Técnica de Cromatografia.docx

8/13/2019 Tcnica de Cromatografia.docx

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Tcnica de CromatografiaNormalmente trabalhamos em laboratrio com substncias

quimicamente puras. Entretanto, muitas vezes os reagentes ousolventes utilizados contm impurezas. Por outro lado, as reaesqumicas geralmente produzem misturas mais ou menos complexas

de produtos, os quais devem ser separados e purificados.Muitos so os mtodos existentes para a purificao e

separao dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidospodemos citar a catao, a dissoluo/cristalizao/ recristalizaofracionada, a extrao, a destilao e a sublimao. Esses mtodosso muito teis, sendo largamente empregados em laboratrios e emindstrias com resultados satisfatrios. No entanto, esses mtodosno so eficientes quando os componentes da mistura possuemconstantes fsicas muito semelhantes, isto , pontos de fuso ouebulio prximos, solubilidade semelhante, etc. A cromatografia

permite resolver este problema.A cromatografia um mtodo de separao desubstncias baseado na distribuio seletiva dos diferentescomponentes de uma mistura entre duas fases imiscveis.

Os mtodos cromatogrficos permitem separar os componentesde uma mistura, baseados na migrao seletiva e diferencial dossolutos atravs de um sistema constitudo de duas fases: umaestacionria (ou fixa) e outra fluida (ou mvel). A fase estacionria denominada adsorvente e a fase mvel o eluente. Adsoro acapacidade de uma substncia (o adsorvente) de deter ou concentrar

seletivamente sobre a sua superfcie gases, lquidos ou slidos, quepodem ser arrastados pelo eluente.A cromatografia muito utilizada para anlise, separao e

purificao de produtos naturais, tais como antibiticos, vitaminas,hormnios, corantes, entre outros, tanto emlaboratrio quanto emescala industrial. Seu uso mais conhecido, no entanto, o da anlise,localizao e identificao de microgramas de substncias em meiosbiolgicos (por exemplo, em exames "anti-doping" e de medicinalegal). Em laboratrios de sntese orgnica muitoutilizada noacompanhamento de reaes e na purificao de substncias.

Os principais procedimentos cromatogrficos so os seguintes:cromatografia em papel, emcamada delgada, em coluna, em fasegasosa, em fase lquida, e cromatografia por excluso de tamanho(GPC).

Cromatografia em papelEsta tcnica cromatogrfica assim chamada porque utiliza

para a separao e identificao das substncias ou componentes damistura a migrao diferencial sobre a superfcie de uma tira de papelfiltro de qualidade especial. Este tipo de cromatografia de execuomuito simples e necessita quantidades muito pequenas dassubstncias para a realizao da anlise. A amostra aplicada a uma


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pequenadistncia da borda inferior de uma tira de papel filtro. Aseguir, a tira colocada em contato com o eluente escolhido,cuidando para que o mesmo no entre em contato direto com aamostra e permitindo que o mesmo molhe o papel, subindo porcapilaridade. Ao subir, o eluente arrasta seletivamente os

componentes da mistura, os quais podem ser identificados porvisualizao direta (caso sejam coloridos) ou pela utilizao dereveladores adequados.A cromatografia em papel um mtodo muito til para separarsubstncias muito polares como os acares e os aminocidos. Possuio inconveniente de s permitir a separao de pequenas quantidadesdas misturas de cada vez.

Cromatografia em camada delgada (CCD)A cromatografia em camada delgada uma tcnica

cromatogrfica muito parecida com a realizada em papel, porm queconduz a resultados muito mais eficientes e perfeitos de separao. uma tcnica simples, barata e muito importante para a separaorpida e anlise qualitativa de pequenas quantidades de material. Ela usada para determinar a pureza decompostos, identificarcomponentes em uma mistura comparando-os com padres,acompanhar o curso de reaes pelo aparecimento de produtos oudesaparecimento de reagentes e ainda para isolar componentes purosde uma mistura.

A tcnica consiste em cobrir uma placa de vidro, alumnio ou

plstico, com um adsorventeadequado e com uma granulaoespecial. A espessura da camada varia de 0,1 a 2,0 mm e deve ser amais uniforme possvel. O adsorvente pode ser misturado a umaglutinante (geralmente gesso ou amido), sendo depois suspenso emgua ou outro solvente e depositado uniformemente sobre a placa(manualmente ou por intermdio de aplicadores apropriados).

Ao secar, o adsorvente permanece aderido placa que, emgeral, deve ser ativada poraquecimento em estufa. Atualmente asplacas revestidas com adsorventes podem ser adquiridas prontas.

A revelao e identificao das substncias feita da mesma

maneira que na cromatografia em papel. Possui a vantagem, noentanto, de poder utilizar reveladores mais agressivos, poisseusuporte mais resistente que o papel.

A cromatografia em camada delgada utilizada habitualmenteem anlise qualitativa equantitativa devido sua grande sensibilidadee preciso. Pode ser utilizada, tambm, em escala preparativa paraamostras de at 250 mg. Para quantidades maiores prefere-se acromatografia em coluna, que ser vista mais adiante.

Pela comodidade, rapidez, perfeio e confiabilidade dosresultados esta tcnicacromatogrfica largamente utilizada emlaboratrios clnicos e de controle de qualidade. Em alguns aspectosela perde para a cromatografia gasosa e para a cromatografia lquidade altaeficincia. Estas ltimas, porm, so muito menos acessveis e


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mais dispendiosas e no estoacessveis em qualquer laboratrio ouindstria.

Fator de Reteno (Rf)Um dos aspectos mais importantes de um determinado sistema

cromatogrfico omovimento relativo de um composto em relao

frente do solvente, que uma propriedade caracterstica ereprodutvel. Nas cromatografias em papel e em camada delgada seexpressa este movimento como um valor do fator de reteno Rf(Rate offlow). Este definido como a razo entre a distnciapercorrida pela mancha e a distncia percorrida pelo solventeconforme mostrado abaixo:

Exemplo de cromatograma:


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Esses valores so reprodutveis em condies idnticas de

trabalho (temperatura, solvente eumidade constantes) e servem paracaracterizar e identificar as substncias. A medida feita desde alinha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) at o centro da

mancha em estudo. O valor obtido comparado aos tabelados naliteratura especializada podendo servir paraidentificar a substncia em questo.

Cromatografia em colunaA cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigoprocedimento cromatogrfico. Foi descrito pela primeira vez pelobotnico russo M. S. Tswett que a utilizou para o isolamento dospigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais.

Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida comum adsorvente adequado. A coluna pode ser um tubo simples, abertoem ambas as extremidades, ou semelhante a uma bureta, com umatorneira na parte inferior. O adsorvente pode ser colocado na colunadiretamente (seco) ou suspenso em um solvente adequado(geralmente o prprio eluente a ser usado no processo deseparao).

Os principais adsorventes normalmente utilizados so silicagel,alumina, carbonato declcio, xido de magnsio, carvo ativado,sacarose e amido. Os principais eluentes so o ter de petrleo, ter

etlico, clorofrmio, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, guadestilada ou misturas dos eluentes anteriores.O procedimento consiste em colocar a substncia a ser

separada ou analisada na partesuperior da coluna e o eluente vertido em seguida, em quantidade suficiente para promover aseparao. Em alguns casos pode-se aplicar vcuo na parte inferiorda coluna ou uma leve presso na parte superior, visando acelerar oprocesso de separao. Quando a mistura a ser separada contmsubstncias coloridas, podem-se visualizar diferentes zonas descendopela coluna, de modo a permitir a separao em diferentes fraes.

Quando a amostra no possuir cor recolhem-se vrias fraesiguais do material eludo,testando-as para verificar a presena desubstncias dissolvidas pelo uso de reveladores adequados (luz UV,reveladores qumicos, etc.). comum monitorar a eluio de umacoluna utilizando CCD.

Cromatografia gasosa, HPLC (Cromatografia lquida dealta eficincia) e GPC(Cromatografia de permeao em gel)Estes procedimentos cromatogrficos envolvem o uso deaparelhagem instrumental mais sofisticada. So procedimentoscromatogrficos de uso mais recente, quando comparados aosdemais, e muito difundidos em laboratrios acadmicos e industriais.


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Permitem anlises qualitativas e quantitativas de quantidades muitopequenas de substncias.

PARTE EXPERIMENTAL

Experimento 1. Cromatografia em papel

Corte uma tira de papel especial para cromatografia na medidaadequada para o recipiente a ser utilizado como cmaracromatogrfica, conforme instrues do professor. Desenhe uma linha(com um lpis de ponta fina) a cerca de 2 cm da extremidade da tira(linha base). Sobre esta linha faa duas pequenas marcas comcanetas hidrocor de cores diferentes, distantes uma da outra.Introduza a tira na cmara cromatogrfica contendo um pequenovolume de etanol,com a linha base na parte inferior. Observe que o nvel de solventedeve ficar abaixo da linha.

Deixando a tira na posio vertical, permita que o eluente suba pelatira, de modo a arrastar oscomponentes da tinta das canetinhas. Atira de papel NO DEVE tocar as paredes da cuba. aconselhvelcolocar o eluente escolhido na cuba algum tempo antes de proceder anlise para permitir que o ambiente fique saturado com seusvapores.

Quando a frente de eluente estiver a cerca de 1 cm do final datira retire-a da cmaracromatogrfica e deixe evaporar. Verifique asposies relativas das manchas e determine os valores de Rfde cadapigmento.

OBS:Preparao de uma cuba cromatogrfica:

Cubas contendo os eluentesetanole outrascontendooutroseluentes(gua, acetona, cido actico, acetato de etila,mistura gua + etanol). Pode-se colocar uma tira de papel revestindoas paredes das cubas para melhorar a saturao do ambiente,cuidando para que fique uma janela que permita a visualizao doexperimento.

Experimento 2. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2.1.Preparao de uma coluna coluna cromatogrficaPrepare uma coluna cromatogrfica (tubo de vidro de 5 x 250

mm, afilado em uma das pontas) tapando a extremidade afilada comum pequeno chumao de algodo e preenchendo-acom cerca de 5 gde silicagel 60 (70-230 mesh) seca, ou na forma de uma suspensoem etanol. Neste ltimo caso, cuide para no deixar secar a slica emnenhum momento. A preparao da coluna seca mais rpida,


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porm a possibilidade de formao de vazios maior, diminuindo aeficincia da separao.ATENO: A altura da camada de slica deve ser deaproximadamente 5-7 cm. Evite, portanto, o DESPERDICIO deeluente e de adsorvente.

Coloque, CUIDADOSAMENTE, cerca de 5 gotas da soluo contendoa mistura de corantes na extremidade superior da coluna. Esperealguns instantes para que a amostra penetre na camada deadsorvente, iniciando ento a adio de etanol puro para que seproceda separao dos constituintes da amostra. Recolha asdiferentes fraes em tubos de ensaio, evitando deixar secar acoluna.Terminada a eluio do primeiro corante, o segundo corante pode sereludo utilizando soluo cido actico.

2.2. SEPARAO DOS COMPONENTES DE UMAMISTURADistribua homogeneamente sobre o topo da coluna dealumina, com auxlio de uma pipeta ou conta-gotas, 1 a 3 mL de umasoluo etanlica de alaranjado de metila e azul de metileno. Aps aadsoro pela coluna, proceda a eluio com etanol, vertendocuidadosamente o solvente pelas paredes internas da coluna,tomando cuidado para no causar distrbios ou agitao na coluna.Ao mesmo tempo, abra a torneira para escoar o solvente. Elua todo oazul de metileno com etanol. Elua, primeiro com gua, o alaranjado

de metila retido na coluna e em seguida com uma soluo aquosa decido actico.

Se o mesmo procedimento acima for realizado utilizandoslica gel como fase fixa da coluna. Observe que a ordem deeluio se inverte, isto , o alaranjado de metila sai cometanol enquanto o azul de metileno fica retido na coluna.

QUESTIONRIO:1- Cite os principais tipos de foras que fazem com que os

componentes de uma mistura sejam adsorvidos pelas

partculas do slido:

Formao de sais, coordenao, pontes de hidrognio, dipolo-dipolo,

London (dipolo induzido).

2- Cite as caractersticas do solvente para lavar ou arrastar oscompostos adsorvidos na coluna cromatogrfica:


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O fluxo de solvente deve ser contnuo, os diferentes compostos da

mistura se movero com velocidades diferentes dependendo da

afinidade relativa com o adsorvente e com o eluente (grupos polares

interagem melhor com o adsorvente). Assim a capacidade de umdeterminado eluente arrastar um composto adsorvido na coluna

depende principalmente da polaridade do solvente com relao ao

composto.

3- Fale sobre o princpio bsico que envolve a tcnica de

cromatografia:

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao doscomponentes de uma mistura mistura.

Est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma

mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases

imiscveis: a fase mvel (FM) e a fase estacionria (FE).

Tcnica usada para a separao dos componentes de uma

amostra, os quais se distribuem entre duas fases, uma estacionria e

a outra mvel.

*FASE ESTACIONRIA ESTACIONRIA > Slido ou lquido;

*FASE MVEL > Lquida, gasosa, fluido supercrtico;

Passagem da fase mvel componentes distribudos e retidos

seletivamente pela fase estacionria > MIGRAES DIFERENCIAIS.

O princpio bsico definido pela separao de misturas por

interao diferencial:

maior interao com a Fase Estacionria = maior reteno

menor interao com a Fase Estacionria = Eluio mais rpida

os componentes da mistura so separados em bandas.

6- O que e como calculado o Rf ?

Parmetro usado frequentemente em cromatografia, o Rf definido

como a razo entre a distncia percorrida pela mancha do

componente e a distncia percorrida pelo eluente, ou seja:


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Rf = d1/d2

Onde: Rf o fator de retardamento; d1 a distncia percorrida pela

mancha do componente; e d2 a distncia percorrida pelo eluente.

7- Quais os usos mais importantes da cromatografia de

camada delgada?

A cromatografia em camada delgada usada para determinar a

pureza do composto, identificar componentes em uma mistura

comparando-os com padres, acompanhar o curso de uma reao

pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento de um dos

reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura.A cromatografia em camada delgada uma tcnica simples, de

fcil compreenso e execuo, de baixo custo, apresenta separao

relativamente rpida, verstil, e reprodutvel quando se tem

prtica. Entretanto, como envolve processos manuais, como por

exemplo a preparao da placa e aplicao da amostra, pode causar

erros. Essa tcnica no possui, tambm, boa eficincia em anlise

quantitativa.

8- A alumina, ou xido de alumnio, tem ao bsica e interage

fortemente com espcies cidas; por sua vez, a slica gel

interage com espcies bsicas devido a natureza cida do

xido de silcio. Baseado nessas informaes, explique o

comportamento distinto dos dois corantes empregados

quando se usa alumina ou slica como fase fixa.

Obs: Pesquise a estrutura dos dois corantes.

O azul de metileno, por ser um sal e ser mais polar tem

maiores interaes com a slica do que o alaranjado de metila, sendo

melhor adsorvido por ela.

O azul de metileno um corante orgnico redox fenotiaznico

descoberto por Heinrich Caro em 1876, que inicialmente ganhou


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