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RAFAEL CAPUTO OLIVEIRA SUPLEMENTAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS EM FINAL DE GESTAÇÃO COM BETACAROTENO LAVRAS-MG 2014
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RAFAEL CAPUTO OLIVEIRA
SUPLEMENTAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS EM
FINAL DE GESTAÇÃO COM BETACAROTENO
LAVRAS-MG
2014
RAFAEL CAPUTO OLIVEIRA
SUPLEMENTAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS EM FINAL DE
GESTAÇÃO COM BETACAROTENO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, área de concentração em Produção e Nutrição de Ruminantes, para obtenção do título de Mestre.
Orientador
Dr. Marcos Neves Pereira
Coorientadora
Dra. Nadja Gomes Alves
LAVRAS – MG
2014
Oliveira, Rafael Caputo. Suplementação de vacas leiteiras em final de gestação com betacaroteno / Rafael Caputo Oliveira. – Lavras : UFLA, 2014.
134 p. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2014. Orientador: Marcos Neves Pereira. Bibliografia. 1. Placenta. 2. Provitamina A. I. Universidade Federal de Lavras.
II. Título. CDD – 636.208528
Ficha Catalográfica Elaborada pela Coordenadoria de Produtos e
Serviços da Biblioteca Universitária da UFLA
RAFAEL CAPUTO OLIVEIRA
SUPLEMENTAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS EM FINAL DE
GESTAÇÃO COM BETACAROTENO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, área de concentração em Produção e Nutrição de Ruminantes, para obtenção do título de Mestre.
APROVADA em 30 de julho de 2014.
Dr. Antônio Gilberto Bertechini UFLA
Dr. Gustavo Augusto de Andrade UFLA
Dra. Renata Apocalypse Nogueira Pereira EPAMIG/URESM
Dr. Marcos Neves Pereira
Orientador
LAVRAS – MG
2014
RESUMO
A suplementação pré-parto de betacaroteno foi avaliada. O conjunto de dados continha 283 vacas holandesas que receberam um tratamento por mais de 14 dias (29,1 ± 6,9 d). As vacas foram blocadas em pares por paridade e data prevista do parto e atribuídas aleatoriamente a um dos tratamentos: Betacaroteno (1,2 g/vaca/d. Rovimix, DSM) ou controle. O mesmo lote da TMR foi oferecido a todas as vacas. O suplemento foi adicionado por cima da dieta e completamente misturado uma vez ao dia. A produção de leite foi registrada diariamente e amostrada aos 30,1 ± 8,3 dias pós-parto. As distribuições de frequência foram analisadas com o GENMOD do SAS por meio de regressão logística para dados binomiais. As variáveis contínuas foram analisadas com o MIXED. Dentro de paridade, as estimativas não paramétricas da função de sobrevivência para as variáveis reprodutivas foram computadas usando o método do produto-limite de Kaplan-Meier com o LIFETEST. O teor sanguíneo de betacaroteno no início do experimento foi similar (2,99 µg/mL, P=0,59) e atingiu um pico a 3,26 µg/mL no dia -15 pré-parto para vacas suplementadas (2,62 µg/mL para o controle, P<0,01). A densidade do colostro, a produção de leite e o teor de sólidos do leite foram semelhantes (P>0,32). A produção de leite a partir do dia 20 ao 109 da lactação foi 3105 kg para primíparas e de 3.595 kg para multíparas (P<0,01). O Betacaroteno tendeu a aumentar o teor de proteína do leite de 2,90 para 2,96% (P=0,09) e para diminuir a proporção de primíparas com a relação gordura sobre proteína do leite >1,5, 25,8 para 9,7% (P=0,10). A proporção de primíparas com parto difícil, CCS>200.000 células/mL, metrite, progesterona >1 ng/mL em 21 e 42 d, % concepção ao primeiro serviço e % prenhez a 90 e 150 d foram semelhantes (P>0,46). Houve tendência de diminuição da incidência de CCS>200.000 células/mL em multíparas suplementadas com betacaroteno (38,9% vs. 28,1%, P=0,12), outras variáveis foram semelhantes (P>0,21). O Betacaroteno reduziu a proporção de multíparas com retenção de placenta 12h pós-parto de 29,9% para 21,7%, o tempo de liberação de placenta foi 392 min (340-440) para o Betacaroteno e 490 min (395-540) para o Controle (Mediana e intervalo de confiança de 95%. Logrank P=0,05 e Wilcoxon P=0,04). O Betacaroteno em primíparas não determinou a liberação da placenta (incidência foi 15,4%). Respostas nos intervalos do parto ao primeiro estro, ao primeiro serviço e à concepção não foram detectadas. A suplementação pré-parto de betacaroteno aumentou o teor sanguíneo em torno do parto. Não houve resposta detectável na produção de leite ou desempenho reprodutivo. O Betacaroteno reduziu a incidência de retenção de placenta em vacas multíparas.
Palavras-chave: Betacaroteno. Período de transição. Retenção de placenta.
ABSTRACT
The pre-calving supplementation of beta-carotene was evaluated. The data set contained 283 Holsteins that received a treatment for >14 d (29.1±6.9 d). Cows were paired blocked by parity and expected calving date and assigned to a treatment: Beta-carotene (1.2 g/cow/d. Rovimix, DSM) or Control. The same TMR batch was offered to all cows and beta-carotene was top dressed per cow once a day. Milk yield was recorded daily and sampled at 30.1±8.3 d post-calving. Frequency distributions were analyzed with GENMOD of SAS using logistic regression for binomial data. Continuous variables were analyzed with MIXED. Within parity, nonparametric estimates of the survivor function for reproductive variables were computed using the product-limit method of the Kaplan-Meier method with LIFETEST. Blood beta-carotene content at the start of the experiment was similar (2.99 µg/mL, P=0.59) and peaked at 3.26 µg/mL on day -15 pre-calving for supplemented cows (2.62 µg/mL for Control, P<0.01). Colostrum density, milk yield, and milk solids content were similar (P>0.32). Milk yield from d 20 to 109 of lactation was 3105 kg for primiparous and 3595 kg for multiparous (P<0.01). Beta-carotene tended to increase milk protein content from 2.90 to 2.96% (P=0.09) and to decrease the proportion of primiparous with a milk fat to protein ratio >1.5 from 25.8 to 9.7% (P=0.10). The proportion of primiparous with difficult calving, SCC >200,000 cells/mL, metritis, progesterone >1 ng/mL at 21 and 42 d, % conception at first service, and % pregnant at 90 and 150 d were similar (P>0.46). There was a trend for decreased incidence of SCC >200,000 cells/mL in multiparous supplemented with beta-carotene (38.9% vs. 28.1%,P=0.12), other variables were similar (P>0.21). Beta-carotene reduced the proportion of multiparous with retained placenta 12 h post-calving from 29.9% to 21.7%, time of placenta release was 392 min (340 to 440) for beta-carotene and 490 min (395 to 540) for Control (Median and 95% confidence interval. LogRank P=0.05 and Wilcoxon P= 0.04). For primiparous, beta-carotene did not determine placenta release (incidence was 15.4%). Responses in the intervals from calving to first estrous, to first service, and to conception were not detected. The pre-calving supplementation of beta-carotene increased the blood content around calving. There was no detectable response in milk yield or reproductive performance. Beta-carotene reduced the incidence of retained placenta in multiparous cows. Keywords: Beta-carotene. Retained placenta. Transition period.
LISTA DE FIGURAS
PRIMEIRA PARTE Figura 1 Estrutura da unidade isoprenoide e de alguns carotenoides encontrados
nos alimentos................................................................................. 17
Figura 2 Bioconversão do betacaroteno a retinol ...........................................32
Figura 3 Interação entre os antioxidantes alfatocoferol (TOH), carotenos (CAR)
e ácido ascórbico (ASCH) e com as espécies reativas de oxigênio
(ERO).............................................................................................48
ARTIGO 1 Figure 1 Survival curve for time post-calving of placenta release for
multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 392min (340 to 440) for Beta-carotene and 490min (395 to 540) for Control. LogRank P=0.05 and Wilcoxon P=0.04……………………………………………….132
Figure 2 Survival curve for time post-calving of placenta release for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 388min (285 to 440) for Beta-carotene and 375min (290 to 425) for Control. LogRank P=0.87 and Wilcoxon P=0.86……………………………………………….133
Figure 3 Survival curve for calving to 1st estrous for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 38d (34 to 43) for Beta-carotene and 44d (37 to 50) for Control. LogRank P=0.55 and Wilcoxon P=0.23………..134
Figure 4 Survival curve for calving to 1st estrous for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 39d (33 to 51) for Beta-carotene and 34d (30 to 43) for Control. LogRank P=0.34 and Wilcoxon P=0.42………..135
Figure 5 Survival curve for calving to conception for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). LogRank P=0.82 and Wilcoxon P=0.75…………………………………………………...136
Figure 6 Survival curve for calving to conception for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median was 125d for Beta-carotene and 97d for Control. LogRank P=0.77 and Wilcoxon P=0.65………………………………………………………………137
Figure 7 Survival curve for calving to 1st service for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 70d (65 to 79) for Beta-carotene and 64d (61 to 70) for Control. LogRank P=0.09 and Wilcoxon P=0.07………..138
Figure 8 Survival curve for calving to 1st service for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 65d (56 to 69) for Beta-carotene and 61d (57 to 67) for Control. LogRank P=0.73 and Wilcoxon P=0.87………..139
LISTA DE TABELAS
PRIMEIRA PARTE
Tabela 1 Efeito da suplementação pós-parto de betacaroteno no teor plasmático e no desempenho produtivo, reprodutivo e de saúde em vacas leiteiras........................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 2 Efeito da suplementação pré e pós-parto de betacaroteno no teor plasmático e no desempenho produtivo, reprodutivo e de saúde em vacas leiteiras. ...............................................................................Erro! Indicador não definido.
Tabela 3 Efeito da suplementação pré-parto de betacaroteno no teor plasmático e no desempenho produtivo, reprodutivo e de saúde em vacas leiteiras.......................................................................................... 78
ARTIGO
Table 1 Number of observations used for analysis of response variables on treatments Control and Beta-carotene, for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows……………………………………………125
Table 2 Proportion of cows with blood beta-carotene content High (>=3.5 µg/mL), Intermediate (>=2 to <3.5 µg/mL) or Low (<2 µg/mL) at Days 0 and -15 pre-calving, and at Days 7 and 56 post-calving, on treatments Control or Beta-carotene………………………………..126
Table 3 Blood beta-carotene content (µg/mL) at Days 0 and -15 pre-calving, and at Days 7 and 56 post-calving, for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows on treatments Control or Beta-carotene…………………………………………………………….. 127
Table 4 Milk somatic cell score, colostrum density, and milk yield and solids content for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows on treatments Control or Beta-carotene………………………………..128
Table 5 Proportion of health and reproductive events for primiparous cows on treatments Control or Beta-carotene………………………………..129
Table 6 Proportion of health and reproductive events for multiparous cows on treatments Control or Beta-carotene………………………………..130
Table 7 Blood beta-carotene content (µg/mL) at 7 and 56 days post-calving according to events………………………………………………….131
SUMÁRIO
PRIMEIRA PARTE 1 INTRODUÇÃO .............................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA......................................................15
2.1 Betacaroteno e outros carotenoides ...............................................15
2.2 Estrutura química dos carotenoides nos alimentos .......................16
2.3 Produção industrial e algumas formas comerciais de betacaroteno ...................................................................................18
2.4 Conteúdo de betacaroteno e outros carotenoides nos alimentos.........................................................................................19
2.5 Metabolismo dos carotenoides .......................................................21
2.5.1 Metabolismo ruminal de carotenoides...........................................21
2.5.2 Absorção intestinal de carotenoides...............................................26
2.5.3 Bioconversão de betacaroteno a retinol .........................................31
2.6 Transporte de carotenoides no corpo ............................................34
2.7 Concentração de carotenoides nos tecidos.....................................35
2.8 Estresse oxidativo e as espécies reativas de oxigênio .....................40 2.9 Comportamento e mecanismos de atuação do betacaroteno
como um antioxidante ....................................................................42
2.9.1 Supressão física do oxigênio singlete..............................................43
2.9.2 Reação dos carotenoides com os radicais livres.............................43
2.9.3 Interação com outros antioxidantes...............................................47
2.10 Relação da suplementação de antioxidantes com o estado oxidativo de vacas leiteiras no pré-parto .......................................48
2.11 Estado metabólico, oxidativo e função imune de vacas leiteiras no periparto ......................................................................50
2.12 Ação do betacaroteno na resposta imune afetando a saúde ..........54 2.12.1 Estudos in vitro ...............................................................................54 2.12.2 Ação na glândula mamária ............................................................56
2.12.3 Ação no útero..................................................................................58
2.12.4 Ação no balanço energético............................................................60
2.12.5 Ação em tumores ............................................................................61
2.12.6 Mecanismos de atuação..................................................................61
2.13 Ação do betacaroteno na produção de leite ...................................62
2.14 Ação do betacaroteno na reprodução ............................................63
2.14.1 Atividade esteroidogênica ..............................................................63
2.14.2 Efeito da suplementação de betacaroteno no útero e na produção de embriões ....................................................................65
2.14.3 Suplementação de vacas em lactação com betacaroteno...............67
2.14.4 Suplementação de betacaroteno no pré-parto de vacas leiteiras............................................................................................71
2.14.5 Mecanismos de atuação..................................................................74
2.15 Discussão comparativa entre os principais trabalhos da literatura.........................................................................................74
REFERÊNCIAS..............................................................................80
SEGUNDA PARTE – ARTIGO...................................................104
ARTIGO SUPPLEMENTATION OF LATE GESTATION DAIRY COWS WITH BETA-CAROTENE..............105
PRIMEIRA PARTE
13
1 INTRODUÇÃO
Em sistemas de produção de leite sob confinamento não é incomum a
utilização de dietas baseadas em forragens conservadas e alta inclusão de
alimentos concentrados. Esta condição geralmente leva a baixa ingestão e/ou
absorção de betacaroteno (Provitamina A), podendo ter impacto negativo sobre o
desempenho produtivo e reprodutivo e a saúde de vacas leiteiras.
Respostas benéficas em fertilidade de vacas leiteiras foram obtidas
quando betacaroteno foi suplementado após o parto (ARÉCHIGA et al., 1998;
DE ONDARZA et al., 2009). Entretanto, ausência de resposta à suplementação
(AKORDOR et al., 1986; BINDAS et al., 1984), ou resposta negativa em
desempenho reprodutivo (FOLMAN et al., 1987), têm sido também relatadas. A
resposta à suplementação com betacaroteno pode ser determinada pela duração
do período de suplementação, pelo teor de betacaroteno na dieta basal e pelo teor
sanguíneo obtido. O desafio ambiental também determina a resposta do animal
ao betacaroteno suplementar (ARÉCHIGA et al., 1998).
O mecanismo de ação pelo qual a suplementação com betacaroteno pode
determinar a eficiência reprodutiva de vacas leiteiras parece envolver sua
conversão em vitamina A no útero e ovários (CHEW et al., 1982a;
SCHWEIGERT et al, 2001). A vitamina A está relacionada com a implantação e
o desenvolvimento embrionário (CLAGETT-DAME; DELUCA, 2002) e
também está envolvida na expressão gênica de enzimas relacionadas a
esteroidogênese nos ovários (WICKENHEISSER et al., 2005). O betacaroteno
também pode ter ação antioxidante, protegendo componentes celulares de
espécies reativas de oxigênio (YOUNG et al., 1985). O sistema de defesa
antioxidante pode estar sobrecarregado no período próximo ao parto, o que pode
ser fator predisponente à ocorrência de enfermidades ligadas ao sistema imune,
como retenção de placenta, metrite e mastite (BERNABUCCI et al., 2002,
14
CASTILLO et al., 2005, LEBLANC et al., 2004). A suplementação com
betacaroteno aumentou a resposta proliferativa de linfócitos e melhorou a
capacidade fagocítica de neutrófilos polimorfonucleares (MICHAL et al., 1994;
TJOELKER et al., 1988).
Aumentos na produção de leite (ARÉCHIGA et al., 1998) e na produção
de gordura no leite (DE ONDARZA et al., 2009) foram observados ao
suplementar vacas leiteiras com betacaroteno após o parto. O aumento da
secreção de gordura no leite pode ser explicado pelo aumento no crescimento de
bactérias ruminais celulolíticas ao incubar fluido ruminal com betacaroteno
(HINO et al., 1993). Outros autores não observaram efeito na produção e
composição de leite em resposta à suplementação de betacaroteno em vacas
leiteiras (BINDAS et al., 1984; KAEWLAMUN et al., 2012; RAKES et al.,
1985; WANG; OWEN; LARSON, 1988).
No Brasil não é incomum a produção de leite em confinamentos de
pequena escala. Neste tipo de sistema de produção de leite é operacionalmente
difícil a adoção de dietas específicas para o período imediatamente posterior ao
parto, devido ao pequeno número de animais neste estágio da lactação.
Entretanto, estratégias nutricionais para o período imediatamente anterior ao
parto são normalmente adotadas, viabilizando o uso de suplementos nesta fase
do ciclo lactacional. Kaewlamun et al. (2012) e Wang et al. (2013) relataram
ganho em saúde uterina de vacas suplementadas com betacaroteno antes do
parto. Além disso, Kawashima et al. (2009) demonstraram que vacas leiteiras
com teor mais alto de betacaroteno plasmático antes do parto tiveram menor
intervalo entre o parto e o primeiro cio, sugerindo que a suplementação com
betacaroteno antes do parto pode ter efeito positivo sobre eventos reprodutivos
no início da lactação. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a
resposta em desempenho produtivo e reprodutivo e a sanidade de vacas leiteiras
em início de lactação à suplementação com betacaroteno antes do parto.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Betacaroteno e outros carotenoides
O betacaroteno é um dentre mais de 600 carotenoides sintetizados por
todos os organismos fotossintéticos incluindo plantas, algas e cianobactérias e
também por algumas bactérias não-fotossintéticas e fungos. Os carotenoides são
encontrados tanto em plantas quanto em animais, porém esses últimos são
incapazes de sintetizá-los.
Betacaroteno, xantofila e licopeno são responsáveis, respectivamente,
pelas colorações laranja, amarelo e vermelho nos organismos e representam o
principal grupo de pigmentos naturais. Em vegetais, a síntese de carotenoides
nos tecidos fotossintéticos ocorre nos cloroplastos, onde estão principalmente
sob a forma de um complexo carotenoide-proteína (cromoproteínas). Nos
tecidos não-fotossintéticos, os carotenoides são depositados nos cromoplastos na
forma estrutural atômica cristalina, como nos tomates e cenouras, ou como
gotículas de óleo como na manga e pimentão (BRITTON, 1983; KURZ,
CARLE; SCHIEBER, 2008).
O betacaroteno é um pigmento lipossolúvel de cor variada encontrado
principalmente em plantas (MCDOWELL, 2012). É um precursor indireto de
retinol (Vitamina A), o qual não é encontrado nos vegetais, sendo, assim, de
grande importância nutricional para herbívoros. Outros carotenoides podem ser
convertidos em vitamina A pelos animais, mas a eficiência de conversão é
inferior a do betacaroteno (NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC, 2001).
As folhas de plantas contêm de cinco a dez vezes mais carotenoides que
os colmos, sendo que o teor nas forragens depende da síntese e da degradação do
composto (LIVINGSTON et al., 1968b; MORRISON, 1917). Park et al. (1983)
demonstraram que a fertilização com nitrogênio aumentou a concentração de
16
carotenoides em forragens; uma possível explicação seria por ativação da
biossíntese dos carotenoides por proteínas. A degradação dos carotenoides é
promovida por vários fatores, como radiação ultravioleta da luz solar, oxigênio
atmosférico (oxidação) ou enzimas (lipoxidases), que se tornam ativas pela
decomposição das plantas (MCDOWELL, 2012). Em forragens colhidas e
armazenadas (silagens e fenos) a concentração de betacaroteno diminui
rapidamente (BRUHN; OLIVER, 1978; PARK et al., 1983), sendo que há
também correlação negativa entre a concentração de betacaroteno e o tempo que
a forragem é estocada (BRUHN; OLIVER, 1978). Nos períodos chuvosos, a
concentração de betacaroteno nas pastagens aumenta, devido a maior presença
de brotos, e a concentração diminui com o avançar da maturidade da planta
(PARK et al., 1983).
2.2 Estrutura química dos carotenoides nos alimentos
Os carotenoides apresentam a estrutura básica de tetraterpenos formados
por oito unidades isoprenoides de cinco carbonos, ligados de tal forma que a
molécula é linear e simétrica com a ordem invertida no centro e apresenta
sistema de duplas ligações alternadas entre os átomos de carbono (cadeia
poliênica). O sistema de duplas ligações conjugadas confere a estes pigmentos
alta reatividade química, podendo ser facilmente isomerizados e oxidados
(MCDOWELL, 2012).
Nas forragens, o todo-trans betacaroteno é o principal representante do
grupo dos carotenos, moléculas compostas apenas de hidrogênio e carbono.
Carotenos são diferentes das xantofilas que contêm oxigênio na molécula,
representadas principalmente pela luteína, zeaxantina e epiluteína (NOZIÈRE et
al., 2006). A fórmula química do betacaroteno é C40H56. Foram encontrados os
isômeros 9-cis e o 13-cis betacaroteno, e o alfacaroteno em algumas forragens,
17
porém em baixas quantidades (REYNOSO et al., 2004). O alfacaroteno é o
isômero primário do betacaroteno que se difere dele pela posição da dupla
ligação do anel benzênico terminal. A formula estrutural da unidade isoprenoide
e de alguns carotenoides estão representadas na figura 1.
Figura 1 Estrutura da unidade isoprenoide e de alguns carotenoides encontrados nos alimentos.
18
2.3 Produção industrial e algumas formas comerciais de betacaroteno
A produção industrial de betacaroteno começou em 1954 pela empresa
Hoffman-La Roche & Co. Ltd. Atualmente, os dois principais produtores
industriais, BASF e Hoffmann-La Roche (a divisão de vitamina foi vendida para
a empresa DSM em 2003), também produzem outros carotenoides, como a
cantaxantina, a astaxantina, a luteína, os apocarotenoides e a citranaxantina
(VALDUGA et al., 2009).
A síntese industrial produz moléculas puras de betacaroteno em
estruturas cristalinas. A empresa BASF produz o betacaroteno a partir da reação
de uma molécula retinal com uma molécula de betaretiniltrifenilfosfônio (C20 +
C20), enquanto que a empresa Hoffmann-La Roche, sintetiza betacaroteno a
partir de duas moléculas de C19-aldeído com uma molécula de diol (C19 + C2 +
C19) (COUTATE, 1996). Abaixo são citadas algumas fontes comerciais de
betacatoteno.
a) Rovimix BetaCarotene 10%, DSM Nutritional Products Ltd, Heerlen,
Holanda. Consiste em grânulos finamente moídos de fluxo livre e de coloração
vermelho acastanhado a castanho avermelhado. Contém no mínimo 10% de
betacaroteno (C40H56) finamente disperso em matriz de gelatina e carboidratos
revestidos por amido de milho. Produto em pó (pelo menos 95% < peneira No.
20, padrão americano).
b) Lucarotin 10% Feed, BASF The Chemical Company, Ludwigshafen,
Alemanha. Contém no mínimo 10% de betacaroteno disperso em matriz de
gelatina (mono e polissacarídeos). Produto em pó (pelo menos 95% < 0,63mm).
c) Carofertin, Alvetra&Werfft AG, Neufeld an der Leitha, Áustria.
Solução aquosa injetável de betacaroteno (10 mg/mL) para bovinos e suínos.
Administração intramuscular ou subcutânea.
19
d) OxC-beta, Avivagen, Ottawa, Canadá. O produto para animais de
produção ainda está em desenvolvimento. O princípio ativo OxC-beta consiste
de derivados oxidados (monômeros e polímeros) resultante da oxidação
completa do betacaroteno em solução de benzeno e na presença de oxigênio.
Apresenta coloração amarelada e fórmula química C40H60O15.
2.4 Conteúdo de betacaroteno e outros carotenoides nos alimentos
Assume-se que a concentração ótima de carotenoides na matéria seca de
forragens para ruminanes é de 200 ppm (MCDOWELL, 1989). As forragens
cultivadas apresentam quatro principais carotenoides: luteína, zeaxantina,
epiluteína, e o betacaroteno (NOZIÈRE et al., 2006).
A variação no teor de carotenoides entre espécies forrageiras é menos
importante que a variação dentro das espécies devido ao efeito negativo da
maturidade da planta sobre o teor do composto. Entre espécies, Chauveau-Duriot
et al. (2005) estudaram a variação dos teores de carotenoides das forragens
azevém, trevo vermelho e grama pé de galinha, e observaram baixa variação nos
teores dos carotenoides na matéria seca destas forragens: 392 ± 56,5 ppm para
carotenoides totais, 209 ± 24,4 ppm para luteína, 88 ± 11,1 ppm para
betacaroteno, 71 ± 19,1 ppm para zeaxantina, 22 ± 3,9 ppm para epiluteína. As
xantofilas representaram a maior parte dos carotenoides nestas forragens (88%).
Em forrageiras tropicais, Reynoso et al. (2004) não detectaram diferença
no teor de betacaroteno e luteína entre grama Bermuda (Cynodon dactylon) e
capim Pangola (Digitaria decumbens). McDowall e McGillivray (1963)
demonstraram que a concentração de carotenoides em Azevém foi mais
determinada pelo estágio de maturação da planta do que pelas estações do ano.
Alguns autores posteriormente confirmaram esta observação (LIVINGSTON et
al., 1968b; PARK et al., 1983), parcialmente explicada pela diminuição da
20
relação entre folhas e caules com o avançar da maturidade da planta (PARK et
al., 1983). Marcin e Nad (2012) avaliaram a variação no teor de betacaroteno em
alfafa (Medicago sativa) após o primeiro corte. Houve queda acentuada no teor
de betacaroteno na matéria seca da planta do dia 1 ao dia 10, que foram,
respectivamente, 205 ± 16 ppm e 85 ± 12 ppm após o corte, e estabilização do
teor do dia 17 ao dia 23, que foram 55 ± 3 ppm e 54 ± 5 ppm.
Silagens de milho apresentam baixo teor de carotenoides. Hegsted et al.
(1938) relataram teor na matéria seca da silagem variando de 47 a 134 ppm para
carotenoides totais e para a planta recém colhida de 238 ppm. Nozière et al.
(2006), em três amostras de silagem de milho, encontraram valores de 70, 76 e
80 ppm de carotenoides totais e concentração de betacaroteno de 24, 30 e 35
ppm. Frye, Williams e Graham (1991) encontraram teor variando de 4 a 56 ppm
de carotenos.
Chauveau-Duriot et al. (2005) estudaram o impacto do método de
conservação de forragens sobre o teor de carotenoides em azevém, trevo
vermelho e grama pé de galinha. O teor de carotenoides totais na matéria seca
destas plantas foi 392 ± 56,5. A fenação induziu queda média de 78,9 % no teor
de carotenoides totais das forragens.
A queda no teor de carotenoides é maior em silagem com pH mais alto,
em condições de baixa anaerobiose induzida por atraso no fechamento do silo e
em maior tempo de armazenamento da silagem (KALAC; MCDONALD, 1981;
KALAC et al., 1983). As perdas podem alcançar 80% da concentração de
betacaroteno na forragem colhida (KALAC et al., 1983).
A maioria dos alimentos concentrados tem baixa concentração de
carotenoides. Farelo de milho contém principalmente luteína e zeaxantina (13,5
ppm na MS) e pouca quantidade de betacaroteno (<1 ppm na MS) (HOLDEN et
al., 1999). O calor utilizado ou gerado no processamento dos concentrados
21
também é capaz de destruir grande parte dos carotenoides presentes nestes
alimentos (HOLDEN et al., 1999; NYS, 2000).
2.5 Metabolismo dos carotenoides
2.5.1 Metabolismo ruminal de carotenoides
Os carotenoides presentes nas forragens estão, principalmente,
complexados com proteínas no citoplasma de células vegetais (BRITTON,
1983). O primeiro evento no processo digestivo dos carotenoides é a degradação
da parede celular vegetal liberando os carotenoides para a fase líquida da digesta
(Mora et al., 1999). Serrano et al. (2005) observaram que a disponibilidade dos
carotenoides no intestino de humanos é dependente do teor de lignina e de
proteínas não digestíveis nas plantas. Esses dados sugerem que a fonte e a
maturação da forragem podem influenciar também na taxa fracional de
degradação ruminal de carotenoides.
Mora et al. (1999) utilizaram quatro novilhos canulados no rúmen para
determinar a taxa fracional de desaparecimento (kd) in vitro e in situ de
betacaroteno contido em feno de alfafa. Apenas 10% do betacaroteno
desapareceram após oito horas de incubação in vitro e se mantiveram
praticamente estáveis até 64 horas (11,8%). O kd do betacaroteno foi 0,13% h-1.
In situ, 71,9% do betacaroteno desapareceram nas primeiras oito horas, sendo
que o desaparecimento foi 91,3% no final de 64 horas. O kd do betacaroteno foi
2,5 % h-1 e da matéria seca do feno de alfafa foi 1,9% h-1. Os autores concluíram
que essas diferenças entre as técnicas in vitro e in situ foram devidas à taxa
fracional de desaparecimento da matéria seca do feno de alfafa, ou seja, grande
parte dos betacarotenos presentes na célula vegetal são liberados no rúmen e
chegam ao intestino sem sofrer degradação ruminal.
22
Cruz-Monterrosa et al. (2011) utilizaram quatro novilhos canulados no
rúmen e no duodeno para avaliar a digestão de carotenoides em grama Estrela
Africana (Cynodon plectostachyus). Amostras da forragem contendo 697 ppm
de carotenoides totais na matéria seca foram incubadas in situ por 12, 24, 48 e 72
h. Após a incubação ruminal, parte das amostras foi transferida para sacos de
nylon e introduzida no duodeno para determinar o desaparecimento intestinal e
no trato digestivo total. No rúmen, mais de 40% da concentração inicial de
carotenoides na forragem desapareceram nas primeiras 12 h de incubação,
enquanto o desaparecimento foi 57, 63 e 71% do inicial nos tempos 24, 48 e 72
h, respectivamente. Parte do desaparecimento dos carotenoides foi atribuído à
atividade biohidrogenadora do rúmen, já que estes compostos apresentam várias
insaturações na cadeia carbônica.
Em um estudo in vitro, realizado no laboratório do INRA, não foi
detectada degradação ruminal de luteína presente em forragens. Entretanto,
houve desaparecimento de 50% do inicial quando luteína sintética foi adicionada
(NOZIÈRE et al., 2006).
Keating, Hale e Hubbert (1964) incubaram betacaroteno sintético em
fluidos ruminais de 12 novilhos alimentados com dietas contendo 30 ou 70% de
concentrado. Estes autores relataram que a degradação ruminal de betacaroteno
foi 16,6% e 26,3% do inicial após 3,5 e 16 h de incubação ruminal in vitro,
respectivamente. Não foi detectado efeito da composição da dieta na degradação
do betacaroteno. Davison e Seo (1963), em experimento conduzido com fluido
ruminal de novihas in vitro, observaram que a proporção de degradação de
betacaroteno em produto purificado foi 25% do inicial após sete horas de
incubação.
Baruffaldi et al. (1981) estudaram a influência de oito valores de pH na
estabilidade do betacaroteno de cenoura fresca. Os valores de pH estudados
foram de 5,0 a 8,0. O teor de betacaroteno manteve-se inalterado para todos os
23
valores de pH avaliados. Qian et al. (2012) também não detectaram diferenças
na degradação do betacaroteno presente em emulsões de óleos enriquecidos com
betacaroteno sintético incubados in vitro, em pH de 4 a 8, por cinco dias.
Entretanto, foi encontrado efeito negativo na degradação do
betacaroteno em pH 3. Os autores também avaliaram o efeito das temperaturas
de 5, 20, 37 e 55 oC na degradação do betacaroteno.
Só foi detectada diferença na degradação do betacaroteno entre as
temperaturas de 5, 20 e 37 oC, a partir do quarto dia. Porém houve maior
degradação, já a partir do primeiro dia, para a temperatura de 55 oC em relação
às demais. Estes resultados poderiam ser extrapolados para um possível efeito
das dietas acidogênicas na estabilidade ruminal do betacaroteno, já que estes
valores de pH podem ser encontrados no ambiente ruminal (GARRETT et al.,
1999) e também para um efeito da temperatura ruminal (~39,5 oC) sobre a
degradação do betacaroteno.
Cardinault et al. (2006) avaliaram a digestão de carotenoides em ovinos
com cânula ruminal, duodenal e ileal. Os ovinos foram alimentados duas vezes
ao dia com Trevo Vermelho (Trifolium pratense). A ingestão diária de luteína,
epiluteína e betacaroteno foram de 174, 52 e 37 mg, respectivamente.
O fluxo diário de carotenoides no duodeno foi superior ao ingerido (204,
56 e 117 mg para luteína, epiluteína e betacaroteno, respectivamente). Estes
resultados demonstram que além da degradação ruminal, ocorre produção de
carotenoides no rúmen. Este resultado foi coerente aos obtidos in vitro pelos
mesmos pesquisadores (CARDINAULT et al., 2004).
McGillivray (1951) demonstrou que pode ocorrer síntese de
carotenoides pelos microrganismos ruminais e intestinais. Neste trabalho foi
mensurada a concentração de carotenoides totais e lignina no alimento, nas fezes
e em diversos pontos do trato gastrointestinal de ovelhas sacrificadas. A lignina
24
foi utilizada como valor de referência. Houve aumento na relação
carotenoides/lignina após a passagem pelo rúmen e também após o ceco.
Vários microrganismos têm sido utilizados na bioprodução de
carotenoides, sendo as leveduras do gênero Rhodotorula consideradas com alto
pontencial industrial (MALDONADE, 2003). Algumas espécies da levedura
Rhodotorula já foram isoladas no rúmen de vacas, como a R. glutinis
(CLARKE; DI MENNA, 1961).
Maldonade (2003), estudando a produção de carotenoides por leveduras
cultivadas in vitro, verificou que, para algumas espécies, o extrato de levedura
foi o substrato com maior influência na produção de carotenoides, enquanto que
os sais de sulfato e fosfato tiveram efeito negativo. Para a espécie R. glutinis, a
máxima concentração de carotenoides obtida foi alcançada com 4 g/L de extrato
de levedura e 17 g/L de glicose em pH inicial 4,0.
Yan et al. (2007) avaliaram o efeito do betacaroteno sobre a fermentação
ruminal in vitro. O fluido ruminal foi obtido de 3 cabras alimentadas com feno
de gramínea, farelo de soja, quirera de arroz e minerais. Estes alimentos foram
incubados com fluido ruminal por 0, 1, 3, 5, 8, 12 e 24 h. Diferentes teores de
betacaroteno (Betacarotene 10%, Roche Vitamins, Basel, Suíça) foram
avaliados: 0, 10, 50, 100, 200, 500 mg/L de fluido ruminal. O teor de nitrogênio
amoniacal no fluido ruminal nos tempos 3 a 24 h foi menor nos tubos contendo
betacaroteno. A concentração de proteína microbiana no fluido em 24 h de
incubação aumentou com o aumento no teor de betacaroteno. A concentração de
ácido acético após 24 h de incubação foi aumentada pela adição de betacaroteno,
e não houve diferença no teor de propionato e de ácidos graxos totais no fluido.
Os autores concluíram que houve aumento no crescimento de bactérias
celulolíticas estimulado pelo betacaroteno.
Hino et al. (1993) detectaram efeito positivo sobre o crescimento
bacteriano e a digestão da fibra ao adicionar betacaroteno e/ou alfatocoferol
25
(Vitamina E) ao fluido ruminal de cabras in vitro. Os fluidos ruminais foram
incubados na presença ou não de betacaroteno (5 ou 10 mg/L) e/ou alfatocoferol
(5 mg/L), com solução de glicose (1 g/L) e diferentes concentrações de óleo de
girassol.
Houve aumento no crescimento bacteriano até 100 mg/L de óleo de
girassol, sendo que o crescimento foi maior para o tratamento com alto teor de
betacaroteno (10 mg/L).
Em concentrações de óleo de girassol superiores a 100 mg/L houve
queda no crescimento bacteriano, demonstrando o efeito tóxico dos ácidos
graxos insaturados sobre as bactérias ruminais. Entretanto, em todos os teores de
óleo de girassol, a inclusão de betacaroteno (10 mg/L) aumentou o teor de N-
bacteriano no fluido ruminal.
A associação de betacaroteno (5 mg/L) com alfatocoferol (5 mg/L)
melhorou a digestibilidade de fibra quando 1 g/L de pó de celulose foi acrescido
aos tubos em substituição à glicose. Da mesma forma, 100 mg/L de óleo de
girassol estimularam a digestão da fibra (17% de aumento), sendo que na
presença dos dois antioxidantes (5 mg/L de cada), a digestibilidade aumentou
ainda mais (33% de aumento) comparad ao controle (sem antioxidantes e sem
óleo de girassol). Ensaios com 300 mg/L de óleo de girassol diminuíram em
72% a digestibilidade da fibra, porém não houve queda na digestão fibrosa
quando antioxidantes foram associados ao óleo de girassol. Os autores sugerem
que antioxidantes poderiam suprimir radicais livres (peróxidos) formados pela
peroxidação de ácidos graxos insaturados de cadeia longa, mecanismo pelo qual
gordura insaturada seria tóxica às bactérias ruminais.
Como conclusão, os principais dados que demostraram alta degradação
ruminal de carotenoides foram realizados com carotenoides sintéticos. Enquanto
que para os carotenoides contidos nas forragens, a degradação in vitro foi baixa
ou não houve.
26
A degradação é atribuída aos microrganismos, mas pode haver um
consumo de carotenoides pelas reações com os radicais livres no rúmen.
Provavelmente, a composição da dieta, o pH e a temperatura ruminal não afetam
a degradação dos carotenoides no rúmen. Há indícios de síntese ruminal de
carotenoides.
Entretanto, mais estudos seriam necessários para confirmar estes dados.
De qualquer forma, mesmo com essa suposta produção ruminal de carotenoides,
vacas leiteiras alimentadas com dietas baseadas em forragens conservadas não
conseguem manter, em nível ótimo, o teor plasmático de betacaroteno (HERDT;
SEYMOUR, 2003). Outros dados indicam, ainda, que o betacaroteno influencia
alguns parâmetros fermentativos no rúmen, diminuindo o N-amoniacal e
aumentando a digestão da fibra, o acetato e o N-bacteriano, sugerindo
crescimento de bactérias celulolíticas.
2.5.2 Absorção intestinal de carotenoides
A absorção dos carotenoides ocorre na mucosa do jejuno proximal
(MCDOWELL, 2012). Serrano et al. (2005) demonstraram que há muitos fatores
que podem influenciar a liberação dos carotenoides do alimento no intestino de
humanos. Os carotenoides estão normalmente complexados com proteínas nos
cloroplastos (principalmente nas folhas) e/ou em sua forma estrutural cristalina
nos cromoplastos (frutos e flores) e necessitam ser transferidos para a fase
lipídica da digesta (micelas) para serem absorvidos. Neste estudo, houve forte
correlação negativa entre a disponibilidade intestinal de carotenoides contidos
em vegetais de folhas verdes e o conteúdo de lignina e proteínas não digestíveis
(r= -0,99 e -0,98, respectivamente).
O processo absortivo dos carotenoides é semelhante ao dos lipídeos, já
que carotenoides são pigmentos lipossolúveis (FURR; CLARK, 1997). No
27
entanto, há distinção entre alguns carotenoides em relação à eficiência absortiva
no trato digestivo. Xantofilas (moléculas polares) estão localizadas na superfície
das emulsões e, consequentemente, a eficiência da sua transferência da emulsão
para as micelas é mais elevada (25-40%) do que para os carotenos (12-18%) que
são moléculas menos polares, ficando integradas no centro destas partículas,
podendo ter influência na eficiência absortiva (FURR; CLARK, 1997).
Moore, Gugger e Erdman (1995) utilizaram células da mucosa do
intestino delgado de roedores (Mongolian gerbils) para estudar o processo
absortivo dos carotenoides. Foi detectada absorção linear até a concentração
máxima de 5,9 µmols/L, sugerindo captação passiva entre as concentrações
utilizadas.
Entretanto, During et al. (2002), utilizando concentrações maiores de
carotenoides que em Moore, Gugger e Erdman (1995), apesar de observarem
absorção linear até 6 µmols/L, detectaram estabilização da absorção a partir de
10 µmols/L.
A extensão da absorção, in vitro, das células CaCo-2 de todo-trans
betacaroteno, 9-cis e 13-cis betacaroteno, alfacaroteno, luteína e licopeno até
16h de incubação foi 11, 2, 3, 10, 7 e 2,5%. Houve efeito marcante da interação
entre carotenoides na extensão da absorção. Licopeno reduziu a absorção de
betacaroteno em 4,7 vezes quando 1µmol/L de betacaroteno e 5 µmols/L de
licopeno foram incubados com células CaCo-2. Betacaroteno também reduziu a
absorção de alfacaroteno, porém com P>0,05. Reboul et al. (2005) detectaram
uma redução de 30 e 57% na absorção de luteína ao incubar células CaCo-2 in
vitro com o anticorpo anti-SR-BI e com o inibidor químico BLT1,
respectivamente. Sugerindo que pelo menos parte da absorção dos carotenoides
é realizada por mediadores de transferência seletiva de lipídeos. Células CaCo-2
são células comerciais que apresentam fenótipo morfológico e funcional
semelhante aos enterócitos. A cinética de absorção, a inibição da absorção de um
28
carotenoide por outro, a especificidade/predileção de absorção entre os isômeros
e a importância de alguns mediadores seletivos de lipídeos na absorção dos
carotenoides indicam que a captação intestinal dos carotenoides acontece por
processo facilitado.
Em ruminantes, a digestibilidade intestinal de carotenoides presentes em
diversas forragens variou de 8 a 60% (CARDINAULT et al., 2006; CRUZ-
MONTERROSA et al., 2011; NOZIÈRE et al., 2006; YANG; LARSEN;
TUME, 1992). Cruz-Monterrosa et al. (2011) demostraram que amostras de uma
gramínea que não foram incubadas no rúmen e que foram colocadas diretamente
no duodeno e coletadas nas fezes, tiveram digestibilidade intestinal de
carotenoides de 53%. Entretanto, amostras da mesma forragem que foram
previamente incubadas no rúmen por 12 h tiveram digestibilidade intestinal de
27%, enquanto que amostras que foram incubadas no rúmen por 24, 48 e 72 h
tiveram digestibilidades intestinais de 19, 21 e 22%, respectivamente. Estes
dados sugerem que os carotenoides de alta digestibilidade são degradados no
fluido ruminal e/ou chegam ao intestino sem sofrer degradação, enquanto que
carotenoides que permaneceram no conteúdo celular da forragem estão
aparentemente mais protegidos dentro da célula vegetal.
Cardinault et al. (2006) observaram que a digestibilidade aparente no
intestino delgado de ovinos foi 15,7% para luteína e de 14,7% para betacaroteno
presente em trevo vermelho. Entretanto, a digestibilidade aparente no intestino
delgado pode ter sido subestimada em relação a digestibilidade verdadeira, já
que parte dos carotenoides no íleo pode ter se originado da circulação entero-
hepática e das células de descamação (BOLING et al., 1969).
Fernandez et al. (1976) observaram que a recuperação fecal de
betacaroteno em ovelhas não variou após aumentar a infusão abomasal de 1,38
para 6,15 mg de betacaroteno sintético. Além disso, Mora et al. (2001) ao
aumentar a suplementação de betacaroteno (Lucarotin 10%. BASF The
29
Chemical Company, Ludwigshafen, Alemanha) de 5,5 para 352 ppm na MS da
dieta de novilhos da raça Holandesa que passaram por período de depleção com
dieta isenta de forragens frescas, observaram aumento na digestibilidade
aparente no trato digestivo de 66 para 88%. Estes dados contradizem os de
(MOORE; GUGGER; ERDMAN, 1995) e de (DURING et al., 2002) que
encontraram absorção linear e, após certa concentração, detectaram estabilização
em resposta ao aumento da concentração dos carotenoides em cultivo in vitro.
Em humanos, os valores de digestibilidade intestinal variaram de 9 a
52% (VAN HET HOF et al., 1999a). A biodisponibilidade relativa de
betacaroteno em alguns vegetais variou de 3 a 6% para folhas de espinafre, 19 a
34% para cenouras e 22 a 24% para brócolis, em relação a disponibilidade do
betacaroteno purificado (Hoffman-LaRoche) (CASTENMILLER et al., 1999;
DE PEE et al., 1995; MICOZZI et al., 1992; VAN HET HOF et al., 1999a). A
biodisponibilidade relativa foi medida pela razão da resposta plasmática
induzida pelos betacarotenos nos vegetais consumidos pela resposta da
suplementação com o betacaroteno sintético. Esses dados sugerem que os
carotenoides presentes nos cromoplastos (brócolis e cenoura) se desprendem
mais facilmente da célula vegetal, apresentando, assim, maior eficiência de
absorção que aqueles presentes nos cloroplastos (espinafre). Além disso, nesses
experimentos e principalmente em (DE PEE et al., 1995), foi demonstrada a
superioridade dos suplementos sintéticos em alcançar teores plasmáticos
satisfatórios de betacaroteno e vitamina A em relação aos vegetais.
A biodisponibilidade relativa da luteína também foi mensurada. Van het
Hof et al. (1999b) demonstraram que a biodisponibilidade da luteína foi bem
maior que a do betacaroteno em dieta com variedade de verduras (67 e 14%,
respectivamente). O mesmo foi encontrado em folhas de espinafre (45 e 5,1%,
respectivamente) (CASTENMILLER et al., 1999;).
30
O teor dietético de lipídeos pode afetar a absorção de carotenoides nos
animais. Fernandez et al. (1976) infundiram betacaroteno no abomaso de
bovinos e observaram que a absorção foi ao redor de 36% quando estes foram
infundidos juntamente com solução de monoacilgliceróis e foi 54% quando
infundidos com triacilgliceróis, enquanto a absorção foi apenas 15% quando
água foi usada como solvente. Esses dados foram calculados a partir da
recuperação fecal de betacaroteno.
Em experimento com bovinos alimentados a pasto, Yang et al. (2002),
ao suplementarem 2.500 UI de vitamina E/d, detectaram redução na
concentração plasmática e tecidual de betacaroteno. Estes autores sugeriram que
houve redução na absorção ou talvez competição entre o tocoferol e o
betacaroteno pelo transporte nas lipoproteínas. Entretanto, este fato poderia ser
explicado pela relação de proteção da vitamina E pelos carotenoides. Ao reduzir
moléculas de tocoferoxil (vitamina E oxidada pelos radicais livres) para
tocoferol, os carotenoides são consumidos no processo (BÖHM et al., 1997;
MAYNE et al., 1989; PACKER, 1993).
Como conclusão, a eficiência de absorção dos carotenoides dos
alimentos no intestino é dependente de suas localizações no tecido vegetal. Os
carotenoides presentes nos cromoplastos apresentam maior biodisponibilidade
que os presentes nos cloroplastos. Além disso, a eficiência de absorção é maior
em alimentos com menores teores de lignina e proteína não digestível. In vitro,
foi demonstrado que o processo absortivo dos carotenoides acontece por difusão
facilitada. A mensuração in situ da absorção dos carotenoides apenas pelo
balanço da ingestão/excreção ou pela resposta plasmática após a suplementação
fornecem apenas uma indicação indireta da absorção intestinal, já que pode
ocorrer síntese e degradação de carotenoides no rúmen e, reciclamento e
excreção através da bile. Sendo assim, o mais indicado seria a mensuração
através de marcadores com isótopos. Alguns trabalhos demonstraram a
31
superioridade dos suplementos sintéticos em alcançar teores plasmáticos
satisfatórios de betacaroteno e vitamina A em relação aos vegetais. Entre os
componentes da dieta, os lipídeos podem melhorar a biodisponibilidade dos
carotenoides por facilitar a incorporação dos carotenoides nas micelas
digestivas.
2.5.3 Bioconversão de betacaroteno a retinol
A conversão de betacaroteno a retinol (Vitamina A) ocorre
principalmente na mucosa do intestino delgado por meio da enzima 15-15’-
carotenoide dioxigenase (Figura 2). Essa bioconversão também pode ocorrer em
outros órgãos, como no fígado (BOREL et al., 2005), corpo lúteo (MORALES et
al., 2006) e útero (CHEW et al., 1982a). Schweigert e Eisele (1990), ao
infundirem betacaroteno por via parenteral, observaram aumento na
concentração de vitamina A no leite, mas não no plasma, sugerindo que pode
ocorrer bioconversão de betacaroteno a retinol também na glândula mamária.
Teoricamente, a enzima poderia clivar (seccionar) a molécula de betacaroteno
pela metade formando duas moléculas de retinol (C20H30O). Entretanto, o U. S.
Institute of Medicine, Food and Nutrition Board - IOM (2001) considera a
eficiência de conversão do betacaroteno a retinol de apenas 50%. Como este
instituto assume eficiência de absorção do betacaroteno em sua forma sintética
de 33%, seriam necessários 6 µg de betacaroteno para formar 1 µg de retinol no
plasma. Van Lieshout et al. (2001), utilizando isótopos, avaliaram a bioeficácia
de betacaroteno sintético diluído em óleo. Bioeficácia é a eficiência do
metabólito ingerido de ser absorvido e convertido em seu princípio ativo. Os
autores observaram a necessidade de ingestão de 2,4 µg de betacaroteno para
formar 1 µg de retinol no plasma de crianças. Não foi possível calcular a
32
absorção e a bioconversão separadamente. Entretanto, estes dados sugerem valor
de conversão a retinol bem acima do considerado pela IOM (2001) de 50%.
Figura 2 Biocoversão do betacaroteno a retinol
Yang e Tume (1993) demonstraram que houve maior conversão in vitro
de betacaroteno a retinol com enzima 15-15’-carotenoide dioxigenase coletada
no intestino de ovelhas que de vacas ou cabras. Vários trabalhos também
demonstraram que existe efeito de raça na coloração do tecido adiposo ou no
teor plasmático de betacaroteno e retinol em bovinos (GRAVES-HOAGLAND;
HOAGLAND; WOODY, 1988; WALKER et al., 1990). A raça Holandesa tem
tecidos e gorduras mais brancas comparado às Guernsey e Jersey que
apresentam gorduras amareladas. Esses dados sugerem que há diferença na
capacidade absortiva e/ou na eficiência de conversão do betacaroteno a retinol
entre raças de bovinos (DUNNE et al., 2008; NOZIÈRE et al., 2006; NRC,
2001; MCDOWELL, 2012).
33
Em experimento realizado com camundongos, Van Vliet et al. (1996)
evidenciaram que a atividade enzimática de clivagem do betacaroteno no
intestino foi determinada pelo teor dietético de vitamina A. Camundongos
deficientes em vitamina A tiveram maior atividade da enzima 15-15’-
carotenoide dioxigenase que camundongos suplementados com 12.000
Equivalentes de Retinol (ER)/kg de dieta ou 50 ppm da dieta de betacaroteno
(8333 ER). Parvin e Sivakumar (2000) demonstraram que camundongos
alimentados com dieta deficiente em proteína também tiveram menor capacidade
de converter betacaroteno em vitamina A.
Mora et al. (2001), ao aumentar a suplementação de betacaroteno
(Lucarotin 10%. BASF The Chemical Company, Ludwigshafen, Alemanha) de
5,5 para 352 ppm na MS da dieta de novilhos da raça Holandesa, não
encontraram diferenças no teor de retinol, indicando que independentemente da
dosagem, a quantidade de retinol formada foi similar e tendeu a estabilizar.
Entretanto, vale ressaltar que o teor de retinol no plasma antes da suplementação
estava acima de 1,0 µg/mL, valor considerado alto por Akar e Gazioglu (2006),
podendo ter influenciado na conversão (VAN VLIET et al., 1996).
Como conclusão, foi encontrada atividade da enzima 15-15’-
carotenoide dioxigenase no intestino, fígado, ovário, útero e glândula mamária.
Teoricamente, a enzima poderia clivar a molécula de betacaroteno pela metade
formando duas moléculas de retinol, porém a eficiência de conversão parece ser
menor. Há um efeito genético importante entre espécies e raças na conversão
e/ou absorção de carotenoides. Além disso, a eficiência de conversão do
betacaroteno a retinol é influenciada negativamente pelo alto teor de retinol na
dieta e plasma e, pelo baixo teor de proteína na dieta.
34
2.6 Transporte de carotenoides no corpo
Os carotenoides que se desprenderam da célula vegetal e que não
sofreram bioconversão a retinol na mucosa do intestino, são absorvidos pelos
enterócitos, incorporados aos quilomícrons e transportados via circulação
linfática até o fígado, onde serão transferidos para lipoproteínas responsáveis
pelo transporte no sangue até os tecidos (CARDINAULT et al., 2006; COMBS
JR, 2012). Cardinault et al. (2006) avaliando a digestão de carotenoides em
ovinos com cânula ruminal, duodenal e ileal, não detectaram carotenoides na
veia porta após incubá-los no duodeno, demonstrando que o transporte dos
carotenoides até o fígado ocorre via sistema linfático.
O betacaroteno, apesar de não representar a maior parte dos carotenoides
em relação as xantofilas nas plantas (CHAUVEAU-DURIOT et al, 2005), em
bovinos ele é o principal carotenoide circulante (YANG; LARSEN; TUME,
1992). Em bovinos cerca de 80% do betacaroteno plasmático está associado às
lipoproteínas de alta densidade (SCHWEIGERT; RAMBECK; ZUCKER, 1987;
YANG; LARSEN; TUME, 1992). Ovelhas e cabras apresentam menor teor
plasmático de betacaroteno e maiores teores de xantofilas, principalmente
luteína, do que bovinos. Além disso, cerca de 57% dos carotenoides estão
associados às lipoproteínas de baixa e muito baixa densidade (YANG;
LARSEN; TUME, 1992). A associação dos carotenoides com as lipoproteínas
foi consistente com a composição plasmática das lipoproteínas entre as espécies.
Entretanto, os autores não esclareceram as diferenças no perfil de carotenoides
circulantes entre as espécies de ruminantes. Entretanto, os dados sugerem efeito
genético na preferência dos enterócitos em captar um carotenoide em relação ao
outro.
35
2.7 Concentração de carotenoides nos tecidos
A queda fisiológica no teor plasmático de betacaroteno de vacas leiteiras
no período próximo ao parto, atingindo nível mínimo na primeira semana após o
parto, tem sido frequentemente relatada (INABA et al, 1986a; MICHAL et al,
1994; KAEWLAMUN et al., 2011a). Este efeito é atribuído à drenagem destes
compostos pela glândula mamária (colostrogênese) no final da gestação
(BLOOD et al., 1988; GOFF et al., 2002). Goff et al. (2002) observaram que o
teor plasmático de betacaroteno em vacas gestantes mastectomizadas foi
superior ao de vacas controle no periparto. Foi detectado rápido aumento da
expressão e atividade da enzima lipoproteína lipase e aumento na expressão de
receptores de lipoproteínas na glândula mamária no período próximo ao parto.
Isso explica as altas concentrações de lipídeos, colesterol e vitaminas
lipossolúveis no colostro, já que essas substâncias são transportadas por
lipoproteínas (RAMÍREZ et al., 1983; SCHWEIGERT, 1990; HERRERA,
2000). A captação do betacaroteno pela glândula mamária é o fator principal
para a queda do teor plasmático de betacaroteno próximo ao parto, porém não é
o único fator responsável. O consumo de betacaroteno por aumento do estresse
oxidativo e a redução fisiológica da ingestão de matéria seca antes do parto
também contribuem para este fato (GOFF et al., 2002).
Um mililitro de colostro contém 17 a 340 ng de betacaroteno
(JOHNSTON; CHEW, 1984; KUME; TOHARMAT, 2001), enquanto que 1 ml
de leite contém 40 a 117 ng de betacaroteno (CHEW et al.,1982b; JENSEN;
JOHANNSEN; HERMANSEN, 1999; JOHNSTON; CHEW, 1984). Jensen,
Johannsen e Hermansen (1999) demonstraram que a secreção diária de
betacaroteno no leite segue a cinética de Michaelis-Menten para transporte ativo
através de membranas. O processo foi saturável independentemente da produção
de leite, alcançando a secreção máxima de 3,6 mg/d de betacaroteno (média de
36
2,5 mg/d). Além disso, a capacidade secretora foi influenciada pela genética
paterna das vacas.
O fígado, sangue e tecido adiposo são considerados reservatórios de
carotenoides nos animais, sendo que no fígado de bovinos, o principal
carotenoide encontrado é o betacaroteno (KNIGHT et al., 1996; MORA et al.,
2001; YANG et al., 2002; YANG; LARSEN; TUME, 1992). O teor de
betacaroteno no fígado de novilhos da raça Holandesa e Hereford foi,
respectivamente, de 7 e 8,1 µg/g de tecido úmido, e no tecido adiposo foi 0,8 e
3,7 µg/g de tecido úmido (MORA et al., 2001; YANG et al., 1992). O fígado
desempenha papel importante na regulação da disponibilidade de carotenoides a
outros tecidos por regular a incorporação dos carotenoides em lipoproteínas, a
converção de carotenoides em vitamina A e a excreção de carotenoides pela bile,
sendo que parte destes pode ser reabsorvido ou convertido a vitamina A nos
enterócitos (NOZIÈRE et al., 2006).
Patterson (1965) encontrou relação linear e positiva entre o teor de
carotenoides plasmáticos e o teor de ácidos graxos livres em vacas leiteiras em
balanço energético negativo no início da lactação. Arias et al. (2009) observaram
queda no teor de betacaroteno no tecido adiposo de bovinos ao estimularem a
mobilização lipídica com epinefrina. Além disso, foi detectado acúmulo de
lípides e de betacaroteno no mesmo tecido ao usar insulina. Rosendo et al.
(2010) estudaram a relação da infiltração gordurosa no fígado de vacas no início
da lactação com os teores plasmáticos e hepáticos de betacaroteno e vitamina A.
A queda fisiológica do teor hepático de betacaroteno no período próximo ao
parto foi muito menor para vacas que apresentaram leve esteatose hepática do
que para vacas sadias (8% e 68%, respectivamente). Além disso, foi detectado
maior teor plasmático de vitamina A nas vacas sadias comparadas às doentes.
Entretanto, não houve efeito no teor plasmático de betacaroteno. Esses dados
sugerem que o papel regulatório do fígado em manter as concentrações
37
plasmáticas de vitamina A parece estar comprometido em vacas com leve
acúmulo de gordura no fígado, porém o mecanismo não foi esclarecido.
A estrutura animal com o maior teor de carotenoides é o corpo lúteo,
sendo sua cor característica formada por esses pigmentos (amarelo intenso).
Chew et al. (1984), quantificando vitamina A e carotenoides em órgãos oriundos
de abatedouro de bovinos, relataram que corpo lúteo tinha 4,7 vezes mais
betacaroteno por grama de tecido úmido que o fígado (14,2 µg/g e 3 µg/g,
respectivamente). Os autores correlacionaram os teores plasmáticos de vitamina
A e betacaroteno com os seus teores no fluido folicular e corpo lúteo. No fluido
folicular, os teores de vitamina A total, retinol, retinil e betacaroteno tiveram
correlações positivas com seus respectivos teores plasmáticos. Os coeficientes
de correlação linear foram de 0,61, 0,58, 0,54 e 0,43, respectivamente (P<0,01).
No corpo lúteo, somente retinol teve correlação significativa (r=0,57) com seu
teor plasmático.
A suplementação de marrãs com 100 mg de betacaroteno (Rovimix
10%. Hoffmann-La Roche, GrenzachWyhlen, Alemanha) aumentou em seis
vezes a concentração de betacaroteno no corpo lúteo comparativamente ao
controle (SCHWEIGERT et al., 2001). Schweigert et al. (2003) analisaram 43
corpos lúteos de vacas não gestantes, representando quatro estágios do ciclo
luteal. Foi mensurada a concentração de betacaroteno, alfatocoferol e retinol. Os
teores de betacaroteno e alfatocoferol aumentaram entre os estágios 1 (inicial) e
4 (final). Entretanto, houve queda no teor de retinol do estágio 1 ao estágio 4. Os
autores sugeriram que o acúmulo de betacaroteno e tocoferol durante o
desenvolvimento do corpo lúteo parece ser secundário à captação de colesterol
para a síntese de progesterona, já que o betacaroteno, alfatocoferol e colesterol
são transportados pelas mesmas lipoproteínas no sangue. Além disso, há um
possível consumo de retinol durante a esteroidogênese, já que esta vitamina está
ligada a produção de progesterona (WICKENHEISSER et al., 2005).
38
Herdt e Seymour (2003) analisaram amostras de sangue de um grande
levantamento realizado nos Estados Unidos (NATIONAL ANIMAL HEALTH
MONITORING SYSTEM - NAHMS, 1996), 85% das amostras de soro de vacas
leiteiras continham teor médio menor que 3,0 µg/mL de betacaroteno, o nível
plasmático sugerido por Frye, Williams e Graham (1991) para promover efeitos
benéficos sobre a reprodução. Os animais sem acesso a pasto tiveram teores
séricos de betacaroteno de 1,68 ± 1,64 µg/mL e os com acesso a pasto de 2,41 ±
2,0 µg/mL. Em outro levantamento realizado em 20 rebanhos canadenses, a
média de 1828 amostras sanguíneas de vacas leiteiras no periparto foi 1,12
µg/mL ± 0,78 (LEBLANC et al., 2004).
Em camundongos alimentados por 147 dias com dieta contendo 0,2% de
betacaroteno seguido por período de depleção, o tempo de meia vida do
betacaroteno no plasma foi 3,5 dias (SHAPIRO et al., 1984). Os tempos de meia
vida foram 9, 16 e 15 dias no fígado, adiposo (da glândula adrenal) e ovários,
respectivamente. Gugger et al. (1992) administraram uma dose oral única de 10
mg/kg de peso vivo de betacaroteno a furões (Mustela putorius furo). Foi
observado pico nos teores séricos de betacaroteno oito horas após a
suplementação (1,8 µmol/L) e retorno a níveis basais após 3,3 dias (GUGGER et
al., 1992). Em marrãs, com teores plasmáticos de betacaroteno abaixo de 10
µg/mL, dose única de 70 mg de betacaroteno (Carofertin. Alvetra&Werfft AG,
Neufeld an der Leitha, Áustria), por administração intramuscular, induziu pico
de betacaroteno no plasma de 13,8 ± 5,8 µg/mL após 24 horas. O tempo de meia
vida no plasma foi 7,2 ± 1,4 horas após o pico (KRAMMER; AURICH, 2008).
Burri et al. (2001) avaliaram o tempo de meia vida do betacaroteno
sérico em humanos. Nove mulheres foram suplementadas com 1,5 mg/d de
betacaroteno por quatro dias seguido por período de depleção de 68 dias com
dieta pobre em carotenoides (0,07 mg/d). O tempo de meia vida do betacaroteno
39
sérico foi 37 dias. Em todo período experimental houve suplementação com
100% das recomendações de vitaminas A, C e E.
Mora et al. (2001) avaliaram o efeito da suplementação de 0, 5,5, 44 e
352 ppm na MS da dieta de betacaroteno (Lucarotin 10%. BASF The Chemical
Company, Ludwigshafen, Alemanha) nos teores teciduais de betacaroteno de
novilhos da raça Holandesa que passaram por período de depleção com dieta
isenta de forragens frescas (0,004 ppm de betacaroteno na MS). Os novilhos
pesavam 346 kg ± 53. O consumo estimado de matéria seca da dieta foi 7,5
kg/novilho/d. O teor plasmático de betacaroteno antes do período de depleção
era 1,6 µg/mL. A queda no teor plasmático de betacaroteno foi linear, sendo
necessários 49 dias para ele se tornar nulo no plasma. O tempo de meia vida foi
próximo de 25d. Após a fase de depleção, os animais foram mantidos na mesma
dieta basal e em 30 dias o teor plasmático de betacaroteno alcançou 3,5 µg/mL
no tratamento com 352 ppm na MS de betacoteno da dieta e de pouco mais de 1
µg/mL nos tratamentos com 5,5 e 44 ppm na MS de betacaroteno da dieta. Após
30 dias de suplementação, os teores de betacaroteno no fígado e tecido adiposo
foram, respectivamente, 8,1 e 3,7 µg/g de tecido úmdo no tratamento 352 ppm
na MS de betacaroteno e de 0,8 e 0,07 µg/g, respectivamente, no tratamento
controle. Esse resultado demonstra a grande capacidade destes tecidos em
estocar betacaroteno. O fígado é a principal reserva de vitamina A do corpo,
apresentando teor de retinol 20 a 100 vezes maior que betacaroteno em bovinos
(FRYE; WILLIAMS; GRAHAM, 1991; MORA et al., 2001; YANG et al.,
1992). Mesmo depois dos animais terem enfrentado longo período de depleção,
o teor de retinol no plasma antes da suplementação estava acima de 1,0 µg/mL,
valor considerado alto por Akar e Gazioglu (2006), sugerindo que as reservas de
vitamina A no corpo são muito mais lábeis que as de betacaroteno.
A suplementação com 330 mg/d de betacaroteno sintético foi necessária
para elevar em 30d o teor plasmático de betacaroteno de 0 a 1 µg/mL de
40
novilhos pesando 346 kg (MORA et al., 2001). Bovinos têm 8% do peso vivo
em sangue (KOLB, 1984). Houve, assim, acréscimo plasmático médio de 0,9
mg/d de betacaroteno. Extrapolando esses dados para vacas em lactação, em
manejos nutricionais baseados em forragens conservadas, a secreção diária de
betacaroteno no leite pode ser relevante, 2,5 mg/d (JENSEN; JOHANNSEN;
HERMANSEN, 1999).
Concluindo, vacas no periparto enfrentam redução expressiva no teor
plasmático de betacaroteno devido a colostrogênese, porém não é o único fator
responsável. O fígado, sangue e tecido adiposo são considerados reservatórios de
betacaroteno em vacas. A suplementação de betacaroteno eleva os teores do
carotenoide no corpo lúteo. O tempo de meia vida do betacaroteno plasmático
em novilhos e em mulheres foi mais alto que em camundongos, furões e
marrãns. Essa diferença pode estar relacionada ao tamanho da reserva do
carotenoide no corpo e o estado metabólico do animal (catabolismo ou
anabolismo), já que há relação positiva entre o teor de betacaroteno plasmático e
o teor de ácidos graxos livres no sangue. O tempo de meia vida do betacaroteno
plasmático em novilhos é de 25 dias. A secreção diária de betacaroteno no leite
pode ser relevante (2,5 mg/d) em manejos nutricionais baseados em forragens
conservadas. Em dois grandes levantamentos foram observados baixos teores
plasmáticos de betacaroteno em vacas leiteiras, sugerindo a necessidade de
suplementar betacaroteno.
2.8 Estresse oxidativo e as espécies reativas de oxigênio
O metabolismo aeróbico em sistemas biológicos é associado a geração
de pró-oxidantes como as espécies reativas de oxigênio. Na cadeia
transportadora de elétrons o oxigênio molecular (O2) serve como um receptor
recebendo quatro elétrons e quatro prótons até o final da reação (redução
41
tetravalente), resultando na formação de duas moléculas de água (H2O).
Entretanto, esta reação de redução é parcial devido a adição de um elétron de
cada vez, sendo que durante esse processo podem ser formados intermediários
reativos, como os radicais hidroxila (OH-), hidroperoxila (HO2-), superóxido
(O2) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
A produção de espécies reativas de oxigênio também é necessária em
algumas funções celulares, como na síntese da tiroxina na glândula tireoide e no
processo de fagocitose dos microrganismos pelos neutrófilos e macrófagos que
utilizam o peróxido de hidrogênio (explosão respiratória) para destruir os
patógenos (PAAPE et al., 2002). Uma variedade de outros processos biológicos
como o envelhecimento, inflamação, carcinogênesis, danos radioativos e efeitos
fotobiológicos também estão envolvidos com as espécies reativas de oxigênio
(CHANCE et al., 1979).
O estresse oxidativo acontece quando há um desbalanço da relação de
equilíbrio pró-oxidante/antioxidante, no sentido dos pró-oxidantes (SIES, 1991).
Essas moléculas instáveis e altamente reativas são capazes de danificar
biologicamente moléculas presentes nas células, como o DNA, proteínas,
carboidratos e lipídeos de membrana (PRYOR, 1986).
Algumas dessas espécies, como o radical hidroxila e o oxigênio
molecular singlete, têm tempos de meia-vida tão curtos (1 x 10-9 e 1 x 10-6
segundos, respectivamente) que a linha de defesa antioxidante (alfatocoferol,
ascorbato e glutationa por exemplo) dificilmente os intercepta, cabendo a esses
antioxidantes um papel maior atuando apenas como um preventivo ou, então,
como reparador das moléculas afetadas (PRYOR, 1986). Entretanto, foi relatada
alta eficiência em interceptação das moléculas excitadas de oxigênio singlete
pelos carotenoides em meios biológicos (TELFER et al., 1994).
Quando uma molécula de O2 no estado fundamental absorve energia, e
um elétron é excitado para orbitais em níveis mais altos de energia, pode-se
42
formar oxigênio singlete ou triplete, dependendo do spin do elétron excitado
(SIES et al., 1991). Em meios biológicos animais, a formação de oxigênio
singlete foi evidenciada a partir de reações envolvendo enzimas peroxidases, na
peroxidação lipídica, na exposição a raios ultravioleta e também no processo de
fagocitose de patógenos pelas células de defesa (SIES et al., 1991). Em
organismos vegetais a energia necessária para excitar um elétron é absorvida
através de reações que envolvem a luz (TELFER et al., 1994).
O oxigênio singlete formado pode reagir com outras moléculas
provocando danos ao DNA e aos carboidratos (SIES et al., 1995). Lipossomas
expostos ao oxigênio singlete sofreram peroxidação lipídica em suas
membranas. A peroxidação lipídica foi mensurada através do aumento de alguns
produtos da degradação das membranas lipídicas, como o malondialdeído
(KRISKY; DENEKE, 1982). Telfer et al. (1994) demonstraram o papel direto do
oxigênio singlete em causar danos oxidativos dentro de um meio biológico
(tecido fotossintético isolado da planta Pisum sativum) mensurados através do
branqueamento das clorofilas. O processo de supressão física do oxigênio
singlete é predominantemente realizado, em meios biológicos, pelos
carotenoides, embora os tocoferóis (vitamina E) também podem desempenhar,
em menor escala, essa atividade (SIES et al., 1995). Entretanto, ainda não foi
provado se a formação de moléculas instáveis de oxigênio singlete em
organismos animais é significativa o bastante para causar doenças (SIES et al.,
1995).
2.9 Comportamento e mecanismos de atuação do betacaroteno como um
antioxidante
O betacaroteno é uma molécula lipofílica e, portanto, solúvel nas
membranas celulares. O sistema de duplas ligações conjugadas confere alta
43
reatividade química a esse composto, protegendo moléculas importantes da ação
dos radicais livres, peróxidos e do oxigênio singlete, o caracterizando como um
antioxidante (BURTON; INGOLD, 1984).
2.9.1 Supressão física do oxigênio singlete
Telfer et al. (1994) demonstraram que o betacaroteno pode agir como
um eficiente supressor de moléculas de oxigênio singlete geradas dentro de um
sistema fotossintético biológico, por diminuir o branqueamento das clorofilas. O
branqueamento é causado pela reação foto-oxidativa do oxigênio singlete com as
clorinas presentes nas clorofilas. Anderson e Krinsky (1973) demonstraram in
vitro a ação protetora do betacaroteno contra danos foto-oxidativos aos
lipossomas causados pelo oxigênio singlete, mensurando malondialdeído.
Farmilo e Wilkinson (1973) demonstraram que a transferência de energia é o
principal mecanismo da proteção dos carotenoides contra o oxigênio singlete
(reação abaixo). Uma vez produzido, o caroteno triplete (3CAR*) pode
facilmente retornar ao seu estado normal (retorno dos elétrons para camadas
eletrônicas menos excitadas) dissipando a energia gerada como forma de calor
(EDGE et. al., 1997).
1O2* + CAR → 3O2 + 3CAR*
2.9.2 Reação dos carotenoides com os radicais livres
Assim como a habilidade de suprimir moléculas em estado excitado, os
carotenoides podem reagir com os radicais livres. Entretanto, diferentemente da
supressão física do oxigênio singlete em que o carotenoide triplete voltaria ao
44
estado menos excitado eliminando a energia em forma de calor, estas reações
com os radicais livres são de transferência de cargas ou de adição de radicais,
sendo que os elétrons ou os produtos formados não são perdidos (EDGE et al.,
1997). O destino destes compostos formados ainda não está totalmente claro
(KRINSKY; YEUM, 2003). Estes últimos autores citaram que há pelo menos
três possíveis mecanismos envolvendo as reações de carotenoides com os
radicais livres. Elas incluem: (1) adição de radical, (2) transferência eletrônica e
(3) abstração do hidrogênio.
(1) Reações de adição. O radical peroxila (ROO*) pode se adicionar em
qualquer lugar da cadeia poliênica dos carotenoides (CAR), resultando na
formação de radical carbono-centrado (ROO–CAR*), uma vantagem desta
reação é o impedimento da peroxidação lipídica nas membranas celulares por
exemplo, já que o produto formado apresenta ser mais estável que o radical
peroxila. Foi demonstrado que o ânion superóxido (O2-) também pode se
adicionar à molécula de betacaroteno. As reações estão descritas abaixo. O sinal
de interrogação refere-se ao destino incerto dessas moléculas formadas.
ROO* + CAR ⎯⎯→ ROO–CAR* ⎯⎯→ ?
O2- + Betacaroteno ⎯⎯→ BetacarotenoO2
- ⎯⎯→ ?
45
(2) Transferência de elétrons. Estas reações resultam na formação de
radicais cátions (CAR+) ou ânions (CAR-), dependendo das espécies envolvidas.
Abaixo, seguem algumas reações com os carotenoides.
O2- + CAR + 2H+ ⎯⎯→ H2O2 + CAR*+ ⎯⎯→ ?
Licopeno + O2- ⎯⎯→ O2 + Licopeno- ⎯⎯→ ?
(3) Abstração de hidrogênio. A característica principal desta reação é a
remoção do átomo de hidrogênio (neutro ou carregado) de uma entidade
molecular. Abaixo, seguem algumas reações com os carotenoides.
CAR + NO*X ⎯⎯→ 4-NO–CAR
46
CAR + ROO* ⎯⎯→ CAR* + ROOH
CAR* + CH3OH ⎯⎯→ CAR–OCH3 + H
Foi descoberto que os carotenoides, em situações de altas pressões de
oxigênio (>150 mmHg, 20% O2) e também em altas concentrações do próprio
composto, podem agir de forma antagônica, como pró-oxidante, ao formar
moléculas reativas como os peróxidos (BURTON; INGOLD, 1984; MARTIN et
al., 1999); as reações estão descritas abaixo. Entretanto, já que a pressão parcial
de oxigênio fisiológica em animais é bem menor que 150 mmHg, foi sugerido
que o efeito pró-oxidante, devido a essa situação, deva ser pequeno (EDGE et
al., 1997).
CAR* + O2 → RO2*
ROO–CAR* + O2 → ROO–CAR–OO*
Rahman e Parker (2001) estudaram a atividade biológica de produtos da
degradação de carotenoides. Houve inibição da proliferação de células T e B em
camundongos expostos a esses produtos. Siems et al. (2002) detectaram queda
47
nos teores plasmáticos de glutationa, aumento nos teores de MDA, inibição da
atividade de Na+–K+ - ATPase e diminuição do terceiro estágio da respiração
celular de mitocôndrias hepáticas em camundongos expostos a alguns produtos
de degradação dos carotenoides. Esses produtos podem se formar em situações
de alto estresse oxidativo como em pacientes fumantes ou trabalhadores
expostos ao amianto.
2.9.3 Interação com outros antioxidantes
Existe uma relação de proteção ou regeneração entre os antioxidantes.
Em dietas deficientes em alfatocoferol e selênio, Mayne et al. (1989) observaram
aumento nos teores plasmáticos de alfatocoferol ao suplementar cantaxantina,
um carotenoide, em humanos. Além disso, houve queda na peroxidação lipídica
das membranas celulares, sugerindo um efeito de proteção ou regeneração dos
carotenoides sobre o alfatocoferol. Packer (1993) estudou o efeito antioxidante
dos carotenoides e alfatocoferóis, in vitro e in vivo, sobre as lipoproteínas de
baixa densidade em humanos. Foi observado que as moléculas de betacaroteno,
nestas proteínas, eram degradadas ao serem expostas à luz UV no comprimento
de onda de 295 nm, situação em que, segundo o autor, só destruiria diretamente
as moléculas de alfatocoferol, implicando assim, também, uma possível
interação de proteção ou regeneração entre o radical alfatocoferoxil e o
betacaroteno. Böhm et al. (1997) investigaram os mecanismos moleculares
relacionados a esses efeitos e demonstraram que os carotenoides são convertidos
aos seus radicais cátions (oxidados) na presença do radical tocoferoxil, o
reduzindo à alfatocoferol. Também foi demonstrado que o ácido ascórbico pode
regenerar os cátions de radical carotenoide em solução de metanol. Edge et al.
(1997) sugeriram que em meio biológico, os cátions de radicais carotenoides
presentes nas membranas celulares podem se reorientar de forma a ter contato
48
com a face polar da membrana, ficando acessível ao ácido ascórbico presente na
fase aquosa dos meios biológicos. Segue abaixo um esquema que representa
estes experimentos (Figura 2). Parece estar relacionado a este fato, algumas
pesquisas em que a suplementação de betacaroteno não diminuiu o risco de
desenvolver câncer de pulmão em pacientes fumantes, mas diminuiu o risco em
pacientes não fumantes (MAYNE et al., 1994; OMENN et al., 1996), já que
segundo Combs Jr (2012), o ato de fumar pode diminuir o teor plasmático de
vitamina C em 40%.
ERO TOH CAR*+ AscH-
ERO reduzida TOH+ CAR Asc*- + H+
Figura 3 Interação entre os antioxidantes alfatocoferol (TOH), carotenos (CAR) e ácido
ascórbico (ASCH) e com as espécies reativas de oxigênio (ERO).
2.10 Relação da suplementação de antioxidantes com o estado oxidativo de
vacas leiteiras no pré-parto
Chawla e Kaur (2004) detectaram correlação positiva entre o teor
plasmático de betacaroteno e a capacidade antioxidante em vacas suplementadas
com betacaroteno antes do parto (r=0,73). A capacidade antioxidante foi
mensurada pelo método de redução do ferro (FRAP). Neste método, o complexo
férrico tripiridiltriazina (Fe+3 - TPTZ) é reduzido ao ferroso (Fe+2 - TPTZ),
mudando sua coloração para azul na presença de antioxidantes em pH ácido
(BENZIE; STRAIN, 1996). Esse achado suporta experimentos prévios o qual a
suplementação de antioxidantes antes do parto melhorou alguns índices de saúde
em vacas leiteiras (SMITH et al., 1984; WEISS et al., 1990a, MICHAL et al.,
1994). Foi sugerido que há necessidade de suplementar betacaroteno durante o
período pré-parto a fim de melhorar o nível de antioxidantes no plasma e,
49
consequentemente, o estado oxidativo, o que poderia refletir nos índices de
saúde no início da lactação (CHAWLA; KAUR, 2004).
Entretanto, nem sempre a suplementação de antioxidantes melhora o
estado oxidativo dos animais. Após observar resultado negativo e inesperado da
suplementação pré-parto com vitamina E (3.000 UI/d) no índice de mastite pós-
parto em vacas de leite, Bouwstra et al. (2010) avaliaram retrospectivamente
quais parâmetros fisiológicos, mensurados no dia antes da suplementação (T0, 8
semanas do parto previsto), influenciaram na resposta da suplementação com
vitamina E no pré- e pós-parto destas vacas leiteiras. Testando a hipótese
sugerida por Nwose et al. (2008) de que a suplementação de vitamina E para
indivíduos com teores plasmáticos insuficientes de compostos que reduzem ou
“regenerem” o radical tocoferoxil à alfatocoferol poderia aumentar o estresse
oxidativo, a equipe separou as vacas em grupos pela combinação de três
parâmetros fisiológicos no T0: 1) Estado oxidativo – espécies reativas de
oxigênio plasmáticas (ERO) maior ou menor que 40 U/mL. 2) Vitamina E
plasmática – maior ou menor que 16 µmol/L. 3) Suficiência do sistema
regenerador de vitamina E (VERS) - suficiente ou insuficiente, de acordo com
uma série de combinações, utilizando o FRAP, a relação glutationa reduzida pela
glutationa oxidada (antioxidante natural) e o teor de glutationa peroxidase no
plasma.
As vacas suplementadas com vitamina E em dois grupos, considerados
insuficientes no VERS no T0, tiveram teor mais alto de ERO duas semanas pré-
parto comparadas com as vacas consideradas suficientes, indicando aumento do
estresse oxidativo. As vacas suplementadas com vitamina E do grupo com teor
plasmático de vitamina E >16 µmol/L tiveram teor plasmático mais alto de
malondialdeído (MDA), produto de degradação das membranas celulares ao
sofrer peroxidação lipídica, indicando também aumento do estresse oxidativo.
50
Foram relacionados os teores plasmáticos de ERO e MDA no pré-parto
de vacas que desenvolveram ou não mastite no início da lactação. As vacas que
desenvolveram mastite, e que foram suplementadas com vitamina E, pareceram
apresentar maiores teores de ERO e MDA no pré-parto (P=0,21 e P=0,14,
respectivamente). Vacas com altos teores plasmáticos de ERO e MDA tiveram
2,8 vezes mais risco de desenvolver mastite (95% CI, 1,1 – 7,1). Ou seja, vacas
que aumentaram o estresse oxidativo ao serem suplementadas com vitamina E
tiveram mais chances de desenvolver mastite. O equilíbrio entre os antioxidantes
do corpo é necessário para manter o estado redox do animal, já que há um
sistema de regeneração entre eles. Nem toda vaca precisa da suplementação de
vitamina E. A suplementação extra de vitamina E no pré-parto de vacas leiteiras
sem conhecer o teor plasmático de vitamina E e a capacidade do sistema
antioxidante de regenerar a vitamina E pode aumentar o estresse oxidativo ao
invés de diminuí-lo.
Hipoteticamente, esta conclusão pode valer para outros antioxidantes
suplementáveis como a vitamina C e o betacaroteno, já que também para eles há
um sistema de regeneração conhecido (COMBS JR, 2012; KRINSKY; YEUM,
2003). Não existem ainda valores de corte seguros para considerar adequada ou
não a relação entre os antioxidantes no plasma de vacas (BOUWSTRA et al.,
2010). Pesquisas nesta linha são necessárias no desenvolvimento de tecnologias
de monitoramento de rebanhos que permitirão maior acurácia na resposta à
suplementação de antioxidantes.
2.11 Estado metabólico, oxidativo e função imune de vacas leiteiras no
periparto
Várias alterações hormonais e metabólicas acontecem em vacas leiteiras
na transição do final da gestação ao início da lactação. O aumento do cortisol
51
dias antes do parto ou em situações estressantes não naturais afeta a atividade
leucocitária. O cortisol é reconhecido por ser um agente imunossupressor por se
ligar aos receptores leucocitários, impedindo-os de migrar para os tecidos alvos
e também por diminuir sua capacidade de destruição dos patógenos. Várias
alterações metabólicas e ambientais em torno do parto, como a hipocalcemia, o
balanço energético, o estado oxidativo e o estresse térmico têm papel na
imunossupressão do periparto (BASCHANT; TUCKERMANN, 2010).
O sistema antioxidante de vacas leiteiras é suficientemente robusto para
lidar com a produção de espécies reativas de oxigênio e outros radicais livres na
condição fisiológica da transição do final da gestação à lactação. Castillo et al.
(2005) detectaram aumento natural na produção de antioxidantes em vacas de
leite expostas ao aumento de radicais livres, provavelmente devido ao esforço
físico do parto. Entretanto, quando ocorre produção elevada de pró-oxidantes
nesta fase, a capacidade antioxidante do corpo será excedida e estresse oxidativo
se desenvolverá (BERNABUCCI et al., 2005; CASTILLO et al., 2005). Foi
detectado maior extresse oxidativo no pré-parto de vacas leiteiras que tiveram
maior variação no escore de condição corporal entre o pré e pós-parto
(BERNABUCCI et al., 2005). Castillo et al. (2005) correlacionaram alguns
índices metabólicos de vacas leiteiras com o estado oxidativo no período de
transição pré-parto. Houve correlação positiva (r=0,61) entre o teor plasmático
de ácidos graxos não esterificados e o teor plasmático de malondialdeído
(MDA), e correlação negativa (r=-0,52) entre o teor plasmático de glicose e o de
MDA. Esses dados sugerem uma possível relação do balanço energético e
possíveis outras desordens metabólicas com o estado oxidativo. Bernabucci et al.
(2002) demonstraram que vacas no período de transição pré-parto expostas a
moderado estresse térmico no verão tiveram maior estresse oxidativo que vacas
parindo na primavera.
52
Na resposta imune inicial, espécies reativas de oxigênio e outros radicais
livres são utilizados pelos linfócitos para combater organismos estranhos. O
excesso de pró-oxidantes podem trazer danos às células imunes se o sistema
antioxidante do animal estiver debilitado, já que membranas contêm alta
concentração de ácidos graxos poliinsaturados, muito susceptíveis a
peroxidação. Estes fatores fazem com que o sistema imune durante o período
próximo ao parto fique enfraquecido, o que pode ser fator predisponente à
ocorrência de enfermidades relacionadas ao sistema imune, como retenção de
placenta, metrite e mastite (BERNABUCCI et al., 2002, CASTILLO et al.,
2005, LEBLANC et al., 2004; MALLARD et al., 1998). Assume-se que a
relação da hipocalcemia com retenção de placenta está mais relacionada com a
diminuição da função imune pelos baixos teores plasmáticos de cálcio do que
pela baixa motilidade uterina (KIMURA et al. 2006; LEBLANC, 2008).
Grommers et al. (1989) estudaram a responsividade das células do
sistema imune de vacas leiteiras em diferentes fases da lactação. Foi detectado
menor resposta a desafio com endotoxina de Escherichia coli na glândula
mamária em vacas no início da lactação do que em vacas no meio e final da
lactação. A fagocitose pelos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) é a mais
efetiva defesa contra a infecção bacteriana. Ao entrar em contato com bactérias,
os PMN liberam potentes radicais livres que as matam enquanto as fagocitam
(PAAPE et al., 2002). Mehrzad et al. (2001) observaram queda na produção de
espécies reativas de oxigênio pelos PMN em vacas no início da lactação
(MEHRZAD et al., 2001).
Durante a fase final da gestação alguns mecanismos induzem a
maturação e o descolamento da placenta. Fatores como a ação de algumas
enzimas e células inflamatórias são essenciais neste processo. Gunnink (1984a)
observou que cotilédones colhidos de vacas leiteras com retenção de placenta
(RP) tiveram menor quimioatração de leucócitos que cotilédones colhidos de
53
vacas que expulsaram a placenta. Os leucócitos coletados alguns dias antes do
parto de vacas que desenvolveram RP foram menos capazes de reconhecer o
tecido cotiledonário num ensaio de quimiotaxia do que leucócitos de vacas sem
RP. A baixa atividade quimiotática de leucócitos aos cotilédones de vacas que
desenvolveram RP foi vista antes, durante e depois do parto nesses estudos
(GUNNINK, 1984a, 1984b, 1984c).
A menor responsividade dos neutrófilos aos quimioatrativos em vacas
com retenção de placenta foi confirmada por outros autores (CAI et al., 1994;
HEUWIESER; GRUNERT, 1987; ROMANIUKOWA et al., 1984). Kimura et
al. (2002) estudaram a função neutrofílica de 142 vacas leiteiras no periparto,
avaliando a atividade quimiotáxica e de destruição destas células. Houve
retenção de placenta em 14,1% das vacas. Os neutrófilos coletados no pré-parto
de vacas que desenvolveram RP apresentaram diminuição na capacidade de
migração ao tecido placentário. Além disso, foi detectado menor capacidade de
destruição de patógenos destas células. Hammon et al. (2006) observaram queda
na função neutrofílica e na ingestão de matéria seca no pré-parto de vacas que
desenvolveram alguma doença uterina no início da lactação. A redução da
função neutrofílica semanas antes do parto sugere que o enfraquecimento da
função imunológica inata possa ser mais causa do que consequência de doenças
uterinas em vacas leiteiras.
Eiler e Hopkins (1992) observaram, ao incubar seções de placentomas
com bactérias produtoras de colagenase, relação negativa entre a retenção de
placenta e a degradação do colágeno placentário. Eiler e Hopkins (1993)
injetaram 200.000 unidades de colagenase na artéria umbilical 24 a 36 horas
após a retenção de placenta. Houve liberação da placenta em 85% das vacas.
Quando a enzima foi administrada na veia jugular houve eficiência de 50%.
Neutrófilos e outros leucócitos são fontes móveis de enzimas colagenases
(BURKHARDT; HARTMANN; SCHWINGEL, 1985; MURPHY et al., 1977).
54
Sendo assim, neutropenia ou qualquer fator que diminua a quimioatração da
placenta pelos neutrófilos pode levar à falha da liberação da placenta.
Retenção de placenta tem sido constantemente associada ao aumento no
risco sobre outras doenças como a cetose, o deslocamento de abomaso, a metrite,
a endometrite e a mastite (CORREA et al., 1993; ERB et al., 1985; GRÖHN et
al.,1990; LEBLANC et al., 2002; OLTENACU et al., 1990). Oltenacu et al.
(1990) demostraram que a retenção de placenta aumentou o risco de cetose em
1,7 vezes, mastite em 1,5 vezes e metrite em 10 vezes. Além disso, a retenção de
placenta, quando provoca metrite, está associada à diminuição em até 16% na
taxa de prenhez (FOURICHON et al., 2000).
2.12 Ação do betacaroteno na resposta imune afetando a saúde
2.12.1 Estudos in vitro
Bendich e Shapiro (1986) detectaram maior proliferação de linfócitos T
e B in vitro quando camundongos foram alimentados com 0,2 % do peso vivo de
betacaroteno ou cantaxantina em comparação a camundongos do tratamento
controle. Cantaxantina não apresenta atividade de vitamina A, vitamina com
atividade imunomodulatória conhecida (COMBS JR, 2012). Sendo assim, foi
concluído que o efeito dos carotenoides sobre o sistema imune se deve também a
uma propriedade além de sua bioconversão à vitamina A. A vitamina A age no
processo de diferenciação das células imunes, aumenta a mitogênese de
linfócitos e também pode influenciar a capacidade fagocítica de monócitos e
macrófagos (COMBS JR, 2012).
Neutrófilos polimorfonucleares (PMN) incubados com betacaroteno
apresentaram maior eficiência bactericida comparados ao controle. Além disso,
não foi detectado dano em suas membranas celulares durante o combate aos
55
microrganismos, causados pelas espécies reativas de oxigênio produzidas
durante a explosão respiratória (ANDERSON; THERON, 1990).
Tjoelker et al. (1988) alocaram 30 vacas holandesas a três tratamentos.
O tratamento VA recebeu 53.000 UI de palmitato de retinol/d, o tratamento
AVA recebeu 213.000 UI de palmitato de retinol (alta suplementação) e o
tratamento VA + BC recebeu 400 mg de betacaroteno + 53.000 UI de palmitato
de retinol misturados à ração. A suplementação foi realizada por 42 dias antes
(D-42) até 14 dias (D14) após a interrupção da lactação (D0). O teor plasmático
de vitamina A no D-42 não diferiu estatisticamente entre os tratamentos e estava
dentro do teor ótimo de 0,25-0,80 µg/mL (AKAR E GAZIOGLU, 2006).
Entretanto, o teor plasmático de betacaroteno estava abaixo do recomendado, de
3 µg/mL (FRYE; WILLIAMS; GRAHAM, 1991). Após a suplementação houve
queda no teor plasmático de vitamina A nos tratamentos VA e AVA e tendência
de aumento no VA + BC, ao longo do experimento. Não houve efeito sobre o
teor plasmático de betacaroteno nos tratamentos VA e AVA, porém houve
aumento de 2,5 µg/mL no D0 para 4 µg/mL no D14. Neutrófilos
polimorfonucleares (PMN) sanguíneos isolados no D0 e D14 foram incubados
com retinol nas concentrações 0, 10-6 e 10-7 M, ácido retinoico nas concentrações
0, 10-7 e 10-8 M, betacaroteno nas concentrações 0, 10-5 e 10-6 M ou solução basal
na presença de Staphylococcus aureus para avaliar a habilidade fagocítica e
bactericida destas células. Houve melhora no índice fagocítico e bactericida dos
PMN isolados no D14 e incubados com betacaroteno nos tratamentos VA e
AVA e efeito nulo no tratamento VA + BC. Houve efeito nulo e/ou negativo
nestes índices para todos os tratamentos incubados com retinol ou ácido
retinoico. Os autores concluíram que a incubação de PMN isolados no D14 com
betacaroteno só melhorou a eficiência de combate contra os patógenos em
animais com teores plasmáticos subótimos de betacaroteno (tratamentos VA e
AVA). Além disso, os dados sugerem que a incubação com diferentes formas de
56
vitamina A (retinol ou ácido retinoico) pode ser tóxica em animais com teor
plasmático adequado de vitamina A.
Daniel et al. (1991a, 1991b) observaram maior proliferação de células
mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) isoladas do leite e do
sangue de vacas leiteiras e incubadas com betacaroteno na concentração 10-9 M
ao serem induzidas a sofrer mitose pela concanavalina A. Não houve efeito da
concentração 10-8 e 10-9 M de retinol ou da concentração 10-9 e 10-10 M de ácido
retinoico sobre a proliferação induzida destas células. Os autores não
mensuraram os teores plasmáticos de betacaroteno e vitamina A durante o
experimento.
Foi avaliada a habilidade do produto OxC-beta (Avivagen, Ottawa,
Canadá) de afetar a expressão de genes relevantes à resposta imune (BURTON
et al., 2014). Fibroblastos humanos foram incubados com 5 µmols/L de OxC-
beta e desafiados com lipopolissacarídeo indutor de mitose para mimetizar uma
condição de infecção. O OxC-beta aumentou a expressão de genes associados
com o reconhecimento dos patógenos, como os responsáveis pela expressão dos
receptores Toll-like e suas moléculas de suporte. O produto também reduziu a
expressão de genes responsáveis pelo processo inflamatório, como os que
expressam as citocinas e os receptores de citocinas e regulou a expressão de
moléculas de transdução de sinais envolvidas na resposta inflamatória, como as
inibidoras e mediadoras da inflamação. Esses resultados sugerem que estes
monômeros e polímeros de betacaroteno encontrados no produto OxC-beta
podem influenciar diversas respostas celulares associadas com o processo imune
inato.
2.12.2 Ação na glândula mamária
57
Rakes et al. (1985) alimentaram 70 vacas Holandesas com dieta baseada
em silagem de alfafa ou silagem de milho. Dentro desse grupo, as vacas foram
alocadas aos tratamentos 0 ou 300 mg/d de betacaroteno (Rovimix. Hoffmann-
La Roche Inc., Nutley, Estados Unidos). As dietas continham teores adequados
de vitamina A (3.919 UI/kg MS) e as vacas foram suplementadas com
betacaroteno do parto até 100 dias em lactação. Não houve diferença entre os
tratamentos no teor plasmático de betacaroteno ao parto (2,6 µg/mL). As vacas
suplementadas com betacaroteno retomaram esse teor de betacaroteno plamático
por volta de 45 dias após o parto e atingiram pico de 3,0 µg/mL no dia 75 após o
parto. As vacas não suplementadas atingiram pico de 2,4 µg/mL no dia 75 após
o parto. Os animais alimentados com silagem de alfafa e suplementados com
betacaroteno tiveram menor contagem de células somáticas no leite que os não
suplementados (114 ± 32 vs. 459 ± 190 células/mL), indicando melhor saúde da
glândula mamária.
Wang et al. (2013) suplementaram 316 vacas por infusão oral de 5 g de
betacaroteno (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Parsippany, Estados
Unidos) nos dias -23, -12 e 0 relativos ao parto. Os autores observaram menor
incidência de mastite em primíparas suplementadas (64,0 vs. 52,9%), mas não
em multíparas (45,3 vs. 51,0%).
Bian et al. (2007) avaliaram o efeito da suplementação de betacaroteno
sobre a saúde de vacas leiteiras em três experimentos. Setenta e cinco vacas
foram suplementadas com 0, 300 ou 500 mg/d de betacaroteno (Rovimix. DSM
Nutritional Products Ltd., Queensland, Austrália) no experimento 1 e 2 e com 0
ou 300 mg/d no experimento 3. A suplementação foi 21 dias do parto previsto
até 70 dias após o parto. O teor plasmático de betacaroteno antes da
suplementação foi em média 1,2 µg/mL. No experimento 1, as vacas
suplementadas com betacaroteno tiveram maior teor plasmático de betacaroteno
nos dias 10 (0,9 vs. 0,5 µg/mL) e 60 após o parto (1,2 vs. 0,4 µg/mL). Houve
58
redução na taxa de mastite dos animais suplementados com betacaroteno em
relação ao tratamento controle, as taxas foram 0, 4,3 e 13,6% para os tratamentos
500, 300 mg e controle, respectivamente, porém não houve diferença entre o
tratamento 500 e 300 mg. No experimento 3, a suplementação com betacaroteno
reduziu a incidência de retenção de placenta (8 % vs. 26%).
Chew et al. (1982b) relacionaram a severidade da mastite com o teor
plasmático de betacaroteno em 45 vacas leiteiras. A severidade da mastite foi
categorizada pelo teste californiano (CMT). Amostras de sangue foram coletadas
a cada CMT realizado. Foi observado decréscimo no teor plasmático de
betacaroteno quanto maior foi a severidade da mastite, foi 4,7 µg/mL para o
escore 1 do CMT, 4,5 µg/mL para o escore 2 e 3,7 µg/mL para o escore 3.
Entretanto, Johnston e Chew (1984) observaram relação inversa entre o
teor plasmático de betacaroteno 10 dias antes até sete dias após o parto e a
incidência de mastite em 96 vacas leiteiras no início da lactação. Outros estudos
não apontaram efeito benéfico da suplementação de betacaroteno em reduzir a
CCS e prevenir mastite (BINDAS et al., 1984; KAEWLAMUN et al., 2012;
LEBLANC et al., 2004; OLDHAM et al., 1991).
2.12.3 Ação no útero
Akar e Gazioglu (2006) relataram menor teor de betacaroteno
plasmático no início da lactação em vacas que desenvolveram RP. O teor
plasmático de betacaroteno nas vacas com RP nos dias 14, 21, 28, 35 e 42 da
lactação foi 1,12, 1,31, 1,48, 1,62 e 1,93 µg/mL, respectivamente. Nos animais
sem RP os teores foram 1,41, 2,44, 3,44, 5,09 e 5,46 µg/mL. Houve diferença
estatística em todos os dias coletados. Inaba et al. (1986a) também observaram
que vacas com maior teor plasmático de betacaroteno no dia do parto e no
primeiro dia pós-parto tiveram menor incidência de RP.
59
Michal et al. (1994) alocaram 56 vacas Holandesas a quatro tratamentos:
1) não suplementado (controle); 2) 300 mg de betacaroteno/d (T300); 3) 600 mg
de betacaroteno/d (T600) ou; 4) 120.000 UI de palmitato de retinol/d (VitA). O
betacaroteno (Rovimix) e o palmitato de retinol foram acrescidos à dieta dos
animais de 30 dias antes (D-30) até 30 dias após o parto (D30). Leucócitos
foram isolados do sangue e do leite das vacas. Os neutrófilos foram incubados
com Staphylococcus aureus e os linfócitos foram incubados e tiveram a
proliferação induzida por agentes mitogênicos. Antes da suplementação as vacas
tiveram teores subótimos de betacaroteno plasmático (2,3 µg/mL) e ótimos de
vitamina A (0,42 µg/mL). Os teores plasmáticos de vitamina A e betacaroteno
diminuíram até o D7 em todos tratamentos. O T600 retardou o decréscimo no
teor plasmático de betacaroteno e teve teor no D30 similar ao D-30 (2,3 µg/mL).
Não houve diferença entre o T300 e o tratamento controle e ambos foram
superiores ao VitA em relação aos teores plasmáticos de betacaroteno. Houve
queda na taxa de retenção de placenta do T600 em relação ao controle (25 vs.
41%) e tendência de queda do VitA e T300 comparados ao controle (33 e 31 vs.
41%). Apesar desta resposta, apenas os tratamentos suplementados com
betacaroteno apresentaram aumento na proliferação induzida de linfócitos
(T600) e no índice fagocítico dos neutrófilos incubados com Staphylococcus
aureus (T300).
Kaewlamun et al. (2011b) suplementaram 20 vacas leiteiras com 1000
mg de betacaroteno/d (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Paris, França),
60 dias antes do parto (D-60) até o parto (D0). Outras 20 vacas foram utilizadas
como controle. O teor plasmático de betacaroteno antes da suplementação foi 3,0
µg/mL. A suplementação elevou o teor plasmático de betacaroteno para 7,5
µg/mL no dia 30 pré-parto (D-30), entretanto houve queda drástica nos teores
plasmáticos de betacaroteno do D-14 (7,0 µg/mL) até o D14 (3,0 µg/mL). No
tratamento controle houve queda nos teores plasmáticos de betacaroteno do D-
60
60 até o D14 (2,3 µg/mL). A diferença nos teores plasmáticos entre as vacas
suplementadas e controle perderam significância a partir do D14. Foi detectado
aumento no teor plasmático de hidroxiprolina (aminoácido relacionado a
degradação do colágeno) no D21. Além disso, houve redução na porcentagem de
neutrófilos em esfregaços cervicais e uterinos das vacas suplementadas
comparadas ao controle no D28, indicando melhor involução uterina nas vacas
suplementadas com betacaroteno.
Wang et al. (2013) suplementaram 316 vacas com 5 g de betacaroteno
(Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Parsippany, Estados Unidos), via
infusão oral, nos dias -23, -12 e 0 (relativos ao parto). Foi detectada menor
incidência de metrite puerperal e febre no início da lactação em vacas multíparas
que tiveram retenção de placenta e que foram suplementadas com betacaroteno
comparadas ao controle.
Veličković et al. (2008) administraram, por via i.m., 200 mg de
betacaroteno ou solução salina a 30 vacas Holandesas, duas semanas antes e
duas semanas após o parto. Não foi observada resposta do betacaroteno na
incidência de retenção de placenta comparado a solução salina.
2.12.4 Ação no balanço energético
Foi demonstrado que dietas com alta energia, em camundongos,
estimulam a expressão do gene (MCP-1) responsável pela quimioatração de
macrófagos no tecido adiposo e camundongos com infiltração macrofágica neste
tecido apresentaram resistência à insulina (KANDA et al., 2006). Foi sugerido
que a produção de ERO pelos macrófagos seria um dos fatores que induziria a
resistência à insulina (KAMEJI et al., 2010) e assim, esses autores incubaram
células adiposas na presença do fator de necrose tumoral alfa (um potente
gerador de ERO) com betacaroteno nas concentrações 0, 10 ou 20 µM. Células
61
adiposas, incubadas com 20 µM de betacaroteno, apresentaram redução na
concentração de ERO e aumento na expressão de vários genes relacionados a
sensibilidade à insulina, incluindo os que expressam as adiponectinas e os
transportadores de glicose (glut-4).
Vacas podem apresentar resistência à insulina durante a transição do
final da gestação à lactação (DRACKLEY,1999). Entretanto, não foi detectada
relação entre o teor plasmático de betacaroteno e o estado energético de vacas
leiteiras (KAEWLAMUN et al., 2012; KAWASHIMA et al., 2010; SHAW et
al., 1950). Kawashima et al. (2010) não observaram diferenças significativas nos
perfis metabólicos de glicose e de ácido graxo não esterificado no início da
lactação de vacas suplementadas ou não com betacaroteno durante 21 dias antes
do parto. Kaewlamun et al. (2012) também não detectaram diferença no teor de
ácidos graxos não esterificados no início da lactação de vacas suplementadas ou
não com 1000 mg de betacaroteno (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd.,
Paris, França) durante 60 dias antes do parto. Shaw et al. (1950) não
encontraram relação entre o teor plasmático de betacaroteno ou vitamina A no
pré-parto de vacas leiteiras e cetose no início da lactação.
2.12.5 Ação em tumores
Em camundongos, a suplementação de betacaroteno protegeu contra
câncer de pele induzido pela radiação ultravioleta e também contra tumores
induzidos quimicamente (BENDICH, 1989). O carcinoma de células escamosas
oculares é a neoplasia com maior frequência em bovinos, sendo que a incidência
de raios ultravioletas é um dos principais fatores que predispõem a doença
(MOULTON et al., 1978).
2.12.6 Mecanismos de atuação
62
Os mecanismos pelos quais os carotenoides regulam a imunidade não
estão completamente compreendidos. Foi citado que os carotenoides melhoram a
função imune através da habilidade de regular a fluidez das membranas, de
melhorar a comunicação da junção do tipo gap e também como antioxidante
(CHEW; PARK, 2004). O efeito antioxidante é o mecanismo mais amplamente
aceito. As células imunes podem sofrer dano por espécies reativas de oxigênio
produzidas durante o processo de eliminação dos patógenos. (BENDICH, 1989;
CHEW, 1993).
2.13 Ação do betacaroteno na produção de leite
Oldham et al. (1991) suplementaram 41 vacas leiteiras com 300 mg/d de
betacaroteno + 50.000 UI de vitamina A/d durante 76 dias antes do parto até 42
dias da lactação. Outras 41 vacas foram utilizadas como controle recebendo
50.000 UI de vitamina A/d. Houve tendência de aumento em produção de leite
das vacas suplementadas com betacaroteno comparadas ao controle (38,1 vs.
35,8 kg/d).
Aréchiga et al. (1998) suplementaram 114 vacas leiteiras multíparas com
400 mg/d de betacaroteno (Rovimix. Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, Estados
Unidos) durante os dias 15 ao 170 pós-parto. Outras 114 vacas foram utilizadas
como controle. Foi observado aumento na produção de leite das vacas
suplementadas comparadas ao controle (8106 vs. 7577 kg).
De Ondarza et al. (2009) suplementaram 266 vacas leiteiras com 425
mg/d de betacaroteno (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Parsippani,
Estados Unidos) por 120 dias após o parto. Outras 249 vacas foram utilizadas
como controle. A dieta basal continha 8.400 UI de vitamina A/kg na MS. Foi
observado aumento no teor e produção de proteína no leite, embora estes efeitos
63
só tenham sido observados em vacas até 100 dias em lactação (2,96% vs. 2,92%,
P=0,11) e em vacas com mais de três partos (1,32 vs.1,27 kg, P=0,13).
Entretanto, o efeito mais marcante foi o aumento na produção de gordura do
leite (1,45 vs. 1,36 kg/d, P=0,02). O aumento da secreção de gordura no leite
pode ser explicado pelo aumento, in vitro, no crescimento de bactérias
celulolíticas em fluidos ruminais incubados com betacaroteno (HINO et al.,
1993). Outros autores não observaram efeito na produção e composição de leite
em resposta à suplementação de betacaroteno em vacas leiteiras (BINDAS et al.,
1984; KAEWLAMUN et al., 2012; RAKES et al., 1985; WANG; OWEN;
LARSON, 1988).
2.14 Ação do betacaroteno na reprodução
2.14.1 Atividade esteroidogênica
Kawashima et al. (2009) relacionaram o teor plasmático de betacaroteno
antes do parto com o retorno da atividade lútea no pós-parto de 22 vacas leiteiras
multíparas. As vacas que ovularam durante a primeira onda folicular pós-parto
tiveram maior teor plasmático de betacaroteno 21 dias antes do parto em
comparação às vacas que não ovularam (2,97 vs. 1,53 µg/mL).
Vários fatores têm sido associados ao desenvolvimento dos cistos
foliculares, incluindo a alta produção de leite, o balanço energético negativo,
complicações no parto, predisposição genética e desordens nutricionais
(Opsomer et al., 1999). O mecanismo da formação dos cistos foliculares parece
envolver a insensibilização do hipotálamo ao estrógeno durante o crescimento
folicular, induzida previamente por uma baixa exposição do hipotálamo à
progesterona (GUMEN; WILTBANK, 2002, 2005). Inaba et al. (1986)
observaram que o teor plasmático de betacaroteno foi significativamente menor
64
em vacas com cistos foliculares que em vacas sem cistos (1,1 vs. 3,3 µg/mL) no
início da lactação. O aumento da produção de progesterona induzido pelo
betacaroteno poderia estar associado a este fato (ARIKAN; RODWAY, 2000;
RAPOPORT et al., 1998; TALAVERA; CHEW, 1988).
Rapoport et al. (1998) coletaram corpos lúteos de bovinos em diferentes
estágios de desenvolvimento e correlacionaram a capacidade esteroidogênica
com os teores de betacaroteno nessas células. Foi observada correlação positiva
(r=0,43) e significativa entre o teor celular de betacaroteno e o teor de
progesterona plasmática.
Alguns autores demonstraram que a adição de betacaroteno poderia
aumentar a produção de progesterona em células luteais in vitro (ARIKAN;
RODWAY, 2000; TALAVERA; CHEW, 1988). Talavera e Chew (1988)
incubaram células luteais de suínos com diferentes concentrações de ácido
retinoico, betacaroteno e retinol. Ao desafiar estas células com hormônio
luteinizante, foi observado aumento linear na produção de progesterona ao
utilizar ácido retinoico e retinol em concentrações crescentes. Apesar do meio
com betacaroteno em sua menor concentração (0,1 µmol/L) ter apresentado os
melhores resultados entre todos os compostos, os meios mais concentrados (1
µmol/L e 10 µmol/L) reduziram linearmente a produção de progesterona. Arikan
e Rodway (2000) observaram efeito positivo da adição de betacaroteno na
concentração 0,1µmol/L sobre a produção de progesterona de células luteais
bovinas in vitro. Entretanto, alto teor de betacaroteno (1µmol/L) inibiu a
produção de progesterona. Vale ressaltar que estes experimentos não
diferenciaram o efeito direto do betacaroteno no aumento da síntese da
progesterona do seu papel como provitamina A, já que o betacaroteno pode ser
convertido em retinol em células luteais (MORALES et al., 2006).
Foi sugerido que a vitamina A poderia estimular a síntese e a ativação da
enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol (CSCCE) nas células luteais,
65
enzima responsável por um dos passos da produção de progesterona
(GANGULY et al., 1980). Mais tarde, foi comprovado que os retinoides estão
relacionados com a ativação de alguns genes relacionados a esteroidogênese,
como o CYP11A1 responsável pela codificação da enzima CSCCE
(WICKENHEISSER et al., 2005). Outro mecanismo sugerido ao betacaroteno
em relação à esteroidogênese é o de proteção das células e componentes
ovarianos contra as espécies reativas de oxigênio (WENG et al., 2000; CHEW et
al., 2001; TALAVERA; CHEW, 1988). Young et al. (1985) observaram que
células luteais cultivadas in vitro com betacaroteno apresentaram menor
concentração de ligações cruzadas entre a enzima CSCCE e radicais livres
produzidos no processo de conversão do colesterol a progesterona. Estas
ligações cruzadas inativam as enzimas CSCCE, limitando assim a produção de
progesterona.
2.14.2 Efeito da suplementação de betacaroteno no útero e na produção
de embriões
Sales et al. (2008) estudaram a resposta superovulatória e a qualidade de
embriões em novilhas e vacas Holandesas em lactação suplementadas com duas
doses de betacaroteno associadas ao tocoferol. Os autores superovularam 87
novilhas e 90 vacas. No dia 0 e 5 do protocolo de superovulação, os animais
receberam a suplementação de betacaroteno (BC) e tocoferol (T) por via
intramuscular, formando três tratamentos. O primeiro tratamento recebeu 800
mg de BC + 500 mg de T, o segundo recebeu 1.200 mg de BC e 750 mg de T e o
terceiro foi utilizado como controle. Não houve efeito da suplementação sobre a
proporção e a quantidade de embriões viáveis. Entretanto, houve interação entre
tratamento e paridade para estas duas variáveis. Foi observado ganho na
viabilidade de embriões nas vacas suplementadas, mas ocorreu efeito inverso nas
66
novilhas. Wang et al. (2002), ao administrar, in vitro, altas doses de tocoferol em
embriões de camundongos, verificaram redução no desenvolvimento e morte
destes embriões. Efeito negativo da suplementação de antioxidantes, como já
visto, pode acontecer por inversão de papéis destes compostos, tornando pró-
oxidantes quando há um desequilíbrio na relação entre os antioxidantes do corpo
(BOUWSTRA et al., 2010).
Schweigert et al. (2002) estudaram o efeito da vitamina A e do
betacaroteno dietético no desenvolvimento e na qualidade embrionária de 36
marrãs alocadas a três tratamentos: 1) 4.000 UI de vitamina A/marrã/d; 2) 8.300
UI de vitamina A/marrã/d; 3) 100 mg de betacaroteno/marrã/d e 4.000 UI de
vitamina A/marrã/d. Previamente essas marrãs passaram por dieta de depleção
de betacaroteno por quatro semanas. Foi detectada maior proporção de
blastocistos e maior qualidade embrionária no tratamento com betacaroteno em
relação aos demais tratamentos, sugerindo melhor desenvolvimento embrionário.
Alguns trabalhos sugerem que o betacaroteno pode regular o fluido
uterino. Marrãs suplementadas com betacaroteno tiveram maior quantidade de
proteína de ligação do retinol (RBP) no dia 15 da gestação comparadas ao
tratamento controle com adequada suplementação de vitamina A (CHEW et al.,
1982a). Outros trabalhos observaram resultados semelhantes no fluido uterino de
gatas (CHEW et al., 2001) e de marrãs (SCHWEIGERT et al., 2002), também
adotando tratamentos controle adequados em vitamina A. Weng et al. (2000) não
observaram efeito sobre a concentração total de proteína no fluido uterino de
cadelas suplementadas com doses crescentes de betacaroteno. Entretanto,
cadelas suplementadas com 50 mg de betacaroteno tiveram maior teor
plasmático de progesterona no dia 12 e 26 da gestação comparativamente ao
controle. A implantação do embrião depende da comunicação cruzada entre o
blastocisto e o endométrio, sendo que este mecanismo depende da vitamina A e
do teor de RBP no meio uterino (SCHWEIGERT et al., 2002). Além disso, a
67
placentação e o desenvolvimento embrionário também são determinados pela
vitamina A (CLAGETT-DAME; DELUCA, 2002).
Outro mecanismo sugerido ao betacaroteno em relação à fertilidade é o
de proteção das células uterinas e embrionárias contra a peroxidação, facilitando
a implantação e sobrevida do embrião (CHEW et al., 2001; SCHWEIGERT et
al., 2002). Ikeda et al. (2005) citaram que é possível que o betacaroteno
extracelular no fluido folicular e o betacaroteno intracelular incorporado em
células foliculares e nos oócitos, os protegem contra a citotoxicidade mediada
pelas espécies reativas de oxigênio, podendo aumentar o desenvolvimento dos
oócitos competentes.
Aréchiga, Ealy e Hansen (1995) demonstraram que alta temperatura
durante o desenvolvimento de embriões aumenta a produção de radicais livres
consumindo antioxidantes solúveis. Neste estudo, a exposição de embriões de
camundongos a choque térmico severo (41°C) prejudicou o desenvolvimento e a
viabilidade destes embriões. Um dos mecanismos para explicar o efeito deletério
da temperatura elevada sobre os embriões foi a diminuição em quase 50% na
concentração intracelular de glutationa (um antioxidante natural). A inibição da
síntese de glutationa, pela adição do composto butionina sulfoximina, também
reduziu a viabilidade e o desenvolvimento dos embriões.
Retinol não tem a capacidade de suprimir moléculas de oxigênio singlete
e tem uma capacidade muito baixa de reduzir outras espécies reativas de
oxigênio (COMBS JR, 2012). Portanto, pode-se presumir um efeito particular do
betacaroteno na fertilidade bovina em relação à vitamina A.
2.14.3 Suplementação de vacas em lactação com betacaroteno
Rakes et al. (1985) encontraram menor diâmetro da cérvix de vacas
(n=35) suplementadas com 300 mg/d de betacaroteno nos 21 e 28 dias pós-parto
68
comparado às vacas não suplementadas com betacaroteno (n=35). Vacas
suplementadas com betacaroteno também foram mais precoces em retornar a
ciclicidade estral. As vacas foram suplementadas com betacaroteno do parto até
100 dias em lactação. Não houve diferença entre os tratamentos no teor
plasmático de betacaroteno ao parto (2,6 µg/mL). A suplementação elevou o teor
plasmático de betacaroteno até o dia 75 (3,0 µg/mL), a partir do qual houve
estabilização. As vacas não suplementadas tiveram queda do teor plasmático até
o dia 25 (1,6 µg/mL) e elevação até o dia 75 (2,4 µg/mL), estabilizando em
seguida.
Aréchiga et al. (1998) realizaram três experimentos utilizando 701 vacas
leiteiras. Os experimentos 1 e 2 foram realizados no verão e o experimento 3 no
inverno. Metade das vacas em cada experimento foi suplementada com 400 mg
de betacaroteno/d (Rovimix. Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, Estados Unidos)
durante os dias 15 a 170 da lactação, a outra metade foi utilizada como controle.
No experimento 1 as vacas suplementadas com betacaroteno apresentaram teores
plasmáticos de betacaroteno superiores às do controle (6 vs. 3 µg/mL, aos 90
dias da lactação). Nos experimentos 2 e 3 houve aumento discreto no teor
plasmático de betacaroteno em resposta à suplementação (3,5 vs. 3 µg/mL e 2,5
vs. 2 µg/mL, aos 90 dias da lactação). Apenas no experimento 1 houve efeito
positivo da suplementação sobre a fertilidade. Vacas suplementadas com
betacaroteno por mais de 90 dias tiveram maior taxa de prenhez aos 120 dias em
relação ao controle (35,4 vs. 21,1%). Os autores sugeriram que a condição de
estresse térmico no experimento 1 pode ter induzido a resposta favorável no
desempenho reprodutivo à suplementação, já que a temperatura corporal está
relacionada ao estresse oxidativo dos animais (BERNABUCCI et al., 2002).
De Ondarza et al. (2009) suplementaram 266 vacas leiteiras com 425
mg/d de betacaroteno (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Parsippani,
Estados Unidos) por 120 dias após o parto. Outras 249 vacas foram utilizadas
69
como controle. A dieta basal continha 8.400 UI de vitamina A/kg na MS.
Sessenta dias após o parto, o teor plasmático de betacaroteno foi 2,47 ± 0,98
µg/mL para o tratamento controle e 3,56 ± 1,93 µg/mL para o tratamento
suplementado. No dia 120, o teor plasmático de betacaroteno foi 1,71 ± 0,55
µg/mL e 2,75 ± 1,34 µg/mL para controle e suplementado, respectivamente. A
proporção de vacas gestantes calculadas a cada 21 dias foi 23% nas vacas
suplementadas e 12% no tratamento controle. No dia 126 o efeito benéfico
continuou, foi 20% e 9% para suplementadas e controle, respectivamente.
Ay et al. (2012) avaliaram o efeito da administração intramuscular com
0,4 mg/kg de peso vivo de betacaroteno (Carofertin. Alvetra&Werfft AG,
Neufeld an der Leitha, Áustria) sobre parâmetros reprodutivos de vacas em
lactação. Um total de 124 vacas Holandesas foram alocadas a cinco tratamentos:
TI) administração de betacaroteno nos dias 15 e 45 após o parto (pp); T2)
administração de betacaroteno apenas no dia 15 pp; T3) administração de
betacaroteno apenas no dia 45 pp; T4) administração de betacaroteno nos dias 35
e 45 pp; T5) controle. O teor plasmático de betacaroteno no dia 15 pp foi
semelhante entre os tratamentos (1,0 µg/mL). No dia 48, o teor plasmático de
betacaroteno foi 3,5 µg/mL no T1, 1,9 µg/mL no T2, 4,1 µg/mL no T3, 4,4
µg/mL no T4 e 1,0 µg/mL no controle. Houve aumento no teor plasmático de
betacaroteno entre os dias 15 e 48 para todos os tratamentos, exceto para o
controle. A proporção de vacas gestantes após três inseminações foi 100% no T1
e 88% no T4, superior aos valores de 80% no T2, 84% no T3 e 70,8% no
controle. O Teste Exato de Fisher foi utilizado para comparar a proporção de
vacas gestantes.
Entretato, vários autores relataram a falta de efeito significativo da
suplementação com betacaroteno após o parto sobre o desempenho reprodutivo.
Akordor et al. (1986) não detectaram efeito sobre a taxa de concepção ao
primeiro serviço e a involução uterina da suplementação de 400 mg/d de
70
betacaroteno (Rovimix. Hoffman-La Roche Ltd., Brampton, Canadá) do dia 10
pós-parto até as vacas ficarem gestantes ou serem descartadas. O teor plasmático
de betacaroteno foi menor ao parto (1,0 µg/mL) que 40 dias antes do parto (4,0
µg/mL). A suplementação elevou o teor plasmático de betacaroteno no dia 98
pós-parto a 2 µg/mL, a partir do qual houve estabilização. No tratamento
controle, o teor plasmático de betacaroteno declinou até o dia 100 pós-parto (0,6
µg/mL).
Bindas et al. (1984) também relataram que a suplementação de vacas
leiteiras com 600 mg/d de betacaroteno (Rovimix. Hoffmann-La Roche and Co.
Ltd., Basel, Suíça), da quarta semana após o parto até a semana 13, não afetou o
intervalo em dias do parto ao primeiro serviço e o número de serviços por
concepção. Além disso a suplementação não teve efeito sobre os teores de LH,
progesterona, insulina e glucagon no plasma. A dieta basal continha silagem de
milho e adequada suplementação de vitamina A com 65.000 UI/d. O teor
plasmático de betacaroteno na primeira semana pós-parto foi baixo (0,8 µg/mL).
A suplementação elevou o teor plasmático de betacaroteno até a semana nove da
lactação para 2,45 µg/mL. As vacas no tratamento controle tiveram teor
plasmático de betacaroteno de 1,5 µg/mL na semana sete da lactação,
estabilizando em seguida.
Wang, Hafi e Larson (1988) avaliaram o efeito da suplementação de 600
mg/d betacaroteno por 27 semanas sobre a liberação de LH pelo hipotálamo em
resposta a desafio com GnRH em vacas leiteiras. As vacas lactantes no
tratamento controle (n=7) e no suplementado (n=6) tiveram teor plasmático de
betacaroteno de 2,6 µg/mL no início do período experimental. A suplementação
elevou o teor plasmático de betacaroteno para 3,5 µg/mL na 16ª semana. No
tratamento controle, o teor plasmático de betacaroteno declinou a 1,9 µg/mL na
semana 16. Após esta fase, os autores interromperam a lactação das vacas,
porém a suplementação foi mantida. Na semana 28, o teor plasmático de
71
betacaroteno declinou para 1,5 µg/mL nos animais suplementados e para 1,0
µg/mL no controle. Os autores não conseguiram explicar a queda no teor
plasmático de betacaroteno com o encerramento da lactação. As vacas foram
ovariectomizadas na semana 20 e o desafio de GnRH foi realizado na semana
27. Não foi detectado efeito de tratamento sobre o teor plasmático basal de LH,
sobre a frequência e amplitude dos pulsos de LH intervalados a cada 15min
durante 6h, ou sobre a quantidade total de LH liberado estimado da área sob a
curva de LH, em resposta à administração de GnRH. Também não foi detectado
efeito sobre o teor plasmático de progesterona, tamanho do corpo lúteo e teor de
progesterona luteal imediatamente antes da ovariectomização.
2.14.4 Suplementação de betacaroteno no pré-parto de vacas leiteiras
Bian et al. (2007) avaliaram o efeito da suplementação de betacaroteno
durante o pré e pós-parto sobre o desempenho reprodutivo de vacas leiteiras em
três experimentos. Nos experimentos 1 e 2, 75 vacas foram suplementadas com
0, 300 ou 500 mg/d de betacaroteno. No experimento 3, 76 vacas foram
suplementadas com 0 ou 300 mg/d. A suplementação começou três semanas
antes do parto até 10 semanas após. No experimento 1 as vacas suplementadas
com betacaroteno (300 e 500 mg) tiveram maior teor plasmático de betacaroteno
em relação ao controle nos dias 10 (0,9 vs. 0,5 µg/mL) e 60 após o parto (1,2 vs.
0,4 µg/mL), porém não apresentaram diferenças entre si. No experimento 2 foi
detectada diferença no teor plasmático de betacaroteno apenas no dia 60 após o
parto, o tratamento suplementado com 500 mg apresentou o maior teor
plasmático (3,3 µg/mL), os tratamentos 0 e 300 mg não diferiram entre si (2,5
µg/mL). Houve redução nos dias do parto ao primeiro estro do tratamento 500
mg em relação aos tratamentos 300 mg e controle, que não diferiram entre si, no
experimento 1 (72, 84 e 80 dias, respectivamente) e experimento 2 (71, 76 e 79
72
dias, respectivamente). No experimento 3 a suplementação de 300 mg de
betacaroteno aumentou a porcentagem de vacas com presença de corpo lúteo (58
vs. 39%) e a taxa de prenhez (36 vs. 24%) no dia 70 após o parto comparado ao
controle.
Kawashima et al. (2010) estudaram o efeito da suplementação de
betacaroteno antes do parto sobre o retorno da ciclicidade estral em vacas
leiteiras após o parto. Dois experimentos foram realizados. No experimento 1 as
vacas foram suplementadas com 0 ou 500 mg de betacaroteno por 24,6 ± 2,6 d
antes do parto. No experimento 2 as vacas foram suplementadas com 0 ou 2.000
mg de betacaroteno por 24,3 ± 1,5 d antes do parto. A suplementação com
betacaroteno aumentou a proporção de vacas que ovularam na primeira onda
folicular pós-parto: 4/5 vs. 1/5 no experimento 1 e 9/12 vs. 5/10 no experimento
2.
Kaewlamun et al. (2011b) suplementaram 20 vacas leiteiras com 1.000
mg de betacaroteno/d (Rovimix. DSM Nutritional Products Ltd., Paris, França)
de 60 dias antes do parto (D-60) até o parto (D0). Outras 20 vacas foram
utilizadas como controle. O teor plasmático de betacaroteno antes da
suplementação foi 3,0 µg/mL. A suplementação elevou o teor plasmático de
betacaroteno para 7,5 µg/mL no dia 30 pré-parto (D-30), entretanto houve queda
do D-14 (7,0 µg/mL) até o D14 (3,0 µg/mL). No tratamento controle, houve
queda no teor plasmático de betacaroteno do D-60 até o D14 (2,3 µg/mL). Não
houve diferença entre tratamentos no teor plasmático de betacaroteno no D14.
Não foi detectado efeito da suplementação pré-parto com betacaroteno sobre o
intervalo do parto à primeira ovulação, na produção total de progesterona
estimada pela área sob a curva de progesterona diária do leite e na atividade
ovariana estimada pelas concentrações de progesterona do leite no período de 0
a 50d e 51 até o fim do experimento, classificada como ciclo normal,
anovulação, ciclo irregular ou corpo lúteo persistente.
73
Veličković et al. (2008) injetaram por via intramuscular 200 mg de
betacaroteno em 15 vacas Holandesas, duas semanas antes e duas semanas após
o parto. Não foi detectado efeito sobre variáveis reprodutivas comparativamente
ao controle não injetado. As variáveis estudadas foram: dias do parto ao primeiro
estro, número de serviços por concepção e dias do parto à concepção.
Wang et al. (2013) suplementaram 316 vacas com 5 g/d de betacaroteno
(Rovimix. DSM, Nutritional Products Ltd., Parsippany, Estados Unidos) nos
dias -23, -12 e 0 relativamente ao parto. Não foi detectado efeito da
suplementação com betacaroteno sobre a reprodução. As variáveis estudadas
foram: proporção de vacas com presença de corpo lúteo no dia 63, taxa de
concepção após 60 dias da 1ª e 2ª IA e porporção de vacas gestantes aos 300 dias
de lactação.
O efeito negativo da suplementação com betacaroteno sobre a fertilidade
de vacas leiteiras foi relatado (FOLMAN et al., 1987). Estes autores alocaram
155 vacas a três tratamentos. No tratamento 1 (VA-VA) as vacas foram
suplementadas por 60 dias antes do parto (D-60), com 69 mg de acetato de
retinil/d e após o parto receberam 96 mg de acetato de retinil. Tratamento 2 (BC-
VA), as vacas foram suplementadas com 500 mg de betacaroteno (Rovimix.
Hoffmann-La Roche, Basel, Suíça) no pré-parto e 96 mg de acetato de retinil no
pós-parto. Tratamento 3 (BC-BC), as vacas foram suplementadas com 500 mg
de betacaroteno no pré-parto e 700 mg de betacaroteno no pós-parto. Os
suplementos foram fornecidos até as vacas gestarem ou serem descartadas. Os
teores plasmáticos de betacaroteno nos D-35 e D-14 (antes do parto) e nos D30,
D60 e D90 (após o parto) foram: 2,36, 1,76, 0,82, 1,00 e 1,06 µg/mL para VA-
VA, 5,51, 5,13, 1,44, 1,39 e 1,43 µg/mL para BC-VA e 5,56, 5,56, 4,30, 5,81 e
6,57 µg/mL para BC-BC. A taxa de concepção para todas as inseminações foi
53,9% para VA-VA), 42,2% para BC-VA e 27,9 % para BC-BC. O intervalo do
parto à concepção para vacas com três partos ou menos (≤3P) e para vacas com
74
quatro partos ou mais (≥4P) foram, respectivamente, 110 e 112 dias para VA-
VA, 130 e 129 dias para BC-VA e 133 e 166 dias para BC-BC. O número de
inseminações por concepção para vacas ≤3P e ≥4P foram de 1,8 e 1,8 para VA-
VA, 2,2 e 2,2 para BC-VA e 2,5 e 3,4 para BC-BC. O teor plasmático de
betacaroteno no tratamento BC-BC foi superior ao ótimo de 3,0 µg/mL (FRYE;
WILLIAMS; GRAHAM, 1991). Os autores não sugeriram algum mecanismo
para a resposta negativa em desempenho reprodutivo à suplementação com
betacaroteno.
2.14.5 Mecanismos de atuação
O mecanismo de ação pelo qual a suplementação com betacaroteno pode
determinar a eficiência reprodutiva de vacas leiteiras parece envolver sua
conversão em vitamina A no útero e ovários, já que a vitamina A está
relacionada com a implantação e o desenvolvimento embrionário e também está
envolvida na expressão gênica de enzimas relacionadas a esteroidogênese nos
ovários. O betacaroteno também pode ter ação antioxidante, protegendo
componentes celulares de espécies reativas de oxigênio, o que pode aumentar a
função imune e a sobrevida dos embriões. Entretanto, o betacaroteno não parece
atuar a nível do sistema hipotálamo-hipofisário. Além disso, a resposta à
suplementação com betacaroteno pode ser determinada pela duração do período
de suplementação, pelo teor de betacaroteno na dieta basal e pelo teor sanguíneo
obtido. O desafio ambiental também determina a resposta do animal ao
betacaroteno suplementar.
2.15 Discussão comparativa entre os principais trabalhos da literatura
75
O teor plasmático de betacaroteno em vacas no ínicio da lactação (11 ±
12d) foi 2,48 ± 1,60 µg/mL e a suplementação média de 454 ± 121 mg/vaca/d de
betacaroteno elevou os teores plasmáticos de betacaroteno em 0,74 ± 0,72
µg/mL após 60 dias de tratamento (Tabela 1). Não foram observadas respostas
em desempenho reprodutivo em experimentos cuja suplementação de
betacaroteno elevou de forma discreta o teor plasmático de betacaroteno
(AKORDOR et al., 1986; BINDAS et al., 1984). Foi detectado um acréscimo na
proporção de vacas gestantes em vacas suplementadas com betacaroteno por
mais de 90 dias (ARÉCHIGA et al., 1988) e por mais de 105 dias (DE
ONDARZA et al., 2008) e nas quais os teores plasmáticos de betacaroteno após
a suplementação alcançaram níveis superiores a 3,0 µg/mL. Entretanto, Folman
et al. (1987) observaram um efeito negativo em desempenho reprodutivo de
vacas leiteiras suplementadas com betacaroteno 60 dias antes do parto até se
tornarem gestantes (Tabela 2). Neste experimento o teor plasmático obtido após
a suplementação foi maior que 6,0 µg/mL. Mensurar a capacidade antioxidante
das vacas antes da suplementação e acompanhar o estado oxidativo em resposta
à suplementação podem ser parâmetros importantes ao suplementar
antioxidantes (BOUWSTRA et al., 2010). Estes dados poderiam ajudar a
explicar a magnitude e a direção das respostas ao uso de betacaroteno
encontradas na literatura.
Diminuição na incidência de retenção de placenta (BIAN et al., 2007;
MICHAL et al., 1994) e melhora na involução (KAEWLAMUN et al., 2011b) e
saúde uterina (WANG et al., 2013) foram observadas principalmente ao
suplementar betacaroteno começando no pré-parto de vacas leiteiras (Tabelas 2 e
3). Sendo que a suplementação apenas no pré-parto de vacas leiteiras (Tabela 3)
pareceu influenciar eventos restritos ao período em torno do parto
(KAEWLAMUN et al., 2011b; WANG et al., 2013), já que a resposta no teor
plasmático de betacaroteno à suplementação de betacaroteno diminuiu com o
76
avançar dos dias em lactação (KAEWLAMUN et al., 2011b). Betacaroteno
reduziu a contagem de células somáticas (RAKES et al., 1985) e diminuiu a
incidência de mastite (BIAN et al., 2007; WANG et al., 2013). Entretanto,
diversos autores não encontraram efeito na saúde da glândula mamária (DE
ONDARZA et al., 2008; BINDAS et al., 1984; OLDHAM et al., 1991;
KAEWLAMUN et al., 2012). Variáveis reprodutivas e de saúde não são
dependentes apenas do teor plasmático de betacaroteno. Alguns fatores podem
mascarar ou evidenciar a resposta à suplementação de betacaroteno e deveriam
ser mais bem descritos nos experimentos como o uso de antibióticos, protocolos
reprodutivos, ambientação e estresse oxidativo dos animais.
77
78
79
80
REFERÊNCIAS
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104
SEGUNDA PARTE – ARTIGO
105
ARTIGO 1
SUPPLEMENTATION OF LATE GESTATION DAIRY COWS WITH
BETA-CAROTENE
Artigo formatado de acordo com as normas para submissão ao periódico
Theriogenology
106
ABSTRACT
The pre-calving supplementation of beta-carotene was evaluated. The data set contained 283 Holsteins that received a treatment for >14 d (29.1±6.9 d). Cows were paired blocked by parity and expected calving date and assigned to a treatment: Beta-carotene (1.2 g/cow/d) or Control. The same TMR batch was offered to all cows and beta-carotene was top dressed per cow once a day. Milk yield was recorded daily and sampled at 30.1±8.3 d post-calving. Frequency distributions were analyzed with GENMOD of SAS using logistic regression for binomial data. Continuous variables were analyzed with PROC MIXED of SAS. Within parity, nonparametric estimates of the survivor function for reproductive variables were computed using the product-limit method of the Kaplan-Meier method with LIFETEST. Plasma beta-carotene content at the start of the experiment was similar (2.99 µg/mL, P=0.59) and peaked at 3.26 µg/mL on day -15 pre-calving for supplemented cows (2.62 µg/mL for Control, P<0.01). Colostrum density, milk yield, and milk solids content were similar (P>0.32). Milk yield from d 20 to 109 of lactation was 3105 kg for primiparous and 3595 kg for multiparous (P<0.01). Beta-carotene tended to increase milk protein content from 2.90 to 2.96% (P=0.09) and to decrease the proportion of primiparous with a milk fat to protein ratio >1.5 from 22.6 to 6.4% (P=0.08). The proportion of primiparous with difficult calving, SCC >200,000 cells/mL, metritis, progesterone >1 ng/mL at 21 and 42 d, % conception at first service, and % pregnant at 90 and 150 d were similar (P>0.46). There was a trend for decreased incidence of SCC >200,000 cells/mL in multiparous supplemented with beta-carotene (38.9% vs. 28.1%, P=0.12), other variables were similar (P>0.21). Beta-carotene reduced the proportion of multiparous with retained placenta 12 h post-calving from 29.9% to 21.7%, time of placenta release was 392 min (340 to 440) for beta-carotene and 490 min (395 to 540) for Control (Median and 95% confidence interval. LogRank P=0.05 and Wilcoxon P=0.04). For primiparous, beta-carotene did not determine placenta release (incidence was 15.4%). Responses in the intervals from calving to first estrous, to first service, and to conception were not detected. The pre-calving supplementation of beta-carotene increased the plasma content around calving. There was no detectable response in milk yield or reproductive performance. Beta-carotene reduced the incidence of retained placenta in multiparous cows.
Keywords: Beta-carotene, retained placenta, transition period
107
1. INTRODUCTION
Carotenoids, such as beta-carotene, can be converted to vitamin A in
cells of the intestinal mucosa, liver, uterus and ovaries [1,2,3]. Carotenoids also
have antioxidant function, protecting cells and cell components against reactive
oxygen species [4]. The antioxidant defense system of dairy cows around
calving may be overloaded with reactive oxygen species, predisposing animals
to immune system related diseases, such as retained placenta, metritis and
mastitis [5,6,7]. Beta-carotene supplementation increased the proliferative
response of lymphocytes to mitogens and enhanced the phagocytic ability of
polymorphonuclear neutrophils [8,9]. Beta-carotene deficiency may play a role
on reproduction, lactation performance and health, justifying its supplementation
to dairy cows around calving.
Under confinement dairy production systems, total farm reliance on
preserved forages is not uncommon. The carotenoid content of forages is
reduced during storage as silage or hay [10] and the content in most grains is not
substantial. Positive responses in dairy cow fertility and lactation performance
have been observed when beta-carotene was supplemented after calving [11,12],
although absent [13,14] or negative [15] effects on reproduction have been
reported. The diverse response to beta-carotene supplementation post-calving
may be related to the duration of supplementation, to the beta-carotene content
of the basal diet, to the blood plasma concentration induced by the supplement,
and by the degree of immune depression and oxidative stress of animals [11].
Although the post-calving supplementation of beta-carotene may be
beneficial to dairy cows, Kaewlamun et al. [16] and Wang et al. [17] reported
benefits in uterine health of cows supplemented with beta-carotene before
calving. Kawashima et al. [18] also showed in a retrospective study that
ovulatory cows in the first follicular wave postpartum had higher plasma beta-
108
carotene concentration before calving than anovulatory cows. These studies
suggest that beta-carotene supplementation before calving may improve fertility
in early lactation.
In small confinement systems adopting multiple diets, it is not
uncommon for fresh cows to go directly to the most nutrient dense diet of the
farm, without having access to a post-calving specific diet. The permanence time
of cows in post-calving groups is also variable, depending on herd management
practices and degree of group crowding. This scenario makes difficult the
adoption of nutrition strategies specially focused on the entire transition period
(pre- and post-calving). Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of
beta-carotene supplementation during the pre-calving transition period on
lactation performance, reproduction and health of early lactation dairy cows
109
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Animals and treatments
Experimental procedures were approved by the Federal University of
Lavras Bioethic Committee in Utilization of Animals (Protocol no 056/13). The
study was conducted in a commercial dairy herd (21°55’S, 36°36’W, Brazil).
The farm separated primiparous from multiparous cows during the pre-calving
transition period and along the lactation. Within these two calving order groups,
cows were paired blocked based on expected calving date and were randomly
assigned to a treatment at days -25 to -31 of the predicted calving date (goal was
a 28-day pre-calving transition period). Cows were moved from the dry cow to
the transition cow group once per week. Treatments were: 1.2 g/d of beta-
carotene (12 g/d of Rovimix, containing 10% beta-carotene. DSM Nutritional
Products, São Paulo, Brazil) or Control. The transition cow free stalls with self-
lockers were split into two identical halves (similar bedding and feed bunk
availability per cow). The same TMR batch was offered to all cows. The beta-
carotene was top dressed once daily to each cow.
Twelve cows that received the pre-calving transition diet for less than 14
days were removed from the final data set. For the 283 cows that received the
pre-calving diet for 14 days or more, the duration of the pre-calving transition
period was 29.1±6.9 days (Mean±SD). The period from the beginning of
treatments allocation till the day the last cow completed 150 days in milk lasted
from January 24th to September 27th, 2012. Calvings occurred from February 1st
to April 30th. For each response variable, the number of experimental units
varied depending on data availability and reliability. The number of observations
for each variable is described in Table 1.
110
2.2. Diets
The composition of the diets was defined by the manager without the
interference of the research team. The formulated diet for the pre-calving
transition period contained (% of DM): 55.9% corn silage, 17.2% green chop
Tifton, 8.9% soybean meal, 3.9% finely ground corn, 6.4% citrus pulp, 4.8%
whole cottonseed, and 2.9% minerals, vitamins, and additives. The formulated
lactating cow diet contained (% of DM): 34.8% corn silage, 8,4% green chop
Tifton, 13.8% soybean meal, 6.1% whole heated soybeans, 18.6% finely ground
corn, 11.9% citrus pulp, 2.3% whole cottonseed, and 4.1% minerals, vitamins,
and additives.
2.3. Blood sampling for beta-carotene and progesterone assays
Blood samples from the coccygeal vessels were obtained on day 0 (first
day of supplementation), between days -18 and -10 relative to calving (day -15),
and on days 7 and 56 of lactation. Blood beta-carotene content was quantified as
in [19] using the iEx system, a single-step denaturation, and beta-carotene
extraction into organic solvent, followed by beta-carotene measurement using
iCheck (BioAnalyt GmbH, Teltow, Germany), a portable spectrophotometer.
Concentrations were classified as High (≥3.5 µg/mL), Intermediate (≥2 to <3.5
µg/mL) or Low (<2 µg/mL).
Blood serum progesterone (P4) concentration was analyzed in samples
from the coccygeal vessels obtained on days 21 and 42 of lactation. Serum was
stored at -20ºC until assayed for P4 concentration by solid phase RIA using a
Coat-A-Count Progesterone kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles,
USA). The intra-assay coefficient of variation for P4 assays were 0.14 and 1.68,
for low and high samples, and the inter-assay were 9.93 and 2.12%, for low and
111
high samples. Cows with luteal activity were defined as serum progesterone
concentration above 1 ng/mL.
2.4. Calving difficulty, colostrum density, and placenta release
Immediately before the expected calving date, cows were moved to
sand-bedded maternity pens. Calving was classified by farm personal as
unassisted or assisted. Colostrum density was determined with a
lactodensimeter. Time post-calving of placenta release was measured up to 12 h
of calf delivery. The non-detachment of fetal membranes within 12 hours was
considered as retained placenta.
2.5. Milk yield and composition
Cows were milked three times per day starting at 4 AM, 12 AM, and 8
PM. Milk yield of each cow was recorded daily from days 20 to 109 of lactation
and samples were obtained between days 15 and 42 of lactation. Milk samples
were preserved in 2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol and the content of solids and
somatic cells (SCC) was analyzed by infrared analysis (Bentley 2000. Bentley
Instruments Inc., Chaska, USA). Milk fat to protein ratio greater than 1.5 was
considered as a sign of ketosis [20]. A SCC greater than 200,000 cells/mL was
considered as mastitis. The SCCs was converted to a linear scale from 0 to 9
(linear SCC), the midpoint of each score represented by the following linear
SCC values (x 1000 cells/mL): 12.5 to linear SCC 0; 25 to SCC linear 1; 50 to
linear SCC 2; 100 to linear SCC 3; 200 to linear SCC 4; 400 to linear SCC 5;
800 to linear SCC 6; 1600 to linear SCC 7; 3200 to linear SCC 8 and 6400 to
linear SCC 9.
112
2.6. Reproductive management
Estrus detection was performed visually. Cows were kept under routine
herd reproductive management practices. Rectal palpation of all cows was
performed by the herd veterinarian at around 30 days of lactation. Purulent
secretion or presence of liquid in uterus at ultrasound exam was defined as
metritis. Cows were then transrectal palpated at two-week intervals until
insemination after a 60 d voluntary waiting period. Only natural estrus or
induced with prostaglandin F2α were used to inseminate the cows. Pregnancy
diagnosis by ultrasonography (Aloka SSD 500®, 5 MHz linear transducer,
Tokyo, Japan) was performed from day 25 to 38 after insemination and
confirmation was performed 14 days later.
2.7. Statistical Analyses
Frequency distributions were analyzed with the GENMOD procedure of
SAS using logistic regression for binomial data. Continuous variables were
analyzed with the MIXED procedure of SAS with a model containing the fixed
effects of Parity (primiparous, multiparous), Block within Parity, Treatment
(Control, Beta-carotene) and the interaction of Parity and Treatment. Analysis
was also performed for the primiparous and the multiparous cow data sets
separately, with a model that did not contain the Parity effect. Blood beta-
carotene content was also analyzed with a model containing the fixed effects of
event (difficult calving, retained placenta, milk fat content to protein content
ratio, metritis, mastitis, P4 at 21d, P4 at 42d, conception at 1st service, pregnancy
at 90d and pregnancy at 150d), sampling day, and the interaction of event and
sampling day. Within parity, nonparametric estimates of the survivor function
for variables calving to 1st estrous, calving to 1st service, calving to conception,
113
and time from calving to placenta release were computed using the product-limit
method of the Kaplan-Meier method, by the LIFETEST procedure of SAS.
Survival curves were generated. Comparison of the survival curves between the
two treatments used rank tests for homogeneity: Log-rank and Wilcoxon test.
The log-rank test places more weight on larger survival times, and the Wilcoxon
test places more weight on early survival times.
3. RESULTS
The blood content of beta-carotene at the start of the pre-calving
transition period (Day 0) was similar across treatments (Tables 2 and 3). In
relation to Day 0, blood content at day -15 relative to calving was decreased for
cows on Control, while it was increased for the beta-carotene supplemented
cows (Table 3). Blood beta-carotene content of supplemented cows peaked at
3.3 µg/mL on Day -15. Blood concentrations were lowest immediately after
calving, although they were increased by the supplement. Primiparous cows had
lower blood beta-carotene content than multiparous only at Day 0 (Table 3). The
pre-calving supplementation of beta-carotene increased the blood content around
calving, but the difference between treatments decreased with the advance in
lactation.
There was no evidence for a response to beta-carotene supplementation
in colostrum density, milk yield, and milk fat content (Table 4). However, beta-
carotene supplementation tended (P=0.09) to increase milk protein content.
Linear SCC and the ratio of fat to protein in milk were lower for primiparous
than for multiparous cows. Peak milk yield was around 46 kg/d for primiparous
and 53 kg/d for multiparous, and the interval from calving to peak milk yield
was smaller for multiparous than for primiparous cows.
114
There was a trend (P=0.08) for a decreased proportion of primiparous
cows with a milk fat to protein ratio greater than 1.5 when beta-carotene was
supplemented (Table 5). There was also a trend (P=0.12) for a decreased
incidence of SCC greater than 200.000 cells/mL for multiparous cows
supplemented with beta-carotene (Table 6). Despite the lack of strong statistical
evidence, the pre-calving supplementation of beta-carotene apparently favored a
lower incidence of ketosis and mastitis.
The supplementation of beta-carotene reduced the time of placenta
release for multiparous cows (Figure 1), reducing the proportion of cows with
retained placenta 12 h post-calving from 29.9% to 21.7%. For primiparous cows,
in which the proportion of cows with retained placenta was 15.4%, beta-carotene
supplementation did not determine placenta release (Figure 2), suggesting that
the supplementation was effective only when the incidence of the disorder was
high.
The supplementation of beta-carotene did not determine the proportion
of cows pregnant at 1st service, and at 90 or 150 days of lactation, or the
proportion of cows with serum progesterone content above 1 ng/mL at days 21
and 42 post-calving (Tables 5 and 6). In addition, there was no response in the
intervals from calving to 1st estrous (Figures 3 and 4) and from calving to
conception (Figures 5 and 6). There was an unexpectedly trend for multiparous
cows supplemented with beta-carotene to have an extended calving to 1st service
interval (Figure 7), although this interval was similar for primiparous cows
supplemented or not (Figure 8).
Regardless of supplementation, blood beta-carotene content was higher
for cows with improved reproduction and without mastitis (Table 7). There was
also a trend for increased blood beta-carotene content for cows with milk fat to
protein ratio greater than 1.5, and with serum progesterone greater than 1 ng/mL
at 21 and 42 days of lactation (Table 7). The relationship between these variable
115
and blood beta-carotene content was consistent along sampling days, no
treatment by day interaction was detected. No difference in blood beta-carotene
content was observed for cows with or without retained placenta, metritis, or
difficult calving (Table 7).
4. DISCUSSION
The lower content of beta-carotene in blood at Day 0 for primiparous
compared to multiparous cows suggests that heifers were more deficient in this
compound than lactating cows. The farm routinely used some green chop grass
as a source of long fiber for lactating cows, while heifers were fed on silage as
the major feed ingredient. Beta-carotene deficiency may be an issue not only for
lactating animals, but also during the raising phase. Although parity had an
effect on blood beta-carotene content before supplementation begun, content at
Day 0 was similar for both treatments. The onset of active mammary function
quickly eliminated the parity effect on blood beta-carotene content.
Blood beta-carotene content of supplemented cows peaked at Day -15,
two weeks after the start of the supplementation. The mean 3.3 µg/mL content
for supplemented cows was lower than the 7.5 µg/mL content two weeks before
calving of Kaewlamum et al [16]. Those authors supplemented pre-calving cows
with 1 g/d of beta-carotene for six weeks; blood beta-carotene was 3 µg/mL
eight weeks prior to calving (at dry-off), and 6.5 µg/mL with two weeks of
supplementation. The lower blood content value in our study may have been the
result of a shorter duration of the supplementation period or of a
supplementation period that was initiated nearer to the active functioning of the
mammary gland in preparation for the next lactation. However, blood beta-
carotene concentration was lowest immediately after calving in both
experiments, although it was increased by the supplement.
116
The lowest blood beta-carotene content immediately after calving (Day
7) is in agreement with other reports [15,16]. It has been attributed to the uptake
of the compound by the mammary gland for colostrogenesis, specially during
the last week of gestation [8,21,22]. The oxidation of beta-carotene by an
increased oxidative stress and the physiological decay in dry matter intake
immediately around calving may also contribute to this observation [23].
The supplementation of beta-carotene prior to calving did not determine
milk yield in early lactation. Similar response has been observed by another
[24]. However, Aréchiga et al [11] reported an increase in milk yield when cows
under heat stress were supplemented with beta-carotene from day 15 post-
partum up to 170 days in lactation. Oldham et al [25] also observed a trend for
increased milk yield when cows were supplemented with beta-carotene before
(75 days) and after (42 days) calving. These results suggest that to elicit a
positive milk yield response to beta-carotene, the supplementation may need to
be done in early lactation. However, we observed a trend (P=0.09) for increased
milk protein content for cows supplemented with beta-carotene. The mechanism
for this response in unclear, although it may deserve consideration, since the
magnitude of the response for multiparous cows was similar to the response to
methionine supplementation (26,27), around 0.1 milk protein percentage units.
A trend (P=0.08) for decreased proportion of primiparous cows with a
milk fat to protein ratio greater than 1.5 was observed in response to beta-
carotene supplementation. It suggests that the supplement may have had a
beneficial effect on the incidence of ketosis in first lactation [20]. Although
previous studies have not detected differences in plasma non-esterified fatty
acids and glucose in response to beta-carotene supplementation before calving
[24,28], the large numerical difference in the frequency between supplemented
and Control cows (22.6% vs. 6.4%) suggests that this finding may deserve
further evaluation. A trend (P=0.12) for decreased proportion of multiparous
117
cows with SCC greater than 200,000 cells/ml in response to beta-carotene
supplementation was also observed. Bian et al (29) and Wang et al (24) also
observed positive effects of beta-carotene supplementation before calving on the
incidence of mastitis in dairy cows. Beta-carotene acts as an antioxidant and can
improve immune function [8,9]. Despite the lack of strong statistical evidence,
the pre-calving supplementation of beta-carotene apparently favored a lower
incidence of ketosis and mastitis.
A positive effect of the supplement on immune function is also indicated
by the reduction for multiparous cows in the momentum post-partum of placenta
release. Michal et al [9] detected an improvement in phagocytic activity and
killing ability of blood neutrophils and a higher blood lymphocyte proliferation
in response to mitogenic agents in dairy cows supplemented with beta-carotene
before and after calving, translated in a lower incidence of retained placenta and
metritis. However, primiparous cows that had a lower incidence of retained
placenta than multiparous (15.4% vs. 25.8%), also had lower blood beta-
carotene content at Day 0 and similar content immediately before calving,
emphasizing the multifactorial nature of the disorder, certainly not determined
only by the content of beta-carotene in blood.
Despite the reduction in placenta retention, treatments did not determine
uterine health and time of first ovulation. The pre-calving supplementation of
beta-carotene was only capable of affecting a response variable event occurring
at calving (placenta release), or the therapeutic procedures adopted by the farm
was capable of masking a treatment effect on reproductive tract status. An
increase in plasma hydroxyproline concentration, suggestive of a more complete
uterine involution [16], and a decreased incidence of puerperal metritis in cows
with retained placenta [17], have been reported in response to the pre-calving
supplementation of beta-carotene.
118
The supplementation of beta-carotene did not determine the intervals
from calving to first estrous and from calving to conception, neither the
proportion of cows pregnant at first service, and at 90 or 150 days of lactation,
or the proportion of cows with plasma progesterone content above 1ng/mL at
days 21 and 42 post-calving. The similarity in the duration of the interval from
calving to first detected estrous suggests that the supplement did not induce gain
in estrous behavior. Kaewlamum et al [16] also did not detect a favorable
response in reproductive performance of dairy cows to the pre-calving
supplementation of beta-carotene. The supplementation of beta-carotene post-
calving may be required to elicit an increase in plasma levels in early lactation,
possibly inducing a positive response in reproductive performance. The
supplementation of dairy cows with beta-carotene has improved the pregnancy
rate when it was performed for at least 90 [11] or 105 [12] days post-partum.
Although there was no detectable effect of the pre-partum
supplementation of beta-carotene on conception rate, cows that conceived at 1st
service, and were pregnant at 90 and 150 days had higher blood beta-carotene
content than non-pregnant cows. Cows with serum progesterone content greater
than 1 ng/mL at 21 and 42 days also had higher blood concentration of beta-
carotene than cows showing no luteal function. Kawashima et al [18] also
showed a positive relationship between plasma beta-carotene content before
calving and ovulation in early lactation. Cows with low SCC also had higher
blood beta-carotene than cows with SCC greater than 200,000 cells/mL. Chew et
al [30] reported a negative relationship between California Mastitis Test scores
and plasma beta-carotene content in dairy cows. These results suggest that beta-
carotene may indeed have a role in immune related diseases and fertility in dairy
cows. High blood beta-carotene content was also related to increased milk fat to
protein ratio, suggesting that increased body fat mobilization increased beta-
carotene content in blood [31,32].
119
120
5. CONCLUSIONS
The supplementation of beta-carotene before calving increased blood
content around calving, but the response decreased with the advance in days of
lactation. Multiparous cows supplemented with beta-carotene had a lower
incidence of retained placenta. There was no detectable response in milk yield or
reproductive performance. Beta-carotene supplementation both before and after
calving may be required to elicit pronounced responses in reproduction,
performance, and health of dairy cows.
121
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125
Table 1. Number of observations used for analysis of response variables on treatments Control and Beta-carotene, for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows.
Control Beta-carotene
Prim Mult Prim Mult
Calving to 1st estrous 33 97 33 91
Calving to 1st service 31 94 29 87
Calving to conception 31 94 29 87
Colostrum density 31 95 26 97
Conception at 1st service 30 84 28 74
Day of peak 30 69 29 70
Difficult calvings 32 107 33 106
Linear SCC 33 95 32 89
Mastitis 33 95 32 89
Metritis 31 94 31 87
Milk 30 69 29 70
Milk %Fat/%Prot 31 89 31 84
Milk Fat% 31 89 31 84
Milk Protein% 31 89 31 84
P4>1ng/mL at 21d 23 86 29 83
P4>1ng/mL at 42d 28 83 31 78
Peak 30 69 29 70
Blood beta-carotene, day 0 33 109 33 108
Blood beta-carotene, day -15 20 41 18 46
Blood beta-carotene, day 56 29 75 31 73
Blood beta-carotene, day 7 30 95 32 103
Pregnancy at 150d 31 94 29 87
Pregnancy at 90d 33 98 33 91
Time post-calving of placenta release 33 107 32 106
126
Table 2. Proportion of cows with blood beta-carotene content High (>=3.5 µg/mL), Intermediate (>=2 to <3.5 µg/mL) or Low (<2 µg/mL) at Days 0 and -15 pre-calving, and at Days 7 and 56 post-calving, on treatments Control or Beta-carotene.
Control Beta-carotene Est1 SE2 95% CI3 P
Day 04
High 28.2 29.1 -0.04 0.26 -0.56 0.47 0.87
Intermediate 66.9 64.5 0.10 0.25 -0.39 0.60 0.68
Low 4.9 6.4 -0.27 0.52 -1.33 0.74 0.60
Day -155
High 4.92 48.4 -2.93 0.65 -4.41 -1.80 <0.01
Intermediate 49.2 45.3 0.83 0.37 0.12 1.57 0.02
Low 45.9 6.3 2.68 0.59 1.62 3.98 <0.01
Day 7
High 0.8 5.2 -1.91 1.08 -4.85 -0.17 0.08
Intermediate 23.2 45.9 -1.03 0.27 -1.58 -0.51 <0.01
Low 76.0 48.9 1.20 0.27 0.67 1.74 <0.01
Day 56
High 3.8 9.6 -0.98 0.61 -2.30 0.15 0.11
Intermediate 59.6 63.5 -0.16 0.29 -0.72 0.40 0.57
Low 36.5 26.9 0.45 0.30 -0.14 1.04 0.14 1Parameter estimate generated with the GENMOD procedure of SAS using logistic regression for binomial data. Control is zero. 2Standard error of the estimate. 3Profile likelihood 95% confidence intervals. 429.1±6.9 days pre-calving. 515.0±2.4 days pre-calving.
127
Table 3. Blood beta-carotene content (µg/mL) at Days 0 and -15 pre-calving, and at Days 7 and 56 post-calving, for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows on treatments Control or Beta-carotene.
Control Beta-carotene SEM Parity1 Treat1 Parity x
Prim Mult Prim Mult Treat1
Day 02 2.71 3.33 2.73 3.19 0.113 0.01 0.59 0.52
Day -153 2.51 2.73 3.19 3.33 0.283 0.51 <0.01 0.71
Day 7 1.55 1.71 2.02 2.08 0.104 0.32 <0.01 0.64
Day 56 2.26 2.29 2.38 2.54 0.094 0.30 0.06 0.50 1Probability values for the effects of parity, treatment and the interaction of parity and treatment. 229.1±6.9 days pre-calving. 315.0±2.4 days pre-calving.
128
Table 4. Milk somatic cell score, colostrum density, and milk yield and solids content for primiparous (Prim) and multiparous (Mult) cows on treatments Control or Beta-carotene.
Control Beta-carotene SEM Parity1 Treat1 Parity x
Prim Mult Prim Mult Treat1
Linear SCS2, 1 to 9 2.18 3.43 2.31 3.09 0.334 <0.01 0.77 0.50
Colostrum density, g/L 1056 1056 1053 1057 1.9 0.30 0.54 0.31
Milk %Fat/%Prot 1.25 1.34 1.19 1.32 0.042 0.01 0.44 0.65
Milk Fat, % 3.65 3.78 3.54 3.87 0.109 0.04 0.95 0.38
Milk Protein, % 2.94 2.85 2.97 2.95 0.037 0.12 0.09 0.36
Milk 3, kg 3105 3667 3104 3522 71.2 <0.01 0.32 0.33
Peak4, kg 45.5 53.5 46.7 52.9 0.93 <0.01 0.79 0.34
Day of peak5, d 75.3 61.9 71.3 68.0 3.65 0.03 0.78 0.18 1Probability values for the effects of parity, treatment and the interaction of parity and treatment.2Linear somatic cell score. 3Milk yield from days 20 to 109 of lactation. 4Maximum daily yield. 5Day of the maximum yield.
129
Table 5. Proportion of health and reproductive events for primiparous cows on treatments Control or Beta-carotene.
Control Beta-carotene Est1 SE2 95% CI3 P
Difficult calvings, % 18.8 24.2 -0.33 0.61 -1.56 0.86 0.59
Mastitis4, % 12.1 15.6 -0.29 0.72 -1.78 1.13 0.68
Metritis5, % 6.5 9.7 -0.44 0.95 -2.52 1.43 0.64
Milk %Fat/%Prot > 1.56, % 22.6 6.4 1.44 0.84 -0.08 3.40 0.08
P4>1ng/mL at 21d7, % 21.7 13.8 0.55 0.74 -0.90 2.07 0.46
P4>1ng/mL at 42d7, % 35.7 29.0 0.31 0.56 -0.79 1.42 0.58
Conception at 1st service, % 50.0 42.9 0.29 0.53 -0.75 1.34 0.59
Pregnancy at 90d8, % 42.4 39.4 0.13 0.50 -0.86 1.12 0.80
Pregnancy at 150d8, % 60.6 57.6 0.13 0.50 -0.86 1.12 0.80 1Parameter estimate generated with the GENMOD procedure of SAS using logistic regression for binomial data. Control is zero. 2Standard error of the estimate. 3Profile likelihood 95% confidence interval. 4Cows with SCC > 200,000/mL at first test 30.1±8.3 days post-calving. 5Purulent secretion or presence of liquid in uterus at ultrasound exam 40.8±9.7 days post-calving. 6Ratio of milk fat content to milk protein content at first test 31.3±9.6 days post-calving. 7Blood progesterone content > 1ng/mL at 21 and 42 days post-calving. 8Cows pregnant at 90 and 150 days post-calving.
130
Table 6. Proportion of health and reproductive events for multiparous cows on treatments Control or Beta-carotene.
Control Beta-carotene Est1 SE2 95% CI3 P
Difficult calvings, % 25.2 18.9 0.37 0.33 -0.28 1.04 0.26
Mastitis4, % 38.9 28.1 0.49 0.32 -0.12 1.12 0.12
Metritis5, % 31.9 35.6 -0.17 0.31 -0.79 0.45 0.60
Milk %Fat/%Prot > 1.56, % 29.2 30.9 -0.08 0.33 -0.73 0.56 0.80
P4>1ng/mL at 21d7, % 17.4 25.3 -0.47 0.38 -1.23 0.27 0.21
P4>1ng/mL at 42d7, % 33.7 38.5 -0.21 0.33 -0.85 0.44 0.81
Conception at 1st service, % 27.4 33.8 -0.30 0.35 -0.99 0.38 0.38
Pregnancy at 90d8, % 28.2 28.2 -0.04 0.34 -0.71 0.63 0.91
Pregnancy at 150d8, % 40.0 40.9 -0.04 0.30 -0.63 0.55 0.90 1Parameter estimate generated with the GENMOD procedure of SAS using logistic regression for binomial data. Control is zero. 2Standard error of the estimate. 3Profile likelihood 95% confidence interval. 4Cows with SCC > 200,000/mL at first test 27.3±8.1 days post-calving. 5Purulent secretion or presence of liquid in uterus at ultrasound exam 39.7±8.5 days post-calving. 6Ratio of milk fat content to milk protein content at first test 29.6.4±8.3 days post-calving. 7Blood progesterone content > 1ng/mL at 21 and 42 days post-calving. 8Cows pregnant at 90 and 150 days post-calving.
131
Table 7. Blood beta-carotene content (µg/mL) at 7 and 56 days post-calving according to events (+ = occurrence; - = nonoccurrence).
Day 7 Day 56
+ - + - SEM Event1 Day1 Event*Day1
Difficult calvings 1.84 1.93 2.42 2.39 0.083 0.48 <0.01 0.36
Retained placenta 1.87 1.90 2.33 2.38 0.082 0.66 <0.01 0.92
Milk %Fat/%Prot > 1.52 1.96 1.90 2.55 2.31 0.091 0.13 <0.01 0.37
Metritis3 1.89 1.88 2.36 2.36 0.080 0.99 <0.01 0.91
Mastitis4 1.67 1.96 2.08 2.44 0.080 <0.01 <0.01 0.69
P4>1ng/mL at 21d5 2.14 1.84 2.39 2.34 0.092 0.07 <0.01 0.20
P4>1ng/mL at 42d5 2.02 1.82 2.40 2.32 0.081 0.10 <0.01 0.49
Conception at 1st service 2.01 1.84 2.53 2.28 0.079 0.01 <0.01 0.56
Pregnancy at 90d6 1.96 1.85 2.48 2.25 0.081 0.01 <0.01 0.79
Pregnancy at 150d6 2.05 1.82 2.49 2.30 0.079 0.04 <0.01 0.44 1Probability values for the effects of event, day, and the interaction of event and day. 2Ratio of milk fat content to milk protein content at first test 31.3±9.6 days post-calving.
3Purulent secretion or presence of liquid in uterus at ultrasound exam 40.1±9.2 days post-calving.4Cows with SCC > 200,000/mL at first test 29.1±8.3 days post-calving. 5Blood progesterone content > 1ng/mL at 21 and 42 days post-calving. 6Cows pregnant at 90 and 150 days post-calving.
132
Figure 1. Survival curve for time post-calving of placenta release for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 392min (340 to 440) for Beta-carotene and 490min (395 to 540) for Control. LogRank P=0.05 and Wilcoxon P=0.04.
133
Figure 2. Survival curve for time post-calving of placenta release for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 388min (285 to 440) for Beta-carotene and 375min (290 to 425) for Control. LogRank P=0.87 and Wilcoxon P=0.86.
134
Figure 3. Survival curve for calving to 1st estrous for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 38d (34 to 43) for Beta-carotene and 44d (37 to 50) for Control. LogRank P=0.55 and Wilcoxon P=0.23.
135
Figure 4. Survival curve for calving to 1st estrous for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 39d (33 to 51) for Beta-carotene and 34d (30 to 43) for Control. LogRank P=0.34 and Wilcoxon P=0.42.
136
Figure 5. Survival curve for calving to conception for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). LogRank P=0.82 and Wilcoxon P=0.75.
137
Figure 6. Survival curve for calving to conception for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median was 125d for Beta-carotene and 97d for Control. LogRank P=0.77 and Wilcoxon P=0.65.
138
Figure 7. Survival curve for calving to 1st service for multiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 70d (65 to 79) for Beta-carotene and 64d (61 to 70) for Control. LogRank P=0.09 and Wilcoxon P=0.07.
139
Figure 8. Survival curve for calving to 1st service for primiparous cows on treatments Control (�) or Beta-carotene (�). Median and 95% confidence interval were 65d (56 to 69) for Beta-carotene and 61d (57 to 67) for Control. LogRank P=0.73 and Wilcoxon P=0.87.
