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Serviço Público Federal Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Biologia - Mestrado Avaliação da Atividade Genotóxica do Composto Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) sobre Cultura de Linfócitos do Sangue Periférico Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, B. Sc.
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Serviço Público FederalUniversidade Federal de GoiásInstituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia - Mestrado
Avaliação da Atividade Genotóxica do Composto Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) sobre
Cultura de Linfócitos do Sangue Periférico
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, B. Sc.
GOIÂNIA, FEVEREIRO DE 2008.
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro
Avaliação da Atividade Genotóxica do Composto Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) sobre
Cultura de Linfócitos do Sangue Periférico
Dissertação apresentada à Univers idade
Federal de Goiás como parte dos
requis i tos para obtenção do Tí tulo de
Mestre em Biologia.
Área de Concentração : Biologia
Celular e Molecular
Orientadora: Prof.Drª. Elisângela de Paula Silveira Lacerda
GOIÂNIA, FEVEREIRO DE 2008
Avaliação da Atividade Genotóxica do Composto Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) sobre
Cultura de Linfócitos do Sangue Periférico
Profª. Dr.ª Elisângela de Paula Silveira Lacerda 1
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, B.Sc 1 *
1 Laboratório de Genét ica Molecular e Ci togenét ica. ICB I - sala 200. Campus II. Univers idade Federal de Goiás .
* Correspondência: agarbio@hotmai l .com
Fevereiro / 2008
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA..........................................................................................................
AGRADECIMENTOS................................................................................................
APOIO FINANCEIRO...............................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................
LISTA DE TABELAS E FIGURAS..........................................................................
LISTA DE TABELAS E FIGURAS ARTIGO 1......................................................
LISTA DE TABELAS E FIGURAS ARTIGO 2......................................................
INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................
JUSTIFICATIVA........................................................................................................
OBJETIVOS................................................................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................
ARTIGO 1: COMPLEXOS METÁLICOS COM EFEITO ANTITUMORAL...
RESUMO......................................................................................................................
ABSTRACT..................................................................................................................
INTRODUÇÃO............................................................................................................
1. COMPOSTOS DE RUTÊNIO (KP1019, RM175, NAMI, NAMI-A, RAP,
MMI/ONCO4403, CLORETO DE CIS-TETRAAMINOXALATORUTÊNIO
(III))...............................................................................................................................
2. COMPLEXO CLORETO DE CIS-TETRAAMINODICLORORUTÊNIO (III)......
3. PERSPECTIVAS......................................................................................................
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
ARTIGO 2: AVALIACAO DOS EFEITOS GENOTOXICOS EM CULTURA
DE LINFOCITOS HUMANOS TRATADOS COM O Cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) EM DIFERENTES CONCENTRACÕES..........
RESUMO......................................................................................................................
ABSTRACT..................................................................................................................
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................
2. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................
i
ii
iv
7
9
10
11
12
23
24
25
33
3435
36
38
43
45
46
51
52
53
54
56
64
3. RESULTADOS........................................................................................................
4. DISCUSSÃO............................................................................................................
5. CONCLUSÃO..........................................................................................................
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
CONSIDERAÇÕES FINAIS.....................................................................................
ANEXOS.....................................................................................................................
67
73
74
83
85
LISTA DE ABREVIATURAS
[Co(NH3)6]Cl3 : Hexamintriclorocobalto
[Ni(CO)4]: Tetracarbonilniquel
µg.mL : Micrograma por mL
ACs : Aberrações Cromossômicas
ANVISA : Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Bcl2: família de proteínas formada por 25 membros de aceleradores que
regulam processo de permeabilização mitocondrial e faz parte do
processo apoptótico.
CO2 : Dióxido de Carbono
DACH- oxaliplatina {[(1R,2R-diaminociclohexano)oxalato-platina(II)]
(1,2-diaminociclo-hexano
DL5 0 : Dose Letal 50%
DMSO : Dimetil-sulfóxido
DNA: Ácido Desoxirribonucleotídeo
DXR : Doxorrubicina
EC : Ensaio Cometa
EDTA : Ácido Etilenodiaminotetracético, sal dissódico
HCl: Ácido Clorídrico
HIV: Human Immunodeficiency Virus
IC5 0 : Concentração da droga estabelecida para inibir crescimento celular
em 50%
Im : Imidazol
IM: Índice Mitótico
INCA: Instituto Nacional de Câncer
IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry
KP 1019 : trans-[tetraclorobisindazolrutênio (III)]
mg.mL : Miligrama por mL
MMI : Medical Marketing International
NaCl: Cloreto de Sódio
NAMI : Na trans-[Ru(Im)(Me 2SO)Cl 4]
NAMI-A : (ImH) trans- -[Ru(Im)(Me2SO)Cl4]
NaOH: Hidróxido de Sódio
NH4OH: Hidróxido de Amônia
RAP: cis-dicloro-1,2-propilenodiamino-N,N,N0,N0-tetraacetato rutênio
(III)
RM 175 : [(η6-C6H5C6H5)-Ru(en)Cl]+
RPM: Rotações por Minuto
RPMI 1640 : Roswell Park Memorial Institute
S180 : Sarcoma 180
SCGE : Single Cell Gell Eletrophoresis
Tf : Transferrina
LISTA DE TABELAS - INTRODUÇÃO GERAL
Tabela 01 : Estimativas, para o ano 2008, de número de casos novos por
câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária.. . . . . . . . . . . . .13
Tabela 02 : Classificação quanto ao tipo de quimioterapias.. . . . . . . . . . . . . . . . .13
LISTA DE TABELAS E FIGURAS - ARTIGO 01
Figura 01: Em destaque, metais e não metais conhecidos por formarem compostos
que exibem atividade antitumoral............................................................................... 36
Figura 02: Mudança do estado de oxidação do rutênio em ambiente celular regular e
tumoral. O ambiente das células cancerígenas favorece a redução do Ru(III) a Ru(II),
que é mais ativo biologicamente. Conseqüentemente, compostos de Ru(III) são
essencialmente pró - fármacos ativados pela redução nas células cancerígenas. Fonte:
CLAIRE & DYSON, 2001..........................................................................................40
Figura 03: Estrutura química do KP1019 (acima a esquerda), de RM175 (acima à
direita), do composto indol carbazol rutênio (abaixo a esquerda) e da NAMI-A (abaixo
a direita) (Bergamo & Sava, 2007).................................................................42
Figura 04: Estrutura do íon complexo cloreto de cis-tetraaminoxalatorutênio
(III)..............................................................................................................................43
Figura 05: Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III)............................................44
LISTA DE TABELAS E FIGURAS - ARTIGO 02
Tabela 01 - Índice mitótico, total de aberrações cromossômicas e
metáfases aberrantes em cultura de linfócitos humanos tratados com
diferentes concentrações de cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Tabela 02 : Número de núcleos analisados, normais e alterados, com os
respectivos danos.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Figura 01 : Fórmula Estrutural da doxorrubicina.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Figura 02 : Delineamento experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Figura 03 : Esquema do ensaio cometa.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Figura 04 : Classificação: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe
0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça ( classe 1); cauda até duas
vezes o diâmetro da cabeça ( classe 2): cauda maior que duas vezes o
diâmetro da cabeça ( classe 3) e sem cabeça ( classe 4).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
Figura 05: Metáfases encontradas após tratamentos com o cis-
tetraamindiclororutênio (III). Em: A-controle negativo; B- Ru 1µg/mL - 1 ;
C- Ru 10µg/mL - 1 ; D- Ru 100µg/mL - 1 ; E- Ru 1000µg/mL - 1 ; F- controle
positivo (quebra cromatídica no braço longo do cromossomo 2).. . . . . . . . . .63
Figura 06 : C-: controle negativo; Ru4: rutênio 1µg.mL - 1 ; Rut3: 10µg.mL -
1 ; Rut2: 100µg.mL - 1 ; C+: controle posit ivo. *P<0,05; **P<0,01;
***P<0,001; ****P<0,0001... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
O câncer é uma doença genética das células somáticas. Nas células
cancerosas, surgem várias mutações que afetam a sua multiplicação e sua
propagação. Tanto as mutações de ganho de função dos oncogenes quanto
as mutações de perda de função dos genes supressores tumorais podem
contribuir para a progressão de um tumor através do desequilíbrio dos
controles normais que reprimem o ciclo celular ou que promovem a
apoptose (Griffith et al. , 2001).
No Brasil, a estimativa para o ano de 2008 aponta que ocorrerão
466.730 novos casos de câncer. Os tipos mais incidentes serão os de
próstata e pulmão para o sexo masculino e mama e colo útero para o sexo
feminino (Tabela 01). Tornando-se o terceiro grupo de causas de
mortalidade, superado apenas por doenças cardiovasculares e por morte
acidental - tanto acidentes de trânsito quanto violência urbana - e
consolidando-se como um problema de saúde pública (INCA 2008).
Os termos “câncer”, “neoplasia maligna” e “tumor maligno” são
sinônimos e dist inguem-se dos tumores benignos pelo poder de invasão e
capacidade de metastatizar-se, isto é, disseminar-se para outras partes do
corpo (Lodish et al. , 2000).
Existem três abordagens principais para o tratamento de câncer:
excisão cirúrgica, irradiação e quimioterapia dependendo do tipo de
tumor e o estágio de desenvolvimento. A quimioterapia constitui o
método mais uti lizado como adjuvante da cirurgia para muitos tipos de
tumores (Laurence et al. , 1997). É classif icada como curativa, adjuvante,
neoadjuvante e paliativa (INCA 2008), (Tabela 02).
Tabela 1: Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária.
Localização PrimáriaNeoplasia Maligna
Estimativa de casos novosMasculino Feminino Total
Próstata 49.530 - 49.530Mama Feminina - 49.400 49.400Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.810 9.460 27.270Cólon e Reto 12.490 14.500 26.990Estômago 14.080 7.720 21.800Colo do Útero - 18.680 18.680Cavidade Oral 10.380 3.780 14.160Esôfago 7.900 2.650 10.550Leucemias 5.220 4.320 9.540Pele/Melanoma 2.950 2.970 5.920Outras Localizações 55.610 62.270 117.880Subtotal 175.970 175.750 351.720Pele/não-Melanoma 55.890 59.120 115.010Todas as Neoplasias 231.860 234.870 466.730
Fonte: MS/Instituto Nacional de Câncer – INCA
Tabela 2: Classificação quanto ao tipo de quimioterapias.
Classificação Objetivos Exemplos
Curativa
Controle completo do
tumor
Doença de Hodgkin, leucemias
agudas, carcinomas de testículos,
coriocarcinoma gestacional.
Adjuvante
Esterilizar células residuais
locais ou circulantes,
diminuindo incidências de
metástases à distância.
Câncer de mama em estádio II.
Neoadjuvante ou
prévia
Redução parcial do tumor Quimioterapia pré-operatória aplicada
em caso de sarcomas de partes moles e
ósseos
PaliativaQualidade de sobrevida Carcinoma indiferenciado de células
pequenas do pulmão1.2. Drogas Antineoplásicas
O conjunto de drogas antineoplásicas inclui agentes químicos que
podem impedir o desenvolvimento de tumores através da inibição do
crescimento celular ou pela morte das células que estão se replicando de
forma continuada. Essas drogas incluem agentes alquilantes
(ciclofosfamida), antimetabólicos (fluorouracil), antibióticos
(doxorubicina), derivados vegetais (vincrist ina), hormônios
(dietilsti lbestrol) e agentes diversos, que não se enquadram nas
categorias anteriores (Goodman & Gilman., 2002).
Agentes físicos e químicos usados como citostático têm
demonstrado capacidade de induzir dano cromossômico, tanto em
experimentos in vitro , como em estudos de monitoramento de pacientes
tratados com este tipo de terapia (Migliore et al. , 1991-a; Green et al. ,
1991). Muitas drogas antitumorais como os agentes alquilantes,
inibidores de topoisomerase II e tiopurinas podem provocar mutações no
DNA e podem causar câncer secundário (Jemal et al. , 2004).
1.3. Drogas Metálicas
Há muitos anos atrás, metais preciosos como o ouro eram usados
no tratamento de enfermidades e acreditava-se que estes metais eram
benéficos para a saúde humana. Mas, estudos recentes têm associado as
propriedades medicinais de drogas inorgânicas com suas propriedades
biológicas (Claire & Dyson, 2001).
A descoberta das propriedades antitumorais da cisplatina na década
de 1960 revolucionou a terapia dos tumores (Rosenberg et al. , 1969;
Claire & Dyson, 2001). A cisplatina é uma das drogas de maior efeito
citostático desenvolvida para o tratamento de carcinomas sólidos
(Nicolini, 1988) e, desde o seu desenvolvimento, vários complexos
metálicos de platina e não-platina foram sintetizados e testados,
demonstrando atividade antitumoral (Kostova, 2006).
Muitas drogas com compostos metálicos são usadas para outros
tipos de tratamentos além do câncer como a prata, que é usada para o
tratamento de infecções microbianas; o ouro que atua no tratamento do
câncer, vírus (HIV), asma, malária e artri te reumática (Claire & Dyson,
2001).
Vários outros compostos derivados de metais têm sido testados
contra tumores em modelos humanos e animais experimentais. Estes
compostos derivados compreendem os compostos metálicos, bismuto
vanádio, irídio, rutênio, gálio, ir ídio, t itânio, germânio e outros
(Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Silveira-Lacerda, 2003).
Dentre os agentes antineoplásicos provenientes de metais, os mais
promissores são os compostos de rutênio, pelo fato de demonstrarem
atividade antimetastática e o câncer metastático ser de difícil controle. A
descoberta da propriedade antimetastática representa um importante
marco no desenvolvimento de uma nova droga antitumoral (Sava et al. ,
1999). O conhecimento da progressão dos tumores no estágio de
metástase e o aparecimento de tumores secundários são importantes para
o desenvolvimento de novas terapias que aproximam dos diagnósticos e
do tratamento de tumores malignos (Bergamo & Sava, 2007).
Estudos pré-clinicos com KP1019 ( trans-
tetraclorobisimidazolrutênio (III)) mostraram atividade promissora no
tratamento de tumores do colo-retal (Kapitza et al. , 2003; Hartinger et al,
2006). O RM175 [(N 6-C6H5C6H5)Ru (en)Cl]+ , onde en=etilenodiamina é
um composto organometálico de rutênio que possui propriedades
citotóxicas para estudos in vitro comparado com a cisplatina (Aird et al. ,
2002). Outra droga de relevância está sendo estudada por Eric Meggers
na Universidade de Pensilvânia, o composto de rutênio indolcarbozol que
possui baixos valores de IC5 0 e mimetismo com estauroporinas (Atil la-
Gokcumen et al. , 2006). NAMI-A (trans-
imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) também possui atividade em
tumores sólidos metastáticos, em fase experimental (Sava et al. , 2003).
1.4. Compostos de Rutênio e Mecanismo de Ação
Os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção por
terem propriedades antimetastática e de baixa toxicidade. Os
componentes do rutênio parecem penetrar na célula tumoral e ligar
efetivamente ao seu DNA (Kostova, 2006).
Existem três propriedades principais do rutênio que fazem com que
seus derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas a saber;
(1) troca de ligante – os compostos de rutênio Ru (II) e Ru (III)
apresentam cinética de troca de l igante similar aos compostos de platina
(II), sendo importante para as drogas atingirem o alvo biológico sem
serem modificadas; (2) estados de oxidação – o rutênio é o único entre o
grupo de metais em que os estados de oxidação são acessíveis em
condições fisiológicas, permitindo a administração de compostos de Ru
(III) que poderão ser ativados por redução formando compostos de Ru
(II) nos tecidos alvos. No sistema biológico, a redução de Ru (IV) e Ru
(III) é favorecida pela glutationa, ascorbato e proteínas transportadoras
de um único elétron, enquanto que o oxigênio e o citocromo oxidase
promovem a oxidação do Ru (II); e (3) mimetizando o ferro - a baixa
toxicidade das drogas de rutênio é explicada pela habilidade que este
elemento tem de imitar o ferro na ligação a várias biomoléculas,
incluindo a transferrina e a albumina. Em mamíferos, estas duas
proteínas são responsáveis pela solubilização e transporte de ferro,
reduzindo a toxicidade deste metal (Claire & Dayson, 2001; Silveira-
Lacerda, 2003).
Quanto aos mecanismos de ação molecular, dentre os compostos de
rutênio com atividade antitumoral, o mais bem explorado é o NAMI
(Na trans-[Ru (Im) (Me 2SO)Cl4]). O complexo de rutênio NAMI,
atualmente na fase I de triagem clínica, apresenta atividade
antimetastática e é ativo contra uma série de tumores incluindo
carcinoma de pulmão, melanoma e câncer mamário (Sava et al. , 1992).
Segundo Bergamo et al. (1999), NAMI-A apresenta ser mais estável e de
maior facilidade de ser sintetizada que NAMI. Trata-se de compostos
menos tóxicos em relação à cisplatina, pois não modifica o crescimento
celular causando bloqueio no ciclo celular de células tumorais na fase
pré-mitótica, ao contrário da cisplatina que reduz a proliferação celular.
Mestroni et al. (1989) sugeriram que cis e trans-RuCl2(DMSO)4
interagem com o DNA in vivo . Estudos de interação in vitro com
nucleotídeos resultaram na l igação entre rutênio e DNA, que ocorre
principalmente no N7 da guanina entre agrupamentos na dupla hélice
(Kung et al. , 2001).
A redução do Ru (III) para Ru (II) pode ser um mecanismo
fundamental da ativação celular por compostos de rutênio (Depenbrock et
al. , 1997). Os compostos de Ru (III) podem ser reduzidos em áreas
tumorais com hipóxia, onde se ligam rapidamente ao DNA e causam
danos à biomolécula (Grguric-Sipka et al. , 2003).
1.5. Citoxicidade
Definições de citotoxicidade variam, dependendo da natureza do
estudo ou simplesmente da indução das alterações metabólicas. Enquanto
um agente antitumoral pode ser requerido para destruir a célula,
demonstrações da toxicidade de outros fármacos podem requerer análises
de mudanças metabólicas ou uma alteração de sinalização célula-célula,
que poderia promover um aumento inflamatório ou uma resposta alérgica
(Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda, 2003).
Testes in vitro são usados na avaliação do potencial de toxicidade
ou como parte de uma investigação do mecanismo de identificação prévia
na toxicidade in vivo . Nos estágios iniciais de descobertas farmacêuticas,
quando o mínimo é conhecido sobre as propriedades de uma nova
molécula, simples triagens predit ivas são apropriadas. As triagens de
toxicidade são usadas para detectarem novas drogas citostáticas
anti tumorais, e também em outros programas de descobertas de drogas
para determinar se a toxicidade é induzida nas concentrações que tenham
o efeito farmacológico desejado (Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda,
2003).
A descoberta de complexos metálicos a base de rutênio como
composto anti tumoral tem induzido vários procedimentos de
investigações. Silveira-Lacerda (2003), trabalhando com o composto de
rutênio cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) ou cis-
[RuCl2(NH3)4]Cl, verificou que o mesmo apresentava atividade
citostática significante, em estudo realizados em células tumorais
humanas e de camundongos. Os resultados indicaram que este composto
apresentava atividade citotóxica e genotóxica sobre células tumorais em
concentrações de 0,1mg.mL - 1 e o DNA de células tumorais tratadas
apresentavam fragmentação do material genético. Esse complexo de
rutênio atua como droga citostática ao impedir a progressão do ciclo
celular das células tumorais e induzir a apoptose. Observou-se também
que a atividade citostática exercida pelo composto de rutênio sobre
células mononucleares do sangue periférico humano foi menor quando
comparadas à atividade citostática deste composto em outras linhagens
tumorais que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2003). Verificou-se ainda
que a toxicidade do composto foi seletiva às células cancerígenas e com
potencial efeito imunoestimulante (Silveira-Lacerda, 2003),
Menezes et al . (2007) também estudou o cloreto de cis-
tetraaminodiclorutênio (III) em camundongos Balb/c transplantados via
subcutânea na viri lha com células do S-180. Os autores constataram que
o composto provocou redução do volume e peso tumoral e aumentou a
sobrevida dos animais tratados.
1.6. Genotoxicidade
A genotoxicidade é a área da genética que estuda as alterações na
base genética da vida, seja ela na estrutura físico-química do DNA,
processo este classificado de mutagênese, ou na alteração da
determinação genética ao nível celular, classificados respectivamente
como carcinogênese e teratogênese. É uma especialidade relativamente
recente e se situa na interface entre toxicologia e genética (Silva et al. ,
2003).
O estudo dos cariótipos é uma das metodologias mais tradicionais
em genética humana, utilizada para a detecção de alterações
cromossômicas numéricas e estruturais. A análise cromossômica é um
procedimento diagnóstico cada vez mais importante em várias áreas da
medicina clínica (Thompson & Thompson, 2002). E são baseados na
detecção de trocas cromossômicas. Estas trocas, as mutações
cromossômicas, são divididas em: aberrações cromossômicas estruturais
como as deleções, duplicações, inversões e translocações, as aberrações
cromossômicas numéricas, como as aneuploidias e euploidias e as
aberrações cromatídicas, como as quebras cromatídicas, que contribuem
para um grande número de abortos, morte pré-natal e nascimento de
pessoas com anormalidades estruturais, fisiológicas e mentais (Chandley,
1981; Sankaranarayanan, 1982; Kirsch-Volders et al. , 2002).
Estudos citogenéticos constituem um sistema clássico de avaliação
de mutagenicidade e clastogenicidade recomendado pelos “guidelines”
por sua sensibilidade em responder a agentes indutores de danos no
DNA, como quebras e outras alterações. Na obtenção de metáfases para
estudo de alterações citogenéticas, um material comumente util izado são
os linfócitos obtidos de sangue periférico e colocados em cultura
(Amara-Morkane et al. , 1996). Cariótipos obtidos de linfócitos têm sido
util izados na observação de alterações cromossômicas desde que o
genoma humano contém um total de 3,2 bilhões de pares de bases
distribuídos em 23 pares de cromossomos, e qualquer alteração no DNA
pode ser detectada nos cromossomos (Bernadini et al, 2004).
A freqüência de aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue
periférico humano tem sido usada por décadas como um biomarcador dos
efeitos iniciais induzidos pela exposição ocupacional ou por tratamento
quimioterápico com carcinógenos, em tecidos específicos. Assumindo-se
que os mecanismos de formação dos danos cromossômicos são
semelhantes em diferentes tecidos, os níveis de danos em linfócitos
podem refletir o nível de danos induzidos em outros tecidos (Norppa et
al. , 2006). O acúmulo de anormalidades cromossômicas, tais como
rearranjos, amplificações e deleções podem afetar genes crí ticos
envolvidos no controle e proliferação, diferenciação e sobrevivência
celular e assim direcionar os processos de múltiplas etapas do
desenvolvimento e progressão do câncer (Goodison et al. , 2005).
Em células somáticas as aberrações cromossômicas, as deleções
cromossômicas e rearranjos ou perda total de cromossomos podem levar
à eliminação de genes supressores de tumor, resultando em câncer
(Phillips, 1987; Minden, 1987; Natarajan, 2002). As quebras que ocorrem
na dupla fita de DNA são mais relevantes, pois são mais difíceis de
serem reparadas, podendo constituir, posteriormente, lesões letais ou
mutagênicas nos organismos expostos (Collins et al. , 1997).
Uma grande variedade de ensaios citogenéticos tem sido usada com
sucesso no monitoramento de populações expostas a agentes mutagênicos
e as aberrações cromossômicas têm sido de grande importância, por
avaliarem a possibilidade da ocorrência de câncer na população (Au et
al. , 2001). Estes ensaios detectam efeitos de substâncias tóxicas para o
genoma. Os mais utilizados são aqueles que detectam mutações em
células germinativas ou somáticas, por exemplo, mutação gênica,
associada às alterações na seqüência de nucleotídeos do DNA, ou ao
nível cromossômico, como aberrações e micronúcleos (Rosa et al. , 2007).
As células respondem ao seu DNA lesado util izando diferentes
estratégias de ação, tais como morte por citotoxicidade ou apoptose,
modulação da expressão gênica controlando o ciclo celular, e reparação
do material genético por via l ivre ou sujeita a erro, sendo a segunda
responsável pela fixação das mutações. Normalmente é a combinação
destes fatores que compõem a resposta a danos genéticos (Agnoletto et
al. , 2007).
Testes de aberrações cromossômicas in vitro uti lizam células
somáticas de mamíferos, e o mais popular são os linfócitos do sangue
periférico ou fibroblastos de hamster chinês (Madle & Obe, 1980). A
cultura de linfócitos do sangue periférico constitui um ótimo sistema
para se testar a capacidade de um agente (físico ou químico), quanto à
sua maneira de causar danos no DNA e também ser util izada no
monitoramento de indivíduos expostos (Rabello-Gay et al. , 1991). A
maioria dos tecidos usados para a análise citogenética não possui um
número significativo de mitoses endêmicas, o que impede a análise
cromossômica sem o cultivo prévio das células. Desta forma, as técnicas
de cultura celulares são fundamentais para a investigação cromossômica
(Rainho, 2000).
Recentemente, o ensaio cometa ou teste do "Single cell gel
eletrophoresis" (SCGE) vem sendo proposto para estudos de
toxicogenética devido a sua peculiaridade e vantagens, quando
comparado a outros testes para detecção de substâncias genotóxicas. O
teste cometa é uti lizado para detectar danos no DNA, que após serem
processadas, podem resultar em mutação (Tice et al. , 2000; Rosa et al,
2007; Trzeciak et al. , 2008).
Os compostos metálicos baseados em platina e seus derivados, os
complexos de rutênio, vêm sendo estudados com interesse por suas
característ icas antitumorais. Considerando o DNA como alvo, vários
compostos de rutênio foram desenvolvidos e suas propriedades de ligação
estão sendo testadas (Clarke et al. , 2003; Bergamo & Sava., 2007). As
duas propriedades atribuídas ao complexo de rutênio: ativação pela
redução e seus transporte seletivo via sistema transferrina pode explicar
estas características antitumorais (Claire & Dyson, 2001; Frasca et al. ,
2001; Timerbaev et al. , 2005).
O composto de rutênio, cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III)
apresenta grande potencial para o uso clínico por possuir baixa
toxicidade, segundo dados das pesquisas que estão sendo realizadas no
laboratório de Genética Molecular e Citogenética da Universidade
Federal de Goiás. Com este composto tem-se observado baixa toxicidade
frente às células mononucleadas de sangue periférico (Silveira-Lacerda,
2003). Isto é devido, em parte, por ter a habilidade de mimetizar o
ligamento do ferro com as biomoléculas, explorando o mecanismo que o
corpo tem de transporte do ferro de uma forma não tóxica (Claire &
Dyson, 2001). Estudos indicam que comparados com outras drogas a base
de platina, o rutênio é o mais promissor para o tratamento do câncer.
Em trabalhos anteriores, foi descrito que o composto cloreto de
cis-tetraaminodiclororutênio(III) ou cis-[RuCl2(NH3)4]Cl apresenta
atividade citotóxica sobre linhagem tumoral humanas Jurkat e HeLa, com
IC5 0 de 190 e 3,5µM, respectivamente (Frasca et al. , 2001). Em célula
tumoral A-20 de camundongo, a atividade citostática foi observada em
concentrações ≥ a 0,1mg.mL - 1 de cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl (Silveira-Lacerda,
2003). A citotoxicidade destes complexos de rutênio parece estar
correlacionada com sua ligação com o DNA, no entanto, o mecanismo de
ação destas drogas permanece ainda desconhecido (Menezes et al. , 2007).
Com os resultados desses trabalhos iniciais, veio a iniciativa de se testar
o mesmo composto frente a células do sangue periférico humano, com
objetivo de estudar o efeito genotóxico do mesmo.
Menezes et al. (2005), estudou o mesmo complexo de rutênio e foi
observado que esse complexo possui atividade antitumoral sobre a
linhagem tumoral Sarcoma 180 de camundongos in vivo e in vitro ; o
valor encontrado da DL5 0 foi de 99,76mg/kg de animal, relativamente
alta comparada às DL5 0 observadas para outros quimioterápicos derivados
de metal. De acordo com as análises bioquímica e hematológica do
sangue dos animais correlacionadas a histopatologia dos órgãos, o
complexo de cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl não provocou efeito toxicológico
grave, não foi genotóxico para células da medula óssea de camundongos,
apresentou atividade bactericida sobre Staphylococcus aureus e
Escherichia coli, e demonstrou interagir com o DNA plasmidial pUC18.
A morte celular é um processo que leva à degradação de DNA.
Todos os métodos de avaliação primária de danos de DNA incluem o
ensaio cometa, que tem um potencial para detectar agentes citotóxicos e
genotóxicos. Os danos de DNA no ensaio cometa são avaliados no nível
de células individuais, permitindo em alguns casos, identif icar morte
celular ou células que então morrendo. Em condições alcalinas, a necrose
ou apoptose celular pode resultar em cometas com pequena cabeça ou
com sua inexistência e com grande difusão da cauda (comumente referida
como “hedgehogs” - porco-espinho), como observado em estudos in vitro
seguido de tratamentos com compostos citotóxicos ou genotóxicos
(Olive., 1995; Burlinson., 2007).
2.0. JUSTIFICATIVA
Com o desenvolvimento da síntese de compostos de Rutênio para a
util ização em várias áreas de pesquisa, inclusive em atividade
anti tumoral, o composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi
escolhido com o propósito de otimização de metodologias avaliando seu
comportamento citotóxico em linhagens tumorais humanas (Jukart e SK-
Br-3) e a l inhagem tumoral de camundongo (A-20) pelo grupo de
pesquisa. Desta forma, viu-se o grande potencial destes compostos a se
tornar um novo antineoplásico, havendo assim a necessidade de se
estudar a atividade genotóxica deste composto em linhagens de células
normais de sangue humano em concentrações diferentes, como um dos
testes pré-clínicos estabelecidos pela ANVISA para liberação de novos
fármacos no mercado.
Nos sistemas de liberação de novos fármacos no mercado, testes
genotóxicos são requisitados para os seus lançamentos. Como o
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética trabalha com a
verificação do potencial de novos fármacos, vê-se a necessidade de
implantação e otimização de novas metodologias em nosso laboratório
para a triagem desses fármacos frente a atividade genotóxica para o
sistema de liberação desses fármacos.
O complexo de rutênio tem sido estudado por possuir propriedades
favoráveis contra o câncer e com menor índice de toxicidade comparando
com a cisplatina. Consequentemente, é fundamental investigar a
probabilidade de danos estruturais causados ao DNA devido a sua
exposição ao composto de Ru, uma vez que as drogas usadas no
tratamento do câncer atuam nas células normais da mesma forma que
atuam, também, em células tumorais do paciente.
3.0. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O estudo visa avaliar o potencial do agente antineoplásico,
composto rutênio cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III), como
indutor de aberrações cromossômicas e fragmentação do DNA mediante a
avaliação citogenética de linfócitos do sangue periférico.
3.2. Objetivos Específicos
1.0 Analisar a freqüência de aberrações cromossômicas estruturais
estáveis em células normais humanas tratadas ou não com o composto
de cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) em cultura de
linfócitos humanos de sangue periférico;
2.0 Analisar a freqüência de aberrações cromossômicas estruturais
instáveis em células normais tratadas ou não com o composto cloreto
de cis-tetraaminodiclororutênio (III);
3.0 Analisar os índices mitóticos encontrados nas células tratadas ou não
com o composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III);
4.0 Avaliar o nível de degradação de DNA das células tratadas ou não
com diferentes concentrações do composto de Rutênio por meio do
teste cometa.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Compostos de Rutênio com Atividades Antitumorais
Rutheniun compost with anticancer activity
Resumo
As características medicinais dos grupos metálicos são estudadas há
muito tempo. O objetivo desse estudo é relatar sobre forma de revisão
bibliográfica sobre os principais estudos relacionados aos complexos
metálicos com atividade anti tumorais. O mecanismo de ação de várias
drogas a base dos metais pesados são, hoje, foco de estudos devido a
aumento de sua potência e redução de seus efeitos. Alguns resultados
promissores foram obtidos com derivados de diferentes metais, como Pt,
Ti, Rh, Au e Ru. Os complexos de platina são usados no tratamento de
câncer testicular, de ovário, cabeça e pescoço, bexiga, mas sua eficácia é
limitada. Isto ocorre devido à resistência, toxicidade e pelo perfil
farmacocinético celular. Tanto a química quanto a biologia destas drogas
são estudas bem como seus efeitos citotóxicos de ligação com o DNA.
Novos fármacos contendo complexos de platina (IV) surgem como uma
alternativa para a solução de alguns destes problemas. A cisplatina é um
dos primeiros metais com atividade anti tumoral estudados a partir de
1960. De fato, o tratamento de tumores sólidos uti lizando cisplatina vem
sendo estudado, mas sua perda de eficiência ocorre devido a efeitos
tóxicos e a resistência dos tumores, o que acaba levando a formação de
tumores secundários. Estudos prévios sugerem que, em contraste com a
cisplatina, os complexos de ouro (III) se ligam as proteínas e não ao
DNA. Estudos pré-clinicos com compostos de rutênio- (KP1019, RM175,
MMI/ONCO4403, RAP, NAMI, NAMI-A, cloreto de cis-
oxalatorutênio(III), cloreto de cis-tetraamindiclororutênio(III))
mostraram atividade promissora no tratamento de tumores.
Palavras chave: complexos metálicos, complexos de platina, cisplatina,
complexos de rutênio.
Abstract
Action mechanism for various pharmacs based on coordination
complexes and medicinal characteristics of metall ic groups have been
studied for a long period of time due improved potential and reduced
side-effects. Present study objective is to make a revision of main
aspects and works relating antitumoral activity of metallic complexes.
Some promising results were obtained when metal derived as Pt, Ti, Rh,
Au and Ru are used. Cisplatin, one of first metal with anti tumoral
effects, is studied since 1960. Platinum complexes has been used on
testicles, ovarian, bladder head and neck cancer treatment but they show
limited efficacy due their toxicity and pharmacokinetics profiles. Thus
novel pharmacs employing new platinum complexes (IV) emerges as
alternative solution to those problems. Previous studies using gold
complexes as an alternative of platinum ones suggest that gold (III)
bonds to proteins instead DNA. Preclinical studies using ruthenium
compounds such KP1019, RM175, MMI/ONCO4403, RAP, NAMI, NAMI-
A, cis-oxalatoruthenium(III) chloride, and cis-
dichlorotetraammineruthenium(III) chloride revealed promising results
on tumour treatment.
Keywords. metall ic complexes, platinum complexes, cisplatin, ruthenium complexes.
1. INTRODUÇÃO
As características medicinais dos metálicos são estudadas há muito
tempo. O ouro era muito usado na Arábia e China, pois se acreditava ser
benéfico à saúde. O mecanismo de ação de várias drogas a base dos
metais pesados são hoje foco de estudos devido a aumento de sua
potência e redução de seus efeitos (Claire & Dyson, 2001).
Recentemente, alguns resultados promissores foram obtidos com
derivados de diferentes metais tais como Pt, Ti, Rh, Au e Ru (Cabrera et
al. , 2004), indicado na Figura 01.
Doses terapêuticas de ouro têm sido conhecidas a milhares de anos
atrás, mas seu uso medicinal tem sido estudado desde 1920. O ouro (III)
tem a mesma forma geométrica planar que a cisplatina e sua atividade
anti tumoral tem sido investigada. Estudos prévios sugerem que, em
contraste com a cisplatina, os complexos de ouro (III) se ligam as
proteínas e não ao DNA. O tratamento de câncer de mama em
camundongos pelos complexos ditiocarbonato de ouro (III) resultou em
uma inibição significante de crescimento tumoral, associado com a
inibição dos proteossomos e indução de apoptose in vivo . O entendimento
do processo fisiológico dos compostos de ouro (III) poderá no futuro
servir de base para desenvolvimento de fármacos antitumorais (Milaci et
al. , 2008).
Figura 01: Em destaque, metais e não-metais conhecidos por formarem compostos que exibem atividade antitumoral.
Os compostos de platina são usados no tratamento do câncer a mais
de 25 anos e são fármacos antineoplásicos empregados em tratamento de
um número considerável de tumores (testicular, ovário, bexiga, cabeça e
pescoço), mas sua eficácia é limitada (Timerbaev et al. , 2006). Isto
ocorre devido à resistência, toxicidade e pelo perfil farmacocinético
celular. Tanto a química quanto a biologia destas substâncias são estudas
bem como seus efeitos citotóxicos de ligação com o DNA. Estas lesões
no DNA são reconhecidas por proteínas nucleares “housekeeping” que
inicia uma cascata apoptótica levando a morte celular (Jung et al. , 2007).
Esta resistência é atribuída ao mecanismo de reparo e tolerância a danos
(Andrews et al. , 1990) . Uma grande proporção do fármaco a base de
platina (II) é perdida, pois a ligação entre proteínas é retida no sistema
circulatório e estas reações possuem efeitos desconfortáveis para o
paciente em tratamento quimioterápico.
Novos fármacos contendo complexos de platina (IV) surgem como
uma alternativa para a solução de alguns destes efeitos colaterais. Isso é
devido a sua geometria octaédrica que introduz dois l igantes extras,
aumentando sua capacidade de se ligar em alvos tumorais mais
específicos, aumentando sua inércia e propiciando baixa reatividade e
reações menos desgastantes (Hall et al. , 2007).
O uso da cisplatina e de outras substâncias derivadas da platina é
limitado pelos mecanismos de resistência do organismo e de seus efeitos
colaterais, como a neuro e nefrotoxicidade (Brabec et al. , 2002). As
possíveis vantagens em se util izar metais de transição diferentes da
platina é que estes devem envolver mudanças no seu estado de oxidação,
apresentar sítios adicionais de coordenação e mudanças na geometria
espacial, al terações nas cinéticas de afinidade e substituição dos ligantes,
aumento da solubilidade e possuírem propriedades fotodiquímicas para
terapia (Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Menezes et al, 2005).
Devido às limitações do uso dos complexos de platina, o estudo de
outros agentes antitumorais vem sendo estudado por serem menos
tóxicos/agressivos aos tecidos sadios e mais efetivos/específicos. Apenas
algumas destas substâncias foram aprovadas para uso clínico. Como os
análogos da cisplatina, a carboplatina [cis-
diaminociclobutanodicarboxilato-platina(II)], oxaliplatina {[(1R,2R-
diaminociclohexano)oxalato-platina(II)](1,2-diaminociclo-hexano =
DACH)} e nedaplatina [cisdiaminoglicolato-platina(II)] são exemplos de
substâncias atualmente empregadas no tratamento de tumores (Brabec et
al. , 2006).
1. COMPOSTOS DE RUTÊNIO- (KP1019, RM175, NAMI, NAMI-A,
RAP, MMI/ONCO4403, cloreto de cis-tetraaminoxalatorutênio(III)).
O rutênio-102 é o elemento químico metálico de símbolo Ru,
pertencente ao Grupo 8 da tabela periódica, o mesmo do ferro, presente
na hemoglobina. Este elemento químico possui propriedades antitumorais
semelhantes à platina, pertencente ao Grupo10. É um metal branco, duro
e brilhante, com quatro formas cristalinas em seu estado reduzido. Se
uma solução de clorato de potássio lhe é adicionada, reage
explosivamente oxidando-se. O rutênio-102 natural consiste de uma
mistura de sete isótopos estáveis (Neves, 2007). Sendo um metal raro, o
rutênio teve sua existência comprovada em 1844 na Rússia, pelo químico
alemão Karl Karlovitch Klaus (Greenwood & Earnshaw, 1997; Neves,
2007). Este optou por manter o nome sugerido por seu conterrâneo
Gottfried Wihelm Osann, dedicado desde 1828 à pesquisa de um novo
elemento do grupo da platina a partir de um minério encontrado nos
montes Urais. O nome deriva de Ruthenia , topônimo latino para Rússia
(Neves, 2007). Da classe dos metais de transição, os compostos de
rutênio são sais metálicos cujo mecanismo de ação parece estar
relacionado à sua estrutura espacial octaédrica.
O composto de rutênio é caracterizado por um mecanismo
completamente novo de ação antitumoral: promove uma mudança de
transferência de energia nas células (via mitocôndria). Este princípio é
facil itado pela ação da transferrina, considerando que as células tumorais
têm número aumentado de receptores para esta proteína, de forma que em
tecidos saudáveis, a concentração do fármaco contendo rutênio será
presumivelmente mais baixa e menos agressiva. Os dados com trabalhos
util izando tumores sólidos permitiram calcular que há em média quase
90% de diminuição do volume tumoral. Os Testes toxicológicos e de
hemograma mostraram um nível esperado do fármaco a base de rutênio
compatível com tratamento, segundo o que se conhece do seu mecanismo
de ação (Keppler, & Jakupec, 2003; Timerbaev et al. , 2006).
Segundo Keppler & Jakupec (2003) os compostos de rutênio e
gálio tem atraído a atenção devido aos seus potenciais anti tumorígenos.
Em estudo comparativo feito entre o trans-[Tetraclorobisindazolrutênio
(III)] e Tris-(8-quinolinolatogálio (III)), observou-se que o complexo de
rutênio possui uma atividade particularmente alta contra tumores colo-
retais, apresentando melhor biodisponibil idade e concentração plasmática
adequada que o complexo de gálio.
Uma das hipóteses sugere que os compostos de rutênio (III) servem
de pró-fármacos que são reduzidos, in vivo , pelas condições
citoplasmáticas das células tumorais tais como: baixas concentrações de
oxigênio em decorrência do consumo atípico de nutrientes; pH baixo
devido à produção de ácido láctico na glicólise anaeróbia, compensatória
da falta de oxigênio e quanto à presença de glutationa em níveis
tipicamente altos. Essas alterações no ambiente citoplasmático das
células tumorais podem favorecer a conversão de rutênio (II) a partir do
rutênio (III), intensificando ligações ao DNA, com toxicidade seletiva às
células tumorais (Clarke, 2003; Silveira-Lacerda, 2003).
Outra hipótese propõe que a baixa toxicidade nos compostos de
rutênio decorre da mimetização do ferro, de forma que o composto se
liga prontamente à albumina e à transferrina no sangue: as células
tumorais, que requerem mais nutrientes que as células normais (demanda
que é satisfeita pela angiogênese) seqüestram mais transferrina
circulante, que libera o grupo - neste caso, o composto de rutênio
(Clarke, 2003; Silveira-Lacerda, 2003). Srivastava et al . 1981 apud
Menezes (2005) mostraram que rutênio radioativo como o 1 0 3RuCl 3 liga-
se à soroalbumina humana e à transferrina na corrente sangüínea de
animais experimentais. Contudo, o 1 0 3Ru-Transferrina será
preferencialmente encontrado em áreas de tumor, provavelmente por
causa do grande número de receptores para transferrinas na superfície da
célula tumoral (Figura 02).
MudanMudançça do estado de oxidaa do estado de oxidaçção do rutênio ão do rutênio em cem céélulas tumorais e clulas tumorais e céélulas saudlulas saudááveis.veis.
Atividade de Ru(II) [glutationa] dano ao [O2] DNA pH
Ru(III)
TrasferrinasCélula Tumoral Ru(III)
⇐ Ru(III):Administraçãoda droga
O2 Oxidases
Tecido sadio Ru(II)
Fonte: CLAIRE & DYSON (2001), modificado.
Figura 02: Mudança do estado de oxidação do rutênio em ambiente celular regular e tumoral. O ambiente das células cancerígenas favorece a redução do Ru(III) a Ru(II), que é mais ativo biologicamente. Conseqüentemente, compostos de Ru(III) são essencialmente pró - fármacos ativados pela redução nas células cancerígenas. Fonte: CLAIRE & DYSON, 2001.
O complexo trans-[tetraclorobisindazolrutênio (III)] (KP1019) e
seu sal de sódio análogo, mostrou-se efetivo no tratamento de tumor
colo-retal autóctone de ratos, e o seu análogo imidazólico mostrou
atividade significativamente mais baixa (Hartinger et al. , 2006). E ainda,
exibiram capacidade de induzir apoptose, além de despolarização da
membrana mitocondrial, redução da atividade do bcl2 e ativação da
caspase 3 (enzimas relacionados à apoptose). Esses efeitos podem ser
parcialmente inibidos pela N-aceti l-cisteína, indicando envolvimento do
estresse oxidativo tanto na indução da apoptose quanto na indução de
danos no DNA. A inibição pela N-acetil-cisteína é muito mais efetiva em
células não malignas, apontando para um potencial efeito protetor dos
tecidos normais pela ação antioxidante (Kapitza et al. , 2003).
O RM175 [(η6-C6H5C6H5)-Ru(en)Cl]+ , onde en=etilenodiamina é
um complexo organometálico de rutênio que possui propriedades
citotóxicas para estudos in vitro comparado com a cisplatina (Aird et al,
2002). Outro fármaco de relevância que está sendo estudado por Eric
Meggers na Universidade de Pensilvânia é o complexo de rutênio
indolcarbozol que possui baixos valores de IC 5 0 e mimetismo com
estauroporinas (Atilla-Gokcumen et al. , 2006).
Valaplana et al. (2006), estudou o cis-dicloro-1,2-
propilenodiamino-N,N,N0,N0-tetraacetato rutênio (III) (RAP) de fácil
solubilidade em água. Sua atividade antitumoral tem sido avaliada in
vivo . Recentes resultados mostraram que o seu composto possui
estabil idade quando se l iga ao DNA e os danos causados no DNA
diminuem de acordo com a retirada do complexo de rutênio do meio de
cultura.
Um dos compostos a base de rutênio mais estudado é o NAMI-A
( trans-imidazoldimetilsulfóxidotetraclororutênio), sendo um dos
fármacos metálicos antitumorais mais promissores desenvolvidos (Casini
et al. , 2007). Este composto corresponde à molécula de NAMI com um
imidazol+H+ no lugar do átomo de Na + . NAMI-A foi inicialmente testado
em modelos in vivo manifestando efeitos antimetastáticos, como no
carcinoma de Lewis em ratos (Sava et al. , 1999; Sava et al. , 2003), e com
baixa toxicidade em ratos e cães (Bergamo et al. , 2000). O composto
NAMI-A aumenta a espessura da cápsula em torno do tumor primário e
da matrix extracelular dos vasos sanguíneos tumorais e assim, previne a
invasão pelas células tumorais em tecidos e em vasos sanguíneos sadios
(Sava et al. , 1998). Também testado em 24 pacientes humanos, inibiu a
proliferação das células cancerígenas (câncer sólido-pulmão) (Fioravanti,
2005) (Figura 03).
A empresa farmacêutica MMI - Medical Marketing International
anunciou, no dia 30 de julho de 2007, a conclusão dos testes pré-clínicos
de um composto de rutênio que ela denominou MMI/ONCO 4403. Seus
estudos de toxicidade teriam demonstrado que o composto tem um perfi l
mais seguro que as substâncias baseadas em platina. Os testes de
toxicidade aguda em doses repetidas com o MMI/ONCO 4403 não
apresentaram supressão da medula óssea ou nefrotoxicidade
significativas, após 28 dias de observação (MMI, 2007).
Figura 03: Estrutura química do KP1019 (acima à esquerda), de RM175 (acima à direita), do composto indol carbazol rutênio (abaixo a esquerda) e do NAMI-A (abaixo a direita) (Bergamo & Sava, 2007).
O cloreto de cis-tetraaminoxalatorutênio (III) é outro composto de
coordenação, potencialmente antineoplásico, em fase inicial de testes
pré-clínicos realizados no Laboratório de Genética Molecular e
Citogenética da Universidade Federal de Goiás – ICB/UFG. Sua síntese
foi previamente realizada pelo Laboratório de Química Supramolecular
da Universidade Federal de Uberlândia – UFU (parceira e colaboradora
do projeto de pesquisa), seguindo os procedimentos descritos por
Marchant (1976) e modificações de Pavanin (Pavanin, 1989). Antes da
aprovação de qualquer novo composto para testes humanos, extensos
testes de toxicidade em animais são exigidos. O tipo mais rudimentar de
teste de toxicidade é a DL 5 0 (dose letal para 50% de um grupo de
animais). Testes de toxicidade, com triagem toxicológica ainda são
amplamente uti lizados e aceitos (Brito, 1994; Andersen et al. , 2004) apud
(Barbosa, 2007).
Diversos estudos com compostos de Rutênio, tais como os de
Clarke (2003), Silveira-Lacerda (2003), Menezes et al . (2007), Barbosa
(2007) dentre outros demonstraram, relativamente a outros compostos
derivados de metais de transição, como cisplatina e carboplatina,
apresentam baixas toxicidades e efeitos terapêuticos significativos, além
do custo relativamente baixo do composto (Figura 04).
Figura 04: Estrutura do íon composto de rutênio cloreto de cis-tetraaminoxalatorutênio (III).
2. COMPOSTO DE RUTÊNIO CLORETO DE CIS-
TETRAAMINODICLORORUTÊNIO (III).
Clarke (2003) foi o primeiro a estudar o cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) e observou uma relação direta entre
citotoxicidade e a ligação com o DNA, exibindo atividade antitumoral em
tumores primários.
O composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi obtido
no Laboratório de Química Supramolecular do Insti tuto de Química da
Universidade Federal de Uberlândia - UFU, seguindo os procedimentos
de Gleu e Breuel (1938), com algumas modificações adaptadas por
Pavanin (1989) (Figura 05) e em seguida, Silveira-Lacerda (2003)
estudou o efeito antitumoral in vitro do composto cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl
Ru
H3
N H3
N H 3
C
CO
O
+
N O
OH3N
(III) sobre linhagens tumorais humanas e de camundongo. Os resultados
indicaram que este composto teve atividade citotóxica sobre células
tumorais em concentrações de 0,1mg.mL - 1 , com fragmentação do material
genético. Esse complexo de rutênio atua como substância citostática ao
impedir a progressão do ciclo celular das células tumorais e induzir a
apoptose.
Menezes et al . (2007) também estudou o cloreto de cis-
tetraaminodiclorutênio (III) em camundongos Balb/c transplantados via
subcutânea na viri lha com células do S-180. Constatou-se que o
composto provocou redução do volume e peso tumoral e aumentou a
sobrevida dos animais tratados.
Figura 05: Cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III): geometria
octaédrica, bi-pirâmide de base quadrada onde átomos de cloro
encontram-se em uma mesma aresta da base (posição cis).
3. PERSPECTIVAS
O interesse por novos fármacos antitumorais a base de metais vem
crescendo nestes últimos anos, devido aos bons resultados obtidos por
grupos de cientistas. Tanto através de atividade de l igação de DNA como
a ligação de proteínas relacionadas com transducão de sinais celulares.
Hoje, os fármacos são considerados diferentes por possuírem alvos
seletivos de atuação, isto é, receptores de membranas, célula regulada
por quinases intracelulares, e enzimas responsáveis pela modulação de
vias celulares. São testados por motivos toxicológicos e seu uso
controlado poderia suprimir alguns processos biológicos. Assim, muitos
compostos a base de rutênio têm sido produzidos e avaliados quanto à
citotoxicidade, genotoxicidade, para eventuais curas de várias
enfermidades.
Muitos fármacos a base de metais, em particular os compostos de
rutênio, tem sido descritos como antitumoral, antimicrobiano, entre
outros.
O cloreto de cis-tetraaminodiclorutênio (III), estudado por nosso
grupo de pesquisa, possui atividade de atuação citostática em células
tumorais, atividade bactericida e não apresentou genotoxicidade em
medula de camundongos.
O estudo com o complexo de rutênio, por apresentar
principalmente, atividade antitumoral, induz a avaliação mais profunda e
detalhada para detectar diferentes propriedades químicas e biológicas
desses novos fármacos, com intuito de tornarem mais efetivas e menos
tóxicas.
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humanos tratados in vivo com o cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio em diferentes concentrações
Evaluation of genotoxic effects of different concentration of
cis-dichlorotetraammineruthenium(III) chloride on lymphocytes
treated in vivo in culture
RESUMO
Conhecendo o desenvolvimento do câncer viu-se a necessidade de
desenvolver novos quimioterápicos. Complexos baseados em rutênio, um
dos metais do grupo da platina, vêm tornando-se uma das formas mais
promissoras de tratamento, uma vez que sua ação sistêmica possibil ita o
acesso a metástases e tumores l íquidos. Entre os medicamentos testados,
os compostos de Rutênio mostram-se promissores devido à propriedade
antimetastática que representa um importante marco no desenvolvimento
de novas drogas antitumorais. O presente trabalho investigou os efeitos
genotóxicos do cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III), em
diferentes concentrações, em culturas de linfócitos humanos in vitro. Os
estudos de índice mitótico (IM), aberrações cromossômicas (ACs) e
danos no DNA detectados pelo ensaio cometa foram avaliados. As
culturas de linfócitos humanos foram tratadas com concentrações de 1,
10, 100 e 1000µg.mL - 1 , como controle positivo foi usado o cloridrato de
doxorrubicina e para o controle negativo, meio completo. As
concentrações de 1, 10 100 e 1000µg.mL - 1 mostraram índice mitótico de
5,9, 4,6, 3,9 e 0%, respectivamente. Foram encontradas aberrações
cromossômicas consideradas espontâneas (0,16%), nas concentrações de
1, 10 e 100µg/mL - 1 , e apresentando resultados estatisticamente
semelhantes quando comparados com o controle negativo. Na
concentração de 1000µg.mL - 1 o índice mitótico foi de 0% indicando
toxicidade. O ensaio cometa mostrou normalidade sugerindo que o
cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) não possui atividade
genotóxica em cultura de linfócitos humanos. Os resultados desses
estudos demonstram que o cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III)
não possui potencial genotóxico in vitro .
Palavras chave: Câncer, cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III),
índice mitótico, aberrações cromossômicas, ensaio cometa.
ABSTRACT
Brazil ian National Cancer Insti tute – INCA points that 466,730 new
cases of cancer will occur in Brazil on 2008. Chemotherapics are playing
an important role in combat of cancer mostly due they systemic action on
organism that allows treatment’s access to liquid tumors and even
metastasis. Among these chemotherapics, Ruthenium compounds are
showing promising results on tumor treatment representing an important
part on development of new antitumor medicines. Present study evaluates
genotóxico effects of cis-dichlorotetraammineruthenium(III) chloride
using human lymphocytes culture in vitro . Studies using Mitotic Index
(MI), chromosomal aberrations (CAs) were performed and DNA Damage
evaluation using Comet Essay were also employed. Human lymphocytes
cultures were treated with Ruthenium compound in concentrations of 1,
10, 100 and 1,000 µg. mL - 1 were showed mitotic index of 5.9; 4.6; 3.9
and 0% respectively. Doxorubicin chloridate were used as positive
control. Chromosomal aberration derived from concentrations of 1, 10
and 100µg/mL - 1 were defined as spontaneous when compared with
negative control. Comet essay using cis-
dichlorotetraammineruthenium(III) chloride results suggest that
compound has no genotoxic activity when using human lymphocyte
cultures.
Key-words: Câncer, cis-dichlorotetraammineruthenium(III) chloride,
mitotic index, chromosomal aberrations, comet essay
1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. No
Brasil, a estimativa para o ano de 2008 aponta que ocorrerão 466.730
novos casos de câncer. Os tipos mais incidentes serão os de próstata e
pulmão no sexo masculino e mama e colo do útero no sexo feminino.
Tornando-se o terceiro grupo de causas de mortalidade, superado apenas
por doenças cardiovasculares e por morte acidental - tanto acidentes de
trânsito quanto violência urbana - e consolidando-se como um problema
de saúde pública (INCA, 2008).
O aparecimento de metástases de tumores sólidos primários é a
causa principal de morte por câncer. A metástase resulta de um processo
no qual as células cancerígenas se espalham em locais diferentes e
distantes do tumor inicial, formando os tumores secundários (Bergamo &
Sava, 2007). Muitos mecanismos têm sido propostos para explicar este
fenômeno migratório, sabendo-se que o câncer aparece devido ao
acúmulo de alterações genéticas na célula (Macaluso et al. , 2003). Tanto
as mutações de ganho de função dos oncogenes quanto às mutações de
perda de função dos genes supressores tumorais podem contribuir para a
progressão e a agressividade de um tumor (Griffith et al. , 2001; Bucca et
al. , 2004).
Com o conhecimento acerca do complexo processo molecular
subjacente ao desenvolvimento do câncer tornou-se necessário
desenvolver novos quimioterápicos que atendem as novas estratégias
terapêuticas. Os complexos de rutênio vêm tornando-se uma das formas
mais promissoras de tratamento, uma vez que sua ação sistêmica
possibilita o acesso a metástases e tumores líquidos (Barbosa et al. ,
2007). A descoberta da propriedade antimetastática representa um
importante marco no desenvolvimento de novas drogas anti tumorais
(Sava et al. , 1999). Sendo que estes novos medicamentos podem ser
usados para possíveis diagnósticos, prognósticos e tratamento de tumores
malignos muito agressivos (Bergamo & Sava, 2007).
Através de três propriedades principais do rutênio que fazem com
que seus derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas:
mudança de ligante, estados de oxidação e o mimetismo com o ferro
(Claire & Dayson., 2001). Os complexos de rutênio parecem penetrar na
célula tumoral e ligar efetivamente ao seu DNA (Kostova., 2006).
A descoberta do Ru como composto antitumoral induz vários
procedimentos de investigações. O composto de rutênio cis-
tetraamindiclororutênio (III) ou cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl apresentou
atividade citostática significante, em estudo realizados em células
tumorais humanas e de camundongos. Esse complexo de rutênio atua
como droga citostática ao impedir a progressão do ciclo celular das
células tumorais e induzir a apoptose (Silveira-Lacerda, 2003).
Verificou-se ainda que a toxicidade do composto é seletiva às células
cancerígenas e com potencial efeito imunoestimulante (Silveira-Lacerda,
2003).
Menezes et al . (2007) também estudou o cis-tetraaminodiclorutênio
(III) em camundongos Balb/c transplantados via subcutânea na virilha
com células do S-180. Constatou-se que o composto provocou redução do
volume e peso tumoral e aumentou a sobrevida dos animais tratados.
Com base nestes estudos, o presente trabalho investigou os efeitos
genotóxicos do cloreto de cis-tetraaminodiclorutênio (III), em diferentes
concentrações, em culturas de linfócitos humanos in vitro. Foi analisado
o índice mitótico (IM), aberrações cromossômicas (ACs) e danos no DNA
detectados pelo ensaio cometa.
O estudo visa a avaliação citogenética de cromossomos humanos
em metáfase e possíveis fragmentação de DNA, detecção de aberrações
espontâneas e/ou induzidas pelo uso do composto cloreto de cis-
tetraamindiclororutêni(III) em cultura de linfócitos humanos do sangue
periférico.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Agentes químicos
O composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi
sintetizado no Laboratório de Química Supramolecular do Instituto de
Química da Universidade Federal de Uberlândia (UFU), seguindo os
procedimentos descritos por Marchant (1976) com algumas modificações
adaptadas por Pavanin (1989). E posteriormente encaminhado ao
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética (UFG) para as
análises.
O meio RPMI 1640 e o soro fetal bovino foram adquiridos da
Gibco® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a fitohemaglutinina e a
colchicina adquiridas da Culti lab. A droga Oncodox® (Cloridrato de
doxorrubicina 50mg) foi adquirida da Meizler. Os antibióticos foram
adquiridos da Sigma (Aldrich Co St Louis, MO, USA ).
2.2. Droga teste
Para o preparo da droga teste, feita pela UFU, foi pesado cerca de
1g de [RuCl(NH 3)5]Cl 2 que foi adicionado a 25mL de NH 4OH a 33% em
NH3 , previamente desaerados em argônio, com a mistura sendo refluxada
até a dissolução do sólido e o aparecimento de coloração rosada, seguido
da adição de 0,7g de dit ionato de sódio à solução quente, que foi
resfriada em banho de gelo, com a precipitação de sólido creme pela
adição de excesso de etanol, havendo a fi ltração e a lavagem do sólido
com éter; o fil trado foi dissolvido em 11,0mL de solução saturada de
ácido oxálico sob refluxo até o aparecimento de um sólido amarelo, que
foi coletado por filtração e lavado com etanol e éter, com posterior
recristalização em HCl5mol.L - 1 .
O composto cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl liofilizado foi pesado e
dissolvido em meio RPMI incompleto nas concentrações de 0,001 a
1mg.mL - 1 . Posteriormente foi submetido à agitação vigorosa para
dissolução completa. O tratamento foi feito após 24 horas de cultura.
2.3. Droga controle
O cloridrato de doxorrubicina é um antibiótico antineoplásico,
derivado da antraciclina e usada no tratamento de tumores sólidos
(Chabner et al. , 1996), originalmente obtido do fungo Streptomyces
peucetius var. caesius. A intercalação ao DNA inibe a replicação
nucleotídica e pode desencadear a quebra do DNA pela topoisomerase-II,
originando distúrbios sérios na estrutura terciária do DNA, levando à
formação de quebras duplas e simples da cadeia do DNA e,
consequentemente, à morte celular. A capacidade da doxorrubicina
(DXR) de se ligar à membrana celular pode afetar uma variedade de
funções (Hurley, 2002). A DXR também parece estar envolvida nas
reações de oxidação/redução, com a produção de radicais livres
altamente reativos e altamente tóxicos (Chabner et al. , 1996; Weijl,
1997).
Células tratadas com DXR têm manifestado alterações nas
característ icas morfológicas associadas à apoptose, o que pode ser um
dos mecanismos de ação da droga. A DXR é ativa durante todo o ciclo
celular, inclusive a intérfase (Mizutani et al. , 2005). As quebras simples
podem ser convertidas para quebras duplas de cadeia durante a replicação
do DNA e transcrição do RNA (Robles et al. , 1999). A DXR é conhecida
comercialmente e clinicamente como andriamicina, apresentando-se
como efetivo agente antineoplásico contra uma grande variedade de
tumores. No entanto, seu uso clínico, freqüentemente, é limitado devido
a indesejáveis efeitos colaterais especialmente a cardiotoxicidade.
Quimicamente, a molécula de DXR consiste em um açúcar amino ligado a
quatro anéis antraquinona cíclicos. A redução de um elétron do anel leva
a formação de um radical livre semiquinona, o qual, na presença de O 2 ,
pode formar radicais superóxido (Xu et al. , 2001). Os efeitos genotóxicos
da DXR foram extensivamente investigados em pacientes submetidos ao
tratamento quimioterápico (Boucher et al. , 1993), em cultura de
linfócitos de doadores saudáveis (Vig, 1971; Antunes & Takahashi,
2007), em linhagens celulares de mamíferos (Antunes et al. , 1999) e em
experimento in vivo , uti lizando-se células da medula óssea de ratos
Wistar (Antunes & Takahashi, 1998, 1999). Os resultados dessas
investigações mostram que a DXR é capaz de induzir aberrações
cromossômicas do tipo quebras cromatídicas e isocromatídicas, “gaps”
cromatídicos e isocromatídicos, rearranjos complexos como trirradiais e
quadrirradiais e trocas entre cromátides irmãs. Segundo Albertini et al .
(2000), as aberrações cromossômicas resultam de quebras diretas do
DNA, replicação de um DNA molde danificado e da inibição da síntese
de DNA.
A fórmula estrutural da DXR é C 2 7H2 9NO11 e sua estrutura química
é mostrada na Figura 01. Devido ser um bom indutor de danos no DNA, a
DXR vem sido citada em vários estudos como controle posit ivo nos
ensaios citogenéticos (Antunes et al. , 2007).
Figura 1: Fórmula estrutural da Doxorrubicina
Figura 01. Fórmula estrutural da Doxorrubicina.
A droga utilizada neste estudo foi o Oncodox (Cloridrato de
doxorrubicina 50mg da Meizler®), solução em pó liofi lizado injetável
50mg, obtida comercialmente do laboratório. A droga controle foi
dissolvida em meio incompleto a uma concentração final de 0,2µg.ml - 1 .
2.4. Cultura de linfócitos
O sangue periférico foi coletado de seis doadores. Sendo eles, três
homens e três mulheres entre 20 e 30 anos, saudáveis, sem histórico de
doenças recentes, não fumantes e não consumidores de álcool. Os
doadores não relataram o uso de medicamentos e não trabalhavam em
laboratórios. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal de Goiás (Nº. 43/2007 – anexo1). O termo de
consentimento foi assinado por todos os participantes (Anexo 2). As
amostras de sangue periférico foram coletadas por punção venosa com
seringas e tubos vacuntainer heparinizados.
A cultura de linfócitos foi realizada com base na metodologia
desenvolvida por Moorhead et al. (1960), com algumas modificações. O
meio de cultura consistiu em meio RPMI 1640 (80%), soro fetal bovino
(20%), fitohemaglutinina (2%) e antibióticos (0,01mg.mL - 1 de penicilina
e 0,005mg.mL - 1 de estreptomicina). Os frascos foram incubados por 48
horas em uma estufa, a 37°C e com 5% de CO 2 e 95% de umidade.
o . Tratamentos e testes biológicos
Para análise citogenética, o cis-tetraamindiclororutênio foi
estudado em quatro concentrações, (0,001, 0,01, 0,1 e 1mg. mL - 1). Com
uma seringa estéri l descartável, foram coletados cerca de 5 mL de sangue
periférico que foram transferidos para um tubo vacuntainer heparinizado.
Com uma pipeta Pasteur, retirou-se cerca de 0,5 mL do sangue total e
semeou-se em 5 mL de meio de cultura completo + 20% de soro fetal
bovino + 2% de fitohemaglutinina A. No total foram util izados seis
réplicas de cultura por doador.
As amostras foram previamente incubadas na estufa por 24 horas
quando foram tratadas com as diferentes concentrações do complexo de
rutênio. A DXR foi util izada como controle positivo e para o controle
negativo, foi uti lizado meio completo (Figura 02) .
0 48h24
Tratamento das culturas:
1. Controle (sem tratamento).
2. Controle positivo (Doxorrubicina) 0,2µg.mL -1
3. Tratamento Ru 1 µg.mL-1
4. Tratamento Ru 10 µg.mL -1
5. Tratamento Ru 100 µg.mL-1
6. Tratamento Ru 1000 µg.mL-1Coleta das culturas
Semeio das células
Figura 02: Delineamento Experimental
o . Estudos citogenéticos
Para obter um número suficiente de metáfases para análise,
colchicina foi adicionada 1h e 30m antes de completar 48 horas, em uma
concentração de 0,0016%. Após este período as células foram
centrifugadas e tratadas com 0,075 M de KCl a 37ºC durante 20 minutos.
As células foram centrifugadas e fixadas em solução de ácido acético:
metanol (1:3). As lâminas foram preparadas, secadas e colocadas em
solução de Giemsa (pH 6,8) por 5 minutos (Moorhead et al. , 1960).
As lâminas foram analisadas sob microscópia óptica (Olympus) e
objetiva de imersão de 100x, visando o encontro de metáfases de células
tratadas com o complexo de rutênio e seus respectivos controles positivo
e negativo. As freqüências das aberrações cromossômicas (AC) foram
determinadas meliante a análise de 100 metáfases por tratamento e o
índice mitótico (IM) determinado pelo número de metáfases em 5000
linfócitos contados.
o . Ensaio cometa
A versão alcalina do ensaio cometa (single-cell gel electroforesis) foi
seguida de acordo com Singh et al. (1988), com pequenas modificações.
O sangue periférico foi coletado em tubos heparinizado de um doador
normal, saudável, com idade entre 20 e 30 anos, com histórico de não
fumante, não etilista e sem o uso de medicação.
Os linfócitos do sangue periférico foram isolados e incubados por 24
horas e depois foram tratados com concentrações diferentes do cloreto de
cis-tetraamindiclororutênio (III), controle posit ivo (Doxorrubicina) e
negativo, por mais 24 horas e então homogeneizados e misturados em
agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente colocada em uma
lâmina que já continha uma camada de gel de agarose a 1%. A lâmina
com as duas camadas de agarose foi colocada a 4°C por 5 minutos. Após
foram incubadas em uma solução de lise (2,5M NaCl, 10mM Tris,
100mM EDTA, 1% Triton X-100 and 10% DMSO, pH10,0) e colocada a
4°C por duas horas para remover proteínas e membranas. Posteriormente,
as lâminas foram colocadas na eletroforese com tampão (300mM NaOH,
1mM EDTA, pH > 13,0). A corrida de eletroforese foi por 20 minutos, a
0,9 V/cm, 300 mA e a 4°C. Todo o procedimento foi feito no escuro ou
sob luz amarela para prevenir danos no DNA. As lâminas foram
mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5), lavada
com água destilada e secadas a temperatura ambiente (Figura 03).
Preparação de lâminasDNA
Detecção de quebrasde fitas de DNA
Figura 03: Esquema do Ensaio Cometa
As lâminas foram preparadas em duplicatas e 100 núcleos
analisados (50 núcleos para cada duplicata) uti lizando microscópio de
fluorescência (Zeiss) equipado com fil tro de excitação de 515-560nm, um
filtro de barreira de 590nm, e objetiva de 40x. O teste foi realizado no
laboratório Lagene e no Núcleo de pesquisa Replicon, da Universidade
Católica de Goiás.
Os núcleos sem danos no DNA apareceram intactos e sem cauda.
Os cometas foram classificados pelo software CometScore 15, em
classes: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do
que o diâmetro da cabeça (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da
cabeça (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça
(classe 3) e sem cabeça (classe 4) (Figura 04). As recomendações para o
ensaio cometa consideram tanto avaliações visuais quanto as avaliações
usando software (Burlinson et al. , 2007). O total da contagem dos danos
foi de 100 por amostra, perfazendo um total de 500 núcleos (desde a
classificação 0-sem danos até 4 danos totais).
Figura 04: Classificação de leitura para o Ensaio Cometa: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça, muito pouco dano (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça, pouco dano (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça, alto dano (classe 3) e sem cabeça, dano máximo (classe 4).
o . Estudos estatíst icos
As análises estatísticas dos ensaios citogenéticos (IM e EC) foram
feitas empregando o teste ANOVA com comparações múltiplas pelo teste
Tukey. Nível para significância de p foi estabelecido para 5%. Para as
aberrações cromossômicas a análise foi descrit iva.
3. RESULTADOS
3.1. Índice mitótico e Aberrações cromossômicas
Os resultados obtidos nesse estudo mostraram o efeito do cloreto
de cis-tetraamindiclororutênio (III) no índice mitótico, aberrações
cromossômicas e ensaio cometa.
Os resultados das aberrações cromossômicas com diferentes
concentrações do cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) (1, 10, 100
and, 1000 µg/mL - 1) e os respectivos controles se encontram na tabela 1.
Aparentemente, o tratamento com cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio
(III) não foi citotóxico nem clastogênico. No tratamento com as menores
concentrações (1 and 10 µg/mL - 1), as células mostraram valores do índice
mitótico similares ao controle negativo. Contudo, na concentração de
100µg/mL - 1 , existiu uma considerável diminuição do índice mitótico
quando comparado com o controle negativo, mas não estatist icamente
significante. Na concentração de 1000µg.mL - 1 as células mostraram
valores do índice mitótico igual a 0%.
Tabela 01 - Índice mitótico, total de aberrações cromossômicas e
metáfases aberrantes em cultura de linfócitos humanos tratados com
diferentes concentrações de cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III).
Tratamento IM% Fct Qct Qcss Total F%Controle Negativo 6,0 1 0 0 1 0,16
Ru 1µg.mL - 1 *5,9 1 0 0 1 0,16
Ru 10µg.mL - 1 4,9 1 0 0 1 0,16
Ru 100µg.mL - 1 3,6 1 0 0 1 0,16
Ru 1000µg.mL - 1 0 0 0 0 0 0
Dox 0,2µg.mL - 1 2,6 50 40 70 160 26,6
Cem células foram analisadas por lâmina por tratamento e 5000 células foram analisadas para o índice mitótico. IM: índice mitótico; Fct:falhas cromatídicas; Qct:quebras cromatídicas; Qcss:quebras cromossômicas; Ru:rutênio; Dox:doxorrubicina. *P<0,05.
Figura 05: Metáfases encontradas após tratamentos com o cis-tetraamindiclororutênio (III). Em: A-controle negativo; B- Ru 1µg.mL - 1 ; C- Ru 10µg.mL - 1 ; D- Ru 100µg.mL - 1 ; E- Ru 1000µg.mL - 1 ; F- controle positivo (quebra cromatídica no braço longo do cromossomo 2).
Nas células tratadas com a DXR, foi observada uma redução
significativa do índice mitótico quando comparada com o controle
negativo (2.7% / 5.3%). Análises de aberrações cromossômicas e
A B
C D
E F
metáfases mostraram diferenças significativas entre as células expostas à
DXR e o controle negativo. De fato, a DXR é clastogênico e é um indutor
efetivo de metáfases aberrantes com danos nos cromossomos quando
comparados com o controle negativo (figura 05).
Na tabela 02 foi mostrada as freqüências do ensaio cometa em
linfócitos humanos tratadas com diferentes concentrações do cloreto de
cis-tetraaminodiclororutênio (III) pelo ensaio cometa e a DXR (0.2
µg/mL - 1) como controle positovo. A DXR sozinha diminuiu o índice
mitótico na cultura de l infócitos humanos (2,7%) e a frequencia do
cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) (1, 10 and, 100 µg/mL - 1)
were 5,9,4,9, e 3,6 %, respectivamente. No controle negativo apenas uma
pequena minoria de células mostraram danos no DNA. O controle
positico mostrou um aumento em danos de DNA, especialmente na
categoria alta (classe 4).
Tabela 02: Número de núcleos analisados, normais e alterados, com os respectivos danos.
Total de células Classes de Cometa %
Tratamento Analisadas 0 1 2 3 4
Controle Negativo 100 22 55 10 11 2
Ru 1µg.mL - 1 100 33 49 13 3 2
Ru 10µg.mL - 1 100 21 47 21 7 4
Ru 100µg.mL - 1 100 19 60 15 2 4
DXR 0,2µg.mL - 1 100 9 26 32 13 20
Nenhuma das concentrações de cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) testadas foi estatist icamente diferente do
controle negativo (p < 0.05) (figura 06). O ensaio cometa mostrou que a
exposição do cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) não causou
aumento de danos no DNA.
C- Ru4 Ru3 Ru2 C+0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Tratamento
Rel
ação
CC
*****
********
**
Figura 06: C-: controle negativo; Ru4: rutênio 1µg.mL - 1 ; Rut3: 10µg.mL - 1 ; Rut2: 100µg.mL - 1 ; C+: controle positivo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001
4. DISCUSSÃO
A classificação citogenética dos diferentes tipos de aberrações
cromossômicas tem um papel importante na genética humana e muitos
cânceres estão associados com tipos específicos de aberrações. A
identificação dos danos cromossômicos e o estudo dos mecanismos de
patogenias são de grande importância para as pesquisas de carcinogênese
e mutagênese.
Na análise do índice mitótico, não foi encontrada diferença
estatíst ica entre as três menores concentrações do grupo tratado e o
grupo controle. O resultado do índice mitótico indicou que o cloreto de
cis-tetraaminodiclororutênio (III), na concentração de 1000µg.mL - 1 , inibe
o ciclo celular (IM=0%). Silveira–Lacerda (2003) encontrou
citotoxicidade nesta mesma concentração quanto ao efeito proliferativo,
em células tumorais. Em nosso estudo, nas concentrações de 1 a
100µg.mL - 1 houve diferença significativa quando comparada ao controle
positivo. E a concentração de 1µg.mL - 1 quando comparado com o
controle negativo apresentou similaridade, indicando que nesta
concentração, o complexo de rutênio parece não ser citotóxico.
Em um estudo de análises de células meristemáticas de bulbos de
Allium cepa com um complexo de rutênio , foi verificado que a
concentração mais elevada promoveu uma regressão no IM, mas não o
surgimento de alterações cromossômicas (Pereira et al. , 2008), o que
corrobora os dados observados neste trabalho.
É conhecido que o aumento da incidência das neoplasias esteja
associado com a instabil idade das síndromes cromossômicas humanas a
qual são caracterizadas pelo aumento na freqüência das aberrações. Esse
rearranjo em linfócitos do sangue periférico pode ser um indicador do
aumento do risco de surgimento de neoplasias secundárias (Udayakumae
et al. , 1996, Bária et al. , 2001, Padja et al. , 2005, Norppa et al. , 2006,
Boffetta et al. , 2006).
Diante dos resultados promissores na terapêutica antitumoral
obtidos com o cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III) por Clarke
(2003), Silveira-Lacerda (2003) e Menezes et al. (2007), viu-se a
necessidade de pesquisar os efeitos genotóxicos do cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III), em cultura de sangue periférico in vitro.
Os resultados das análises de 100 metáfases por tratamento
mostraram que o complexo de rutênio nas concentrações de 1, 10 e
100µg.mL - 1 não induziu aberrações cromossômicas conforme os
resultados observados com maior freqüência no grupo controle positivo
tais como falhas e quebras cromatídicas e/ou falhas e quebras
cromossômicas. Visto que diversos fármacos utilizados hoje no
tratamento do câncer apresentam altos índices de aberrações
cromossômicas, tais como a DRX, apresentando em nosso estudo uma
freqüência de 26%.
Vilaplana (2006) observou que o complexo cis-dichloro-1,2
propylenediamine-N,N,N0,N0-tetraacetato ruthenium (III) (RAP) também
não apresentou aberrações cromossômicas significantes e sua atividade
anti tumoral tem sido avaliada in vivo . Recentes resultados mostraram que
o seu composto possui estabilidade quando se liga ao DNA e os danos
causados no DNA diminuem de acordo com a retirada do complexo de
rutênio do meio de cultura.
A doxorrubicina é um agente genotóxico que inibe a atividade da
topoisomerase II, resultando na acumulação de quebras das fitas de DNA,
que não são reparadas pela célula causando mutações. O sucesso da
doxorrubicina no tratamento do câncer provavelmente se deve a
intercalação da droga ao DNA e inibição da topoisomerase II (Weijl et
al. , 1997; Mizutani et al. , 2005).
No tratamento das células utilizando 1000µg.mL - 1 não foi
observado a presença de nenhuma metáfase, indicando que
possivelmente, nesta concentração, o complexo de rutênio impediu a
proliferação celular dos linfócitos. Acredita-se que o complexo de
rutênio tenha penetrado nos linfócitos do sangue periférico em menor
quantidade, pois se sabe que receptores de transferrinas se apresentam
diminuídas nas membranas das células normais, comparadas com células
tumorais. Quando esse complexo se encontra um meio sem hipóxia, com
pH normal e concentrações normais de glutationa, possivelmente não
ocorre a redução do composto (III) para o composto (II). De alguma
forma o composto de rutênio bloqueia o ciclo celular, em algum momento
da interfase, evitando o mecanismo de reparo e bloqueando a mitose.
Compostos genotóxicos causam danos no DNA por vários mecanismos,
atuando indiretamente nas funções das proteínas celulares, levando um
acúmulo de danos endógenos de DNA.
Uma abordagem que pode ser uti lizada nos estudos citogenéticos é
a análise de proliferação e progressão celular em tecidos expostos a
agentes clastogênicos, no sentido de observar a influência dos mesmos na
regulação do ciclo celular. Qualquer distúrbio nos eventos que controlam
a progressão das células em divisão pode impedir que as mesmas sigam o
curso normal e estas podem ficar paradas em uma fase ou ser induzidas à
apoptose (M’Bemba et al. , 2006).
A freqüência das aberrações cromossômicas encontradas nos
indivíduos do grupo controle negativo e dos grupos tratados em nosso
estudo foi de 0,16% e está dentro dos valores propostos como freqüência
basal para indivíduos saudáveis, que é de até 2% (Preston et al. , 1987).
Foi observado um aumento tanto na freqüência de células com aberrações
como no total de aberrações entre os grupos controle, sendo que a di ferença foi
es tat ist icamente s ignif icat iva. Em Lima et al . , (2007) foi encontrado maior
freqüência de AC quando ut i l izaram DXR. Após o t ratamento com o composto de Ru,
não houve aumento na f reqüência de AC nas amostras obt idas dos doadores
comparadas com outros t rabalhos que ut i l izam quimioterápicos que hoje são usados
no mercado, como a cisplat ina (Zang & Lippard, 2003; Kasparkova et a l . , 2003;
Brabec & Kasparkova, 2005).
Compostos citotóxico são conhecidos por seus potenciais tóxicos,
tanto quanto a doxorrubicina e a cisplatina (Rojas et al. , 1992; Dhawan
et al. , 2003) , além de seus efeitos citostáticos, possuem efeitos severos
tais como genotoxicidade. Efeitos genotóxicos de drogas anti tumorais em
células não tumorais são de significado especial devido à possibil idade,
que possuem, de induzir tumores secundários em pacientes com câncer.
Além disso, os efeitos mutagênicos e carcinogênicos de agentes
antineoplásicos de pacientes que necessitam destas drogas também
precisam ser considerados (Fucic et al. , 1998; Maluf and Erdtmann,
2000).
Outro composto indutor de aberrações é a ciclofosfamida. É um
agente nitrogênico do grupo das oxazoforinas bifuncional capaz de
induzir vários tipos de danos primários de DNA, mutação gênica e
aberrações cromossômicas e outras formas de l igações transversais que
são traduzidos durante o reparo da excisão (Anderson et al. , 1995). Vale
ressaltar que Sánchez-Suárez et al (2008) observou que quebras de fitas
simples e de fi tas duplas de DNA em linfócitos de sangue periférico
estão presentes em pacientes com câncer antes do tratamento e um
aumento significante após a quimioterapia. E que não existe correlação
entre danos de DNA de l infócitos de sangue periférico e a resposta à
quimioterapia.
Para os ensaios de aberrações cromossômicas, os resultados não
apresentaram atividade genotóxica sobre cultura de linfócitos de sangue
periférico. De acordo com Silveira-Lacerda (2003), observou-se que
mesmo em concentrações utilizadas acima de 1mg.mL - 1 do cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) sobre cultura de células do sangue
periférico humano, as mesmas sofreram apenas inibição na sua
capacidade proliferativa, não apresentando quebra na molécula do DNA
das células tratadas, enquanto que, quando cultivadas na presença de
baixas concentrações (< 0,1mg.mL - 1) apresentaram proliferação celular.
Esses dados são confirmados em nosso trabalho quando as células são
tratadas com Ru (0,001mg.mL - 1) apresentando IM igual a 5,9%, valor
estatist icamente não significativo em relação ao controle negativo. Estes
dados reforçam ainda mais as observações anteriores (Clarke, 2003)
sobre a seletividade dos compostos de rutênio (III) mediar citotoxicidade
preferencial em células tumorais, mas não células normais.
O presente estudo também avaliou danos no DNA pela versão
alcalina do ensaio cometa em linfócitos de sangue periférico. Este ensaio
tem sido usado como um teste para avaliar o risco de desenvolvimento de
doenças (carcinoma de células renais, câncer de bexiga, pulmão e
esôfago), danos individual no DNA (Djuzenova et al. 1999; Lin et al.
2007; Schabath et al. 2003; Shao et al. 2005). O ensaio cometa in vitro é
proposto como uma alternativa para ensaios citogenéticos, como
genotoxicidade/fotogenotoxicidade para seleção de drogas candidatas
(Witte et al. 2007) como as de neurotoxicidade. Na versão alcalina é uma
técnica sensível e relativamente barata para a detecção de danos e reparo
no DNA (Singh et al. , 1988). Uma das maiores vantagens é a
possibilidade de analisar danos e reparo no DNA em células individuais.
Além disso, um pequeno número de células é necessária para este ensaio,
o que é particularmente vantajoso para análise executados nas amostras
de populações humanas. Tem sido usado para testar a genotoxicidade de
químicos expostos exposições de carcinógenos no ambiente, toxinas e
agentes físicos tanto in vitro quanto in vivo (Trzeciak et al. , 2000;
Sekihashi et al. , 2002). Este método também é usado para medir a
capacidade de reparo da célula (Banath et al. , 1998) e de sistema acelular
(Dusinska´ et al. , 2004). Além disso, este ensaio tem sido usado em teste
de diagnóstico prenatal, em síndromes de reparo de DNA incluindo o
xeroderma pigmentoso (XP) and tr icotiodistrofia (TTD) (Alapetite et al. ,
1997).
Em nossos estudos o cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III)
não mostrou aumento significante nas caudas das células em todas as
concentrações em relação ao controle positivo. Assim, não existiu
indução de quebras de fitas de DNA pelo cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) (1, 10 and 100ug.mL) e talvez não esteja
associado a citotoxicidade das aberrações cromossômicas e não é um
efeito direto no DNA em linfócitos de sangue periférico.
Silveira-Lacerda (2003), em seus resultados, demonstrou que o
composto apresenta alta atividade citostática em células tumorais nas
linhagens celulares testadas com este mesmo composto. E também
verificaou que o cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III), em altas
comcentrações (>0.1 mg.mL - 1), apresentou uma moderado atividade
citostática em células isoladas do sangue periférico humano, e em baixas
concentrações (0.01mg.mL - 1) promoveu proliferação celular. Em geral, a
indução de danos genotóxicos como as lesões no cromossôms e DNA
estão fortemente correlacionadas com atividade mutagênica e
carcinogênica. Consequentemente, danos genotóxicos podem ser
considerados um relevante biomarcador de risco carcinogênico.
Assim, podemos deduzir que os compostos de rutênio apresentam
seletividade para entrada nas células, tanto para as células tumorais
quanto para células normais. Sabemos que todas as células do organismo
apresentam receptores para transferrina, especialmente nas células
tumorais, nas quais esses receptores encontram-se em maior quantidade.
Essas condições fazem com que maior quantidade de complexos de
rutênio penetre no tecido tumoral, reduzem rutênio (III) para rutênio (II),
ligando-se ao DNA (Guanina) e promovendo sua quebra (Claire & Dyson,
2001; Clarke, 2003).
Possivelmente, a ausência de fragmentação do DNA nas células
tratadas com o composto de rutênio se deva inicialmente por esta
explicação. A segunda hipótese é que mesmo em pequena quantidade,
esse composto tenha conseguido entrar nas células normais, pois o
complexo de rutênio só é ativado por sua redução quando encontram um
ambiente com alta concentração de glutationa, pH baixo e condições de
hipóxia. É muito comum que células tumorais estarem nessas condições.
Segundo Clarke (2003), células tumorais são conhecidas por terem um
alto nível de glutationa, assim como, o consumo de oxigênio quanto seus
nutrientes são rapidamente utilizados devido ao seu desenvolvimento
acelerado, promovendo hipóxia. Conseqüentemente necessitam mais de
energia glicolítica, que ocasiona o aumento de ácido lático no tecido,
diminuindo o pH do meio. Vale à pena ressaltar que os complexos de
rutênio (III) servem como uma pró-droga que são ativadas pela redução
in vivo para rutênio (II).
Em resumo, nossos resultados indicaram que o cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio (III) não causou danos no DNA em cultura de
linfócitos humanos.
5. CONCLUSÃO
O estudo avaliou os cromossomos humanos em metáfase e
possíveis fragmentação de DNA, detecção de aberrações espontâneas
e/ou induzidas pelo uso do composto de rutênio cis-[RuCl 2(NH3)4]Cl, e
concluiu que:
A. Os índices mitóticos encontrados nas células tratadas com o
cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III) nas concentrações de
0,001, 0,01, 0,1 e 1 mg.mL - 1 apresentaram os respectivos
percentuais, de 5,9%, 4,9%, 3,6%, 0%, indicando que quanto maior
o IM maior a proliferação celular.
B. Através da análise da freqüência de aberrações cromossômicas em
células normais humanas do composto de Rutênio Cloreto de cis-
tetraamindiclororutênio (III) em cultura de linfócitos humanos do
sangue periférico, não se observou alterações em nenhuma das
células tratadas;
C. De acordo com os resultados do teste cometa, todas as
concentrações do cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III) não
causaram danos no DNA de l infócitos do sangue periférico.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Quando se fala de genotoxicidade falamos da área da genética que
estuda as alterações na base genética dos seres vivos, isto é, alterações
físicas, químicas do DNA, e/ou alterações genéticas a nível celular. A
maioria dos testes de detecção de danos genéticos busca agentes que
possam afetar o genoma de um organismo. Para suprir a necessidade de
informações em mutagênese e carcinogênese humana foram criadas
estratégias de avaliação com testes in vitro e in vivo.
A metodologia util izada neste trabalho permite avaliar os efeitos
genotóxicos do fármaco organometálico, que faz parte da primeira fase
dos estudos para a liberação de novos medicamentos no mercado,
exigidos pela ANVISA.
Em nossos experimentos usamos três técnicas para análise de nosso
composto de rutênio: as aberrações cromossômicas, índice mitótico e
ensaio cometa, que vem sendo util izada por vários pesquisadores em
diversos tipos de células para várias finalidades, como a genética
toxicológica, dosimetria biológica e em biomonitoramento, devido a sua
ampla sensibilidade.
Os nossos resultados indicaram que em linfócitos humanos de
sangue periférico não houve a formação de aberrações cromossômicas e
nem danos no DNA quando tratados com o cis-tetraamindiclororutênio
(III). E na concentração de 1000µg.mL - 1 , apesar de índice mitótico 0%, a
quantidade de células apresentadas era considerada normal, quando
sugere que os complexos de rutênio poderiam exercer atividade
anti tumoral de forma direta e de forma indireta, estimular células
mononucleares para proliferação celular.
Esses resultados merecem atenção, pois já é de conhecimento que
os fármacos, hoje no mercado, possuem um mecanismo de ação agressivo
tanto para células tumorais quanto para os linfócitos. Proporcionando
efeitos colaterais indesejáveis para o paciente e possível aparecimento de
câncer secundário. E que os novos compostos de metais, os complexos de
rutênio, estão sendo uma alternativa de quimioterapia, com atividade
anti tumoral mais seletiva e menos tóxica.
Com esses resultados, novas perspectivas de estudos com o cis-
tetraamindiclororutênio (III) merecem ser avaliadas. Um estudo sobre a
correlação entre este complexo de rutênio e as fases do ciclo celular será
necessário para identificar as causas de seus possíveis bloqueios, e
posteriormente, definir a fase que o rutênio interfere no ciclo celular.
ANEXOS
ANEXO1
ANEXO 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
“Avaliação do Potencial Genotóxico dos Novos Compostos de
Rutênio Utilizando Testes Citogenéticos in vitro”.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Pessoas para Contato: Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda – (62) 9293-3121
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro – (62)
9997-8494
Em caso de dúvida sobre a pesquisa, você poderá entrar em contato
com a pesquisadora responsável, Profª Drª Elisângela de Paula Silveira
Lacerda, no telefone: (62) 3521-1481. Em caso de dúvidas sobre os seus
direitos como participante nesta pesquisa, você poderá entrar em contato
com o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás
pelo telefone: (62) 3269-8338.
Propósito do Estudo: Você está sendo convidado (a) para participar, como
voluntário, em uma pesquisa. O projeto de pesquisa tem o nome de
“Avaliação do Potencial Genotóxico dos Novos Compostos de Rutênio
Utilizando Testes Citogenéticos in vitro” , cuja finalidade é determinar a
existência ou não de aberrações cromossômicas, ou seja, alguma
alteração na estrutura do cromossomo ( verificar se existe uma alteração
nas células de seu sangue), estudada por nosso grupo, devido ao uso dos
novos compostos de rutênio no tratamento do câncer.
Procedimentos: Você responderá um questionário informando alguns
dados pessoais como nome completo, endereço, idade, sexo, se fuma ou
bebe, se trabalha em algum laboratório ou afins, se está tomando algum
tipo de medicamento nas últimas 48h. Para a realização dessa pesquisa
será necessário, ainda, colher uma pequena quantidade do seu sangue (5
mL) retirados por punção venosa na prega do cotovelo direita ou
esquerda (assim como é feito para a realização de qualquer exame de
sangue que você conhece). As amostras colhidas serão encaminhadas ao
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética/ICB da Universidade
Federal de Goiás, para realização dos da pesquisa.
Riscos ou Desconfortos: Estes procedimentos não lhe acarretarão nenhum
risco, prejuízo ou lesões, pois trabalhamos com materiais de coleta de
sangue descartáveis e profissionais qualificados. Durante a coleta de
sangue, você receberá a picada de uma agulha como aquela que é feita
para qualquer paciente que deseja fazer um exame de sangue.
Geralmente, esse procedimento não trás complicações para as pessoas,
além do desconforto que ocorre no momento em que se pega a veia.
Benefícios: Sua participação nesse estudo será de grande contribuição
para a realização da pesquisa, sabendo estaremos participando da
descoberta de um novo remédio contra o câncer.
Custos: Você não pagará nada para participar desse estudo e também não
receberá pagamentos pela sua participação.
Confidencialidade: Todas as informações prestadas durante a entrevista
serão de caráter confidencial e as informações colhidas serão util izadas
somente para fins científicos nesta pesquisa, sem qualquer identif icação
pessoal.
Participação voluntário-retirada do estudo: A participação nessa pesquisa
é de livre e espontânea vontade do paciente. Você está sendo convidado.
Caso aceite, e, não desejando mais continuar, poderá, a qualquer
momento, sair do estudo, não importa se já respondeu o questionário e
colheu sangue para a pesquisa.
Esclarecimento quanto ao uso de material biológico: declaro o
compromisso de utilizar tal material biológico (sangue humano)
exclusivamente para o projeto de pesquisa proposto e apresentar
informação quanto ao armazenamento de material biológico para futuros
estudos. Se possível você será chamado para dar sua autorização para
o(s) novo(s) projeto(s). Caso isso seja impossível, seu material biológico
somente será util izado mediante aprovação do novo(s) projeto(s) pelo
CEP e ou pela CONEP.
Após ser esclarecido (a) sobre as informações a seguir, no caso de
aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento que está
em duas vias. Uma delas é a sua e a outra do pesquisador responsável.
Em caso de dúvida sobre a pesquisa, você poderá entrar em contato com
os pesquisadores responsáveis acima citados. Se util izar material
biológico, declarar o compromisso do pesquisador de util izar tal material
o(s) novo(s) projeto(s).
DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO
Eu, _____________________________________, RG
__________________ CPF n.º ______________________ abaixo
assinado, declaro ter lido o termo que me foi apresentado sobre o projeto
de pesquisa “ Avaliação do Potencial Genotóxico dos Novos Compostos
de Rutênio Utilizando Testes Citogenéticos in vitro ”. Com as
explicações que me foram dadas, entendi as informações contidas nesse
documento, cuja cópia fica em meu poder, e declaro que estou de acordo
em participar do estudo que me foi apresentado, respondendo as
perguntas do questionário que me forem apresentadas e permitindo a
retirada de sangue conforme explicado.
Goiânia, _______ de _______________ de 200__.
____________________________________
Pesquisado
____________________________________
Pesquisador (a) Responsável
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome:_______________________________Assinatura:______________
Nome:_______________________________Assinatura:______________
OBS: Esse termo apresenta duas vias, uma destinada ao usuário e outra
aos pesquisadores.
Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda.
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro
Bióloga – Mestranda em Biologia – Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética Clínica-Fone-
35211481
ICB I – Sala 200. Campus Samambaia II, s/n, Setor Itatiaia. Goiânia -
Goiás
