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INSTITO DE SALUD PUBLICA DE CHILESUBDEPARTAMENTO LABORATORIOS DEL AMBIENTE

SECCION QUÍMICA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINARFIBRA DIETÉTICA TOTAL

Método Enzimático - Gravimétrico

PRT-701.03-019Rev Nº :2Pagina 1 de 4

1.0. OBJETIVO

Determinar fibra dietética total en diversos tipos de alimentos por método enzimático-gravimétrico.

2.0. CAMPO DE APLICACION

El método es aplicable a muestras de harinas, pan y cereales, recepcionadas en el Laboratorio deAditivos del Subdepartamento de Laboratorios del Ambiente.

3.0. FUNDAMENTO

Muestras en duplicado de alimentos secos y desgrasados son gelatinizados con α - amilasatérmicamente estable y luego digeridas enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa pararemover la proteína y el almidón. La fibra dietética soluble es precipitada por la adición de etanol ,elresiduo total se filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en duplicado se determina proteína, yen el otro cenizas.Fibra dietética total = Peso del residuo - Peso ( proteína + cenizas).

4.0. REFERENCIAS

4.1.- Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition. U.S.A. (1990).

5.0. TERMINOLOGIA

5.1. N.A.

6.0. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1. Materiales y Equipos

6.1.1. Balanza analítica, con sensibilidad de 0,1 mg.6.1.2. Baños termorregulados: (a) a ebullición y (b) ajustable a 60 ºC con agitación directa en el

interior de cada matraz de digestión para dar un movimiento constante al matraz de digestióndurante la hidrólisis enzimática.

6.1.3. Bomba de vacío.6.1.4. Crisol con placa porosa, porosidad Nº 2 o equivalente de 40 - 60 µm.6.1.5. Desecador con silicagel o similar.6.1.6. Estufa de vacío a 70 ºC o alternativamente estufa de aire de acuerdo a lo indicado en la

referencia.6.1.7. Mufla a 525 ºC.6.1.8. Tamiz de 0,3 - 0,5 mm.6.1.9. Vasos de precipitados altos de 400 a 600 mL.






6.1.10. pHmetro.6.1.11. Homogenizador.6.1.12. Material usual de laboratorio.

6.2. Reactivos

6.2.1. Etanol al 95 %, p.a.6.2.2. Etanol al 78 %.Mezclar un volumen de agua con cuatro volúmenes de etanol al95 %.6.2.3. Acetona p.a.6.2.4. Tampón fosfato 0,08 M, pH 6,0:Disolver 1,4 g de fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2HPO4) (o 1,753 g dihidratado) y 9,68 g de

fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH2PO4) (o 10,94 g dihidratado) enalrededor de 700 ml de agua. Diluir a 1 L con agua. Chequear el pH con pHmetro.

6.2.5. α - amilasa termoestable. Mantener refrigerada.6.2.6.- Proteasa. Mantener refrigerada.6.2.7. Amiloglucosidasa. Mantener refrigerada.6.2.8. Hidróxido de sodio 0,275 N. Disolver 11,00 g de NaOH en 700 ml de agua en un matraz

volumétrico de 1 L. Diluir a volumen con agua.6.2.9. Acido clorhídrico 0,325 N Diluir una solución stock de HCl de título conocido. por ejemplo,

325 mL de HCl 1 N a 1 L con agua.6.2.10. Celite C - 211, lavado con ácido.6.2.11. Eter de petróleo.

7.0. DESARROLLO DEL PROCESO

7.1. Determinación de la pureza de la enzima

Para asegurar la ausencia de actividad enzimática indeseable en las enzimas usadas en esta técnica, sedeben ensayar las enzimas, cuando se cambia de lote, o a intervalos de 6 meses, para asegurar que laenzima no se ha degradado siguiendo el mismo procedimiento que para las muestras de acuerdo a lasiguiente tabla.

Muestra Actividad ensayada Peso muestra (g) % Recuperación

Pectina cítrica pectinasa 0,1 95 - 100Goma de alerce hemicelulasa 0,1 95 - 100Almidón de trigo amilasa 1,0 0 - 1Almidón de maiz amilasa 1,0 0 - 2Caseína proteasa 0,3 0 - 2β glucano β glucanasa 0,1 95 - 100.






7.2. Preparación de la muestra y extracción

7.2.1. Homogeneizar, secar y moler la muestra en un homogenizador.7.2.2. Pasar por un tamiz de malla de 0,3 - 0,5 mm.7.2.3. Extraer con éter de petróleo sí el contenido de grasa es superior al 10 %, tres veces con

porciones de 25 mL / g de muestra.7.2.4. Anotar la pérdida de peso por la remoción de la grasa y considerarlo en el cálculo final.

7.3.- Determinación

7.3.1. Pesar en duplicado alrededor de 1 g de muestra en un vaso de precipitados de 400 mL.El peso de las muestras no debe diferir en más de 20 mg. Registrar m en el cuadernofoliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes.

7.3.2. Agregar 50 mL de tampón fosfato pH 6,0 a cada vaso.7.3.3. Controlar el pH y ajustar a pH 6 ± 0,2 si fuese necesario.7.3.4. Adicionar 0,1 mL de la solución de α amilasa. Cubrir el matraz con papel aluminio,

colocarlo en un baño de agua y hervir durante 15 minutos. Agitar a intervalos de 5minutos. El contenido debe llegar a 95 - 100 ºC.

7.3.5. Enfriar la solución a temperatura ambiente.7.3.6. Ajustar pH a 7,5 ±0,2 con aproximadamente 10 mL NaOH 0,275 N.7.3.7. Adicionar 5 mg de proteasa. Cubrir el matraz con papel aluminio e incubar 30 minutos a

60 ºC con agitación continua.7.3.8. Enfriar y añadir 10 mL de HCl 0,325 N.7.3.9. Medir el pH y agregar gotas de ácido sí fuese necesario. El pH final debe ser4,0 - 4,6.7.3.10. Añadir 0,3 mL amiloglucosidasa, cubrir con papel aluminio e incubar 30 minutos a 60

ºC con agitación continua.7.3.11. Adicionar 280 mL de etanol al 95 % precalentado a 60 ºC.7.3.12. Dejar precipitar a temperatura ambiente por 60 minutos.7.3.13. Pesar el crisol que contiene celite, humedecerlo y redistribuir el celite en el crisol

usando etanol al 78 % y aplicar succión.7.3.14. Mantener la succión y transferir cuantitativamente el precipitado al crisol.7.3.15. Lavar el residuo sucesivamente con tres porciones de 20 mL de etanol al 78 %, dos

porciones de 10 mL de etanol al 95 % y dos porciones de 10 mL de acetona. Se puedeformar goma con algunas muestras, atrapando el líquido. Sí así fuera, rompa la películade la superficie con espátula para mejorar el filtrado. El tiempo de filtración y lavadovariará de 0,1 a 6 horas, con un promedio de 1 1/2 hora por muestra. Se pueden evitartiempos largos de filtración, mediante una succión intermitente y cuidadosa.

7.3.16. Secar el crisol que contiene el residuo durante la noche en estufa de vacío a 70 ºC o enestufa de aire a 105 ºC.






7.3.17. Enfriar en desecador y pesar . Restar el peso del crisol y del celite para determinar elpeso del residuo. Registrar m1 en el cuaderno foliado del Laboratorio de Aditivos yContaminantes.

7.3.18. Analizar proteínas usando N x 6,25 como factor de conversión en el residuo de una delas muestras de los duplicados. Registrar P en el cuaderno foliado del Laboratorio deAditivos y Contaminantes.

7.3.19. Calcinar el residuo de la segunda muestra del duplicado durante 5 horas a 525 ºC.7.3.20. Enfriar en desecador y pesar.

7.3.21. Restar el peso del crisol y del celite para determinar cenizas. Registrar C en el cuadernofoliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes.

7.3.22. Efectuar la determinación del blanco en duplicado y en las mismas condicionesdescritas en el procedimiento para el análisis de muestras.

7.4. Cálculo e informe de resultados

7.4.1.- Determinación del blanco:

B = blanco, mg = masa del residuo - PB - CB donde: - Masa del residuo = promedio de masa del residuo (mg) para la determinación blanco.

- PB y CB = masa (mg) de proteína y cenizas, respectivamente enlos residuos de los blancos.

7.4.2.- Cálculo de fibra dietética total:

% FDT = [ ( masa del residuo - P - C - B)/ masa de la muestra ) ] x 100

donde : - m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg). - m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado (mg). - P y C = masa (mg) de proteína y cenizas, respectivamente en los residuos de las muestras. - B = blanco, indicado en 7.4.1.

Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con dos decimales.Repetibilidad: La diferencia de los resultados no deberá ser superior al 5 % del promedio.

Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sidodesgrasada en el caso de contener más de 10 % de grasa.

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