas con melatonina

*

Control MLT Sham

Grupos Experimentales

* P > 0.05 Vs control

--

Gráfico 2

Concentraciónes plasmáticas de CPK-Total en ratas sham, controles y tratadas con melatonina

6000~--------------------------------------.

J:9 4000 o 1-

1

~ D.. o e: '0 2000 +--·-o f! ~

e: C1) o e: o o o-+---

*

Control MLT

Grupos Experimentales

'~ P < 0.05 Vs Control ** P < 0.01 Vs Sham

**

Sham

-o

Gráfico 3

Incidencia de extrasistoles ventriculares durante la Fase de Isquemia en ratas controles y tratadas con melatonina

100 .-----------------------------------------------.

80 +-----------r---------------------------------~ *

z 60 -¡--- - --~ 40 -t---- -

20 +----

o -t-----

Control MLT

Grupos Experimentales

* P < 0.05 Vs control

Gráfico 4

100

Productos de peroxidación lipídica en grupos de ratas sham, controles y tratadas con

melatonina

90+------r--------------------------------

80+-----~--------------------------------

70+------r--------------------------------ca _. e

a. 'Ci36Q--t--­Q)+-' -ce tn c. o C') 50 +----0 E ::l­"C_ o o 40 --t---0:. E

e 30+--

20+--

10+--

0+--

Control

*

MLT

Grupos experimentales

* P < 0.05 Vs Control

*

Sham

25

DISCUSIÓN

TAMAÑO DEL INFARTO

La enfermedad arterial coronaria es actualmente una de las principales causas de muerte

en los paises desarrollados. Los radicales libres juegan un papel importante en la patogénesis y

progresión de esta enfermedad.

En un tejido isquémico abundan los radicales libres provenientes del oxígeno y pudieran

contribuir a la lesión del miocardio, en particular después de reanudar el flujo sanguíneo. 49

Durante la isquemia miocárdica, los radicales libres son generados por las mismas células

miocárdicas lesionadas, por los neutrófilos que migran al área de injuria, por las plaquetas y por

las células endoteliales. Igualmente, la reintroducción de oxígeno al miocardio isquémico puede

incrementar la injuria celular a través de un aumento en la producción de radicales libres. Estos

promueven la peroxidación lipídica y adicionan un sustrato para el sistema xantino - oxidasa. Un

aumento en el calcio intracelular durante la isquemia miocárdica y reperfusión pueden

incrementar la actividad de la ATPasa y fosfolipasas, los cuales generan más cantidad de

radicales libres con una mayor injuria so

Un medio directo de limitar la producción de radicales libres es limitar la producción

de los principales metabolitos del oxígeno: anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales

hidroxilos.

Datos de estudios en animales sugirieron que la extensión de la necrosis del miocardio

y la disfunción posisquémica pueden mejorar por medio de eliminadores de radicales libres de

oxigeno, como serian la dismutasa de superóxido, pero los resultados iniciales no han sido

alentadores en seres humanos. 51

Otras formas de terapéutica antioxidante, como las vitaminas E y C se estudian en

animales de experimentación, pero no hay certeza respecto a su posible utilidad en el ser

26

humano. 52 De tal manera que el papel de agentes antioxidantes como medida terapéutica ha

sido un tema de mucha controversia.

Recientemente, Sugden 13 y Reiter 14, han reportado que una hormona sintetizada en la

glándula pineal, y conocida como ML T, posee un efecto barredor de radicales libres. Los más

recientes hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la

ML T, como responsable de dichas acciones.

La importancia de la ML T ( N - acetil - 5 - metoxitriptamina ) estriba en su capacidad

de regular numerosos procesos fisiologicos relacionados con los ritmos biológicos y la función

neuroendócrina. Su acción bioquímica consiste principalmente en la inhibición de la

adenilciclasa, probablemente por actuar sobre receptores asociados a proteinas G. Dentro del

SNC se han descrito sitios de fijación específicos para ML T en la retina, pars tuberalis 1

eminencia media, nucleos supraquiasmatico del hipotalamo, área postrema y otras estructuras

relacionadas con la sincronización de ritmos biológicos.

Estudios in vivo e in vitro han sido llevados a cabo con la MLT. Todos han tenido como

objetivo evaluar el efecto antioxidante de esta hormona, principalmente dirigidos a comprobar su

eficacia en patologías del SNC, que tienen como mecanismos fisiopatológicos la producción de

radicales libres.

En contraposición, los conocimientos de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es

incipiente y existe escasa literatura que mencionan los resultados de estudios experimentales en

animales y clínicos sobre la posible importancia de su uso en esta afección, y si tomamos en

consideración que los radicales libres son determinantes en la extensión de la zona infartada y en

la inestabilidad de la membrana del miocito, a través de los mecanismos mencionados

anteriormente, fue razonable pensar porque no estudiarla en una preparación in vivo que

reprodujera fisiopatologicamente el comportamiento de los radicales libres como citotoxicos. Por

tal motivo se implementó un modelo de isquemia y reperfusión en ratas, las cuales fueron

sometidas a 15 min. de isquemia y 2 horas de reperfusion.

27

Los resultados obtenidos muestran homogeneidad en el peso de los corazones y del VI

en los 3 grupos estudiados. ( tabla 1 ). Se ha demostrado que la edad asi como un mayor tamaño

de la masa ventricular en modelos experimentales llevados a cabo in vivo incrementan la injuria

por isquemia y reperfusión.

La administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 mio. previos al procedimiento

disminuyó el tamaño de la zona infartada en un 3% al compararse los resultados del grupo

control con el grupo tratado con ML T ( ver Gráfico 1 ). Sobre la eficacia cardioprotectora de la

MLT hay pocos reportes y con resultados controversiales. Así, Lagneux y coe2 en ratas

pretratadas con ML T a dosis de 1 O mg 1 Kgl IP en un modelo de isquemia y reperfusión

reportaron que esta hormona redujo de manera marcada el tamaño del infarto. Otros como Dave

RH y col, estudiaron el efecto de la ML T sobre parámetros hemodinámicos, flujo sanguíneo y

tamaño del infarto en un modelo de isquemia y reperfusión en conejos, encontrando un efecto

neutro sobre las variables estudiadas, lo cual lo llevó a concluir que la ML T no posee efectos

sobre el sistema cardiovascular, al menos en este modelo.

En otros modelos de isquemia y reper:fusión, tales como los de neuroprotección, la ML T

ha demostrado disminuir el tamaño del infarto en ratas sometidas a obstrucción de la arteria

cerebral. 32

LmERACIÓN DE CK Total

La concentración plasmática de enzima cardíaca ( CPK - TOTAL ) mostró significancia

estadística ( p < 0.04 ) entre los grupos control y tratado con MLT al obtenerse valores

plasmáticos de 3969.6 U/Len el grupo control y de 2006.2 U/Len el grupo tratado. Así mismo,

esta relación fue de mayor significancia ( p< 0.001 ) entre los grupos con MLT y Sham, siendo

los valores de este último de 962.5 U/ L ( Grár~eo 2 ).

Estos resultados son acorde a lo esperado, ya que el grupo sham ( traqueostomía y

toracotomía ) no sufrió ligadura coronaria.

En modelos de isquemia en ratas, ligando la coronaria izquierda, los niveles séricos de CK

se elevan entre las 3 y 5 horas post IM ( pico máximo ). La administración de ML T redujo en

forma sifnificativa los niveles de CK total ( 490/o ) al compararla con el control, a pesar de no

28

tener efecto sobre el tamaño del infarto. Esto posiblemente sea debido a su acción antioxidante y

barredora de radicales libres que de algún modo limitó el daño miocárdico tal como se reflejó en

su efecto sobre los productos de peroxidación lipídica, analizados más adelante. El conocimiento

de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es incipiente y existe escasa literatura que

mencionan los resultados de estudios experimentales en animales. En la literatura revisada, donde

se halló algún efecto cardioprotector de la ML T, no se mencionan su efecto sobre la liberación de

CK total. Consideramos necesario la realización de nuevos estudios con mayor número de

animales para establecer el efecto real de esta droga sobre la cardiopatía isquémica.

ARRITMIAS

Es ya conocido que los radicales libres provocan peroxidación lipídica de la membrana

celular y alteran la excitabilidad de la misma al aumentar los niveles de calcio intracelular, de

manera tal que la aparición de arritmias cardíacas es común en las preparaciones in vivo e in vitro

con agentes oxidantes. En el infarto del miocardio, los radicales libres son en partes responsables

en la aparición de arritmias cardiacas. Nuestro modelo experimental, reprodujo los eventos de

isquemia y reperfusión , notandose durante los mismos la aparición de arritmias cardíacas. Las

taquiarritmias ventriculares del tipo taquicardia ventricular y extrasistoles ventriculares

predominaron durante el estudio, y por tal motivo se tomaron en consideración para el análisis

correspondiente. La incidencia de extrasistoles ventriculares fueron menores y significativas

durante la fase de isquemia entre el grupo control y tratado con ML T. Nuestros resultados

coinciden con otros modelos de isquemia y reperfusión,. Lagneux y col., y Kaneco y col,

utilizando corazones aislados de ratas encontraron que la ML T disminuyó la duración de

episodios de taquicardia ventricular y fibrilación ventricular. 31

PRODUCTOS DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA

La determinación de productos de peroxidación lipídica fueron reducidos marcadamente

por la ML T a la dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento, esto en comparación

con los otros dos grupos de estudio. El mecanismo de acción de la MLT, como barredora de

radicales libres bien explican este comportamiento. Reiter ha sido un pionero en el estudio del

29

mecanismo de acción de la ML T, en donde la han comparado con otros antioxidantes, siendo la

ML T 100 veces más potente. Este efecto antioxidante de la ML T concuerda con Pierrefiche y col 15 quienes al comparar el efecto antioxidante de la ML T con el que produce el glutatión, el

manitol y las vitaminas E y C, encontraron una superioridad de esta hormona en un 100%.

El efecto intensificador·del daño miocárdico producido por la peroxidación lipídica de la

membrana celular con la formación de radicales libres es bien conocido. Kogan AK y col. 32

determinó en un modelo experimental de isquemia en ratas que la severidad de la lesión

isquémica puede ser reducida por inhibición de la peroxidación lipídica por radicales libres

usando agentes antioxidantes de diferentes naturaleza química. De esta manera explicamos el

efecto cardioprotector exhibido por la ML T en este modelo de isquemia y reperfusión en ratas,

sobre todo expresado en disminución de los niveles de CK total, efecto antiarrítmico y efecto

antioxidante potente.

30

CONCLUSIONES

l. La melatonina a dosis de 1 O mg 1 Kg 1 IP administrada 15 min. antes del procedimiento

redujo marcadamente los productos de peroxidación lipídica y en menor grado, aunque

de forma significativa los niveles séricos de CK total y las extrasistoles ventriculares

durante la isquemia, sin embargo, no tuvo efecto en reducir el tamaño del infarto.

2. Se corroboró en este trabajo el efecto antioxidante predominante de la melatonina

31

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