Tecnologia da Biologia Celular e Molecular A biologia celular e molecular estuda objetos muito pequenos, por isso depende inteiramente do aperfeioamento dos instrumentos e das tcnicas de pesquisa. Para estudo no microscpio ptico, os tecidos so fixados, cortados e corados; as imagens obtidas podem ser armazenadas em discos de computador e processadas posteriormente. Os microscpios de contraste de fase facilitam o exame de clulas vivas. Com o microscpio confocal, possvel fazer cortes pticos da clula e a reconstituio tridimensional, por computao, das imagens digitalizadas de organelas e outros constituintes celulares. O microscpio eletrnico de transmisso tem um poder de resoluo mais de 100 vezes superior ao do microscpio ptico e revelou numerosas mincias da estrutura celular que no eram sequer percebidas anteriormente, revolucionando os estudos sobre as clulas. O microscpio eletrnico de varredura visa ao estudo das superfcies externas e internas das clulas e organelas. A imunocitoqumica empregada para a localizao de macromolculas celulares especficas. Nas culturas, as clulas podem ser mantidas vivas e proliferando por muito tempo, o que facilita o estudo de suas funes. As organelas podem ser isoladas das clulas por centrifugao fracionada (centrifugao diferencial). A cromatografia em coluna uma tcnica utilizada para separar macromolculas celulares. A tcnica de eletroforese pode ser usada para identificar macromolculas e para determinar o tamanho das molculas proticas. Os conhecimentos sobre as clulas progridem paralelamente ao aperfeioamento dos mtodos de investigao. Inicialmente, o microscpio ptico, tambm chamado microscpio de luz, possibilitou o descobrimento das clulas e a elaborao da teoria de que todos os seres vivos so constitudos por clulas. Posteriormente, foram descobertas tcnicas citoqumicas para a identificao e localizao de diversas molculas constituintes das clulas. Com o advento dos microscpios

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eletrnicos, que tm grande poder de resoluo, foram observados pormenores da estrutura celular que no poderiam sequer ser imaginado pelos estudos feitos com os microscpios pticos. Mais ou menos simultaneamente com o uso dos microscpios eletrnicos, foram aperfeioados mtodos para a separao de organelas celulares e para o estudo in vitro de suas molculas e respectivas funes. A anlise de organelas isoladas em grande quantidade, a cultura de clulas, a possibilidade de manipular o genoma atravs da adio ou supresso de genes e o aparecimento de numerosas tcnicas de uso comum aos diversos ramos da pesquisa biolgica levaram ao surgimento do que se costuma chamar de biologia celular e molecular, que o estudo integrado das clulas, atravs de todo o arsenal tcnico disponvel. impossvel descrever, mesmo sumariamente, todas as tcnicas utilizadas nos variados estudos sobre as clulas. Cada pesquisador tem usado sua imaginao para criar abordagens as mais variadas, de acordo com o problema a ser resolvido. Neste captulo, apenas como exemplos, sero estudadas algumas tcnicas que tm contribudo de modo significativo para o progresso da biologia celular e molecular. Para manter o livro com um tamanho razovel, muitas tcnicas importantes foram deixadas de lado. Confeco de cortes para estudo nos microscpios ptico e eletrnico Embora seja possvel o estudo microscpico de clulas vivas, muitas vezes h vantagem em obter um preparado permanente (lmina) no qual as clulas ficam preservadas, isto , fixadas e coradas, para melhor demonstrao dos seus componentes. Um preparado permanente ideal deveria mostrar as clulas com a mesma estrutura microscpica e composio qumica que possuam quando vivas. Isso, entretanto, no possvel, e todos os preparados apresentam artefatos, que so alteraes produzidas nas clulas pelas tcnicas utilizadas. Fixao. A fixao a primeira etapa para a obteno de um preparado permanente, e tem as seguintes finalidades: - evitar a autlise, que a destruio da clula por suas prprias enzimas; - impedir a atividade e a proliferao de bactrias; - endurecer as clulas para que elas resistam melhor s etapas seguintes da tcnica; - aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na microscopia ptica e aumentar o contraste na microscopia eletrnica (ver adiante, neste captulo). Comparao da atividade fixadora do formol e do glutaraldeido (aldedo

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glutrico) sobre os microtbulos, que so constitudos por dmeros proticos (representados por esferas). Possuindo dois grupamentos aldedicos, cada molcula do glutaraldeido pode ligar-se a dois dmeros proticos, mantendo a estrutura do microtbulo. O formol incapaz de manter essa estrutura, pois cada molcula de formol tem apenas um grupamento aldedo e se prende a um nico dmero. A qumica da fixao complexa e pouco conhecida. O for-mol e o aldedo glutrico (glutaraldeido) fixam as clulas por se combinarem com os grupamentos amnicos das protenas. O aldeido glutrico possui um grupamento aldedicos em cada extremidade de sua molcula, sendo capaz de estabelecer pontes entre as unidades proticas, estabilizando a estrutura quaternria da protena. O tetrxido de smio e o glutaraldedo so os fixadores mais usados em microscopia eletrnica porque coagulam as protenas, causando modificaes mnimas na estrutura celular. Cada um dos fixadores simples apresenta certos inconvenientes, ao lado de algumas qualidades desejveis. Por isso foram elaboradas as misturas fixadoras, que contm propores variveis dos fixadores simples com a finalidade de compensar-lhes as deficincias. Microtomia. Em sua maioria, as clulas fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas para exame no microscpio. Esses cortes so feitos em um aparelho denominado micrtomo. Para ser cortado no micrtomo, o fragmento de tecido fixado geralmente protegido por um material que o envolve e nele penetra, devendo possuir propriedades fsicas que facilitem o corte. Os tecidos destinados ao estudo no microscpio ptico so protegidos, isto , includos em parafina ou em resinas plsticas especiais, e cortados com uma espessura de 1 a 6 micrmetros, geralmente. Para estudo no microscpio eletrnico, os tecidos devem ser includos em resinas mais duras, como as do tipo epxi (Araldite, Epon). Os cortes para o microscpio eletrnico so muito finos, medindo 0,02 a 0,1 xm. Os micrtomos que cortam tecidos includos em parafina utilizam navalhas de ao, e os que cortam tecidos includos em resinas usam navalhas de vidro ou de diamante. Colorao. Quase todas as organelas so transparentes e incolores, o que dificulta seu estudo microscpico. Para vencer essa dificuldade, foram criados numerosos processos de colorao que tornam visveis os diversos componentes celulares. A maioria dos corantes comporta-se como base ou como cido. Nos corantes bsicos, o grupamento qumico responsvel pela cor ou grupamento cromforo (cromo, cor,

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e/oro, conduzo) catinico. Os cromforos desses corantes combinam-se com os agrupamentos cidos (aninicos) das molculas celulares. Portanto, as molculas cidas, como as do DNA e RNA, so basfilas, isto , tm afinidade pelos corantes bsicos. O azul-de-toluidina e o azul-de-metileno so exemplos de corantes bsicos. A he-matoxilina, um corante muito usado, comporta-se como corante bsico, ligando-se s estruturas basfilas dos tecidos. Nos corantes cidos, o cromforo aninico (portanto, com carga eltrica negativa) e tende a se combinar com os componentes celulares bsicos, que so eletricamente positivos. Estruturas ricas em grupamentos bsicos so acidfilas, por terem afinidade pelos corantes cidos. Os corantes cidos, como a eosina, orange G e fucsina cida, coram principalmente os componentes bsicos das protenas citoplasmticas. O microscpio ptico ou microscpio de luz. O microscpio ptico, tambm conhecido como microscpio de luz, compe-se de uma parte mecnica, que serve de suporte, e uma parte ptica, constituda por trs sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular. A finalidade do condensador projetar um cone de luz sobre as clulas que esto sendo examinadas no microscpio. Aps atravessar as clulas, esse feixe luminoso, em forma de cone, penetra na objetiva. A objetiva projeta uma imagem aumentada, no plano focai da ocular, que novamente a amplia. Por fim, a imagem fornecida pela ocular pode ser percebida pela retina como uma imagem situada a 25 cm da lente ocular, ou ento pode ser projetada sobre uma tela ou uma chapa fotogrfica. A ampliao total dada por um microscpio igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular. Micrtomo moderno, especialmente ergonmico, para cortes de tecidos includos em parafina ou em resina plstica. Modelo ErgoStar HM 200. (Ilustrao gentilmente cedida pela Microm, empresa do grupo Carl Zeiss). Microscpio ptico moderno, binocular, com iluminao embutida (Fotografia cedida pelo fabricante, Carl Zeiss). Esquema do microscpio ptico mostrando o trajeto dos raios luminosos. 1 base do microscpio, 2 condensador, 3 lente objetiva, 4 cristalino do globo ocular. A, sistema de iluminao; B, platina; C, tubo binocular; D, globo ocular do observador. (Ilustrao cedida pela firma Carl Zeiss.) Chama-se poder de resoluo de um sistema ptico a sua capacidade

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de separar detalhes. Na prtica, o poder de resoluo expresso pelo limite de resoluo, que a menor distncia que deve existir entre dois pontos para que eles apaream individualizados. Por exemplo: duas partculas separadas por 0,3 \m aparecem individualizadas quando examinadas em um sistema ptico com limite resolutivo de 0,2 (xm, porm aparecem como uma partcula nica quando o limite resolutivo de 0,5 (xm (Figs. 2.5 e 2.6). Esquema do cone luminoso que penetra em uma objetiva, mostrando o semingulo de abertura, que entra no clculo da abertura numrica (AN). O que determina, pois, a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema ptico o seu limite de resoluo, e no o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos. A propriedade de aumentar s tem valor prtico se acompanhada de um aumento paralelo do poder resolutivo. O limite de resoluo depende essencialmente da objetiva. A ocular no pode acrescentar detalhes imagem; sua funo apenas aumentar de tamanho a imagem, que projetada em seu plano de foco pela objetiva. O limite de resoluo depende, sobretudo, da abertura numrica (AN) da objetiva e do comprimento de onda da luz utilizada. O limite de resoluo (LR) da objetiva dado pela frmula Onde k uma constante estimada por alguns em 0,61 e, por outros, em 0,5, e, o comprimento de onda da luz empregada. Na prtica, o objeto iluminado por luz branca, constituda por diversos comprimentos de onda. Para o clculo do limite de resoluo, tomase o comprimento de onda da faixa do verde-amarelo (0,55 (xm), por ser o olho humano mais sensvel a essas cores do que a quaisquer outras. Portanto, na prtica A anlise desta frmula mostra que o limite de resoluo diretamente proporcional ao comprimento de onda da luz usada e inversamente proporcional abertura numrica da objetiva. Microscpio de polarizao. O emprego de um feixe luminoso polarizado permite estudar certos aspectos da organizao molecular dos constituintes celulares. Ao atravessar a clula, o feixe de luz pode passar por estruturas cristalinas ou constitudas por molculas alongadas e paralelas, que dividem o feixe polarizado em dois, cujos planos so perpendiculares. Essas estruturas so chamadas anisotrpicas e so birrefringentes, pois apresentam dois ndices de refrao diferentes, conforme a incidncia da luz. As estruturas celulares que no apresentam tal organizao no modificam o plano de polarizao da luz, e so ditas isotrpicas.

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O microscpio de polarizao semelhante ao microscpio ptico comum, acrescido de dois prismas ou dois discos polarides. Um desses elementos colocado no condensador e funciona como polarizador; o outro colocado na ocular e chamado analisador. A funo do polarizador iluminar a clula com um feixe de luz polarizada. O analisador verifica o efeito das estruturas celulares sobre o feixe polarizado. Quando o polarizador e o analisador esto com seus planos de polarizao perpendiculares (cruzados), s as estruturas birrefringentes ou anisotrpicas podem ser vistas. Isso ocorre porque elas dividem o feixe polarizado em dois; um deles absorvido pelo analisador, mas o outro, perpendicular ao primeiro, atravessa o analisador e vai formar a imagem. As estruturas isotrpicas no so vistas, pois no desviam o plano de polarizao da luz, e o feixe que passa pelo polarizador chega inalterado ao analisador, onde retido. Microscpio de contraste de fase. Esse microscpio dotado de um sistema ptico especial que transforma diferenas de fase dos raios luminosos em diferenas de intensidade. Assim, as diferenas de fase, para as quais o olho no sensvel, tornam-se visveis, pois so transformadas em diferenas de intensidade luminosa, facilmente perceptveis. O microscpio de contraste de fase pode ser usado de modo que as estruturas celulares apaream escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa). A velocidade da luz ao atravessar um corpo e o ndice de refrao deste dependem da quantidade de matria presente, isto , da densidade do corpo. Quanto maior a densidade, menor ser a velocidade da luz no interior desse corpo. Menor ser tambm o ndice de refrao. As diversas estruturas celulares tm quantidades diversas de matria e causam atrasos diferentes na luz que as atravessa. Isso gera diferenas de fase na luz emergente, que, por interferncia, so transformadas em diferenas de amplitude, dando diferenas de intensidade luminosa, s quais a retina sensvel. O microscpio de contraste de fase empregado em especial para o estudo de clulas vivas. de grande utilidade para a observao de clulas cultivadas, cujo crescimento e diviso mittica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes. O microscpio idealizado por Normaski um tipo de microscpio de contraste de fase que se utiliza da luz polarizada. Como no microscpio de fase comum, as estruturas celulares se tornam visveis devido interferncia dos raios luminosos . Microscpio confocal. Clulas isoladas e cortes de tecidos tm espessura maior do que o plano de foco do microscpio ptico. Na prtica, as lminas so examinadas usando-se o artifcio de variar o plano de focalizao atravs do boto micromtrico do microscpio, o

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que modifica a distncia entre as clulas e a lente objetiva. Com a movimentao do boto micromtrico, um plano da clula entra em foco, enquanto os outros planos saem de foco. Todavia, esse procedimento tem o inconveniente de oferecer uma imagem do plano focalizado que perde nitidez pela interferncia dos raios luminosos que passam pelos planos fora de foco. Na realidade, forma-se uma imagem ntida do plano focalizado e, simultaneamente, a ela est superposta a imagem "borrada" dos outros planos da clula. O microscpio confocal soluciona esse inconveniente do microscpio ptico comum. Microscpio confocal Zeiss. (Reproduzido por cortesia do fabricante). No microscpio confocal, a iluminao feita por um delgado feixe de raios laser, que varre o corte iluminando apenas, ponto por ponto, um determinado plano da clula, realizando um verdadeiro "corte ptico". A imagem formada exclusivamente pelas estruturas que esto no plano da varredura, sem que os componentes celulares situados em outros planos contribuam para a formao da imagem. No somente a imagem muito ntida, como tambm a clula pode ser "cortada" durante a microscopia e as "fatias" obtidas podem ser utilizadas de vrias maneiras. Geralmente, as clulas so submetidas a um composto fluorescente e a luz emitida processada num computador, que envia os sinais para formao da imagem na tela de um monitor de vdeo. As imagens dos "cortes pticos" assim obtidas podem ser armazenadas no disco do computador e utilizadas para construir uma imagem tridimensional, ou para clculos de comprimento, rea, volume e outras anlises, de acordo com a finalidade do estudo. Uma vez digitalizadas, as imagens podem ser arquivadas para estudos posteriores. O microscpio eletrnico possibilitou a visualizao de estruturas celulares no visveis no microscpio ptico, porque seu poder resolutivo muito maior. A capacidade resolutiva de qualquer microscpio limitada pelo comprimento de onda da radiao empregada. A radiao visvel permite distinguir detalhes de 0,2 p,m, porm a forma de objetos menores no visvel. Mais recentemente foi aperfeioado o microscpio eletrnico. Esse microscpio emprega feixes de eltrons que, acelerados por uma diferena de potencial de 60.000 volts, tm um comprimento de onda de 0,005 nm. No momento no se consegue aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscpios eletrnicos por causa das dificuldades em preservar as clulas e, sobretudo, em obter cortes extremamente finos, imprescindveis para o mximo de resoluo.

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Microscpio eletrnico, modelo EM910 da firma Carl Zeiss. (Cortesia do fabricante.) Os componentes do microscpio eletrnico, representados de modo esquemtico, lembram um microscpio ptico. Os eltrons so produzidos graas ao aquecimento, no vcuo, de um filamento de tungstnio o ctodo que emite eltrons. Essas partculas so aceleradas devido a uma diferena de potencial de 60 a 100 kV existente entre o ctodo e o nodo. Este ltimo uma placa perfurada no centro e s permite a passagem de parte dos eltrons, formando um feixe. Os eltrons passam por uma bobina ou lente magntica, tambm chamada condensadora, que os dirige em feixe uniforme na direo do objeto. Aps atravessar o objeto, onde muitos eltrons so desviados, o feixe passa por outra bobina, que corresponde objetiva do microscpio ptico. Por fim, uma terceira bobina projeta os eltrons sobre uma tela fluorescente onde eles formam uma imagem visvel ou sobre um filme fotogrfico. Os eltrons desviados por certas estruturas da clula em estudo no contribuiro para formar a imagem. Essas estruturas aparecem escuras e so chamadas eltrondensas. Os componentes celulares que desviam uma pequena percentagem de eltrons aparecero em diversas tonalidades de cinza. A tela fluorescente em que a imagem se forma uma placa revestida por ZnS (sulfeto de zinco), substncia que emite luz ao ser excitada pelos eltrons. Na prtica, as observaes mais cuidadosas so efetuadas nas micrografias obtidas pela retirada da tela do trajeto dos eltrons, os quais incidiro sobre um filme fotogrfico. Como as emulses fotogrficas so sensveis aos eltrons, elas registram a imagem fornecida pelo aparelho. Depois de revelados, os filmes so ampliados 2 a 4 vezes e as micrografias podem ser examinadas vontade. A tela fluorescente, constituda por partculas relativamente grosseiras, emite pouca luz em relao aos eltrons que recebe e fornece imagem menos contrastada do que a obtida nas ampliaes fotogrficas. Por isso, os estudos de microscopia eletrnica so feitos principalmente nas ampliaes em papel fotogrfico, mais do que diretamente no microscpio eletrnico. Trajeto dos eltrons no microscpio eletrnico. O corte de tecido colocado logo acima da bobina ou lente objetiva. A imagem, j aumentada pela objetiva, novamente ampliada por outra bobina, que a projeta em uma tela fluorescente. Devido ao fraco poder de penetrao dos feixes de eltrons utilizados nos microscpios eletrnicos, as clulas devem ser cortadas com uma espessura de 20 a 100 nm.

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Para isso necessria a incluso em resina epxi (Epon, Araldite). Os cortes so feitos em micrtomos especiais, que utilizam navalhas de vidro fraturado ou de diamante. No microscpio eletrnico, todo o trajeto dos eltrons feito no vcuo, condio necessria para a obteno de um feixe de eltrons, que seriam desviados ao colidirem com os tomos do ar. Por isso, no se podem examinar clulas vivas, mas apenas clulas fixadas e completamente secas. Todavia, h aparelhos que usam baixo vcuo e podem ser usados para exame de material contendo gua, embora sem que se possa obter a boa resoluo fornecida pelo microscpio eletrnico comum, que de alto vcuo. A preparao das clulas para a microscopia eletrnica requer cuidados muito especiais. A fixao em geral feita em soluo de aldedo glutrico (glutaraldedo) tamponado a pH 7,2. Usa-se tambm a fixao em soluo de tetrxido de smio. Na maioria das vezes, esses dois fixadores so empregados em seqncia: primeiro fixa-se o tecido em glutaraldedo e, depois, em smio. O smio, alm de fixador, atua como contraste, por ser um elemento de nmero de massa elevado, que desvia os eltrons. As estruturas que se combinam com o smio aparecero escuras. Alm do smio, outros tomos so empregados para fixar e aumentar o contraste entre os componentes celulares. Aps a fixao com aldedo glutrico, seguida da fixao com smio, podem-se passar ainda as clulas por solues de sais de urnio ou chumbo. Como as diversas estruturas celulares tm afinidades diferentes por esses metais, o contraste melhora quando mais de um deles usado. Algumas etapas da obteno dos cortes para a microscopia eletrnica. Os tecidos so includos em blocos de resina epxi. Em A, v-se o suporte do micrtomo com o bloco a ser cortado e a navalha de vidro. Preso navalha, h um pequeno recipiente contendo gua, sobre a qual os cortes sero recolhidos. Em B, os cortes esto sendo colhidos em uma tela de 3 mm de dimetro, manejada por meio de uma pina. Em C, aparece a tela com os cortes. Essa tela submetida soluo de sais de urnio e chumbo, que impregnam os componentes celulares, aumentando seu contraste. Em seguida, a tela levada ao microscpio eletrnico. Esquema da tcnica de colorao negativa aplicada evidenciao de bacterifago (vrus de bactria), neste exemplo. Com o auxlio de uma pipeta, coloca-se sobre um suporte adequado uma soluo de cido fosfotngstico contendo bacterifagos em suspenso. Aps a secagem Bio cido fosfotngstico, que desvia o trajeto dos eltrons, acumula-se em volta dos bacterifagos. No microscpio eletrnico, os bacterifagos

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aparecem claros contra um fundo escuro. Alm do mtodo de contraste com metais que se ligam aos tecidos, chamados de contraste ou colorao positiva, usa-se tambm a chamada colorao negativa. Na colorao negativa, clulas, organelas isoladas ou vrus so mergulhados em solues contendo tomos que desviam os eltrons e, depois, examinados no microscpio eletrnico. O corante negativo fica entre as estruturas e penetra em suas depresses e orifcios, de modo que, ao microscpio, a estrutura aparece clara, contornada por um material eltron-denso, que o corante. Essa tcnica muito empregada no estudo de vrus e de organelas isoladas. Em certos casos, sobretudo no estudo dos vrus, usa-se tambm a tcnica de sombreamento, em que se faz vaporizao de um metal sobre uma estrutura, segundo um certo ngulo. Como s um lado da estrutura recoberto pela camada metlica que se deposita durante o processo, sua forma aparece em relevo. Microscpio eletrnico de varredura. Como o microscpio eletrnico comum ou de transmisso, o microscpio eletrnico de varredura tambm usa um feixe de eltrons. Mas, da em diante, eles pouco tm em comum e, na verdade, so aparelhos complementares. O microscpio eletrnico de transmisso possui poder de resoluo muito maior, enquanto o de varredura tem a vantagem de fornecer imagens tridimensionais, pelo exame da superfcie das estruturas. Basicamente, o microscpio eletrnico de varredura consiste em um sistema anlogo ao do microscpio de transmisso, que produz um feixe delgado de eltrons cujo dimetro pode ser modificado. O trajeto do feixe de eltrons , em seguida, modificado por um conjunto de bobinas defletoras que o fazem percorrer o espcimen ponto por ponto e ao longo de linhas paralelas (varredura). A tcnica do sombreamento consiste na deposio de fina camada de metal (ouro, cromo, urnio) sobre a clula em estudo. O metal evaporado no vcuo e deve incidir obliquamente sobre o espcimen, como mostra o esquema A. Em B, aspecto visto no microscpio eletrnico. Ao atingirem o espcimen, os eltrons causam diversos efeitos, entre os quais a emisso de eltrons secundrios pelo prprio espcimen. Os eltrons secundrios so colhidos por um coletor, passam por um sistema de amplificao e so transformados em pontos de maior ou menor luminosidade, num monitor de vdeo. As micro-grafias so obtidas pela fotografia da imagem na tela do monitor, e no pela ao dos prprios eltrons sobre um filme fotogrfico, como acontece no microscpio eletrnico de transmisso.

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Geralmente, os espcimens no precisam ser cortados para serem examinados no microscpio eletrnico de varredura. Objetos de 1 cm ou mais podem ser examinados inteiros. Em biologia celular, o microscpio de varredura tem sido muito usado para o estudo da superfcie de clulas mantidas em cultivo. O material a ser estudado, aps fixao em glutaraldedo ou outro fixador, cuidadosamente dessecado e recoberto por delgada camada condutora de eletricidade em geral ouro ou platina depositados a vcuo e est pronto para ser examinado no aparelho. Citoqumica: compreende tcnicas diversas para a identificao e localizao das molculas que constituem as clulas A citoqumica estuda a localizao intracelular das diversas substncias que compem as clulas. Os preparados pela tcnica de citoqumica podem ser examinados no microscpio ptico e no microscpio eletrnico. No primeiro caso, o produto da reao citoqumica deve ser corado e, no segundo, deve dispersar os eltrons, isto , possuir "eltrondensidade". Esquema geral do microscpio eletrnico de varredura. Na parte inferior do aparelho esto localizadas as bombas de vcuo, pois a coluna percorrida pelos eltrons deve ser mantida em alto vcuo. Algumas reaes citoqumicas seguem a lei de Lambert Beer, quer dizer, produzem nas clulas e tecidos uma intensidade de cor proporcional concentrao da substncia em estudo. Nesses casos, possvel usar um aparelho denominado histofotmetro ou citofotmetro, que permite determinar a intensidade da cor produzida dosando, por esse meio, a quantidade da substncia analisada. cido desoxirribonuclico. O DNA demonstrado citoquimicamente pela reao de Feulgen, tcnica que consiste em duas etapas. Na primeira, mergulha-se a lmina com os cortes de tecidos em soluo aquecida de cido clordrico, o que promove a hidrlise das bases pricas, deixando livres as extremidades da desoxirribose, que possuem radicais aldedicos. Na segunda etapa, trata-se o preparado pelo reativo de Schiff, que, ao se combinar com os grupamentos aldedicos da desoxirribose, forma um complexo de cor vermelha. O reativo de Schiff uma soluo de fucsina bsica descorada pelo anidrido sulfuroso. A reao de Feulgen especfica para o DNA e, como a intensidade da cor vermelha que se forma proporcional concentrao de DNA, ela permite o estudo quantitativo desse cido nuclico. Graas a esse processo, descobriu-se que a quantidade de

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DNA fixa para cada espcie e se duplica na intrfase, de modo que, ao entrar na prfase, a clula j contm uma quantidade dupla de DNA. cido ribonuclico. O estudo citoqumico do RNA baseado em sua basofilia e nas propriedades da enzima ribonuclease, que ataca exclusivamente o RNA. So feitas duas preparaes, uma das quais digerida pela ribonuclease. Depois, as duas preparaes so tratadas por um corante bsico, como o azul-de-toluidina. Por ser fortemente basfilo, o RNA aparecer corado. Pela comparao das duas lminas ao microscpio, torna-se possvel detectar o RNA, pois este s aparecer corado na lmina que no foi digerida pela ribonuclease. Catecolaminas. O formaldedo reage com as catecolaminas produzindo compostos fluorescentes. Desse modo, possvel a localizao citoqumica das catecolaminas adrenalina e noradrenalina. Protenas. As reaes para demonstrao das protenas totais das clulas so baseadas em tcnicas que identificam aminocidos. Entre essas tcnicas esto a de Millon, para tirosina; a do diaminoazobenzeno, para triptofano; e a de Sakaguchi, para arginina. As diversas protenas celulares so constitudas pelos mesmos aminocidos; por isso, as tcnicas baseadas na identificao de aminocidos no permitem individualizar as protenas, o que pode ser feito com mtodos de imunocitoqumica (ver adiante, neste captulo). Polissacardeos. Um exemplo a tcnica para evidenciar o glicognio, conhecida como tcnica do PAS (periodic acid Schiff). Como indica a reao baseia-se na oxidao, pelo cido peridico (peridico), de grupamentos OH vizinhos, formando grupamentos aldedicos que do cor vermelha com o reativo de Schiff. Como foi explicado anteriormente, o reativo de Schiff a fucsina bsica descorada pelo anidrido sulfuroso. A reao no especfica para glicognio, de modo que se aplica um artifcio semelhante ao descrito para a demonstrao do RNA: tomam-se duas lminas com cortes do mesmo tecido, uma das quais previamente tratada pela enzima alfa-amilase. Essa enzima hidrolisa e remove o glicognio. Portanto, a estrutura que aparecer corada pelo PAS na lmina no tratada pela alfa-amilase, mas no aparecer corada na lmina tratada pela enzima glicognio. Enzimas. Muitas enzimas podem ser estudadas por tcnicas citoqumicas. Algumas vezes, para impedir que o fixador inativo a enzima, preciso usar cortes de tecidos

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no fixados, obtidos por congelao. As desidrogenases e as fosfatases so exemplos de enzimas demonstrveis citoquimicamente. Uma das tcnicas para as fosfatases cidas utiliza meio de incubao contendo glicerofosfato de sdio e nitrato de chumbo, em tampo pH 5,0. A enzima hidrolisa o glicerofosfato, formando-se um precipitado insolvel e incolor de fosfato de chumbo. Em seguida, os cortes so mergulhados em soluo de sulfeto de amnia, que transforma o precipitado incolor do fosfato de chumbo em um precipitado negro de sulfeto de chumbo. Como os sais de chumbo so eltrondensos, a reao pode ser vista ao microscpio eletrnico. Essa tcnica usada para o estudo dos lisossomos organelas ricas em enzimas hidrolticas, entre as quais esto as fosfatases cidas.

Glndula salivar de sagi. Mtodo de Falck e Hillarp para demonstrao de catecolaminas pela fluorescncia. Fibras nervosas contendo adrenalina (adrenrgicas) aparecem fluorescentes e localizadas em redor das unidades secretoras. Os duetos (d) so desprovidos de inervao. Aumento: 280 X. (Cortesia da Dra. Conceio Machado.) A microscopia, de fluorescncia geralmente aplicada com tcnicas citoqumicas. As substncias fluorescentes gozam da propriedade de emitir luz quando excitadas por radiaes de certos comprimentos de onda. Na prtica utiliza-se a radiao ultravioleta como excitadora. Alguns constituintes celulares, como a riboflavina (vitamina B2), a vitamina A e as porfirinas, so fluorescentes e podem ser identificados e localizados por meio da microscopia de fluorescncia. Utilizam-se tambm corantes fluorescentes que se combinam e identificam certas substncias no-fluorescentes normalmente presentes nas clulas. Um dos corantes fluorescentes mais usados o alaranjado-de-acridina, que se combina com os cidos nuclicos, permitindo a sua localizao. Todavia, a principal aplicao da microscopia de fluorescncia ocorre em combinao com mtodos imunolgicos, nas tcnicas imunocitoqumicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos fluorescentes, e que sero descritas a seguir. A imunocitoqumica localiza molculas proticas especficas As tcnicas de imunocitoqumica permitem o estudo da localizao intracelular de

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protenas especficas. Ela localiza, com preciso, um determinado tipo de molcula protica, excluindo todas as outras protenas existentes nas clulas. Como a imunocitoqumica se baseia na reao antgeno-anticorpo, devem-se estudar antes algumas noes bsicas dessa reao, cujo estudo detalhado pertence ao domnio da imunologia. Textos de imunologia devem ser consultados para maiores esclarecimentos. Imunocitoqumica direta. Suponha-se que, de um determinado rgo de rato, se possa extrair e purificar quimicamente uma protena, que ser chamada protena X. O problema citoqumico consiste em descobrir em que clulas ou parte da clula est localizada a protena X, pois ela foi isolada de um rgo inteiro. Injetando-se a protena X (antgeno) em um coelho, este formar uma gamaglobulina (anticorpo) com a propriedade de se combinar exclusivamente com a protena X, no se combinando com qualquer outra. O anticorpo aparece porque a protena X pertence a um rgo de rato e, portanto, estranha para o coelho no qual foi injetada. Algum tempo aps a injeo da protena X no coelho, pode-se obter do sangue desse animal um anticorpo especfico contra aquela protena. Esse anticorpo pode ser, por exemplo, combinado com a enzima peroxidase, que serve como marca. A identificao citoqumica da peroxidase identifica tambm o anticorpo ligado enzima. Colocando-se, sobre um corte do rgo de rato que contm a protena X, uma soluo do anticorpo marcado com a peroxidase, haver uma combinao do antgeno (protena X) com seu anticorpo (gamaglobulina anti-X) marcado com peroxidase (Fig. 2.17). O complexo antgeno-anticorpo que se forma no visvel ao microscpio ptico nem ao eletrnico, mas tornar-se- visvel se a peroxidase for evidenciada por uma reao citoqumica apropriada. Essa evidenciao feita colocando-se sobre o corte uma substncia que, sob a ao da peroxidase, forme um composto corado e eltron-denso. Em substituio peroxidase, pode-se usar, como marcador, um corante fluorescente ligado ao anticorpo. Nesse caso, o preparado obtido pela ao do anticorpo sobre o corte que contm o antgeno pode ser imediatamente examinado ao microscpio de fluorescncia. Todavia, a peroxidase permite melhor localizao, pois o corte pode ser estudado com o microscpio eletrnico e o antgeno localizado, com alta resoluo, nas organelas celulares. Uma terceira forma de marcar o anticorpo consiste em sua conjugao com

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ferritina. A ferritina, uma protena que, devido ao seu alto teor em ferro, muito eltrondensa, possibilita o estudo da localizao de protenas (antgenos) ao microscpio eletrnico. Essa marcao no serve para o estudo ao microscpio ptico. Mais recentemente surgiu a marcao com o complexo de ouro coloidal + protena A. Essa tcnica consiste na adsoro, pelas molculas da protena A, de partculas de ouro, muito pequenas (5-20 nm) e eltrondensas. A protena A extrada das bactrias Staphylococcus aureus e, alm da afinidade pelo ouro coloidal, tem afinidade por uma regio comum s molculas de todos os anticorpos (segmento Fe). Essa tcnica apresenta grande preciso para localizar molculas proticas e grande resoluo, pois as partculas de ouro coloidal so muito pequenas. O processo pode ser feito em trs etapas: l.a) incubar o tecido a ser estudado com o anticorpo desejado. Tcnica imunocitoqumica direta. O composto (precipitado) formado pela ao da peroxidase sobre a 3-3'-diaminobenzidina de cor marrom-clara e eltron-denso. Por isso, a tcnica pode ser aplicada tanto microscopia ptica como eletrnica. Imunocitoqumica direta com anticorpo fluorescente. Lavar; o anticorpo fixa-se protena; 2.a) incubar o tecido em soluo de ouro conjugado protena A; lavar; 3.a) estudar no microscpio eletrnico. A tcnica direta de imunocitoqumica no muito sensvel e, por isso, pouco usada atualmente. Ela foi descrita aqui para facilitar a compreenso da tcnica indireta, muito mais til na prtica por sua alta sensibilidade. Imunocitoqumica indireta. Nessa tcnica, a marcao colocada em um antianticorpo, isto , uma antigamaglobulina. Por sua maior sensibilidade, permitindo a demonstrao de quantidades mnimas de antgeno, a tcnica indireta a mais usada na prtica. Desenhos esquemticos mostrando os fundamentos da tcnica de imunocitoqumica usando como marcador o complexo de protena A (uma protena de estafilococo) e partculas de ouro coloidal. Eletromicrografia de um preparado total da bactria Haemophlius aegyptius, causadora da febre purprica brasileira. Notem-se na figura dois tipos celulares, onde as clulas assinaladas por estrelas mostram projees filamentosas marcadas pelo complexo protena A-ouro, ligado a um anti-soro policlonal anti-25kD. A protena 25-kD uma subunidade protica da fmbria. A clula assinalada por um asterisco no mostra projees filamentosas. Observa-se, em algumas oportunidades, a disposio linear (que revela a

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estrutura filamentosa da fmbria, seta) das partculas de ouro eltrondispersantes, que medem aproximadamente 5 nm de dimetro. Aumento: 63.000 X. (Gentileza da Dra. Hatune Tanaka do Instituto Adolfo Lutz, So Paulo). Esquema para demonstrar a maior sensibilidade da imunocitoqumica indireta. Pela tcnica direta, esse antgeno celular fixaria quatro molculas do anticorpo; pela tcnica indireta, ele fixou 20 molculas de antigamaglobulina. Saber a localizao celular da protena Y, tambm contida em um rgo de rato, a primeira etapa consiste na colocao, sobre o corte de tecido, de uma soluo do anticorpo (gamaglobulina) anti-Y, obtido pela injeo da protena Y em um coelho. Haver combinao de Y com seu anticorpo. Na segunda etapa, coloca-se sobre o corte uma soluo de anticorpo contra gamaglobulina de coelho. Esse anticorpo, que uma antigamaglobulina e, portanto, um antianticorpo, pode ser obtido pela injeo de gamaglobulina de coelho em carneiro ou cabra. Por fim, ter-se- um complexo constitudo pela protena Y, seu anticorpo e uma antigamaglobulina. A antigamaglobulina pode ser evidenciada por conjugao com substncias fluorescentes, ferritina ou peroxidase, conforme foi descrito na tcnica direta. Macromolculas como protenas, DNA e RNA podem ser isoladas por cromatografia em coluna. As protenas e os cidos nuclicos isolados das clulas so freqentemente separados pela tcnica de cromatografia em coluna. Essa tcnica baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de protenas dissolvidas em gua passar por uma coluna constituda por uma matriz slida e porosa, contida num tubo de vidro, a velocidade de migrao das diferentes protenas varia conforme a interao de cada uma delas com a matriz. Mandando-se um fluxo contnuo de protenas, que sai pela parte inferior da coluna, podem-se coletar separadamente as protenas contidas na amostra inicial. O grau e o tipo de interao das protenas com a matriz da coluna podem ser de natureza varivel, a saber: Interao de troca inica onde a matriz constituda por partculas com carga positiva ou negativa e na qual a separao das protenas depende das cargas eltricas na superfcie de suas molculas; Interao hidrofbica as partculas da matriz apresentam superfcie hidrofbica, retardando a migrao das protenas hidrofbicas, que tm afinidade pelas partculas da matriz; Filtrao em gel nesse caso, a matriz atua apenas como uma peneira, por onde

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as protenas migram com velocidade varivel, dependendo do tamanho e forma de suas molculas; Interao por afinidade muitas molculas biolgicas interagem com alto grau de especificidade, como acontece entre as enzimas e seus substratos, entre certos segmentos de DNA e RNA e entre antgenos e anticorpos. A tcnica , por exemplo, muito usada para purificao de anticorpos. Nesse procedimento, as molculas (anticorpos) ligam-se s partculas da matriz que contm o respectivo antgeno. As outras protenas passam pela coluna, mas os anticorpos se prendem matriz com alta especificidade e afinidade. Posteriormente passagem das outras protenas, o anticorpo removido da coluna, por meio de soluo apropriada. Esquema demonstrativo das etapas da tcnica imunocitoqumica indireta. Na etapa 1, o antgeno cuja localizao se deseja determinar combina-se com o anticorpo especfico, formando um complexo que no visvel nem no microscpio ptico, nem no eletrnico. A finalidade das etapas seguintes tornar esse complexo visvel. Na etapa 2, agrega-se antigamaglobulina marcada com peroxidase ao complexo j formado. Na etapa 3, por meio da tcnica citoqumica para peroxidase, forma-se precipitado visvel nos microscpios ptico e eletrnico, revelando-se assim o local onde est presente o antgeno cuja localizao era desejada. Exemplos da tcnica imunocitoqumica indireta. A. Clulas hipofisrias produtoras do hormnio luteinizante. Fotomicrografia no microscpio ptico comum. Aumento: 500 X. (Cortesia dos Drs. Flvio Fava de Moraes e Burton R. Baker.) B. Clulas da glndula tireide.Fotomicrografia no microscpio de fluorescncia. Aumento:400 X. (Cortesia do Dr. Mrio Camargo.) O tamanho das molculas proticas pode ser determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida A tcnica de eletroforese em gel tem diversas variantes, para esclarecer diferentes problemas. Uma dessas variantes empregada para determinar o tamanho das molculas proticas e consiste na dissoluo das protenas em soluo de sdio dodecil sulfonato (SDS). Esse composto um detergente forte, cujas molculas so carregadas negativamente. Na presena de um excesso de molculas negativas de SDS, todas as molculas proticas se tornam tambm negativas, porque todas as cargas positivas das protenas so neutralizadas. Alm disso, adiciona-se um agente redutor, geralmente mercaptoetanol, que rompe as ligaes S-S das subunidades proticas, destruindo a forma original das molculas de protenas, que pode

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ser muito complexa. Colocando-se a mistura de protenas sobre o gel e submetendo-se este a um campo eltrico, todas as molculas proticas migraro na direo do plo positivo, e a velocidade dessa migrao depender exclusivamente do tamanho da molcula de cada cadeia polipeptdica, pois todas as protenas tero a forma alongada. A radioautografia muito empregada para Estudar os locais de sntese e o destino de macromolculas. A radioautografia pode ser aplicada como uma tcnica citoqumica para a deteco de istopos radioativos. Baseia-se na sensibilidade das emulses fotogrficas s radiaes ionizastes. Como no existem tomos radioativos nas clulas, podem-se seguir, pela radioautografia, a incorporao e a migrao de compostos radioativos introduzidos nas clulas com finalidades experimentais. Por exemplo, desejando-se saber quais as clulas de um tecido que esto sintetizando DNA, injeta-se num animal um precursor desse cido nuclico, a timidina radioativa marcada com trcio (H3). A timidina ser incorporada apenas nos ncleos celulares que estiverem sintetizando DNA. Cobrindo-se a lmina que contm cortes do tecido, com uma emulso fotogrfica, esta ser impressionada pelos ncleos celulares radioativos (partculas beta emitidas pelo trcio). Revelando-se a emulso, aparecero grnulos negros de prata metlica sobre o ncleo celular cujo DNA foi sintetizado com a timidina-H3. Depois de revelada a emulso, as clulas podem ser coradas para facilitar seu estudo ao microscpio. A emulso fotogrfica basicamente uma suspenso de microcristais de brometo (ou outro halogeneto) de prata em gelatina. Os cristais de brometo de prata so os detectores da radioatividade. A radioautografia pode ser aplicada tambm ao microscpio eletrnico. O processo basicamente o mesmo usado para o microscpio ptico, porm os grnulos de prata em geral aparecem como filamentos enovelados devido ao maior poder de resoluo do microscpio eletrnico. Das diversas tcnicas radioautogrficas, a mais empregada em biologia celular a tcnica da emulso lquida. Essa tcnica emprega emulses fotogrficas especiais, sob a forma de um gel que se torna lquido temperatura de 45C. As etapas so as seguintes: Mergulha-se a lmina contendo as clulas radioativas na emulso fundida a 45C. Remove-se com papel absorvente a emulso do verso da lmina e deixa-se secar temperatura ambiente.

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Colocam-se os preparados em caixas prova de luz, para o perodo de exposio, durante o qual a radiao ir atuar sobre a emulso. Aps a exposio, revela-se a emulso fotogrfica, tratando-se a lmina como se fosse uma pequena chapa fotogrfica. Em seguida, as clulas so coradas e examinadas ao microscpio. Grnulos negros de prata metlica indicaro as partes radioativas das clulas. Tcnica radioautogrfica com emulso lquida. As etapas demonstradas nestes desenhos so executadas na cmara escura, com luz vermelha de segurana. A radioautografia muito usada para o estudo da sntese de diversas molculas. Para isso, como no exemplo do DNA j citado, injeta-se em um animal ou coloca-se no meio de cultura de clulas um precursor radioativo da substncia que se deseja estudar. Para o estudo do RNA, pode-se usar adenina ou uridina e, para o estudo da sntese e migrao de protenas, empregam-se aminocidos. Em geral, as molculas radioativas usadas nesses experimentos so marcadas com hidrognio (H3), carbono (C14) ou enxofre (S35). Esses trs istopos emitem partculas beta (eltrons) de fraco poder de penetrao, de modo que no causam dano s clulas. Para estudar o metabolismo normal, preciso utilizar radiao fraca para que no haja alterao do funcionamento celular pela radiao. Outros istopos radioativos tambm muito utilizados em radioautografia so o I131, J125 e p32 Por centrifugao possvel obter organelas celulares em estado de pureza e, em seguida, estudar suas propriedades qumicas, fsicas e biolgicas. As tcnicas que permitem o fracionamento celular e a obteno de fraes relativamente puras de organelas contriburam muito para o desenvolvimento da biologia celular nos ltimos anos. As organelas so separadas pela centrifugao de um homogeneizado de clulas em que as membranas plasmticas so rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio lquido, geralmente contendo sacarose. Esse glicdio muito utilizado porque mantm a integridade dos componentes celulares e evita a tendncia de as organelas aglutinarem-se quando as clulas se rompem. A ruptura das membranas plasmticas para a obteno do homogeneizado em geral feita pela ao mecnica de um pisto girando em um cilindro que contm as clulas na soluo de sacarose. Pode ser feita tambm por meio de ultra-som ou de um aparelho

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parecido com um liquidificador domstico. Durante a homogeneizao e as centrifugaes que se seguem, a maioria das organelas mantm sua forma intacta. Todavia, o retculo endoplasmtico se rompe, e, como suas membranas tendem a se soldar, formam-se vesculas lisas ou granulares, conforme se trate do retculo endoplasmtico liso (REL) ou do rugoso (RER). As vesculas formadas a partir deste ltimo, cuja superfcie carregada de ribossomos, recebem a denominao de microssomos. Portanto, os microssomos so fragmentos do retculo endoplasmtico rugoso. O isolamento de uma organela atravs da centrifugao depende do seu coeficiente de sedimentao, isto , do seu tamanho, forma e densidade, bem como da densidade e viscosidade da soluo em que est sendo centrifugada. A separao de componentes celulares por centrifugao em geral efetuada pela tcnica conhecida por centrifugao fracionada ou centrifugao diferencial, que consiste em uma srie de centrifugaes a velocidades crescentes. As organelas ou incluses maiores e mais densas sedimentam primeiro, e o sobrenadante de cada centrifugao centrifugado de novo, porm com maior velocidade. Desse modo, os componentes celulares vo sendo sucessivamente separados. As fraes assim preparadas muitas vezes contm mais de um componente celular, mas podem ser purificadas por ressuspenso e nova centrifugao. Por exemplo, a frao das mitocndrias quase sempre contm lisossomos e peroxissomos, mas as trs organelas podem ser separadas por novas centrifugaes. Em geral, o sobrenadante que permanece aps a ltima centrifugao denominado frao solvel. Outra tcnica de fracionamento celular a centrifugao contragradiente, onde as partculas so separadas por suas diferenas de densidade. O gradiente consiste em uma soluo que pode ser de sacarose cuja concentrao mxima na parte profunda do tubo de centrifugao e mnima na superfcie. Existe, portanto, no tubo, um gradiente de densidade crescente de cima para baixo. Logo aps ter sido preparado o gradiente, coloca-se o homogeneizado sobre sua superfcie e faz-se a centrifugao. Impulsionadas pela fora centrfuga, as partculas penetram no gradiente. Cada tipo de partcula pra no local onde h equilbrio entre a fora centrfuga da partcula e a concentrao do gradiente. As fraes obtidas por qualquer tcnica de fracionamento devem ser examinadas quanto sua pureza. Para isso podem se empregar os microscpios pticos e eletrnico, ou mtodos bioqumicos que demonstram na frao a predominncia de um composto que lhe caracterstico. Por exemplo, a frao dos lisossomos apresenta quantidade muito elevada de

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fosfatase cida, enquanto a frao nuclear muito rica em DNA. Uma vez isoladas, as organelas e as incluses podem ser estudadas por diversos mtodos. Sua composio qumica pode ser determinada e sua atividade metablica estudada fora da clula e, portanto, em um meio rigorosamente controlado. Isoladas, as organelas no esto mais sujeitas aos mecanismos intracelulares de controle, de modo que seu funcionamento pode ser testado mais livremente pelo experimentador, embora as condies sejam artificiais, em comparao com o meio intracelular. Esquemas das diversas fases da tcnica radioautogrfica. Tomou-se como exemplo o estudo da sntese de DNA pela injeo de timidina radioativa. Clulas hepticas incubadas durante 1 hora em soluo nutritiva contendo uridinaH3. Esse nucleosdeo utilizado pela clula para fabricar RNA. Notar a predominncia dos grnulos de prata sobre o ncleo celular, indicando sntese de RNA. Colorao pela hematoxilina citosina. Aumento: 1.500 X. Se empregar os microscpios pticos e eletrnico, ou mtodos bioqumicos que demonstram na frao a predominncia de um composto que lhe caracterstico. Por exemplo, a frao dos lisossomos apresenta quantidade muito elevada de fosfatase cida, enquanto a frao nuclear muito rica em DNA. Uma vez isoladas, as organelas e as incluses podem ser estudadas por diversos mtodos. Sua composio qumica pode ser determinada e sua atividade metablica estudada fora da clula e, portanto, em um meio rigorosamente controlado. Isoladas, as organelas no esto mais sujeitas aos mecanismos intracelulares de controle, de modo que seu funcionamento pode ser testado mais livremente pelo experimentador, embora as condies sejam artificiais, em comparao com o meio intracelular. possvel separar as clulas de um tecido e isolar um determinado tipo celular Vrios procedimentos possibilitam a separao das clulas que constituem os tecidos. A primeira etapa geralmente consiste na destruio da arquitetura da matriz extracelular (por meio de enzimas como colagenase e tripsina) e das junes que unem as clulas, muito freqentes nos epitlios glandulares e de revestimento. Para isso, preciso retirar os ons Ca2+, que participam da aderncia entre as clulas, com auxlio do EDTA {ethilenediaminetetraacetic acid) que capta os ons Ca2+ removendo-os do meio. Depois de separadas, as clulas continuam misturadas, e os tipos celulares desejados precisam ser isolados. O isolamento das clulas pode ser feito de diversas maneiras. Elas podem ser isoladas por centrifugao, de acordo com seus tamanhos e densidade. Certas clulas, como

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os macrfagos, tm tendncia para aderir ao vidro e a plsticos e, assim, podem ser isoladas das clulas que no tm essa tendncia. Mas a maneira mais precisa e eficiente de isolar um nico tipo celular em grande quantidade pelo uso de um aparelho denominado FACS (fluorescence-activated cell sorter). As clulas em suspenso so tratadas com um anticorpo fluorescente que se ligue especificamente superfcie de certas clulas. A medida que a suspenso de clulas passa pelo aparelho, as clulas fluorescentes so desviadas para um recipiente, enquanto as no-fluorescentes sero colhidas em outro recipiente. Estudo de clulas vivas e culturas de clulas animais e vegetais As clulas retiradas do corpo de um animal ou de uma planta podem ser estudadas, por algum tempo, enquanto esto vivas. Para isso elas devem ser colocadas em meio isotnico, que no lhes causa alterao de volume. Como quase sempre os constituintes celulares so incolores e transparentes, torna-se necessrio o uso do microscpio de contraste de fase. Em alguns casos, podem-se empregar corantes supravitais, que so pouco txicos e penetram na clula viva, corando determinadas estruturas. Um corante supravital bastante empregado o verde-jano, que cora as mitocndrias. Quando se quer estudar clulas vivas por tempo mais longo, costuma-se cultivlas em solues nutritivas (meios de cultura), onde o comportamento e metabolismo celulares so estudados em condies mais bem definidas do que no corpo de um animal. As culturas possibilitam o estudo dos movimentos celulares, da mitose, da ao de diversas substncias sobre as clulas e da secreo, pela clula, de produtos que iro acumular-se no meio de cultura. As culturas so feitas principalmente em frascos, com clulas isoladas dos tecidos pela aplicao de diversas tcnicas, como foi mencionado anteriormente. A maioria das clulas no vive em suspenso em meio lquido, necessitando de uma superfcie slida sobre a qual crescem e se dividem. Essa superfcie pode ser a prpria parede dos frascos de plstico onde so feitos os cultivos. Porm, a maioria das clulas no adere parede do frasco, a no ser que esta esteja recoberta por molculas teciduais extracelulares, como o colgeno. O cultivo em frasco possibilita o emprego de meios de cultura quimicamente definidos, constitudos por aminocidos, glicdios, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento, que so protenas especficas, estimuladoras da proliferao e diferenciao de certos tipos celulares. Um exemplo o fator de crescimento para clulas nervosas ou NGF (nerve growthfactor). Na ausncia desse fator, no se podem cultivar clulas nervosas. As clulas retiradas do corpo de um animal e cultivadas diretamente constituem as culturas primrias. Em geral, as clulas das culturas primrias morrem aps um certo nmero

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de mitoses (50 a 100 mitoses). Mas, s vezes, algumas clulas sofrem mutao e se tornam imortais, isto , multiplicam-se indefinidamente, constituindo as culturas secundrias. As clulas imortais formam as linhagens celulares, que no so constitudas de clulas inteiramente normais, pois sofreram alguma mutao, sendo chamadas clulas transformadas. Todavia, elas conservam muitas caractersticas das clulas normais, sendo muito usadas em diversos experimentos. As linhagens derivadas de clulas transformadas in vitro ou de clulas cancerosas apresentam certas particularidades. Por exemplo, elas podem crescer sem se prenderem parede do frasco e multiplicam-se muito mais do que as clulas normais, atingindo uma densidade populacional maior. Graas dissociao, combinada com engenhosas tcnicas de isolamento celular, foi possvel a obteno de cultivos de clones derivados de uma nica clula. As clulas desses clones podem expressar muitas de suas especializaes funcionais. Os cultivos vm sendo usados para estudos do metabolismo de clulas normais e cancerosas e, alm disso, tm sido valiosos para experincias com vrus, que s se multiplicam no interior das clulas. Alguns protozorios foram estudados, tambm, em culturas de clulas por se desenvolverem no citoplasma. Na citogentica, as culturas celulares so de grande utilidade, facilitando muito o estudo dos cromossomos de clulas vegetais e animais. A determinao de caritipos humanos (estudo do nmero e morfologia dos cromossomos de uma pessoa) geralmente feita em culturas de clulas do sangue. Quando se generalizou o emprego de culturas de clulas para cultivar vrus, observou-se que alguns vrus tm molculas fusognicas, com a propriedade de induzir as clulas a se fundirem, formando clulas binucleadas e clulas multinucleadas (sinccios), mesmo quando se trata de clulas de animais de espcies diferentes. Formam-se assim clulas com cromossomos de espcies diferentes, denominadas heterocrios. Os heterocrios tm sido utilizados para o estudo da fisiologia do ncleo celular e, principalmente, dos efeitos do citoplasma sobre o ncleo. Esquema da tcnica de centrifugao fracionada. O sobrenadante de cada tubo centrifugado novamente, cada vez com maior fora centrfuga. Os desenhos da direita mostram os componentes celulares do sedimento de cada tubo. A fora centrfuga representada por G; 1.000 G significa 1.000 vezes a fora da gravidade. Gentrifugao contra gradiente. esquerda, antes da centrifugao, com a

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amostra colocada sobre o gradiente de concentrao de sacarose. direita, aps a centrifugao, mostrando as faixas, cada uma delas contendo, geralmente, um tipo de organela. O vrus Sendai, do grupo dos mixovrus, o preferido para a obteno de heterocrios. Esse vrus, que causa no homem uma doena parecida com a gripe, foi isolado pela primeira vez em Sendai, no Japo, da recebendo o nome. Os vrus inativados pela radiao ultravioleta no perdem a propriedade de promover a fuso das clulas, sendo preferidos para se obter heterocrios, pois assim no h proliferao virtica, o que dificultaria a observao dos fenmenos celulares. Nos heterocrios binucleados, os ncleos geralmente entram em mitose de modo sincrnico; mas, como se forma um nico fuso, o resultado so duas clulas-filhas, cada uma com um ncleo constitudo por cromossomos de ambos os ncleos iniciais do heterocrio. Desse modo, formam-se clulas mononucleadas mas que possuem cromossomos de espcies animais diferentes. Essas clulas podem multiplicar-se numerosas vezes, embora freqentemente ocorra a eliminao de algum cromossomo em cada diviso, havendo tendncia para permanecerem os cromossomos de uma espcie, enquanto os da outra vo sendo parcialmente eliminados. O heterocrio formado pela fuso de clulas HeLa, que sintetizam DNA e RNA, com eritrcitos de galinha os quais no sintetizam DNA e quase no sintetizam RNA forneceu importantes resultados quanto aos efeitos do citoplasma sobre o ncleo. O estudo desse heterocrio facilitado pela lise que o vrus provoca no eritrcito de galinha. Destruindo a membrana do eritrcito, o vrus isola o ncleo dessa clula, que penetra no citoplasma da clula HeLa. A clula HeLa uma linhagem celular obtida a partir de um carcinoma uterino humano. Uma vez que o citoplasma do heterocrio deriva exclusivamente da HeLa, qualquer modificao no ncleo do eritrcito s pode ser promovida pelo citoplasma da clula HeLa. Observa-se que, aps penetrar na HeLa, o ncleo do eritrcito, que condensado, aumenta de volume e sua cromatina se torna frouxa, dando ao ncleo um aspecto claro. Ao mesmo tempo, esse ncleo adquire a capacidade de sintetizar DNA e RNA. Esse experimento demonstra que a atividade sinttica do ncleo e sua capacidade de multiplicar o material gnico so influenciadas pelo citoplasma. Muitos tipos de clulas vegetais tambm podem ser mantidas em meios de cultura, onde crescem e se multiplicam, como o fazem as clulas animais. A separao das clulas dos vegetais exige procedimentos diferentes. Inicialmente, necessrio submeter as clulas ao da enzima celulase, que digere a celulose, principal constituinte de suas

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paredes. A destruio das paredes libera as clulas envoltas apenas pela membrana plasmtica e que, nessa condio, so denominadas protoplastos. Os protoplastos podem ser cultivados em meios de cultura adequados, de composio qumica definida, que possibilitam que eles cresam e se dividam por mitoses. Quando as condies da cultura so adequadas, os protoplastos, depois de diversas divises mitticas, acabam formando pequenos agregados de clulas indiferenciadas. Esses agregados podem ser induzidos a originar plantas inteiramente novas, indicando que as clulas vegetais so totipotentes, o que no acontece com as clulas animais. Essa propriedade das clulas vegetais cultivadas de dar origem a um novo indivduo completo (planta) inexistente nas clulas animais e tem sido utilizada na agricultura. As clulas vivas, animais e vegetais, podem ser submetidas a diversas tcnicas de microcirurgia que utilizam instrumentos com extremidades de dimenses microscpicas. Entre esses instrumentos, geralmente feitos de vidro, esto agulhas de diversas formas, bisturis, pipetas e eletrodos. Atravs da microcirurgia, possvel proceder determinao do pH intracelular, ao deslocamento e remoo de organelas e vesculas, ao transplante de partes de uma clula para outra e remoo, por seccionamento, de fragmentos celulares. A microcirurgia feita com aparelhos especiais, denominados micromanipuladores, que proporcionam movimentos muito precisos e delicados. Resumo Os conhecimentos sobre as clulas progridem medida que as tcnicas de investigao se aperfeioam. O aparecimento de um novo instrumento de trabalho, ou a aplicao mais engenhosa de um aparelho j existente, leva sempre a novas descobertas e elucidao de algumas funes celulares. O estudo da clula comeou com o microscpio ptico ou de luz, que, j em 1896, atingia grande eficincia graas s primeiras objetivas de grande resoluo. O emprego desse aparelho em combinao com a descoberta de tcnicas de microtomia e colorao permitiu o estudo morfolgico das clulas com grandes detalhes. O microscpio ptico tem evoludo, com o microscpio de contraste de fase, o microscpio confocal e os sistemas eletrnicos de intensificao, armazenamento e processamento de imagens. Outro passo foi representado pela utilizao sistemtica de tcnicas citoqumicas. Essas tcnicas permitiram o conhecimento da composio qumica de muitos componentes celulares que antes eram estudados apenas do ponto de vista morfolgico. O isolamento de organelas por centrifugao diferencial ou fracionada representou outro grande avano, pois

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assim foi possvel estudar, in vitro, tanto a composio qumica precisa como tambm as funes das organelas. O advento do microscpio eletrnico com seu emprego para estudos morfolgicos e citoqumicos representou enorme impulso para o conhecimento das funes celulares. A influncia do microscpio eletrnico foi to grande que levou a uma reviso completa nos conceitos morfolgicos dos constituintes celulares. Atualmente, a forma e a estrutura das organelas so geralmente descritas conforme aparecem no microscpio eletrnico. O emprego conjunto das tcnicas modernas, incluindo a radioautografia, a cultura de clulas em meios nutritivos definidos, o emprego do microscpio defluorescncia, do microscpio confocal, dos microscpios eletrnicos, das tcnicas de criofratura e das tcnicas bioqumicas, veio ampliar de tal maneira o estudo das clulas, que se tornou usual designar essa nova abordagem sob a rubrica de Biologia Celular e Molecular.