SILVANA MARCUSSI “Caracterização Funcional e Estrutural de...
143
SILVANA MARCUSSI “Caracterização Funcional e Estrutural de uma Metaloprotease Isolada do Veneno de Bothrops jararacussu” RIBEIRÃO PRETO 2007 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Transcript of SILVANA MARCUSSI “Caracterização Funcional e Estrutural de...
SILVANA MARCUSSI
“Caracterização Funcional e Estrutural de uma Metaloprotease
Isolada do Veneno de Bothrops jararacussu”
RIBEIRÃO PRETO
2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
SILVANA MARCUSSI
“Caracterização Funcional e Estrutural de uma Metaloprotease
Isolada do Veneno de Bothrops jararacussu”
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Giglio
RIBEIRÃO PRETO – SP
2007
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências para obtenção do título de Doutora em Ciências, Área de concentração: Bioquímica.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Marcussi, Silvana Caracterização Funcional e Estrutural de uma Metaloprotease
Isolada do Veneno de Bothrops jararacussu./ Silvana Marcussi; orientador Prof. Dr. José Roberto Giglio. - Ribeirão Preto, 2007.
113 p. il. 30cm. Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Ciências.
Área de concentração: Bioquímica) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
1. metaloprotease. 2. atividade bactericida e antitumoral.
3. veneno de serpentes. 4. Bothrops jararacussu. 5. Clonagem e expressão. 6. Modelagem molecular.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Silvana Marcussi
Caracterização Funcional e Estrutural de uma Metaloprotease Isolada do Veneno de Bothrops
jararacussu
Banca Examinadora
Prof. (a) Dr. (a) ____________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________________
Prof. (a) Dr. (a) ____________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________________
Prof. (a) Dr. (a) ____________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________________
Prof. (a) Dr. (a) ____________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________________
Prof. (a) Dr. (a) ____________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________________
Defendida e aprovada pela comissão julgadora em: ________________________________
Dedicatória e Agradecimentos
Agradeço à NATUREZA, que se faz presente em tudo que é vivo e em
tudo que sustenta a vida no universo, em inter-relações tão complexas e
perfeitas que existem devido à imensa energia que pode ser absorvida e
liberada por tudo e por todos.
Dedicatória e Agradecimentos
Dedico este trabalho:
À minha família e namorado que, mesmo sem perceber, me proporcionam no
dia a dia carinho e motivação para continuar sempre em frente e não me abater ou
desistir diante de obstáculos que todos nós precisamos transpor.
Aos meus eternos amigos (Aline P. R. Montanari, Marilza C. C. dos Rios,
Simone C. Z. Torres, Natael R. Malta-Neto) que mesmo estando ausentes de
corpo sempre me acompanham em espírito fazendo com que eu me sinta protegida
e amada em todos os momentos de minha vida.
A meu orientador Prof. Dr. José Roberto Giglio e a meu extra-oficial, mas
eterno orientador Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, que são exemplos de
experiência profissional e de vida, por quem tenho imenso apresso e gratidão pelo
incentivo pessoal e profissional, pela orientação constante, conduzindo-me com
clareza e dedicação ao longo de todo meu projeto de doutorado e direcionando
meus próximos passos.
Dedicatória e Agradecimentos
Agradecimentos
Agradeço sinceramente a todos que contribuíram direta ou indiretamente para o
desenvolvimento e realização deste trabalho e em particular:
- Aos Profs. Drs. Auro Nomizo (USP), André L. Fuly (UFF-RJ), Eduardo B. Oliveira (USP),
Eliane C. Arantes (USP), Marcos R. M. Fontes (UNESP), Odair A. Gomes (UNAERP), Paulo
S. Pereira (UNAERP) e Suely V. Sampaio (USP) pela colaboração, cedendo gentilmente
equipamentos, reagentes e proporcionando locais e condições adequados para a realização de
parte da tese de doutorado. Seu profissionalismo, carisma, competência e ética nos servem de
espelho para o desenvolvimento acadêmico, profissional e pessoal.
- Aos técnicos, especialistas e secretárias de diversos departamentos que se tornaram meus
amigos (Carlos Alberto, Odete, Silvana, Ivone, Marrom, Franco e Adélia) e que foram
pacientes e solícitos ao me passarem conhecimentos teórico e prático possibilitando a
realização de grande parte do projeto de doutorado.
- Especialmente aos meus amigos de estudo e bancada Clayton, Carolina, Maurício, Fábio,
Aristides, Mônica, Saulo, Danilo, Lucas, Daniela, Raquel, Gilmara, Lorane, Elaine (FCFRP-
USP) e Ângelo (UNESP), que tiveram papel fundamental no desenvolvimento deste projeto e
trouxeram companheirismo e motivação tornando agradável cada dia desta jornada.
- À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro e
a oportunidade de crescer profissionalmente e pessoalmente através da realização deste
projeto.
Abreviaturas e siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
• aa - aminoácidos;
• ADP – adenosina difosfato;
• AMBIC - (NH4HCO3) tampão bicarbonato de amônio;
• ATCC – “American Type Culture Collection”, Rockville, MD, USA);
• BAPNA - benzoil arginil paranitroanilida;
• BHI – “Brain Heart Infusion”;
• Bjussu – veneno bruto de Bothrops jararacussu;
• BjussuMP-I - metaloprotease hemorrágica de alto peso molecular isolada do veneno de
Bothrops jararacussu;
• BjussuMP-II - metaloprotease de baixo peso molecular isolada do veneno de Bothrops
jararacussu;
• BFS – soro bovino fetal;
• BthTX-I – fosfolipase A2 Lys49-homóloga isolada do veneno de B. jararacussu;
• cDNA - DNA complementar;
• CIM – concentração inibitória mínima;
• CK - creatina cinase;
• CM-Sepharose – Carboximetil-Sepharose;
• DMH - dose mínima hemorrágica;
• DMSO - dimetil sulfóxido;
• DNA - ácido desoxiribonucléico;
• DEPC – dietil pirocarbonato;
Abreviaturas e siglas
• EDTA - ácido etilenodiamina tetraacético;
• EGTA - etilenoglicol-bis (N, N, N’, N’-ácido tetra-acético);
• HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência;
• IPTG – isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside;
• LB – meio de cultura Luria Bertani;
• MP - metaloprotease;
• Mr- massa atômica relativa;
• MTT – 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide;
• NCBI – “National Center for Biotechnology Information”;
• NTSB - 2-Nitro-5-thiosulphobenzoate;
• OD - densidade óptica;
• pb - pares de bases;
• PBS - tampão fosfato em salina;
• PCR - reação em cadeia de polimerase;
• PEG – polietilenoglicol;
• pI – ponto isoelétrico;
• PLA2 - fosfolipase A2;
• PPM – padrão de peso molecular;
• PM – peso molecular;
• PMSF – Phenylmethylsulphonyl-fluoride;
• PRP – plasma rico em plaquetas;
• RNA - ácido ribonucléico;
• RPMI – meio para cultura de células adquirido comercialmente;
Abreviaturas e siglas
• RT-PCR - reação em cadeia de polimerase utilizando a enzima transcriptase reversa;
• S-2238 – substrato cromogênico específico para trombina (fórmula: H-D-Phe-Pip-Arg-NA·2HCl)
• SBF – soro bovino fetal;
• SD – desvio padrão;
• SDS-PAGE - eletroforese com dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida;
• TAE – tampão composto por tris, ácido acético e EDTA;
• TAME - Nα – p – tosil – L – arginina metil éster;
• TBE – tampão composto por tris, ácido bórico e EDTA;
• TC - tempo de coagulação;
• TCA - ácido tricloroacético;
• TEMED - N´, N´, N´, N´- tetrametilenodiamino;
• TFA – ácido trifluoracético;
• VB - veneno bruto;
• WRP – plasma rico em plaquetas, lavado;
• UV – ultra violeta;
• UFC – unidade formadora de colônia;
• RCF – força centrífuga relativa;
• X-gal - substrato incolor que se converte a azul sob a ação da enzima β-galactosidase.
Figuras e tabelas
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Representação esquemática dos domínios de uma metaloprotease (KINI e EVANS, 1992)................................................................................................................................. 6
Figura 2. Isolamento da metaloprotease BjussuMP-II .................................................................. 45 Figura 3. Atividade fibrinogenolítica da BjussuMP-II em diferentes concentrações, tempos de
incubação, pHs e temperaturas ....................................................................................... 50 Figura 4. Atividade fibrinogenolítica da BjussuMP-II na presença de diferentes íons metálicos,
EDTA e heparina ........................................................................................................... 51 Figura 5. Efeito de Inibidores sobre a Atividade fibrinogenolítica de BjussuMP-II .................... 52 Figura 6. Atividade proteolítica da BjussuMP-II sobre diferentes substratos............................... 53 Tabela 1. Efeito da BjussuMP-II de B. jararacussu sobre plasma bovino citratado..................... 54 Figura 7. Análise Histopatológica após injeção da BjussuMP-II.................................................. 55 Figura 8. Efeito inibitório da BjussuMP-II sobre plaquetas.......................................................... 56 Tabela 2. Efeito da BjussuMP-II sobre plaquetas ......................................................................... 57 Tabela 3. Atividade da BjussuMP-II e trombina sobre fibrinogênio ou substrato S-2238 ........... 57 Figura 9. Efeito citotóxico dose resposta da metaloprotease sobre E. coli e S. aureus ................ 58 Figura 10. Efeito da BjussuMP-II sobre células tumorais............................................................. 59 Figura 11. Seqüência do cDNA e de aminoácidos deduzidos da BjussuMP-II ............................ 62 Figura 12. Comparação da seqüência de aminoácidos da BjussuMP-II com outras
metaloproteases de diferentes venenos de serpentes ..................................................... 63 Figura 13. (A) Ramachandran gerado no programa PROCHECK v.3.5.4. (B) R.m.s.d.
derivado do modelo da BjussuMP-II durante a dinâmica molecular (MD) .............. 65/66 Figura 14. Estrutura secundária e terciária do modelo teórico final da BjussuMP-II .................. 67 Figura 15. (A) Representação da distância entre o íon Zn++ (esfera verde) e os resíduos de
aminoácidos do sítio catalítico do modelo teórico final da BjussuMP-II; (B) Representação da região de maior flexibilidade do modelo da BjussuMP-II, 153-176 (vermelho) ...................................................................................................................... 68
Figuras e tabelas
Figura 16. Resíduos conservados, encontrados na BjussuMP-II e BjussuMP-I (resíduos internos são mostrados em azul e os de superfície estão apresentados em verde) ......... 69
Figura 17. Análise eletroforética dos cDNAs amplificados com os primers específicos de MPs
(MP-1 e MP-2) .............................................................................................................. 70 Figura 18. Expressão e Purificação da BjussuMP-II recombinante ............................................ 71 Figura 19. Atividade Fibrin(ogen)olítica da BjussuMP-II nativa e recombinante ....................... 72 Figura 20. Análises imunoquímicas de difusão enzimática e ELISA ......................................... 74
Resumo
RESUMO
As metaloproteases de venenos de serpentes compreendem um grupo de enzimas
dependentes de zinco, de massa molecular variável, responsáveis pelo efeito hemorrágico
induzido pelo veneno destes animais. Este trabalho teve por objetivo a caracterização bioquímica,
funcional e estrutural de uma metaloprotease de baixo peso molecular isolada do veneno de
Bothrops jararacussu, denominada de BjussuMP-II. Esta enzima foi isolada em duas etapas
cromatográficas: uma troca iônica em CM-Sepharose seguida por uma hidrofóbica em Phenyl-
Sepharose. O grau de pureza da BjussuMP-II foi verificado por SDS-PAGE e HPLC de fase
reversa em coluna C18. A BjussuMP-II apresentou uma única cadeia polipeptídica com massa
molecular relativa de aproximadamente 24.000 na ausência e presença de agentes desnaturantes,
mostrando ser monomérica. A atividade proteolítica foi avaliada sobre diferentes substratos
(caseína, gelatina, fibrina, colágeno e fibrinogênio) e condições experimentais (variações de
concentrações, pHs, temperaturas, tempo de incubação, efeito do EDTA, heparina, diferentes íons
divalentes, inibidores sintéticos e naturais). A BjussuMP-II demonstrou ser uma potente α-β-
fibrinogenase, dose-dependente, permanecendo estável em diferentes pHs e temperaturas. A
atividade fibrinogenolítica foi completamente abolida após incubação prévia com EDTA ou
heparina. A proteína não apresentou atividade coagulante e anticoagulante sobre o plasma
humano citratado, além de não se mostrar miotóxica e letal em doses de 100 e 300µg/animal,
respectivamente. A protease não induziu hemorragia (doses de 50 a 300µg) nem se mostrou ativa
sobre o BAPNA e o TAME (ausência de atividade esterásica e amidolítica), sugerindo tratar-se
de uma metaloprotease de baixo peso molecular, não hemorrágica, possivelmente da classe P-IB.
A análise histopatológica demonstrou infiltrados leucocitários focais, leve destruição das fibras
musculares e leve hemorragia no tecido pulmonar. A BjussuMP-II inibiu totalmente a agregação
plaquetária induzida por ADP e colágeno, perdendo a atividade inibitória na presença de EDTA,
PMSF e benzamidina. A metaloprotease apresentou efeito bactericida sobre as linhagens de E.
coli e S. aureus e atividade antitumoral sobre quatro linhagens de células testadas (JURKAT, SK-
BR-3, EAT e B16F10). A partir do RNA total extraído da glândula de veneno da serpente
Bothrops jararacussu, obteve-se o cDNA da protease de interesse e este foi clonado em E. coli e
posteriormente extraído e seqüenciado. A seqüência completa da BjussuMP-II, obtida por
técnicas de biologia molecular, revelou 615pb que codificam para 205 resíduos de aa. A
Resumo
seqüência N-terminal dos primeiros 30 resíduos de aminoácidos, diretamente da enzima
BjussuMP-II, confirmaram que este cDNA codifica para a mesma proteína. Através do
alinhamento da seqüência da BjussuMP-II com outras metaloproteases pode-se observar grande
similaridade entre elas, principalmente entre as proteases da classe P-I. A expressão da
BjussuMP-II foi obtida com sucesso por clonagem em E. coli, e a protease recombinante
apresentou a mesma massa molecular da proteína nativa em SDS-PAGE além de demonstrar
atividade fibrin(ogen)olítica. A BjussuMP-II mostrou-se imunogênica, sendo capaz de induzir a
produção de anticorpos quando injetada em coelhos, e, os anticorpos apresentaram-se
imunorreativos com metaloproteases e outras proteínas. A modelagem molecular demonstrou
claramente que a molécula apresenta uma forma elipsoidal e dois subdomínios, além de
apresentar a conformação da região ligante de íon Zn++. Os aspectos abordados neste trabalho
poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, relacionando estrutura e
função, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de
venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica, destas proteínas nos envenenamentos
causados pela serpente Bothrops jararacussu.
Palavras-chave: 1. Metaloprotease. 2. Atividade enzimática. 3. Peçonha de serpentes. 4.
Bothrops jararacussu. 5. Clonagem e expressão. 6. Modelagem molecular.
Abstract
ABSTRACT
Snake venom metalloproteases consist of a set of zinc dependent enzymes with variable
molecular masses, responsible for the hemorrhagic effect induced by these venoms. This work
aimed at the biochemical, functional and structural characterization of a low molecular weight
metalloprotease (class P-I) isolated from B. jararacussu venom and named BjussuMP-II. It was
isolated through two chromatographic steps: an ion exchange chromatography on CM-Sepharose
followed by a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. It was assayed for purity by
SDS-PAGE and reverse phase HPLC on a C18 column. BjussuMP-II showed a single
polypeptide chain with a Mr close to 24,000 in the presence or absence of denaturating agents,
showing therefore as monomeric. Its proteolytic activity was evaluated on different substrates
(casein, gelatin, fibrin, collagen and fibrinogen) and experimental conditions (concentration, pH,
temperature, incubation time, effect of EDTA, heparin, several ions and synthetic or natural
inhibitors). BjussuMP-II showed to be a potent dose dependent fibrinogenase, stable at different
pHs and temperatures. Its fibrinogenolytic activity was completely abolished after incubation
with EDTA or heparin. It did not show any coagulant or anticoagulant activity on citrated human
plasma, and no myotoxic or lethal effect at 100 and 300µg/animal, respectively. It also did not
induce hemorrhage (doses from 50 to 300 µg) and did not act on BAPNA or TAME (absence of
esterase and amidolytic activities), suggesting a low molecular weight metalloprotease, not
hemorrhagic, probably from class P-IB. Histopathologic analysis showed focal leukocyte
infiltrates, presence of plasmocytes and destruction light of muscle fibers. In the lung tissue we
observed hemorrhage light, decreased alveolar spaces due to thickening of septs and interstitial
spaces expanded by the inflammatory infiltrate. BjussuMP-II completely inhibited platelet
aggregation induced by ADP and collagen, losing this activity in the presence of EDTA, PMSF
and benzamidine. It also showed bactericidal effect on E. coli and S. aureus lines, as well as
antitumoral activity on four assayed cell lines (JURKAT, SK-BR-3, EAT e B16F10). Starting
from the total RNA extracted from B. jararacussu venom glands, the cDNA of the protease was
obtained, which was cloned in E. coli and then extracted and sequenced. The complete sequence
of BjussuMP-II, obtained through molecular biology techniques, revealed 615 bp that codified
for 205aa residues. The N-terminal sequence of the 30 first residues, revealed directly from the
enzyme, confirmed that this cDNA codify for the same protein. Through alignment of the
Abstract
BjussuMP-II sequence with other metalloproteases, a strong similarity was observed, chiefly
among class P-I proteases. Expression of BjussuMP-II was obtained successfully by cloning in
E. coli. The recombinant protease showed the same molecular mass of the native protein by SDS-
PAGE in addition to fibri(ogen)olytic activity. BjussuMP-II showed to be immunogenic, being
able to induce antibodies that showed reactivity against metalloproteases and other proteins.
Molecular modelling clearly showed that the molecule displays an ellipsoidal form and two
subdomains, in addition to the Zn++ binding region conformation. The approaches worked out in
this project may provide complementary information on the action mechanism, relating structure
and function, as well as a better understanding of the effects induced by snake venom
metalloproteases and their direct or synergic participation in envenomations caused by B.
jararacussu venom.
Key words: 1. Metalloprotease; 2. Enzymatic activity; 3. Snake venom; 4. Bothrops jararacussu.
5. Cloning and expression. 6. Molecular modeling.
Sumário
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................................................1
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................10
3. MATERIAL ..............................................................................................................................11
4. MÉTODOS ...............................................................................................................................16 4.1. Preparação da amostra ...................................................................................................16
4.2. Isolamento da metaloprotease de baixo peso molecular do veneno de Bothrops jararacussu ...........................................................................................................................16
4.3. Sistema de ultrafiltração ................................................................................................17
4.4. Determinação quantitativa de proteínas ........................................................................17
4.5. Determinação do Peso Molecular (SDS-PAGE) ...........................................................17
4.6. Eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas ........................................18
4.7. Atividades enzimáticas da metaloprotease ....................................................................18
4.7.1. Teste de degradação do fibrinogênio ..............................................................18
4.7.2. Teste de degradação de fibrina .......................................................................19
4.7.3. Teste de degradação do Colágeno ..................................................................20
4.7.4. Atividade caseinolítica ...................................................................................20
4.7.5. Atividade gelatinolítica ..................................................................................20
4.7.6. Atividade coagulante ......................................................................................21
4.7.7. Atividade anticoagulante .....................................................................................................21
Sumário
4.8.Atividades farmacológicas da metaloprotease ...............................................................21
4.8.1.Atividade hemorrágica ....................................................................................21
4.8.2.Indução de edema em camundongos ...............................................................22
4.8.3.Atividade miotóxica ........................................................................................22
4.8.4.Toxicidade da protease ....................................................................................23
4.8.5.Produção de anticorpos policlonais .................................................................23
4.8.6.Agregação Plaquetária e Formação de Trombina ............................................25
4.8.7.Atividade antibacteriana ..................................................................................26
4.8.8.Análise Histopatológica ...................................................................................26
4.8.9.Atividade antitumoral de BjussuMP-II ............................................................27
4.9. Outras Atividades ..........................................................................................................28
4.9.1. Atividade amidolítica sobre o substrato cromogênico artificial (BAPNA) 28
4.9.2. Atividade esterásica sobre o substrato artificial TAME .................................29
4.9.3.Atividade hemolítica indireta ..........................................................................29
4.10. Estudo estrutural da metaloprotease ............................................................................30
4.10.1. Determinação da seqüência completa do cDNA da metaloprotease ............30
4.10.1.1. Extração das glândulas veneníferas da serpente Bothrops jararacussu e preparação do RNA total ........................................................30
4.10.1.2. Construção e preparação dos oligonucleotídeos ..........................30
4.10.1.3. Síntese do cDNA e amplificação por PCR ..................................31
4.10.1.4. Preparo de bactérias competentes ................................................32
4.10.1.5. Transformação das bactérias competentes ...................................32
4.10.1.6. Clonagem do cDNA da metaloprotease em E. coli .....................32
4.10.1.7. Purificação de plasmídeos ............................................................33
4.10.1.8. Digestão .......................................................................................33
4.10.1.9. Reação de seqüênciamento de cDNA por produto de PCR .........33
4.10.1.10. Análise computacional das seqüências ........................................34
4.11. Clonagem em vetor de expressão do cDNA da BjussuMP-II..................................................34
4.11.1. Isolamento do cDNA completo ....................................................................34
4.11.2. Ligação do cDNA ao vetor de expressão e transformação genética ............35
4.11.3. Análise das colônias transformantes .............................................................38
4.11.4. Expressão da proteína recombinante ............................................................38
Sumário
4.11.5. Análise da expressão da BjussuMP-II recombinante em gel de poliacrilamida ...........................................................................................................39
4.11.6. Purificação e redobramento da proteína recombinante ................................40
- Extração e Purificação da metaloprotease dos corpos de inclusão ........................40
- Redobramento e Purificação da metaloprotease recombinante..............................41
4.12. Estudo Estrutural da BjussuMP-II ...............................................................................42
4.12.1. Modelagem molecular ..................................................................................42
4.12.2. Simulação Dinâmica Molecular ...................................................................42
4.12.3. Avaliação do Modelo Teórico da BjussuMP-II ............................................43
4.13. Análise estatística dos resultados ................................................................................43
5. RESULTADOS ........................................................................................................................44 Isolamento e Caracterização Bioquímica da Metaloprotease ...............................................44
Caracterização Funcional da Metaloprotease .......................................................................46
Caracterização Estrutural da BjussuMP-II ...........................................................................60
Caracterização Imunoquímica ..............................................................................................73
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................75 Isolamento e Caracterização Bioquímica da Metaloprotease ...............................................75
Caracterização Funcional e Imunoquímica da Metaloprotease ............................................77
Caracterização Estrutural da Metaloprotease .......................................................................83
7. CONCLUSÃO ..........................................................................................................................92
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................93
Introdução 1
1. INTRODUÇÃO
Na história da civilização, as serpentes venenosas durante anos assumiram peculiaridades
culturais. Na arte, na ciência e na religião representaram valores simbólicos envolvendo inúmeras
crenças. Nas últimas cinco décadas de investigações, sobre a bioquímica e farmacologia dos
venenos de serpentes, novos conceitos foram introduzidos. Atualmente, várias pesquisas
demonstram uma grande diversidade funcional/estrutural de seus componentes e suas possíveis
aplicações terapêuticas. Os acidentes com animais peçonhentos constituem problema de saúde
pública, sobretudo nos países de clima tropical e subtropical, regiões que caracterizam o habitat
destes répteis, tanto pela freqüência com que ocorrem como pela gravidade dos acidentes.
Em todo o mundo, aproximadamente trezentas espécies de serpentes são conhecidas como
venenosas, ocorrendo somente duas famílias na fauna brasileira, a Elapidae e a Viperidae. No
Brasil ocorrem entre 19 a 22 mil casos de acidentes ofídicos por ano. Dentre as serpentes
peçonhentas existentes no Brasil, destaca-se o gênero Bothrops (família Viperidae) que é
responsável por aproximadamente 90% dos acidentes (PINHO e PEREIRA, 2001).
Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de
proteínas, compreendendo grande variedade de enzimas e toxinas não enzimáticas (neurotoxinas,
citotoxinas, cardiotoxinas, proteases, desintegrinas, peptídeos potenciadores de bradicinina entre
outros), além de componentes não protéicos que podem ser orgânicos ou inorgânicos,
representados por lipídeos, carboidratos e compostos de baixo peso molecular como nucleosídeos
e diversos íons. As proporções em que os componentes dos venenos aparecem e suas
propriedades biológicas variam de acordo com diversos fatores como, por exemplo: região
geográfica, idade, sexo, hábitos alimentares, mudanças de estações, variando de espécie para
espécie nos diferentes gêneros e famílias, e até mesmo o tempo decorrido entre uma extração de
veneno e outra poderia estar interferindo em sua composição (FRANÇA e FAN, 1992).
Introdução 2
Essas proteínas podem apresentar atividades enzimáticas que determinam a toxicidade do
veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação
sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. As enzimas proteolíticas presentes nestes
venenos de serpentes podem atuar numa grande variedade de substratos naturais, tais como:
hemoglobina, colágeno, elastina, fibrinogênio, insulina, glucagon e outros (IWANAGA e
SUZUKI, 1979; MAZZI et al., 2004).
Algumas dessas enzimas são toxinas hemorrágicas que degradam proteínas da matriz
extracelular (MATRIZIAN, 1992), outras afetam a coagulação do sangue, agindo como
procoagulantes, convertendo o fibrinogênio em fibrina (MARKLAND e DAMUS, 1971;
STOCKER e BARLOW, 1976; SELISTRE-de-ARAÚJO e GIGLIO, 1987), enquanto outras
agem como anticoagulantes por exercerem atividade fibrin(ogen)olítica (KOMORI et al., 1985;
DAOUD et al., 1986; SWENSON e MARKLAND, 2005).
O envenenamento botrópico caracteriza-se por induzir estado de choque, causa mais
freqüente de morte, exercer intensa atividade proteolítica, coagular o plasma sanguíneo, estimular
a liberação de substâncias como histamina e bradicinina, e resultar em pronunciados efeitos
locais como hemorragia e necrose, o que ocasiona perda de tecido, resultando em seqüelas que
podem levar à amputação do membro afetado (VITAL BRAZIL, 1982).
Durante o envenenamento por serpentes do gênero Bothrops, a alteração do equilíbrio
hemostático geralmente está relacionada à ação de proteases sobre diferentes fatores da cascata
de coagulação, tais como o fibrinogênio ou fibrina (GASMI et al., 2000; DUNN e BROADY,
2001; TAKATSUKA et al., 2001). As proteases do veneno, classificadas em serinoproteases e
metaloproteases, são os principais grupos de enzimas proteolíticas que podem levar ao
desequilíbrio hemostático (MATSUI, FUJIMURA e TITANI, 2000).
Introdução 3
As metaloproteases (MPs) de venenos de serpentes compreendem uma série de enzimas
dependentes de zinco de massa molecular variável. São altamente tóxicas na sua grande maioria,
apresentam atividade fibrinogenolítica e são as principais responsáveis pelo efeito hemorrágico
observado após o envenenamento, induzido pelas serpentes Viperidae (KAMIGUTI et al., 1998),
além de geralmente induzirem mionecrose, danos na pele e reação inflamatória (GUTIÉRREZ e
RUCAVADO, 2000; TEIXEIRA et al., 2005). Isoladas do veneno de várias serpentes, são
importantes objetos de estudo devido à complexidade funcional e estrutural.
As serpentes do gênero Bothrops, importante fonte de estudo desta classe de enzimas,
recebe especial atenção em virtude dos aspectos clínicos e epidemiológicos, ou seja, devido ao
grande número de acidentes que provocam e à gravidade destes (GUTIÉRREZ, 2002;
BOCHNER e STRUCHINER, 2003).
As MPs isoladas e caracterizadas do veneno botrópico, em conjunto com outras toxinas
do veneno contribuem para o efeito tóxico. Essas toxinas podem interagir com diferentes fatores
da cascata de coagulação (MATSUI, FUJIMURA e TITANI, 2000). O efeito sobre os
componentes da coagulação, tais como o fibrinogênio, fator de von Willebrand, fibrina e/ou
plaquetas, tem sido um dos mais prováveis mecanismos de ação propostos para as MPs
(BRAUD, BOM e WISNER, 2000; MATSUI, FUJIMURA e TITANI, 2000; SWENSON e
MARKLAND, 2005; MATSUI e HAMAKO, 2005). Assim, com algumas exceções, podem ser
classificadas em α- ou β-fibrinogenases de acordo com especificidade de hidrólise das cadeias do
fibrinogênio. Estas enzimas degradam preferencialmente a cadeia α do fibrinogênio e com menor
intensidade a cadeia β (MARKLAND, 1991; SWENSON et al., 2004).
As metaloproteases com atividade fibrinogenolítica são aplicáveis no tratamento de
tromboses, pois diminuem o nível plasmático do fibrinogênio ou solubilizam os coágulos de
Introdução 4
fibrina, processo conhecido como trombólise (MATSUI et al., 2000; MATSUI e HAMAKO,
2005).
O quadro fisiopatológico após envenenamento por serpentes das subfamílias Crotalinae e
Viperinae se caracteriza por um complexo efeito hemorrágico (GUTIÉRREZ, 1995; WARREL,
1996). As hemorragias locais, muito comuns em envenenamentos por serpentes botrópicas, são
conseqüências de lesões nas paredes dos pequenos vasos sanguíneos (OSHAKA, 1979; OWNBY
et al., 1990). Acredita-se que isso seja causado pela proteólise de componentes da lâmina basal da
microvasculatura induzida pelas metaloproteases (BJARNASON; HAMILTON; FOX, et al.,
1988). Essa ação leva à perda da integridade capilar com resultante hemorragia no local da
picada. Gutiérrez et al. (2005) relatam possíveis mecanismos de ação de metaloproteases
hemorrágicas durante a danificação de microvasculatura, hidrolisando proteínas de membrana em
células endoteliais, além de integrinas e caderinas, envolvidas na matriz celular e no processo de
adesão célula-célula.
As metaloproteases, que geralmente são representadas por α-fibrinogenases de baixa e
média massas moleculares relativas (20.000 a 60.000), têm sido isoladas do veneno de serpentes
como, por exemplo, Trimeresurus mucrosquamatus (OUYANG, TENG e CHEN, 1977),
Crotalus atrox (PANDYA e BUDZYNSK, 1984), Bothrops jararaca (MARUYAMA et al.,
1992), Bothrops moojeni (SERRANO et al., 1993), Bothrops asper (GUTIÉRREZ et al., 1995),
Bothrops neuwidi (RODRIGUES et al., 2000), Lachesis muta muta (ESTEVÃO-COSTA et al.,
2000; SANCHEZ et al., 2000).
As metaloproteases hemorrágicas e não-hemorrágicas são sintetizadas na glândula de
veneno como proteínas multidomínios, sendo pró-enzimas inativas contendo um domínio
catalítico protease zinco-dependente. Os processamentos proteolíticos dessas enzimas originam
isoformas biologicamente ativas (GUTIÉRREZ, 2002).
Introdução 5
A classificação das MPs de acordo com seus domínios fornece informações essenciais para
compreender os mecanismos de ação dessas enzimas. De acordo com seus domínios estruturais,
estas metaloproteases foram classificadas em quatro grupos principais (Figura 1): P-I, enzimas
que possuem somente o domínio metaloprotease caracterizado por uma seqüência
(HEXXHXXGXXH) que se conserva; P-II possuem um domínio metaloprotease seguido por um
domínio semelhante a desintegrina; P-III compreende os domínios metaloprotease, semelhante a
desintegrina e rico em cisteína; e P-IV, apresenta todos os domínios anteriormente descritos e um
adicional domínio semelhante a lectina tipo-C ligado por pontes de dissulfeto (MATSUI,
FUJIMURA e TITANI, 2000; FOX e SERRANO, 2005).
As MPs do tipo P-I incluem as proteínas de baixo peso molecular e baixa atividade
hemorrágica, como por exemplo a Atrolisina e seus subtipos isolados do veneno de Crotalus
atrox. As classes P-II e III representam proteínas de médio e alto peso molecular,
respectivamente, e o processamento proteolítico da enzima origina as desintegrinas, que são
denominadas “Desintegrin-Like” ou domínio rico em cisteína. Essas classes são representadas
por toxinas altamente hemorrágicas. A classe P-IV representa as proteínas de alto peso molecular
e baixa atividade hemorrágica (FOX e SERRANO, 2005).
Introdução 6
Outro tipo de classificação de MPs foi proposto por Jiang e Bond (1992), através do estudo
do cDNA de cinco toxinas isoladas do veneno de Crotalus atrox, classificando as MPs
pertencentes a superfamília “Metzincin”, em 4 subfamílias, assim denominadas: I-termolisina; II-
astacina; III-metaloprotease do veneno de serpentes e IV- matrixina (MMP). As enzimas que
compõem esta superfamília possuem uma característica comum quanto aos aminoácidos ligados
ao Zn++ (HEXXHXXGXXH) que se conservam, e uma metionina presente no sítio ativo da
molécula (STÖCKER et al., 1995). O íon Zn++, elemento essencial para a atividade da enzima,
confere maior estabilidade à mesma, impedindo mudanças conformacionais na estrutura com
conseqüente perda de atividade (GOMIS-RUTH e FRANS-XAVER, 1993; MOURA-da-SILVA
et al., 2003; XU et al., 2004).
Figura 1. Representação esquemática dos domínios de uma metaloprotease (KINI e EVANS, 1992), originados por proteólise (P): A-região contendo domínio lectina C; B-região rica em cisteína; C-domínio metaloprotease; D-domínio desintegrina, contendo seqüência RGD e E- região rica em cisteína.
Introdução 7
As metaloproteases, cada vez mais exploradas, apresentam uma ampla variedade de
atividades farmacológicas. Dentre estas, podemos citar a jerdonatina, uma desintegrina inibidora
de agregação plaquetária e a jerdohagina, proteolítica sobre protrombina, ambas isoladas do
veneno de T. jerdonii (ZHOU et al., 2004; CHEN et al., 2003; 2004); uma protease
anticoagulante e não tóxica isolada de Naja naja naja (JOGADEESHA et al., 2004); uma
metaloprotease indutora de apoptose de Gloydius halys (YOU et al., 2003); a basparina A,
ativadora de protrombina, inibidora de agregação plaquetária e indutora de defibrinação de
trombos, isolada de B. asper (LORIA et al., 2003); a crovidisin de C. viridis e a triflavin de T.
flavoviridis que apresentaram atividade diferencial sobre células de osteosarcomas e osteoblastos
primários (TANGE et al., 2004) e a jerdonatin de T. jerdonii, inibidora de agregação plaquetária
(ZHOU et al., 2004). O isolamento e a caracterização funcional e estrutural da BjussuMP-I, uma
metaloprotease hemorrágica de alto peso molecular da classe P-III, com atividade antibacteriana
do veneno de B. jararacussu foi recentemente descrito (MAZZI et al., 2004; 2007).
Em 2006, Ramos e Selistre-de-Araújo publicaram uma revisão de metaloproteases de
venenos de serpentes focalizando relações de estrutura e função de domínios catalíticos e de
desintegrina, e suas possíveis utilizações. Dentre as possíveis utilizações farmacêuticas das MPs
estão o tratamento de doenças autoimunes, Alzheimer, infecção por vírus e bactérias,
osteoporose, asma, trombose e câncer.
Foi elucidada a estrutura tridimensional da BaP1, uma metaloprotease de baixo peso
molecular isolada de B. asper que produz proeminente lesão local de tecidos como hemorragia,
mionecrose, dermonecrose e edema (WATANABE et al., 2003), além de induzir apoptose em
células endoteliais humanas “in vitro” (DIAZ et al., 2005).
Estudos com jararagina, uma metaloprotease isolada de Bothrops jararaca, mostraram
que essa proteína estimula a migração de células epiteliais e induz hemorragia pulmonar agindo
Introdução 8
sobre as células dos capilares (ESCALANTE et al., 2003; COSTA e SANTOS, 2004), apresenta
também, ação sobre fator de von Willebrand, degrada fibrinogênio e inibe a adesão de plaquetas
(LAING e MOURA-da-SILVA, 2005).
A atividade hemorrágica é muito comum nas metaloproteases. Estudos dos efeitos de
modificações pós-traducionais sobre essa atividade foram realizados com as proteínas ACLF e
jararagina (GARCIA et al., 2004). Em 2005, Swenson e Markland, publicaram um estudo de
enzimas de venenos de serpentes fibrinolíticas e fibrinogenolíticas, sugerindo o potencial
farmacológico destes agentes para o tratamento clínico de tromboses, podendo agir dissolvendo
ou prevenindo a formação de trombos.
De modo geral, as MPs hemorrágicas e não hemorrágicas possuem similaridades
estruturais. Entretanto, uma análise comparativa entre diferentes classes de MPs mostra que há
alterações estruturais no domínio catalítico e na superfície da molécula, os quais podem estar
contribuindo para o efeito hemorrágico. Assim, um estudo mais recente propôs modificações pós-
traducionais, como por exemplo, N-glicosilação na região C-terminal e resíduos de ácido
aspártico (Asp 148) e serina (Ser 176) conservados no sítio catalítico, que podem potencializar a
hemorragia (RAMOS e SELISTRE-de-ARAÚJO, 2004).
É válido ressaltar que informações sobre a estrutura e função destas proteínas dependentes
de metais poderão auxiliar na melhor compreensão dos processos fisiopatológicos induzidos por
estas enzimas, para conhecer melhor os seus respectivos substratos que participam diretamente
em diversos efeitos tóxicos e farmacológicos resultantes dos envenenamentos ofídicos. Proteínas
isoladas de venenos animais, produzidas na forma recombinante e/ou peptídeos sintéticos, estão
sendo cada vez mais utilizados entre os grupos de pesquisas e as indústrias de biotecnologia.
Adicionalmente, as interações com íons, agentes quelantes e inibidores naturais e artificiais
poderão resultar também em informações relevantes sobre os mecanismos de ação destas
Introdução 9
proteases e seu papel específico nos envenenamentos ofídicos, assim como sua possível
utilização na elaboração de futuros fármacos, uma vez que estas proteínas podem apresentar
atividades como antitumoral, bactericida e trombolítica. Desta forma, o isolamento, uma ampla
caracterização estrutural e funcional, além de estudos de inibição desta proteína poderão
direcionar discussões e questionamentos para o prosseguimento de novos estudos.
Objetivos 10
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve, por objetivo geral, o isolamento, a caracterização estrutural,
funcional e inibitória de uma metaloprotease do veneno de Bothrops jararacussu, abordando os
seguintes aspectos:
• Isolamento de uma metaloprotease do veneno de Bothrops jararacussu através de técnicas
cromatográficas;
• Caracterização bioquímica: Atividade proteolítica (sobre: fibrinogênio, gelatina, fibrina,
caseína e colágeno), coagulante, anticoagulante e efeito sobre o TAME e o BAPNA;
• Ensaios para avaliar os efeitos na atividade proteolítica da metaloprotease sobre o
fibrinogênio, utilizando inibidores artificiais e naturais;
• Caracterização tóxica e farmacológica: Indução de edema, hemorragia, miotoxicidade,
letalidade, agregação plaquetária, ação antitumoral e bactericida, além da análise
histológica de diferentes órgãos após injeção intramuscular da proteína;
• Caracterização imunoquímica: incluindo produção e purificação de anticorpos policlonais
e ensaios de reatividade cruzada;
• Caracterização estrutural: obtenção da seqüência da proteína por Biologia Molecular
(clonagem e sequenciamento de cDNA); análise por alinhamento múltiplo; expressão da
metaloprotease recombinante e modelagem molecular.
Material 11
3. MATERIAL
• Veneno
O veneno bruto cristalizado de serpente B. jararacussu foi adquirido do Serpentário de
Proteínas Bioativas Ltda (Bioagents), Batatais-SP.
• Animais
Camundongos machos da linhagem suíça (swiss) com peso de 18-22g e coelhos machos,
brancos, de Nova Zelândia, foram fornecidos pelo Biotério Central do Campus da Universidade
de São Paulo de Ribeirão Preto – USP.
• Plasma
O plasma humano que foi utilizado para os experimentos de coagulação e anticoagulação,
foi obtido do Hemocentro de Ribeirão Preto.
• Reagentes para eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
• N´, N´, N´, N´- tetrametilenodiamino (TEMED) (Sigma Chem. Co);
• Acrilamida (Sigma Chem. Co);
• Bis-acrilamida (N´, N´ - metilenobisacrilamida) (Sigma Chem. Co);
• SDS (Dodecil sulfato de sódio) (Sigma Chem. Co);
• Coomassie Brilliant Blue G-250 (Sigma Chem. Co);
• β-mercaptoetanol (Pharmacia Biotech);
• Persulfato de amônio (Merck);
Material 12
• Tris - Base (Sigma Chem. Co);
• Padrões de peso molecular para proteínas (Escala de proteínas – GIBCO BRL®);
• Glicina (Sigma Chem. Co);
• Ácido acético glacial (Merck);
• Azul de bromofenol (Merck);
• Reagentes e equipamento para cromatografias
CM-Sepharose (carboximetil-Sepharose), (Amersham Biosciences);
Bicarbonato de amônio (NH4HCO3, AMBIC) sintetizado em nosso laboratório;
Phenyl-Sepharose (Amersham Biosciences);
NaCl (Synth);
L-glutamina (Sigma Chem. Co.);
Gentamicina (Sigma Chem. Co.);
Ácido trifluoracético (TFA), (Merck);
Acetonitrila (Merck);
Metanol (Synth);
Coletor de frações GradiFrac System da Pharmacia Biotech;
Electrophoresis Power Supply EPS 601 – Amersham Pharmacia Biotech;
Espectrofotômetro Genesys 2;
HPLC - Shimadzu SPD MIOA vp;
Sistema de ultrafiltração, AMICON (Millipore);
Material 13
• Reagentes para Ensaios Imunoquímicos (Produção de Anticorpos e Imunodifusão)
Adjuvantes completo e incompleto de Freud’s (Amersham Biosciences);
• Reagentes e equipamentos para ensaios enzimáticos e farmacológicos
EDTA (Sigma Chem. Co);
EGTA (Sigma Chem. Co);
Metanol (Synth);
Azida sódica (Sigma Chem. Co);
Cloreto de cálcio (Pharmacia Biotech);
Triton X-100 (Pharmacia Biotech);
Heparina (Sigma Chem. Co);
Fibrinogênio bovino (Sigma Chem. Co);
Fibrina (Sigma Chem. Co);
Caseína (Sigma Chem. Co);
Colágeno (Sigma Chem. Co.);
Trombina (Sigma Chem. Co);
TAME (Nα – p – tosyl – L – arginine methyl ester) (Sigma Chem. Co);
BAPNA (Benzoil arginil paranitroanilida) (Sigma Chem. Co);
Gelatina incolor (Royal);
Ágar bacteriológico (Sigma Chem. Co);
Uréia (Sigma Chem. Co.);
Peroxidase de rábano (Tipo IV Sigma Chem. Co);
Meio LB (VETEC);
Material 14
PEG 8000 (BioAgency);
S-2238 (substrato cromogênico artificial) (DiaPharma, West Chester, OH);
Xilol (Quimibras Indústrias Químicas Ltda);
Parafina (Quimibras Indústrias Químicas Ltda);
Paraformaldeído (Quimibras Indústrias Químicas Ltda);
Hematoxilina (Quimibras Indústrias Químicas Ltda);
Soro fetal bovino-SFB (Sigma Chem. Co);
MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
Invitrogen);
Kit Creatina Kinase-UV-47-20 cinético (Sigma Chem. Co);
Sistema de ultrafiltração (AMICON, Millipore);
Paquímetro de baixa pressão 0,01mm (Mitutoyo, Japão);
“Blood Lumi-Aggregometer, chrono-Log Corporation”;
Leitor de microplaca “Thermomax” (Molecular Devices, Menlo Park, CA,
USA);
Eosina (Quimibras Indústrias Químicas Ltda);
Câmera digital JVC - TKC1380;
Microscópio binocular Nikon Eclipse E600;
• Reagentes e equipamentos para ensaios de clonagem, seqüênciamento e expressão:
TRIZOL® LS Reagent ultra pureTM , LIFE Technologies;
IPTG (isopropylthio-β-gatactoside (Invitrogen);
Buffalyte (Pierce)
Material 15
X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--β-D-gatactoside (Invitrogen);
Hind III fragments (Gibco BRL);
“Primers”, oligo dt e enzimas de restrição foram adquiridos da Invitrogen;
Resina de exclusão molecular BioGel P6 (BIORAD);
Hidrocloreto de guanidina (Sigma Chem. Co);
Tiocianato de guanidina (BioAgency).
Kit Super Script II (Life Technologies);
Kit Concert Rapid PCR Purification System (Gibco BRL);
Kit QIAGEN PCR cloning handbook;
Kit QIAGEN PLASMID MINI Handbook;
Kit ABI Prism® Big DyeTM Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction
(Perkin Elmer);
Aparelho ABI Prism 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer);
• Outros materiais
Os demais reagentes utilizados para caracterização da proteína foram de grau
analítico, e os demais materiais e equipamentos estão descritos na metodologia.
Metodologia 16
4. METODOLOGIA UTILIZADA
4.1. Preparação da amostra: Cerca de 300 mg do veneno bruto cristalizado de B. jararacussu
foram suspensos em 1,5mL do tampão bicarbonato de amônio (NH4HCO3) 0,05M, pH 8,1 e
centrifugado a 1.530xg durante 10 minutos a 4ºC em centrifuga Excelsa Baby I. Alíquotas do
sobrenadante foram retiradas para dosagem de proteínas e monitoramento em espectrofotômetro
a 280nm, e o restante foi aplicado em uma coluna contendo resina CM-Sepharose.
4.2. Isolamento da metaloprotease de baixo peso molecular do veneno de Bothrops
jararacussu: Cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose foi realizada conforme descrito
por Andrião-Escarso et al. (2000). A amostra de veneno foi eluída com tampão bicarbonato de
amônio 0,05M pH 8,1 com gradiente de concentração até 1M, num fluxo de 0,5mL/min,
coletando-se frações de 3,5mL/tubo. As medidas de condutividade foram realizadas em
condutivímetro Beckman modelo RC-16C. Os picos obtidos foram analisados em SDS-PAGE e
quanto à atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, sendo selecionada a fração com a enzima de
interesse. Esta fração denominada de J-II foi liofilizada e submetida à cromatografia em Phenyl-
Sepharose, em um fluxo de 0,4mL/min, frações de 3mL/tubo, eluída com concentrações
decrescentes de NaCl (4-0M), em tampão Tris-HCl 0,05M pH 7,4 e finalmente água. A enzima
isolada, denominada de BjussuMP-II, foi submetida a HPLC de fase reversa em coluna C18 e
SDS-PAGE para averiguar o grau de pureza. A cromatografia foi realizada eluindo a enzima com
acetonitrila: 0,1% TFA (5:95 v/v, tampão A) e acetonitrila: 0,1% TFA (60:40 v/v, tampão B),
seguindo um gradiente linear para 25% de tampão B depois de 30 min a um fluxo de 1mL/min.
Todas as frações foram monitoradas em Abs 280nm e atividade proteolítica sobre caseína.
Metodologia 17
4.3. Sistema de ultrafiltração: As frações eluídas das cromatografias foram filtradas num
sistema de ultrafiltração AMICON, utilizando membrana de separação para PM < 10.000. As
frações foram monitoradas em espectrofotômetro Beckman DU-640 a 280nm, sendo
concentradas, liofilizadas e armazenadas a 4°C.
4.4. Determinação quantitativa de proteínas: As dosagens de proteínas em soluções contendo
0,05 a 2,0 mg/mL foram realizadas pelo método do microbiureto, conforme descrito por Itzhaki e
Gill (1964).
4.5. Determinação do Peso Molecular (SDS-PAGE): Foi realizada segundo metodologia
descrita por Laemmli (1970), com modificações conforme descrito a seguir. O gel de resolução a
12% (m/v) em acrilamida (bis-acrilamida: acrilamida 1: 19m/m) foi preparado em tampão Tris-
HCl 0,5 M pH 8.8 e SDS 1%. O gel de concentração a 6% em acrilamida foi preparado em
tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6.8 e SDS 0,1%. Amostras contendo de 5 a 50 µg de proteína ou
veneno bruto foram dissolvidas em tampão fosfato em salina (PBS), acrescidas de 4µL de tampão
para amostras, Tris-HCl 0,5M pH 6.5 contendo azul de bromofenol (0,01%), SDS (2%) e glicerol
(10%), seguido por fervura a 100°C por 4 minutos. As amostras de proteína foram preparadas na
presença ou ausência de β-mercaptoetanol que foi adicionado ao tampão de amostra a 3,5%. O
gel foi corado por 10 minutos em azul de coomassie G-250 0,1% (p/v) dissolvido em água:
metanol: ácido acético (40: 50: 10, v/v) e descorado em ácido acético 10%. Após descorar, o gel
foi fotografado e documentado em equipamento Made Master (Pharmacia Biotech), sendo seco
entre papéis celofanes e embebido em gelatina incolor a 5%. Os padrões de peso moleculares
utilizados foram: Albumina bovina (66.000), albumina de ovo (45.000), gliceraldeído-3-fosfato
Metodologia 18
desidrogenase de músculo de coelho (36.000), anidrase carbônica bovina (29.000), tripsinogênio
de pâncreas bovino (24.000), inibidor de tripsina de soja (20.100) e α-lactalbumina de leite
bovino (14.200). A mobilidade eletroforética relativa de cada banda foi determinada em
centímetros e a massa molecular foi calculada, relacionando-se a mobilidade eletroforética
relativa com o logarítmo do peso molecular do padrão.
4.6. Eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas: A eletroforese foi realizada em
gel de poliacrilamida a 10% (m/v), segundo método descrito por Davis (1964) para proteínas ácidas.
O tampão do eletrodo foi Tris-Glicina pH 8,3. As amostras foram diluídas num tampão Tris-HCl
0,025M pH 6,8 + sacarose a 10% (m/v). Como indicador foi adicionado ao tampão de amostra azul
de bromofenol a 0,1%. As condições eletroforéticas foram: 120 V (voltagem) com corrente de 10mA
(Electrophoresis Power Supply EPS 601 – AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). O gel foi
corado com azul de Comassie G-250 0,1% (p/v) dissolvido em água: metanol: ácido acético 40: 50:
10, v/v) por 10 minutos e a descoloração foi realizada com ácido acético a 10% (v/v).
4.7. Atividades enzimáticas da metaloprotease:
4.7.1. Teste de degradação do fibrinogênio: Foi determinado segundo a técnica descrita por
Edgar e Prentice (1973), com algumas modificações de acordo com Rodrigues (2001). Os ensaios
foram realizados com preparações da proteína em diferentes concentrações (0,01; 0,1; 0,5; 2 e
5µg), pHs (2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 7,0; 8,0 e 10,0), temperaturas (-20; 4; 25; 37; 50; 60; 80; 90; 100ºC)
e tempos de incubação (30min; 2h; 8h; 12h; 24h), nas quais a enzima controle foi mantida por 30
min a 37ºC, sendo estas amostras posteriormente incubadas por 2 horas a 37ºC com uma solução
Metodologia 19
de fibrinogênio a 1,6mg/mL. Sobre esta atividade também foi testado o efeito de diferentes íons
(Co++; Mg++; Mn++; Fe++; Zn++ e Ca++), do EDTA (2,5; 5; 10; 20; 25mM), da heparina (100; 200;
300; 400 e 500µg) e de alguns extratos de plantas, sendo realizada incubação prévia da proteína
com as diferentes substâncias por período de 30 min a 37ºC. As reações foram interrompidas com
10 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 6,5, contendo glicerol 10% (v/v), β-mercaptoetanol 10%
(v/v), SDS 2% (v/v) e azul de bromofenol 0,05% (p/v), e analisadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 12%.
4.7.2. Teste de degradação de fibrina: O ensaio de atividade fibrinolítica foi realizado de
acordo com o método descrito por Leitão, Polizello e Rothschild (2000), incubando-se diferentes
concentrações da metaloprotease em placas de Petri contendo fibrina. Foi preparada uma solução
de fibrinogênio 0,3%, e solução de agarose 0,95% sob aquecimento até a formação de um colóide
transparente (vol. final = 10mL), sendo que ambas as soluções foram preparadas em tampão
barbital 0,05 M, pH 4,6 contendo CaCl2 166x10-5 M, MgCl2 68x10-5M e NaCl 94x10-4 M. Após o
esfriamento da solução de agarose (+/- 40ºC) adicionou-se a solução de fibrinogênio
(fibrinogênio : agarose; 1:1; v/v). À mistura (fibrinogênio-agarose) foi adicionada 100 µL de uma
solução contendo trombina bovina (1µg/µL), e vertida em placa de petri para a coagulação. As
placas contendo o coágulo foram mantidas a 4°C e após 30 min, com auxílio de uma ponteira, um
número adequado de pequenos orifícios (5 mm de diâmetro) foram feitos sobre o coágulo de
fibrina para a aplicação das amostras nas concentrações desejadas, em volume final de 30µL,
seguido de incubação por 24 horas a 37ºC. A atividade fibrinolítica foi avaliada visualmente e
quantificada através dos halos de lises produzidos. Como controle positivo e negativo foi
utilizado o veneno bruto de Bothrops jararacussu e PBS, respectivamente.
Metodologia 20
4.7.3. Teste de degradação do colágeno: Foi realizado utilizando a mesma metodologia
descrita para o teste de degradação do fibrinogênio, amostras contendo a BjussuMP-II em
diferentes concentrações, incubadas com solução de colágeno tipo IV (70µg) por período de 2 h.
As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. Após a corrida
eletroforética o gel foi retirado das placas, corado e descorado conforme descrito no item 4.5.
4.7.4. Atividade caseinolítica: Foi realizada segundo método descrito por Van Der Walt e
Joubert (1971). Amostras da proteína em diferentes concentrações foram incubadas por 30 min a
37ºC em solução de Tris-HCl 0,1M pH 9,0 contendo caseína a 1%. Após o período de incubação
foram adicionados 1,5mL de TCA a 30% em cada amostra para parar a reação enzimática,
seguido por centrifugação a 1.530xg por 25 min e leitura das amostras em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 280nm. Uma unidade de atividade proteolítica foi definida como a
quantidade de enzima a qual produz um aumento na absorbância de 0,001 unidade/minuto a
280nm.
4.7.5. Atividade gelatinolítica: Esta atividade foi avaliada em gel de poliacrilamida de acordo
com a metodologia de Leber et al. (1997). O gel de concentração foi elaborado nas condições
normais do gel de eletroforese em poliacrilamida, enquanto que o gel de separação contendo
poliacrilamida a 12% foi preparado com gelatina a 3mg/mL (dissolvida por leve aquecimento em
água). As amostras contendo a proteína em diferentes concentrações e veneno bruto (controle)
foram preparadas na ausência de agentes desnaturantes e sem fervura para conservar a atividade
enzimática. Após a corrida eletroforética em gel de poliacrilamida/gelatina, o gel permaneceu por
30 min a 4°C, em solução de Triton X-100 (2,5%) em 100mL de tampão Tris-HCl 0,1M pH 7,5,
efetuando uma troca de tampão. Em seguida, o gel foi incubado por 90 min no mesmo tampão a
Metodologia 21
25°C sem Triton X-100. O gel foi então submetido à coloração em azul de coomassie por 30 min
e descorado em solução de ácido acético 10%. A avaliação dos resultados foi feita visualmente,
pela observação da ausência de coloração pelo coomassie, nos locais de degradação da gelatina.
4.7.6. Atividade coagulante: Diferentes quantidades da proteína (1, 5, 10, 25, 50 e 100µg)
foram adicionadas em 200µL de plasma humano citratado (fornecido pelo Hemocentro da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/SP) incubado a 37ºC e o tempo de coagulação (TC) foi
cronometrado em segundos. Os controles foram feitos utilizando-se apenas o plasma e 50µL de
solução de cloreto de cálcio a 0,01M ou 20µg de solução de veneno bruto de B. jararacussu.
4.7.7. Atividade anticoagulante: A atividade anticoagulante foi realizada de acordo com o
método previamente descrito (ALVARADO e GUTIÉRREZ, 1988), utilizando plasma humano
citratado, recém coletado. Para o ensaio, o plasma foi descongelado e mantido incubado a 37°C.
A atividade teve por objetivo avaliar o efeito da BjussuMP-II sobre o tempo de coagulação do
plasma, em diferentes concentrações. A enzima foi previamente incubada com 200µL de plasma
por 1 a 10 min a 37ºC sendo posteriormente adicionados 25µL de solução de cloreto de cálcio
(0,25mM) e cronometrado o tempo de recalcificação em segundos. Os controles foram realizados
adicionando-se 25µL de solução de cloreto de cálcio (0,25mM) a 200µL de plasma citratado.
4.8. Atividades farmacológicas da metaloprotease:
4.8.1. Atividade hemorrágica: Foi realizada segundo método descrito por Nikai et al. (1984).
As amostras contendo veneno bruto ou metaloprotease isolada (10-50µg; 50-200µg
respectivamente) foram diluídas em 50µL de solução salina e injetadas por via intradermica no
Metodologia 22
dorso de camundongos machos de 18 a 22g (n=6). Após 3h os animais foram eutanasiados com
CO2, as peles removidas e os halos hemorrágicos medidos em dois ângulos retos (diâmetros)
expressos em mm. Define-se como dose mínima hemorrágica (DMH) a concentração de enzima
necessária para produzir um halo de 10mm de diâmetro.
4.8.2. Indução de edema em camundongos: Grupos de 05 camundongos Swiss machos (18-22g)
foram injetados via intradérmica (i.d) na região subplantar da pata direita posterior com 50 µL de
soluções contendo diferentes enzimas (PLA2s, metaloproteases e veneno total), dissolvidos em PBS.
A mensuração da espessura das patas foi realizada previamente, antes da inoculação das amostras
(tempo 0h). Os controles negativos foram realizados com injeções de 50 µL de PBS por animal. Em
seguida, realizou-se a mensuração das patas em diferentes intervalos de tempo após as
administrações, 30 min, 1h e 3h (de cada valor obtido foram subtraídos os valores inicialmente
aferidos no tempo 0h). O aumento do volume na pata dos camundongos foi medido com um
paquímetro de baixa pressão 0.01 mm (Mytutoyo, Japão) e expresso em milímetros de edema
induzido (Soares, 2000).
4.8.3. Atividade miotóxica: Grupos de 6 camundongos machos Swiss (18-22 g) foram injetados
via intramuscular (i.m) no músculo gastrocnêmio direito com diferentes doses de enzimas
(veneno bruto de B. jararacussu ou proteínas isoladas), dissolvidos em 50 µL de PBS. Os
controles negativos receberam somente PBS. Três horas depois, o sangue dos camundongos foi
coletado, por corte na extremidade da cauda, em capilares heparinizados e imediatamente
centrifugados por 20 min a 1.530xg. A atividade da enzima creatina cinase foi determinada
utilizando-se 4 µL de plasma com 1,0 mL de reativo do kit CK-UV cinético (Bioclin) dissolvido
em água destilada, por 3 min a 37ºC. Realizaram-se leituras a 340 nm nos intervalos de 0 e 3 min,
Metodologia 23
e a atividade foi expressa em unidades/litro. Uma unidade consiste no resultado da fosforilação
de um nanomol (nmol) de creatina por minuto (Soares, 2000).
4.8.4. Toxicidade da protease: Esta foi observada após injeção de 100µL das amostras por via
intraperitonial (i. p.) contendo o veneno bruto de B. jararacussu ou a metaloprotease em
diferentes concentrações, em camundongos machos de 18 - 22g. Os controles negativos foram
realizados com injeção (i. p.) de PBS e todos os animais foram observados durante um período de
48 horas.
4.8.5. Produção de anticorpos policlonais: Este experimento foi realizado conforme
previamente descrito (Rodrigues, 2001). Cerca de 0,6 – 1,2 mg da protease emulsificada com
adjuvante completo de Freund foi injetada subcutâneamente (s.c) em coelhos machos (2 – 2,5
Kg). Após 15 dias foi administrada uma dose reforço com a mesma quantidade da toxina
emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. O soro foi obtido por centrifugação do sangue
a 1.060xg por 10 min, coletado 30 dias após a primeira injeção. Para verificar a produção de
imunorreatividade entre os anticorpos policlonais e BjussuMP-II, foram realizados ensaios de
imunodifusão 15 dias após a primeira injeção e 15 dias após a segunda injeção.
- Purificação dos anticorpos policlonais: O soro do animal imunizado foi separado por
centrifugação a 350xg durante 10 min, e em seguia precipitado com 0,8 volume de solução
saturada de sulfato de amônio pH 6.5, incubando-se por 30min a 4ºC e então novamente
centrifugado durante 10 min a 1370xg. O sobrenadante foi descartado e, em seguida, o
precipitado lavado co sulfato de amônio a 40% e novamente centrifugado, sendo desprezado o
sobrenadante.
Metodologia 24
O precipitado foi dissolvido em cerca de 5 mL de salina e dialisado em câmara fria (2
banhos de 4 L em salina e 2 banhos de 4 L em tampão fosfato 0,02M pH 7.5 em intervalos de 5
h). Para controle negativo da amônia foi utilizado o teste de Nessler.
A amostra foi purificada através de uma cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel (2
x 20cm), equilibrada em tampão fosfato 0,02M pH 7.5, sendo que a imunoglobulina G foi eluída no
pico inicial. Este pico foi reunido e liofilizado. Posteriormente foi dialisado contra bicarbonato de
amônio 0,05M, pH 8.0 (2 banhos de 4 L em intervalos de 5 h) e novamente liofilizado.
- Imunodifusão: Os testes foram realizados segundo metodologia descrita por Campbell et
al. (1970). Lâminas de microscopia foram recobertas com uma película de ágar a 2,5 % e, em
seguida, foram adicionados 3 mL de ágar a 1,25 %, formando uma camada de 2 a 4 mm de
espessura. O ágar foi perfurado na forma de uma roseta e cerca de 150µg de anti-BjussuMP-II
foi colocado no orifício central e 10µg da BjussuMP-II foi adicionado em cada orifício ao redor.
As lâminas foram colocadas em uma câmara úmida a temperatura ambiente por 48 h para o
desenvolvimento de arcos de precipitação. Depois desse período, as lâminas foram lavadas por 24
h com NaCl 0,3 M e em seguida com NaCl 0,15 M. As lâminas foram secas em papel de filtro e
coradas com amido negro 0,1 % em solução de metanol : ácido acético (9 : 1, v/v) por 10 min,
lavadas em solução de ácido acético a 2 % e secas em estufas a 45°C.
- ELISA - Imunorreatividade cruzada: Microplacas (Dynatech) preenchidas com diferentes
proteínas (2,5µg) foram incubadas por 16h em tampão Tris-HCl 0,1M pH 9,0 + NaCl 0,1M.
Após 5 lavagens com a solução A (Tris-HCl 0,05M pH 7,4 contendo NaCl 0,15M, ZnCl2 20µM e
MgCl2 1µM) as placas foram submetidas a secagem e estocadas a 4ºC. Os anticorpos purificados
Metodologia 25
(anti-BjussuMP-II) foram diluídos na solução A contendo BSA a 2% (m/v) e adicionados em
triplicata às placas, em uma diluição de 1:12.500 (m/v) e incubados em temperatura ambiente por
2h. As placas foram submetidas novamente a 5 lavagens com a solução A e a ligação dos
anticorpos foi detectada na presença de anti-imunoglobulina de coelho conjugada com fosfatase
alcalina, diluída 1:2.000 (m/v) na solução A contendo BSA e incubada por 90 min. Após uma
última lavagem, a coloração foi desenvolvida na presença do substrato p-nitrofenilfosfato e as
absorbância registradas em microleitor de placas a 410nm (Dynatech 5.000). Os soros normais e
a BjussuMP-II foram utilizados como controles.
4.8.6. Agregação plaquetária e formação de trombina: O sangue foi coletado de doadores
voluntários saudáveis, que não haviam tomado nenhum medicamento por período de 15 dias, e
acrescido de citrato de sódio para impedir sua coagulação (0,31 % v/v). Plasma rico em
plaquetas (PRP) foi obtido por centrifugação a 350xg por 12 minutos em temperatura ambiente.
Plaquetas lavadas (WRP) foram obtidas, na presença de 5 mM EDTA, a partir do PRP
centrifugado a 1.370xg por 15 min. em temperatura ambiente. O precipitado de plaquetas foi
ressuspendido em uma solução Tyrode contendo 0,35 % (p/v) BSA e 0,1 mM EGTA
(concentração final), pH 6,5 e lavados duas vezes por centrifugação (1.370xg por 15 min.). O
pellet final foi ressuspendido em mesma solução Tyrode, pH 7,5 sem EGTA. A suspensão de
plaquetas foi ajustada para 3 x 105 plaquetas/µL. A agregação plaquetária foi medida usando um
“Whole Blood Lumi-Aggregometer” (Chrono-log Corp.). Os testes foram realizados utilizando
200 µL de PRP ou WRP e a agregação foi avaliada após 2 min de incubação com a enzima. Os
controles foram feitos usando colágeno, ADP ou trombina obtendo-se 100% de agregação
plaquetária. Para o teste de inibição da atividade da enzima, foram utilizados inibidores de
Metodologia 26
protease (5mM PMSF e 7mM benzamidina), procedendo com incubação prévia destes com a
protease por 2 - 3 minutos em 37oC.
A atividade “thrombin-like” induzida pela BjussuMP-II foi avaliada por coagulação do
fibrinogênio ou por hidrólise do substrato cromogênico S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA),
conforme descrito a seguir. BjussuMP-II foi misturada com 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10
mM CaCl2, 1 mg/mL PEG 8000, pH 7,5. A reação foi iniciada por adição de fibrinogênio (2
mg/mL) ou S-2238 (0,1 mM), concentração final. A absorbância em 405 nm foi aferida a 37oC
por 20 min. em intervalos de 6 segundos, usando um leitor de microplaca “Thermomax”
(Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA). O controle negativo foi realizado na ausência da
BjussuMP-II e para o positivo utilizou-se 1nM de trombina.
4.8.7. Atividade antibacteriana: Foram utilizadas cepas de Escherichia coli (ATCC 29648) e
Staphilococus aureus (ATCC 25923). Em 1,0 mL de bactérias a 1,2 x 106 UFC (unidades
formadoras de colônias/tubo) adicionou-se meio BHI seguido de diferentes concentrações de
BjussuMP-II e incubação a 37 ºC por períodos de 30 minutos. A leitura da concentração
inibitória mínima (CIM), definida como a menor concentração da enzima capaz de inibir o
crescimento bacteriano, foi realizada visualmente pela turvação do meio em macro-diluições. A
técnica de diluição em placa permite avaliar o número de unidades formadoras de colônias que
cresceram em placas com meio sólido de Muller-Hinton por 20 minutos, 1 h e 24 horas, após
incubação com a BjussuMP-II em diferentes concentrações.
4.8.8. Análise histopatológica: Foram utilizados dois camundongos Swiss machos (28-30g) para
cada grupo controle e teste. Os animais do grupo controle receberam injeções por via
intramuscular (50µL) de PBS no músculo gastrocnêmio direito. Os grupos teste receberam
Metodologia 27
injeções contendo a protease isolada, BjussuMP-II, nas concentrações de 250 e 500µg/animal,
dissolvida em PBS.
Os animais foram sacrificados (com CO2) após 3h, a parede anterior do tórax e do abdome
foram abertas para a coleta de fragmentos das vísceras estudadas (fígado, pulmão, baço, rim e
coração). O mesmo procedimento foi usado para retirada do gastrocnêmio direito na região
posterior da perna. O crânio foi aberto para a retirada do encéfalo. A seguir, os fragmentos foram
lavados em solução PBS e mantidos em solução fixadora (paraformaldeído a 4% em tampão
fosfato), por 24 horas, desidratados em série crescente de álcoois, diafanizados em xilol e
incluídos em parafina, de acordo com o padrão histológico (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1985;
YOUNG e HEATH, 2001).
Os cortes semi-seriados foram obtidos com 5µm de espessuras transversais e longitudinais
aos fragmentos, que logo a seguir foram corados pelo método de hematoxilina-eosina. As
imagens histopatológicas foram capturadas por uma câmera digital JVC - TKC1380 acoplada a
um microscópio binocular Nikon Eclipse E600, e depois transferidas e armazenadas através de
um software Adobe Premiere 5.1.
4.8.9. Atividade antitumoral de BjussuMP-II: Foram testadas culturas de células das seguintes
linhagens da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA): SK-Br-3, cultura
de células de adenocarcinoma de mama humana; Jurkat, de células de leucemia linfoblástica T
humana; linhagem EAT, de células de tumor de Ehrlich e B16F10, de células de melanoma
murínico. As linhagens foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Auro Nomizo. Todas foram
mantidas em meio de cultura RPMI suplementado com 10% de SBF (soro bovino fetal), 20mM
de L-glutamina e 10µg/mL de gentamicina. As células foram mantidas em estufa de CO2 a 5% a
37˚C após serem descongeladas.
Metodologia 28
A atividade citotóxica da enzima BjussuMP-II foi avaliada pelo método de MTT (3-[4, 5-
dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) de acordo com os ensaios descritos por
Mosmann (1983), que avalia as células viáveis após incubação com elemento citotóxico.
As células foram cultivadas em frascos apropriados e mantidas em fase exponencial de
crescimento. As culturas de células aderentes foram então destacadas com tripsina a 0,05% e
0,02% de EDTA em PBS (tampão fosfato salino) livre de cálcio e lavadas com meio RPMI em
centrífuga a 800xg/15min a 10 ˚C. As células foram colocadas em placas de cultura de 96 poços
com 1 x 105 células por poço após determinar a concentração de células em câmara de Neubauer.
Depois de 24 horas de cultura, o meio foi removido e, diferentes concentrações das amostras de
proteína e droga controle foram adicionadas e incubadas por 24h. Após este período 20µL de
MTT a 10 mg/mL foram adicionados aos poços e incubados por mais 4 horas para que as células
viáveis incorporassem o tetrazolium. Finalmente 50µL de dodecil sulfato de sódio a 20% foram
adicionados em cada poço no intuito de dissolver os cristais de formazan formados no meio de
cultura, sendo incubados a 37 ˚C por 12 horas no escuro.
Após este período, foram feitas as leituras dos poços contendo os controles negativo e
branco, em espectrofotômetro de microplacas no comprimento de onda de 570 nm. A taxa de
citotoxicidade foi calculada com a seguinte equação: % de toxicidade dos compostos = 1 –
absorbância do poço tratado / absorbância do poço controle X 100.
4.9. Outras Atividades:
4.9.1. Atividade amidolítica sobre o substrato cromogênico artificial benzoil arginil
paranitroanilida (BAPNA): Foi realizada utilizando-se o substrato cromogênico BAPNA. O
substrato foi diluído a 1% em Tris-HCl 0,1M pH8.1. Foram adicionados 500µL da solução de
Metodologia 29
Tris-HCl + BAPNA em cada tubo contendo as amostras de veneno e a proteína isolada em
diferentes concentrações. O tempo foi cronometrado e os tubos permaneceram em banho a 37ºC,
possibilitando a leitura em espectrofotômetro a 415 nm, sendo considerado 0.009 = 1U/min. Foi
utilizado como coeficiente de extinção molar do produto p-nitroanilida o valor de 8800M-1.cm-1
(SANT’ANA et al., 2007).
4.9.2. Atividade esterásica sobre o substrato artificial TAME: A atividade esterásica foi
determinada por titulação potenciométrica usando 0,01 M de Nα – p – tosyl – L – arginine methyl
ester (TAME) como substrato em uma solução contendo 0,15 M KCl pH 8,0 incubada a 37°C
como previamente descrito (EHREMPREIS e SCHERAGA, 1957).
4.9.3. Atividade hemolítica indireta: A atividade fosfolipásica foi testada pelo método de
hemólise radial indireta, realizado em placas. Neste método, descrito por Gutiérrez et al. (1988),
foi utilizada uma única modificação, a troca da agarose por ágar. O experimento consiste na
elaboração de um gel (CaCl2 0,01 M; gema de ovo 1:3 v/v PBS, pH 7.2; eritrócitos 1:3 v/v PBS;
ágar bacteriológico 1%; azida de sódio 0,005% sendo o volume final completado com PBS) que é
vertido em placas em temperatura de 45-50ºC. Após a solidificação do gel foram feitos orifícios
de tamanho uniforme (0,5 cm de diâmetro) e aplicadas as amostras (40 µL), de veneno bruto ou
metaloprotease diluídos em PBS com diferentes doses (1, 5, 10, 25, 50 e 100µg).
Os géis contendo as amostras foram mantidos em estufa a 37ºC por 12 horas. A formação
de halo translúcido ao redor do orifício no gel é um indicativo de atividade, onde os halos foram
medidos em milímetros para a quantificação da atividade fosfolipásica.
O sangue humano utilizado durante os testes foi imediatamente diluído em tampão PBS
(30 mL) e as células lavadas 3 vezes com centrifugações de 400 xg por 10 minutos, para volumes
Metodologia 30
aproximados de 10 mL de sangue. Após as centrifugações, o plasma e o PBS foram desprezados
e as células foram utilizadas na composição do gel. A dose hemolítica indireta mínima (DheM),
corresponde a dose de amostra (µg) responsável pela formação de um halo de 10 mm.
4.10. Estudo estrutural da metaloprotease:
4.10.1. Determinação da seqüência completa do cDNA da metaloprotease por biologia
molecular:
4.10.1.1. Extração das glândulas veneníferas da serpente Bothrops jararacussu e preparação
do RNA total: Um exemplar adulto desta espécie foi decapitado e as glândulas de veneno
retiradas e maceradas imediatamente em nitrogênio líquido. Após a evaporação do N2, foi
adicionado ao tecido macerado TRIZOL® LS Reagent ultra pureTM (100mL) LIFE Technologies.
O RNA total obtido foi dissolvido em 20µL de água milli-Q estéril e armazenado a –70ºC, por
curto período de tempo até a realização do RT-PCR.
4.10.1.2. Construção e preparação dos oligonucleotídeos: Os primers (oligonucleotídeos)
usados foram desenhados de acordo com a seqüência N-terminal determinada para a BjussuMP-II
e o C-terminal através de alinhamentos múltiplos com outras metaloproteases de venenos de
serpentes (seqüências depositadas no NCBI -Genebank/SwissProt) de forma que, após a
amplificação, a seqüência do cDNA contivesse nas suas extremidades 5’ e 3’ os sítios de
restrição para as enzimas NheI e BamHI, respectivamente.
MP-1 foward: 5´gctagcatggaacaacaaaaattctccccaaga3´
MP-2 reverse: 5´ggatccttaggcttgttgagaatgcattgt3´
Metodologia 31
4.10.1.3. Síntese do cDNA e amplificação por PCR: A partir do RNA isolado foi realizada a
síntese do cDNA. O RNA total (5µL) foi submetido à reação de transcrição reversa para a síntese
da primeira fita do cDNA da toxina na presença de transcriptase reversa e oligo dT durante 1 hora
a 42ºC. A segunda fita foi sintetizada utilizando-se 2µL da reação descrita acima, combinados
com os primers específicos (MP-1 foward e MP-2 reverse), para amplificar o gene de interesse.
Os primers foram desenhados com base na seqüência N-terminal obtida por sequenciamento
direto da proteína nativa e por alinhamentos de inúmeras seqüências de metaloproteases
depositadas no banco de dados do NCBI, respectivamente. A amplificação foi realizada
utilizando-se o kit Super Script II (Life Technologies), conforme as especificações do fabricante.
A amplificação do cDNA obtido foi realizada por reação em cadeia de polimerase (PCR). Os
produtos da PCR foram analisados quanto ao tamanho amplificado por meio de eletroforese em
gel de agarose a 1,5% com tampão TBE (composto por tris, ácido bórico e EDTA) 1X. O gel foi
corado com brometo de etídio (0,5µg/mL) e revelado sob a luz ultravioleta. A purificação das
bandas da PCR foi realizada utilizando-se o kit Concert Rapid PCR Purification System (Gibco
BRL), conforme as especificações do fabricante. A quantificação do cDNA da BjussuMP-II foi
realizada em espectrofotômetro pela determinação da absorbância em 260nm (1 UABS260
corresponde a 50µg/mL de DNA fita dupla).
4.10.1.4. Preparo de bactérias competentes: As bactérias Escherichia coli DH5α competentes
foram preparadas utilizando-se o método do CaCl2 descrito por Sambrook et al. (1989). O método
consiste em colocar uma colônia isolada para crescer em 5mL de meio de cultura líquido, LB
(Luria Bertani), “overnight” em estufa sob agitação (1.530xg) a 37ºC, seguindo-se incubação de
0,5mL desta cultura em 50mL de mesmo meio em mesma agitação e temperatura, por período de
Metodologia 32
3 a 4h até a densidade óptica da cultura atingir 0,3 a 0,4 em 600nm. Em seguida, 30mL da cultura
de células são centrifugados em tubo estéril (2.090xg por 15min a 4ºC). Descarta-se o
sobrenadante e as células são ressuspensas em 15mL de solução Tris-Cálcio, permanecendo em
gelo por 20min. Após este período, as células são novamente submetidas à centrifugação com
rotação de 2.090xg por mesmo período e em mesma temperatura, o sobrenadante é novamente
descartado e as células ressuspensas em 1mL de solução Tris-Cálcio, permanecendo no gelo por
aproximadamente 45min. As células são então consideradas competentes podendo ser guardadas
no gelo por até 24h ou armazenadas a –70ºC.
4.10.1.5. Clonagem do cDNA da metaloprotease em E. coli: Foi utilizado o Kit QIAGEN PCR
cloning handbook, para a construção do vetor recombinante (pDrive Cloning Vector) que foi
inserido em bactérias competentes. Bactérias competentes foram transformadas pelo método da
eletroporação conforme descrito por Hanahan (1985), sendo selecionadas em meio contendo
ampicilina e visualizadas com o acréscimo de IPTG e X-Gal no meio de cultura. Após a
transformação, as colônias de bactérias recombinantes foram analisadas por PCR e eletroforese
em gel de agarose 1,2% para confirmação da clonagem.
4.10.1.6. Transformação das bactérias competentes: A transformação foi realizada pelo
método da eletroporação conforme descrito por Hanahan (1985). O método consiste em colocar o
vetor recombinante (2µL) juntamente com as células competentes (40µL), sendo todos os
procedimentos realizados em gelo. A mistura deve ser agitada levemente, transferida para a
cubeta de eletroporação e as células submetidas a um pequeno choque no eletroporador. Em
seguida é adicionado 1mL de meio LB líquido e toda a solução é transferida para um tubo
permanecendo em estufa a 37ºC a 1.060xg durante 1h. Desta solução de células transformadas,
Metodologia 33
cada 100µL foram plaqueados em placas de petri contendo meio LB sólido acrescido de
ampicilina, que permite o crescimento apenas das células transformadas que se apresentam
resistentes a este antibiótico devido ao gene de resistência presente no plasmídio por elas
adquirido.
4.10.1.7. Purificação de plasmídeos: As bactérias transformadas, crescidas em meio sólido
contendo ampicilina, foram colocadas para crescer overnigth sob agitação de 500xg a 37ºC (em 3
mL de meio LB contendo ampicilina 0,1%), posteriormente centrifugadas para abaixar o
precipitado, que foi utilizado para a purificação de plasmídeos pelo Kit QIAGEN PLASMID
MINI Handbook – 100, segundo protocolo otimizado.
4.10.1.8. Digestão: A digestão, com as enzimas NheI e BamHI, de uma alíquota dos plasmídeos
purificados das colônias de E. coli foi realizada para confirmação, em gel de agarose 1,2%, da
presença do cDNA da proteína de interesse. Como padrão de peso molecular foram utilizados
10µL de Hind III fragments, 90µL (preparado em água e tampão TAE – composto por tris, ácido
acético e EDTA) Foram realizados: uma PCR e posterior precipitação e purificação de seu
produto precedendo o sequënciamento.
4.10.1.9. Reação de seqüênciamento de cDNA por produto de PCR: Os produtos da PCR
foram submetidos ao seqüênciamento direto, usando o kit ABI Prism® Big DyeTM Terminador
Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer). Foram utilizados primers que amplificam
regiões presentes no plasmídeo. O protocolo de reação foi conduzido conforme as especificações
do fabricante, com 25 ciclos de reação de: 95ºC por 10 segundos, 50ºC por 20 segundos, 72ºC
por 4 minutos; após este intervalo as amostras foram mantidas a -4ºC. À mistura de
Metodologia 34
seqüênciamento foram adicionados 80 µL de isopropanol a 75%, seguido de incubação por 15
min a temperatura ambiente. Após a incubação, a mistura foi centrifugada a 1.060xg por 45 min,
a 5ºC, sendo realizada uma lavagem com etanol 70% gelado e em seguida incubação em estufa a
37ºC por 1 hora. A eletroforese seguiu em um aparelho ABI Prism 377 DNA Sequencer (Perkin
Elmer), usando gel de poliacrilamida a 4%, uréia 6 M, sendo conduzida a 1500V, temperatura de
51ºC, durante 7 horas. Os eletroferogramas obtidos foram analisados através do programa ABI
Analysis Data Collection e as seqüências posteriormente analisadas através do software
Sequencher versão 3.1.
4.10.1.10. Análise computacional das seqüências: A seqüência de cDNA e de aminoácidos da
metaloprotease obtida de B. jararacussu foi analisada quanto à homologia com outras seqüências
de proteases previamente depositadas no banco de dados do NCBI (National Center for
Biotechnology Information), GenBank e SwissProt, para nucleotídeos e aminoácidos.
Adicionalmente foram realizados o alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos através
da utilização do programa Clustal W multiple Alignement (THOMPSON et al, 1994).
4.11. Clonagem em vetor de expressão do cDNA da BjussuMP-II:
4.11.1. Isolamento do cDNA completo.
A partir dos plasmídeos extraídos de clones selecionados, foram amplificados os
fragmentos de BjussuMP-II. A extração dos plasmídeos recombinantes foi realizada com o “Kit
ConcertTM Rapid plasmid – Miniprep System” (GibcoBRL) de acordo com as especificações do
fabricante. Em seguida os plasmídeos foram analisados em eletroforese em gel de agarose 1%
com tampão TBE 1X pH 8.2. O gel foi corado com brometo de etídio (0,5µg/mL) e visualizado
Metodologia 35
em luz ultravioleta. Foi utilizado os mesmos oligonucleotídeos (MP-1 e MP-2) específicos
desenhados para a amplificação do cDNA, sem a região codificadora do peptídeo sinal.
Um programa para PCR foi otimizado e programado no termociclador (MJ Research,
Inc). Os produtos da PCR foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose a 1% com
tampão TBE 1X. O gel foi corado com brometo de etídio (0,5µg/mL) e revelado sob luz
ultravioleta. A purificação das bandas da PCR foi realizada por meio de eletroforese em gel de
agarose low melting a 1% em tampão TAE 1X pH 8.0 utilizando o “Kit Wizard PCR Preps –
DNA Purification System” (Promega), segundo as especificações do fabricante. A quantificação
do DNA da BjussuMP-II foi realizada em espectrofotômetro pela determinação da absorbância
em 260nm.
Os fragmentos amplificados foram clonados utilizando o “Kit TOPO TA Cloning”
(Invitrogen) seguindo as especificações do fabricante. Os plasmídeos foram extraídos utilizando
o Kit anteriormente citado e, após a extração, a qualidade do DNA plasmidial foi analisada por
meio de eletroforese em gel de agarose conforme condições já descritas.
4.11.2. Ligação do cDNA ao vetor de expressão e transformação genética.
Os vetores de expressão utilizados para a clonagem do cDNA da proteína foram os do
sistema pET (Novagen) (STUDIER e MOFFATT, 1986; ROSENBERG et al., 1987; STUDIER
et al., 1991). Neste trabalho, foram utilizados os vetores pET21a que foram digeridos com as
enzimas NheI e BamHI . Cada plasmídeo recombinante (4µg) contendo o cDNA de interesse
(ligado ao plasmídeo do “Kit TOPO TA Cloning”) também foi digerido com estas mesmas
enzimas.
Metodologia 36
Quantidade (µL) Sistemas de digestão
PET21a
Água 74
Vetor 8 (3,6µg)
BamHI (10U/µL) 5
NheI (5U/µL) 3
Tampão 10X de BamHI 10
Volume final 100
O sistema de digestão foi incubado a 37ºC durante 1 hora e 30 minutos. Após a digestão,
os produtos foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Em seguida, os
vetores foram submetidos a uma etapa de precipitação, antes da ligação do inserto, que consistiu
do seguinte procedimento:
1- 90µL do vetor digerido + 7,5µL de SDS 10% + 3µL de EDTA 0,5M e 5µL de NaCl 3M;
2- Homogeneização e extração com 150µL da mistura de fenol: clorofórmio: álcool
isoamílico 24: 22: 1;
3- Agitação por 1 minuto e centrifugação por 2 minutos a 12.000xg;
4- Repetição da extração com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico;
5- Extração com um volume de clorofórmio hidratado (2 vezes);
6- Centrifugação por 2 minutos a 12.000xg e separar o sobrenadante;
7- Ao sobrenadante obtido foram adicionados 1/10 volume de NaCl 3M e 2,5 volumes de
etanol;
Metodologia 37
8- Incubação a –20ºC overnight;
9- Centrifugação por 2 minutos a 12.000xg e ressuspensão do precipitado em 20µL de água
MilliQ estéril.
Após a precipitação do vetor digerido, foi realizada a ligação com cDNA da proteína
previamente preparado. A ligação do cDNA da BjussuMP-II nos vetores de expressão foi
processada conforme a reação a seguir:
Componentes Volume (µL)
Água 5,5
Tampão 10X de ligase 1,5
Vetor 3,0 (3µg)
Inserto (BjussuMP-II) 4,0 (20µg)
T4 DNA Ligase (1U/µL) 1,0
Volume final 15
O sistema de ligação foi incubado à temperatura ambiente por 30 minutos, seguido de 1
hora a 16ºC. Uma vez efetuada a ligação, foi realizada uma transformação, em células
competentes previamente preparadas, de E. coli BL21 (DE3) pLysS. Essa hospedeira apresenta
resistência ao antibiótico cloranfenicol na concentração de 34µg/mL, devido à presença do
plasmídeo pLys.
As células competentes da linhagem hospedeira foram preparadas conforme o método do
CaCl2 descrito por Cohen et al. (1972) e a transformação foi induzida por choque térmico. Cerca
de 5µL do produto da ligação foram adicionados a 100 µL de suspensão de células hospedeiras
Metodologia 38
competentes e os tubos incubados em gelo por uma hora. Em seguida, as células foram
submetidas a um choque térmico a 42ºC por 2 minutos; incubadas em meio de cultura LB líquido
a 37ºC por uma hora e, em seguida, plaqueadas em meio de cultura LB sólido contendo 34µg/mL
de cloranfenicol e 100µg/mL de ampicilina. Após incubação a 37ºC overnight as colônias
transformantes foram analisadas.
4.11.3. Análise das colônias transformantes.
Os clones foram incubados em 3mL de meio de cultura LB líquido contendo ampicilina e
cloranfenicol e incubados por 14 horas a 37ºC. Em seguida, foi realizada uma extração de DNA
plasmidial utilizando o “Kit ConcertTM Rapid Plasmid – Miniprep System” (GibcoBRL) de
acordo com as recomendações do fabricante. Após a extração dos plasmídeos, a qualidade do
DNA plasmidial foi analisada por meio de eletroforese em gel de agarose. As amostras foram
submetidas a uma PCR com os primers desenhados, nas mesmas condições já descritas, seguida
pela análise em eletroforese. As amostras positivas foram seqüenciadas utilizando o primer do
promotor T7. O sequenciamento e a análise das seqüências foram realizados conforme descrito
anteriormente.
4.11.4. Expressão da proteína recombinante.
A expressão foi induzida pela adição de IPTG. Vários testes foram realizados em busca
das melhores condições de expressão em pET21a, alterando-se os constituintes do meio de
cultura, pH, concentração de IPTG, temperatura e o tempo de indução da proteína recombinante.
Os estudos de expressão foram realizados com células E coli BL21 (DE3)pLysS transformadas
com os plasmídeos recombinantes derivados do pET21a. A expressão foi iniciada com as
construções em pET21a, inoculando uma colônia dos clones em 50mL de meio de cultura LB
Metodologia 39
líquido acrescido de cloranfenicol e ampicilina, mantendo-se a cultura sob agitação a 1.200xg, a
37ºC. A proliferação foi monitorada pela medida da absorbância a 600nm, e quando a cultura
atingiu 0,6-1,0 UAbs (aproximadamente 3 horas), foi adicionado o IPTG na concentração de
1mM sendo o cultivo mantido por mais 4 horas. Simultaneamente, foi feito um controle não
induzido, sem a adição do IPTG, nas mesmas condições.
4.11.5. Análise da expressão da BjussuMP-II em gel de poliacrilamida.
Decorrido o tempo de indução, 1mL do meio de cultura foi centrifugado e o sedimento
lavado com solução contendo Tris-HCl 50mM pH 8.0, EDTA 20mM, uréia 0,5M e triton X-100
0,5%. Esta etapa de lavagem do sedimento é realizada sob agitação em agitador tipo vórtex por
alguns minutos seguida de centrifugação por 3 min a 6.800xg e à temperatura ambiente. O
sedimento contendo os corpos de inclusão foi novamente ressuspenso em 100µL de água MilliQ
estéril e 10µL analisado por eletroforese vertical em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE),
juntamente com os controles não induzidos. O restante do meio de cultura foi centrifugado por 30
minutos a 6.800xg e as células contendo os corpos de inclusão foram armazenadas a –70ºC.
O gel de poliacrilamida foi confeccionado a 12%, utilizando SDS como agente
desnaturante segundo método descrito por Laemmli (1970). O gel de concentração foi preparado
a 6% em poliacrilamida (acrilamida e bisacrilamida 19:1) em tampão Tris-HCl 1,5M pH6,8, SDS
10%, persulfato de amônio 10% e TEMED, e o gel de separação a 12% poliacrilamida foi
preparado em tampão Tris-HCl 1M pH 8,8, SDS 10%, persulfato de amônio 10% e TEMED. As
amostras (10µL contendo corpos de inclusão) foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl
0,5M pH 6,5; SDS 2%; β-mercaptoetanol 3,5% e azul de bromofenol 1mg/mL) fervidas por 5
minutos e aplicadas no gel. A eletroforese foi realizada em tampão Tris-glicina 1X pH 8,3 a 90V
Metodologia 40
por aproximadamente 2,5 horas, até o indicador azul alcançar o final do gel. O gel foi corado em
uma solução de azul de Coomassie (metanol 50%, ácido acético 10% e Coomassie Blue 0,2%),
por 10 minutos e depois descorado em ácido acético 10%.
4.11.6. Purificação e redobramento da proteína recombinante.
Extração e purificação da metaloprotease dos corpos de inclusão.
Os sedimentos de células induzidas contendo a proteína recombinante na forma de corpos
de inclusão, armazenados a -70°C, passaram por duas etapas de sonicação em tampão contendo
Tris-HCl 50mM pH8,0, EDTA 20mM, uréia 0,5M e Triton X-100 0,5% para uma completa
homogeneização, seguida de centrifugação (4.000xg por 10 min). O homogenato foi distribuído
em tubos de 2mL e submetidos novamente à centrifugação (4.000xg por 5 min) para eliminar o
excesso de tampão.
Após a sonicação, o sedimento contendo os corpos de inclusão foi tratado com 1mL de
tampão Tris-HCl 50mM pH8,0 contendo uréia 3M e EDTA 20mM por 30 min a 37°C. As
amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 20.000xg e o sobrenadante descartado. O
sedimento foi ressuspenso em 500µL do tampão de modificação (300µL NTSB, 0,283g
tiocianato de guanidina) e incubado por 1 hora à temperatura ambiente para completa dissolução.
Em seguida as amostras foram aplicadas em colunas de filtração em gel (1,6 X 2,5 cm)
empacotadas com uma resina de exclusão molecular BioGel P6 (BIORAD). A coluna foi
equilibrada com tampão contendo Tris-HCl 50mM pH8,0/EDTA 1mM, e a proteína eluída com
tampão Tris-HCl 20mM pH8,0, EDTA 2mM e hidrocloreto de guanidina 2M, segundo protocolo
previamente descrito (WARD et al., 2001). O pico de proteína eluída detectado por absorbância
em 280nm serviu como amostra para o redobramento.
Metodologia 41
- Redobramento e Purificação da metaloprotease recombinante.
O redobramento da proteína recombinante foi conduzido in vitro em fase sólida em coluna
de filtração em gel (1,5 x 2,5 cm) empacotada com a mesma resina de exclusão molecular BioGel
P6 (BioRad) equilibrada com 12mL de tampão de redobramento contendo Tris-HCl 20mM
pH8,0, hidrocloreto de guanidina 0,3M, cisteína 6mM e cistina 3mM. Após aplicação da amostra
protéica na resina de adsorção, a coluna foi mantida por aproximadamente 16 horas em incubação
à temperatura ambiente. Em seguida, a coluna foi lavada com 10mL de tampão Tris-HCl 50mM,
pH 8.0 contendo EDTA 1mM e hidrocloreto de guanidina 0,3M, para eluição da proteína. As
amostras coletadas foram diluídas em 10mL de tampão contendo Tris-HCl 50mM contendo
hidrocloreto de guanidina 0,3M, cistina 3mM e de cisteína 6mM e mantidas à temperatura
ambiente com agitação moderada durante 48 horas para permitir a renaturação.
Decorrido o tempo de redobramento, as amostras foram purificadas em cromatógrafo
líquido de alta eficiência (HPLC – Shimadzu), equipado com coluna de troca aniônica
(Asahipack ES502N) e detector U.V., previamente programado para um gradiente linear de 0-
100%, de NaCl 2M em 20 minutos. Utilizou-se no reservatório A tampão de eluição com Tris-
HCl 50mM pH 8,0 e no reservatório B tampão de eluição com Tris-HCl 50mM pH 8,0 contendo
NaCl 2M com um fluxo de 0,5mL/minuto. As frações eluídas no intervalo de 20 a 40 minutos
foram coletadas. O perfil cromatográfico da BjussuMP-II isolada do veneno de Bothrops
jararacussu, obtido na mesma coluna sob as mesmas condições, foi utilizado como padrão de
comparação. A proteína recombinante foi submetida aos testes de atividade fibrinogenolítica e
fibrinolítica.
Metodologia 42
4.12. Estudo estrutural da BjussuMP-II
4.12.1. Modelagem protéica: Todos os alinhamentos entre a seqüência da BjussuMP-II e as
outras moléculas homólogas depositadas no banco de dados estrutural, foram gerados usando o
programa HHpred (SÖDING, BIEGERT e LUPAS, 2005), acessível pelo Instituto Max-Planck
do servidor Desenvolvimento da Biologia (http://protevo.eb.tuebingen.mpg.de/toolkit). A
estrutura da BaP1, uma metaloprotease do veneno da serpente Bothrops asper (PDB code 1ND1)
(WATANABE et al., 2003), foi selecionada e usada como molde pelo programa MODELLER
8v2 (MARTI-RENOM et al., 2000) para construir o modelo inicial da BjussuMP-II. O íon Zn++
foi adicionado ao molde estrutural para o modelo inicial usando o programa MODELLER 8v2.
4.12.2. Simulação Dinâmica Molecular: A simulação Dinâmica Molecular foi realizada usando
o programa GROMACS (Groningen Machine for Chemical Simulation) v.3.3.1 (BERENDSEN
et al., 1996; LINDAHL et al., 2001) e explícitas moléculas de água (BERENDSEN et al., 1981),
em um bi-processador Intel Xeon 64 usando um sistema Ubuntu Linux v.6.06. Um contador de
íons foi adicionado para neutralizar o sistema e o campo de força GROMOS 96 53a6
(OOSTENBRINK et al., 2005) para realização da simulação MD. A simulação MD foi realizada
em temperatura e pressão constantes em uma caixa dodecaédrica, com uma distância mínima de
1.2 nm entre os átomos da proteína e a parede da caixa.
Na seqüência para gerar o início da configuração do sistema, há uma minimização da
energia inicial (EM) usando um “steepest descent algorithm” e 200 ps (pico segundos) de
dinâmica molecular com restrições de posições aplicadas à proteína (PRMD). Então, uma
desenfreada simulação MD de 5000 ps foi executada para a aproximação da estabilidade do
modelo. Durante o processo, temperatura e pressão foram controladas, respectivamente, para 298
Metodologia 43
K e 1.0 bar (BERENDSEN et al., 1986). As distâncias entre as histidinas catalíticas e o íon Zn++
do modelo BjussuMP-II foram obtidas de acordo com Andreini et al. (2005).
4.12.3. Avaliação do Modelo Teórico da BjussuMP-II, superposição de átomos de Cα e
análise de resíduos de superfície conservados: A qualidade geométrica do modelo teórico final
da BjussuMP-II foi verificada utilizando o programa PROCHECK v.3.5.4 (LASKOWSKI et al.,
1996). A superposição dos átomos de Cα da BjussuMP-I foi executada com o programa O (INNIS
et al., 2000).
4.13. Análise estatística dos resultados: Os dados obtidos foram analisados estatisticamente,
sendo expressos os resultados pela média +/- desvio padrão (SD).
Resultados 44
5. RESULTADOS
Isolamento e Caracterização Bioquímica da Metaloprotease
A metaloprotease, BjussuMP-II, foi obtida em elevado grau de pureza em apenas duas
etapas cromatográficas, uma coluna contendo resina CM-Sepharose em tampão bicarbonato de
amônio com gradiente de concentração variando de 0,05 a 1M pH 8,1, e uma cromatografia de
interação hidrofóbica em resina Fenil-Sepharose, eluída em tampão Tris-HCl 0,05M pH 7.4, com
gradiente decrescente de NaCl de 4 a 0M e por fim água (Figura 2A e B). O alto grau de pureza
da BjussuMP-II foi confirmado em HPLC de fase reversa (Figura 2C) e em eletroforese em gel
de poliacrilamida na presença de SDS (Figura 2D), que demonstrou também uma única cadeia
polipeptídica com massa molecular relativa de 24.000.
Resultados 45
Figura 2. Isolamento da metaloprotease BjussuMP-II. (A) Perfil Cromatográfico em CM-Sepharose, equilibrada com AMBIC 0.05M e gradiente de concentração até 1M, pH 8.1, à temperatura ambiente. Amostra: 300 mg de veneno bruto de B. jararacussu dissolvidos em 1,5 mL do mesmo tampão. Fluxo de 24mL/hora e frações de 3,5 mL/tubo. (B) O pico J-II (15 mg), obtido da cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose, foi aplicado em coluna de Fenil-Sepharose, sendo eluído em tampão Tris-HCl 0,05M pH 7.4, seguido pelo mesmo tampão em gradiente decrescente de NaCl (4 – 0M) e água, em um fluxo de 0,4mL/min e coletando-se frações de 3mL/tubo. (C) Avaliação do grau de pureza da BjussuMP-II em HPLC de fase reversa em coluna C18, eluída em acetonitrila: 0,1% TFA (5:95 v/v, tampão A) e acetonitrila: 0,1% TFA (60:40 v/v, tampão B), seguindo um gradiente linear para 25% de tampão B depois de 30 min a um fluxo de 1mL/min. (D) Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de agentes desnaturantes (Dodecil sulfato de sódio - SDS e β-mercaptoetanol). Amostras: 1- Padrão de peso molecular (PM); 2- BjussuMP-II (30µg).
Ace
toni
trila
(%)
0 5 10 15 20 25 300.00
0.05
0.10
0.15
0.20 60
45
30
15
0
Abs
280
nm
0 5 10 15 20 25 300.00
0.05
0.10
0.15
0.20 60
45
30
15
0
Abs
280
nm
Tempo de retenção (min)
Ace
toni
trila
(%)
0 5 10 15 20 25 300.00
0.05
0.10
0.15
0.20 60
45
30
15
0
Abs
280
nm
0 5 10 15 20 25 300.00
0.05
0.10
0.15
0.20 60
45
30
15
0
Abs
280
nm
Tempo de retenção (min)
C
0 50 100 150 200 250 3000
1
2
3
4
A BthTX-I
BthTX-II
J-V
J-IVJ-III
J-II
J-I
J-0
Abs
280n
m
Número de tubos0 10 20 30 40 50 60
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
NaC
l [M
]
H2O0
1
2
3
4
B
BjussuMP-II
Abs
280
nm
Número de tubos
Resultados 46
Caracterização Funcional da Metaloprotease
A BjussuMP-II, em baixas quantidades (0,01; 0,1 e 0,5µg), foi capaz de hidrolisar as
cadeias α e β do fibrinogênio, enquanto que a cadeia γ não foi hidrolisada, mesmo na presença
de quantidades maiores (2 e 5µg) da enzima (Figura 3A). Esta enzima induziu atividade
fibrinogenolítica dose-tempo-dependente, mostrando-se ativa após 30 min de incubação (Figuras
3B). A BjussuMP-II foi capaz de hidrolisar a cadeia β do fibrinogênio após ser incubada em
diferentes temperaturas e valores de pHs (Figura 3C e 3D). Esta metaloprotease apresentou
intensificação de sua atividade sobre fibrinogênio quando incubada com os íons Zn++ e Ca++ em
concentração de 40mM, mantendo atividade proteolítica semelhante ao controle, quando
incubada com outros íons divalentes, como Mn++, Co++, Fe++ e Mg++ (Figura 4A).
A heparina foi capaz de inibir totalmente a atividade fibrinogenolítica da metaloprotease
(Figura 4C), sendo o mesmo observado na presença de EDTA acima de 10 mM (Figura 4B).
Adicionalmente, o EGTA e a 1,10-fenantrolina, agentes quelantes de metais, também inibiram
esta atividade. Entretanto, os inibidores β-mercaptoetanol, aprotinina e PMSF a 10mM não
inibiram o efeito proteolítico da BjussuMP-II sobre o fibrinogênio (Figura 5A).
Alguns extratos de plantas, com atividade antiofídica comprovada foram testados,
resultando em inibição parcial da atividade fibrinogenolítica da protease apenas pelos extratos de
Stryphnodendron barbadetiman, Jatropha elíptica e Sapindus saponaria. Os demais extratos
(Mandevilla velutina, Mikania glomerata, Jacaranda decurrens e Anacardium humile)
mostraram-se sem efeito inibitório sobre esta atividade na proporção de 1:30 (m/m) conforme
mostrado na Figura 5B.
A protease mostrou-se inativa sobre os substratos TAME e BAPNA (resultados não
apresentados).
Resultados 47
No teste de degradação de gelatina, realizado em gel de poliacrilamida, tanto o veneno
bruto de B. jararacussu (20µg) quanto a proteína BjussuMP-II (20 e 50µg) mostraram-se
proteolíticos sobre este substrato podendo ser visualizadas bandas sem coloração após tratamento
do gel de acordo com protocolo experimental (resultado não apresentado).
A BjussuMP-II mostrou-se proteolítica sobre a caseína com efeito dose dependente, e
com atividade maior que a apresentada pelo veneno bruto de B. jararacussu (Figura 6A). Para o
efeito sobre fibrina, também foi observada maior atividade da enzima em relação ao veneno
bruto, sendo que a BjussuMP-II mostrou-se ativa em concentrações de 3 a 96µg (Figura 6B). A
proteína apresentou efeito proteolítico sobre o colágeno tipo IV em diferentes concentrações,
mostrando-se ativa a partir de 6µg (Figura 6C), tendo atividade dose-dependente.
A metaloprotease em concentrações de 1 a 50µg não apresentou atividade coagulante e
nem anticoagulante sobre plasma bovino. No entanto, esta enzima foi capaz de acelerar a
coagulação na presença de íons cálcio, demonstrando uma possível ação pró-coagulante (Tabela
1).
A metaloprotease não induziu hemorragia, em altas doses (200µg), sendo considerada não
hemorrágica uma vez que o veneno bruto induziu hemorragia com 10µg, ou seja, 1 DMH (dose
mínima hemorrágica). Esta enzima apresentou baixa atividade indutora de edema, quando
comparada aos controles realizados com veneno bruto de B. jararacussu e fosfolipase A2
homóloga isolada do mesmo veneno (BthTX-I). A BthTX-I e o veneno bruto (10µg) induziram
90 e 100% de edema em 30 min, respectivamente, após a injeção das amostras, enquanto que,
para a BjussuMP-II induzir 80%, foi necessária a concentração de 100µg (resultados não
apresentados).
A BjussuMP-II também não se mostrou miotóxica quando injetada em músculo
gastrocnêmio direito de camundongos, obtendo-se o valor de 214,01U/min para a atividade da
Resultados 48
creatina cinase após injeção de 200µg da proteína equivalente aos valores de atividade dosados
nos animais controle os quais receberam injeção de PBS (212,08 U/min). Foi realizado um
controle positivo com injeção de 40µg da BthTX-I isolada do veneno de B. jararacussu, que
apresentou miotoxicidade na ordem de 1.352,81 U/min (resultados não apresentados).
A BjussuMP-II não se mostrou letal em altas doses (500µg) administradas por injeção
intra-peritonial, em contraste com o veneno bruto de B. jararacussu (50µg) que resultou em
100% de morte dos animais 4 horas após a injeção.
A análise histopatológica de amostras do músculo gastrocnêmio, coletadas 3 horas após a
injeção i.m. da BjussuMP-II (250µg), demonstrou infiltrados leucocitários focais (com
neutrofilia), a presença de plasmócitos (caracterizando inflamação) e destruição das fibras
musculares (Figura 7A). O tecido pulmonar após injeção da BjussuMP-II apresentou congestão
difusa (hemorragia), espaços alveolares diminuídos por espessamento dos septos e espaços
intersticiais expandidos pelo infiltrado inflamatório (Figura 7D). Não foram observadas
alterações significativas nos rins e outros tecidos viscerais (cerebral, renal, esplênico e muscular
cardíaco).
A BjussuMP-II inibiu a agregação plaquetária induzida por colágeno (10µg/mL) ou ADP
(10µM). A adição da BjussuMP-II (5 a 30µg/mL) em solução de plaquetas lavadas e posterior
acréscimo de colágeno também resultou em inibição da agregação plaquetária dose-dependente
(Figura 8).
A inibição da agregação plaquetária induzida pela BjussuMP-II foi quase totalmente
abolida após tratamento com EDTA (5mM), PMSF (5mM) e benzamidina (7mM) (Tabela 2). A
atividade proteolítica da BjussuMP-II sobre o fibrinogênio ou o substrato S-2238 foi nula,
enquanto que a trombina apresentou 100% de atividade na presença destes mesmos substratos
(Tabela 3).
Resultados 49
A BjussuMP-II mostrou-se bactericida sobre E. coli e S. aureus (Figura 9), e apresentou
considerável atividade antitumoral sobre células JURKAT, SK-BR-3 e EAT. O metotrexato,
droga antitumoral largamente empregada na clínica foi utilizada como controle e apresentou
atividade semelhante a BjussuMP-II sobre células EAT (Figura 10). Entretanto, sobre células da
linhagem B16F10 de camundongos, o efeito citotóxico da BjussuMP-II foi menos pronunciado,
sendo necessário 1mg/mL de proteína para se obter 22% de citotoxicidade, frente ao metotrexato
que nesta concentração resultou em 30% de citotoxicidade (Figura 10).
Resultados 50
Figura 3. Atividade fifrinogenolítica da BjussuMP-II em diferentes concentrações, tempos de incubação, pHs e temperaturas. (A) Atividade fibrinogenolítica de BjussuMP-II em diferentes concentrações. 1- Fibrinogênio bovino (80g); 2- Fibrinogênio + BjussuMP-II (0,01µg) a 37°C em pH 7.0 por 30min.; 3- (0,1µg); 4- (0,5µg); 5- (2µg); 6- (5µg). (B) BjussuMP-II (2µg) em diferentes tempos de incubação. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibrinogênio + BjussuMP-II (30min) a 37°C em pH 7.0; 3- (2h); 4- (8h); 5- (12h); 6- (24h). (C) BjussuMP-II (2µg) em diferentes pHs. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibrinogênio + BjussuMP-II previamente incubados em PBS a 37°C por 30 min.; 3- pH 2.5; 4- pH 3.5; 5- pH 4.5; 6- pH 5.5; 7- pH 7.0; 8- pH 8.0; 9- pH 10.0. (D) BjussuMP-II (2µg) em diferentes temperaturas. 1-Fibrinogênio (80µg); 2-Fibrinogênio + BjussuMP-II (previamente incubada durante 30min) a –20ºC em pH 7.0; 3- 4ºC; 4- 25ºC; 5- 37ºC; 6- 50ºC; 7- 60ºC; 8- 80ºC; 9- 90ºC e 10- 100ºC.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 C D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 A B α β γ
1 2 3 4 5 6
Resultados 51
Figura 4. Atividade fifrinogenolítica da BjussuMP-II na presença de diferentes íons, EDTA e heparina em diferentes quantidades. (A) BjussuMP-II (2µg) com diferentes íons. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibrinogênio + BjussuMP-II previamente incubados em PBS por 30min. em pH 7.0; 3- solução de Mg++ (10mM); 4- Co++; 5- Zn++; 6- Ca++; 7- Fe++; 8- Mn++. (B) BjussuMP-II (2µg) com EDTA. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibrinogênio + BjussuMP-II previamente incubados em PBS a 37°C em pH 7.0 por 30 min.; 3- solução de EDTA 2,5mM; 4- 5mM; 5- 10mM; 6- 20mM; 7- 25mM. (C) BjussuMP-II (2µg) com heparina. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- BjussuMP-II previamente incubada com heparina 100µg; 3- (200µg); 4- (300µg); 5- (400µg); 6- (500µg); 7- Fibrinogênio + BjussuMP-II em PBS a 37°C em pH 7.0 por 30 min.
1 2 3 4 5 6 7 A 1 2 3 4 5 6 7 8 B
α β γ
C
Resultados 52
Figura 5. Efeito de Inibidores sobre a Atividade fibrinogenolítica de BjussuMP-II. (A) Inibidores químicos. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibri + BjussuMP-II (2µg) a 37ºC por 30 min. em pH 7.0; 3- Fibri + BjussuMP-II + β-mercaptoetanol (4mM); 4- Fibri + BjussuMP-II + EGTA (10mM); 5- Fibri + BjussuMP-II + aprotinina (10mM); 6- Fibri + BjussuMP-II + 1,10-fenantrolina (10mM) e 7- Fibri + BjussuMP-II + PMSF (10mM). (B) Inibidores naturais obtidos de plantas. 1- Fibrinogênio (80µg); 2- Fibri + BjussuMP-II (2µg) a 37°C em pH 7.0 por 30 min.; 3- Fibri + BjussuMP-II + Stryphnodendron barbadetiman (1:30); 4- Fibri + BjussuMP-II + Mandevila velutina (1:30); 5- Fibri + BjussuMP-II + Eclipta alba (1:30); 6- Fibri + BjussuMP-II + Micania glomerata (1:30); 7- Fibri + BjussuMP-II + Jatropha eliptica (1:30); 8- Fibri + BjussuMP-II + Jacaranda decurrens (1:30); 9- Fibri + BjussuMP-II + Sapindus saponaria (1:30); 10- Fibri + BjussuMP-II + Anacardium humile (1:30).
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B
BjussuMP-II
α β γ
1 2 3 4 5 6 7
Resultados 53
Figura 6. Atividade proteolítica da BjussuMP-II sobre diferentes substratos. (A) Sobre caseína em diferentes concentrações de BjussuMP-II com incubação em pH 7.0 por 30 min. a 37ºC. (B) Sobre fibrina em diferentes concentrações de BjussuMP-II com incubação “over night” a 37ºC. (C) Sobre colágeno tipo IV em diferentes concentrações de BjussuMP-II com incubação em pH 7.0 por 30 min. a 37ºC. 1- Colágeno (70µg); 2- Colágeno + BjussuMP-II (6µg); 3- Colágeno + BjussuMP-II (18µg); 4- Colágeno + BjussuMP-II (30µg); 5- Colágeno + BjussuMP-II (42µg); 6- Colágeno + BjussuMP-II (48µg); 7- Colágeno + BjussuMP-II (54µg); 8- Colágeno + BjussuMP-II (60µg).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,00
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
A
500
10 25 50 100 2505
Ativ
idad
e C
asei
nolit
ica
(U/m
in)
BjussuMP-II (µg)0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8 B
6 12 24 48 963 PBSAt
ivid
ade
fibrin
olíti
ca (c
m)
BjussuMP-II (µg)
C 1 2 3 4 5 6 7 8
α β γ
Resultados 54
Tabela 1. Efeito da BjussuMP-II de B. jararacussu sobre plasma bovino citratado na presença de íons Ca++ (0,1 M)
Amostras Tempo de coagulação (segundos)
Ca2+ 154
BjussuMP-II 0,4µg 62 1µg 49,5 2µg 47 4µg 47 8µg 13,6
Resultados 55
Figura 7. Análise Histopatológica após injeção da BjussuMP-II. Lâminas obtidas de amostras de músculo e pulmão de camundongos, 3 h após injeção com PBS ou com a BjussuMP-II. (A) Músculo gastrocnêmio injetado com PBS, normal, aumento 40X; (B) Músculo gastrocnêmio injetado com BjussuMP-II, demonstrando infiltrado inflamatório, (destruição das fibras musculares, mantido o tecido conjuntivo – endomísio – de revestimento), (plasmócitos, célula característica de inflamação), aumento 40X; (C) Pulmão de animal injetado com PBS, normal (espaços alveolares mantidos), aumento 40X; (D) Pulmão de animal injetado com BjussuMP-II, (espaços alveolares diminuídos por espessamento dos septos), espaços intersticiais expandidos pelo infiltrado inflamatório, aumento 40X.
A B
C D
Resultados 56
Figura 8. Efeito inibitório da BjussuMP-II sobre plaquetas. (A) Amostras de PRP foram incubadas por 2 min a 37oC com a BjussuMP-II (0,5 a 40 µg/mL), então a agregação plaquetária foi induzida com 10 µg/mL de colágeno (O) ou 10 µM de ADP (∆). (B) A suspenção de plaquetas lavadas (WRP) foi pré-incubada nas mesmas condições e então 10 µg/mL de colágeno foi adicionado para induzir a agregação. O ensaio com plaquetas lavadas permite eliminar a interferência de outros componentes do plasma, no processo de agregação. Os resultados foram calculados pela média ± SD (n=03).
0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
% In
ibiç
ão d
a A
greg
ação
Pla
quet
ária
BjussuMP-II (µg/mL)
B
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
Colágeno ADP
% In
ibiç
ão d
a A
greg
ação
Pla
quet
ária
BjussuMP-II (µg/mL)
A PRP WRP
Resultados 57
Tabela 2. Efeito da BjussuMP-II sobre plaquetas
Amostras Concentração Reagente Concentração % Inibição da agregação plaquetária
BjussuMP-II 40 µg/mL ---------------- ---------------- 100
BjussuMP-II 40 µg/mL EDTA 5 mM 0
BjussuMP-II 40 µg/mL PMSF 5 mM 8
BjussuMP-II 40 µg/mL Benzamidina 7 mM 5
BjussuMP-II (40 µg/mL) foi pré-incubada com PRP por 2 minutes a 37oC na presença ou ausência de EDTA, PMSF ou benzamidina, concentração final. Então, a agregação plaquetária foi iniciada por adição de 2 µg/mL de colágeno. Os controles dos experimentos foram feitos com colágeno sem os reagentes inibidores. Os resultados foram calculados pela média ± SD (n=2).
Tabela 3. Atividade da BjussuMP-II e trombina sobre fibrinogênio ou substrato S-2238.
Amostras Reagente % AtividadeBjussuMP-II Fibrinogênio 0
Trombina Fibrinogênio 100
BjussuMP-II S-2238 0
Trombina S-2238 100
Resultados 58
Figura 9. Efeito citotóxico dose resposta da metaloprotease sobre E. coli e S. aureus após 60 min de incubação prévia. Resultados expressos pela média ± SD (n=3).
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
E. coli S. aureus
Inib
ição
de
CFU
(%)
BjussuMP-II (µg)
Resultados 59
Figura 10. Efeito da BjussuMP-II sobre células tumorais. Células testadas: (A) JURKAT (células de Leucemia linfoblástica T humana), (B) B16F10 (cultura de células de melanoma murínico), (C) EAT (tumor de Ehrlich), (D) SK-BR-3 (cultura de células de adenocarcinoma de mama humana), e como droga antitumoral controle foi utilizado o MTX (metotrexato). Os testes foram realizados com um volume final de 260µL a 37°C por 24h. Os resultados foram expressos pela média ± SD (n=3).
0 1 2 30
20
40
60
80
100
120
0,1 0,1(MTX)
Controle (EAT)
0,05
C
0,01
% c
itoto
xida
de
BjussuMP-II (µg)
0 1 2 30
20
40
60
80
100
120
Controle(JURKAT)
0,1(MTX)
0,05 0,1
A
0,01
% c
itoto
xida
de
BjussuMP-II (µg)
0 1 2 30
20
40
60
80
100
120
0,05 0,1 0,1(MTX)
D
Controle (SK-BR-3)
0,01
% c
itoto
xida
de
BjussuMP-II (µg)
0 1 2 30
20
40
60
80
100
120
0,05 0,1 0,2
B
Controle(B16F10)
0,2(MTX)
0,01%
cito
toxi
dade
BjussuMP-II (µg)
Resultados 60
Caracterização estrutural da BjussuMP-II
O produto de reação com a transcriptase reversa, após amplificação por PCR, produziu
um fragmento de cDNA de 615 pb o qual codifica uma proteína madura com 205 resíduos de
aminoácidos (Figura 11), Mr e pI teóricos de ~23.563 e 6,43, respectivamente. Alguns clones
com insertos de mesmo tamanho foram seqüenciados e mostraram seqüências nucleotídicas
idênticas. O alinhamento da BjussuMP-II e de outras metaloproteases não hemorrágicas mostrou
que estas enzimas tem 65-90% de similaridade com a BaP1 de Bothrops asper, insularinase de
B. insularis, leucurolysina-a de B. leucurus, neuwiedase de B. neuwiedi, adamalisina II de
Crotalus adamanteus, atroxase de C. atrox e LHF-II de Lachesis muta (Figura 12). Em adição, a
BjussuMP-II apresentou os seguintes domínios estruturais conservados: o domínio
metaloprotease, e o sítio ligante de Zn++ (HELGHNLGMEH) (Figura 14).
A estrutura da BaP1 (uma metaloprotease de Bothrops asper) (WATANABE et al., 2003),
foi selecionada como molde para construir o modelo inicial da BjussuMP-II, devido ao grau de
identidade (81%) e o score atribuído pelo programa HHpred (SÖDING e LUPAS et al., 2005)
para o alinhamento dessas duas seqüências.
R.m.s.d. do modelo final da BjussuMP-II foi estabilizado ao redor de 1500ps durante a
simulação de dinâmica molecular (Figura 13 B). O gráfico de Ramachandran (LASKOWSKI et
al., 1993) (Figura 13A) demonstrou que 98,9% dos resíduos do modelo estão em regiões
favoráveis, tornando-o confiável.
Em toda a estrutura está presente uma forma elipsoidal e dois subdomínios: o maior é
constituído pelos primeiros 152 resíduos de aminoácidos e este é composto por quatro α-hélices
(h1, h2, h3 e h4) e seis folhas-β (β1, β2, β3, β4, β5 e β6), enquanto a menor possui 98 resíduos e
é formada por uma α-hélice e alguns loops (Figura 14A). O modelo final da BjussuMP-II
Resultados 61
também apresenta três pontes dissulfeto (Cys116-Cys196, Cys156-Cys180 e Cys158-Cys163)
(Figura 14B), que são correspondentes as existentes na estrutura da BaP1 (WATANABE et al.,
2003). As histidinas catalíticas do modelo teórico final da BjussuMP-II (His141, His 145 e His
151) sustentam o anel imidazol em uma posição favorável para coordenar o íon zinco catalítico
(Figura 15A e B). De igual forma, o resíduo Glu 142 apresenta uma boa proximidade para as
histidinas catalíticas (Figura 15A).
As modelagens apresentadas na Figura 16A e B revelam átomos de resíduos internos e de
superfície conservados em metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas, respectivamente,
podendo ser observados os resíduos Asn199, Cys196, Arg88, Asp84 e Ser59 na superfície das
metaloproteases hemorrágicas e nas não hemorrágicas os resíduos Leu63 e Lys61.
A extração dos plasmídeos contendo o cDNA da BjussuMP-II foi realizada de forma
simples obtendo-se plasmídeos com qualidade adequada para a reação de PCR. O perfil
eletroforético de cDNAs (insertos) amplificados com os primers específicos para metaloprotease,
destacou uma banda de ~600pb, tamanho estimado do cDNA da BjussuMP-II (Figura 17). As
amostras amplificadas foram submetidas a uma eletroforese em gel de agarose low melting
permitindo assim, a purificação da banda que continha a seqüência do cDNA da MP para
posterior ligação ao vetor de expressão.
Os métodos de purificação e redobramento da proteína recombinante na forma ativa,
apresentaram resultados satisfatórios. A BjussuMP-II recombinante foi isolada por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna de troca aniônica (Figura 18A). A
expressão da BjussuMP-II recombinante foi obtida com sucesso em E. coli, mostrando-se, em
SDS-PAGE, com a mesma massa molecular da proteína nativa (Figura 18B). A Figura 19
demonstra a atividade fibrin(ogen)olítica da BjussuMP-II nativa e recombinante.
Resultados 62
1 gaacaacaaaaattctccccaagatacattgaggttgctgtagttgcagatcaccgaatg 60
1 E Q Q K F S P R Y I E V A V V A D H R M 20
61 ttcaagaaatacaacagcaatttaaatactataagaaaatgggtacatgaaatggtcaac 70
21 F K K Y N S N L N T I R K W V H E M V N 40
71 agtatgaatggggtttacagatctatggatgtgcatctatcactggctaacctagaagtt 130
41 S M N G V Y R S M D V H L S L A N L E V 60
131 tggtccaagaaagatttgatcaacgtgcagaaagattcaagagaaactttgaagtcattt 190
61 W S K K D L I N V Q K D S R E T L K S F 80
191 ggagaatggagagagagagatttgctgcctcgcataagtcatgataatgctcagttactc 250
81 G E W R E R D L L P R I S H D N A Q L L 100
251 acggccgttgtcttcgatcaacaaactataggaagagcttacatagccggcatgtgcgac 310
101 T A V V F D Q Q T I G R A Y I A G M C D 120
311 ccgaggcattctgtaggagttgttatggatcatagtaaagaaaatcttcaggttgcagtt 370
121 P R H S V G V V M D H S K E N L Q V A V 140
371 acaatggcccatgagctgggtcataatctgggcatggaacatgatgaaaatcagtgtcat 430
141 T M A H E L G H N L G M E H D E N Q C H 160
Cys X1
431 tgcgatgctccctcatgcgttatggcttccgtactaagcgtagtactttcctatgagttc 490
161 C D A P S C V M A S V L S V V L S Y E F 180
Cys X4 Cys X16
491 agcgattgtagtcagaatcaatatcagacgtatcttactaagcataacccacaatgcatt 550
181 S D C S Q N Q Y Q T Y L T K H N P Q C I 200
Cys X15
551 ctcaacaagcccttg 565
201 L N K P L 205
Figura 11. Seqüência do cDNA e de aminoácidos deduzidos da BjussuMP-II: Nucleotídeos e aminoácidos. Região N-terminal seqüenciada diretamente da proteína (Aas sublinhados); Domínio ligante de Zn++ ( ); Região com algumas cistinas (Cys-X1-CysX4-CysX16-CysX15) (C).
Resultados 63
1 50(Identity %)Adamalysin -----------EQNLPQRYIELVVVADRRVFMKYNSDLNIIRTRVHEIVNIINEFYRSLN 71 Atroxase ---------EDQQNLSQRYIELVVVADHRVFMKYNSDLNIIRKRVHELVNTINGFYRSLN 73 Atrolysin KKASDLNLNPDQQNLPQRYIELVVVADHRVFMKYNSDLNTIRTRVHEIVNFINGFYRSLN 73 Neuwiedase ----------QQRFFPQRYIELVIVADRRMYTKYNSDSNKIRTRVHELVNTVNGFFRSMN 78 BjussuMP-II ----------EQQKFSPRYIEVAVVADHRMFKKYNSNLNTIRKWVHEMVNSMNGVYRSMD -- BjussuMP-I KKASKLVVTAEQQKFPYRYVEIVVVVDRRMVTKYNGDLKKIRKWVYELVNIVNNIYRSLN 81 Insularinase EKASQSNLTPEQQKFSPRYIELAVVADHGMFTKYNSNLNTIRTRVHEMVNTLNGFFRSVN 87 LEUCA_BOTLC ---------------SPRYIELVVVADHGMFKKYNSNLNTIRKWVHEMLNTVNGFYRSMN 82 BAP1_BOTAS -----------QQRFSPRYIELAVVADHGIFTKYNSNLNTIRTRVHEMLNTVNGFYRSVD 87 Acutolisin-A KKASQLIVSTEFQ----RYMEIVIVVDHSMVKKYNGDSDKIKAWVYEMINTITESYSYLY 72 Acutolysin-C -------------PAPQTSIELFLIVDHSMYAKYNSNSSKITTTLKARVNIMNAIYSSLN 69 Trimerelysin ------------QRFPQRYIELAIVVDHGMYKKYNQNSDKIKVRVHQMVNHINEMYRPLN 72 Alfimeprase -----------QQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLN 75 Fibrolase -----------EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLN 74 ::: ::.*: : *** : . * : :* :. : : 51 100 Adamalysin IRVSLTDLEIWSGQDFITIQSSSSNTLNSFGEWRERVLLTRKRHDNAQLLTAINFEGKII Atroxase IDVSLTDLEIWSDQDFITVDSSAKNTLNSFGEWREADLLRRKSHDHAQLLTAINFEGKII Atrolysin IHVSLTDLEIWSNEDQINIQSASSDTLNAFAEWRETDLLNRKSHDNAQLLTAIELDEETL Neuwiedase VDASLANLEVWSKKDLIKVEKDSSKTLTSFGEWRERDLLRRKSHDNAQLLTAIDFNGNTI BjussuMP-II VHLSLANLEVWSKKDLINVQKDSRETLKSFGEWRERDLLPRISHDNAQLLTAVVFDQQTI BjussuMP-I VHVALVGLEIWSKGDKITVQPDSDYTLNSFGEWRERDLLPRKKHDNAQLLTAVVFDGPTI Insularinase VDASLANLEVWSKKDLIKVEKDSSKTLTSFGEWRERDLLPRISHDHAQLLTTIVFDQQTI LEUCA_BOTLC VDASLVNLEVWSKKDLIKVEKDSSKTLTSFGEWRERDLLPRISHDHAQLLTVIFLDEETI BAP1_BOTAS VHAPLANLEVWSKQDLIKVQKDSSKTLKSFGEWRERDLLPRISHDHAQLLTAVVFDGNTI Acutolisin-A IDIILSGLEIWSEKDLINVETSAENTLKSFGEWRAKDLIHRISHDNAQLLTATDFDGPTI Acutolysin-C LVITLSGIEMWSAADLITVQSSSRNTLKLFASWRETDLLKRTSNDNAQLLTATNFNGNTV Trimerelysin IAISLNRLQIWSKKDLITVKSASNVTLESFGNWRETVLLKQQNNDCAHLLTATNLNDNTI Alfimeprase IQFTLVGLEIWSNQDLITVTSVSHDTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTV Fibrolase IQFTLVGLEIWSNQDLITVTSVSHDTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTV : * :::** * *.: : ** *..** *: : :* *:***. :: : 101 150 Adamalysin GKAYTSSMCNPRSSVGIVKDHSPINLLVAVTMAHELGHNLGMEHDGKDCLRG-ASLCIMR Atroxase GRAYTSSMCNPRKSVGIXKDHSPINLLVGVTMAHELGHNLGMNHDGEKCLRG-ASLCIMR Atrolysin GLAPLGTMCDPKLSIGIVQDHSPINLLMGVTMAHELGHNLGMEHDGKDCLRG-ASLCIMR Neuwiedase GRAYLGSMCNPKRSVGIVQDHSPINLLVGVTMAHELGHNLGMEHDGKDCLCG-ASLCIMS BjussuMP-II GRAYIAGMCDPRHSVGVVMDHSKENLQVAVTMAHELGHNLGMEHDENQCHCD-APSCVMA BjussuMP-I GRAYIAGMCDPRHSVGVVMDHSKENLQVAVTMAHELGHNLGMEHDENQCHCD-APSCVMA Insularinase GLAYTAGMCDPRQSVAVVMDHSKKNLRVAVTMAHELGHNLGMDHD-DTCTCG-AKSCIMA LEUCA_BOTLC GIAYTAGMCDLSQMVAWGQDY------VAVSMAHELGHNLGMRHDGNQCHCN-APSCIMA BAP1_BOTAS GRAYTGGMCDPRHSVGVVRDHSKNNLWVAVTMAHELGHNLGIXHDTGSCSCG-AKSCIMA Acutolisin-A GLAYVASMCDPKRSVGVVQDHSSVNRLVAITLAHEMAHNLGVRHDEGSCSCGSGYTCIMS Acutolysin-C GLAYLKTMCNSKYSVGLIQDHSAIPLLMAVTMAHELGHNLGMNHDGAG-CSCAT--CIMA Trimerelysin GLAYKKGMCNPKLSVGLVQDYSPNVFMVAVTMTHELGHNLGMEHDDKDKCKCEA--CIMS Alfimeprase GLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQ-CHCGANSCVMA Fibrolase GLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQ-CHCGANSCVMA * * **: . *: :.::::**:.****: ** *:* 151 200 Adamalysin PGLTPGRSYEFSDDSMGYYQKFLNQYKPQCILNKP------------------------- Atroxase PGLTPGRSYEFSDDSMGYYQSFLKQYNPQ------------------------------- Atrolysin PGLTKGRSYEFSADSMHYYERFLKQYKPQCILNKPLRIDPVSTPVSGNELLEAGEE---- Neuwiedase PGLTDGPSYEFSDCSKDYYQTFLTNHNPQ------------------------------- BjussuMP-II SVLSVVLSYEFSDCSQNQYQTYLTKHNPQCILNKPL------------------------ BjussuMP-I SVLSVVLSYEFSDCSQNQYQTYLTKHNPQCILNEPLLTVSGNELLEAGEECDCGAPENPC Insularinase STISKGLSFEFSKCSQNQYQTYLTDHNPQCILNKPLTTVSGNELLEAGEECDCGAPENPC LEUCA_BOTLC DTLSKGLSFEFSDCSQNQYQTYLTKHNPQCILNKP------------------------- BAP1_BOTAS SVLSKVLSYEFSDCSQNQYETYLTNHNPQCILNKP------------------------- Acutolisin-A PVINSEVIKYFSDCSYIQCREYISKENPPCILNKPLRTDTVSTPVSGNELLEAGKDYD-- Acutolysin-C PVLSSGPAKSFSDCSKHDYQSFLTIHKPQCLLN--------------------------- Trimerelysin DVISDKPSKLFSDCSKNDYQTFLTKYNPQCILNAP------------------------- Alfimeprase AMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP------------------------- Fibrolase AMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP------------------------- :. ** * . ::. :*
Resultados 64
Figura 12. Comparação da seqüência de aminoácidos deduzida da BjussuMP-II com outras metaloproteases de diferentes venenos de serpentes, pertencentes a classe P-I. A seqüência de aminoácido da BjussuMP-II foi alinhada com: adamalisina de Crotalus adamanteus (gi: 640082), atroxase de Crotalus atrox (gi: 9457230), atrolisina de Crotalus atrox (gi: 1311405), neuwiedase de Bothrops newiedi (gi: 6760464), BjussuMP-I de Bothrops jararacussu (gi: 89475241), insularinase de Bothrops insularis (gi: 52426579), leucurolisina de Bothrops leucurus (gi: 114149951), BaP1 de Bothrops asper (gi: 38492529), acutolisina-A de Agkistrodon acutus (gi: 5821910), acutolisina-C de Agkistrodon acutus (gi: 9256872), trimerelisina de Trimeresurus flavoviridis (gi:50403719), alfimeprase forma recombinante da fibrolase de Agkistrodon contortrix contortrix (gi: 462095) e fibrolase de Agkistrodon contortrix contortrix (gi: 26393688).
Resultados 65
A
Resultados 66
Figura 13. (A) Ramachandran (LASKOWSKI et al., 1993); (B) R.m.s.d. derivado do modelo da BjussuMP-II durante a simulação dinâmica molecular (MD) (proteína total: preto; cadeia principal mais alguns aminoácidos, backbone: verde; cadeia principal: vermelho) (LINDAHL et al., 2001).
B
Resultados 67
Figura 14. Estrutura secundária e terciária do modelo da BjussuMP-II. O íons Zn++ é mostrado como uma esfera verde. Gerada pelo programa PyMOL (DELANO, 2002).
Resultados 68
Figura 15. (A) Representação da distância entre o íon Zn++ (esfera verde) e os resíduos de aminoácidos do sítio catalítico do modelo teórico final da BjussuMP-II; (B) Representação da região de maior flexibilidade do modelo da BjussuMP-II, 153-176 (vermelho). Ambas geradas pelo programa PyMOL (DELANO, 2002).
A
B
Resultados 69
Figura 16. Resíduos conservados, encontrados na BjussuMP-II e BjussuMP-I (resíduos internos são mostrados em azul e os de superfície estão apresentados em verde). (A) Átomos de resíduos de superfície conservados nas metaloproteases hemorrágicas de venenos de serpentes (esferas verdes: Asn199, Cys196, Arg88, Asp84 e Ser59); (B) Átomos de resíduos de superfície conservados em metaloproteases não-hemorrágicas de venenos de serpentes (esferas verdes: Leu63 e Lys61).
A
B
Resultados 70
Figura 17. Análise eletroforética dos cDNAs amplificados com os primers específicos de MPs (MP-1 e MP-2). 1- marcador de peso molecular de 100pb; 2 e 3-Produto da amplificação de dois clones contendo o cDNA da BjussuMP-II, analisado por eletroforese em gel de agarose a 1%.
600pb
1 2 3
Resultados 71
Figura 18. Expressão e Purificação da BjussuMP-II recombinante. (A) Cromatograma da purificação da proteína recombinante em HPLC utilizando coluna de troca aniônica e tampão de eluição pH 8,0 com os clones pETP-21. Em vermelho representa a BjussuMP-II nativa, e em preto a proteína recombinante expressa. (B) Análise em SDS-PAGE a 12%. Amostras: 1- BjussuMP-II recombinante purificada; 2- expressão induzida por IPTG; 3- não induzida; 4- PPM.
A
14.4
66
45
22.1
1 2 3 4
BjussuMP-II rec 24,000
B
Resultados 72
Figura 19. Atividade Fibrin(ogen)olítica da BjussuMP-II nativa e recombinante. (A) Atividade proteolítica sobre o fibrinogênio. 1-Fibrinogênio controle (80µg); 2-Fibri + BjussuMP-IIrec (4µg); 3- Fibri + BjussuMP-IIrec (8µg); 4- Fibri + BjussuMP-II nativa (4µg). (B) Atividade proteolítica sobre a fibrina. 1-BjussuMP-II nativa (8µg); 2-BjussuMP-II nativa (4µg); 3 a 8-BjussuMP-II recombinante em concentrações crescentes: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 8,0µg, respectivamente.
Bα β γ
1 2 3 4 A B
Resultados 73
Caracterização Imunoquímica
A BjussuMP-II mostrou-se imunogênica, sendo capaz de induzir a produção de anticorpos
quando injetada em coelhos (Figura 20A).
Os anticorpos produzidos contra a BjussuMP-II foram utilizados em teste de reatividade
cruzada contra esta proteína e contra diferentes proteínas isoladas do veneno de B. jararacussu, a
crotamina do veneno de C. d. terrificus e a neuwiedase do veneno de B. neuwiedi (Figura 20B).
Para a BjussuMP-II foi obtida 100% de reatividade, e as maiores reatividades com as outras
proteínas testadas foram observadas para a neuwiedase e a BjussuMP-I, proteínas de mesma
classe (metaloproteases). A BjussuLAAO-I (L-aminoácido oxidase) apresentou
aproximadamente 20% de reatividade, e a BjussuSP-I (serinoprotease), a BthTX-I e a BthTX-II
(fosfolipases A2) foram menos reativas, enquanto que para a crotamina (neurotoxina) a
imunoreatividade foi praticamente nula.
Resultados 74
Figura 20. Análises imunoquímicas de difusão enzimática e ELISA. (A): Reatividade entre anti-BjussuMP-II produzidos em coelhos por BjussuMP-II (10µg) e 150µg de anti-BjussuMP-II (canaleta central); (B): Reatividade de anti-BjussuMP-I com diferentes proteínas de venenos de serpentes do gênero Bothrops e Crotalus. Os resultados foram expressos pela média ± SD de dois experimentos individuais.
Reatividade Cruzada (%)0 20 40 60 80 100
Control
Crotamine
BjussuLAAO-I
BthTX-II
BthTX-I
BjussuSP-I
BjussuMP-I
Neuwiedase
BjussuMP-II
Reatividade Cruzada (%)0 20 40 60 80 100
Control
Crotamine
BjussuLAAO-I
BthTX-II
BthTX-I
BjussuSP-I
BjussuMP-I
Neuwiedase
BjussuMP-II
0 20 40 60 80 100
Control
Crotamine
BjussuLAAO-I
BthTX-II
BthTX-I
BjussuSP-I
BjussuMP-I
Neuwiedase
BjussuMP-II
B
Tox
inas
isol
adas
Discussão 75
6. DISCUSSÃO
Isolamento e Caracterização Bioquímica da Metaloprotease
As metaloproteases de venenos de serpentes (svMP) podem induzir uma grande variedade
de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos devendo ser melhor estudadas visando a caracterização de
moléculas com alto potencial biotecnológico ou de modelos estruturais a serem utilizados na
clínica-médica.
A BjussuMP-II, metaloprotease de baixo Mr (24.000), foi isolada em dois passos
cromatográficos (CM-Sepharose seguida por Fenil-Sepharose) sendo obtida em alto grau de
pureza e armazenada em quantidade suficiente para a realização dos ensaios funcionais e
estruturais. O alto grau de pureza da proteína foi confirmado por HPLC de fase reversa,
sequenciamento N-terminal e SDS-PAGE. As frações das cromatografias, correspondentes aos
picos que continham a metaloprotease, foram submetidas ao ensaio de atividade fosfolipásica ou
de hemólise indireta (50µg), em concentração 10X maior que a utilizada para os ensaios com
fosfolipases A2 sabidamente ativas, pois o veneno de B. jararacussu possui grandes quantidades
(35-50%) desta classe de enzimas (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; ANDRIÃO-
ESCARSO et al. 2000; 2002; ROBERTO et al., 2004; KASHIMA et al., 2004), para averiguar se
havia contaminação por estas enzimas nas amostras obtidas, constatando-se ausência total de
atividade fosfolipásica.
A BjussuMP-I, metaloprotease hemorrágica de alto Mr (60.000), foi isolada por Mazzi et al.
(2004), desta mesma espécie B. jararacussu, também em duas etapas cromatográficas. No
entanto, a primeira foi em resina de exclusão molecular (Sephacryl S-200), seguida por uma
Fenil-Sepharose, eluída com NaCl (4M), que promoveu a exposição dos grupos de aminoácidos
hidrofóbicos presentes na molécula. Assim a alta afinidade da enzima pela matriz foi observada
Discussão 76
após aplicação de um gradiente decrescente de sal. A neuwiedase, uma metaloprotease de baixa
Mr (20.000) com atividade fibrin(ogen)olítica, foi isolada do veneno da serpente B. neuwiedi
pauloensis em apenas um passo cromatográfico, em coluna de CM-Sepharose (RODRIGUES et
al., 2000), metodologia esta que difere da empregada por Gutiérrez et al. (1995), para o
isolamento da BaP1, outra MP hemorrágica com Mr ~ 24.000 isolada do veneno de B. asper, os
quais utilizaram duas cromatografias, uma troca iônica (CM-Sephadex) seguida por um gel de
filtração (Sephacryl S-200).
Para o isolamento de proteases em geral, metodologias tais como cromatografias de
bioafinidade (ex: utilizando anticorpos) e de interação hidrofóbica demonstram alta seletividade
por esses compostos (GRANET e BERTRAND, 1996). Considerando essa característica, alguns
trabalhos sobre purificação dos princípios hemorrágicos de serpentes do gênero Bothrops, tais
como B. jararaca, B. asper, B. moojeni, B. jararacussu, B. atrox e B. neuwiedi
(MANDELBAUM, ASSAKURA e REICHL, 1984; MARUYAMA et al., 1992; GUTIÉRREZ et
al., 1995; FRANCESCHI et al., 2000; MAZZI et al., 2004) descrevem a utilização de técnicas
baseadas na hidrofobicidade das moléculas.
Borkow e Gutiérrez (1993) utilizaram o princípio hidrofóbico associado com técnicas de
exclusão molecular e troca iônica, para o isolamento de uma metaloprotease hemorrágica de alta
Mr (64.000) do veneno de B. asper. Da espécie B. alternatus, uma MP com Mr de
aproximadamente 55.000, com propriedades fibrinolíticas foi isolada por Souza et al. (2000),
utilizando o mesmo princípio, a hidrofobicidade. Ambos os procedimentos, resultaram na
obtenção de amostras puras e homogêneas.
Discussão 77
Caracterização Funcional e Imunoquímica da Metaloprotease
A estabilidade estrutural e funcional das metaloproteases depende essencialmente de fatores
tais como pH, temperatura, e influência de íons (GOMIS-RUTH e FRANS-XAVER, 1993;
MOURA-da-SILVA et al., 2003; XU et al., 2004). Desta forma, para avaliar a estabilidade
enzimática da BjussuMP-II, foi realizada a atividade fibrinogenolítica incubando a proteína por
30 min em diferentes temperaturas, pHs e na presença de íons e inibidores naturais e artificiais. A
BjussuMP-II mostrou ser uma enzima estável a diferentes valores de pH e temperatura.
Entretanto, a atividade proteolítica da enzima é dependente de metais (principalmente Zn++), e
esta característica foi confirmada pela perda total da atividade fibrinogenolítica após incubação
com EDTA (agente quelante de metais) em diferentes concentrações (2,5-25mM).
Metaloproteases dependentes de metal são fortemente inibidas por quelantes de metais como o
EDTA ou a fenantrolina, e por citrato em menor grau (MACKESSY, 1996; ODELL et al., 1998).
Estudos de dicroísmo circular feitos antes e depois da remoção do metal indicam que estes
agentes induzem um abrupto decréscimo na capacidade de formação de α–hélices
(BJARNASON e FOX, 1994). De fato, mudanças nas estruturas secundária e terciária de
algumas metaloproteases comprometem permanentemente a atividade enzimática (SANCHEZ et
al., 1995).
A BjussuMP-II foi capaz de hidrolisar preferencialmente as cadeias α e β do fibrinogênio,
demonstrando ser uma fibrinogenase do tipo α/β (SWENSON e MARKLAND, 2005). Entre os
fatores envolvidos no equilíbrio hemostático, o fibrinogênio participa diretamente na formação
do coágulo, seja como precursor da fibrina ou como um mediador da adesão entre plaquetas.
Entretanto, concentrações elevadas de fibrinogênio no plasma indicam que o mesmo está
associado com várias doenças vasculares, em especial, a trombose (HANDLEY e HUGHES,
Discussão 78
1997). Agentes trombolíticos podem ser utilizados em terapias, não apenas no controle da síntese
de fibrinogênio, mas também na dissolução de coágulo de fibrina, sendo fundamentais para
estudo e tratamento de doenças cardiovasculares.
A BjussuMP-II mostrou-se proteolítica sobre diferentes substratos como fibrinogênio,
fibrina, colágeno, caseína e gelatina. Os possíveis substratos endógenos de metaloproteases são:
fibrinogênio/fibrina, fibronectina, laminina, nidogênio, colágeno IV, fator de Von Willebrand,
α2-macroglobulina, insulina, glucagon, ocitocina, bradicinina e proteínas de superfície celular
(BJARNASON e FOX, 1994; KAMIGUTI et al., 1996; SAIDI et al., 1999; TERADA et al.,
1999; TRUMMAL et al., 2000).
A atividade fibrinogenolítica de algumas toxinas, inicialmente estudadas por Didisheim e
Lewis (1960), demonstra que esses compostos poderiam ser aplicados na clínica-médica, em
terapias trombolíticas, pois não eram inativados por inibidores no plasma humano. Atualmente, o
estudo da hemostasia utilizando veneno de serpentes tem mostrado que várias proteases isoladas
podem ser úteis também no diagnóstico de distúrbios hemostáticos, como por exemplo, na
elaboração de kits diagnósticos para ensaios de protrombina e ativadores dos fatores V, VII e X
(BRAUD, BON e WISNER, 2000).
O efeito direto de enzimas proteolíticas sobre o fibrinogênio é o tipo de ação mais comum
de proteases do veneno de serpentes. Entretanto a atividade proteolítica sobre fibrina é uma
característica descrita para alguns constituintes isolados do veneno, como por exemplo, aqueles
relatados por Rodrigues et al. (2000), Sánchez et al. (2000) e Mazzi et al. (2007) que
demonstraram esses efeitos com metaloproteases isoladas de Bothrops neuwiedi, Lachesis muta
muta e, B. jararacussu, respectivamente.
Discussão 79
Os estudos realizados quanto às propriedades coagulantes e anticoagulantes das
metaloproteases mostram a especificidade destas enzimas sobre alguns componentes do sangue,
os quais são responsáveis pelo equilíbrio hemostático (GOULD et al., 1990; ESTEVÃO-COSTA
et al., 2000; ANDREWS et al., 2001 e LORÍA et al., 2003). A BjussuMP-II não apresentou
atividades coagulante e anticoagulante porém induziu efeito pró-coagulante que pode ser
parcialmente explicado em virtude da interação da metaloprotease com fatores da cascata de
coagulação, como o fibrinogênio e a fibrina.
A existência de metaloproteases que atuam por diferentes mecanismos sobre a cascata de
coagulação reforça a importância de um estudo mais detalhado da função destas enzimas e o seu
envolvimento direto na degradação do fibrinogênio, fibrina e interação com plaquetas.
A BjussuMP-II induziu inibição de agregação plaquetária, assim como as metaloproteases
desintegrinas de Trimeresurus jerdonii (ZHOU et al., 2004), e a basparin A de B. asper (LORÍA
et al., 2003). A BjussuMP-II inibiu totalmente a agregação plaquetária na presença de ADP ou
colágeno, perdendo a atividade com a adição de EDTA (resultados não apresentados), de forma
semelhante à BjussuMP-I (MAZZI et al., 2007). E em relação aos substratos fibrinogênio e S-
2238, esta proteína não se mostrou ativa, diferindo do efeito induzido pela trombina. Outras
pesquisas com as metaloproteases jararagina e atrolisina E, duas inibidoras de agregação
plaquetária que possuem apenas o domínio desintegrina-símile RGD, demonstram que a
seqüência RGD não é essencial para a indução deste efeito (KAMIGUTI et al., 1996).
A BjussuMP-II demonstrou ser uma metaloprotease da classe P-IB de baixa massa
molecular e não-hemorrágica, enquanto que a BjussuMP-I é uma metaloprotease hemorrágica de
alta massa molecular, pertencente à classe P-III das metaloproteases de venenos de serpentes
(MAZZI et al., 2004; 2007).
Discussão 80
Muitas análises têm sido realizadas para predizer o potencial hemorrágico das
metaloproteases, incluindo alinhamento de seqüências, análise filogenética, comparação de
propriedades físico-químicas e estudos de “motifs”, sugerindo que a região de “loop” entre a 3ª
Histidina (His151) ligante de zinco e Metionina “Met-turn”168 podem ser observadas para o
fenótipo hemorrágico. Análises de estruturas moleculares elucidadas mostraram uma correlação
indireta entre o potencial hemorrágico e a área de superfície molecular polar de metaloproteases
da classe P-I (STÖCKER et al., 1995; RAMOS e SELISTRE-de-ARAÚJO, 2004).
Metaloproteases não hemorrágicas (“in vivo”) e fibrinogenolíticas (“in vitro”), assim
como a BjussuMP-II, podem ser exploradas como possíveis agentes trombolíticos, por prevenir a
formação ou induzir a dissolução de trombos. A fibrolase, uma metaloprotease fibrinogenolítica
de Mr = 23.000 de Agkistrodon contortrix contortrix, foi avaliada em estudos pré-clínicos e
investigações clínicas (MARKLAND et al., 1994; MARKLAND, 1996; SWENSON, BUSH e
MARKLAND, 2000; TOOMBS, 2001; SWENSON et al., 2004; SWENSON e MARKLAND,
2005). A fibrolase e a alfimeprase, sua forma recombinante, são fibrinogenolíticas sobre a cadeia
Aα do fibrinogênio, e em estudos farmacológicos in vivo comprovou-se que a trombólise na
presença da alfimeprase ocorre 6 vezes mais rápida do que com ativadores de plasminogênio.
Adicionalmente, esta enzima é inativada por α2-macroglobulina diminuindo o risco de
complicações hemorrágicas e efeitos adversos observados com ativadores de plasminogênio
(TOOMBS, 2001).
A BjussuMP-II não induziu miotoxicidade, resultado este condizente com a literatura, que
associa o efeito miotóxico induzido pelo veneno bruto de B. jararacussu principalmente à
presença de fosfolipases A2 (SOARES e GILGIO, 2003), com menor participação de outras
classes de metaloproteases. O efeito de miotoxicidade produzido pelo veneno de várias serpentes,
Discussão 81
incluindo o gênero Bothrops, podem ser evidenciados através da liberação in vitro de creatina
cinase muscular. Calil-Elias, Martinez e Melo (2002) demonstraram que a administração de doses
crescente do veneno de B. jararacussu por via intramuscular foi capaz de induzir miotoxicidade
com um aumento proporcional de CK plasmática. Nikai et al. (1985), Ownby, Colberg e Li
(1994) e Franceschi et al. (2000), observaram que as toxinas hemorrágicas são capazes de
produzir lesão tecidual e mionecrose.
A BjussuMP-II apresentou atividade citotóxica sobre diferentes linhagens de células
tumorais, porém seu maior efeito foi observado sobre células procedentes de tumores humanos
(SK-BR-3, EAT e JURKAT), sendo menor a citotoxicidade da proteína sobre as células da
linhagem B16F10 de melanoma murínico, sugerindo algum tipo de especificidade que deve ser
futuramente explorada para o melhor entendimento dos mecanismos de ação antitumoral desta
proteína. Mecanismos de apoptose têm sido sugeridos para explicar o efeito citotóxico de
metaloproteases, assim como possíveis interações com receptores de membrana específicos ainda
não identificados (FOX e SERRANO, 2005).
A possível toxicidade local e sistêmica da BjussuMP-II foi avaliada por análises
histopatológicas dos diferentes tecidos (renal, pulmonar, cardíaco, esplênico, cerebral e
muscular). Os animais que receberam injeção (i.m.) da BjussuMP-II (250µg) no músculo
gastrocnêmio demonstraram infiltrados inflamatórios focais (com neutrofilia) e necrose leve,
quando comparada a severa ação miotóxica do veneno bruto de B. jararacussu (20µg) e PLA2
(25µg) isolada (resultados não apresentados). Os ensaios de dosagem de creatina cinase no
plasma, realizados com material coletado 3h após a injeção da protease (250µg), também não
resultaram em aumento significativo nos níveis de CK. Observou-se também uma leve
hemorragia no tecido pulmonar (congestão difusa), sugerindo que, possivelmente, a BjussuMP-II
não sofra a ação de inibidores endógenos de proteases. Para os outros tecidos viscerais (cerebral,
Discussão 82
renal, esplênico, e muscular cardíaco) não houve alterações significativas, quando comparados
aos controles.
Notadamente, e conforme esperado, os tecidos esplênico, cerebral e cardíaco não
apresentam alterações consideráveis, uma vez que a metaloprotease em questão mostrou-se até o
presente momento uma proteína com atividades farmacológicas, não tóxicas, em experimentos in
vivo e in vitro. É necessário destacar a via de administração, uma vez que a via intramuscular
tende a priorizar efeitos locais da proteína. Tendo em vista que a BjussuMP-II agiu
predominantemente no local da injeção (músculo estriado esquelético), pode-se justificar que os
focos de infiltrados inflamatórios juntamente com neutrofilia são resultantes de inflamação
acompanhada de necrose. As análises destas atividades demonstraram que esta enzima é
fracamente miotóxica, sendo necessárias altas doses para se visualizar este efeito tóxico.
Diferentemente da BjussuMP-II, as análises histopatológicas de tecido muscular após
injeção de Neuwiedase, uma metaloprotease não-hemorrágica da classe P-I, resultaram em
proeminente mionecrose, com infiltrados inflamatórios de leucócitos polimorfonucleares além de
um significante aumento nos níveis de CK. Experimentos utilizando a neuwiedase demonstram a
formação de edema sem a indução de hemorragia sugerindo mecanismos de degradação
proteolítica de componentes de membrana basal, que induziriam a exsudação do plasma sem
causar colapso na estrutura dos microvasos e a liberação de mediadores farmacológicos
(RODRIGUES et al., 2001).
A BjussuMP-II não se mostrou letal. Entretanto, a neuwiedase apresentou uma DL50 de
5µg/g contra 0,47µg/g obtida para o veneno bruto de B. neuwiedi, além de induzir hemorragia
nos pulmões evidenciada pela presença de abundantes eritrócitos nos espaços alveolares em
tecido pulmonar, observado em análises histopatológicas, após injeção da metaloprotease,
(RODRIGUES et al., 2001). Semelhante aos resultados obtidos para a BjussuMP-II, a
Discussão 83
neuwiedase também não induziu alterações nos demais tecidos analisados (cardíaco, esplênico,
renal, cerebral e hepático), porém, foi observada hemorragia pulmonar quando injetada por via
endovenosa.
A BjussuMP-II mostrou ser antigênica, e estes anticorpos policlonais foram capazes de
reconhecer outras proteínas além da BjussuMP-II, havendo maior reatividade cruzada com as
metaloproteases neuwiedase (classe P-IB) e BjussuMP-I (classe P-III) (RODRIGUES et al.,
2000; MAZZI et al., 2004). A serinoprotease BjussuSP-I e as PLA2s BthTX-I e BthTX-II
isoladas do mesmo veneno de B. jararacussu, foram fracamente reconhecidas pelos anticorpos,
enquanto que a crotamina de Crotalus d. terrificus não apresentou nenhuma reatividade.
Diferentemente, somente a LAAO do veneno de B. jararacussu, a BjussuLAAO-I, mostrou
reatividade cruzada mais significativa (~20%). Aparentemente, esta é uma das proteínas que
exibe epítopo hábil em assumir a conformação reconhecida pelo anticorpo, uma vez que está
comprovada a não participação de seqüências homólogas no processo de reatividade cruzada,
mas sim a presença de epítopos específicos (STÁBELI et al., 2005). Mazzi et al. (2004)
demonstraram que os anticorpos anti-neuwiedase (metaloprotease de B. neuwiedi), reconhecem
parcialmente a BjussuMP-I e também proteínas de venenos de diferentes espécies de serpentes
(Crotalus atrox, B alternatus, B. jararaca, B. jararacussu, B. asper e B. moojeni).
Caracterização Estrutural da Metaloprotease
A seqüência de aminoácidos da BjussuMP-II mostrou alta similaridade estrutural com
outras metaloproteases de serpentes, agrupando-a na classe P-I. Apresentou também a região
ligante de Zn++ conservada como em todas as metaloproteases, no caso da BjussuMP-II
correspondente a seqüência HELGHNLGMEH. Adicionalmente, a estrutura da BjussuMP-II
apresenta as histidinas catalíticas (His141, His145 e His151). Certamente, as histidinas catalíticas
Discussão 84
do modelo teórico final da BjussuMP-II, assim como em outras metaloproteases (MAZZI et al.,
2007), sustentam o anel imidazol em uma posição favorável para coordenar o íon zinco que é
cofator essencial para a atividade catalítica da enzima (Figura 15A e B). De igual forma, o
resíduo Glu143 apresenta uma boa proximidade para as histidinas catalíticas (Figura 16). Este
resíduo de aminoácido Glu143 polariza a molécula de água catalítica, que é responsável pelo
ataque nucleofílico sobre o carbono carbonil da ligação do peptídeo de quebra no substrato
(MATTHEWS, 1988; HUANG et al., 2002).
As metaloproteases são usualmente mais ativas e solúveis em pHs que se estendem de
neutro a básico (MANNING, 1995; XU et al., 2004). Acutolysin A (metaloprotease da classe P-I
de Agkistrodon acutus), por exemplo, apresenta decréscimo na atividade proteolítica em pHs 7,5
a 5,0 (ZHU et al., 1997). Este fato pode estar relacionado a uma queda na polarização do resíduo
de glutamina e no estado de protonação do resíduo de Histidina no sítio ativo, podendo conduzir
a um aumento na interação entre o zinco catalítico e a molécula de água.
A análise estrutural de proteínas permite compreender a estrutura e a função biológica
destes compostos, uma vez que estes assumem estruturas tridimensionais constituídas por
diferentes domínios funcionais. Contudo, para compreender os mecanismos envolvidos com a
função biológica de cada proteína, é necessário, na maioria das vezes o emprego de métodos que
permitem não somente a quantificação, determinação do grau de pureza da amostra e a estrutura
parcial da molécula, mas também técnicas como a de sequenciamento automático de
aminoácidos, a tecnologia do DNA recombinante e técnicas cristalográficas e
espectrofotométricas (SHIVELY, PAXTON e LEE, 1989).
Peculiaridades estruturais são observadas com as diferentes classes de metaloproteases da
peçonha de serpentes. Para a classe P-I, por exemplo, a presença de ligações dissulfeto no
Discussão 85
domínio metaloprotease sugere a especificidade das enzimas por diferentes substratos (FOX e
SERRANO, 2005).
A análise da seqüência de ácidos nucléicos que codificam para as metaloproteases de
venenos de serpentes indica que elas são sintetizadas e armazenadas in vivo como zimogênios
inativos (BJARNSON e FOX, 1994; SELISTRE-de-ARAÚJO e OWNBY, 1995; OWNBY,
COLBERG e LI, 1994; KINI, 1996). Essa propriedade possivelmente é regulada pela seqüência
PKMCGVT, conservada em todas as metaloproteases, estando localizada entre a seqüência sinal
e o domínio catalítico da BjussuMP-II. A ativação da pró-enzima ocorre por um mecanismo
“cysteine-switch”, proposto para metaloproteases de matriz (GRAMS et al., 1993).
A conservação de sete resíduos de cisteína (Cys), nas posições (106, 125, 171, 314, 354,
356 e 361) do domínio metaloprotease, juntamente com a disposição das ligações dissulfeto no
domínio metaloprotease, podem contribuir para que ocorra a autólise da enzima (FOX e
SERRANO, 2005). A BjussuMP-II apresenta apenas cinco resíduos de cisteína (Cys116-Cys196,
Cys156-Cys180 e Cys158-Cys163), sugerindo uma baixa probabilidade para a ocorrência de
autólises e, adicionalmente, foi observado para esta proteína alta estabilidade e manutenção da
cadeia principal mesmo quando estocada durante meses após ter sido solubilizada em PBS.
A BjussuMP-II recombinante foi expressa de forma insolúvel e inativa nos corpos de
inclusão localizados no citoplasma da célula hospedeira (E. coli linhagem BL21(DE3)pLysS),
sendo que, a proteína recombinante foi purificada em cromatografia de troca aniônica e
redobrada para recuperar sua forma nativa. A BjussuMP-IIrec apresentou a mesma massa
molecular da proteína nativa, em SDS-PAGE, (Figura 18) e atividade proteolítica sobre o
fibrinogênio e fibrina (Fig. 19).
Embora se tenha uma grande quantidade de informações sobre clonagem e análises de
seqüências de MPs, poucos artigos relatam a produção destas enzimas recombinantes com
Discussão 86
atividade enzimática. O alto número de resíduos de cisteínas encontrados em desintegrinas com
domínio rico em cisteínas é um fator limitante para a produção destas proteínas em sistemas
simples como as bactérias. Alguns grupos têm expressado com sucesso RGD-desintegrinas ativas
em E. coli (FERNANDEZ et al., 2005) e células de mamíferos (ZHOU et al., 2000).
A presença de resíduos de cisteína no “motif” de proteínas desintegrina-símile, como na
jararhagin-C, por exemplo, é um fator limitante para a produção da proteína ativa (PAINE et al.,
1992; SELISTRE-de-ARAÚJO, SOUZA e OWNBY, 1997), sabendo-se que bactérias não
produzem eficientemente pontes de dissulfeto e ligações ao acaso são provavelmente formadas
durante o processo de isolamento e enovelamento in vitro da proteína recombinante. Por causa
destas dificuldades, poucos grupos têm produzido metaloproteases recombinantes ativas em
bactérias (MOURA-da-SILVA et al., 1999) e sistemas eucarióticos como células de rim
embriônico humano (SHIMOKAWA et al., 1996; JIA et al., 1997). Entretanto, o domínio
catalítico de ACLF, uma metaloprotease fibrinolítica e não hemorrágica, do veneno de
Agkistrodon contortrix laticinctus, foi produzida em sistema bacteriano, na forma ativa
(SELISTRE-de-ARAÚJO et al., 2000; RAMOS, CARMONA, SELISTRE-de-ARAUJO, 2003).
Nestes dois casos a proteína foi produzida em corpos de inclusão insolúveis, purificada em
condições desnaturantes e enovelada in vitro após remoção gradativa do agente desnaturante.
Para alcançar a forma ativa, a pró-enzima foi incubada em temperatura ambiente para permitir
uma autólise limitada ocorrendo a clivagem do pró-domínio. A enzima foi ativa em degradar as
cadeias α e β do fibrinogênio (RAMOS, CARMONA, SELISTRE-de-ARAUJO, 2003). O
domínio catalítico da jararhagin de B. jararaca foi também produzido em E. coli na forma ativa,
usando o mesmo protocolo (GARCÍA et al., 2004) e a pro-atrolysin E recombinante de C. atrox
foi produzida em células de inseto (SHIMOKAWA et al., 1996).
Discussão 87
Além das aplicações clínicas, estas enzimas podem ser usadas como ferramentas
bioquímicas em estudos moleculares na indústria biotecnológica (convertendo intermediários por
clivagem de ligações peptídicas específicas), estudos de mecanismo de ação de venenos,
desenhos de inibidores de metaloproteases e melhor compreensão de características das
metaloproteases.
Atualmente, um enfoque mais específico desses compostos mostra que algumas respostas
celulares complexas podem ser compreendidas. Em virtude da especificidade que as toxinas
hemorrágicas de serpentes possuem sobre vários receptores celulares, diversas áreas
multidisciplinares são estimuladas para se estudar estas enzimas. Clinicamente, algumas toxinas
são utilizadas em terapias trombogênicas. Assim, na biotecnologia, por exemplo, sugerem novas
aplicações e fornecem modelos estruturais para o desenvolvimento de substâncias com potencial
farmacêutico.
As atividades α e β-fibrinogenolíticas têm provado ser eficiente em dissolver coágulos em
artéria femoral apenas com uma simples administração intravenosa, sem efeitos adversos sobre a
pressão sanguínea ou o coração do rato (SWENSON e MARKLAND, 2005). Em comparação
com a estreptocinase, amplamente usada como agente trombolítico, pequenas metaloproteases
não hemorrágicas e fibrinogenolíticas apresentam vantagens promissoras para serem usadas em
trombólises: seu pequeno tamanho (uma baixa resposta imune é esperada) e o fato de não serem
afetadas por inibidores de serinoproteases do sangue. Desta forma os resultados obtidos para a
BjussuMP-II justificam-se, uma vez que esta proteína de baixo peso molecular induziu uma baixa
toxicidade, além de mostrar-se fibrin(ogen)olítica, não hemorrágica e resistente à ação de
inibidores de serinoproteases (benzamidina e PMSF), conforme descrito para outras
metaloproteases semelhantes.
Discussão 88
Através da dinâmica molecular foi comprovado que a BjussuMP-II é uma metaloprotease
da classe P-I (svMP) destituída de atividade hemorrágica, em contraste com a BjussuMP-I
também isolada do veneno da mesma espécie, que pertence a classe P-III e induz hemorragia
(MAZZI et al., 2004; 2007). De acordo com alguns autores, o distinto potencial de indução da
atividade hemorrágica em svMPs pode ser relatado pela presença dos domínios desintegrina-
símile e rico em cisteína no grupo P-III. Estes domínios extras poderiam contribuir para o
aumento deste efeito patológico por reconhecimento de diferentes substratos presentes em
capilares e lâmina basal, além de participar no efeito de inibição de agregação plaquetária
(MATTHEWS, 1988; KAMIGUTI et al., 1996; JIA et al., 1997; JEON and KIM, 1999;
MOURA-da-SILVA et al., 1999; JIA et al., 2000). Embora o alinhamento entre essas duas
seqüências mostre diferenças em suas estruturas primárias, o segmento que compreende os
primeiros 105 resíduos de aminoácidos da BjussuMP-I e MP-II exibem uma distinta composição
em aminoácidos, considerando que os últimos 95 resíduos de ambas as proteínas são idênticos.
Com base nas análises descritas, é possível que a diferença na estrutura primária de ambas as
proteínas também seja um importante fator de ausência da atividade hemorrágica na BjussuMP-
II.
Finalmente, devido a ausência de uma estrutura experimental de BjussuMP-II, um modelo
teórico foi construído usando técnicas computacionais, ordenando alguns critérios adicionais
dentro das propriedades estruturais/funcionais desta proteína.
A estrutura da BaP1 (metaloprotease de B. asper) (WATANABE et al., 2003) foi
selecionada como padrão para a construção do modelo inicial devido à alta similaridade com a
BjussuMP-II (81%) e o “score” (417.0) atribuído pelo programa HHpred (SÖDING, BIEGERT e
LUPAS, 2005) para o alinhamento destas duas seqüências. A análise do modelo final da
BjussuMP-II mostrou que este é similar ao domínio catalítico do modelo teórico da BjussuMP-I e
Discussão 89
outras estruturas experimentais de domínios catalíticos já descritas (HUANG et al., 2002;
MAZZI et al., 2007).
Entretanto, a comparação entre domínios catalíticos da BjussuMP-I e BjussuMP-II mostra
que a ausência de domínios extras não é o único fator responsável pela falta de atividade
hemorrágica na BjussuMP-II. Em relação ao alto grau de identidade destas duas metaloproteases
(81%), a superposição de seus átomos de Cα mostra um r.m.s.d. (“root mean square deviation” –
desvio médio quadrático) de aproximadamente 2.3 Å, indicando uma importante modificação
conformacional da BjussuMP-II. Adicionalmente, a análise do r.m.s.f. (“root mean square
flutuation”) dos modelos da BjussuMP-I e BjussuMP-II indica uma região que compreende o
segmento entre os resíduos 153 e 176 que são mais flexíveis no domínio catalítico da BjussuMP-
II do que na BjussuMP-I. Este conjunto de resíduos é parte de um extenso loop localizado entre
as hélices h4 e h5 (Figura 15B) e, de acordo com Watanabe et al. (2003), possui um provável
papel estrutural na atividade hemorrágica de algumas metaloproteases de venenos. Foi
demonstrado que a BaP1 hemorrágica de Bothrops asper e acutolisina A de Agkistrodon acutus
apresentam uma grande similaridade estrutural em suas regiões em comparação com a H2-
proteinase de Trimeressurus flavoviridis, que é destituída de atividade hemorrágica
(WATANABE et al., 2003).
Curiosamente, o loop que inclui a região 153-176 no modelo da BjussuMP-II e corresponde
aos mesmos resíduos em outras cinco metaloproteases de venenos, apresenta duas pontes
dissulfeto (KUMASAKA et al., 1996; GONG et al., 1998; ZHU et al., 1999; WATANABE et al.,
2003; LOU et al., 2005; MAZZI et al., 2007). Esta informação indica que a estabilidade estrutural
desta região pode ser importante para as atividades induzidas por estas proteínas. Deste modo o
alto grau de flexibilidade da região 153-176 no modelo da BjussuMP-II pode determinar a
Discussão 90
ausência de atividade hemorrágica, bloqueando a ligação da molécula a componentes particulares
presentes em microvasos e/ou o acesso de substratos específicos para o sítio de atividade desta
metaloprotease.
Além disso, para identificar possíveis resíduos conservados presentes em metaloproteases
foram analisadas as seqüências de três metaloproteases hemorrágicas, BjussuMP-I, acutolisinas A
e C e três moléculas não hemorrágicas BjussuMP-II, H2-proteinase e metaloprotease FII
(KUMASAKA et al., 1996; GONG et al., 1998; ZHU et al., 1999; LOU et al., 2005; MAZZI et
al., 2007).
O resultado demonstrou cinco resíduos de aminoácidos polares e hidrofílicos na superfície
das metaloproteases hemorrágicas (Ser59, Asp84, Arg88, Cys196 e Asn199) enquanto que as
moléculas não hemorrágicas possuem somente dois resíduos conservados em sua superfície,
sendo um hidrofílico (Lys61) e outro hidrofóbico (Leu63) (Figuras 16A e B). Em adição, a
conservação de um maior número de resíduos polares de superfície em metaloproteases
hemorrágicas sugere que estes resíduos poderiam ser mais um fator no direcionamento destas
moléculas para seus alvos específicos. Conseqüentemente, é possível propor que a falta de
atividade hemorrágica na BjussuMP-II e outras metaloproteases de venenos de serpentes é
causada por um alto grau de flexibilidade da região 153-175 e a ausência de resíduos de
superfície conservados com características químicas específicas.
A presença de histidinas na região ligante de Zn++, que se mostram conservadas nas
metaloproteases, é essencial para a estabilidade do sítio ativo da molécula e também para a
atividade proteolítica e hemorrágica da enzima (BJARNASON e FOX, 1994; MAZZI et al.,
2004; 2007). Conseqüentemente, a comparação entre o modelo teórico da BjussuMP-II e outras
metaloproteases de venenos de serpentes foi utilizada para obter e embasar algumas idéias dentro
das prováveis justificativas relatadas para a atividade hemorrágica ou supressão desta neste grupo
Discussão 91
de proteínas. Futuros estudos bioquímicos e estruturais poderão auxiliar na confirmação de
hipóteses baseadas na relação estrutura-função das MPs, e fornecer, também, informações
relevantes para o desenvolvimento de drogas e produtos biotecnológicos utilizados no tratamento
de desordens da coagulação.
Conclusão 92
7. CONCLUSÃO
As informações sobre a estrutura e função destas proteínas dependentes de metais poderão
auxiliar na melhor compreensão dos processos fisiopatológicos induzidos por estas enzimas, que
participam direta ou indiretamente em diversos efeitos tóxicos e farmacológicos resultantes dos
envenenamentos ofídicos. A utilização de proteínas isoladas de venenos animais, assim como
proteínas recombinantes, ou peptídeos sintéticos, estão se tornando cada vez mais freqüentes
entre os grupos de pesquisas e as indústrias. Adicionalmente, as interações com íons, agentes
quelantes e inibidores naturais e artificiais poderão resultar também, em informações relevantes
sobre os mecanismos de ação destas proteases e seu papel específico nos envenenamentos
ofídicos, assim como sua possível utilização na elaboração de futuros fármacos, uma vez que
estas proteínas podem apresentar atividades como antitumoral, bactericida e trombolítica. Desta
forma o isolamento e uma ampla caracterização estrutural, funcional e inibitória poderão
direcionar discussões e questionamentos para o prosseguimento de novos estudos sobre as
metaloproteases de venenos de serpentes e suas possíveis aplicações terapêuticas.
Referências 93
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVARADO, J.; GUTIÉRREZ, J.M. Anticoagulant effect of myotoxic phospholipase A2
isolated from the venom of the snake Bothrops asper (Viperidae). Biol. Trop., v. 36, p. 563-564,
1988.
ANDREINI, C.; BANCI, L.; BERTINI, I.; ROSATO, A. Counting the zinc-proteins encoded in
the human genome. J. Proteome, v. 5, p. 196-201, 2006.
ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; SOARES, A. M.; RODRIGUES, V. M.; ANGULO, Y.; DIAZ, C.;
LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J. M.; GIGLIO, J. R. Myotoxic phospholipases A2 in Bothrops
snake venoms: effect of chemical modifications on the enzymatic and pharmacological properties
of bothropstoxins from Bothrops jararacussu. Biochimie, v. 82, p. 755-63, 2000.
ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; SOARES, A. M.; FONTES, M. R. M.; FULY, A. L.; CORRÊA,
F. M. A.; ROSA, J. C.; GREENE, L. J.; GIGLIO, J. R. Structural and functional characterization
of an acidic platelet aggregation inhibitor and hypotensive phospholipase A2 from Bothrops
jararacussu snake venom. Biochem. Pharmacol., v. 7359, p. 1-10, 2002.
ANDREWS, R.K.; KAMIGUTI, A.S.; BERLANGA, O.; LEDUC, M.; THEAKSTON, R.D.;
WATSON, S.P. The use of snake venom toxins as tools to study platelet receptors for collagen
and von Willebrand factor. Haemostasis, v. 31, p. 155-172, 2001.
ASSAKURA, M. T.; SILVA, C. A.; MENTELE, R.; CAMARGO, A. C. M.; SERRANO, S. M.
T. Molecular cloning and expression of structural domains of bothropasin, a P-III
metalloproteinase from the venom of Bothrops jararaca. Toxicon, v. 41, p. 217-227, 2003.
BERENDSEN, J.P.M.; VAN GUNSTEREN, POSTMA.; HERMANS, W.F.J. Interaction models
for water in relation to protein hydration. In: B. Pullman (Ed.) Intermolecular Forces, D. Reidel
Publishing Company: Dordrecht, P. 331-342, 1981.
Referências 94
BERENDSEN, H.J. Bio-molecular dynamics comes of age. Science, v. 271, p. 954-955, 1996.
BERENDSEN, H.J.; VAN GUNSTEREN, W.F.; ZWINDERMAN, H.R.; GEURTSEN, R.G.
Simulations of proteins in water. Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 482, p. 269-286, 1986.
BERENDSEN, H.J. Bioinformatics. Reality simulation observe while it happens. Science, v.
294, p. 2304-2305, 2001.
BJARNASON, J. B.; HAMILTON, D.; FOX, J. W. Studies on the mechanism of hemorrhage
production by five proteolytic hemorrhagic toxins from Crotalus atrox venom. Biol. Chem.
Hoppe. Seyler., p. 121-129, 1988.
BJARNASON, J. B.; FOX, J. W. Hemorrhagic metalloproteinases from snake venoms.
Pharmacol. Ther., v. 62, p. 325-72, 1994.
BRAUD, S.; BON, C.; WISNER, A. Snake venom proteins acting on hemostasis.
Biochimie, v. 82, p. 851-859, 2000.
BOCHNER, R.; STRUCHINER, C. J. Snake bite epidemiology in the last 100 years in Brazil: a
review. Cad. Saúde Pública, v. 19, p. 7-16, 2003.
BORKOW, G.; GUTIÉRREZ, J. M. Isolation and characterization of synergistic hemorrhagins
from the venom of the snake Bothrops asper. Toxicon, v. 31, p. 1137-1150, 1993.
CHEN, R.; JIN, Y.; WU, J.; ZHOU, X.; LU, Q.; WANG, W.; XIONG, Y. A new protein
structure of P-II class snake venom metalloproteinases: it comprises metalloproteinase and
disintegrin domains. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 310, p. 182-187, 2003.
CALIL-ELIAS, S.; MARTINEZ, A.M.; MELO, P.A. Effect of heparin and antivenom on skeletal
muscle damage produced by Bothrops jararacussu venom. Histol. Histopathol., v. 17, p. 463-
470, 2002.
Referências 95
CHEN, R.; JIN, Y.; WU, J.; ZHOU, X.; LI, D.; LU, Q.; WANG, W.; XIONG, Y. A novel high
molecular weight metalloproteinase cleaves fragment F1 of activated human prothrombin.
Toxicon, v. 44, p. 281-287, 2004.
COHEN, S.N.; CHANG, A.C.; HSU, L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria:
genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 69, p.
2110-2114, 1972.
COMINETTI, M. R.; RIBEIRO, J. U.; FOX, J. W.; SELISTRE-de-ARAÚJO, H. S. BaG, a new
dimeric metalloprotease/desintegrin from Bothrops alternatus that interacts with α5 β1 integrin.
Arch. Biochem. Biophys., v. 416, p. 171-179, 2003.
COSTA, E. P.; SANTOS, M. F. Jararhagin, a snake venom metalloproteinase-disintegrin,
stimulates epithelial cell migration in an in vitro restitution model. Toxicon, v. 44, p. 861-870,
2004.
DAOUD, E.; TU, A. T.; ELASMAR, M. F. Isolation and characterization of anticoagulant
proteinase cerastase F-4, from Cerastes cerastes (Egyptian Sand Viper) venom. Thromb. Res.,
v. 42, p. 52-58, 1986.
DAVIS, B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N.
Y. Acad. Sci., v. 28, p. 404-427, 1964.
DELANO, W.L. Unraveling hot spots in binding interfaces: progress and challenges. Curr.
Opin. Struct. Biol., v. 12, p. 14-20, 2002. http://www.pymol.org.
DIAZ, C.; VALVERDE, L.; BRENES, O.; RUCAVADO, A.; GUTIÉRREZ, J.M.
Characterization of events associated with apoptosis/anoikis induced by snake venom
metalloproteinase BaP1 on human endothelial cells. J. Cell. Biochem., v. 94, p. 520-528, 2005.
Referências 96
DUNN, R. D.; BROADY, K. W. Snake inhibitors of phospholipase A2 enzymes.
Biochim. Biophys. Acta, v. 1533, p. 29-37, 2001.
EDGAR, W.; PRENTICE, C. R. M. The proteolytic action of ancrod on human fibrinogen and its
polypeptide chains. Thromb. Res., v. 2, p. 85-95, 1973.
EHRENPREIS, S.; SCHERAGA, H. A. Observations on analysis for thrombin and the
inactivation of fibrin monomer. J. Biol. Chem., v. 227, p. 1043-1061, 1957.
ESCALANTE, T.; NÚNEZ, A.; MOURA DA SILVA, A. M.; RUCAVADO, A.; THEAKSTON,
R. D. G.; GUTIÉRREZ, J. M. Pulmonary hemorrhage induced by jararhagin, a metalloproteinase
from Bothrops jararaca snake venom. Toxicol. Appl. Pharmacol., v. 193, p. 17-28, 2003.
ESTEVÃO-COSTA, M. I.; DINIZ, C. R.; MAGALHÃES, A.; MARKLAND, F. S.; SANCHEZ,
E. F. Action of metalloproteinases mutalysin I and II on several components of the hemostatic
and fibrinolytic systems. Thromb. Res., v. 99, p. 363-376, 2000.
FERNANDEZ, J.H.; SILVA, C.A.; ASSAKURA, M.T.; CAMARGO, A.C.; SERRANO, S.M.
Molecular cloning, functional expression, and molecular modeling of bothrostatin, a new highly
active disintegrin from Bothrops jararaca venom. Biochem. Biophys., v. 329, p. 457-464, 2005.
FRANÇA, F.O.S.; FAN, H.W. Plantas venenosas e animais peçonhentos. (Schvartsman, S.)
Sarvier, 1992.
FRANCESCHI, A.; RUCAVADO, A.; MORA, N.; GUTIÉRREZ, J. M. Purification and
characterization of BaH4, a hemorrhagic metalloproteinase from the venom of the snake
Bothrops asper. Toxicon, v. 38, p. 63-77, 2000.
FRANCESCHI, A.; RUCAVADO, A.; MORA, N.; GUTIÉRREZ, J.M. Purification and
characterization of BaH4, a hemorrhagic metalloproteinase from the venom of the snake
Bothrops asper. Toxicon, v. 38, p. 63-77, 2000.
Referências 97
FOX, W. J.; SERRANO, S. M. T. Structural considerations of the snake venom metalloproteases,
key members of the M 12 reprolysin family of metalloproteases. Toxicon, v. 45, p. 969-985,
2005.
GARCÍA, L. T.; PARREIRAS E SILVA, L. T.; RAMOS, O. H. P.; CARMONA, A. K.;
BERSANETTI, P. A.; SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S. The effect of post-translational
modifications on the hemorrhagic activity of snake venom metalloproteinases. Comp. Biochem.
Physiol., v. 138C, p.23-32, 2004.
GASMI, A.; SRAIRI, N.; KAROUI, H.; EL AYEB, M. Amino acid sequence of VlF:
identification in the C-terminal domain of residues common to non-hemorrhagic
metalloproteinases from snake venoms. Biochim. Biophys. Acta, v. 1481, p. 209-212, 2000.
GOMIS-RUTH, F. X.; KRESS, L. F.; BODE, W. First structure of a snake venom
metalloproteinase: a prototype for matrix metalloproteinases/collagenases. EMBO J., v. 12, p.
4151-4157, 1993.
GOULD, R.J.; POLOKOFF, M.A.; FRIEDMAN, P.A.; HUANG, T.F.; HOLT, J.C.; COOK, J.J.;
NIEWIAROWSKI, S. Disintegrins: a family of integrin inhibitory proteins from viper venoms.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 195, p. 168-171, 1990.
GONG, W.; ZHU, X.; LIU, S.; TENG, M.; NIU, L. Crystal structures of acutolysin A, a three-
disulfide hemorrhagic zinc metalloproteinase from the snake venom of Agkistrodon acutus. J.
Mol. Biol., v. 283, p. 657-668, 1998.
GRAMS, F.; HUBER, R.; KRESS, L.F.; MORODER, L.; BODE, W. Activation of snake venom
metalloproteinases by a cysteine switch-like mechanism, FEBS Lett., v. 335, p. 76-80, 1993.
GRANET-I.; BERTRAND, O. Separation of proteases: old and new approaches. J.
Chromatography, v. 684B, p. 239-266, 1996.
Referências 98
GUTIÉRREZ, J. M. Clinical toxicology of snake bite in central america. In: Clinical Toxicology
of Animal Venoms and Poisons (Meir, J. e White, J. Eds). Florida: CRC Press, 1995.
GUTIÉRREZ, J. M.; ROMERO, M.; DIAZ, C.; BORKOW, G.; OVADIA, C. Isolation and
characterization of a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity from the venom of the
snake Bothrops asper (terciopelo). Toxicon, v. 33, p. 19-29, 1995.
GUTIÉRREZ, J.M.; ROMERO, M.; DIAZ, C.; BORKOW, G.; OVADIA, M. Isolation and
characterization of a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity from the venom of the
snake Bothrops asper (terciopelo). Toxicon, v. 33, p. 19-29, 1995.
GUTIÉRREZ, J.M.; RUCAVADO, A. Snake venom metalloproteinases: their role in the
pathogenesis of local tissue damage. Biochimie, v. 82, p. 841-850, 2000.
GUTIÉRREZ, J.M.; AVILA, C.; ROJAS, E.; CERDAS, L. An alternative in vitro method for
testing the potency of the polyvalent antivenom produced in Costa Rica. Toxicon, v. 26, p. 411-
413, 1988.
GUTIÉRREZ, J. M. Understanding snake venoms: 50 years of research in Latin America.
Rev. Biol. Trop., v. 50, p. 377-394, 2002.
GUTIÉRREZ, J.M.; RUCAVADO, A.; ESCALANTE, T.; DIAZ, C. Hemorrhage induced by
snake venom metalloproteinases: biochemical and biophysical mechanisms involved in
microvessel damage. Toxicon, v. 45, p. 997-1011, 2005.
HANDLEY, D.A.; HUGHES, T.E. Pharmacological approaches and strategies for therapeutic
modulation of fibrinogen. Thromb., v. 87, p. 1-36, 1997.
HANAHAN, D. DNA cloning. A pratical approch., D.M. Glover, Edit. IRL, Press Oxford, v. 1,
p. 109-135, 1985.
Referências 99
HONSI-BRANDEBURGO, M. I.; QUEIROZ, L. S.; SANTO-NETO, H.; RODRIGUES-
SIMIONI, L.; GIGLIO, J. R. Fractionation of Bothrops jararacussu snake venom: partial
chemical characterization and biological activity of bothropstoxin. Toxicon, v. 26, p. 615-27,
1988.
HOWES, J.M.; KAMIGUTI, A.S.; THEAKSTON, R.D.; WILKINSON, M.C.; LAING, G.D.
Effects of three novel metalloproteinases from the venom of the West African saw-scaled viper,
Echis ocellatus on blood coagulation and platelets. Biochim. Biophys., v. 1724, p. 194-202,
2005.
HUANG, K.F.; CHIOU, S.H.; KO, T.P.; YUANN, J.M.; WANG, A.H. The 1.35 A structure of
cadmium-substituted TM-3, a snake-venom metalloproteinase from Taiwan habu: elucidation of
a TNFalpha-converting enzyme-like active-site structure with a distorted octahedral geometry of
cadmium. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., v. 58, p. 1118-1128, 2002.
ITZHAKI, R. F.; GILL, D. M. A microbiuret method for estimating proteins. Anal. Biochem., v.
9, p. 401-410, 1964.
IWANAGA, S.; SUZUKI, T. Enzymes in snake venoms. In: Handbook of Experimental
Pharmacology, v. 52, p. 61-158, 1979.
INNIS, C.A.; SHI, J.; BLUNDELL, T.L. Evolutionary trace analysis of TGF-ß and related
growth factors: implications for site-directed mutagenesis. Protein Eng., v. 13, p. 839-847, 2000.
JIANG, W.; BOND, J. S. Families of metalloendopeptidases and their relationships.
FEBS Lett., v. 312, p. 110-114, 1992.
JIA, L.G.; WANG, X.M.; SHANNOM, J.D.; BJARNASON, J.B.; FOX, J.W. Function of
disintegrin-like/cysteine-rich domains of atrolysin A. Inhibition of platelet aggregation by
recombinant protein and peptide antagonists. J. Biol. Chem., v. 272, p. 13094-13102, 1997.
Referências 100
JIA, L.G.; WANG, X.M.; SHANNON, J.D.; BJARNASON, J.B.; FOX, J.W. Inhibition of
platelet aggregation by the recombinant cysteine-rich domain of the hemorrhagic snake venom
metalloproteinase, atrolysin A. Arch. Biochem. Biophys., v. 373, p. 281-286, 2000.
JEON, O.H.; KIM, D.S. Cloning, expression, and characterization of a cDNA encoding snake
venom metalloprotease. Biochem. Mol. Biol. Int., v. 47, p. 417-425, 1999.
KAMIGUTI, A.S.; HAY, C.R.; THEAKSTON, R.D.; ZUZEL, M. Insights into the mechanism
of haemorrhage caused by snake venom metalloproteinases. Toxicon, v. 34, p. 627-642, 1996.
KAMIGUTI, A.S.; ZUZEL, M.; THEAKSTON, R.D. Snake venom metalloproteinases and
disintegrins: interactions with cells. Braz. J. Med. Biol., v. 31, p.853-862, 1998.
KAMIGUTI, A. S.; GALLAGHER, P.; MARCINKIEWICZ, C.; THEAKSTON, R. D. G.;
ZUZEL, M.; FOX, J. W. Identification of sites in the cysteine-rich domain of the class P-III
snake venom metalloproteinases responsible for inhibition of platelet function. FEBS Lett., v.
549, p. 129-134, 2003.
KASHIMA, S.; ROBERTO, P. G.; SOARES, A. M.; ASTOLFI-FILHO, S.; PEREIRA, J. O.;
GIULIATI, S.; FARIA, M. JR.; XAVIER, M. A.; FONTES, M. R.; GIGLIO, J. R. Analysis of
Bothrops jararacussu venomous gland transcriptome focusing on structural and functional
aspects: I--gene expression profile of highly expressed phospholipases A2. Biochimie, v. 86, p.
211-9, 2004.
KINI, R. M.; EVANS, H. J. Structural domains in venom proteins: evidence that
metalloproteinases and nonenzymatic platelet aggregation inhibitors (disintegrins) from snake
venoms are derived by proteolysis from a common precursor. Toxicon, v. 30, p. 265-93, 1992.
KINI, R.M.; ZHANG, C.Y.; TAN, B.K. Pharmacological activity of the interdomain segment
between metalloproteinase and disintegrin domains. Toxicon, v. 35, p. 529-535, 1997.
Referências 101
KOMORI, Y.; HAGIHARA, S.; TU, A. T. Specificity of hemorrhagic proteinase from Crotalus
atrox (Western diamindback rattlesnake) venom. Biochim. Biophys. Acta, v. 829, p. 127-130,
1985.
KUMASAKA, T.; YAMAMOTO, M.; MORIYAMA, H.; TANAKA, N.; SATO, M.;
KATSUBE, Y.; YAMAKAWA, Y.; OMORI-SATOH, T.; IWANAGA, S.; UEKI, T. Crystal
structure of H2-proteinase from the venom of Trimeresurus flavoviridis. J. Biochem., v. 119, p.
49-57, 1996.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
LAING, G.D. ; MOURA-da-SILVA, A.M. Jararhagin and its multiple effects on hemostasis.
Toxicon, v. 45, p. 987-996, 2005.
LASKOWSKI, R.A.; MAC ARTHUR, M.W. ; MOSS, D.S. ; THORNTON, J.M.
PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl.
Cryst., v. 26, p. 283-291, 1993.
LEBER, T.M.; BALKWILL, F.R. Zymography: a single-step staining method for quantitation of
proteolytic activity on substrate gels. Anal Biochem., v. 249, p. 24-28, 1997.
LEITÃO, D.P. ; POLIZELLO, A.C. ; ROTHSCHILD, Z. Coagulation and fibrinolysis in
capybara (Hydrochaeris hydrochaeris), a close relative of the guinea-pig (Cavia porcellus).
Comp. Biochem. Physiol., v. 125, p. 113-120, 2000.
LINDAHL, E.; HESS, B.; VAN DER SPOEL, R. GROMACS 3.0: a package for molecular
simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., v. 7, p. 306-317, 2001.
LOPEZ-LOZANO, J. L.; de SOUSA, M. V.; RICART, C. A.; CHAVEZ-OLORTEGUI, C.;
FLORES SANCHEZ, E.; MUNIZ, E. G.; BUHRNHEIM, P. F.; MORHY, L. Ontogenetic
Referências 102
variation of metalloproteinases and plasma coagulant activity in venoms of wild Bothrops atrox
specimens from Amazonian rain forest. Toxicon, v. 40, p. 997-1006, 2002.
LORIA, G. D.; RUCAVADO, A.; KAMIGUTI, A. S.; THEAKSTON, R. D. G.; FOX, J. W.;
ALAPE, A.; GUTIÉRREZ, J. M. Characterization of basparin A, a prothrombin-activating
metalloproteinase, from the venom of the snake Bothrops asper that inhibits platelet aggregation
and induces defibrination and thrombosis. Arch. Biochem. Biophys., v. 418, p. 13-24, 2003.
LOU, Z.; HOU, J.; LIANG, X.; CHEN, J.; QIU, P.; LIU, Y.; LI, M.; RAO, Z.; YAN, G. Crystal
structure of a non-hemorrhagic fibrin(ogen)olytic metalloproteinase complexed with a novel
natural tri-peptide inhibitor from venom of Agkistrodon acutus. J. Struct. Biol., v. 152, p. 195-
203, 2005.
MACKESSY, S.P. Characterization of the major metalloprotease isolated from the venom of the
northern pacific rattlesnake, Crotalus viridis oreganos. Toxicon, v. 34, p. 1277-1285, 1996.
MATTHEWS, B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases.
Acct. Chem., v. 21, p. 333-340, 1988.
MANNING, M.C. Sequence analysis of fibrolase, a fibrinolytic metalloproteinase from
Agkistrodon contortrix contortrix. Toxicon, v. 33, p. 1189-1200, 1995.
MANDELBAUM, F. R.; ASSAKURA, M. T.; REICHL, A. P. Characterization of two
hemorrhagic factors from the venom of Bothrops neuwiedi (Jararaca pintada). Toxicon, v. 22, p.
193-206, 1984.
MARKLAND, F. S.; DAMUS, P. S. Purfication and properties of an enzyme from the venom of
Crotalus adamanteus. J. Biol. Chem., v. 246, p. 6460-64-65, 1991.
MARKLAND, F. S. Jr. Inventory of alpha- and beta-fibrinogenases from snake venoms. For the
Subcommittee on Nomenclature of Exogenous Hemostatic Factors of the Scientific and
Referências 103
Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis.
Thromb. Haemost., v. 65, p. 438-443, 1991.
MARKLAND, F.S.; FRIEDRICHS, G.S.; PEWITT, S.R.; LUCCHESI, B.R. Thrombolytic
effects of recombinant fibrolase or APSAC in a canine model of carotid artery thrombosis.
Circulation, v. 90, p. 2428-2456, 1994.
MARKLAND, F.S. Fibrolase, an active thrombolytic enzyme in arterial and venous thrombosis
model systems. Adv. Exp. Med. Biol., v. 391, p. 427-438, 1996.
MARTI-RENOM, M.A.; STUART, A.; FISER, A.; SÁNCHEZ, R.; MELO, F.; SALI, A.
Comparative protein structure modeling of genes and genomes. Annu. Rev. Biophys. Biomol.
Struct., v. 29, p. 291-325, 2000.
MARUYAMA, M.; SUGIKI, M.; YOSHIDA, E.; MIHARA, H; NAKAJIMA, N. Broad substrate
specificity of snake venom fibrinolytic enzymes: Possible role in haemorrhage. Toxicon, v. 30, p.
1387-1397, 1992.
MARUYAMA, M.; SUGIKI, M.; ANAI, K.; YOSHIDA, E. N-terminal amino acid sequences
and some characteristics of fibrinolytic/hemorrhagic metalloproteinases purified from Bothrops
jararaca venom. Toxicon, v. 40, p.1223-1226, 2002.
MATSUI, T.; FUJIMURA, Y.; TITANI, K. Snake venom proteases affecting hemostasis and
thrombosis. Biochim. Biophys. Acta, v.1477, p. 146-156, 2000.
MATSUI, T.; HAMAKO, J. Structure and function of snake venom toxins interacting with
human von Willebrand factor. Toxicon, v. 45, p. 1075-1087, 2005.
MATRIZIAN, L. M. The matrix-degrading metalloproteinases. BioEssays, v. 14, p. 455-463,
1992.
Referências 104
MAZZI, M. V.; MARCUSSI, S.; CARLOS, G. B.; STÁBELI, R. G.; FRANCO, J. J.; TICLI, F.
K.; CINTRA, A. C. O.; FRANCA, S. C.; SOARES, A. M.; SAMPAIO, S. V. A new hemorrhagic
metalloprotease from Bothrops jararacussu snake venom: isolation and biochemical
characterization. Toxicon, v. 44, p. 215-223, 2004.
MAZZI, M.V.; MAGRO, A.M.; AMUI, S.F.; OLIVEIRA, C.Z.; TICLI, F.K.; STÁBELI, R.G.;
FULY, A.L.; ROSA, J.C.; BRAZ, A.S.K.; FONTES, M.R.; SAMPAIO, S.V.; SOARES, A.M.
Molecular characterization and phylogenetic analysis of BjussuMP-I: A RGD-P-III class
hemorrhagic metalloprotease from Bothrops jararacussu snake venom. J. Mollec. Graph.
Model., in press, 2007.
MOURA-da-SILVA, A.M.; LINICA, A.; DELLA-CASA, M.S.; KAMIGUTI, A.S.; HO, P.L.;
CRAMPTON, J.M.; THEAKSTON, R.D. Jararhagin ECD-containing disintegrin domain:
expression in Escherichia coli and inhibition of the platelet-collagen interaction. Arch. Biochem.
Biophys., v. 369, p. 295-301, 1999.
MOURA-da-SILVA, A. M.; DELLA-CASA, M. S.; DAVID, A. S.; ASSAKURA, M. T.;
BUTERA, D.; LEBRUN, I.; SHANNON, J. D.; SERRANO, S. M.; FOX, J. M. Evidence for
heterogeneous forms of the snake venom metalloproteinase jararhagin: a factor contributing to
snake venom variability. Arch. Biochem. Biophys., v. 409, p. 395-401, 2003.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, v. 65, p. 55–63, 1983.
NIKAI, T.; MORI, N.; KISHIDA, M.; TSUBOI, M.; SUGIHARA, H. Isolation and
characterization of hemorrhagic toxin g from the venom of Crotalus atrox (western diamondback
rattlesnake). Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 34, p. 1167-1172, 1985.
ODELL, G.V.; FERRY, P.C.; VICK, L.M.; FENTON, A.W.; COWELL, L.S.; OWNBY, C.L.;
GUTIÉRREZ, J.M. Citrate inhibition of snake venom proteases. Toxicon, v. 36, p. 1801-1806,
1998.
Referências 105
OOSTENBRINK, C.; SOARES, T.A.; VAN DER VEGT, N.F.A.; VAN GUNSTEREN, W.F.
Validation of the 53A6 GROMOS force field. Eur. Biophys. J., v. 34, p. 273-284, 2005.
OSHAKA, A. Hemorragic, necrotizing and edema-forming effects of snake venoms. Hand. Exp.
Pharmac., v. 52, p. 480-546, 1979.
OUYANG, C.; TENG, C. M.; CHEN, Y. C. Physicochemical properties of alpha- and beta-
fibrinogenases of Trimeresurus mucrosquamatus venom. Biochim. Biophys. Acta, v. 481, p.
622-630, 1977.
OWNBY, C. L., NIKAI, T., IMAI, K., SUGIHARA, H. Patoghenesis of haemorhage induced by
bilitoxin, a hemorrhagic toxin isolated from the venom of the common cantil (Agkistrodon
bilineatus bilineatus). Toxicon, v. 23, p. 837-846, 1990.
OWNBY, C.L.; COLBERG, T.R.; LI, Q. Presence of heat-stable hemorrhagic toxins in snake
venoms. Toxicon, v. 32, p. 945-954, 1994.
PAL, S. K.; GOMES, A.; DASGUPTA, S. C.; GOMES, A. Snake venom as therapeutic agents:
from toxin to drug development. Indian. J. Exp. Biol., v. 40, p. 1353-1358, 2002.
PANDYA, B. V.; BUDZYNSKI, A. Z. Anticoagulant proteases from western diamondback
rattlesnake (Crotalus atrox) venom. Biochemistry, v. 23, p. 460-470, 1984.
SHEVELY, J.E.; PAXTON, R.J.; LEE, T.D. Highlights of protein structural analysis.
Trends Biochem. Sci., v. 14, p. 246-252, 1989.
PINHO, F.M.O.; PEREIRA, I.D. Ofidismo. Ass. Med. Bras., v. 47, p. 24-29, 2001.
RAMOS, O. H. P.; CARMONA, A. K.; SELISTRE-de-ARAUJO, H. S. Expression, refolding,
and in vitro activation of a recombinant snake venom pro-metalloprotease. Protein Exp. Purif.,
v. 28, p. 34-41, 2003.
Referências 106
RAMOS, O. H. P.; SELISTRE-de-ARAUJO, H. S. Comparative analysis of the catalytic domain
of hemorrhagic and non-hemorrhagic snake venom metallopeptidases using bioinformatic tools.
Toxicon, v. 44, p. 529-538, 2004.
RAMOS, O.H.; SELISTRE-de-ARAÚJO, H.S. Snake venom metalloproteases structure and
function of catalytic and disintegrin domains. Comp. Biochem. Physiol., v. 142, p. 328-346,
2006.
ROBERTO, P.G.; KASHIMA, S.; SOARES, A.M.; CHIOATO, L.; FACA, V.M.; FULY, A.L.;
ASTOLFI-FILHO, S.; PEREIRA, J.O.; FRANÇA, S.C. Cloning and expression of an acidic
platelet aggregation inhibitor phospholipase A2 cDNA from Bothrops jararacussu venom gland.
Protein Expr. Purif., v. 37, p. 102-108, 2004.
RODRIGUES, V. M.; SOARES, A. M.; GUERRA-SA, R; RODRIGUES, V.; FONTES, M. R.;
GIGLIO, J. R. Structural and functional characterization of neuwiedase, a nonhemorrhagic
fibrin(ogen)olytic metalloprotease from Bothrops neuwiedi snake venom. Arch. Biochem.
Biophys., v. 381, p. 213-224, 2000.
RODRIGUES, V. M.; SOARES, A. M.; ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; FRANCESCHI, A.M.;
RUCAVADO, A.; GUTIÉRREZ, J. M.; GIGLIO, J. R. Pathological alterations induced by
neuwiedase, a metalloproteinase isolated from Bothrops neuwiedi snake venom. Biochimie, v.
83, p. 471-9, 2001.
RUCAVADO, A.; LOMONTE, B.; OVADIA, M.; GUTIÉRREZ, J. M. Local tissue damage
induced by BaP1, a metalloproteinase isolated from Bothrops asper (Terciopelo) snake venom.
Exp. Mol. Pathol., v. 63, p. 186-199, 1995.
RUCAVADO, A.; SOTO, M.; KAMIGUTI, A. S.; THEAKSTON, R. D.; FOX, J. W.;
ESCALANTE, T.; GUTIÉRREZ, J. M. Characterization of aspercetin, a platelet aggregating
component from the venom of the snake Bothrops asper which induces thrombocytopenia and
potentiates metalloproteinase-induced hemorrhage. Thromb. Haemost., v. 85, p. 710-705, 2001.
Referências 107
SAIDI, N.; SAMEL, M.; SIIGUR, J.; JENSEN, P.E. Lebetase, an alpha(beta)-fibrin(ogen)olytic
metalloproteinase of Vipera lebetina snake venom, is inhibited by human alpha-macroglobulins.
Biochim. Biophys., v. 1434, p. 94-102, 1999.
SAMBROOK, J.; FRISCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2n ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.
SANCHEZ, E.F.; CORDEIRO, M.N.; DE OLIVEIRA, E.B.; JULIANO, L.; PRADO, E.S.;
DINIZ, C.R. Proteolytic specificity of two hemorrhagic factors, LHF-I and LHF-II, isolated from
the venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta). Toxicon, v. 33, p. 1061-1069, 1995.
SANCHEZ, E. F.; SANTOS, C. I.; MAGALHÃES, A.; DINIZ, C. R.; FIGUEIREDO, S.;
GILROY, J.; RICHARDSON, M. Isolation of a proteinase with plasminogen-activating activity
from Lachesis muta muta (bushmaster) snake venom. Arch. Biochem. Biophys., v. 378, p. 131-
141, 2000.
SANT’ANA, C.D.; TICLI, F.K.; OLIVEIRA, L.L.; GIGLIO, J.R.; RECHIA, C.G.; FULY, A.L.;
SELISTRE de ARAÚJO, H.S.; FRANCO, J.J.; STÁBELI, R.G.; SOARES, A.M.; SAMPAIO,
S.V. BjussuSP-I: A new thrombin-like enzyme isolated from Bothrops jararacussu snake venom.
Comp. Biochem. Physiol., 2007.
SELISTRE, H.; GIGLIO, J. R. Isolation and characterization of the thrombin-like enzyme from
the venom of the snake Bothrops insularis (jararaca ilhoa). Toxicon, v. 25, p. 1135-1144, 1987.
SELISTRE-de-ARAÚJO, H.S.; OWNBY, C.L. Molecular cloning and sequence analysis of
cDNAs for metalloproteinases from broad-banded copperhead Agkistrodon contortrix laticinctus.
Arch. Biochem. Biophys., v. 320, p. 141-148, 1995.
SELISTRE-de-ARAÚJO, H.S.; de SOUZA, D.H.; OWNBY, C.L. Analysis of a cDNA sequence
encoding a novel member of the snake venom metalloproteinase, disintegrin-like, cysteine-rich
Referências 108
(MDC) protein family from Agkistrodon contortrix laticinctus. Biochim. Biophys., v. 1342, p.
109-115, 1997.
SELISTRE-de-ARAÚJO, H.S.; de SOUZA, E.L.; BELTRAMINI, L.M.; OWNBY, C.L.;
SOUZA, D.H. Expression, refolding, and activity of a recombinant nonhemorrhagic snake venom
metalloprotease. Protein Expr. Purif., v. 19, p. 41-47, 2000.
SERRANO, S. M.; SAMPAIO, C. A.; MANDELBAUM, F. R. Basic proteinases from Bothrops
moojeni (caissaca) venom--II. Isolation of the metalloproteinase MPB. Comparison of the
proteolytic activity on natural substrates by MPB, MSP 1 and MSP 2. Toxicon, v. 31, p. 483-492,
1993.
SENIS, Y.A.; KIM, P.Y.; FULLER, G.L.; GARCIA, A.; PRABHAKAR, S.; WILKINSON,
M.C.; BRITTA, H.; ZITZMANN, N.; WAIT, R.; WARRELL. D.A.; WATSON, S.P.;
KAMIGUTI, A.S.; THEAKSTON, R.D.; NESHEIM, M.E.; LAING, G.D. Isolation and
characterization of cotiaractivase, a novel low molecular weight prothrombin activator from the
venom of Bothrops cotiara. Biochim. Biophys., v. 1764, p. 863-871, 2006.
SERRANO, S. M.; MATOS, M. F.; MANDELBAUM, F. R.; SAMPAIO, C. A. Basic
proteinases from Bothrops moojeni (caissaca) venom-I. Isolation and activity of two serine
proteinases, MSP 1 and MSP 2, on synthetic substrates and on platelet aggregation. Toxicon, v.
31, p. 471-481, 1993.
SILVA, C.A.; ZULIANI, J.P.; ASSAKURA, M.T.; MENTELE, R.; CAMARGO, A.C.;
TEIXEIRA, C.F.; SERRANO, S.M. Activation of alpha(M)beta(2)-mediated phagocytosis by
HF3, a P-III class metalloproteinase isolated from the venom of Bothrops jararaca.
Biochem. Biophys., v. 322, p. 950-956, 2004.
SOARES, A.M.; GIGLIO, J.R. Chemical modifications of phospholipases A2 from snake
venoms: effects on catalytic and pharmacological properties.Toxicon., v. 42, p. 855-868, 2003.
Referências 109
SOSZKA, T.; KNUDSEN, K.A.; BEVIGLIA, L.; POGGI, A.; NIEWIAROWSKI, S. Inhibition
of murine melanoma cell-matrix adhesion and experimental metastasis by albolabrin, an RGD-
containing peptide isolated from the venom of Trimeresurus albolabris. Exp. Cell Res., v. 196,
p. 6-12, 1991.
SOUZA, H. F.; IEMMA, M. R. C.; FERREIRA, L. L.; FARIA, J. P.; OLIVA, M. L. V. The
disintegrin-like domain of the snake venom metalloprotease alternagin inhibits α2 β1 integrin-
mediated cell adhesion. Arch. Biochem. Biophys., v. 384, p. 341-350, 2000.
STÁBELI, R.G.; MAGALHÃES, L.M.; SELISTRE-de-ARAÚJO, H.S.; OLIVEIRA, E.B.
Antibodies to a fragment of the Bothrops moojeni l-amino acid oxidase cross-react with snake
venom components unrelated to the parent protein. Toxicon, v. 46, p. 308-317, 2005.
STROKA, A.; DONATO, J.L.; BON, C.; HYSLOP, S.; deARAÚJO, A.L. Purification and
characterization of a hemorrhagic metalloproteinase from Bothrops lanceolatus (Fer-de-lance)
snake venom. Toxicon, v. 45, p. 411-420, 2005.
STOCKER, K.; BARLOW, G. H. The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom
(bathroxobin). In: Methods in Enzymology, v. 45B, p. 214, (Lorard, L., Ed.) New York,
Academic Press.,1976.
SÖDING, J.; BIEGERT, A.; LUPAS, A.N. The HHpred interactive server for protein homology
detection and structure prediction. Nucleic Acids, v. 33, p. 244-248, 2005.
STUDIER, F.W.; MOFFATT, B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective
high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., v. 189, p. 113-130, 1986.
STUDIER, F.W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression
system. J. Mol. Biol., v. 219, p. 37-44, 1991.
Referências 110
SHIMOKAWA, K.; JIA, L.G.; WANG, X.M.; FOX, J.W. Expression, activation, and processing
of the recombinant snake venom metalloproteinase, pro-atrolysin E. Arch. Biochem. Biophys.,
v. 335, p. 283-294, 1996.
SHIVELY, J.E.; PAXTON, R.J.; LEE, T.D. Highlights of protein structural analysis. Trends
Biochem. Sci., v. 14, p. 246-252, 1989.
SWENSON, S.; BUSH, L.R.; MARKLAND, F.S. Chimeric derivative of fibrolase, a fibrinolytic
enzyme from southern copperhead venom, possesses inhibitory activity on platelet aggregation.
Arch. Biochem. Biophys., v. 384, p. 227-237, 2000.
SWENSON, S.; TOOMBS, C.F.; PENA, L.; JOHANSSON, J.; MARKLAND, F.S.Jr. Alpha-
fibrinogenases. Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord., v. 4, p. 417-435, 2004.
SWENSON, S.; BUSH, L.R.; MARKLAND, F.S. Chimeric derivative of fibrolase, a fibrinolytic
enzyme from southern copperhead venom, possesses inhibitory activity on platelet aggregation.
Arch. Biochem. Biophys., v. 384, p. 227-237, 2000.
SWENSON, S.; MARKLAND, F.S. Snake venom fibrin(ogen)olytic enzymes. Toxicon, v. 45, p.
1021-1039, 2005.
TAKATSUKA, H.; SAKURAI, Y.; YOSHIOKA, A.; KOKUBO, T.; USAMI, Y.; SUZUKI, M.;
MATSUI, T.; TITANI, K.; YAGI, H.; MATSUMOTO, M.; FUJIMURA, Y. Molecular
characterization of L-amino acid oxidase from Agkistrodon halys blomhoffii with special
reference to platelet aggregation. Biochim. Biophys. Acta, v. 1544, p. 267-277, 2001.
TANG, C. H.; YANG, R. S.; LIU, C. Z.; HUANG, T. F.; FU, W. M. Differential susceptibility of
osteosarcoma cells and primary osteoblasts to cell detachment caused by snake venom
metalloproteinase protein. Toxicon, v. 43, p. 11-20, 2004.
Referências 111
TEIXEIRA, C.F.; FERNANDES, C.M.; ZULIANI, J.P.; ZAMUNER, S.F. Inflammatory effects
of snake venom metalloproteinases. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., v. 100, p. 181-184, 2005.
TERADA, S.; HORI, J.; FUJIMURA, S.; KIMOTO, E. Purification and amino acid sequence of
brevilysin L6, a non-hemorrhagic metalloprotease from Agkistrodon halys brevicaudus venom. J.
Biochem., v. 125, p. 64-69, 1999.
TOOMBS, C.F. Alfimeprase: pharmacology of a novel fibrinolytic metalloproteinase for
thrombolysis. Haemostasis, v. 31, p. 141-147, 2001.
THOMPSON, J.D.; HIGGINS, D.G.; GIBSON, T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids., v. 22, p. 4673-4680, 1994.
TRUMMAL, K.; TONISMAGI, K.; SIIGUR, E.; AASPOLLU, A.; LOPP, A.; SILLAT, T.;
SAAT. R.; KASAK. L.; TAMMISTE, I.; KOGERMAN, P.; KALKKINEN, N.; SIIGUR, J. A
novel metalloprotease from Vipera lebetina venom induces human endothelial cell apoptosis.
Toxicon, v. 46, p. 46-61, 2005.
TRUMMAL, K.; VIJA, H.; SUBBI, J.; SIIGUR, J. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of
substrate specificity of lebetase, a direct-acting fibrinolytic metalloproteinase from Vipera
lebetina snake venom. Biochim. Biophys., v. 1476, p. 331-336, 2000.
VAN DER WALT, S. J.; JOUBERT, F. J. Studies on puff adder (Bitis arietans) venom: I:
Purification and properties of protease A. Toxicon, v. 9, p. 153-161, 1971.
VITAL BRAZIL, O. Peçonhas. In: Farmacodinâmica. (Corbett, C.E.). Guanabara-Koogan, Rio
de Janeiro. p.679-697, 1982.
Referências 112
WANG, S. H.; SHEN, X. C.; YANG, G. Z.; WU, X. F. cDNA cloning and characterization of
Agkistin, a new metalloproteinase from Agkistrodon halys. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
v. 301, p. 298-303, 2003.
WANG, W. J.; SHIH, C. H.; HUANG, T. F. A novel P-I class metalloproteinase with broad
substrate-cleaving activity, agkislysin, from Agkistrodon acutus venom. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v. 324, p. 224-230, 2004.
WARRELL, D. A. Clinical features of envenoming of snake bites. In: Envenoming and their
treatment. Ed. C. Bon and M. Goyffon, pp 63-76. Fon. Marcel Mérieux, Lyon, 1996.
WATANABE, L.; SHANNON, J. D.; VALENTE, R. H.; RUCAVADO, A.; ALAPE-GIRON,
A.; KAMIGUTI, A. S.; THEAKSTON, R. D.; FOX, J. W.; GUTIÉRREZ, J. M.; ARNI, R. K.
Amino acid sequence and crystal structure of BaP1, a metalloproteinase from Bothrops asper
snake venom that exerts multiple tissue-damaging activities. Protein Sci., v. 12, p. 2273-2281,
2003.
WEI, J.F.; MO, Y.Z.; OIAO, L.Y.; WEI, X.L.; CHEN, H.Q.; XIE, H.; FU, Y.L.; WANG, W.Y.;
XIONG, Y.L.; HE, S.H. Potent histamine-releasing activity of atrahagin, a novel snake venom
metalloproteinase. Int. J. Biochem. Cell Biol., v. 38, p. 510-520, 2006.
XU, W.; WU, S.; ZHANG, J.; LI, Z.; WU, S. Purification and characteristics of polypeptide with
inhibition of platelet aggregation from Agkistrodon blomhoffii Bioe. Zhong Yao Cai., v. 27, p.
914-915, 2004.
YOU, W.; SEO, H.; CHUNG, K.; KIM, D. A novel metalloprotease from Gloydius halys venom
induces endothelial cell apoptosis through its protease and disintegrin-like domains. J. Biochem.,
v. 134, p. 739–749, 2003.
ZHOU, Q.; HU, P.; RITTER, M.R.; SWENSON, S.D.; ARGOUNOVA, S.; EPSTEIN, A.L.;
MARKLAND, F.S. Molecular cloning and functional expression of contortrostatin, a
Referências 113
homodimeric disintegrin from southern copperhead snake venom. Arch. Biochem. Biophys., v.
375, p. 278-288, 2000.
ZHOU, X.; DING, C.; TAI, H.; JIN, Y.; CHEN, R.; LU, Q.; WANG, W.; XIONG, Y. A novel
disintegrin, jerdonatin, inhibits platelet aggregation and sperm–egg binding. Comp. Biochem.
Physiol., v. 139, p. 117-122, 2004.
ZHU, Z.; GONG, W.; ZHU, X.; TENG, M.; NIU, L. Purification, characterization and
conformational analysis of a haemorrhagin from the venom of Agkistrodon acutus. Toxicon, v.
35, p. 283-292, 1997.
ZHU, X.; TENG, M.; NIU, L. Structure of acutolysin-C, a haemorrhagic toxin from the venom of
Agkistrodon acutus, providing further evidence for the mechanism of the pH-dependent
proteolytic reaction of zinc metalloproteinases. Acta Crystallogr., v. 55, p. 1834-1841, 1999.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
