síntese de derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas e ...

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

ELAINE CRISTINA KORMANN

SÍNTESE DE DERIVADOS SULFONAMÍDICOS

BENZILIDENOTIAZOLIDINODIONAS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIBACTERIANA E CITOTÓXICA

Itajaí

2013

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ELAINE CRISTINA KORMANN




Projeto de pesquisa submetido à Universidade do

Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Fátima de Campos Buzzi.

Co-orientador: Prof. Dr. Vania Floriani Noldin.

Itajaí, Maio/2013

AGRADECIMENTOS

Inicio meus agradecimentos por Deus, já que Ele colocou

pessoas tão especiais a meu lado, sem as quais certamente não teria

dado conta!

Aos meus pais, Edson e Lourdes, meu infinito agradecimento.

Sempre acreditaram em minha capacidade e me acharam A

MELHOR de todas, mesmo não sendo. Isso só me fortaleceu e me fez

tentar, não ser A MELHOR, mas a fazer o melhor de mim.

Obrigada pelo amor incondicional!

A minha querida orientadora Fátima de Campos Buzzi, por

todo empenho, sabedoria, compreensão, exigência e sugestões que

fizeram com que concluíssemos este trabalho!

A minha co-orientadora, Vânia Floriani Noldin, pela

colaboração nos ensaios de citotoxicidade celular!

Ao professor Alexandre Bella Cruz, por todo o carinho e apoio

prestado no laboratório de microbiologia!

Aos professores Rivaldo Niero e Rogério Corrêa, pelo auxílio

na elucidação dos espectros!

A todos que direta ou indiretamente fizeram parte deste

trabalho, MUITO OBRIGADA!!




Autor: Elaine Cristina Kormann

Maio/2013

Orientador: Fátima de Campos Buzzi, Doutora.

Co-orientador: Vânia Floriani Noldin, Doutora.

Número de Páginas: 119.

O N-heterocíclo 2,4-tiazolidinodiona e o grupo sulfonamida são considerados fragmentos biologicamente ativos que vem ganhando grande importância devido as suas atividades antibacterianas e oncostática. Este trabalho teve como objetivo sintetizar derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas e avaliar a possível atividade antibacteriana e citotóxica. Foram síntetizadas 3 séries de compostos, com um total de 14 compostos, sendo 9 inéditos. As séries 1 e 2 foram feitas em três etapas: formação do núcleo benzilidenotiazolidinodiona, clorossufonação e substituições nucleofílicas. Já os derivados da série 3, além das três etapas mencionadas anteriormente, foi realizada uma nova substituição nucleofílica apartir do composto 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenil-butil)benzenosulfonamida (E5, série 2). Os compostos foram purificados e caracterizados por ponto de fusão e métodos espectroscópicos usuais, cujo os rendimentos foram satisfatórios, variando de 18% a 93,76% após a recristalização. A análise computacional foi avaliada através da “regra dos 5” estabelecida por Lipinski, a fim de avaliar a biodisponibilidade por via oral dos compostos sintetizados. As séries 1 e 2 não apresentaram nenhuma violação á regra, demonstrando boa biodisponibilidade por via oral. A avaliação da atividade antibacteriana foi avaliada pela concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) através do método de diluição em ágar, e a atividade citotóxica avaliada através de ensaio de viabilidade celular. O composto N-(3,4-diclorofenil)–4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazo-lidino-5-ilideno)metil]benzenosulfonamida (E4, série 1) foi o que apresentou melhor atividade antibacteriana, apresentando CIM e CBM de 62,5 μM e 250 μM; 31,25 μM e 250 μM; 15,62 μM e 31,25 μM para S. aureus, S. saprophyticus e B. Subitillis, respectivamente. Os testes farmacológicos “in vitro” foram realizados com células de melanoma murino (B16F10). O composto E5 (série 2) foi o que apresentou melhor atividade citotóxica, com valores de CI50 de 50,1 μM, 38,2 μM e 31,9 μM em peírodos de 24, 48 e 72h de incubação, respectivamente. Desta forma foi modificado o composto E5, a fim de aumentar seu potêncial citotóxico. Destas modificações foram obtidos cinco derivados, dos quais o derivado 4-{(Z)-[3-(3,4-diclorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfonami- da (N4) apresentou valores de CI50 de 29 µM, 19,7 µM e 9,9 µM nos tempos de 24h, 48h e 72h e o derivado 4-{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5

Ilideno]-metil}bemze- nosulfonamida (N5) apresentou valores de CI50 de 36,9 µM, 25,3 µM e 10,9 µM nos períodos de 24h, 48h e 72h. Ambos os derivados N4 e N5 apresentaram maior atividade citotóxica quando comparados ao protótipo E5, porém o composto N4 foi o mais citotóxico.

Palavras-chave: tiazolidinodiona. melanoma. antibacteriano.

SYNTHESIS OF SULFONAMIDE BENZYLIDENE

THIAZOLIDINEDIONES DERIVATIVES AND EVALUATION OF

ANTIBACTERIAL AND CYTOTOXIC ACTIVITY

Author: Elaine Cristina Kormann March 2013

Supervisor: Fatima Campos Buzzi, Dr.

Co-supervisor: Vania Noldin Floriani, Dr.

Number of Pages: 119.

N-heterocycle 2,4-thiazolidinedione and the sulfonamide group are considered biologically active fragments that have been increasing in importance due to their antibacterial and oncostatic activities. This study aimed to synthesize the sulfonamide derivatives benzylidene thiazolidinodiones, and to evaluate their possible antibacterial and cytotoxic action. Three series of compounds were synthesized, with a total of 14 compounds, 9 of which were new. Series 1 and 2 were performed in three stages: formation of the benzylidene thiazolidinodione core, and chlorossufonation and nucleophilic substitutions. In the derivatives of series 3, besides the three steps mentioned above, a new nucleophilic substitution was performed from compound 4 - [(E) - (2,4-dioxo-1,3-thiazolidin-5-ylidene) methyl]-N-(4-phenylbutyl) benzenesulfonamide (E5, series 2). The compounds were purified and characterized by melting point and the usual spectroscopic methods, with satisfactory yields ranging from 18% to 93.76% after recrystallization. The computational analysis was evaluated using the "rule of five" established by Lipinski, in order to evaluate the oral bioavailability of the compounds synthesized. Series 1 and 2 showed no violation to the rule, demonstrating good oral bioavailability. Antibacterial activity was evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) by the agar dilution method, and cytotoxicity was evaluated by the cell viability assay. The compound N-(3,4-dichlorophenyl) -4 - [(Z) - (2,4-dioxo-1,3-thiazolidin-5-ylidene) methyl] benzenesulfonamide (E4, Series 1) was the one that showed the best antibacterial activity, with MIC and MBC of 62.5 µg / mL and 250 µg / ml; 31.25 µM and 250 µM, 15.62 µM and 31.25 µM for S. aureus, S. saprophyticus and B. Subitillis, respectively. Pharmacological tests "in vitro" were performed with murine melanoma (B16F10). Compound E5 (Series 2) showed the best cytotoxic activity, with IC50 values of 50.1 µM, 38.2 µM and 31.9 µM at 24h, 48h and 72 h of incubation, respectively. Compound E5 was therefore modified in order to increase its cytotoxic potential. These modifications resulted in five derivatives, of which derivative 4 - {(Z) - [3 - (3,4-dichlorobenzyl) -2,4-dioxo-1,3-thiazolidin-5ilideno] methyl} benzenesulfonamide (N4 ) showed IC 50 values of 29 µM, 19.7 µM and 9.9 µM at 24h, 48h and 72h, and derivative 4 - {(Z) -[3-(4-chlorobenzyl)-2,4-dioxo-1,3-thiazolidin-5ilideno]methyl}benzenesulfonami -de (N5) showed IC50 values of 36.9 µM, 25.3 µM and 10.9 µM at 24h, 48h and 72h. Derivatives N4 and N5 both showed higher cytotoxic activity compared to prototype E5, but compound N4 was the most cytotoxic. Keywords: thiazolidinedione. melanoma. antibacterial.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B) tiazolidinona e (C)

tiazolidinodiona. ................................................................................. 19

Figura 2 - Localização da região de micro-ondas no espectro eletromagnético. 24

Figura 3 - Estrutura da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas. .......................................................................................... 28

Figura 4 - Estrutura dos principais agentes quimioterápicos. ............................ 38

Figura 5 - Mecanismo de ação das TZDs. ......................................................... 41

Figura 6 - Esquema geral de reação de síntese dos derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas. ............................................................. 43

Figura 7 - Esquema geral de reação de síntese dos derivados da 4-[(E)-(2,4-

dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzeno-

sulfonamida (E5). .............................................................................. 48

Figura 8 - Estrutura geral dos compostos planejados como novos protótipos de

fármacos citotóxicos e antimicrobianos. ............................................ 56

Figura 9 - Mecanismo de condensação da tiazolidinodiona com benzaldeido

seguido de eliminação. ...................................................................... 57

Figura 10 - Mecanismo de substituição eletrofílica aromática para a formação do

cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzeno-

sulfonila (BTZDCl). ............................................................................ 58

Figura 11 – Proposta de mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular

para a formação dos derivados sulfonamídicos. ............................. 60

Figura 12 - Espectro de IR do composto (E1) (KBr, cm-1). ............................... 63

Figura 13 - Espectro de RMN 1H do composto (E1) (CDCl3/ 300 MHz). .......... 64

Figura 14 - Espectro de RMN 13C do composto (E1) (CDCl3/ 300 MHz). ........ 65

Figura 15 - Mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para a formação

dos derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-

(4-fenilbutil)benzenosulfonamida (E5). .......................................... 73

Figura 16 - Espectro de IR do composto (N2) (KBr, cm-1). ............................... 75

Figura 17 - Espectro de RMN 1H do composto (N2) (CDCl3/ 300 MHz)............ 76

Figura 18 - Espectro de RMN 13C do composto (N2) (CDCl3/ 300 MHz). ......... 77

8

Figura 19 - Estrutura do composto ((Z)-5-(4-((E)-3(3,5-(benziloxi)fenil)-3-

oxoprop-1-enil)-benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona). .................. 90

Figura 20 - Estrutura química do composto ácido-(S)-2-((Z)-5-(4-((E)-3-

(Naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en- 1-il)benzilideno)-4-oxo-2-

tioxotiazolidin-3-il)-3-fenilpropanóico. .............................................. 91

Figura 21 - Estrutura química do composto 2-[4-[(2,4-dioxotiazolidin-5-

Ilideno)metil]fenoxi]-N-[3-(triflurometil)fenil]acetamida. ................... 96

Figura 22 - Estruturas dos compostos: (A) 5-[2-cloro-3-(4-nitrofenil)-2-

propenilideno]-2-(3-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-ona e (B) 5-(4-

clorobenzilideno)-2-(4-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-ona. .............. 97

Figura 23 - Estrutura química da (Z)-5-(4-((E)-3-oxo-3-(tiofen-2-il)prop-1-

enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona). ..................................... 97

Figura 24 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação

com diferentes concentrações do composto E3 nos tempos de 24h

(A), 48h (B) e 72h (C). ..................................................................... 98



(A), 48h (B) e 72h (C). ..................................................................... 99



(A), 48h (B) e 72h (C). ..................................................................... 99

Figura 27 - Estrutura química do Taxol. .......................................................... 102


com diferentes concentrações do composto N2 nos tempos de 24h

(A), 48h (B) e 72h (C). ................................................................... 103



(A), 48h (B) e 72h (C). ................................................................... 103



(A), 48h (B) e 72h(C).............................................................. 104

Figura 31 - Estruturas dos compostos: (A) 2-(2,4-dioxo-tiazolidin-5-il)-N-(4-

sulfamoil-fenil)-acetamida, (B) 2-[5-(4-dimetilamino-benzilideno)-2,4-

dioxo-tiazolidin-3-il]-N-(2-trifluorometil-fenil)-acetamida e (C) 2-[5-(4-

9

cloro-benzilideno)-2,4-dioxo-imidazolin-3-il]-N-(2-trifluoro-metil-fenil)-

acetamida. ..................................................................................... 105

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Estimativas para o ano de 2012/2013 das taxas brutas de incidência

por 100 mil habitantes e de número de casos novos de câncer,

segundo sexo e localização primária. ................................................ 33

Tabela 2- Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta

por Topliss. ........................................................................................ 51

Tabela 3 - Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função

dos prováveis parâmetros mais ativos. ............................................. 51

Tabela 4 - Estrutura, tempo reacional, rendimento e ponto de fusão das

substâncias BTZD, BTZDCl e das séries 1 e 2, realizadas sob

agitação a temperatura ambiente. ..................................................... 61

Tabela 5 - Estrutura, tempo reacional, rendimento e ponto de fusão das

substâncias da série 3, por irradiação em micro-ondas, temperatura

de 70 °C e potência de 300 W. .......................................................... 74

Tabela 6 - Biodisponibilidade dos derivados da série 1 e 2 ............................... 82

Tabela 7 - Biodisponibilidade dos derivados da série 3. .................................... 84

Tabela 8 - Avaliação da atividade antibacteriana frente a E. coli e S. aureus,

para os compostos TZDCl, derivados das séries 1 e 2 em comparação

com o antibiótico Sulfadiazina. .......................................................... 86

Tabela 9 - Atividade antibacteriana frente a S. typhimurium, S. saprophyticus e

B. subitillis para os compostos TZDCl e seus derivados (séries 1 e 2)

em comparação com o antibiótico Sulfadiazina................................. 88

Tabela 10 - Concentração bactericida mínima dos compostos E0, E3 e E4 para

as bactérias S. aureus, S. saprophyticus e B. subitillis. .................. 92

Tabela 11 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação

por 24 horas com os derivados da série 1 e o composto BTZDCl. . 94


por 24 horas com os compostos das séries 2 e 3. .......................... 95


por 24 horas com os derivados do composto E5. ......................... 100

11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABCD: Assimetria, Borda, Cor, Diâmetro e Evolução do melanoma

ADMET: Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção, Toxocidade do

compostos em estudo.

AMPK: Proteína quinase ativada por-adenosina monofosfato

Ar: Aromático

BTZD: ((5-Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona)

BTZDCl: Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzenosul-

fonila

CBM: Concentração Bactericida Mínima

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CI50: Concentração inibitória de 50%

CIM: Concentração Inibitória Mínima

d: Dubleto

dd: Duplo-dubleto

DNA: deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)

DTIC: Dacarbazina

DMF: Dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

E0: N fenilbenzenosulfonamida-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilide-no)metil]

E1: 4–[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidin–5-ilideno)metil]–N-(4-metilfenil)benzenosul-

fonamida

E2: 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno)metil]-N-(4-metoxifenil)benzenosul-

fonamida

E3: N-(4-clorofenil)–4-[(Z-(2,4–dioxo-1,3-tiazolidino–5-ilidenometil]benzensulfo-

namida

E4: N-(3,4-diclorofenil)–4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino-5-ilideno)metil]benzeno-

sulfonamida

E5: 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzenosulfo-

namida

E6: 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(3-fenilpropil)benzenosul-

fonamida

E7: N-benzil-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]benzenosulfonamida

E8: 4-[(Z)-(2,4–dioxo-1,3–tiazolidino–5–ilideno)metil]–N-(2-feniletil)benzenosulfo-

namida

EC1: (5Z)-5-[4-(1H-imidazol-1-ilsulfonil)benzilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona

EC2: (5Z)-5-[4-(piperidin-1-ilsulfonil)benzilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona

EC3: (5Z)-5-[4-(1H-pirazol-1-ilsulfonil)benzilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona

EC4: (5Z)-5-[4-(morfolin-4-ilsulfonil)benzilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona

EC5: (5Z)-5-[4-(piperazin-1-ilsulfonil)benzilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona

Es: Parâmetros Estéreos

HEPES: Ácido etanossulfônico de hidroetil-piperazina

Hz: Hertz

IL-2: Interleucina-2

INCA: Instituto Nacional do Câncer

IV: Infra Vermelho

J: Constante de acoplamento

K562: Linhagem de célula leucêmica

Log P: Coeficiente de partição octanol/água

m: Multipleto

MCF7: Linhagens celulares de câncer de mama

MTIC: 5-(3-metil-1-triazeno)imidazol-4-carboxamida

MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiazol-2-il]2,5-difeniltetrazólio

N1: 4-{(Z)-[3-(4-metoxibenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosul-

fonamida

N2: 4-{(Z)-[3-(4-metilbenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfo-

nami-da

N3: 4-{(Z)-[3-(benzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfonamida

N4: 4-{(Z)-[3-(3,4-diclorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzeno-

sulfonamida

N5: 4-{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfo-

namida

nAT: Número de átomos

NHA: Grupos aceptores de hidrogênio

NHD: Grupos doadores de hidrogênio

nR: Número de rotações

O2: Oxigênio molecular

1O2: Oxigênio singleto

PC3: Linhagem celular de câncer de próstata

PF: Ponto de fusão

PF. R: Ponto de fusão do composto recristalizado

PM: Peso molecular

PPARs: Peroxisome proliferator-activated receptors (Receptores ativados do

peroxisomo proliferador)

QSAR: Relações Quantitativas de Estrutura-Atividade

REA: Relação estrutura-atividade

REND: Rendimento

REND. R: Rendimento do composto recristalizado

Rf: Fator de retenção

s: Simpleto

SFB: Soro fetal bovino

t: Tripleto

TMZ: Temozolomida

TPSA: Área de superfície polar total

TZD: 2,4-Tiazolidinodiona

UV: Ultravioleta

VOL: Volume

: Estiramento

µM: Micro-molar

σ: Parâmetros eletrônicos

π: Parâmetros hidrofóbicos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 18

2.1 Objetivo Geral: ......................................................................................... 18

2.2 Objetivos Específicos: ............................................................................ 18

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 19

3.1 QUÍMICA ................................................................................................... 19

3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL ..................................................................................... 19

3.1.2 O USO DA QUÍMICA VERDE NA SÍNTESE POR MICRO-ONDAS ................ 22

3.2 DOENÇAS INFECCIOSAS ....................................................................... 24

3.2.1 BACTÉRIAS .................................................................................................... 26

3.2.2 AGENTES ANTIBACTERIANOS .................................................................... 29

3.2.3 RESISTÊNCIA BACTERIANA ......................................................................... 30

3.3 CÂNCER ................................................................................................... 32

3.3.1 MELANOMA .................................................................................................... 34

3.3.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS TIAZOLIDINODIONAS................................... 39

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 42

4.1 QUÍMICA ................................................................................................... 42

4.1.1 Rota sintética dos derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas

.................................................................................................................................. 42

4.1.2 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas .................... 44

4.1.3 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas ....................... 46

4.1.4 Rota sintética dos derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilide-

no)metil]–N-(4-fenilbutil)benzeno-sulfonamida (E5) ............................................ 47

4.1.5 Purificação e caracterização estrutural ........................................................ 50

4.1.6 Análise “In silico”: Cálculos teóricos computacionais ............................... 50

4.1.7 Relação Estrutura-Atividade - Método de Topliss ....................................... 50

4.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ................................. 52

4.2.1 Micro-organismos .......................................................................................... 52

4.2.2 Preparação dos inóculos ............................................................................... 52

15

4.2.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ............................ 52

4.2.4 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) ....................... 53

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA ........................................... 53

4.3.1 Reagentes e materiais.................................................................................... 53

4.3.2 Cultura celular e crescimento ....................................................................... 54

4.3.3. Ensaio da viabilidade celular ....................................................................... 54

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 55

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 55

5.1 QUÍMICA ................................................................................................... 55

5.1.1 Análise computacional .................................................................................. 81

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ................................. 85

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA ........................................... 93

5.3.1 Avaliação da Viabilidade Celular - MTT ........................................................ 93

6 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 107

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 109

1 INTRODUÇÃO

Um dos principais objetivos da química orgânica e medicinal é o

desenvolvimento, síntese e produção de moléculas com atividades terapêuticas,

destacando-se os heterocíclos tiazolidina, 4-tiazolidinona e a 2,4-tiazolidinodiona

(TZD) (MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011), sendo o heterocíclo tiazolidina um

dos fragmentos estruturais privilegiados na química medicinal, devido ao seu amplo

espectro de ação (HAVRYLYUK et al., 2010).

A TZD é um derivado da tiazolidina, apresentando dois grupos carbonila nas

posições 2 e 4, e diversas aplicações biológicas, como hipoglicemiante, antitumoral,

antibacteriana (ALAGAWADI; ALEGAON, 2011; RANCIC et al., 2012), cujas

atividades são atribuídas aos diferentes grupamentos ligados em seu anel que

podem atuar como agonistas dos receptores ativados do peroxisomo proliferador

(PPARs) específicos por meio dos ligantes de ácidos graxos livres (MALIK;

UPADHYAYA; MIGLANI, 2011). Além das TZDs, estruturas sulfonamídicas também

têm demonstrado um amplo espectro de atividades biológicas, entre elas a atividade

antibacteriana e oncostática (MACHADO et al., 2011).

As Infecções bacterianas podem desencadear doenças graves que

apresentam elevados índices de morbi-mortalidade, especialmente relacionadas

com as várias formas de resistência bacteriana, o que justifica a pesquisa e o

desenvolvimento de novos agentes antibacterianos, visando maior eficácia e

segurança (LIU et al., 2011). Já o câncer é um grande problema de saúde pública,

sendo a segunda causa de morte por doença no Brasil e no mundo. Os carcinomas

de mama, próstata e pele não melanoma são os tumores mais comuns

(CHAKRABARTY; GEISSE, 2004; ALMEIDA et al., 2005).

O melanoma é uma neoplasia maligna originada a partir dos melanócitos e

representa apenas 4% de todas as neoplasias cutâneas, entretanto, é responsável

por 65-80% das mortes relacionadas a casos de câncer de pele, e por isso, várias

pesquisas almejam descobrir um fármaco efetivo para o tratamento do melanoma

metastático (LEE; TOMSU; VON ESCHEN, 2000; CARVALHO et al., 2004; JEMAL

et al., 2009; FARAONE et al., 2009).

17

No Brasil, estima-se que mais de seis mil casos novos de melanoma sejam

diagnosticados em 2013, sendo que o maior número de casos ocorrerá nos estados

do Sul, cuja prevalência está diretamente relacionada com a etnia da população, que

predominantemente tem pele e olhos claros, em sua maioria, descendentes

europeus (CARVALHO et al., 2004; ASHTON-PROLLA et al., 2008; INCA, 2012).

Este trabalho propoz desenhar e sintetizar novas moléculas a partir do núcleo

TZD e da sulfonamida, unindo fragmentos biologicamente ativos, na busca de

substâncias com potencial citotóxico e antibacteriano.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Sintetizar derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas e avaliar

indícios de relação estrutura-atividade antibacteriana e citotóxica.

2.2 Objetivos Específicos:

Sintetizar diferentes séries de derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas, contemplando os substituintes sugeridos por Topliss e

diferentes tamanhos de espaçadores;

Purificar e caracterizar espectroscopicamente os compostos sintetizados e

seus intermediários;

Avaliar a biodisponibilidade por via oral e a permeabilidade dos compostos

sintetizados de acordo com os parâmetros estipulados na regra dos 5 de Lipinski “in

silico”;

Avaliar a ação antibacteriana dos compostos sintetizados pela determinação

da concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM)

pelo método de diluição em Ágar em bactérias gram-positivas e bactérias gram-

negativas;

Avaliar a citotoxicidade dos compostos sintetizados pelo método de MTT em

células de melanoma murino (B16F10).

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 QUÍMICA

3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL

A química medicinal engloba a invenção, descoberta, planejamento,

identificação e preparação de substâncias biologicamente ativas. Esses aportes

abrangem a interpretação de seu modo de ação no âmbito molecular, no estudo de

seu metabolismo e no estabelecimento das relações estrutura-atividade, buscando o

desenvolvimento de novos fármacos (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO;

CORRÊA, 2010).

Os N-heterocíclos tem grande destaque na área da química medicinal, pois,

muitos compostos desta classe possuem atividades biológicas e farmacológicas

atuando em diversos alvos terapêuticos (MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011), em

especial os heterocíclos que possuem anel de cinco membros contendo enxofre,

nitrogênio e oxigênio (SEMENOV et al., 2011).

Entre estes heterocíclos se incluem a tiazolidina (A), que apresenta um anel

de cinco membros, contendo dois heteroátomos, um átomo de enxofre e um átomo

de nitrogênio nas posições 1 e 3 do anel. Na presença de uma carbonila na posição

4 do anel tem-se a 4-tiazolidinona (B) e na presença de duas carbonilas na posição

2 e 4 a 2,4-tiazolidinodiona (C) (Figura 1) (MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011).

Figura 1 - Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B) tiazolidinona e (C) tiazolidinodiona.

5

4

S1

NH3

2

5

4

S1

NH3

2

O

2

S1

NH35

4

O

O

(A) (B) (C)

20

A TZD é uma estrutura de grande interesse na química medicinal e é

responsável por muitas atividades farmacológicas e biológicas, tais como

hipoglicêmica, antibacteriana, antiarrítmica, oncostática (ALAGAWADI; ALEGAON,

2011; RANCIC et al., 2012), cardiotônica, anti-inflamatória, antifúngica,

anticonvulsivante, neuroprotetora, anti-hipertensiva e antiproliferativa (SWATHI et al.,

2013; ALAGAWADI; ALEGAON, 2011).

Segundo Swathi e colaboradores (2013), o heterocíclo TZD é considerado um

bom substrato para reações de Knoevenagel. Esta reação é uma modificação da

condensação aldólica e consiste na adição nucleofílica de um carbânion a um grupo

carbonila seguida de uma reação de desidratação na qual uma molécula de água é

eliminada. O produto é quase sempre uma enona α,β-insaturada. Além disso, é

comum para a TZD a denominação de reações de Knoevenagel quando se observa

a formação de um aduto com uma ligação dupla carbono-carbono (GAONKAR;

SHIMIZU, 2010; CUNHA, SANTANA, 2012).

Outra reação utilizada para a síntese de heterocíclos envolvendo a TZD é a

reação de Perkin, que é uma condensação catalisada por base de um aldeído

aromático com um anidrido de ácido carboxílico formando um ácido carboxílico α,β-

insaturado. Uma variação da reação de Perkin pode ser considerada com a TZD, a

qual reage de uma forma muito similar ao anidrido da reação original (MAYO; PIKE;

FORBES, 2010).

Aparentemente o tamanho e as características dos substituintes nos

heterocíclos podem modificar suas propriedades físico-químicas e potencialmente

alterar sua atividade biológica (LI et al., 2012). Neste contexto, a introdução de

fragmentos biologicamente ativos, tal como as sulfonamidas, que têm demonstrado

atividade antitumoral (MACHADO et al., 2011) e atividade antibacteriana (LAL et al.,

2013) remetem a moléculas hibridas, contendo grupos farmacofóricos

potencialmente terapêuticos.

O método de descoberta de fármacos baseado na modificação estrutural de

moléculas conhecidas é largamente empregado na indústria farmacêutica, levando á

obtenção de novos compostos-protótipos que atuam pelo mesmo mecanismo

farmacológico da molécula de origem, buscando assim o desenvolvimento de novos

fármacos (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010).

O planejamento adequado de variações na estrutura de um composto bioativo

pode resultar em derivados com maior interesse terapêutico, seja por apresentar

21

maior atividade, menor toxicidade ou, ainda, por adquirir características

farmacotecnicamente mais adequadas. As estratégias modernas usadas no

planejamento racional de novos compostos protótipos podem se basear na

abordagem fisiológica, permitindo planejar a estrutura química de uma nova

molécula com base na definição prévia do mecanismo de ação terapêutica

(CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010). Além disso, várias

estratégias foram desenvolvidas para compreender os mais diversos parâmetros

físico-químicos envolvidos numa série de compostos em relação a sua atividade

biológica (BOECK, 2005).

As relações quantitativas de estrutura-atividade (QSAR) correlacionam dentro

de uma série de compostos congêneres, afinidade dos ligantes aos seus sítios

ativos, constantes de inibição, constantes de velocidade e outras atividades

biológicas, ou ainda certas características estruturais, como átomos, grupos ou

descritores moleculares, tais como lipofilicidade, polarizabilidade, propriedades

eletrônicas ou estéreas (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010).

Através de uma equação matemática, com base em dados estatísticos, pode-

se comprovar que a atividade biológica pode ser influenciada pelos parâmetros

hidrofóbicos, eletrônicos e estéricos de compostos estruturalmente similares, porém,

com substituintes diferentes (JORGE et al., 2011).

Métodos semiquantitativos também podem ser utilizados na busca racional de

novos protótipos a fármacos. O método manual de Topliss é fundamentado na

síntese de 5 derivados contendo os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3,

4-OCH3, escolhidos devido à acessível obtenção sintética desses derivados como

ponto de partida e então avalia-se a ordem de potência destes substituintes em

relação aos parâmetros π (hidrofóbicos), Es (estéreos) e σ (eletrônicos) (CAMPOS-

BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010). A partir da análise do comportamento

destes compostos pode-se propor novos substituintes a fim de otimizar a atividade

biológica dos compostos em estudo (YUNES et al., 2002).

Na indústria farmacêutica é comum a utilização de estratégia de screening

virtual como ferramenta para determinação teórica de seletividade e para auxílio na

etapa de otimização do protótipo (TALELE et al., 2010).

A tecnologia de screening virtual está sendo estendida para analisar os

problemas de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET).

Neste sentido, os parâmetros incluídos na “regra dos 5” de Lipinski: Peso molecular

22

(PM) (não deve exceder a 500 g/mol), LogP (valor limite é 5), grupos doadores de

hidrogênio (valor limite é 5) e grupos aceptores de hidrogênio (valor limite é 10) são

utilizados como elementos para “filtrar” e selecionar compostos que possam ter

características de fármacos (CAMPOS-BUZZI et al., 2010; BUTINA et al., 2002).

3.1.2 O USO DA QUÍMICA VERDE NA SÍNTESE POR MICRO-ONDAS

A química tem uma grande participação em inúmeros produtos fundamentais

à humanidade. A sua presença pode ser destacada desde diversos combustíveis

aos mais complexos medicamentos. Porém, a produção química também gera

inúmeros inconvenientes, como a formação de subprodutos tóxicos e a

contaminação do ambiente e do próprio homem exposto a estes xenobióticos

(PRADO, 2003).

Considerando a necessidade de um contínuo desenvolvimento econômico,

social e ambientalmente sustentável, com vistas à manutenção da qualidade de vida

em todo o planeta, torna-se extremamente importante uma conduta química com o

aprimoramento de técnicas e metodologias, e geração de menor quantidade de

resíduos e efluentes tóxicos (DUARTE; SANGI; CORRÊA, 2010).

A Química Verde (QV) é uma subárea da Química baseada num conjunto de

princípios construídos com o propósito de minimizar a aplicação de materiais e

técnicas tóxicas e prejudiciais ao meio ambiente, durante o planejamento,

desenvolvimento e utilização de produtos químicos. O desenvolvimento de novas

metodologias sintéticas ambientalmente favoráveis e seguras ao pesquisador é um

foco de interesse cada vez maior na área de Síntese Orgânica (BATALHA, 2013).

Devido à toxicidade dos solventes e reagentes usados na síntese de

heterociclos, os pesquisadores têm investido em processos que usem e/ou gerem a

menor quantidade de substâncias nocivas ao meio ambiente, estratégia que está

inserida no campo da QV (GONÇALVES et al., 2013). Ao contrário dos requisitos

regulamentares para a prevenção da poluição, a QV é um processo inovador, não

regulamentar, economicamente impulsionado para a sustentabilidade

(GHERNAOUT; GHERNAOUT; NACEUR, 2011).

23

A emergência da QV na educação e na pesquisa está sendo suportada por

sociedades científicas, governos e indústrias. Os princípios da prática química

guiada pela preocupação com a qualidade de vida e com o meio ambiente formam

os doze princípios da QV: prevenção, economia de átomos, síntese de compostos

de menor toxicidade, desenvolvimento de compostos seguros, diminuição de

solventes e auxiliares, eficiência energética, uso de substâncias recicladas, redução

de derivativos, catálise, desenvolvimento de compostos para degradação, análise

em tempo real para a prevenção da poluição e química segura para a prevenção de

acidentes (PRADO, 2003).

Uma área importante da QV está na investigação do meio reacional. Um dos

principais problemas da indústria química está relacionado com a utilização de

solventes orgânicos (voláteis ou não) em seus processos, já que, dependendo do

solvente utilizado, sua manufatura, transporte, estoque, manuseio e descarte

representam aspectos que demandam cuidados e custos (SILVA, LACERDA;

JUNIOR, 2005).

Segundo Kharissova et al. (2013), nos últimos dois anos, vários livros sobre

QV foram publicados, descrevendo processos em geral e seus aspectos

especializados, dentre eles as reações realizadas em micro-ondas.

A tecnologia de irradiação por micro-ondas começou a ser desenvolvida na

década de 40, possuindo um campo de aplicação bastante restrito, sendo utilizada

principalmente na indústria de alimentos e polímeros. A sua utilização como

ferramenta pelos químicos orgânicos só aconteceu em meados da década de 80,

sendo utilizado o micro-ondas doméstico. Já no meio da década de 90, a entrada no

mercado de aparelhos de micro-ondas desenvolvidos especificamente para a

síntese orgânica permitiu ao químico orgânico sintético controle de todos os parâme-

tros reacionais (temperatura, pressão, potência) e, com isso, maior reprodutibilidade

e segurança nos experimentos realizados (SOUZA; MIRANDA, 2011).

O uso de energia de micro-ondas é uma técnica que tem sido muito usada

para diminuir o tempo reacional das reações e, frequentemente, reações que

classicamente são realizadas em solução, podendo ser feitas sem solvente. Apesar

de um grande número de reações sem solventes ser conhecido, o uso da energia de

micro-ondas vem para estender o escopo deste tipo de metodologia (SILVA,

LACERDA; JUNIOR, 2005), além de aumentar o rendimento e limitar a formação de

subprodutos (SOSNIK; GOTELLI; ABRAHAM, 2011).

24

As micro-ondas são ondas eletromagnéticas não ionizantes, com frequências

que se encontram entre 300 MHz e 30 GHz, as quais correspondem a comprimentos

de onda de 1mm a 1m. A região de micro-ondas situa-se entre a região de infra-

vermelho (IV) e ondas de rádio no espectro eletromagnético conforme ilustrado na

Figura 2 (BRAGA; SIMÕES; GAMA, 2012).

Figura 2 - Localização da região de micro-ondas no espectro eletromagnético.

Devido os heterociclos possuirem grande destaque na área de química

medicinal, o conhecimento de metodologias de síntese para a obtenção destes

compostos é de grande interesse e a irradiação por micro-ondas é uma ferramenta

que tem crescente destaque neste campo (DUARTE; SANGI; CORRÊA, 2010).

3.2 DOENÇAS INFECCIOSAS

Uma das principais causas de mortalidade no mundo tem sido atribuída às

doenças infecciosas, sendo que em muitos países tropicais as infecções são

responsáveis por cerca da metade dos óbitos. Essa estatística talvez não seja uma

surpresa quando associada aos países em desenvolvimento, entretanto deve-se

25

registrar que seu incremento também tem sido observado em países desenvolvidos

(BELLA-CRUZ et al., 2010).

As doenças infecciosas foram definidas pelo epidemiologista e bacteriologista

Theobald Smith como resultado da interação entre a virulência microbiana e a

defesa do hospedeiro (SHRESTHA, 2011). Elas são causadas por bactérias, vírus,

parasitas e fungos devido a uma complexa interação entre o hospedeiro, agentes

patogênicos e o meio ambiente (HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).

Para que a infecção ocorra existem duas condições: a primeira, o parasita e o

hospedeiro devem estar em contato frequente, já a segunda deve resultar em

reprodução parasitária no hospedeiro. No entanto, para a doença ocorrer uma

terceira condição é necessária: multiplicação parasitária no hospedeiro causando

expressão sintomática (PONTIER et al., 2009).

Tendo o patógeno invadido o hospedeiro o curso de uma doença infecciosa

apresenta quatro períodos. O primeiro é o período de incubação, tempo que decorre

entre a entrada do patógeno e o aparecimento dos sintomas. O segundo é o período

prodrômico, tempo durante o qual o hospedeiro se sente “indisposto”, mas ainda não

demonstra os reais sintomas da doença. O terceiro é o período da doença, tempo

durante o qual o hospedeiro apresenta sintomas típicos associados à doença

específica (ex: faringite, cefaleia, congestão nasal). Por fim, o quarto período, o

período de convalecença, aquele durante o qual o hospedeiro se recupera

(ENGELKIRK; ENGELKIRK, 2012).

As infecções não dependem somente de fatores intrínsecos, como sistema

imunológico, estresse, idade e fatores genéticos, mas também de fatores

extrínsecos como temperatura e umidade (PONTIER et al., 2009). Segundo BELLA-

CRUZ e colaboradores (2010), o aumento das infecções pode estar associado à

disseminação de doenças imunossupressoras que contribuem para o seu

desenvolvimento, que são desencadeadas por micro-organismos oportunistas,

especialmete aqueles responsáveis pelas micoses humanas; ao aumento de micro-

organismos emergentes, alguns ainda não identificados e responsáveis pelas novas

doenças infecciosas; porém, a principal razão, provavelmente, está relacionada ao

surgimento de micro-organismos resistentes aos agentes antimicrobianos, o que tem

gerado grande preocupação aos setores de saúde pública.

O tratamento das doenças infecciosas continua sendo um importante e

desafiador problema devido à combinação de fatores, tais como doenças infecciosas

26

emergentes e micro-organismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos, com

particular relevância as bactérias Gram–positivas (ALAGAWADI; ALEGAON, 2011).

É consenso que para se obter sucesso no tratamento das doenças

infecciosas deve-se fazer a opção pelo uso de antimicrobianos (naturais ou

sintéticos), bem como considerar aquele que for mais adequado à erradicação ou

controle de agente etiológico (BELLA-CRUZ et al., 2010).

Terapias antimicrobianas vêm sendo mostradas para reduzir a mortalidade

em paciente com infecção grave. No entanto, mesmo com terapias apropriadas e

precoces, a mortalidade permanece alta em pacientes críticos (lupos eritematoso,

HIV, transplantados, imunidade baixa), que vão de 20 – 50% (SCAGLIONE, 2009).

3.2.1 BACTÉRIAS

As bactérias são organismos unicelulares, identificados pela primeira vez por

Van Leeuwenhoek por volta dos anos 1670, após a invenção do microscópio.

Porém, somente no século XIX a possibilidade destes micro-organismos serem

causadores de processos infecciosos começou a ser aventada. Esta hipótese surgiu

após os elegantes experimentos de Louis Pasteur, que demonstrou que algumas

linhagens de bactérias eram importantes para processos de fermentação e, também,

que as bactérias eram de ampla distribuição pelo meio ambiente. Robert Koch e

outros cientistas relataram que muitos micro-organismos eram responsáveis por

doenças como a tuberculose, a cólera e a febre tifóide (GUIMARÃES; MOMESSO;

PUPO, 2010).

A forma das bactérias é uma característica genética e geralmente elas são

monomórficas, isto é, mantêm uma única forma. Entretanto, algumas condições

ambientais e de cultivo podem fazer com que os organismos apresentem formas ou

rearranjos diferentes (TRABULSI; ALTERTHUN, 2008).

O teste de coloração de Gram foi descrito a mais de um século e é bem

estabelecido para a identificação e caracterização das bactérias mais comuns

(ZYWIEL et al., 2011). O termo Gram origina do nome de Christian Gram,

pesquisador dinamarquês que, em 1884, desenvolveu, de maneira empírica, o

método de coloração que passou a ter seu nome e que permitiu dividir as bactérias

27

em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. As bactérias Gram-

positivas coram-se na cor púrpura, enquanto que as bactérias Gram-negativas

coram-se em cor rosa, porém nem todas as bactérias podem ser visualizadas

utilizando-se a coloração de Gram. Alguns importantes patógenos de humanos,

como as bactérias que causam a tuberculose e a sífilis, não podem ser visualizados

utilizando-se essa coloração (LEVINSON, 2010). Embora estejam disponíveis

técnicas de biologia molecular mais avançadas, a coloração de Gram permanece em

uso na clínica e em aplicações laboratoriais (ZYWIEL et al., 2011).

A estrutura da parede celular distingue as bactérias Gram-positivas das Gram-

negativas (Figura 3). As Gram-positivas possuem uma única membrana contendo

uma bicamada lipídica (HANSON; NEELY, 2012), parede celular espessa de

múltiplas camadas, constituída principalmente em peptidioglicano (geralmente mais

que 30% do total da parede celular), proteínas, polissacarídeos e/ou ácidos teicóicos

(MURRAY et al., 2000; HANSON; NELLY, 2012; SCHLEIFER, 2009).

Ao contrário das Gram-positivas, as Gram-negativas possuem parede celular

mais complexa, formada principalmente por lipopolissacarídeos, fosfolipídeos,

proteínas, lipoproteínas e pouco peptidioglicano, geralmente menos que 10% do

total da parece celular. Além disso, possui membrana citoplasmática e membrana

externa (SCHLEIFER, 2009).

28

Figura 3 - Estrutura da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

Fonte: Disponível em: http://www.medicinageriatrica.com.br/2008/07/06/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/

A membrana e as proteínas da parede celular desempenham algumas das

funções fisiológicas mais importantes, tais como o transporte de íons e nutrientes,

entrega de sinais celulares, adesão às células do hospedeiro, e resistência aos

antibióticos. Em função disso, até o momento, 50% - 70% dos antibióticos

conhecidos atuam nas proteínas de membrana (YANG et al., 2012).

O S. aureus é encontrado com relativa frequência como membro da

microbiota normal do corpo humano, porém é uma das bactérias patogênicas mais

importantes, uma vez que atua como agente de uma ampla gama de infecções,

variando desde aquelas localizadas, geralmente superficiais, até algumas

disseminadas, com elevada gravidade (TRABULSI; ALTERTHUM, 2010).

Em geral, as doenças causadas por esse micro-organismo podem ser

classificadas como superficiais (abcessos cutâneos e as infecções de feridas),

invasivas (bacteremia, endocardite, osteomelite, artrite, miosite tropical e

pneumonia) ou tóxicas (síndrome do choque tóxico, síndrome da pele escaldada e

intoxicação alimentar). Sua importância clínica tem variado ao longo dos anos, tendo

http://www.medicinageriatrica.com.br/2008/07/06/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/

http://www.medicinageriatrica.com.br/2008/07/06/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/

29

crescido particularmente devido ao aumento na ocorrência de infecções hospitalares

graves causadas por amostras multirresistentes (TRABULSI; ALTERTHUM, 2010).

O B. subitillis não é uma bactéria patogênica, no entanto é utilizado

geralmente para testes de substâncias ativas devido a sua morfologia, servindo de

modelo para outros bacilos (KALEMBA; KUNICKA, 2003).

Já o S. saprophyticus é um habitante normal da pele e da região periuretral do

homem e das mulheres e, depois da Escherichia coli, é o mais comum causador de

infecção urinária em mulheres na faixa de 20 a 40 anos de idade. Pode também

causar infecção urinária no homem, principalmente depois dos 50 anos (TRABULSI;

ALTERTHUM, 2010).

3.2.2 AGENTES ANTIBACTERIANOS

Antibióticos são compostos naturais, semissintéticos ou sintéticos capazes de

inibir o crescimento ou causar a morte de bactérias. Os de origem natural são

produzidos por micro-organismos. Os semissintéticos são produzidos por micro-

organismos, porém sofrem modificação estrutural em laboratório. Já os de origem

sintética são totalmente sintetizados em laboratório. Além disso, são classificados

como bacteriostáticos ou bactericidas (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010).

As características marcantes do comportamento dos fármacos

bacteriostáticos são: as bactérias podem voltar a crescer quando o fármaco é

retirado, e os mecanismos de defesa do hospedeiro, como a fagocitose, são

necessários para matar as bactérias. Já os fármacos bactericidas são

particularmente úteis em determinadas infecções, como, por exemplo, aquelas que

representam risco imediato à vida e cujos fármacos bacteriostáticos não promovem

a cura (LEVINSO, 2010). Deve ser lembrado que alguns antibióticos, tipicamente

bacteriostáticos, podem ser bactericidas para determinadas espécies de bactérias

(TRABULSI; ALTERTHUN, 2008).

A descoberta dos fármacos com ação antibacteriana proporcionou um dos

maiores avanços da medicina no século XX, entretanto o uso abusivo e/ou

equivocado, tanto em âmbito hospitalar quanto ambulatorial, é considerado o

30

principal fator associado ao surgimento de bactérias resistentes (BELLA-CRUZ et al.,

2010).

O conceito mais importante que fundamenta a terapia antibacteriana

corresponde à toxicidade seletiva, isto é, a inibição seletiva do crescimento da

bactéria sem causar danos ao hospedeiro, como por exemplo, as penicilinas e

cefalosporinas, que são agentes antibacterianos eficazes por inibirem a síntese de

peptídeoglicano, inibindo assim, o crescimento das células bacterianas, mas não

afetando as células humanas (LEVINSON, 2010).

Os mecanismos pelos quais as substâncias com atividade antibacteriana

inibem o crescimento ou causam a morte da bactéria são variados e dependem dos

alvos afetados. Existem quatro sítios principais na célula bacteriana que diferem o

suficiente da célula humana, de modo que podem atuar como a base de ação dos

fármacos clinicamente efetivos: parede celular, ribossomos, ácidos nucleicos, e

membrana celular (CALVO; MARTÍNEZ, 2009).

3.2.3 RESISTÊNCIA BACTERIANA

A propagação de micro-organismos multirresistentes é atualmente uma causa

de grande preocupação. Têm sido mostradas taxas crescentes de resistência de

patógenos em septecemia e infecções respiratórias (KAHLMETER; POULSEN,

2012).

A primeira referência á resistência de micro-organismos aos antibacterianos

surgiu nos anos 1940, com as penicilinas, tendo ressurgido com o advento dos

novos antibacterianos nos anos 1950 e 1960. Atualmente a resistência aos

antibacterianos causa enormes problemas terapêuticos com implicações na saúde

pública (BELLA-CRUZ et al., 2010).

O desenvolvimento da resistência pode ser de forma natural (intrínseco) ou

adquirido (extrínseco), podendo a resistência ser transmitida por espécies de

bactérias idênticas ou diferentes (HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).

Existem quatro mecanismos principais que medeiam à resistência das

bactérias aos fármacos (LEVINSON, 2010):

As bactérias produzem enzima que inativam o fármaco;

31

As bactérias modificam alvos, os quais os fármacos não têm efeito;

As bactérias reduzem sua permeabilidade de modo que uma concentração

intracelular efetiva do fármaco não é obtida;

As bactérias exportam os fármacos ativamente, empregando uma “bomba

de resistência a múltiplos fármacos”.

Cocos Gram-positivos são responsáveis por muitas infecções graves em

ambientes comunitários e hospitalares, e a resistência desses micro-organismos à

múltiplas substâncias têm aumentado significativamente na última década (BEIBE et

al., 2010). Devido a sua crescente resistência aos antibióticos tradicionais, tais como

ampicilina, aminoglicosídeos e cefotaxima, os glicopeptídeos tais como vancomicina

são muitas vezes necessários para a terapia adequada (KOCHER; MULLER;

RESCH, 2010).

Segundo Quiao et al. (2012,) os agentes patogênicos Gram-negativos

causam maior resistência aos antibióticos em comparação com os Gram-positivos,

sendo considerado prioridade o tratamento de infecções causadas por bactérias

Gram-negativas. Os tratamentos para infecções causadas por estas são

extremamentes inadequadas quando comparadas aos tratamentos usados para

infecções causadas por bactérias Gram-positivas.

A prevenção e o controle da resistência antibacteriana se dão em duas

estratégias complementares: medidas de controle de infecção para reduzir as

bactérias multiresistentes, e otimização de antibióticos usados para terapia e

profilaxia (CHAN et al., 2011). Uma estratégia usada para ultrapassar estes

mecanismos de resistência é a combinação de antibióticos (HEMAISWARYA;

KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008). No entanto, apesar do amplo número de antibióticos

e quimioterápicos de uso clínico, se faz necessário o desenvolvimento de novas

classes de agentes antibacterianos devido ao surgimento de novas cepas

resistentes nas últimas décadas (ALAGAWADI; ALEGAON, 2011).

Programas de manejo de antimicrobianos foram implementados em todo o

mundo numa tentativa de controlar o aumento da resistência aos antimicrobianos,

especialmente nos países desenvolvidos. Estudos têm mostrado que estes

programas podem efetivamente reduzir a utilização de antibióticos, custo de

atendimentos e até mesmo as taxas de resistência bacteriana (LIEW et al., 2012).

3.3 CÂNCER

Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças que têm em comum o

crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e órgãos (INCA, 2012).

Um tumor cresce a partir de uma única célula que sofre alguma mutação,

bloqueando sua via de sinalização apoptótica, fazendo esta célula se proliferar

descontroladamente. Durante as fases iniciais do crescimento do tumor as células

dependem unicamente da difusão para obter nutrientes, limitando seu tamanho em

aproximadamente 2 mm3 (STEICHEN; MOORE; PEPPAS, 2012). Dividindo-se

rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e incontroláveis,

determinando a formação de tumores malignos, que podem espalhar-se para outras

regiões do corpo (metástase) (INCA, 2012).

O processo de metástase tem sido tradicionalmente visto como uma cascata

sequencial de eventos partindo de uma invasão local no tumor primário, migrando

através da via linfática ou hematológica e por fim, colonizando e crescendo em locais

distantes (LORUSSO; RUEGG, 2012). Segundo Luo e Guan (2010), para que ocorra

metástase e invasão as células tumorais requerem alteração da sua capacidade de

adesão para aderirem às células vizinhas e a matriz extracelular.

Geralmente, considera-se que a disseminação metastática ocorra tardiamente

durante a progressão do tumor, no momento em que o tumor primário já se encontra

em um tamanho considerável, de fato, para a maioria dos tipos de câncer o volume

do tumor primário representa um fator de risco para a progressão de uma metástase:

quanto maior for o volume, maior é o risco (LORUSSO; RUEGG, 2012).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam para a ocorrência

de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele

não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país (Tabela 1).

É esperado um total de 257.870 casos novos para o sexo masculino e 260.640 para

o sexo feminino sendo que as regiões Sul e Sudeste, de maneira geral, apresentam

as maiores taxas (INCA, 2012).

O desenvolvimento do câncer está relacionado às causas externas e/ou

internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas internas são,

na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à capacidade

do organismo se defender das agressões externas. As causas externas referem-se

33

ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e

cultural. De todos os casos, 80% a 90% dos cânceres estão associados à fatores

ambientais, que são tabagismo, hábitos alimentares, alcoolismo, hábitos sexuais

(HPV), medicamentos, fatores ocupacionais e radiação solar (INCA, 2012).

Cerca de 30% das mortes por câncer são devido aos cinco principais riscos

comportamentais e alimentares, que são: índice de massa corporal elevado; baixo

consumo de frutas, legumes e verduras; falta de atividade física; tabagismo e uso de

álcool, sendo que o tabagismo é o fator de risco mais importante, causando 22% das

mortes por câncer e 71% das mortes por câncer de pulmão no mundo (WHO, 2012).

Tabela 1- Estimativas para o ano de 2012/2013 das taxas brutas de incidência por 100 mil habitantes e de número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização primária.

Homens Mulheres

Localização Primária Casos novos Localização Primária Casos novos

Próstata 60.180 Mama feminina 52.680

Traqueia, pulmão 17.210 Colo de Útero 17.540

Cólon e Reto 14.180 Cólon e Reto 15.960

Estômago 12.670 Glândula Tireoide 10.590

Cavidade Oral 9.990 Traqueia, pulmão 10.110

Esôfago 7.770 Estômago 7.420

Bexiga 6.210 Ovário 6.190

Laringe 6.110 Corpo do Útero 4.520

Linfoma não Hodgkin 5.190 Linfoma não Hodgkin 4.450

SNC 4.820 SNC 4.450

Leucemia 4.570 Leucemia 3.940

Pele melanoma 3.170 Pele melanoma 3.060

Outras localizações 43.120 Outras localizações 38.720

Pele não melanoma 62.680 Pele não melanoma 71.490

TOTAL 257.870 TOTAL 260.640

Fonte: INCA. Estatísticas do Câncer. Vigilância do Câncer e de Fatores de Risco. Disponível em: http://www1.inca.gov.br/vigilancia/

Para a prevenção do câncer deve-se evitar contato com os fatores de riscos,

vacinar-se contra o HPV e vírus da hepatite B, controlar os riscos profissionais e

http://www1.inca.gov.br/vigilancia/

34

reduzir a exposição à luz solar (WHO, 2013). Segundo Goodman et al. (2011),

modificações no estilo de vida, relacionados com tabagismo, obesidade, falta de

atividade física e dieta, poderiam prevenir vários tipos de câncer.

As principais formas de tratamento do câncer são cirurgia, radioterapia,

quimioterapia ou transplante de medula óssea. Em muitos casos é necessário

combinar mais do que uma modalidade (INCA, 2012).

3.3.1 MELANOMA

O melanoma é um tumor maligno de pele, proveniente de melanócitos

(KARAKOUSIS; CZERNIECKI, 2011). Embora represente somente 10% de todos os

diagnósticos de câncer de pele, é responsável por pelo menos 65% das mortes

relacionadas a ele (COCKERELL, 2012). É altamente resistente aos quimioterápicos

convencionais, sendo uma doença invasiva que apresenta preferencialmente

metástase de pulmão, cérebro, fígado e pele (GAVA et al., 2006).

De acordo com o INCA, embora o câncer de pele seja o mais frequente no

Brasil e corresponda a 25% de todos os tumores malignos registrados no País, o

melanoma representa apenas 4% das neoplasias malignas do órgão, apesar de ser

o mais grave devido à sua alta possibilidade de metástase. A estimativa de novos

casos no Brasil em 2013 é de 6.230, sendo 3.170 para homens e 3.060 para

mulheres, sendo que as maiores taxas estimadas em homens e mulheres

encontram-se na região Sul (INCA, 2012). Segundo Vikey (2012), a incidência

mundial por ano é de 3% a 8% e está aumentando.

O melanoma é classificado baseado em fatores clínicos e patológicos que

incluem quatro subtipos principais: melanoma expansivo superficial, melanoma

nodular, melanoma lentigo maligno e melanoma acrolentiginoso (SCOLYER; LONG;

THOMPSON, 2011). Subtipos raros de melanoma incluem melanoma desmoplásico

(MD), melanoma amelanótico, melanoma verrucoso, melanoma folicular e melanoma

decorrente a nevos azuis (COCKERELL, 2012).

A etiologia do melanoma é multifatorial, com fatores genéticos e ambientais,

contribuindo para o seu desenvolvimento (KANAVY; GERSTENBLITH, 2011). Tais

fatores incluem bronzeamento artificial (RUSSAK; RIGEL, 2012), pele clara, cabelo

35

loiro ou ruivo, olhos azuis, presença de sardas, presença de múltiplos nevos, e

exposição ao sol (MANGAS et al., 2010), sendo que o principal fator de risco

ambiental é a radiação ultravioleta (CHO; CHIANG, 2010).

A história de queimaduras solares confere o dobro de riscos para o

desenvolvimento de melanomas em pessoas que já tiveram queimaduras do que as

que não tiveram, e aqueles que possuem história de queimadura ainda na infância

têm um risco maior (CHO; CHIANG, 2010).

Como em outros tumores, uma história familiar e presença de nevos também

são fatores de risco. Pessoas com um parente de primeiro grau com melanoma tem

maior risco de desenvolver melanoma do que em pessoas que não possuem história

familiar de melanoma (CHO; CHIANG, 2010). Sabe-se que mutações nos genes

CDKN2A e CDK4 desempenham um papel importante para a formação de

melanoma, compreendendo cerca de 10% de todos os casos de melanomas

cutâneos (WARD; LAZOVICH; HORDINSCKY, 2012).

Ações de prevenção primária que estimulem a proteção contra a luz solar são

efetivas e de baixo custo para evitar o câncer de pele, inclusive os melanomas. A

educação em saúde é outra estratégia internacionalmente aceita. O indivíduo deve

procurar o dermatologista ao primeiro sinal de surgimento de manchas ou sinais

novos na pele, ou a mudança nas características desses, reconhecendo assim

possíveis alterações precoces sugestivas de malignidade (INCA, 2012). Além disso,

a conscientização dos fatores de risco é essencial para a prevenção do melanoma

(OTTENSMEIER; GORE, 2008).

Segundo Cho e Chiang (2010), tendo um ou dois fatores de risco, as chances

de gerar melanoma aumentam de duas a quatro vezes, e quando há mais de três

fatores de risco, as chances de gerar o melanoma aumentam para mais de vinte

vezes.

A distribuição anatômica das lesões se difere por sexo e idade. Nos homens,

são normalmente localizadas no tronco (55%), especialmente na parte de trás

(39%). Nas mulheres, 42% das lesões de melanoma são localizadas nas

extremidades inferiores, sendo 24% na parte inferior da perna, já o segundo local

mais comum é o tronco (25%), com 17% na parte de trás (TUONG; CHENG;

ARMSTRONG, 2012). São raros os casos de melanoma que ocorrem em pessoas

com menos de 20 anos, sendo a faixa etária entre 40-70 anos, com média entre os

55 anos (VIKEY; VIKEY, 2012).

36

A avaliação de qualquer paciente que apresenta lesão de pele pigmentada

com aparência atípica deve ser iniciada com anamnese e exame físico. Especial

atenção deve ser dada a história de exposição excessiva ao sol, particularmente em

idade jovem, e para qualquer história familiar de câncer de pele. As características

clínicas de uma lesão que causam preocupação para a possibilidade de um

melanoma podem ser resumidas pelo uso tradicional ABCDE (assimetria, borda, cor,

diâmetro e evolução) do melanoma (KARAKOUSIS; CZERNIECKI, 2011).

Morfologicamente, a maioria dos melanomas malignos cresce com uma taxa

de irregularidade, resultando em assimetria. Esta assimetria difere das lesões

pigmentadas benignas que são normalmente redondas e simétricas. A taxa de

crescimento desigual geralmente causa melanoma maligno com borda irregular, ao

contrário de lesões pigmentadas benignas que normalmente apresentam margens

regulares. Melanomas maculares são muitas vezes variados, contendo cores

variáveis de bege, marrom, preto, vermelho e branco, enquanto que lesões benignas

possuem cores uniformes. A maioria dos melanomas malignos possuem diâmetro de

pelo menos 6 mm no momento do diagnóstico (TUONG; CHENG; ARMSTRONG,

2012).

As fases do melanoma variam de 1 à 4. Quando o melanoma é local é

caracterizado pela fase 1 (< 1,0 mm) e 2 (1,01 - 2,0 mm), os que possuem

metástase regional são de fase 3 (2,01 – 4,0 mm), já os que possuem metástase

distantes são os da fase 4 (4,0 mm) (CHO; CHIANG, 2010).

Inicialmente, lesões que se apresentam no início são assintomáticas, com as

bordas pigmentadas e com alteração da cor e da textura da pele ou da mucosa,

apresentando mais tarde espessura elevada e superfícies pretas com ou sem

ulcerações (VIKEY; VIKEY, 2012).

Estratégias de tratamento tais como a cirurgia, podem controlar o tumor no

estágio inicial do melanoma. No entanto, a forma metastática da doença continua a

ter um prognóstico ruim com uma média de sobrevida de 6 a 9 meses (HOMSI;

GRIMM; HWU, 2011). Embora a detecção precoce, cirurgia apropriada e terapias

adjuvantes terem melhorado os resultados, o prognóstico do melanoma metastático

é ruim (MOUAWAD et al., 2010).

As terapias para o melanoma incluem quimioterapia, bioquimioterapia,

imunoterapia, excisão cirúrgica (KASPER et al., 2007), terapia fotodinâmica, vacinas,

citocinas, e radioterapia, sem apresentar grande impacto na sobrevida global nos

37

casos de melanoma metastático. Apenas 10% a 20% dos pacientes em tratamento

com quimioterapia têm resposta satisfatória (TARHINI; AGARWALA, 2001; KASPER

et al., 2007).

O tratamento de escolha para o melanoma é a cirurgia. No estágio 1 o

melanoma é excisado com uma margem de 1 mm, precisando de uma biópsia do

linfonodo sentinela. No estágio 2 é tratado com excisão cirúrgica e biópsia do

linfonodo. No estágio 3 da doença é feita uma larga excisão com 2 mm e

dessecação do linfonodo, e a radiação ou a quimioterapia é administrada no pós-

operatório. Já no estágio 4, juntamente com os diferentes parâmetros cirúrgicos são

adicionados a ele diferentes bioquimioterapias, incluindo quimioterapia, interferons,

interleucinas e vacinas (VIKEY; VIKEY, 2012).

As substâncias que apresentam ação antitumoral normalmente atuam

impedindo a divisão celular e/ou causam danos nas células resultando em morte

celular principalmente em células de divisão rápida, tais como as células tumorais.

Vários agentes com atividade antitumoral têm sido investigados em pacientes com

melanoma, mas as opções atuais de tratamento para pacientes com metástase são

limitadas e não curam na maioria dos casos (MOUAWAD et al., 2010).

Os tratamentos quimioterápicos mais recomendados são aqueles que incluem

a dacarbazina (DTIC) (MANGAS et al., 2010). A DTIC é o agente mais ativo e o

primeiro quimioterápico aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o

tratamento de melanoma metastático. É um pró-fármaco que requer a conversão no

fígado para 5-(3-metil-1-triazeno)imidazol-4-carboxamida (MTIC), o composto ativo

(YANG; CHAPMAN, 2009), tendo como principal efeito náuseas, que podem ser

controladas com terapia antiemética (MOUAWAD et al., 2010; TREISMAN; GARLIE,

2010), além de fadiga, constipação e mielosupressão (FOX et al., 2013).

A poliquimioterapia geralmente resulta em aumento da resposta, que varia

entre 30% a 50%. Existem numerosas combinações de quimioterápicos que estão

sendo estudados. Estas combinações têm geralmente empregado a DTIC, ou mais

recentemente a temozolomida (TMZ). As combinações mais usadas são as DTIC

com vimblastina e cisplatina ou DTIC com cisplatina, carmustina e tamoxifeno

(Figura 4) (TREISMAN; GARLIE, 2010).

38

Figura 4 - Estrutura dos principais agentes quimioterápicos.

N

NH

OHNH2

N

NN

CH3

CH3

NH2O

NN

NCH3

O

NN

Cl

N

NO

O

NHCl

Pt

H3N

H3N Cl

Cl

Dacarbazina Temozolomida Carmustina Cisplatina

CH3

NCH3

O

CH3

Tamoxifeno Vimblastina

A relação entre o melanoma e o sistema imune tem sido reconhecida por

décadas. Relatos de casos de regressão espontânea de tumor em pacientes com

melanoma metastático têm sugerido que a imunoterapia pode ter um grande impacto

sobre tais resultados do que em outros tipos de cânceres. Isto tem levado a intensos

estudos sobre estratégias de tratamentos com imunomoduladores, especialmente a

interleucina-2 (IL-2) e interforon-α, que têm grande importância na terapia adjuvante

e no tratamento de melanoma metastático. Já a bioquimioterapia refere-se à

combinação de DTIC e/ou poliquimioterapia com interforon-α (subcutâneo) ou

interleucina-2 (IL-2) (intravenosa ou subcutânea) em doses variadas (MANGAS et

al., 2010).

A terapia fotodinâmica requer três elementos fundamentais para apresentar

um bom efeito citotóxico: agente fotossensibilizador (porfirinas), oxigênio e uma fonte

de luz com comprimento de onda adequado (QUON et al., 2011), gerando uma

conversão fotoquímica de oxigênio molecular (3O2) em oxigênio singleto (1O2). Este

último é um agente citotóxico que danifica as células por meio de apoptose ou

necrose (PASZCO et al., 2011).

A radioterapia é baseada em modelos tradicionais radiobiológicos, onde o

efeito da radiação sobre as células resulta em uma cascata de eventos simultâneos

ou sucessivos que se iniciam com dano ao DNA. A presença de danos no DNA das

39

células ativa os mecanismos de reparação, bem como a sinalização das vias de

transdução, conduzindo a parada do ciclo celular e apoptose (MILLÁN et al., 2012).

Dependendo da situação clínica a radioterapia é usada para melhorar o controle

local ou para o tratamento paliativo (RAO et al., 2011).

Por fim, a base do tratamento para o melanoma continua sendo a cirurgia,

porém quando a cirurgia não é viável para a doença avançada ou metastática, a

radioterapia paliativa pode ser usada. Apesar dos avanços globais nas áreas da

biologia e oncologia, o tratamento de melanoma metastático tem permanecido um

desafio, e o prognóstico para pacientes com metástase é ruim, o que justifica as

pesquisas com substâncias farmacologicamente ativas, tais como os derivados

tiazolidínicos, com potencial atividade antitumoral (OTTENSMEIER; GORE, 2008).

3.3.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS TIAZOLIDINODIONAS

As TZDs tornaram-se uma importante classe de compostos heterocíclicos

com atividade biológica desde a sua introdução na forma de glitazonas (KUMAR et

al, 2011), sendo conhecidas comercialmente como Rosiglitazona (Avandia®),

Pioglitazona (Actos®), Muraglitazona (Pargluva®) que não chegou a ser

comercializada, Englitazona, Ciglitazona e Troglitazona (Rezulin), terapeuticamente

úteis como anti-hiperglicêmicos para o tratamento de diabetes mellitus tipo 2 (DOU,

2010; KUMAR et al., 2011).

As TZDs são derivadas da tiazolidina e a maior parte de suas ações se deve

ao fato de atuarem como agonistas de receptores PPARs, grupo de receptores

presentes no interior do núcleo celular (HAVRYLYUK et al., 2011). Estes receptores

desempenham papel na regulação da homeostase da glicose e lipídeos, na

proliferação celular, na apoptose, na inflamação (TSUKAHARA, 2013) e na

diferenciação celular (PETERS; SHAH; GONZALES, 2013). Além disso, os PPARs

são conhecidos por atuarem em duas vias distintas, a trans-repressão e a

transcrição. A trans-repressão é um mecanismo independente de DNA (ácido

desoxirribonucleico), estando associada com a interrupção de fatores de transcrição

de outras vias, enquanto que a transcrição é um mecanismo dependente de DNA e

40

envolve a ligação do PPAR a seu elemento responsivo da proliferação do

peroxissomo (PPRE) ao gene alvo (AGRAWAL; DIKSHIT, 2012).

Existem 3 tipos de receptores PPARs, classificados em PPARα , PPARΔ e

PPARγ (CARIOU; CHARBONNEL; STAELS, 2012). O receptor PPARα foi o primeiro

a ser identificado, sendo expresso em células do rim, coração, músculos, tecido

adiposo, entre outros (HAVRYLYUK et al., 2011), particularmente em tecidos que

requerem oxidação de ácidos graxos como fonte de energia. Além disso, ele é

essencial para a manutenção da homeostase de lipídeos, aumentando a capacidade

celular de mobilizar e catabolizar os ácidos graxos, em particular no fígado, onde a

oxidação de ácidos graxos é essencial para a produção de energia (PETERS;

SHARA; GONZALES, 2013).

O receptor PPARΔ regula a homeostase da glicose e de lipídios. A ativação

deste receptor diminui as concentrações de triglicerídeos, aumenta a sensibilização

para a insulina e melhora os sintomas associados à síndrome metabólica (PETERS;

SHARA; GONZALES, 2013), sendo expresso em muitos tecidos, mas

acentuadamente no cérebro, tecido adiposo e pele (HAVRYLYUK et al., 2011).

O receptor PPARγ apesar de ser transcrito pelo mesmo gene, existe nas

formas de γ1 (expresso em praticamente todos os tecidos, incluindo coração,

músculos, cólon, rim, pâncreas e baço), γ2 (expresso principalmente no tecido

adiposo) e γ3 (expresso em macrófagos, intestino grosso, tecido adiposo branco)

(HAVRYLYUK et al., 2011). Além disso, sua expressão já foi estudada em vários

tipos de células neoplásicas, tais como o câncer de mama, próstata, pulmão,

colorretal, meduloblastoma, câncer endometrial e melanoma (HERWING et al.,

2013).

Os receptores PPARγ, quando ativados, induzem diferenciação celular,

inibem a proliferação celular e promovem apoptose pelo aumento da expressão da

sinalização pró-apoptótica da BAX e BAD. Além disso, inibem a inflamação em

varios tipos de câncer, estando essa inflamação associada ao aumento da atividade

do fator nuclear kappa B (NF-kB) e também relacionada à promoção do tumor

(PETERS; SHARA; GONZALES, 2013).

As TZDs agem como agonistas sintéticas seletivas dos receptores PPARγ

(KUMAR et al., 2011). A ligação entre a TZD e a PPARγ leva a formação de

heterodímeros com receptores X retinoides (RXRs). Isto é seguido por ligações

sequenciais específicas de DNA denominadas de PPREs, sendo encontrados os

41

promotores dos genes PPARγ, estimulando assim a sua transcrição, mecanismo

este denominado de transativação (figura 5)(CARIOU; CHARBONNEL; STAELS,

2012).

Figura 5 - Mecanismo de ação das TZDs.

FONTE: (ELTE; BLICKLÉ, 2011).

A ativação das PPARγ em linhagens celulares cancerígenas está associada

com a indução da parada do ciclo celular, aumentando a expressão de mRNAs e

proteínas necessárias para a diferenciação celular, incluido as queratinas, antígeno

carcinoembronário, E-caderina, fosfatase alcalina e diferenciação relacionada ao

gene 1 (DRG1), bem como as alterações na morfologia das células com um fenótipo

diferenciado (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2013), levando muitos grupos à

hipótese de que as TZDs, por serem agonistas deste receptor, podem induzir a

diferenciação das células cancerosas e inibir o crescimento do câncer (CHOU et al.,

2007).

As TZDs também apresentam ação atravéz das ciclinas. Bem se sabe que as

ciclinas são reguladoras do ciclo celular, especificamente são subunidades

reguladoras das quinases específicas, sendo sua ativação relacionada com a

42

regulação da progressão do ciclo celular. De fato, as ciclinas são potenciais

oncogênicos, sendo que a superexpressão e/ou amplificação da ciclina D1 são

fatores comuns em vários tipos de câncer, promovendo a progressão da fase G1

(MALIK; UPADHYAYA, MIGLANI, 2011). Sendo assim, os agonistas dos receptores

PPARγ modulam a expressão de diferentes reguladores do ciclo celular, diminuindo

os níveis de ciclina D1 e aumentando os inibidores das quinases dependentes das

ciclinas p21 e p27 (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2013).

Segundo Yang et al. (2012), além das TZDs serem agonistas das PPARγ,

elas também modulam a atividade da AMPK, reduzindo o risco de câncer. Assim,

estudos sugerem que a substância troglitazona, que apresenta atividade

antineoplásica, seja utilizada como protótipo para o desenvolvimento de novos

fármacos antineoplásicos (COLIN et al., 2010; CHANDRAPPA et al., 2010) pois inibe

a via de sinalização de RAF/MEK/ERK (LIU et al., 2012) e estudos apontam que o

uso da rosiglitazona diminui a incidência de câncer (YANG et al., 2012).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 QUÍMICA

4.1.1 Rota sintética dos derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas

Os derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas foram sintetizados

em três etapas sequenciais. Inicialmente realizou-se a síntese do ((5Z)–5–

benzilideno-1,3 tiazolidino-2,4-diona) (BTZD) utilizando o método de irradiação por

micro-ondas, segundo metodologia desenvolvida no laboratório de síntese orgânica.

Em seguida houve a clorossulfonação, segundo Shashikant et al. (2009) com

modificações, e posteriormente foram obtidas 2 séries através de reações de

substituição nucleofílica segundo a Figura 6 abaixo.

43

Figura 6 - Esquema geral de reação de síntese dos derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas.

+

S

NH

O

O

+ OH2

O

S

NH

O

O

S

NH

O

OS

O

OCl

HSO3Cl

S NH

O

O

S

O

O

NH

R

ácido acético

piperidina

a

b

NH2R

c

1 23

45

Serie 1 R = -H, 4-Cl, 3,4 Cl2, 4-CH3, 4-CH3O

Série 2 R= CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3

((5Z)–5–benzilideno-1,3 tiazolidino-2,4-diona) (BTZD)

A BTZD foi obtida pela condensação da TZD (1 g - 8,5 mmol) com

benzaldeído (0,8 mL - 7,8 mmol), ácido acético (12 μl - 0,2 mmol) e piperidina (20 μl

- 0,2 mmol) (LUDESCHER; KHAN; PAUL, 2009). A reação foi realizada por micro-

ondas, sem utilização de solvente a temperatura de 120 ºC e potência de 300 W. O

produto final foi identificado como ((5Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona).

Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzenosulfonila

(BTZDCl)

Foram adicionados 7,845 g (1 mol) de BTZD obtida anteriormente em 15,14

mL (6 mol) de ácido clorossulfônico. Esta reação foi mantida lentamente sob banho

44

de gelo até a completa adição da mistura reacional e em seguida foi aquecida em

banho-maria a 45°C. Após 45 minutos de reação esta foi vertida em um béquer

contendo gelo/água com agitação para a completa precipitação. O produto

precipitado foi filtrado à vácuo e mantido em dessecador á vácuo com sílica gel por

24h.

4.1.2 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas

A substância clorossulfonada (BTZDCl) foi submetida a reação de

substituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas utilizando inicialmente os

5 substituintes propostos no método manual de Topliss e posteriormente os demais

sugeridos de acordo com os parâmetros relacionados a atividade biológica e a

disposição no laboratório de síntese orgânica.

N-fenilbenzenosulfonamida-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil] (E0)

Em um Erlenmeyer foi adicionado 0,2 g (6,6 mmol) de BTZDCl, 10 mL de

metanol e 0,12 mL (1,32 mmol) de anilina destilada. A reação foi mantida sob

agitação em temperatura ambiente por 5 minutos. A reação foi vertida em uma

mistura de água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner e

mantido em dessecador à vácuo por 24h. O composto formado foi um pó de cor

bege e em seguida foi recristalizado em etanol gerando cristais de cor amarelo claro.

4–[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidin–5-ilideno)metil]–N-(4-metilfenil)benzenosulfo-

namida (E1)


metanol e 0,3429 g (3,5 mmol) de 4-metilanilina. A reação foi mantida sob agitação

45

em temperatura ambiente por 6 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de

água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner e mantido em

dessecador à vácuo por 24h. O composto formado foi um pó branco e em seguida

recristalizado em etanol gerando cristais de cor amarelo claro.

4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno)metil]-N-(4-metoxifenil)benzenosulfo-

namida (E2)


metanol e 0,3941 g (3,2 mmol) de 4-metoxianilina. A reação foi mantida sob agitação




recristalizado em etanol gerando um pó amorfo de cor branca.

N-(4-clorofenil)–4-[(Z-(2,4–dioxo-1,3-tiazolidino–5-ilideno)metil]benzenosulfo-

namida (E3)

Em um Erlenmeyer foi adicionado 0,5 g (1,65 mmol) de BTZDCl, 10 ml de

metanol e 0,4082 g (3,2 mmol) de 4-cloroanilina. A reação foi mantida sob agitação




recristalizado em etanol gerando cristais de cor amarelo claro.

N-(3,4-diclorofenil)–4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino-5-ilideno)metil]benzenosul-

fonamida (E4)

Em um Erlenmeyer foi adicionado 0,5 g (1,65 mmol) de BTZDCl 10 mL de

metanol e 0,5185 g (3,2 mmol) de 3,4-dicloroanilina. A reação foi mantida sob

46


mistura de água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner e

mantido em dessecador à vácuo por 24h. O composto formado foi um pó bege e em

seguida recristalizado em etanol gerando cristais de cor amarelo claro.

4.1.3 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas

A BTZDCl foi submetida a reação de substituição nucleofílica com diferentes

aminas alifáticas.

4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzenosulfo-

namida (E5)


metanol e 0,5059 mL (3,2 mmol) de 4-butilfenilamina. A reação foi mantida sob


mistura de água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner. O

composto formado foi um pó de cor amarelo claro e em seguida recristalizado em

etanol gerando cristais de cor amarelo.

4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(3-fenilpropil)benzenosulfo-

namida (E6)


metanol e 0,4031(3,2 mmol) mL de 3-fenilpropilamina. A reação foi mantida sob


mistura de água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O

47


etanol gerando cristais brancos.

N-benzil-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]benzenosulfonamida

(E7)


metanol e 0,3495 mL (3,2 mmol) de benzilamina. A reação foi mantida sob agitação


água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O composto

formado foi um pó de cor amarelo claro e em seguida recristalizado em etanol

gerando cristais brancos.

4-[(Z)-(2,4–dioxo-1,3–tiazolidino–5–ilideno)metil]–N-(2-feniletil)benzenosulfona-

mida (E8)


metanol e 0,4031 mL (3,2 mmol) de 2-fenetilamina. A reação foi mantida sob


mistura de água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O


etanol gerando um pó amorfo branco.

4.1.4 Rota sintética dos derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilide-

no)metil]–N-(4-fenilbutil)benzeno-sulfonamida (E5)

Os derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenil -

butil)benzeno-sulfonamida (E5) foram sintetizados utilizando o método de irradiação

48

por micro-ondas, segundo metodologia desenvolvida no laboratório de síntese

orgânica, segundo Bielenica et al. (2011) com modificações, obtendo-se assim a

série 3 (Figura 7).

Figura 7 - Esquema geral de reação de síntese dos derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzeno-sulfonamida (E5).

O

N

O

S

H

S

O

O

NH R

O

NH

O

S

H

S

O

O

NH

X

R

+ MW

70 °C300 W

X = Cl, Br

Série: R = H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH

3, 4- OCH

3

4-{(Z)-[3-(4-metoxibenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfo-

namida (N1)

Em um balão de 25 mL foi adicionado 0,490 g (1,18 mmol) do composto E5, 1

mL de dimetilformamida (DMF), 181 µL (1,26 mmol) de brometo de 4-metoxibenzila

e 0,174 g (1,26 mmol) de K2CO3. A reação foi mantida sob agitação no micro-ondas

na temperatura de 70°C por 53 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de

água/gelo e o precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O composto

formado foi um pó branco e em seguida recristalizado em etanol gerando um pó

amorfo branco.

4-{(Z)-[3-(4-metilbenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfona-

mida (N2)


mL de DMF, 181 µL (1,26 mmol) de metilbenzilbrometo e 0,174g (1,26 mmol) de

K2CO3. A reação foi mantida sob agitação no micro-ondas na temperatura de 70°C

49

por 60 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de água/gelo e o precipitado

formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O composto formado foi um pó branco e em

seguida recristalizado em etanol gerando um pó amorfo branco.

4-{(Z)-[3-(benzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfonamida

(N3)


mL de DMF, 181 µL (1,11 mmol) de de cloreto de benzila e 0,158 g (1,14 mmol) de

K2CO3. A reação foi mantida sob agitação no micro-ondas na temperatura de 70°C

por 1h e 15 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de água/gelo e o

precipitado formado foi filtrado em funil de Bϋchner. O composto formado foi um pó

branco e em seguida recristalizado em etanol gerando cristais cinzas.

4-{(Z)-[3-(3,4-diclorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosul-

fonamida (N4)


mL de DMF, 184 µL (1,26 mmol) de brometo de 3,4-diclorobenzil e 0,174 g (1,26

mmol) de K2CO3. A reação foi mantida sob agitação no micro-ondas na temperatura

de 70°C por 50 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de água/gelo e o


de cor amarelo claro e em seguida recristalizado em etanol gerando cristais brancos.

4-{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfona-

mida (N5)

50

Em um balão de 25 mL foi adicionado 0,490 g (1,18 mmol)do composto E5, 1

mL de DMF, 0,259 g (1,26 mmol) de brometo de 4-clorobenzil e 0,174 g (1,26 mmol)

de K2CO3. A reação foi mantida sob agitação no micro-ondas na temperatura de

70°C por 300 minutos. A reação foi vertida em uma mistura de água/gelo e o


de cor amarelo claro e em seguida recristalizado em etanol gerando cristais brancos.

4.1.5 Purificação e caracterização estrutural

A formação dos produtos foi monitorada por cromatografia em camada

delgada e ao término das reações os produtos foram isolados. Quando necessário,

os compostos sintetizados foram submetidos à purificação por recristalização

(CECHINEL-FILHO& YUNES, 1998). Para elucidar e caracterizar quimicamente os

compostos purificados foram utilizados dados espectroscópicos usuais como IV,

ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN-1H) e carbono 13 (RMN-13C).

4.1.6 Análise “In silico”: Cálculos teóricos computacionais

Os valores do peso molecular (PM), LogP, aceptores de ligação hidrogênio (N

+ O) e doadores de ligação hidrogênio (NH + OH) foram obtidos a partir do programa

freemolinspiration online, através do JME Editor, cortesia de Peter Ertl da Novartis,

disponível no site: http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties.

4.1.7 Relação Estrutura-Atividade - Método de Topliss

Foram sintetizados derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas em

cuja estrutura estão presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4

–OCH3 ligados a um anel aromático (TOPLISS, 1993). Estes compostos foram

avaliados quanto à atividade citotóxica e antibacteriana, e então foi determinada a

ordem de potência dos parâmetros hidrofóbicos, eletrônicos e estéreos (Tabela 2). A

http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties

51

partir desta análise sugere-se sintetizar novos derivados segundo a tabela 3.

Tabela 2- Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por Topliss.

Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss

π 2π– π 2 - π + 2π - π - π - 2 π - 3 Es

3,4-Cl2 1 1-2 1 5 1 1 1-2 3-4 5 2-5

4-Cl 2 1-2 2 4 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5

4-CH3 3 3 4 2 3 2-3 1-2 1 1 2-5

4-OCH3 4-5 4-5 5 1 5 4 4 2 2 2-5

H 4-5 4-5 3 3 4 5 5 5 3-4 1

Tabela 3 - Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos.

Prováveis parâmetros mais ativos Seleção de novos substituintes

, +, 3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;

4-C-C5H9

, 2– , – 4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4-

O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2

– 2, – 3, 4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9;

4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3

2 – 2 4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3-CH3;

3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl2

4.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

4.2.1 Micro-organismos

Os micro-organismos utilizados como cepas padrões para a realização dos

ensaios de atividade antibacteriana foram bactérias gram-positivas: Staphylococus

aureus (ATCC6538P), Staphylococus saprophyticus (ATCC35552) e Bacillus

subitillis (ATCC 2385). Gram-negativas: Escherichia coli (ATCC 11775) e Salmonella

typhymurium (NEWP 0028).

4.2.2 Preparação dos inóculos

Primeiramente, cada bactéria foi ativada, transferida para o meio ágar

Mueller-Hinton e em seguida incubada a 35 ºC por 18h - 24h.

Para o preparo do inóculo foram selecionadas 3 a 4 colônias da bactéria

ativada em ágar Mueller-Hinton e então transferidas com swab de aste de madeira

estéril para um tubo com 5 mL de salina a 0,86% estéril e então submetido a forte

agitação. A suspensão foi ajustada por espectrofotometria no comprimento de onda

de 530 nm para a obtenção de 75% de transmitância. Para o branco foi utilizado

salina a 0,86% estéril e a transmitância ajustada para 100%. Em cada frasco

contendo meio de cultura foi inoculado 1 uL (1,5 x 105 células) com uma alça

calibrada estéril (CLSI, 2009).

4.2.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A concentração inibitória mínima significa a menor concentração que o

composto em estudo inibe o crescimento bacteriano. Os valores da CIM foram

determinados através do método da diluição em ágar. Os compostos foram

53

dissolvidos em DMSO, atingindo uma concentração de 40 mg/mL, em seguida foram

preparados uma serie de diluições em 10 tubos com concentrações que variaram de

1000 a 2 uM e então adicionado 1000 uL de ágar Mueller-Hinton em cada tubo.

Estes foram imediatamente agitados para total homogeneização da mistura e

inclinados. Após a solidificação dos meios de cultura, os micro-organismos

previamente ativados foram inoculados nas séries correspondentes. Posteriormente

foram incubados em estufa a 35 ºC por 18h - 24h.

Durante os testes foram utilizados tubos controle, contendo apenas o meio de

cultura, sendo considerados os testes válidos aqueles tubos que obtiveram

crescimento bacteriano.

4.2.4 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

A concentração bactericida mínima significa a menor concentração que o

composto em estudo mata a bactéria. Para determinar da CBM foram selecionados

os compostos que apresentaram melhores valores de CIM, sendo realizadas suas

respectivas subculturas em meio ágar Mueller-Hinton. Estas subculturas foram

incubadas a 37 ºC por 18h - 24h e em seguida inspecionadas para a verificação da

CBM.

Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição no ensaio

de CIM e crescimento de micro-organismo na subcultura (CBM) significa ação

bacteriostática e a ausência do crescimento na subcultura significa ação bactericida

(BARON; FINEGOLD, 1990).

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA

4.3.1 Reagentes e materiais

54

O meio de cultura Eagle, modificado por Dulbecco (DMEM), e o soro fetal

bovino (SFB) foram adquiridos da Cultilab (São Paulo, Brasil); os antibióticos

(penicilina, estreptomicina) e o antifúngico (anfotericina B) foram adquiridos da

Invitrogen® (Alemanha); o dimetilsulfóxido (DMSO) foi adquirido da Nuclear; o

brometo de 3-[4,5-dimetiazol-2-il]2,5-difeniltetrazólio (MTT) e o ácido etanossulfônico

de hidroetil-piperazina (HEPES) foram adquirido da Sigma® (St. Louis, MO, EUA).

4.3.2 Cultura celular e crescimento

Foi utilizada a linhagem celular de melanoma murino (B16F10) obtida do

banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ: CR010). As células foram mantidas em

garrafas plásticas de cultura com meio de cultura DMEM (Dulbelco’s Modified Eagle

Medium) contendo 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 10 mM de HEPES, pH 7,4 e,

suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina G, 100 µg/mL

de estreptomicina, 50 µg/mL de anfotericina B, em estufa umidificada, à 37 oC e com

5% CO2.

Antes da realização dos experimentos, o número de células viáveis foi

determinado pelo método de Azul de Trypan (FRESHNEY, 1987). A contagem foi

realizada em câmara de Neubauer.

As substâncias das séries 1, 2 e 3 foram dissolvidas em dimetilsulfóxido

(DMSO), e preparadas às soluções estoques na concentração de 10 mM e a partir

destas, foram feitas as diluições, sendo que a concentração máxima de DMSO no

poço/tratamento foi de 0,1%.

4.3.3. Ensaio da viabilidade celular

A viabilidade celular foi analisada pelo método do MTT (MOSMANN, 1983). O

método MTT baseia-se na utilização de um corante (sal de tetrazólio) solúvel em

água, de cor amarela, que é convertido em um formazan púrpura insolúvel após

clivagem do anel tetrazólio pelas desidrogenases mitocondriais de células viáveis. O

55

formazan púrpura é determinado em 540 nm sendo proporcional à viabilidade

celular.

Foram incubadas 3 x 104 células com as substâncias sintetizadas em

diferentes tempos de incubação (24, 48 e 72 horas) e em diferentes concentrações,

a fim de determinar a curva tempo versus resposta, e concentração versus resposta,

sendo todos os experimentos realizados em triplicata, em placas de 96 poços.

Decorrido o tempo de incubação, o meio de cultura foi retirado e acrescentado um

novo meio contendo o MTT (0,5 mg/mL) seguido de incubação por 2 horas à 37°C.

Este meio foi retirado e o precipitado formazan foi dissolvido com DMSO. O

formazan foi medido em 540 nm, com o uso de um leitor de microplacas. A

densidade óptica obtida do grupo controle, células sem tratamento, foi considerado

como 100% de células viáveis.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média erro padrão da média. As

concentrações inibitórias cinquenta por cento foram determinadas por regressão

linear utilizando GraphPad Prism 6.0®.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 QUÍMICA

Considerando que derivados da TZD demonstraram importantes resultados

como potenciais agentes antitumorais contra linhagens celulares ‘in vitro’ e i’n vivo’

(ALAGAWADI; ALEGAON, 2011; RANCIC et al., 2012) e atividade antibacteriana

(LAL et al., 2013), e que derivados sulfonamídicos também foram ativos contra

varias linhagens celulares (MACHADO et al., 2011), além de também apresentarem

56

atividade antibacteriana (PAREKH; JUDDHAWALA.; RAWAL, 2013), as moléculas

para este estudo foram racionalmente planejadas para unir estes dois fragmentos,

teoricamente ativos: um anel TZD e uma sulfonamida. As modificações ocorreram no

grupo espaçador e no anel arila, conforme a Figura 8.

Figura 8 - Estrutura geral dos compostos planejados como novos protótipos de fármacos citotóxicos e antimicrobianos.

S

NH

O

O

S

O

ONH (CH2)n

R

TZD

Sulfonamida

Espaçador

Arila

Considerando que a busca de novos fármacos com ação citotóxica é de

grande interesse clínico-científico, visto que os quimioterápicos utilizados na clínica

não apresentam grande eficácia contra o melanoma. E, os antibióticos têm diminuido

a sua eficácia em virtude da resistência bacteriana. Além disso, ambos estão

associados a graves efeitos colaterais. Assim, as moléculas planejadas para este

estudo se apresentam como promissores protótipos a futuros fármacos anticancer e

antibacterianos.

Inicialmente realizou-se a condensação da TZD (8,5 mmol) com benzaldeído

(7,8 mmol), formando (BTZD). Esta reação mecanisticamente pode ser considerada

uma derivação da reação de Perkin, ou uma condensação de Knoevenagel.

A reação clássica de Perkin é uma condensação catalisada por base de um

aldeído aromático com um anidrido de ácido carboxílico formando um ácido

carboxílico α,β- insaturado. Uma variação da reação de Perkin pode ser considerada

com a TZD, a qual reage de uma forma muito similar ao anidrido da reação original.

Esta molécula é um heterocíclo com um grupo metileno ativo (ácido) que pode ser

57

desprotonado com uma base relativamente leve, no caso a piperidina gerando um

nucleófilo que ataca a carbonila do grupo funcional aldeído (MAYO; PIKE; FORBES,

2010).

A reação de Knoevenagel é uma modificação da condensação aldólica, isto é,

uma condensação de Knoevenagel é uma adição nucleofílica de um carbânion a um

grupo carbonila seguida de uma reação de desidratação na qual uma molécula de

água é eliminada. O produto é quase sempre uma enona alfa, beta conjugada.

Nesta reação o grupo carbonila estava presente no anel TZD e o catalisador

utilizado foi a piperidina (uma amina fracamente básica) (PINEDA et al., 2013).

Neste trabalho foi realizada esta reação sob irradiação de micro-ondas, a uma

potência de 300 W e temperatura de 120oC, nestas condições a reação segue com

uma rápida reação de eliminação (desidratação) após a adição nucleofílica formando

o núcleo benzilideno (Figura 9).

Figura 9 - Mecanismo de condensação da tiazolidinodiona com benzaldeido seguido de eliminação.

NHS

O

OH

H

..

NH

C-

S

O

OH

O

HNHS

O

O

O-

HH

NHS

O

O

OH

HH

H+NHS

O

O

O+

H H

HH

NHS

O

O

+ OH2

+

H+

NH

N+

H H

..

..

A BTZD formada foi então clorossulfonada utilizando-se ácido clorosulfônico

à temperatura controlada, ocorrendo assim uma substituição eletrofílica aromática e

formando o Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzeno-

sulfonila (BTZDCl) (Figura 10).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Condensa%C3%A7%C3%A3o_ald%C3%B3lica

http://pt.wikipedia.org/wiki/Adi%C3%A7%C3%A3o_nucleof%C3%ADlica

http://pt.wikipedia.org/wiki/Carb%C3%A2nion

http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbonila

http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_de_desidrata%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Enona

http://pt.wikipedia.org/wiki/Sistema_conjugado

http://pt.wikipedia.org/wiki/Catalisador

http://pt.wikipedia.org/wiki/Amina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Base_(qu%C3%ADmica)

58

Um importante agente de sulfonação originador de ácidos sulfônicos, sulfonas

e cloretos de sulfonilo é o ácido clorossulfônico, utilizado como reagente para

clorossulfonação ou sulfonação de compostos aromáticos. Para realizar a

sulfonação basta um equivalente molar ao composto, utilizando um solvente inerte

(Ex: clorofórmio) evitando assim formação de produtos indesejáveis. Já na

clorossulfonação o equivalente molar deve estar em excesso podendo a reação

acontecer mesmo com a ausência ou presença de um solvente inerte.

Ao se utilizar uma quantidade equimolar de ácido clorossulfônico há

inicialmente a formação de ácido sulfônico e, na presença de um excesso de

reagente, o ácido sulfônico inicialmente formado é convertido lentamente em cloreto

de sulfonilo com libertação de ácido sulfúrico. Não se conhece exatamente a via

mecanística, contudo sabe-se que quando a clorossulfonação é realizada sob

condições suaves e com excesso de ácido clorossulfônico como solvente, é possível

que a espécie eletrofílica possa ser o ácido clorossulfônico, intacto (CARVALHO,

2009).

Figura 10 - Mecanismo de substituição eletrofílica aromática para a formação do cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzeno-sulfonila (BTZDCl).

NHS

O

OS

O

OOH

Cl

+0 °C - 45 °C

agitação

S

O

OH

O

NHS

O

O

S

O

Cl

OH

O-

H

NHS

O

O+

SO2ClO

H

+S

O

O+

O

NHS

O

O

H H

SO

O

Cl

O-

+

S

O

Cl

O

NHS

O

O

+ +OH2 SO3

..

..

..

....

59

A BTZDCl, é uma substância bastante reativa frente as reações de

substituição nucleofílica, assim inicialmente utilizou-se diferentes aminas aromáticas

selecionadas segundo os substituintes propostos por Topliss: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-

OCH3, 4-CH3, diretamente ligados ao anel aromático na sua estrutura, formando a

Série 1.

A metodologia conhecida como método manual de Topliss, consiste de um

modelo não estatístico e não computadorizado, que pode ser usado para predizer

quais grupos substituintes podem ser introduzidos em determinada molécula para

aumentar significativamente sua atividade biológica (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-

FILHO; CORRÊA, 2010).

A ordem de potência projetada destes cinco derivados, para vários

parâmetros (hidrofóbico, eletrônico e ou estéreo) é mostrada na tabela 2, cujos

compostos são colocados em ordem de atividade e comparados com a ordem

destes parâmetros. A partir disto são selecionados novos substituintes (Tabela 3) a

fim de se obter compostos ainda mais ativos que os da série inicial.

A maior vantagem da aplicação deste método de correlação entre estrutura

atividade consiste na sua simplicidade, possibilitando bons resultados com rapidez, e

não requerer o uso de procedimentos estatísticos e computadorizados, embora uma

deficiência no método consista em não se estender a outros parâmetros (CAMPOS-

BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010).

Além da série de Topliss (Série 1), foi sintetizada mais uma série, também

através da reação com substituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas

(Série 2). A série 3 foi sintetizada a partir do derivado E5 da série 2 a fim de otimizar

a atividade biológica, também por reação de substituição nucleofílica.

Ambas as séries foram realizadas explorando a reatividade da função cloreto

de sulfonila. Em todas elas realizou-se a condensação com os derivados das aminas

através da reação de substituição nucleofílica biomolecular. Esta é uma reação em

que o par de elétrons do nitrogênio da amina é o nucleófilo e ataca o átomo de

enxofre do cloreto de sulfonila (deficiente em elétrons). A eliminação do cloreto como

grupo abandonador é sincronizada e há a formação de derivado sulfonamídico

segundo o mecanismo demonstrado na Figura 11.

60

Figura 11 – Proposta de mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para a formação dos derivados sulfonamídicos.

Série 1:

R= -C6H

5; 4-CH

3C

6H

4; 4-OCH

3C

6H

4; 4-ClC

6H

4; 3,4-Cl

2C

6H

4;

Série 2:

R= -CH2C

6H

5; -(CH

2)2C

6H

5;-(CH

2)3C

6H

5;-(CH

2)4C

6H

5;

NHS

O

OS

O

O

Cl+NH2R

NHS

O

OS

O

O

NH

R

+ ClH

MeOH

t. ambagitação NHS

O

OS-

O-

O-

Cl

N+

R

H

H

A grande reatividade do BTZDCl pode ser observada no baixo tempo de

reação realizada apenas sob agitação a temperatura ambiente (5 a 7 minutos), e na

sua grande maioria os rendimentos reacionais foram bastante satisfatórios

demonstrando por CCD apenas um único “spot” sob observação a 264 nm em

câmara de luz UV. Todas as reações foram submetidas à recristalização com etanol

para aumentar ainda mais o grau de pureza dos compostos, garantindo uma boa

caracterização, embora algumas perdas significativas foram encontradas durante o

procedimento de recristalização e o Rf dos compostos foram todos mantidos, sendo

usados como eluentes o hexano e acetato de etila na concentração de 1:1, sem

nenhuma alteração visualmente significante por cromatografia. Também foi realizado

o ponto de fusão dos compostos antes e após a recristalização, não se observando

diferença significativa. Isto demonstra que a reação ocorre de forma bastante limpa,

sem a formação de subprodutos (Tabela 4).

61

Tabela 4 - Estrutura, tempo reacional, rendimento e ponto de fusão das substâncias BTZD, BTZDCl e das séries 1 e 2, realizadas sob agitação a temperatura ambiente.

NH

O

S

O

R

Substituinte

-R

Código Tempo

(min)

Rend. R.

(%)

R.f. P. F (oC)

Recrist

H BTZD 10 67,5 0,723 255,5 – 256,0

SO2Cl

BTZDCl 45 52,0 0,676 244,5 – 245,1

Série 1

SO2 NH

E0

5

74,68

0,714

236,8 – 237,2

SO2 NH

CH3

E1

5

51,37

0,543

263,1 – 263,7

SO2 NH

OCH3

E2

7

42,28

0,531

217,1 – 218,8

SO2 NH

Cl

E3

6

47,88

0,706

212,1 – 217,8

SO2 NH

Cl

Cl

E4

7

93,76

0,594

234,7 – 235,6

Série 2

SO2 NH (CH2)4

E5

5

40,40

0,75

198,2 – 198,8

SO2 NH (CH2)3

E6

6

55,12

0,666

235,3 – 235,7

62

SO2 NH

E7

5

50,10

0,687

248,1 - 248,8

SO2 NH (CH2)2

E8

5

23,85

0,472

210,2 – 210,7

Legenda:; R.f: Fator de retenção; Rend. R.: Rendimento do composto recristalizado; P.F.R: Ponto de fusão do composto recristalizado.

Os espectros de IR (Figura 12), 1H RMN (Figura 13) e 13 C RMN (Figura 14)

da 4–[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidin–5-ilideno)metil]–N-(4-metilfenil)benzenosulfonami-

da (E1) foram selecionados a título de ilustração e para a demonstração detalhada

dos valores observados nas séries 1 e 2.

No espectro de IR verifica-se a presença de bandas de absorção em 1734,01

e 1716,65 cm-1, caracteristicas de deformações axiais correspondentes as carbonilas

do anel tiazolidinodiona. A presença da ligação C=C é evidenciada pela banda de

absorção em 1683,86 cm-1. Em 605,65 cm-1 é possível observar a absorção devido

ao estiramento relativo ao =C-S presente no anel tiazolidinodiona. Em 1328,96 e

1150 cm-1 verifica-se deformações simétricas e assimétricas, correspondentes ao

SO2 presente na sulfonamida. Em 1606,63 e 1508,33 cm-1 evidenciam-se as bandas

de absorção características de C=C do anel aromático. Além disso, verifica-se uma

banda de absorção em 3277,06 cm-1, característica de deformação axial

correspondente ao NH da sulfonamida e em 3146 cm-1 outra deformação axial

correspondente ao NH do anel tiazolidinodiona.

Continua

63

Figura 12 - Espectro de IR do composto (E1) (KBr, cm-1).

No espectro de RMN 1H pode-se observar um simpleto em 2,17 ppm referente

aos 3 hidrogênios do radical metila, ligado ao anel para substituído que apresenta os

seis sinais em 7,04 – 6,95 ppm como um duplo dupleto referente aos hidrogênios

H16/20 e H 17/19 respectivamente, com uma constante de acoplamento (J) de 6,3 Hz

para ambos. Entre 7,83 e 7,70 ppm pode-se observar outro duplo dupleto referente

aos hidrogênios H9/11 e H 8/12 respectivamente, do anel benzilideno também para

substituído (J = 6,3 Hz). Em 7,76 ppm tem-se um simpleto referente ao hidrogênio

H6, e em 10,26 ppm outro simpleto atribuído ao NH da sulfonamida.

500750100012501500175020002250250027503000325035003750400042504500

1/cm

37.5

45

52.5

60

67.5

75

82.5

90

97.5

%T

3508

.52

3277

.06

3145

.90

3045

.60

2920

.23

2762

.06

1734

.01

1716

.65

1683

.86

1608

.63

1508

.33

1328

.95

1300

.02

1290

.38

1219

.01

1153

.43

1089

.78

1014

.56

937.

40

756.

10

605.

65

580.

5754

2.00

2

O

NH3

4

O

5

S1

67

H8

9

12

10

11

S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

CH321

64

Figura 13 - Espectro de RMN 1H do composto (E1) (CDCl3/ 300 MHz).

No espectro de RMN 13C o sinal em 20,7 ppm refere-se ao carbono C21 do

grupo metila ligado ao anel C. Este anel para substituído apresenta sinais de CHs

em 121,2 ppm (C16/20) e 130,1 ppm (C17/19) e carbonos quaternários em 134,2 ppm

(C18) e 134,9 ppm (C15). O anel B apresenta a mesma configuração de sinais, sendo

os CHs em 127,9 ppm (C9/11) e 130,8 ppm (C8/12) e os quaternários em 137,4 ppm

(C7) e 140,6 ppm (C10). O CH do benzilideno encontra-se em 129,9 ppm, e no anel A

da TZD tem-se apenas o C5 em 127,2 ppm e os sinais em 167,9 e 167,5 ppm

referentes as carbonilas C2 e C4, respectivamente.

2

O

NH3

4

O

5

S1

67

H

89

1210

11S13

O

ONH1415

16

20

17

19

18

CH321

ABC

65

Figura 14 - Espectro de RMN 13C do composto (E1) (CDCl3/ 300 MHz).

Desta mesma forma foram analisadas todas as demais moléculas protótipos e

séries 1 e 2 cujos dados de caracterização química estão abaixo:

((5Z)–5–benzilideno-1,3 tiazolidino-2,4-diona) (BTZD)

S1

2

O

NH3

4

O

5

6

7

8

12

11

9

10

Fórmula molecular: C10H7NO2S

IR (KBr, cm-1): 3142-3014 (NH), 1739; 1691 (-C=O), 1627 (C=C).

2

O

NH3

4

O

5

S1

67

H8

9

12

10

11

S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

CH321

ABC

66

RMN 1H (DMSO-d6, ppm): 7,486 – 7622 (H8-12, 5H, Ar); 7,801 (s, 1H, H6); 12,5 (s,

1H, H3).

RMN 13C (DMSO-d6, ppm): 123,5 (C5); 129,3 (C9/11); 129,9 (C8/12); 130,4 (C10); 131,8

(C6); 133,0 (C7); 167,3 (C4); 167,9 (C2).

Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)metil]benzenosulfonila

(BTZDCl)

S1

2

O

NH3

4

O

5

6

7

8

12

11

9

10

S

O

O

Cl

Fórmula molecular: C10H7O4NS2Cl

IR (KBr, cm-1): 3221 (v, s –NH, tiazolidinodiona), 1753; 1740 (v -C=O,

tiazolidinodiona), 1602 (v -C=C), 1404; 1589 (v -C=C, anel aromático), 1315; 1151

(vs, vas –SO2), 748. (v –S, tiazolidinodiona).

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 7,58 – 7,56 (dd, Ar, 2H, J= 8,1Hz), 7,74 - 7,71 (dd, Ar, 2H,

H9/11, J= 8,1Hz), 7,77 (s, 1H, H6), 12,62 (bl, 1H, H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 124,7 (C8/12), 126,5 (C5), 129,7 (C6), 131,1 (C7), 133,3

(C9/11), 149,5 (C10), 167,4 (C4), 168,0 ( C2).

Série 1: Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas

N fenilbenzenosulfonamida-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil] (E0)

67

2

NH3

4

O

S1

5

O6

7

8

9

10

11

12S13

O

O

NH14

15

16

20

17

19

18

Fómula molecular: C16H2N204S2

IR: (Pastilha de KBr, cm-1): 3217 (ν, s –NH), 3061 (v, s –NH, tiazolidinodiona), 1744;

1718 (v -C=O, tiazolidinodiona), 1609 (v -C=C), 1406; 1495 (v -C=C, anel aromático),

1317; 1155 (vs, vas –SO2), 748 (v –S, tiazolidinodiona).

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 7,27 – 7,01 (m, 5H Ar, H16-20), 7,72 – 7,87 (dd, 4H Ar, H8/12

e H9/11), 7,78 (s, 1H, H6), 10,44 (s, 1H, H14), 12,75 (bl, 1H, H3).

13C RMN: 120,2 (C16/20), 124,3 (C18), 126,9 (C9/11), 127,2 (C5), 127,6 (C17/19), 129,4

(C8/12), 130,4 (C6), 137,1 (C15), 137,3 (C10), 140,2 (C7), 167,1 (C4), 167,5 (C2).

4–[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidin–5-ilideno)metil]–N-(4-metilfenil)benzenosulfo-

namida (E1)

2

O

NH3

4

O

5

S1

67

8

9

12

10

11

S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

CH321

Fómula molecular: C17H14N2O4S2




1H RMN (DMSO-d6, ppm): 2,17 (s, 3H, H21), 6,95 – 6,97 (d, 2HAr, H17/19, J= 6,3 Hz),

7,04 – 7,02 (d, 2HAr, C16/20, J= 6,3 Hz), 7,70 – 7,72 (d, 2HAr, H8/12, J= 6,3Hz), 7,76

(s, 1H, H6), 7,80 – 7,83 (d, 2H Ar, H9/11, J=6,3Hz),10,25 (s, 1H, H14).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 20,68 (C21), 121,2 (C16/20), 127,2 (C5), 127,9 (C9/11), 129,9

(C6), 130,1 (C17/19), 130,8 (C8/12), 134,2 (C15), 134,9 (C18), 137,4 (C10), 140,6 (C7),

167,5 (C4), 167,7 (C2).

68

4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno)metil]-N-(4-metoxifenil)benzenosulfo-

namida (E2)

2

O

NH3

4

O

5

S1

6

7

8

9

12

10

11

S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

O21

CH322





1H RMN (DMSO-d6, ppm): 3,67 (s, 3H,H22), 6,80 – 6,83 (d, 2HAr, H17/19, J= 8,7 Hz),

6,96 – 6,99 (d, 2HAr, H16/20, J= 8,7 Hz), 7,74 – 7,72 (d, 2HAr, H8/12, J= 8,7 Hz), 7,78

(s, 1H, H6), 7,79 – 7,77 (d, 2HAr, H9/11, J= 8,1 Hz), 10,07 (s, 1H, H14), 12,76 (bl, 1H,

H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 55,1 (C22), 114,3 (C17/19), 123,7 (C16/20), 126,9 (C9/11),

127,3 (C5), 127,7 (C15), 129,7 (C8/12), 130,6 (C6), 136,9 (C10), 140,2 (C7), 156,7(C18),

167,2 (C4), 167,6 (C2).

N-(4-clorofenil)–4-[(Z-(2,4–dioxo-1,3-tiazolidino–5-ilideno)metil]benzenosulfo-

namida (E3)

2

O

NH3

4

O

5

S1

6

7

8

9

1210

11S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

Cl

Fórmula molecular: C16H11ClN2O4S2




69

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 7,10–7,13 (d, 2Ar, H19/17, J=8,7 Hz), 7,30 – 7,33 (d, 2Ar,

H16/20, J=8,7 Hz), 7,74 – 7,77 (d, 2Ar, H8/12, J=8,4 Hz), 7,79 (s, 1H, H6), 7,85 – 7,87

(d, 2Ar, H9/11, J=8,1 Hz), 10,60 (s, 1H, H14), 12,76 (bl, 1H, H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 121,8 (C16/20), 127,0 (C9/11), 127,6 (C5), 128,5 (C17/19),

129,3 (C8/12), 130,4 (C18), 130,7 (C15), 136,3 (C10), 137,3 (C7), 139,8 (C6), 167,2 (C4),

167,6 (C2).

N-(3,4-diclorofenil)–4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino-5-ilideno)metil]benzenosul-

fonamida (E4)

2

O

NH3

4

O

5

S1

6

7

8

9

1210

11S13

O

ONH14

15

16

20

17

19

18

Cl

Cl

Fómula molecular: C16H10Cl2N2O4S2


1699 (v -C=O, tiazolidinodiona), 1603 (v -C=C), 1591; 1474; 1404 (v -C=C, anel

aromático), 1327; 1100 (vs, vas –SO2), 690 (v –S, tiazolidinodiona).

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 7,09-7,12 (dd, 1HAr, H20, J=8,7 Hz), 7,29-7,30 (d, 1HAr,

H16, J=2,7 Hz), 7,51-7,54 (d, 1HAr, H19, J=8,7 Hz),, 7,76-7,79 (d, 2HAr, H8/12, J=8,1

Hz), 7,79 (s, 1H, H6), 7,89-7,91 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4 Hz), 10,92 (bl, 1H, H3/14).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 119,9 (C17/19), 120,9 (C16/20), 126,3 (C9/11), 127,3 (C5),

127,7 (C15), 129,1 (C8/12), 129,5 (C6), 131,5 (C10), 137,6 (C7), 139,4 (C18), 167,3 (C4),

167,6 (C2).

Série 2: Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas

4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzenosulfo-

namida (E5)

70

2

O

NH3

4O

5

S1

67

89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

17

18

19

20

21

22 23

24


IR: (Pastilha de KBr, cm-1): 3277 (ν, s –NH), 3147 (ν, s –NH, tiazolidinodiona), 1747;



1H RMN (DMSO-d6, ppm): 1,34–1,41 (m, 2H, H17), 1,45–1, 53 (m, 2H, H16), 2,45–

2,51 (q, 2H, H18), 2,76 – 2,82 (q, 2H, H15), 7,11 – 7,27 (m, 5HAr, H20/24), 7,73 (t, 1H,

H14), 7,76– 7,80 (d, 2HAr, H8/12, J=8,1 HZ), 7,84 (s, 1H, H6), 7,87 – 7,90 (d, 2HAr,

H9/11, J=8,4 HZ), 12,76 (bl,1H, H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 27,9 (C17), 28,7 (C16), 34,6 (C18), 42,4 (C15), 125,7

(C21/23), 126,6 (C20/24), 127,0 (C9/11), 128,2 (C8/12), 129,7 (C19), 130,0 (C22), 130,7 (C5),

136,6 (C6), 141,6 (C10), 141,9 (C7), 167,3 (C4), 167,7 (C2).

4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(3-fenilpropil)benzenosulfo-

namida (E6)

2

O

NH34

O5

S1

6

7

89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

17

18

1920

21

2322





71

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 1,59 – 1,69 (m, 2H, H16), 2,51 (t, 2H, H17), 2,75 – 2,81 (q,

2H, H15), 7,08 – 7,26 (m, 5HAr, H19/23), 7,78 – 7,81 (d, 2HAr, H8/12, J=8,4 Hz), 7,83

(m, 1H, H14), 7,85 (s, 1H, H6), 7,88 – 7,91 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4 Hz), 12,76 (bl,1H,

H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 31,1 (C16), 32,4 (C17), 42,5 (C15), 126,3 (C9/11), 127,1

(C21), 127,5 (C19/23), 127,9 (C20/22), 128,8 (C8/12), 130,1 (C5), 130,5 (C6), 131,3 (C10),

137,1 (C7), 141,7 (C18), 167,7 (C4), 168,3 (C2).

N-benzil-4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]benzenosulfonamida

(E7)

2

O

NH3

4O

5

S1

67

89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

19

20 21



1691 (v -C=O, tiazolidinodiona), 1605 (v -C=C), 1500; 1450, 1400 (v -C=C, anel

aromático), 1380; 1150 (vs, vas –SO2), 600 (v –S, tiazolidinodiona).

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 4,04–4,02 (d, 2H, H15, J=6,3 Hz), 7,22–7,30 (m, 5HAr,

H17/21), 7,75–7,77 (d, 2HAr, H8/12, J=8,1Hz), 7,84 (s, 1H, H6), 7,88–7,91 (d, 2HAr,

H9/11, J=8,4 Hz), 8,33 (t, 1H, H14), 12,76 (bl,1H, H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 46,1 (C15), 126,6 (C19), 127,1 (C17/21), 127,4 (C9/11), 128,2

(C8/12), 130,6 (C5), 136,6 (C6), 137,4 (C10), 141,6 (C7), 167,3 (C4), 167,7 (C2).

4-[(Z)-(2,4–dioxo-1,3–tiazolidino–5–ilideno)metil]–N-(2-feniletil)benzeno-

sulfonamida (E8)

72

2

O

NH3

4O

5

S1

67

89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

1718

19

20 21

22





1H RMN (DMSO-d6, ppm): 2,68 (t, 2H, H16), 2,97-3,04 (q, 2H, H15), 7,14 – 7,28 (m,

5HAr, H18/22), 7,76 – 7,79 (d, 2HAr, H8/12, J=8,1 Hz), 7,84 (s, 1H, H6), 7,86 – 7,90 (d,

2HAr, H9/11, J=8,4 Hz), 7,89 (t, 1H, H14), 12,75 (bl,1H, H3).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 126,8 (C9/11), 127,2 (C19/21), 127,6 (C18/22), 128,6 (C8/12),

129,7 (C20), 130,4 (C5), 130,8 (C6), 136,8 (C10), 138,7 (C7), 141,3 (C17), 167,4 (C4),

167,8 (C2).

A síntese da série 3 foi realizada apenas após a análise biológica das séries 1

e 2 na tentativa de otimizar o composto E5 (série 2) o qual apresentou maior

atividade no método de toxicidade celular. Esta série utilizou o derivado E5 como

protótipo e realizou-se uma reação de substituição nucleofílica no nitrogênio do anel

da TZD. Esta série foi sintetizada segundo metodologia proposta por Kaminskyy et

al. (2009) e Romagnoli et al. (2013), com modificações.

Kaminskyy et al. (2009), relatam que a substituição deste nitrogênio em

substâncias análogas as apresentadas neste trabalho aumenta a atividade citotóxica

da molécula.

Em 2013, Romagnoli e colaboradores sintetizaram compostos contendo 5-

benzilideno-2,4-tiazolidinodiona, nos quais foram feitas substituições no nitrogênio

do anel da TZD com diferentes haletos de benzila, apresentando atividade

anticâncer.

Esta reação também ocorre por um mecanismo de reação bimolecular, porém

agora o nucleófilo da reação é o nitrogênio do anel da TZD e a reação ocorre com

73

diferentes haletos de benzila cujas substituições no anel aromático também foram

selecionadas segundo a metodologia de Topliss já descrita anteriormente. O

mecanismo desta reação está demonstrado na Figura 15.

Figura 15 - Mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para a formação dos derivados da 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzenosulfonamida (E5).

O

N

O

S

H

S

O

O

NH R

O

NH

O

S

H

S

O

O

NH

X

R

+ MW

70 °C300 W

X = Cl, Br

Série 3: R = H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH

3, 4- OCH

3

O

N

O

S

H

S

O

O

NH

H

C

X

H

H

Considerando a baixa reatividade nucleofílica do nitrogênio do anel TZD todas

as reações, da série 3, foram realizadas sob irradiação de micro-ondas, com tempos

reacionais variando entre 50 e 75 minutos e rendimentos acima de 50%. As

substâncias foram recristalizadas em etanol para a obtenção de cristais para as

análises de caracterização. O acompanhamento destas reações por CCD e a

verificação do ponto de fusão antes e após a recristalização demonstraram que

nestas reações também não foi verificado a formação de subprodutos, utilizando

como eluente o hexano e acetato de etila na concentração de 1:1 (Tabela 5).

74

Tabela 5 - Estrutura, tempo reacional, rendimento e ponto de fusão das substâncias da série 3, por irradiação em micro-ondas, temperatura de 70 °C e potência de 300 W.

O

N

O

S

S

O

O

NHR

Substituinte

-R

Cód. Tempo

(min)

Rend.

(%)

Rend. R

(%)

R.f. P. F (oC)

P. F. R (oC)

4-OCH3 N1 53 62,82 20 0,787 186,1 - 186,7 186,6 - 187,1

4-CH3 N2 60 60,86 19 0,848 183,0 - 183,6 183,4 - 183,9

-H N3 75 55,98 18 0,517 167,6 - 168,3 167,2 - 167,9

3,4-Cl2 N4 50 54,5 22 0,690 342,3 - 343,0 342,7 - 343,3

4-Cl N5 300 52,6 21 0,878 - -

Legenda: Cód.: Código; Rend.: Rendimento; Rend.R.: Rendimento do composto Recristalizado; R.f: Fator de Retenção; P.F: Ponto de Fusão; P.F.R: Ponto de Fusão do composto Recristalizado.

Os espectros de IR (Figura 16), 1H RMN (Figura 17) e 13 C RMN (Figura 18)

da 4-{(Z)-[3-(4-metilbenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfonami-

da (N2) foram selecionados a título de ilustrações e para a demonstração de valores

da série 3.

No espectro de IR verifica-se a presença de bandas de absorção em 1697,36

e 1681,93 cm-1 caracteristicas de deformações axiais correspondentes as carbonilas

do anel tiazolidinodiona. A presença da ligação C=C está evidenciada na banda de

absorção em 1606,70 cm-1. Em 1580 e 1500 cm-1 evidencia-se as ligações C=C do

anel aromatico. Em 721,38 cm-1 evidencia-se o átomo de enxofre (S), presente no

anel tiazolidinodiona e em 1313,52 e 1151,50 cm-1 verificam-se deformações

simétricas e assimétricas, correspondentes ao SO2 presente na sulfonamida. Em

3242,34 cm-1 evidencia-se a banda de absorção característica deformação axial

correspondente ao NH da sulfonamida.

75

Figura 16 - Espectro de IR do composto (N2) (KBr, cm-1).

No espectro de RMN 1H observa-se dois multipletos entre 1,34–1,41 e 1,45–

1,52 ppm, ambos com uma integral de 2 hidrogênios, respectivamente aos metilenos

H16 e H17. Em 2,27 ppm tem-se um simpleto referente aos 3 hidrogênios do grupo

metila H32. Os metilenos H18 e H15 apresentam-se na forma de quartetos nas regiões

de 2,45-2,50 e 2,77-2,84 ppm. Em 4,80 ppm observa-se um simpleto referente ao

H25 do grupo benzilico. Na região de 7,10-7,26 ppm observamos um multipleto com

a integral referente a 9 hidrogênios os quais referem-se ao anel monosubstituido H20-

24, e também ao anel benzilico H27/31 e H28/30. Em 7,76 ppm observa-se um tripleto

com a integral de 1 hidrogênio que foi atribuído ao H14 da sulfonamida. Entre 7,79 e

7,92 ppm observa-se um duplo dupleto característico de anel para substituído

referente aos H8/12 e H9/11 (J= 8,4 Hz). Em 8,0 ppm pode-se observar um simpleto

referente ao H6 do alceno conjugado.

80010001200140016001800200024002800320036004000

1/cm

22.5

30

37.5

45

52.5

60

67.5

75

82.5

90

97.5

%T

3242

.34

2931

.80

2922

.16

2360

.87

1762

.94

1697

.36

1681

.93

1606

.70

1423

.47

1384

.89

1336

.67

1313

.52

1284

.59

1151

.50

1091

.71

1072

.42

744.

52

721.

38

Amostra -

2

O

N3

4O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

17

18

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

28

29

CH332

76

Figura 17 - Espectro de RMN 1H do composto (N2) (CDCl3/ 300 MHz).

No espectro de RMN 13C o sinal em 20,6 ppm refere-se ao C32 da metila, os

sinais em 27,8, 28,6, 34,5 e 42,3 corresponde aos metilenos da cadeia butílica,

sendo respectivamente, C17, C16, C18, C15, devido ao desblindamento exercido pelo

anel aromático e pelo grupo sulfonamida nestes carbonos. O C25 é observado em

44,6, sendo o mais desblindado devido à dupla vizinhança do anel da TZD e do anel

2

O

N3

4O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

17

18

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

28

29

CH332

A

B

C

D

77

aromático (D). Este anel apresenta os seu sinais de CHs em 127,2 ppm (C28/30) e em

129,2 ppm (C27/31), seus carbonos quaternários estão em 131,5 ppm (C29) e 132,3

ppm (C26). Nesta mesma região também se observam os sinais do anel C, cujos

CHs estão em 125,6 ppm (C22), 128,1 ppm (C20/24), 128,2 ppm (C21/23) e o carbono

quaternário em 137,1 ppm (C19). O anel B também para-substituído apresenta os

sinais de CHs em 123,9 ppm (C9/11) e 130,6 (C8/12) e os carbonos quaternários em

141,8 (C7/10). O sinal do C5 do anel A pode ser observado em 127,7 ppm, e suas

carbonilas em 165,3 ppm (C4) e 166,9 ppm (C2).

Figura 18 - Espectro de RMN 13C do composto (N2) (CDCl3/ 300 MHz).

Desta mesma forma foram analisadas todas as demais moléculas da série 3

cujos dados de caracterização química estão abaixo:

2

O

N3

4O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

15

16

17

18

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

28

29

CH332

A

B

C

D

78

4-{(Z)-[3-(4-metoxibenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfo-

namida (N1)

2

O

N3

4

O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

2829

O32

CH333


IR: (Pastilha de KBr, cm-1): 3255 (ν, s –NH, sulfonamida), 1697; 1682 (v -C=O,


(vs, vas –SO2), 650 (v –S, tiazolidinodiona).

1H RMN (DMSO-d6, ppm): 1,34 - 1,41(m, 2H, H17), 1,47 - 1,52 (m, 2H, H16), 2,45 -

2,51 (s, 1H, H18), 2, 79 – 2, 81 (s, 1H, H15), 3,73 (s, 3H, H33), 4,78 (s, 2H, H25), 6,90-

6,93 (d, 2HAr, H27/31, J=8,7 HZ), 7,10-7,23 (m, 5Har, H20-24), 7,26 – 7,29 (d, 2HAr,

H28/30, J=8,7 Hz), 7,75 (t, 1H, H14), 7, 79 – 7, 82 (d, 2HAr, H8/12, J=8,4 Hz), 7,89 –

7,91 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4 HZ), 8,00 (s, 1H, H6).

13C RMN (DMSO-d6, ppm): 27,8 (C17), 28,6 (C16), 34,5 (C18), 42,3 (C15), 44,3 (C25),

55,1 (C33), 114,0 (C28/30), 124,0 (C22), 125,6 (C9/10), 127,2 (C5), 127,3 (C20/24), 128,1

(C8/12), 128,2 (C21/23), 129,4 (C27/31), 130,6 (C26), 131,5 (C6), 136,4 (C19), 141,8 (C7/10),

158,4 (C29), 165,3 (C4), 167,9 (C2).

4-{(Z)-[3-(4-metilbenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfona-

mida (N2)

2

O

N3

4

O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

2829

CH332

79





1H RMN (DMSO-d6, ppm): 1,34 – 1,41 (m, 2H, H16), 1,45 – 1,53 (m, 2H, H17), 2,27 (s,

3H, H32), 2,45 – 2,52 (q, 2H, H18), 2,77 – 2,84 (q, 2H, H15), 4,80 (s, 1H, H25), 7,10-

7,26 (m, 9HAr, H20-24 , H27/31 e H28/30), 7,76 (t, 1H, H14), 7,79 - 7,83 (d, 2HAr, H8/12,

J=8,4 Hz), 7,89 - 7,92 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4 HZ), 8,0 (s, 1H, H6).


44,6 (C25), 123,9 (C22), 125,6 (C9/11), 127,2 (C28/30), 127,7 (C5), 128,1 (C20/24), 128,2

(C21/23), 129,2 (C27/31), 130,6 (C8/12), 131,5 (C29), 132,3 (C6), 136,4 (C26), 137,1 (C19),

141,8 (C7/10), 165,3 (C4), 166,9 (C2).

4-{(Z)-[3-(benzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzenosulfonamida

(N3)

2

O

N3

4

O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

2829





1H RMN (DMSO-d6, ppm): 1,32 – 1,41 (m, 2H, H16), 1,45 – 1,55 (m, 2H, H17), 2,45 –

2,52 (q, 2H, H18), 2,77 – 2,84 (q, 2H, H15), 4,86 (s, 1H, H25), 7,10-7,37 (m, 10HAr,

H20-24 , H27-31), 7,76 (t, 1H, H14), 7,80 - 7,83 (d, 2HAr, H8/12, J=8,4 Hz), 7,89 - 7,92 (d,

2HAr, H9/11, J=8,4 HZ), 8,0 (s, 1H, H6).


123,9 (C22), 125,6 (C29), 127,2 (C9/11), 127,6 (C20/24), 127,8 (C5), 128,0 (C21/23), 128,1

80

(C28/30), 128,6 (C27/31), 130,6 (C8/12), 131,5 (C6), 135,3 (C26), 136,4 (C19), 141,8 (C7/10),

165,3 (C4), 167,0 (C2).

4-{(Z)-[3-(3,4-diclorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfo-

namida (N4)

2

O

N3

4

O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

2829

Cl

Cl

Fómula molecular: C27H24Cl2N2O4S2

IR: (Pastilha de KBr, cm-1): 1745; 1690 (v -C=O, tiazolidinodiona), 1618 (v -C=C),

1607; 1470 (v -C=C, anel aromático), 1327; 1168 (vs, vas –SO2), 600 (v –S,

tiazolidinodiona).


2,52 (q, 2H, H18), 2,77 – 2,84 (q, 2H, H15), 4,86 (s, 1H, H25), 7,10-7,26 (m, 5HAr, H20-

23), 7,31-7,34 (dd, 1HAr, H27), 7,61-7,63 (d, 1HAr, H28), 7,64 (s, 1 HAr, H31), 7,77 (t,

1H, H14), 7,80 - 7,83 (d, 2HAr, H8/12, J=8,4 Hz), 7,89 - 7,92 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4 HZ),

8,0 (s, 1H, H6).


124,2 (C22), 125,7 (C9/11), 127,3 (C27), 128,1 (C5), 128,2 (C20/24), 129,9 (C21/23), 130,6

(C30), 130,7 (C27/31), 130,8 (C8/12), 131,2 (C29), 131,5 (C6), 136,3 (C19), 136,4 (C26),

141,9 (C7/10), 165,4 (C4), 167,2 (C2).

4-{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5ilideno]metil}benzenosulfona-

mida (N5)

81

2

O

N3

4

O

5

S1

67

H89

12

10

11

S13

O

O

NH14

1516

1718

1920

21

22 23

24

25

2631

27

30

2829

Cl

Fómula molecular: C27H25ClN2O4S2





2,52 (q, 2H, H18), 2,77 – 2,84 (q, 2H, H15), 4,85 (s, 2H, H25), 7,10-7,26 (m, 5HAr, H20-

24), 7,34-7,37 (d, 2HAr, H27/31, J=8,7 Hz), 7,41-7,44 (d, 2HAr, H28/30, J=8,7 Hz), 7,73

(t, 1H, H14), 7,80 - 7,83 (d, 2HAr, H8/12, J=8,4 Hz), 7,89 - 7,92 (d, 2HAr, H9/11, J=8,4

HZ), 8,0 (s, 1H, H6).


124,0 (C22), 125,6 (C9/11), 127,2 (C28/30), 128,1 (C5), 128,6 (C20/24), 129,6 (C21/23),

130,6 (C27/31), 131,6 (C8/12), 132,5 (C29), 132,5 (C6), 134,3 (C26), 136,4 (C19), 141,8

(C7/10), 165,3 (C4), 167,0 (C2).

5.1.1 Análise computacional

Na avaliação “in sílico” da predição das propriedades moleculares dos

derivados sintetizados foram calculados os parâmetros disponíveis no software

Molinspiration Cheminformatics para as séries 1 e 2 (Tabela 6) e série 3 (Tabela 7).

Entre os parâmetros avaliados podem-se destacar os descritos por Lipinski

(2001), e analisados quanto à permeabilidade e biodisponibilidade por via oral.

Segundo Lipinski, os critérios a serem analisados são: PM, o qual não deve exceder

a 500 g/mol; o logP, cujo valor limite é 5; e os grupos doadores (NH + OH) e

aceptores (N + O) de ligação hidrogênio, cujas somatórias não devem ultrapassar a

5 e 10, respectivamente. Apenas classes de compostos que são substratos para

82

transportadores biológicos e produtos naturais são consideradas exceções à regra

(LIPINSKI et al, 2001; KELLER et al, 2006; DUCHOWICZ et al, 2007).

Analisando a Tabela 6 podemos observar que nenhuma das três séries

apresentou violações dos parâmetros estabelecidos por Lipinski. O valor de PM

variou de 360,416 a 429,306. O TPSA (área de superfície polar total) ficou entre

87,313 a 105,336 e o LogP entre 0,092 a 3,532. Além disso, apresentaram 1 à 2

doadores e 6 à 7 aceptores de hidrogênio, fazendo com que estes compostos

possuam boa permeação e biodisponibilidade adequadas a um candidato a fármaco.

Tabela 6 - Biodisponibilidade dos derivados da série 1 e 2

NH

O

S

O

R

Substituintes Cód PM

Vol

(A3)

TPSA

(A2)b

nAT

NHA

NHD

LogPf

nR

Viol.

Série 1

SO2 NH

E0 360.46 284.36

96.102

24.0 6

2

2.24 4

0

SO2 NH

CH3

E1 374.44

300.92

96.102 25.0

6

2

2.67 4

0

SO2 NH

OCH3

E2 390.44 309.90 105.33 26.0

7

2

2.28

5

0

SO2 NH

Cl

E3 394.86 297.89 96.102 25.0

6

2 2.92 4 0

SO2 NH

Cl

Cl

E4 429.31 311.43

96.102

26.0

6 2 3.53

4 0

83

Legenda: Cód.: Código; PM: Peso Molecular; Vol(A3): Volume; TPSA (A2)b : Área superficial polar total; nAT: Numero de átomos; NHA: Grupos aceptores de hidrogênio; NHD: Grupos doadores de hidrogênio; nR: Numero de rotações; Viol.: Violações.

Bakht e colaboradores (2010), afirmam que para o desenvolvimento de

moléculas com atividades terapêuticas a biodisponibilidade é uma propriedade muito

importante. Boa absorção intestinal, redução da flexibilidade molecular, baixo TPSA

são necessários para que a molécula em desenvolvimento seja biodisponível por via

oral. Além disso, o número de nR (número de rotações) é importante para as

mudanças conformacionais da molécula. Para existir biodisponibilidade por via oral o

número de nR deve ser menor ou igual à 10. De fato, os compostos analisados

apresentaram 3 à 8 nR.

Segundo Swathi e colaboradores (2013), valor de TPSA inferior a 140 indica

que o composto possui boa permeabilização na membrana celular.

Ahsan et al. (2012), demonstram que propriedades moleculares como

permeação da membrana e biodisponibilidade são associadas ao LogP, massa

molecular e ao número de doadores e aceptores de hidrogênio presentes da

molécula.

Segundo Bali e colaboradores (2012), substâncias que apresentam baixa

permeação e baixa absorção possuem mais de 5 e 10 doadores e aceptores de

hidrogênio, respectivamente.

Para a série 3 (Tabela 7), pode-se observar que todos os compostos

apresentaram 2 violações. As duas violações caracterizam-se por apresentarem PM

acima de 500 Da e valor de LogP que excede 5. A modificação realizada deixou a

Série 2

SO2 NH (CH2)4

E5 416.52

351.56

96.102 28.0

6 2 3.14

8 0

SO2 NH (CH2)3

E6 402.49

334.76 96.102

27.0

6 2 2.87

7 0

SO2 NH

E7 374.44

301.16 96.102

25.0

6 2 1.95

5 0

SO2 NH (CH2)2

E8 388.47

317.96

96.102

26.0

6 2 2.35 6 0

Continua

84

molécula maior e mais lipofílica, podendo indicar segundo Bali et al. (2012)

problemas na sua biodisponibilidade por via oral.

No entanto, existem vários fármacos já comercializados que apresentam

estas características, como por exemplo o Taxol®, um quimioterápico utilizado contra

diversos tipos de câncer, apresentando 4 doadores e 14 aceptores de hidrogênio.

Além disso, possui LogP 4 e peso molecular de 853,83 Da. Devido a sua baixa

solubilidade (6,5%) ele é administrado por via intravenosa por possuir baixa

biodisponibilidade por via oral (DAHMANI et al., 2012).

Tabela 7 - Biodisponibilidade dos derivados da série 3.

O

N

O

S

S

O

O

NHR

Legenda: Cód.: Código; PM: Peso Molecular; Vol(A3): Volume; TPSA (A2)b : Área superficial polar total; nAT: Numero de átomos; NHA: Grupos aceptores de hidrogênio; NHD: Grupos doadores de hidrogênio.

Substituintes Cód PM

Vol

(A3)

TPSA

(A2)b

nAT

NHA

NHD

LogPf

nR

Viol

Série 3

4-OCH3 N1 524.66 455.114

92.783

36.0

7 1 5.122

11 2

4-CH3 N2 508.66 446.13 83.549 35.0

6 1 5.513

10 2

-H N3 543.11 459.906 83.549

36.0

6 1 5.64

11 2

3,4-Cl2 N4 563.53 456.64

83.549

36.0

6 1 6.349

10 2

4-Cl N5 529.08 443.105

83.549

35.0

6 1 5.719

10 2

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração

bactericida mínima (CBM) dos compostos sintetizados foram realizadas através do

método de diluição em ágar, como descrito no item 4.2.3 e 4.2.4, respectivamente.

Para a classificação da atividade antibacteriana podem ser utilizados diversos

critérios, dependendo do objetivo que se tem para o produto em análise. Levando

em consideração o objetivo do emprego clínico dos compostos, foram seguidos os

critérios descritos em Tegos e colaboradores (2002) e Holetz e colaboradores

(2002), que classificam a atividade antibacteriana como ótima se a CIM for < 10 µM,

boa entre 10 e 100 µM, moderada entre 100 e 500 µM, fraca quando a CIM for entre

500 e 1000 µMe inativo se for > 1000 µM.

Inicialmente foi realizada uma triagem com o composto TZDCl e todos os

seus derivados (séries 1 e 2) para verificar a possível ação antibacteriana contra um

representante de bactérias Gram-positivas (S. aureus) e bactérias Gram-negativas

(E. coli), até a concentração máxima de 1000 µM. No entanto, para E. coli nenhum

dos compostos foram ativos, apresentando CIM > 1000 µM, já para S. aureus os

compostos E0 e E3 mostraram atividade moderada com valores de CIM de 250 e

125 µM, respectivamente, e o composto E4 mostrou boa atividade com valores de

CIM de 62,5 µM (Tabela 8).

86

Tabela 8 - Avaliação da atividade antibacteriana frente a E. coli e S. aureus, para os compostos TZDCl, derivados das séries 1 e 2 em comparação com o antibiótico Sulfadiazina.

NH

O

S

O

R

Substituinte

-R

Código E. coli S. aureus

SO2Cl BTZDCl >1000 >1000

Série 1

SO2 NH

E0

>1000

250

SO2 NH

CH3

E1

>1000

>1000

SO2 NH

OCH3

E2

>1000

>1000

SO2 NH

Cl

E3

>1000

125

SO2 NH

Cl

Cl

E4

>1000

62,5

Série 2

SO2 NH (CH2)4

E5

>1000

>1000

SO2 NH (CH2)3

E6

>1000

>1000

87

SO2 NH

E7

>1000

>1000

SO2 NH (CH2)2

E8

>1000

>1000

Sulfadiazina

Sulfa

>1000

31,25

Legenda: E. coli: Escherichia coli; S. aureus: Staphylococus aureus.

Os dois compostos da série 1 (E3 e E4), cujo os substituintes foram

selecionados por Topliss, possuem respectivamente um e dois átomos de cloro na

sua estrutura, sendo estes retiradores de elétrons, apresentando maior atividade

contra a bactéria S. aureus que os demais compostos que possuem grupos elétrons

doadores ou ainda nenhum substituinte.

No que diz respeito ao composto E0, o qual não possui substituinte, este foi

mais efetivo que os compostos com substituinte metil (E1) que é um ativador fraco

com capacidade de doar elétrons, e metóxi (E2) que é um ativador moderado que

também doa elétrons.

A análise dos compostos sugeridos por Topliss (série 1) mostrou que o

composto mais efetivo contra S. aureus foi aquele que possui dois átomos de cloro

nas posições 3 e 4 (E4), seguido pelo composto com um átomo de cloro na posição

para (E3), depois aquele que não possui substituintes (E0), seguido do composto

com um grupo metil na posição para (E1), e por fim o composto com um grupo

metóxi na mesma posição (E2), podendo assim afirmar que esta série seguiu o

parâmetro físico-químico proposto por Topliss, o que indica que são os

parâmetros eletrônicos que estão relacionados a esta série, como mostra a tabela 2.

A ausência de atividade contra as bactérias Gram-negativas destes

compostos pode ser explicada pela diferença de estrutura e organização entre o

envelope celular das bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

As bactérias Gram-negativas são mais resistentes aos antibacterianos

provavelmente devido ao seu envelope celular mais complexo. Estas organizações

Continua

88

celulares resultam na presença de vários canais de porinas envolvidos no transporte

de captação ou efluxo de uma variedade de compostos, nutrientes ou moléculas

tóxicas (açúcares, medicamentos, peptídeos e produtos químicos). Entre estes

vários canais, porinas e bomba de efluxo contribuem para o equilíbrio da

acumulação de medicamentos dentro da célula, estando envolvidos na

susceptibilidade aos antibióticos (BOLLA et al., 2011).

As bactérias Gram-positivas, em contraste com as Gram-negativas, possuem

envelope mais simples, cujo peptídioglicano possui formato de redes com vários

poros, os quais permitem com que moléculas estranhas entrem na célula sem

nenhuma dificuldade (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2005).

Com base nos resultados de triagem da atividade antibacteriana, onde se

verificou que os compostos E0, E3 e E4 apresentaram atividade contra S. aureus,

foram realizados outros ensaios contra outras Gram-positivas como B. subitillis e S.

saprophyticus e para confirmar a tendência de ausência de atividade contra

bactérias Gram-negativas foi realizado ensaio contra Salmonella typhimurium

(Tabela 9).

Tabela 9 - Atividade antibacteriana frente a S. typhimurium, S. saprophyticus e B. subitillis para os compostos TZDCl e seus derivados (séries 1 e 2) em comparação com o antibiótico Sulfadiazina.

NH

O

S

O

R

Substituinte

-R

Cód S. typhymurium S. saprophyticus B. subitillis

SO2Cl BTZDCl >1000 >1000 1000

Série 1

SO2 NH

E0

>1000

250

250

89

SO2 NH

CH3

E1

>1000

>1000

>1000

SO2 NH

OCH3

E2

>1000

>1000

>1000

SO2 NH

Cl

E3

>1000

62,5

62,5

SO2 NH

Cl

Cl

E4

>1000

31,25

15,62

Série 2

SO2 NH (CH2)4

E5

>1000

>1000

>1000

SO2 NH (CH2)3

E6

>1000

>1000

>1000

SO2 NH

E7

>1000

>1000

>1000

SO2 NH (CH2)2

E8

>1000

>1000

>1000

Sulfadiazina

Sulfa

>1000

7,8

7,8

Legenda: Cód.: Código; S. typhymurium: Salmonella typhymurium; S. saprophyticus: Staphylococus saprophyticus; B.subitillis: Bacilus subitillis.

Analisando todos os dados, podemos comprovar que todas as séries testadas

não tiveram atividade contra bactérias Gram-negativas, no entanto obtivemos

resultados de CIM muito importantes para os compostos E3 (125 µM, 62,5 µMe 62,5

Continua

90

µM) e E4 (62,5 µM, 31,25 µM e 15,62 µM) frente aos micro-organismos S.aureus,

S.saprophyticus e B.subitillis, respectivamente, principalmente o composto E4 que

apresentou boa atividade antibacteriana para todas as Gram-positivas.

Existem diversos estudos de atividade antibacteriana realizados para

derivados de TZDs. Alagawadi e colaboradores (2011) sintetizaram novos derivados,

contendo o núcleo TZD, e em seguida avaliaram a atividade antibacteriana para

bactéria Gram-positiva (S. aureus) e Gram-negativa (E. coli, E. faecalis e P.

aeruginosa) apresentando boa atividade antibacteriana contra S. aureus e E.

faecalis.

Estudos realizados por Avupati e colaboradores (2012), também descrevem a

atividade antibacteriana de derivados de TZDs para B. subitillis, B. pumilus, S.

aureus, M. luteus, E. coli e P. vulgaris. O derivado ((Z)-5-(4-((E)-3(3,5-

(benziloxi)fenil)-3-oxoprop-1-enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona) (Figura 19),

contendo o núcleo TZD, apresentou valores de CIM de 16 µM para B. subitillis, B.

pumilus, S. aureus, M. luteus e 32 µM para E. coli e P. vulgaris.

Figura 19 - Estrutura do composto ((Z)-5-(4-((E)-3(3,5-(benziloxi)fenil)-3-oxoprop-1-enil)-benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona).

O

S

ONH

OF

Liu et al. (2011) revelaram que derivados de chalconas contendo o núcleo

TZD possuem ótima atividade antibacteriana. Apresentando atividade contra S.

aureus (RN 4220) com valor de CIM de 1µM e S. aureus (KCTC 503) com valores de

CIM de 2 µM a 4 µM. Já para a bactéria E. coli o valor de CIM foi de > 62 µM.

Em 2012, Jim e colaboradores testaram análogos da TZD para um

representante Gram-positivo (S. aureus) e para um representante Gram-negativo

(E.coli) cujo teste demonstrou que todos os análogos continham atividade

91

antibacteriana para a bactéria Gram-positiva, principalmente o composto ácido-(S)-2-

((Z)-5-(4-((E)-3-(Naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-1-il)benzilideno)-4-oxo-2-tioxotiazolidin

-3-il)-3-fenilpropanóico (Figura 20), o qual apresentou valores de CIM de 2 µM. No

entanto, nenhum dos análogos apresentou atividade para a bactéria Gram-negativa.

Figura 20 - Estrutura química do composto ácido-(S)-2-((Z)-5-(4-((E)-3-(Naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en- 1-il)benzilideno)-4-oxo-2-tioxotiazolidin-3-il)-3-fenilpropanóico.

.

COOH

N

S

O

O

O

Assim como o presente trabalho e o estudo feito por Jim et al.(2012), a

ausência de atividade antibacteriana para micro-organismos Gram-negativos

provavelmente se dá ao fato de que o núcleo TZD não é sozinho o responsável pela

atividade antibacteriana, e sim um conjunto de substituintes associados com o

núcleo TZD.

Após a determinação da concentração inibitória mínima foi realizado o ensaio

da concentração bactericida mínima (CBM), que é a mínima concentração de uma

determinada substância necessária para a inviabilização dos micro-organismos e

não apenas a inibição de seu crescimento.

Para o ensaio da CBM foram testados somente os compostos E0, E3 e E4,

pois foram os que apresentaram atividade antibacteriana no ensaio da CIM. Todos

os três compostos apresentaram atividade bactericida. O composto E0 apresentou

CBM de 1000 µM para S. aureus, S. saprophyticus e B. subitillis. O composto E3

apresentou CBM de 250 µM, 1000 µM e 125 µM para S. aureus, S. saprophyticus e

B. subittillis, respectivamente. Já o composto E4 apresentou os melhores valores de

CBM, com 250 µM, 250 µM e 31,25 µM para S. aureus, S. saprophyticus e B.

subitillis, respectivamente (Tabela 10).

92

Tabela 10 - Concentração bactericida mínima dos compostos E0, E3 e E4 para as bactérias S. aureus, S. saprophyticus e B. subitillis.

NH

O

S

O

R

Substituinte

R

Código S.aureus

CIM CBM

S. saprophyticus

CIM CBM

B.subitillis

CIM CBM

SO2 NH

E0 250µM 1000µM 250µM 1000µM 250µM 1000µM

E3 125µM 250µM 62,5µM 1000µM 62,5µM 125µM

SO2 NH

Cl

Cl

E4 62,5µM 250µM 31,25µM 250µM 15,62µM 31,25µM

Legenda: S.aureus: Staphylococus aureus; S. saprophyticus: Staphylococus saprophyticus;

B.subitillis: Bacillus subitillis.

Relacionando estes resultados com os obtidos no ensaio de citoxicidade

celular, o fato de os compostos E0, E3 e E4 terem apresentado atividade

antibacteriana e não atividade citotóxica possui grande relevância, uma vez que para

um agente antibacteriano ser utilizado ele não pode ser citotóxico. Além disso,

analisando a Tabela 6, onde são apresentados os parâmetros estabelecidos por

Lipinski, podemos afirmar que estes compostos por não apresentarem nenhuma

violação são biodisponíveis por via oral.

Assim, as evidencias demonstram indícios de relação estrutura-atividade

devido ao parâmetro σ proposto por Topliss. Com base nestes dados, a validação

poderia ser futuramente realizada sugerindo a análise da Tabela 3 e a seleção de

novos substituintes a serem adicionados ao composto E4, já que este apresentou os

melhores valores de CIM e CBM, a fim de obtermos novos compostos com maior

potencial antibacteriano. Além disso, também se faz necessário, a realização de

estudos para se descobrir o mecanismo de ação que estas moléculas estão

atuando, uma vez que em células bacterianas não existem receptores PPARy.

SO2 NH

Cl

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA

5.3.1 Avaliação da Viabilidade Celular - MTT

A primeira série foi avaliada quanto a atividade citotóxica em células de

melanoma murino B16F10, cujo screening foi realizado por meio do ensaio

colorimétrico de MTT, o qual avalia a viabilidade celular. Além destes derivados foi

avaliado também o protótipo BTZDCl quanto a atividade citotóxica em diferentes

concentrações (1, 5, 10, 25 e 50 M) a fim de se obter a concentração inibitória de

cinquenta por cento (CI50).

O MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-brometo] é um sal de

tetrazólio amarelo, solúvel em água, o qual é acrescentado no meio de cultura após

o tempo de incubação com as substâncias testadas. É um teste baseado na

capacidade de absorção e metabolismo deste sal pelas células testadas, o qual é

reduzido no interior das mitocôndrias a um produto denominado de formazan (LU et

al., 2012).

Os derivados desta série (1) não apresentaram atividade citotóxica nas

concentrações testadas, porém, quando comparadas ao protótipo BTZDCl foi

possível notar uma diminuição da viabilidade celular, principalmente o composto E3,

que reduziu em 42% a viabilidade celular (Tabela 11).

94

Tabela 11 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação por 24 horas com os derivados da série 1 e o composto BTZDCl.

NH

O

S

O

R

Substituinte - R

Código Concentração (µM) Viabilidade celular (%)

SO2Cl

BTZDCl

50 µM

100

SO2 NH

E0

50 µM

68

SO2 NH

CH3

E1

50 µM

95

SO2 NH

OCH3

E2

50 µM

71

SO2 NH

Cl

E3

50 µM

58

SO2 NH

Cl

Cl

E4

50 µM

86

Apesar de a primeira série ter sido sintetizada segundo a metodologia

proposta por Topliss, ao se analisar os resultados de citotoxicidade não foi possível

estabelecer uma correlação entre as estruturas químicas (efeito estéreo, parâmetros

eletrônicos, hidrofóbicos ou ambos) e a atividade citotóxica encontrada, uma vez que

a ordem de potência estabelecida foi 4-Cl > H > 4-OCH3 > 3,4-Cl2 > 4-CH3, não

sendo possível encontrar correspondência na tabela 2 estabelecida por Topliss.

Provavelmente os efeitos eletrônicos e hidrofóbicos não foram para esta molécula os

efeitos preponderantes a esta atividade avaliada.

95

Dando continuidade aos testes de citotoxicidade, um novo screening com os

compostos da série 2 foi feito nas concentrações de 15, 20, 30, 40 e 50 μM em

células de melanoma murino B16F10 (Tabela 12). Somente as substâncias E5 e E6

foram citotóxicas, reduzindo a viabilidade celular na concentração de 50 μM em

aproximadamente 60%.

Tabela 12 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação por 24 horas com os compostos das séries 2 e 3.

NH

O

S

O

R

Substituinte - R


Série 2

SO2 NH (CH2)4

E5 50 µM 40

SO2 NH (CH2)3

E6

50 µM

42

SO2 NH

E7

50 µM

80

SO2 NH (CH2)2

E8

50 µM

72

Analisando os compostos da série 2 (E5, E6, E7 e E8), nota-se um aumento

da atividade citotóxica quando se aumenta a cadeia espaçadora do anel aromático.

96

Desta forma, observam-se características comuns às séries homólogas, pois quanto

maior a cadeia mais lipofílico este se torna, permeando com facilidade a membrana

celular e então aumentando a atividade citotóxica, como é o caso dos compostos E5

e E6.

Vários estudos de citotoxicidade celular avaliando estruturas contendo o

núcleo TZD já foram feitos. Patil e colaboradores (2010) sintetizaram vários

derivados de TZDs e avaliaram a citotoxicidade, dos quais o mais ativo foi o

composto 2-[4-[(2,4-dioxotiazolidin-5-Ilideno)metil]fenoxi]-N-[3-(triflurometil)fenil]ace-

tamida (Figura 21) que apresentou CI50 em média de 6 M contra cinco das sete

linhagens de células testadas, sendo estas de câncer de mama (MCF7), de próstata

(PC3), leucêmicas (K562), nasofaríngea e cavidade oral (KB e GURAV).

Figura 21 - Estrutura química do composto 2-[4-[(2,4-dioxotiazolidin-5-Ilideno)metil]fenoxi]-N-[3-(triflurometil)fenil]acetamida.

O

NH

O

NH

O

SO CF3

Subtel’na e colaboradores (2010), também sintetizaram derivados de TZD e

avaliaram a citotoxicidade em diferentes linhagens celulares. Dos derivados

testados, os compostos 5-[2–cloro–3-(4–nitrofenil)–2-propenilideno]–2-(3–hidroxi-

fenilamino)tiazol–4(5H)-ona e 5-(4–clorobenzilideno)–2-(4–hidroxifenilamino)- tiazol–

4(5H)-ona (Figura 22) apresentaram ação citotóxica e maior seletividade para as

linhagens de células leucêmicas.

97

Figura 22 - Estruturas dos compostos: (A) 5-[2-cloro-3-(4-nitrofenil)-2-propenilideno]-2-(3-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-ona e (B) 5-(4-clorobenzilideno)-2-(4-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-ona.

O

N

S

NHCl

OH

Cl

O

N

S

NH

OH

O2N

(A) (B)

Avupati e colaboradores (2012) sintetizaram e avaliaram a atividade citotóxica

de novas moléculas contendo o núcleo TZD. Destas, a (Z)-5-(4-((E)-3-oxo-3-(tiofen-

2-il)prop-1-enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona) (Figura 23) foi a que

apresentou a melhor CI50. De fato, compostos que possuem núcleo TZD são

reportados com atividade citotóxica em várias linhagens celulares.

Figura 23 - Estrutura química da (Z)-5-(4-((E)-3-oxo-3-(tiofen-2-il)prop-1-enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona).

S

NH

O

O

O

S

Após os testes preliminares foram selecionados os compostos, de cada série,

que apresentaram melhor atividade citotóxica, os quais foram testados nas células

de melanoma B16F10 em diferentes concentrações e tempos de tratamento, a fim

de determinar a CI50 e a influência do tempo de incubação, que variaram de 24, 48 e

72 horas para os compostos E3 (Figura 24), E5 (Figura 25) e E6 (Figura 26)

Como pode ser visto no período de 24h (24A) não foi possível determinar a

CI50 para o composto E3, pois na sua concentração mais alta (70 µM) ele apresentou

98

55% de células viáveis. Quando aumentado o período de incubação para 48h (24B)

percebe-se uma diminuição da viabilidade celular com CI50 de 60,8 µM. No período

de 72h (24C), apresentou CI50 de 54,5 µM. Com os dados obtidos pode-se afirmar

que o derivado E3 causa morte celular de maneira dependente de tempo de

incubação.

Figura 24 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação com diferentes concentrações do composto E3 nos tempos de 24h (A), 48h (B) e 72h (C).

(A) (B) (C)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 3 ( M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 3 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r(%

)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 3 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r (

%)

O composto E5 apresentou no período de 24h (25A) CI50 de 50,1 µM.

Aumentando o tempo de incubação para 48h (25B) foi possível observar diminuição

da viabilidade celular e CI50 de 38,2 µM e no período de 72h (25C) CI50 de 31,9 µM.

Na concentração de 70 µM a viabilidade celular nos períodos de 24h, 48h e 72h

foram de 30,5%, 21,5% e 17,5%, respectivamente, ocorrendo morte celular de

maneira dependente de tempo.

CI50 de 60,8 µM CI50 de 54,5 µM

µM µM

99


(A) (B) (C)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 5 ( M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 5 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r (

%)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 5 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r (

%)

De forma semelhante, o composto E6 apresentou atividade citotóxica

dependente de tempo, cujos valores de CI50 foram: 47,6 µM; 41,3 µM e 34,3 µM para

os tempos de 24, 48h e 72h, respectivamente (figura 26). Assim como os demais

compostos avaliados, este na concentração mais alta, 70 µM, apresentou 35%, 27%

e 19,5% de células viáveis nos períodos de 24h, 48h e 72h, respectivamente.


(A) (B) (C)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 6 ( M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 6 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r (

%)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E 6 ( M )

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r (

%)

Analisando todos os dados obtidos, o composto E5 foi o que apresentou

melhores valores de CI50, por conta disto foram feitas modificações em sua estrutura

a fim de se obter maior atividade citotóxica

As modificações sugeridas para o composto E5 foram baseadas em trabalhos

feitos por Kaminskyy et al. (2009) e Romagnoli et al. (2013) que apresentaram

CI50 de 50,1µM CI50 de 38,2 µM CI50 de 31,9 µM

CI50 de 47,6 µM CI50 de 41,3 µM CI50 de 34,3 µM

100

moléculas contendo uma grande ligação ao nitrogênio do anel da TZD. Desta forma

a reação escolhida para esta nova série foi a alquilação deste nitrogênio, com

substituintes novamente seguindo a seleção manual de Topliss, a fim de

potencializar sua atividade citotóxica.

A partir desta nova classe de compostos (série 3) foi realizado novamente um

screening através do teste de MTT nas concentrações de 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70

µM, para que se pudesse analisar se houve aumento de citotoxicidade devido aos

novos substituintes na molécula E5 (Tabela 13)

Analisando a tabela 13 e comparando-a com a tabela 12 pode-se afirmar que

o composto N2 apresentou a mesma citotoxicidade que o composto E5 na

concentração 50 µM, ambos reduziram em 60% a viabilidade celular. Os compostos

N4 e N5 mostraram maior atividade citotóxica, apresentando 24% e 34% de células

viáveis, respectivamente.

Tabela 13 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação por 24 horas com os derivados do composto E5.

O

N

O

S

S

O

O

NHR

Substituinte - R


4-OCH3 N1 50 µM 55

4-CH3 N2 50 µM 40

-H N3 50 µM 63

4,3-Cl2 N4 50 µM 24

4-Cl N5 50 µM 34

Os dois compostos desta série, N5 e N4, possuem um e dois átomos de cloro

na sua estrutura, respectivamente. Estes átomos são retiradores de elétrons,

apresentando maior atividade que os outros compostos que possuem grupos

elétrons doadores, como é o caso do substituinte metóxi (N1), ativador moderado

101

doador de elétrons, o metil (N2), considerado um ativador fraco que também doa

elétrons, e o N3 que não possui substituintes. Assim, a análise destes substituintes

sugeridos por Topliss mostrou que o composto mais potente é aquele que possui

dois átomos de cloro nas posições 3 e 4 (N4), seguido do composto com um átomo

de cloro na posição para (N5), depois o que possui um grupo metil na posição para

(N2), seguido do composto com um grupo metóxi na mesma posição (E1), e por fim

o composto N3, que não possui substituinte.

Com essas modificações estruturais no composto E5 e com a análise da

seleção de Topliss foi possível observar que esta série mostrou indícios de relação

estrutura-atividade seguindo o parâmetro físico-químico 2π - proposto por Topliss

(Tabela 2), mostrando que são ambos os efeitos hidrofóbicos e eletrônicos

envolvidos na atividade citotóxica desta série, sendo possível sugerir a continuidade

destes estudos, propondo moléculas que possam vir a ser ainda mais potentes que

as moléculas da série 3.

Analisando os parâmetros estabelecidos por Lipinski, todos os derivados

desta série apresentaram PM e LogP elevados, diminuindo sua solubilidade e

absorção, não apresentando biodisponibilidade por via oral. No entanto, estes

derivados podem ser administrados por via intravenosa, já que o Paclitaxel,

conhecido como Taxol (Figura 27), também apresenta PM e LogP elevados e

mesmo assim é considerado um excelente quimioterápico contra vários tipos de

câncer, porém é administrado por via intravenosa pela sua baixa solubilidade e

absorção.

O Taxol é um complexo diterpeno, derivado do taxan. Ele induz parada das

fases G2/M do ciclo celular através da ligação e estabilização dos microtúbulos, e

assim, interrompendo a polarização/despolarização normal do ciclo dos

microtúbulos. Além disso, o bloco mitótico induzido por baixas concentrações desta

substância induz a apoptose celular. Alguns estudos já realizados por outros grupos

mostram que o Taxol possui papel na indução de algumas vias de transdução, além

de causar perturbação e fosforilação/inativação de proteínas anti-apoptóticas

(MESHKINI; YAZDANPARAST, 2012).

102

Figura 27 - Estrutura química do Taxol.

ONHO

O

OH

CH3

OH

O

O

CH3

CH3

O

O

CH3O

CH3OH

O

O

H

CH3

O

A partir dos dados obtidos na tabela 13 e levando em conta que o Taxol

também não possui biodisponibilidade por via oral assim como esta série de

compostos, foi dado continuidade aos testes de citotoxicidade celular em períodos

de 24, 48 e 72 horas em diferentes concentrações para os compostos N2 (figura 28),

N4 (figura 29) e N5 (figura 30), os quais mostraram melhor atividade citotóxica no

screening, a fim de determinar a CI50 e a influência do tempo de incubação sobre a

viabilidade celular.

Como pode ser visto, no período de 24h (28A) o composto N2 apresentou

praticamente a mesma CI50 que o composto protótipo E5, com valor de 42 µM. No

período de 48h (28B) a CI50 diminuiu para 33.7 µM e quando aumentado o tempo de

incubação para 72h (28C) o valor da CI50 diminuiu para de 22 µM. A maior

concentração testada foi de 70 µM, sendo que nos períodos de 24h, 48h e 72h a

viabilidade celular foi de 25%, 20,5% e 11,5%, respectivamente. Com os dados

obtidos pode-se afirmar que o derivado N2, assim como o protótipo E5 causa morte

celular de maneira dependente de tempo de incubação.

103

Figura 28 - Viabilidade celular determinada pelo método MTT após incubação com diferentes concentrações do composto N2 nos tempos de 24h (A), 48h (B) e 72h (C).

(A) (B) (C)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 5 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 2 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 2 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

O composto N4 apresentou no período de 24h (29A) CI50 de 29 µM.

Aumentando o tempo de incubação para 48h (29B) foi possível observar diminuição

da viabilidade celular e CI50 de 19,7 µM e no período de 72h (29C) CI50 de 9,9 µM.

Da mesma forma que a analise anterior este composto foi testado a uma

concentração máxima de 70 µM com 17,5%, 12% e 9% de células viáveis nos

tempos de 24h, 48, e 72h, respectivamente, ocorrendo morte celular de maneira

dependente de tempo.


(A) (B) (C)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 4 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 4 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 4 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

Da mesma forma que os demais compostos, o composto N5 (figura 30)

também foi testado até a concentração de 70 µM, o qual apresentou nos tempos de

24h, 48, e 72h viabilidade celular de 26%, 19,5% e 14%, respectivamente,

CI50 de 42 µM CI50 de 33,7µM CI50 de 22 µM

CI50 de 29 µM CI50 de 19,7 µM CI50 de 9,9 µM

104

apresentando atividade citotóxica dependente de tempo, cujos valores de CI50 foram:

36,9 µM; 25,3 µM e 10,9 µM para os tempos de 24, 48h e 72h, respectivamente.


(A) (B) (C)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 5 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 5 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

N 5 (u M )

Via

bil

ida

de

ce

lula

r (

%)

Kaminskyy et al. (2009), assim como o presente estudo, também sintetizaram

derivados da TZD substituindo o NH deste núcleo e avaliaram a atividade citotóxica

destes derivados em células leucêmicas, de melanoma, pulmão, cólon, mama, SNC,

ovário, rim e próstata. O composto 2-(2,4-dioxo-tiazolidin-5-il)-N-(4-sulfamoil-fenil)-

acetamida inibiu o crescimento de células renais e o composto 2-[5-(4-dimetilamino-

benzilideno)-2,4-dioxo-tiazolidin-3-il]-N-(2-trifluorometil-fenil)-acetamida apresentou

citotoxicidade significativa sobre células leucêmicas, ambos os compostos com o

núcleo TZD. Já o composto 2-[5-(4-cloro-benzilideno)-2,4-dioxo-imidazolidin-3-il]-N-

(2-trifluorometil-fenil)-acetamida, análogo da TZD, foi superior aos outros compostos

por apresentar maior seletividade para várias linhagens de células leucêmicas

(Figura 31).

CI50 de 36,9 µM CI50 de 25,3 µM

µM

CI50 de 10,9 µM

105

Figura 31 - Estruturas dos compostos: (A) 2-(2,4-dioxo-tiazolidin-5-il)-N-(4-sulfamoil-fenil)-acetamida, (B) 2-[5-(4-dimetilamino-benzilideno)-2,4-dioxo-tiazolidin-3-il]-N-(2-trifluorometil-fenil)-acetamida e (C) 2-[5-(4-cloro-benzilideno)-2,4-dioxo-imidazolin-3-il]-N-(2-trifluoro-metil-fenil)-acetamida.

O

N

OS O

NH

NCH3

CH3

CF3O

N

ONH

O

NH

Cl

CF3O

S

NH

O

O

NHSO

O

NH2

(A) (B) (C)

Romagnoli e colaboradores (2013), também substituíram o NH do anel TZD a

fim de obter moléculas com maior atividade citotóxica. Foram sintetizados vários

derivados da TZD, em seguida testados em células leucêmicas, sendo que os

compostos N-(3-((Z)-(3-Benzil-2,4-dioxotiazolidin-5-ilideno)metil)fenil)-2-bromoacri-

lamida, N-(3-((Z)-(3-(4-Fluorobenzil)-2,4-dioxotiazolidin-5-ilideno)metil)fenil)-2-bro-

moacrilamida e N-(3-((Z)-(3-(4-Trifluorometilbenzil)-2,4-dioxotiazolidin-5-ilideno)me-

til)fenil)-2-bromoacrilamida induziram a morte celular por apoptose caracterizada

pela condensação da cromatina e núcleo fragmentado.

Segundo Herwig e colaboradores (2013), os receptores PPARy estão

presentes em várias células tumorais, incluindo as células de melanoma, sendo as

TZDs agonistas dos receptores PPARy, induzindo parada do ciclo celular,

diferenciação e apoptose em células cancerígenas. No entando, estudos feitos por

Shiau e colaboradores (2005), evidenciam que a inibição da proliferação do tumor

através da TZD em várias linhagens celulares é independente da ativação dos

receptores PPARy.

Wei et al. (2009), também descrevem que a atividade antitumoral da TZD

independe da ativação dos receptores PPARy, cujas razões descritas pelos autores

se devem a especificidade da sua estrutura; a existência de uma discrepância de 3

grandezas entre a concentração requerida para se obter o efeito antitumoral e para a

ativação das PPARy e porque há uma falta de correlação entre a susceptibilidade

das células tumorais para as TZDs e o nível de expressão das PPARy.

Sendo assim, várias evidências indicam que as TZDs podem interfererir com

múltiplos mecanismos de sinalização, independente da ativação dos receptors

106

PPARy, que afetam muitos aspectos das funções celulares, regulando a progressão

do ciclo celular e a sobrevivência das células cancerosas.

Assim, analisando os dados da literatura, podemos dizer que de fato as TZDs

possuem atividade citotóxica, não apenas para células de melanoma, mas também

para várias linhagens celulares, no entanto, o tipo de morte celular e o mecanismo

de indução de morte celular mediado pelos derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas deve ser avaliado em futuros estudos de mecanismo de

ação destas moléculas.

6 CONCLUSÃO

Foram sintetizadas 3 séries de derivados sulfonamídicos

benzilidenotiazolidinodionas através de reações nucleofílicas pelo método de

Knoevenagel. A primeira série (E0, E1, E2, E3, E4) e a terceira série (N1, N2, N3,

N4, N5) contemplando os derivados sugeridos por Topliss e a segunda série (E5,

E6, E7, E8) contendo diferentes tamanhos de espaçadores.

As reações das séries 1 e 2 foram feitas sob agitação e temperatura

ambiente, já nas reações da série 3 foi utilizado os princípios da Química Verde

através do uso de irradiação por micro-ondas, onde pode ser observado maior

rendimento e menor tempo de reação.

Após as sínteses todos os compostos foram recristalizados com etanol para

aumentar o grau de pureza, não apresentando nenhum subptoduto, garantindo uma

boa caracterização através de espectro de IR, espectro de RMN 1H e espectro de

RMN 13C, pelos quais foi possível comprovar que os compostos sintetizados foram

os compostos propostos por este trabalho.

Foi analisado o Rf antes e depois a recristalização, não havendo variação e

realizado o ponto de fusão, o qual não apresentou variação significativa antes e

após a recristalização. Além disso, os rendimentos obtidos foram bastante

significativos, que depois de recristalizados variaram de 42,28% a 93,76% para a

série 1, 23,85% a 55,12% para a série 2 e 18% a 22% para a série 3.

Nenhum dos compostos das séries 1 e 2 apresentaram violações, sendo

estes biodisponíveis por via oral. Os compostos da série 3 apresentaram violações,

ambos os compostos com LogP e PM elevados, não possuindo boa

biodisponibilidade por via oral, porém nada impede que estes compostos sejam

administrados por via intravenosa, uma vez que o Taxol, quimioterápico bastante

utilizado para vários tipos de câncer possui as mesmas características que estes

compostos e é administrado por via intravenosa.

A série 1 apresentou os compostos mais ativos, seguindo o parâmetro σ

(eletrônico) estabelecido por Topliss. O composto N-(3,4-diclorofenil)–4-[(Z)-(2,4-

dioxo-1,3–tiazolidino-5-ilideno)metil]benzeno-sulfonamida (E4) foi o que apresentou

os melhores valores de CIM frente aos microrganismos S.aureus, S.saprophyticus e

108

B.subitillis, respectivamente, e CBM para S. aureus, S. saprophyticus e B. subitillis,

respectivamente.

A atividade citotóxica foi avaliada para todos os compostos. A série 1 não

seguiu nenhum dos parâmetros estabelecidos por Topliss e a série 2 apresentou o

composto 4-[(E)-(2,4-dioxo-1,3–tiazolidino–5-ilideno)metil]–N-(4-fenilbutil)benzeno-

sulfonamida (E5) como sendo o mais ativo de ambas as séries, podendo concluir

que quanto maior a cadeia espaçadora maior a característica lipofílica da estrutura e

maior a atividade citotóxica.

Os compostos da série 2 foram citotóxicos, porém não apresentaram

atividade antibacteriana, e os compostos da série 1 apresentaram atividade

antibacteriana, porém não atividade citotóxica. Este resultado é bastante relevante,

uma vez que para um medicamento com atividade antibacteriana ser administrado

ele não pode ser citotóxico, obtendo para este estudo duas classes de compostos,

uma atuando como agente antibacteriano e outra como agente citotóxico.

Por conta de o composto E5 ter apresentado a melhor atividade citotóxica de

ambas as séries, foram realizadas novas modificações estruturais a partir do

composto E5 a fim de aumentar sua atividade citotóxica, sintetizando-se uma nova

série (série 3) com substituintes propostos por Topliss. Esta série seguiu o

parâmetro 2π-σ, sendo os parâmetrso hidrofóbicos e eletrônicos envolvidos na

atividade citotóxica destes compostos, dos quais o composto 4-{(Z)-[3-(3,4-dicloro-

benzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-ilideno]metil}benzeno-sulfonamida (N4) diminuiu

significativamente a viabilidade celular quando comparada ao E5.

Com os dados obtidos na avaliação da atividade antibacteriana e citotóxica,

têm-se como perspectiva para futuros estudos a avaliação do mecanismo de ação

dos compostos mais ativos, uma vez que as bactérias não apresentam receptores

PPARs, e alguns estudos dizerem que a atividade antitumoral das TZDs

independem da ativação dos receptors PPARy, uma vez que elas são agonistas

seletivas destes receptores.

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