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AMOSTRAGEMAMOSTRAGEMIMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO

ENCONTRO ABRASP

30 out 2013

T&E Analítica Flávio Leite

Laboratório de Análises Químicas

Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – BrasilFone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128

teanalitica@teanalitica.com.br www.teanalitica.com.br

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BOCA/ESÔFAGO

ESTÔMAGO

DUODENO

JEJUNOCOLON

TRANSVERSO

COLONASCENDENTE

ÍLEO COLONDESCENDENTE

INTESTINODELGADO

INTESTINOGROSSO

pH= entre 5 - 6pH= jejum alim 4,9 5,2 6,1 5,4 6,3 5,1 6,4Médio e Distal pH= jejum alim

4,,4 - 6,5 5,2 - 6,0 6,6 6,2

pH= jejum alim 6,5 6,8 - 7,8

6,8 - 8,0 6,8 - 8,0 7,4 7,5

pH= entre 1 - 3,5

Apr

oxim

adam

ente

6 m

etro

s de

com

prim

ento

MEIOS SISTÊMICOS BIOLÓGICO – pHs – via oral

Ref.: Michael E.AultoN 2ª EDIÇÃO DELINEAENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS

Temperatura 37ªC

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É quando um composto sofre alteração estrutural para compostos menores ou maiores, mais estáveis em determinada condição de temperatura e pressão.:

REAÇÕES DE DECOMPOSIÇÃO (Análise)

Quando um composto exposto de forma natural a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade

REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO

Quando um composto é exposto de forma forçada a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade

DECOMPOSIÇÃO E DEGRADAÇÃO

PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO

A espécie final formada, pode ser produto de várias reações. A espécie estável final está em função do conjunto de energias aplicadas.

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IMPUREZAS DA ROTA QUÍMICA OU IMPUREZAS RELATADASResíduos de solventes utilizados na fabricação e presença de metais/semi/ametais. Produtos de reações secundárias. Impurezas intrínsecas à matéria-prima.

IMPUREZAS

IMPUREZAS DE DECOMPOSIÇÃOGeradas pela instabilidade natural do compostos. Geradas, após a composição earmazenamento do produto final (contato embalagem, contato insumos, temperaturade armazenamento). Geradas nos meios sistêmicos do organismo biológico.

IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃOGeradas após exposição em situação de estresse.

ENSAIO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA

Elaborado para o estudo de NOVOS FÁRMACOS E ESTABILIDADE

Pesquisa: Interferência de Potência e ou natureza genotóxicas.

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ANVISA OBJETO LOCALIZADORESPÉCIE DE ESTRESSSE

Lim: Not-Id-QtICH (10-30%)

INTENSIDADE ESTRESSANTE "IN VIVO"

RE 899, de 29/05/2003

Validação de Métodos

Item2- Especificidade e

Seletividade - 2.1.2

Não define Não traz no corpo da norma

Não define Não define

IT 1 de 15/07/2008

Esclarecimento da RE 1 de 29/07/2005

Toda a IT 1 temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos

Traz no corpo da IT

60°C;75%UR; HCl e NaOH 0,1N;

H2O2 3% ; UV-B; Fe2 ou Cu2

0,05M

Não define

C P 11, de 23/01/2012

Impurezas Degradação

Toda a CP 11 temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos

Traz no corpo da CP

Não define Art.8 §5 Toxici e Genotoxi

RDC 45 de 09/08/2012

Estabilidade de Insumos Farmacêuticos

Seção VIII art.36-39

temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise

Não traz no corpo da norma

Não define Não define

IMPUREZAS – PUBLICAÇÕES ANVISA

ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Requisitos para IMPUREZAS EM NOVOS MEDICAMENTOS - várias públicações: QA/QB/QC/QD e Guide Lines

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ICH - IMPURITIES IN NEW DRUGSUBSTANCES – Q3A(R2) oct/2006

Notificação – Identificação - Qualificação

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ICH- ÁRVORE PARA IDENTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO - Q3A(R2) oct/2006 New Drugs Products - NOVOS MEDICAMENTOS

É impureza com limite superior de Identificação

Sem ação

Sem ação

EstruturaIdentificada?

Reduzir para não mais que

o limite deIdentificação?

Sem novasmedidas

Algum conhecimentode risco relevante ao ser humano?

Reduzir Limitede segurança

Reduzir para não maisque o limite deQualificação?

Maior que o limite de

Qualificação?

Considere a população de pacientes e duração de uso e considerar a realização de: a) Os estudos de genotoxicidade (mutação de ponto, aberração cromossômica)b) Estudos toxicidades gerais (uma espécie, geralmente

14 a 90 dias)c) Outros parâmetros de toxicidades específicas. (conforme o caso).

Algum efeitoadverso clínicorelevante?

Reduzir Limitede segurança

Qualificado

sim

não

sim

sim

sim

sim

sim

sim

não

não

nãonão

não

não

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USO DE ESTRESSANTES PELA CP 11

ESTRESSAR:- Matéria prima do ATIVO que compõe o formulado- Placebo do formulado- Produto formulado ou acabado

ESTRESSANTES:

1- Aquecimento2- Umidade3- Solução Ácida4- Solução Básica5- Solução Oxidante6- Exposição Fotolítica7- Ions metálicos

DEFINIÇÃO PARA O STRESS:

Degradar de 10 a 30% do ATIVO

Dificuldades:- Parar a reação e manter o equilíbrio- Isolar a impureza- Quantificar/Identificar a impureza - Genotoxi (principalmente pela qdade)

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∆H

ENERGIA DE ATIVAÇÃOLuminosidade/Ausência de LuzResfriamento-AquecimentoMetais ou sais – Ácidos-BasesOxigênio / EnzimasHidratação/DesidrataçãoReações secundáriasRadiação Ionizante e N.IonizanteOutras possíveis Caminho da reação

Caminho da reação

ENERGIA DE ATIVAÇÃO

Toda reação química para acontecernecessita de energia. Esta energia edenominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO

Caminho da reação

Reag Prod

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REAÇÕES QUÍMICAS

ESCALA MACRO São reações que ocorrem em previsão para concentrações acima de 1% em massa ou volume.

H+

Ácido Oleico (c/impurezas) + Metanol (c/impurezas) Oleato de Metila + Água + impurezas (a.palmítico, (etanol, (palmitado e esteárico, formol, estearato/ C4,C6, etc) a.fórmico,etc metila e etila)

ESCALA MICRO São reações que ocorrem de forma secundária e nem sempre previstas dentro dos parâmetros teóricos da química reacional. Material orgânico em decomposição + cloro CH4 + Cl2 várias possibilidades

IMPUREZA DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO Podem ocorrer na escala MACRO como na escala MICRO, sendo a escala MICRO a mais complexa para identificação e quantificação.

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REAÇÕES E MECANISMOS DAS REAÇÕES

Mecanismos: - homolítico, heterolítico, pericíclico[ - nucleófilo, eletròfilo

Reações: - adição, substituição, eliminação - salificação, esterificação, - oxidação branda, exaustiva e combustão - redução , polimerizaçãoFormação de Cadeias Carbônicas:

- normal e ramificada - aromática - cíclica normal e ramificada- alicíclica normal e ramificada- alquil /aromática/ciclica/alicíclica

Considerando as moléculas da Farmacêutica, para alterar o equilíbrio do meio a a seguinte matriz deve ser olhada para o interferente e produto:

Fator 1- Concentração (quanto menor , maior deve ser Fator 2 e ou Fator 3)

Fator 2-Tempo de contato

Fator 3 - Energia aplicada (agitação, temperatura, radiação, etc)

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0,01

1

,0

3,

0

5,0

10

1

5 100 30 20 15 10 5 2

0

1 2 3 4 5 6 7 8 10

Inte

nsid

ade

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ante

tempo

% degradação “observada”

0,01

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te +

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tempo

% degradação “observada”

AÇÃO DE ESTRESSANTE ÚNICO E COMBINADO - Previsão

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Considerando o Produto acrescido de Estressante

1 - Pode resultar em precipitações ou solubilizações na solução do produto,

2 - Pode ocorrer polimerizações,

3 - Pode alterar as estruturas e não “aparecerem” na condição analítica (principalmente nas reações com NaOH e HCl),

4 - Pode ocorrer alteração de cor, que dificultará a análise na condição analítica,

5 - Extração com solvente, pode-se supor que a impureza não seja extratível e ou ainda gerar IOV,

6 - Interações do tipo excipiente-excipiente ; ativo-excipiente ; embalagem

7- Reações conhecidas da química, como oxidação de aldeídos a alcoóis, hidrólise de ésteres, adições, quebras, etc

PREVISÕES DE REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO

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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO PARA METAIS, SEMI-METAIS E AMETAIS

Em casos que a alteração do número de oxidação é de fundamental importância na aplicação.

Exemplo 1: o antimônio utilizado no tratamento da “úlcera de Bauru”, no qual a mudança do número de oxidação do antimônio resultada em dor elevada quando ministrado na formainjetável muscular. Exemplo 2: aplicação sobre complexos metálicos, na relação: quelato / não quelato

ANÁLISE DE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO POR OUTRAS TÉCNICAS

Nem todas as técnicas permitem análise de impurezas de degradação

Exemplo 1: Volumetria, colorimetria, potenciometria, absorção a luz ultravioleta e visível, infravermelho, etc..Exemplo 2: Compostos que possuem sua quantificação por métodos microbiológicos,

SOBRE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO

Técnicas separativas: HPLC e CFG em seus detectores

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Agentes estressantes

Área=1000

LB

Área=700

Área= 300

Área= 650

Área= 1000

Área=1200LC-UV/VisGC-FIDMat.prima ou

Placebo ouFormulado

Sistema Físico de Separação – ALTERAÇÃO DO SINAL

Submeter um produto a estressantes pode alterar o sinal analítico da espécie emanálise para aquele sistema de detecção.

As alterações podem resultar em diferentes interpretações. As justificativas podemser dirigidas para fenômenos Químicos e ou Físicos.

Área= 700

Não visívelaquele detectpr

ANÁLISECondição Analítica : análise sem validaçãoMétodo: análise com validação

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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

Placebo

Prod.Acabado

Prod.Acabado+Es

Estressante

M.Prima

M.prima+Es

Placebo+Es

LB

LB

LB

LB

LB

LB

LB

Para as análises no estudo de ID o cuidado com o equipamento é importante,não apenas aos danos materiais, mas às falsas interpretações de resultados.

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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO

Duas situações são colocadas para as ImpurezasPRESENTES ou INDUZIDAS em um fármaco

ANALISANDO COM O MÉTODO/CONDIÇÃO ANALÍTICA (CA) :

Situação 1- a Cond.Analítica utilizada VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse. Situação 2- a Cond.Analítica utilizada NÃO VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse.

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O MÉTODO NÃO VISUALIZA:

Utilizando-se deste método sobre as amostras colocadas sob os efeitos de energia (stress) poderão resultar em espécies que não sejam absorvidas pela LUZ ULTRAVIOLETA, destaforma, o sinal analítico não será percebido e não se pode deduzir que houve impureza.

SITUAÇÃO – 2 – NÃO VISUALIZA

Considerando técnicas separativas: CFG; HPLC, etc

Absorve no UV Absorve no UV NÃO Absorve no UV

Qual direção analítica utilizar? Quantos métodos serâo necessários?

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SISTEMAS DE EXTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO

SPME = Solid Phase Micro Extraction

“Sobre” agulha

Resina Polar; Apolar/Interm. CFG

Líquido

SPE = Solid Phase Extraction

Mistura Líquida

Adsorvente

Demais Componentes

-Analito fica retido -É extraído com solvente em função da polaridade

Extração Líquido/LíquidoExtração Líquido/Vapor)Extração Contra Corrente Extração por Ppdades Coligativas

Cromatografia PreparativaCromatografia de Camada DelgadaCromatografia de Coluna SPE - SPME - SBE

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CC e CCD (TLC)

Cromatografia de Camada Delgada

Cromatografia de Coluna

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HPLC PREPARATIVA

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DE FORMA BEM SIMPLIFICADAESPECTROMETRIA DE MASSAS - Determina fragmentos e Peso MolecularINFRA VERMELHO - Determina grupos funcionais RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR - Determina posições na Cadeia CarbônicaABSORÇÃO AO ULTRA-VIOLETA - Determina a presença de insaturaçõesCC e CCD - Determinações da Química ClássicaICP (Inductively Coupled Plasma) - Determina metais/ametais/semi-metaisACOPLAMENTOS - LC/MS; LC/MSMS; GC/MS ; MIC/IV; LC/TOF; LC/PDA

F-X (Fluorescência X) - Determina metais/semi-metaisRAIO-X - DIFRAÇÃO - Determina Polimorfismo/Estrutura cristlinaMICROSCOPIA - Determina: Polimosfismo/Tamanho de PartículaMEV/EDS - Determina análise elementar ANÁLISE ELEMENTAR (CHNSO) - Determina a composição CentesimalABSORÇÃO AO VISÍVEL - Determina a presença de cromóforosCOLORIMETRIA - Determinações da Química ClássicaAED (Detector de Emissão Atômica) - Determina composição centesimalANÁLISE TÉRMICA ATD/ATG - DSC - Determina decomposição da molécula; polimorfismo

ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA

Caso um proposta é obtida: o nome atribuído a impureza pode não ser comparado aos nomes existentes no mercado. (se houver)

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ENSAIOS FARMACÊUTICOS PARA TOXICIDADE GENÉTICA

ANVISA : - RE 90- de 16 de março de 2004: “Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos” - Ofício Circular no 002/2009/GGTOX) Gerência Geral de Toxicologia Brasília 08/09/2009

- GUIA PARA A CONDUÇÃO DE ESTUDOS NÃO CLÍNICOS DE SEGURANÇA NECESSÁRIOS AO DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS - Gerência de Avaliação de Segurança e Eficácia - GESEF

Neles incluem-se: - toxicidade aguda - toxicidade de doses repetidas (longa duração) - estudo especial - Genotoxicidade

Aqui Apresentados:

1- TOXICIDADE : Daphnia 2- TOXICIDADE : DL 50 e CL 503- MUTAGENICIDADE : Ensaio de AMES4- MUTAGENICIDADE : Ensaio Micronúcleo

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1- O ensaio de toxicidade só é possível com o isolamento da(s) espécie(s), o que é complexo, para ter massa suficiente para a identificação/quantificação e suficiente para toxicidade.

Obs.: Uma substância testada em toxicidade isolada, pode não ser tóxica quando no formulado

TOXICIDADE/GENOTOXICIDADE

Genotoxicidade não e uma medida de Carcinogenicidade (Indicador para o câncer)

Mutagenicidade mede evento inicial ou intermediário do processo de tumorigenese

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O ensaio consiste básicamente na exposição do microcrustáceo de água doce Daphnia magna em diferentes condições, visando assim a detectar seus efeitos letais e/ou subletais em estudos de avaliação de toxicidade

TOXICIDADE AGUDA POR DAPHNIA

O Ensaio:- para cada concentração observa-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos indivíduos após o

período de exposição de 24 e 48 horas, encerrando o teste após 48 horas.

Resultados:Porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade / quantidade de indivíduos no início do ensaio

Quanto maior a porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade dos indíviduos no tempo do ensaio, maior a toxicidade

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A morte é universal: Todas as drogas são capazes de causar a morte. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados em determinado período de tempo é denominada de dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT).

TOXICIDADE - DL 50 ( Dose Letal Média)

Algumas substâncias já possuem literatura quanto a degradação e toxicidade destas impurezas. O ácido ascórbico tem sua degradação em 10% em massa inicial da seguinte forma:

Vamos parar de consumir laranja, acerola, entre outras fontes da Vit C? ?

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O ensaio de AMES , determina mutagenicidade utilizando de Cepas (estirpes) Salmonella typhimurium. O ensaio mede a indução de mutações reversas em cepas

auxotróficas (His-) para o aminoácido Histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem).

MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE AMES

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O teste do micronúcleo, sendo um teste  citogenético, consiste na investigação de células  previamente expostas  a  agentes químicos,

com a finalidade de detectar  possíveis aberrações  cromossômicas.

O  teste baseia-se num  aumento da  freqüência de  eritrócitos policromáticos com micronúcleos, utilizando-se  para  isso, preferencialmente, células de mamíferos (medula óssea ou sangue periférico de animais  devidamente tratados. (camundongos machos e jovens).

Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: grupo controle negativo, grupo-controle positivo (administra-se  substância reconhecidamente indutora de mutagênese p.ex

ciclofosfamida 50mg/Kg) e grupo-teste (administra-se a substância teste ). 

Quantidade de coletas em tempos máximos determinados, devem ser rigorosamente observados. Os micronúcleos normalmente são visualizados  usando-se  de diferentes técnicas, entre elas a coloração de Giemsa ou a Fluorescência . A quantificação é por microscopia.

MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE MICRONUCLEO

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ETAPA 1A- BUSCA DA IMPUREZA DE DEGRADAÇÃO CONSIDERANDOENSAIOS TÉCNICA PERTINENTE

(LC-DAD, HPLC-UV/Vis , CFG ou GC/MS)MP Ativo

Tfinal

PLACEBO Tfinal

FORMULADO Tfinal

BRANCO Stressante

Teor Ativo (dupl) ANTES colocar as quantidades (tzero ) *Teor impurezas conhecidas antes Teor do ativo+Imp LUZ - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp UMIDADE - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp-TEMPERATURA - FINAL de cada dia (60oC) Teor do ativo+Imp-OXIDAÇÃO - FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp-HIDRO ÁCIDA- FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp- HIDRO BÁSICA- FINAL 2 conc de cada dia Teor ativo+Imp OXIREDUÇÃO-FINAL,2 conc,2 reagde cada dia Quantificação NOVAS Imp Fator Resposta Ativo ou Área%

Incremento de análises diárias (1 a 20 dias)

TOTAL ANÁLISES=

MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP - 11

Prazo: 10 a 20 dias

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ETAPA 2- ISOLAMENTO IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS

Quantidade de impurezas Impureza por TLC, CC ou LC/Prep

ETAPA 3- PROPOSTA DE IDENTIFICAÇÃO DA IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS

Quantidade de impurezas Impureza por DAD/MS/IV

ETAPA 4- QUANTIFICAÇÃO FATOR RESPOSTA IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS

Quantidade de impurezas Impureza por LC ou GC

ETAPA 5- GENOTOXICIDADEENSAIOS PROVÁVEIS

Quantidade de Impurezas DL 50 Daphineas AMES Micronuclideo Outros métodos

Prazo: 20 a 50 dias

Prazo: 10 a 30 dias

Prazo: 5 a 15 dias

Prazo: 3 a 12 meses

MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP 11

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PRINCIPAIS REFERÊNCIAS

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OBRIGADO

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