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TCNICAS IMUNOLGICAS

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UM TESTE SOROLGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO... Qualitativo: + ou Semi-quantitativo: amostra testada foi diluda a maior diluio que apresentar reao o seu ttulo (ex. + ate a diluio 1:320) Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado. IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnstico ?

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Alguns fatores que afetam as medies das reaes Ag/Ac Afinidade Avidez Taxas Ag-Ac Reaes Cruzadas Anticorpos: Monoclonais Policlonais

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TCNICAS IMUNOLGICAS Tcnicas sem uso de marcadores Reaes de Precipitao Reaes de Aglutinao Tcnicas com uso de marcadores ELISA Citometria de fluxo Imunofluorescncia Radioimunoensaio

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TCNICAS IMUNOLGICAS PRECIPITAO - Imunodifuso dupla - Imunodifuso radial - Imunoeletroforese AGLUTINAO - Aglutinao direta e indireta - Inibio da aglutinao - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA - Imunofluorescncia - Citometria de Fluxo PRECIPITAO X AGLUTINAO

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SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNSTICO

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REAES DE PRECIPITAO ZONA DE EQUIVALNCIA EFEITO PR - ZONA EFEITO PS - ZONA

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IMUNODIFUSO DUPLA Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs) Utiliza uma matriz de gar Ag + Ac = linha de precipitao visvel

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Ac Ag Ac Ag Ac Ag As solues sofrem difuso e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela formao de uma linha de precipitao Pode ser visualizada ps lavagem do gel, para remoo das protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com corante Utilizao da tcnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenas auto-imunes Coloca-se agarose sobre uma lmina: Faz-se em seguida, pequenos orifcios no gel e so adicionadas as solues testes de Ag e Ac, como por exemplo, mostrado abaixo: Ac

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Interpretao Dimetro do anel proporcional concentrao do Ag Mtodo de Mancini Anticorpo no gel Antgeno no poo Vice-versa IMUNODIFUSO RADIAL Ag Concentrao Diameter 2 Ag Ac no gel

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IMUNODIFUSO RADIAL Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas Fcil, baixo custo Utiliza uma matriz de gar quantitativa

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IMUNOELETROFORESE +- Ag 1- Separao de antgenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta canaleta 3- Difuso e precipitao Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag que so separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica. As molculas migram para o plo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas eltricas. Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitao. qualitativo Utiliza lminas recobertas com gar til para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma mltiplo e a macroglobulinemia

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IMUNOELETROFORESE

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REAES DE AGLUTINAO Pode ser direta ou indireta + sensveis qtidade de Ac 500 vezes menor partculas amplificam a reao Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao (semi- quantitativo) Agregao visvel de partculas Eritrcitos Bactrias Fungos ltex USO: Tipagem ABO Testes confirmatrios para sfilis, FR

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2) Reagente (anticorpo anti A, B): AGLUTINAO DIRETA 1) Amostra de sangue na placa teste: Exemplo: tipagem sangunea em lminas (sistema ABO) Partculas que apresentam determinantes antignicos naturais na sua superfcie + Ac = Aglutinao 3) Controle negativo: 4) Mistura-se: Hemcias Bactrias Protozorios

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AGLUTINAO DIRETA 5) Leitura do resultado: negativo positivo Um resultado positivo indicado por uma aglutinao visvel (aglomerao dos eritrcitos na placa teste);

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AGLUTINAO INDIRETA (PASSIVA) Exemplo: Hemaglutinao Passiva para a Doena de Chagas: As hemcias so revestidas com Ag do T. cruzi (ligao covalente) e ento distribudas nos poos da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diludos, so adicionados aos poos da referida placa. Se houver Ac especfico contra o Ag, as hemcias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poo. Quando no existe Ac especfico, as clulas formam um boto no fundo do poo. Aglut + Aglut - Ags solveis associados a outras superfcies (Partculas de ltex ou superfcie de hemcias)

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AGLUTINAO EM LTEX: FATOR REUMATIDE Fator Reumatide: Anticorpos que reconhecem eptopos presentes na frao cristalizvel (Fc) da molcula de IgG. A maioria destes Acs so da classe IgM porm pode-se encontrar tambm Acs IgA e IgG. Teste: Visualizao de aglutinao das partculas de ltex revestidas pelo antgeno (no caso IgG humana ou de coelho) Interpretao: No caso de artrite reumatide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade Causas viraisHBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, ps vacinao Doenas auto- imunes Artrite Reumatide, Lpus Eritematoseo sistmico, Esclerose sistmica, polimiosite, dermatomiosite, sndrome de Sjrgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc NeoplasiasAps irradiao ou quimioterapia Infeces bacterianas Tuberculose, sfilis, hansenase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose Doenas parasitrias Malria, esquistossomose, filariose, tripanossomase Enfermidades em que o encontro de FR comum

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TESTE DE COOMBS (Antiglobulina) DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrcitos INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrcitos no soro 1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (me produz IgGantiRh). 2.R. medicamentosa 3.R. transfusional

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Teste baseado na inibio da aglutinao devido a competio com antgeno solvel. INIBIO DA AGLUTINAO Resultado positivo: (presena de hCG na urina): no ocorre aglutinao. Resultado negativo:(ausncia de hCG na urina): ocorre aglutinao, pois os anticorpos anti-hCG no so bloqueados na incubao inicial, porque no havia o hormnio na urina. Livres, podem aglutinar as partculas revestidas de hCG.

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Princpio da tcnica: Anticorpos ou antgenos so conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiaes UV, emite luz no espectro visvel. A reao feita em lminas de microscopia e a observao em um microscpio de fluorescncia Principais fluorocromos: fluorescena (isotiocianato de fluorescena FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). IMUNOFLUORESCNCIA (IFA) IFA direta: Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas tumorais, e doenas imunolgicas renais e de pele. IFA indireta: pesquisa de antgenos ( plasmdio em hemcia) e de anticorpos ( sfilis, toxoplasmose, rubola, citomegalovrus, vrus herpes simples, doena de chagas, malria, etc)

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IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

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Treponema pallidum Pneumocystis carinii Tripanosoma cruzi Giardia lamblia

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Separao de clulas marcadas por fluorescncia; Anticorpos dirigidos contra molculas de membrana ou Antgenos do Conjunto de Diferenciao (CD) Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. um teste qualitativo e quantitativo. Ferramenta que detecta e quantifica clulas individuais passando em uma corrente atravs de um feixe de Laser. CITOMETRIA DE FLUXO ( clula medida em movimento ) CD 4 CD 18 CD 125 CD 147

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CITMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTCULAS EM UM FLUXO CONTNUO SISTEMA PTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRNICO: CONVERTE OS SINAIS PTICOS EM SINAIS ELETRNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANLISE NO COMPUTADOR.

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CD4 CD8 CD20

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USO Determinar o tipo e n o de cls. sanguneas brancas Isolar populaes celulares Quantidade, tamanho, granulosidade; Distribuio de cls de acordo com a densidade dos Ag s Tamanho celular.

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APLICAES CLNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO - Anlise da subpopulao linfoctica - Diagnstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnstico e acompanhamento de mieloma mltiplo - Deteco de clulas neoplsicas no-hematopoiticas - Anlise de reticulcitos - Deteco de anticorpos antiplaquetrios - Quantificao de clulas progenitoras (Stem cells) - Avaliao imunolgica de paciente transplantado

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Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final ao da enzima sobre o substrato = COR Produto final corado leitura em fotocolormetro. Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -No trabalha com radioistopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto automao -No depende de formao de precipitado, aglutinado, etc. Direto = Ag Indireto = Ac

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Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA substrato Qualitativos Quantitativos Ac marcados com Enzimas + + Ag Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase DIRETO OU SANDUCHEINDIRETO = COR

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Ponte de corte ( cut-off) : o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

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ESTE EXEMPLO DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?

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CURVA PADRO - ELISA

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RADIOIMUNOENSAIO - RIA Molculas marcadas com istopo ( I 125,I 131 ) Marcaes: I 125 : emite raios gama H 3 : raios beta Desvantagem manipulao de istopo radioativo.

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RADIOIMUNOENSAIO

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Aplicaes: Triagem vrus da hepatite B em doadores de sangue, Hormnios, protenas sricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc. Vantagens: Alta sensibilidade Permite medidas rpidas e precisas Limiar de deteco em nanogramas e picogramas. Desvantagens: Custo Vida mdia dos reagentes Risco operacional (radiao) RADIOIMUNOENSAIO