TESE DE MESTRADO - PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

Avaliação de Neutrófilos Circulantes em Pacientes com Neoplasia Pré-invasiva e

Invasiva de Colo Uterino

PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

UBERABA–MG 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

Avaliação de Neutrófilos Circulantes em Pacientes c om Neoplasia Pré-invasiva e Invasiva de Colo Uterino

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Patologia, sub-área

Patologia Ginecológica e Obstétrica, da

Universidade Federal do Triângulo Mineiro

como requisito para obtenção do título de

Mestre em Patologia Ginecológica e

Obstétrica.

ALUNO : PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA

UBERABA – MG

2006

Capa: Lençóis Maranhenses

Foto: Cristian Knepper e Márcio Vasconcelos

Criação: VCR Comunicação e Marketing

Catalogação na fonte por Beatriz Gabellini Alves - Biblioteca da UFTM

F411a Fernandes Junior, Paulo Cesar Avaliação de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia pré-invasiva e invasiva de colo uterino. / Paulo Cesar Fernandes Junior. – – 2006. 106f.: tab.; graf.; fig. Tese de Mestrado em Patologia Ginecológica e Obstétrica – Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba-MG, 2006. Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Martins Tavares Murta

1. NEOPLASIA DE COLO UTERINO. 2. NEUTRÓFILOS. 3. ESTADIAMENTO.

4. FUNÇÃO CELULAR. I. Título. II. Murta, Beatriz Martins Tavares.

NLM – WP458

ii

Apoio Financeiro:

• Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)

• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

Local de desenvolvimento do trabalho:

• Ambulatório de Oncologia Ginecológica e Mastologia da Disciplina de

Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Escola da UFTM

• Laboratório da Disciplina de Farmacologia do Departamento de Ciências

Biológicas da UFTM

iii

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

TÍTULO: AVALIAÇÃO DE NEUTRÓFILOS CIRCULANTES EM PACIENTES COM NEOPLASIA PRÈ-INVASIVA E INVASIVA DE COLO UTERINO

AUTOR: PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA

APROVADO COMO PARTE DAS EXIGÊNCIAS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO

DE MESTRE EM PATOLOGIA (SUB-ÁREA PATOLOGIA GINECOLÓ GICA E

OBSTÉTRICIA) PELA COMISSÃO EXAMINADORA:

PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA-MG

PROFª. DRª. WIRLA MARIA DA SILVA CUNHA TAMASHIRO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP-CAMPINAS-SP

PROFª. DRª. RENATA MARGARIDA ETCHEBEHERE

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA

DATA DA REALIZAÇÃO: 02 DE AGOSTO DE 2006

_________________________________________ PRESIDENTE DA COMISSÃO EXAMINADORA

PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA - ORIENTADORA -

iv

Dedico Este Trabalho Especialmente:

Aos meus pais Paulo Cesar e Maria Emília ,

Pelo apoio e, apesar da distância, pelo amor, cumplicidade, carinho...

Aos meus orientadores, Dra. Beatriz e Dr. Eddie , pela confiança e exemplos de

atuação profissional...

A Andréia , pelo seu amor, paciência e cumplicidade....

v

AGRADECIMENTOS

À Professora Beatriz Martins Tavares Murta, pessoa ímpar na orientação e apoio

recebidos durante a realização deste trabalho. Ainda, pela atenção, amizade e

confiança dispensadas e, sobretudo, pela seriedade e profissionalismo que tanto

contribuíram para minha formação.

Ao Professor Eddie Fernando Candido Murta, pela co-orientação, pelo aprendizado

no contexto clínico e cirúrgico das pacientes participantes de nosso trabalho e pelo

exemplo como médico e professor pesquisador.

Às mulheres, pacientes e voluntárias, pela participação e especialmente, por

acreditarem na ciência e assim contribuir para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos funcionários do Laboratório da Disciplina de Farmacologia, Januário Barbosa

dos Santos Júnior e Douglas Cobo Micheli, pelo auxílio na realização das técnicas e

no dia-a-dia no laboratório e, principalmente, pela amizade e dedicação.

Às secretárias da Disciplina de Farmacologia e da Disciplina de Ginecologia e

Obstetrícia, Beatriz Cibele Resende Gerolin, Kelly Cristina de Araújo Pantaleão e

Viviane Beatriz Rodrigues Matos, pelo auxílio em várias etapas deste trabalho, pelo

companheirismo, dedicação e grande amizade.

À professora Maria Angélica, por quem tenho um carinho muito especial, exemplo

daqueles que possuem o dom da arte de ensinar.

vi

Aos colegas do curso de Pós-Graduação, em especial, Cristiana Bernadelli, pela

paciência, respeito e aprendizado.

Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, pela oportunidade de conhecimento

nas mais diversas áreas da ciência.

À Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Disciplinas de Ginecologia e

Obstetrícia e Farmacologia da UFTM, pela acolhida e pela estrutura que permitiu o

desenvolvimento da pesquisa.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................21

1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco ...............21

1.2. Resposta Inflamatória ....................................................................................24

1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória ..............................................................28

2. HIPÓTESE ...........................................................................................................32

3. OBJETIVOS .........................................................................................................34

4. PACIENTES E MÉTODOS ..................................................................................36

4.1. Pacientes .......................................................................................................36

4.2. Tratamento ....................................................................................................37

4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes ....................38

4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos ....................38

4.4.1. Coleta de Sangue ......................................................................................38

4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulantes .......................................39

4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia ................................................................................40

4.4.4. Ensaio de Fagocitose .................................................................................46

4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagentes e Drogas ......................49

4.5.1. Meios de Cultura e Soluções ....................................................................49

viii

4.5.2. Corantes e Reagentes ................................................................................50

4.5.3. Drogas e Citocinas .....................................................................................50

4.5.4. Zimosan ....................................................................................................51

4.6. Análise Estatística ........................................................................................51

5. RESULTADOS ....................................................................................................53

5.1. População de Estudo ....................................................................................53

5.2. Avaliação do Leucograma..............................................................................53

5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilos entre Controles e

Pacientes .......................................................................................................58

5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento

Inicial e avançado ..........................................................................................61

5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento

Inicial antes e após tratamento ......................................................................63

5.6. Avaliação da Função Fagocítica ...................................................................65

6. DISCUSSÃO .........................................................................................................68

7. CONCLUSÃO ......................................................................................................79

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................81

ANEXOS

ix

LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS

Figura 1 . Tipos de Câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não

melanoma, na população brasileira ..................................................................... 22

Figura 2 . Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000

mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a Unidade da Federação

(Neoplasia Maligna do Colo Uterino).................................................................... 22

Figura 3 . Evento Celular da Inflamação .............................................................. 25

Figura 4 . Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo anticoagulante.

............................................................................................................................. 40

Figura 5 . Microcâmara de quimiotaxia................................................................. 42

Figura 6 . Curva Dose-Efeito do Número de Neutrófilos Emigrados .................... 45

Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de colo

uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ................................................................. 55

Figura 8 . Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo

uterino dos grupos NIC/MICRO e INV (Avaliação quantitativa) ........................... 56

Figura 9 . Presença ou não de neutrofilia (n° absoluto de ne utrófilos >70% leucócitos

x

totais) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV

............................................................................................................................. 57

Figura 10. Presença ou não de neutrofilia (n° absoluto de neut rófilos >6.500/mm3)

em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ...... 57

Figura 11 . Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com

neoplasia de colo uterino em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos

(10-7M) fMLP, LTB4, e IL-8.................................................................................... 59

Figura 12 . Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com

neoplasia de colo uterino comparando-se a resposta aos

quimioatraentes (10-7M) ..................................................................................... 60

Figura 13 . Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO e INV em

resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. .... 61

Figura 14 . Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes dos grupos NIC/MICRO INV,

comparando-se a resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. ................ 62

Figura 15 . Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO antes e

cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos estímulos

(10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 .................................................................................... 63

Figura 16 . Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO antes e

xi

cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta ao RPMI e

aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. ............................................................ 64

Figura 17 . Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo

uterino e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de acordo com o

estadiamento ....................................................................................................... 65

Figura 18 . Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO nos tempos antes e cerca de 30

dias após tratamento cirúrgico.. ........................................................................... 66

Prancha 1 . Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) quimiotaxia de

neutrófilos-10x-400-vezes.jpg); (foto 2) quimiotaxia de neutrófilos-50x-2000-

vezes.jpg; (foto 3) quimiotaxia de neutrófilos -100x-4000-vezes.jpg) ................. 43

Prancha 2 . Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) fagocitose em

neutrófilos -10x-jpg.jpg; (foto 2) fagocitose em neutrófilos-100x-jpg.jpg; (foto 3)

fagocitose em neutrófilos -100x.-jpg.jpg .............................................................. 47

xii

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BSA – soroalbumina bovina

°C – grau Celsius

CO2 – dióxido de carbono

FIGO – Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia

fMLP – formil-metil-leucil-fenilalanina

g – grama

GM-CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos

HE – Hospital Escola

HPV – papilomavírus humano

IF – índice fagocítico

IFN – interferon

IL – interleucina

INCA – Instituto Nacional do Câncer

l – litro

LT – leucotrieno

µl – microlitro

µm – micrômetro

M – molar

MCP – proteína quimiotática para monócitos

M-CSF – fator estimulador de colônia de monócitos

mg – miligrama

MHC – complexo de histocompatibilidade principal

min – minuto

MIP – proteína inflamatória de macrófagos

xiii

ml – mililitro

n – número da amostra

NIC – neoplasia intraepitelial cervical

NK – natural killer

P.A. – para análise

PBS – solução salina tamponada com fosfato

pH – potencial hidrogeniônico

q.s.p. – quantidade suficiente para

RNL – relação neutrófilo-linfócito

TGF – fator de crescimento e transformação

TNF – fator de necrose tumoral

UFTM – Universidade Federal do Triângulo Mineiro

UI – Unidade internacional

x g – aceleração da gravidade

____________________________ ____________________________ ____________________________ ____________________________ RESUMO

Resumo _____________________________________________________________

xv

O câncer de colo uterino é o segundo tipo de câncer mais comum em

mulheres no mundo. No Brasil, o número de novos casos esperados para 2006 é de

19.260 (MS/INCA-2005). Uma vez que os neutrófilos apresentam atividade anti-

tumoral e que funções de leucócitos circulantes podem estar alteradas em pacientes

com câncer de diferentes origens, nosso objetivo foi verificar se pacientes com

neoplasia de colo uterino, em diferentes estadiamentos, apresentam alterações no

número e/ou função quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes e o efeito do

tratamento sobre esses parâmetros. Foram estudadas 21 mulheres sadias

voluntárias (Grupo Controle) e 23 pacientes, sendo 11 diagnosticadas como NIC alto

grau ou carcinoma microinvasivo (Grupo NIC/MICRO) e 12 como carcinoma invasivo

(Grupo INV) por meio de biópsia. De acordo com o estadiamento, as pacientes

foram submetidas à cirurgia (grupo NIC/MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O

leucograma das pacientes no momento do diagnóstico mostrou neutrofilia e aumento

da relação neutrófilo/linfócito (RNL) na maioria das pacientes em estadiamento

avançado, em oposto ao observado no grupo em estadiamento inicial. A quimiotaxia

de neutrófilos purificados do sangue periférico foi avaliada em microcâmara em

resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 comparados a migração aleatória

(RPMI). As pacientes (Grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos

estímulos quimiotáticos, porém menor para LTB4 e IL-8 comparado ao grupo

controle (p<0,05). Ainda, foi observado que as pacientes do grupo INV tiveram

quimiotaxia reduzida a todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo

NIC/MICRO (p<0,01). Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias), houve

aumento da migração dos neutrófilos em resposta aos estímulos fMLP e LTB4 em

pacientes do grupo NIC/MICRO (p<0,05). A função fagocítica foi avaliada utilizando

zimosan sensibilizado como partícula fagocítica e os resultados apresentados por

Resumo _____________________________________________________________

xvi

meio do índice fagocítico (IF). Não foi observada diferença no IF entre controles e

pacientes, porém, considerando o estadiamento, observou-se uma redução da

capacidade fagocítica em pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO

(p=0,015). Após o tratamento cirúrgico, não foi observada variação estatisticamente

significante quanto ao IF em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=6). Conclui-se que o

estadiamento mais avançado no câncer cervical é fator determinante para o

aumento do número de neutrófilos circulantes e a redução da função dessas células.

A retirada da lesão aumentou a capacidade de migração dos neutrófilos frente aos

estímulos quimiotáticos, sugerindo a produção de mediadores inibitórios circulantes

pelas células tumorais. A neoplasia de colo uterino mesmo em estadiamento pré-

invasivo pode ser considerada como uma doença com repercussões sistêmicas.

Palavras-chave : neoplasia de colo uterino; estadiamento; neutrófilos; função celular.

__________________________ __________________________ __________________________ __________________________ ABSTRACT

Abstract _____________________________________________________________

xviii

Cervical cancer is the second most common type of cancer in women

worldwide. In Brazil, the number of new cases awaited for 2006 is 19.260 (MS/INCA-

2005). Considering that neutrophils may present anti-tumor activity and that sistemic

leucocyte functions can be altered in cancer patients, our aim was to verify if patients

with cervical neoplasia, at different tumor stage, present alterations in the number

and/or chemotactic and phagocytic function of circulating neutrophils and the effect of

treatment on these parameters. It was enrolled twenty one healthy women (Control

Group) and 23 patients, being 11 diagnosed as cervical intraepithelial neoplasia

grade III or microinvasive carcinoma (NIC/MICRO Group) and 12 as invasive

carcinoma (INV Group) through biopsy. According to tumor stage, patients were

submitted to surgery (NIC/MICRO Group) or chemotherapy (group INV). Leucogram

of patients upon diagnosis showed neutrofilia and increased neutrophil/lymphocyte

ratio in most patients of advanced tumor stage (INV Group), in opposite to results

found in patients at early stage group (NIC/MICRO Group). The chemotactic activity

of blood peripheral neutrophils was evaluated in microchemotaxis chamber assay

towards the chemotactic stimuli (10-7M) fMLP, LTB4 and IL-8, compared to random

migration (RPMI). Total patient group had significant neutrophil migration in response

to the chemotactic stimuli, however lesser for LTB4 and IL-8 compared to controls

(p<0,05). Moreover, it was observed that patients from INV group had reduced

neutrophil migration to all the chemotactic stimuli compared with NIC/MICRO group

(p<0,01). After surgical treatment (around 30 days) neutrophil migration was increase

towards fMLP and LTB4 in patients of NIC/MICRO group (p<0,05). Phagocytic

function was evaluated using sensitized zimosan as phagocytic particle, and the

results were presented as the phagocytic index (IF). It was not observed differences

Abstract _____________________________________________________________

xix

in IF between controls and patients. However considering tumor stage, a reduction of

phagocytic activity was observed in patients of INV group compared to NIC/MICRO

group (p=0,015). After surgical treatment in pacients of NIC/MICRO group (n=6) no

significant differences were observed compared to time upon diagnosis. It can be

concluded that advanced tumor stage in cervical cancer is a determinant factor for

the increase in the number of circulating neutrophils and reduction in the function of

these cells. The withdrawal of neoplasia cells increased the capacity of neutrophil

migration suggesting the production of circulating mediators by tumor cells. Cervical

cancer, even at initial stages, can be seen as an illness with systemic findings.

Keywords: cervical cancer; neutrophil; tumor stage; cellular function.

_______________________ _______________________ _______________________ _______________________ INTRODUÇÃO

Introdução _______________________________________________________________

21

1. INTRODUÇÃO

1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco

O câncer de colo uterino destaca-se dos demais tumores malignos do trato

genital feminino pela maior freqüência e por levar a óbito, grande número de

mulheres em idade ainda jovem (GUSBERG; RUNOWICZ, 1991). Em 2006, estima-

se o aparecimento de 237.480 novos casos de câncer não especificados em

mulheres. Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), espera-se, para o ano de

2006, cerca de 20.000 novos casos de câncer do colo uterino (Figura 1 ). Na região

sudeste, existe uma estimativa de 7.970 novos casos de câncer de colo de útero

para este ano, sendo que, no Rio Grande do Sul, se observa a maior incidência por

100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006 (30,9) (Figura 2 ).

Dentre os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino,

destaca-se a infecção pelo papilomavírus humano (HPV), pois, em 99,7% das

neoplasias invasivas do colo uterino, é detectado DNA do HPV (PEREYRA;

PARELLADA, 2003).

Introdução _______________________________________________________________

22

Fonte: MS/INCA-2005

Figura 2 : Representação espacial das taxas brutas de incidência de neoplasia maligna do

colo uterino por 100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a Unidade da Federação.

Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não melanoma, na população brasileira. Fonte: MS/INCA 2005.

Introdução _______________________________________________________________

23

Segundo um estudo controlado, o fator mais convincente relacionado com o risco de

câncer do colo do útero foi a presença dos tipos de HPV 16, 18, 31 e 33 (ELUF-

NETO et al., 1994).

Além do HPV, outros fatores de risco são identificados para o câncer de colo

de útero, tais como: baixas condições sócio-econômicas, início precoce da atividade

sexual, multiplicidade de parceiros, idade precoce do primeiro parto, tabagismo

(diretamente relacionado à quantidade de cigarros fumados), higiene íntima

inadequada e uso prolongado de contraceptivos orais. A prevenção primária do

câncer do colo de útero pode ser realizada por meio do uso de preservativos durante

a relação sexual, uma vez que a prática de sexo seguro é uma das formas de evitar

o contágio pelo HPV (MS/INCA, 2006).

A principal estratégia utilizada para detecção precoce da doença (prevenção

secundária), no Brasil, é pela realização do exame de Papanicolaou. Este teste,

combinado com o teste de HPV colhido por profissional de saúde, mostrou ser a

estratégia mais efetiva (maior número de casos detectados) para a detecção

precoce da neoplasia de colo uterino, em um estudo de custo-efetividade realizado

pelo INCA. Porém, pelo seu alto custo, torna-se incompatível com a realidade

brasileira (INCA, 2006).

A transformação maligna do epitélio do colo uterino, normalmente, é um

processo lento, que passa pelos estádios (facultativo) de displasia e carcinoma in

situ (neoplasia intraepitelial cervical, NIC I-III) até o carcinoma invasivo. A maioria

das neoplasias cervicais invasivas (90-95%) deriva do epitélio escamoso; 2-8% do

epitélio colunar. Por definição, a neoplasia intraepitelial cervical (NIC) é pré-invasiva

e limitada ao epitélio. Existem três estádios de desenvolvimento. O primeiro é a

Introdução _______________________________________________________________

24

transição de NICII a NICIII, quando a possibilidade de reversão da displasia é menor.

O segundo é o início do crescimento invasivo (estádio IA1) com invasão estromal

microscópica inferior a 5 mm de profundidade e 7 mm de largura do estroma cervical

subjacente. A terceira é a transformação de microcarcinoma (estádio IA1) para

doença franca (estádio IB), invadindo além do útero, mas não a parede pélvica ou o

terço inferior da vagina, quando a lesão desenvolve potencial metastático

(SELLORS; SANKARANARAYANAN, 2003).

Em fases muito precoces da invasão do estroma, a neoplasia do colo uterino

pode não dar origem a sintomas manifestos ou características clínicas e, portanto, é

conhecida como doença invasiva pré-clínica. O câncer cervical (estádio IB-IV), com

freqüência, apresenta um ou mais dos seguintes sintomas: hemorragia

intermenstrual, hemorragia pós-coito, fluxos menstruais mais intensos, corrimento

seroso purulento excessivo, corrimento de odor fétido, cistite recorrente, urgência

miccional e aumento da freqüência urinária, dor nas costas e dor abdominal no

quadrante inferior. Em estádios avançados, as pacientes podem apresentar falta de

ar devido à anemia grave, uropatia obstrutiva, edema de membros inferiores,

hematúria, obstrução intestinal e caquexia (SELLORS; SANKARANARAYANAN,

2003).

1.2. Resposta Inflamatória

A inflamação é uma resposta do organismo a diversos agentes lesivos, como,

por exemplo, microorganismos, queimaduras, trauma físico ou células tumorais

(DEJANA, CORADA; LAMPUGNANI, 1995).

Introdução _______________________________________________________________

25

Os neutrófilos, também denominados leucócitos polimorfonucleares, graças

aos seus núcleos morfologicamente diferenciados e multilobulados, são os mais

numerosos dentre os granulócitos presentes no sangue periférico. Estas células

respondem rapidamente aos estímulos quimiotáticos, realizam funções fagocitárias e

são a população celular principal na resposta inflamatória (ABBAS; LICHTMAN;

POBER, 1995). Após sua migração, os neutrófilos são ainda capazes de liberar mais

mediadores, o que promove a amplificação da resposta inflamatória (HEIT et al.,

2002). O recrutamento de neutrófilos para o local da inflamação envolve uma

seqüência de eventos (ativação, rolamento, adesão e transmigração), coordenada

por moléculas de adesão expressas na superfície dos leucócitos e das células

endoteliais, envolvidas na interação leucócito-endotélio (Figura 3 ).

O início do rolamento dos neutrófilos é mediado pela ligação reversível das

glicoproteinas selectinas encontradas tanto no neutrófilo como no endotélio

(SPERTINI et al., 1991; KADONO et al., 2002). Devido à expressão de outras

glicoproteínas na superfície dos leucócitos, denominadas de integrinas, que

Modificado de Holgate ST, Church MK, Lichtenstein LM. — Allergy. 2end edition. London: Mosby

Endotélio

Tecido

Fagocitose

Quimiotaxia

Correntesangüínea

Atividademicrobicida

TNF-ααααIL-8 ÓxidoÓxido

NítricoNítrico=

==

=

=

=

== =

=

=

=

==

=

=

=

= ==

Macrófagos

TGF-ββββIL-10

Figura 3 : Evento Celular da Inflamação

Introdução _______________________________________________________________

26

reconhecem moléculas de adesão endoteliais (família das imunoglobulinas), ocorre a

ligação de alta afinidade dos leucócitos ao endotélio. A Mac-1 é reconhecida como a

integrina mais relevante na maioria dos modelos de resposta inflamatória com

participação de neutrófilos, com sítios de ligação específicos nas células endoteliais

(WAGNER; ROTH, 1999). Entre as células endoteliais, ocorre a transmigração do

neutrófilo, que, para chegar ao local de injúria tecidual, se move em direção ao

gradiente quimiotático representado por um excesso de mediadores (DITTMAR et

al., 2000).

A migração celular é um evento chave na resposta inflamatória de qualquer

etiologia. Os leucócitos circulantes migram em resposta aos mediadores

inflamatórios liberados no sítio de lesão, como os componentes do sistema

complemento (C5a), os produtos derivados da via das lipooxigenases (LTB4) e as

quimiocinas (COUSSENS; WERB, 2002). Grande parte destes agentes

quimiotáticos, IL-8, fMLP, LTB4 e C5a, ligam-se aos neutrófilos por receptores

transmembrana específicos. Estes receptores ativam as proteínas G triméricas, nos

neutrófilos, iniciando, deste modo, a sinalização que permitirá a essas células

migrarem para os sítios inflamatórios. As quimiocinas, subdivididas em quatro

famílias (CXC, CC, C e CX3C), de acordo com a seqüência de resíduos de cisteína,

podem controlar a evolução natural da resposta inflamatória, recrutando células

efetoras específicas. Desta forma, a contínua produção de citocinas no sítio

inflamatório torna-se importante para o desenvolvimento de uma doença crônica,

incluindo uma neoplasia (WAHL; KLEINMAN, 1998).

Sabe-se que, para manter outras funções importantes dos leucócitos, como a

fagocitose e atividade microbicida, é essencial que sua função quimiotática esteja

preservada (MacFADDEN, SAITO; PRUZANSKI, 1985). Em pacientes com sepse

Introdução _______________________________________________________________

27

observa-se redução da função quimiotática de neutrófilos comparado a voluntários

sadios, maior no grupo de pacientes não sobreviventes, sugerindo que essa

disfunção contribui para o prognóstico da doença (TAVARES-MURTA et al., 2002).

Em doenças infecciosas, o papel de neutrófilos como células de defesa é bem

documentado. Em pacientes com AIDS, as drogas antiretrovirais aumentam a

quimiotaxia de neutrófilos e monócitos e reduzem a incidência de infecções

(MASTROIANNI et al.,1999).

A fagocitose é um evento celular complexo no qual partículas são

reconhecidas, internalizadas e eliminadas. Consistindo na primeira linha de defesa

do organismo na remoção de microorganismos, esse processo envolve o

reconhecimento de antígenos por receptores de superfície nas células fagocíticas,

iniciando a polimerização e a internalização de partículas externas ou organismos no

fagossomo (ALLEN; ADEREM, 1996). Além de microorganismos, a remoção de

células em apoptose ocorre por fagocitose (FRANK, WHITE; EZEKOWITZ, 1999).

Na superfície do fagócito, são expressos vários receptores capazes de reconhecer e

decodificar seus ligantes cognatos, presentes na superfície de agentes infecciosos e

células apoptóticas, e desencadear o englobamento (STUART; EZEKOWITZ, 2005).

Neste processo, ocorre interação de receptores de membrana com moléculas

específicas ligantes, localizadas na superfície de partículas. O complexo ligante-

receptor estimula a reorganização local do citoesqueleto de actina submembranosa,

que provê força para a internalização das partículas (KWIATKOWSKA; SOBOTA,

1999). A fagocitose é seguida pela fusão do fagossomo com lisossomos contendo

enzimas digestivas, formando o fagolisossomo, seguindo-se a degradação da

partícula. O remodelamento e a homeostase do número de células são outras

funções para as quais a fogocitose foi adaptada. Desta forma, o excesso de células

Introdução _______________________________________________________________

28

ou células danificadas, removidas durante o desenvolvimento, está diretamente

relacionado com a apoptose ou morte programada de células (STUART;

EZEKOWITZ, 2005).

1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória

Os tumores malignos, ou câncer, crescem de modo descontrolado, invadem

os tecidos normais e, freqüentemente, desencadeiam metástases e crescem em

sítios distantes do tecido de origem. O câncer pode surgir, a partir de quase todos os

tecidos do organismo. Os derivados de células epiteliais, denominados carcinomas,

são os tipos mais comuns. Sarcomas são tumores malignos dos tecidos

mesenquimatosos surgindo a partir de células como fibroblastos, células musculares

e adiposas. A presença de infiltrados de células mononucleares, compostos de

linfócitos T, células NK e macrófagos circundando diversos tumores, assim como o

achado freqüente de proliferação linfocitária (hiperplasia) nos linfonodos de

drenagem dos sítios de crescimento tumoral sugere que os tumores podem ser

imunogênicos. Uma função fundamental do sistema imune é o reconhecimento e a

destruição de células malignas denominadas “clones mutantes”, antes que elas

cresçam e originem tumores. Vários tipos de antígenos tumorais estudados são

compartilhados por diferentes tumores, sendo denominados antígenos associados a

tumor, podendo ser encontrados em células tumorais e em células normais (ABBAS;

LICHTMAN; POBER, 1995).

Os macrófagos são células potencialmente importantes da imunidade anti-

tumoral, pois são capazes de lisar, preferencialmente, as células tumorais e não as

células normais. Na resposta imune contra o HPV, tanto na região cervical como na

Introdução _______________________________________________________________

29

circulação periférica, o ambiente pode tornar-se favorável à transformação de

neoplasias, o que permite a progressão de lesões intraepiteliais cervicais para

carcinoma cervical (AHMED et al., 2002). A imunidade local é considerada fator

importante no desenvolvimento do carcinoma cervical. Em tecidos tumorais,

encontra-se infiltrado de leucócitos no próprio estroma (NEGUS et al., 1997) e nos

líquidos neoplasicos (MONTOVANI et al., 1997).

Vários estudos têm demonstrado que as citocinas podem modular o

desenvolvimento tumoral (SRIVANI; NAGARAJAN, 2003). Síntese de RNAm para IL-

1α, IL-1β, IL-6, IL-8 e proteína quimiotática para macrófago (MCP-1) foi detectada

em diversas linhagens de células de carcinoma cervical (HAZELBAG et al; 2001).

Acredita-se que os neutrófilos ativados pela IL-8 tenham papel tumoricida

(SCHROEDER et al., 1990), além de produzir mediadores capazes de reduzir o

crescimento tumoral (LLOYI., OPPENHEIN, 1992). Por outro lado, a IL-8 pode

promover a migração de células tumorais (WANG et al., 1990) e, em associação

com os fatores de crescimento de endotélio vascular (VEGF) e derivado de

plaquetas (PDGF), produzido por células malignas ou pelo estroma, participar na

angiogênese do carcinoma cervical (FUJIMOTO et al., 2000). Em pacientes com

câncer de mama, foi demonstrada, já no sítio tumoral, a correlação positiva entre o

número de macrófagos infiltrantes, grau de vascularização e prognóstico da doença

(LEEK et al,. 1996).

Sabe-se que, no infiltrado de células inflamatórias tumorais, macrófagos e

neutrófilos desenvolvem papel importante na progressão e disseminação de vários

tipos de tumores (BALKWILL; MONTOVANI, 2001; COUSSENS; WERB, 2002).

Funções celulares podem estar alteradas em pacientes com câncer de diferentes

origens, já no momento do diagnóstico (LUKAC et al., 1994; GEBHARD et al., 2000).

Introdução _______________________________________________________________

30

Além disso, durante o tratamento, as drogas quimioterápicas podem alterar funções

de leucócitos circulantes (HUMPHREYS et al., 1993, MENDONÇA et al., 2006).

Dependente do sistema citotóxico clássico, o efeito anti-tumoral dos

neutrófilos têm sido sugerido como um importante mecanismo na depuração de

células tumorais (KOGA et al., 2004). Uma vez que os neutrófilos podem exercer

atividade anti-tumoral por meio de diferentes mecanismos (KIM et al., 2000), o

conhecimento de alterações de funções de leucócitos, em determinadas doenças

,possibilita a correção farmacológica desses defeitos, o que pode ser benéfico para

o prognóstico da doença.

______________________________________________________ HIPÓTESE

Hipótese ________________________________________________________________

32

2. HIPÓTESE

Pacientes com neoplasia de colo uterino devem apresentar alterações no

número e funções de neutrófilos, variáveis de acordo com o estadiamento do tumor.

___________________________________________________ OBJETIVOS

Objetivos ________________________________________________________________

34

3. OBJETIVOS

3.1. Verificar se ocorrem alterações no número e/ou na função quimiotática e

fagocítica de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo

uterino, em estadiamento inicial ou avançado da doença, antes do início de

qualquer tratamento.

3.2. Verificar o efeito do tratamento sobre os parâmetros acima descritos.

__________________________ PACIENTES E MÉTODOS

Pacientes e Métodos _______________________________________________________

36

4. PACIENTES E MÉTODOS

4.1. Pacientes

Foram estudadas pacientes com neoplasia de colo uterino, independente do

estadiamento, não submetidas a tratamento anterior, atendidas no Ambulatório de

Oncologia Ginecológica do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo

Mineiro (HE/UFTM). O diagnóstico foi realizado por meio de história, exame clínico

e ginecológico - incluindo toque retal para a avaliação de paramétrios, citologia

oncótica, colposcopia e biópsia de colo uterino. O diagnóstico citopatológico seguiu

a classificação de BETHESDA (KURMAN; SOLOMON, 1994) e a de Richart (1990)

(SILVEIRA; PESSINI, 2000), sendo as lâminas avaliadas pelos citopatologistas da

instituição (HE-UFTM). As análises das biópsias guiadas por colposcopia foram

efetuadas pelo serviço de Patologia Cirúrgica do HE-UFTM.

Para estadiamento e avaliação pré-tratamento, foram utilizados Raio X de

tórax; eletrocardiograma; ultrassonografia de abdome total e pélvico; tomografia

computadorizada de abdome total e tórax; rotina de sangue, incluindo hemograma,

eletrólitos, uréia, creatinina, transaminases, bilirrubina (total e frações), glicemia de

jejum, proteínas (total e frações), urina I e urocultura com antibiograma.

Foram considerados critérios de exclusão, as pacientes submetidas a

tratamento anterior ou em estado de imunossupressão (diagnóstico de doença

imunossupressora ou uso de medicamentos).

As pacientes avaliadas tiveram diagnóstico de NIC (grupo NIC), carcinoma


37

microinvasivo (grupo MICRO) ou carcinoma invasivo (grupo INV). Posteriormente,

foram agrupadas em estadiamento inicial (grupo NIC/MICRO) ou avançado (grupo

INV).

Os controles foram mulheres adultas (≥ 18 anos) voluntárias sadias, isto é,

sem doença diagnosticada, sem uso de medicamentos imunossupressores, e com

citologia cervicovaginal normal nos últimos 12 meses, abordadas quando da

realização dos experimentos.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres

Humanos em 19 de dezembro de 2003 (Protocolo número 445). O “Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido para Participação em Pesquisa” (Anexo J) foi

lido e assinado pelas participantes ou seu responsável, quando de acordo em

participar da pesquisa.

4.2. Tratamento

Conforme o estadiamento, as pacientes foram submetidas a tratamento

cirúrgico (grupo NIC e MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O tratamento cirúrgico

consistiu de um dos seguintes procedimentos: 1) conização: procedimento

diagnóstico, mas que, em muitos casos, promove uma terapia definitiva, descrito

como sendo a retirada de um cone de tecido do colo uterino contendo toda a lesão;

2) histerectomia simples: retirada do útero; 3) cirurgia de Wertheim-Meigs: remoção

do útero, ovários, tubas uterinas, paramétrios, linfadenectomia pélvica.

O tratamento quimioterápico foi realizado com cisplatina (100 mg/m2) em

infusão intravenosa, durante 2 h no primeiro dia (D1), associada ao 5-fluorouracil (5-


38

FU, 1000 mg/m2 por dia) em infusão contínua do primeiro ao quinto dia (D1 a D5). O

intervalo entre os ciclos foi cerca de 21 dias.

Nas pacientes submetidas ao tratamento cirúrgico, foi efetuada uma segunda

coleta de sangue, cerca de 30 dias após a cirurgia, para nova avaliação.

4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes

Em todas as pacientes, foi realizado o leucograma no diagnóstico, como parte

da rotina de avaliação pré-tratamento. Mediante este exame, foram avaliados os

seguintes parâmetros: 1) Relação neutrófilo/linfócito (RNL), que é a divisão entre

número absoluto de neutrófilos e linfócitos. A RNL foi calculada para cada paciente e

determinada se <5 ou ≥5 (WALSH et al., 2005). 2) Presença ou não de neutrofilia,

definida como número de neutrófilos absolutos >6.500/mm3 ou ≥70% do número de

leucócitos totais, de acordo com o critério do laboratório no qual foi efetivado o

exame (Laboratório de Patologia Clínica HE-UFTM).

4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos

Circulantes

4.4.1. Coleta de Sangue

As amostras de sangue foram coletadas em 2 tempos: 1) no diagnóstico,

antes de qualquer tratamento; 2) cerca de 30 dias após o tratamento cirúrgico. A

coleta foi feita utilizando material descartável e esterilizado, seguindo os princípios

de assepsia. Em cada tempo, foi coletada 1 amostra de sangue (5 ml) em tubo


39

contendo anti-coagulante (heparina 100 UI/ml), empregada para o ensaio de

quimiotaxia e fagocitose de neutrófilos. O mesmo procedimento foi realizado para a

coleta de sangue das mulheres voluntárias sadias, em um único tempo.

4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulant es

Os neutrófilos presentes no sangue venoso coletado de pacientes e controles

foram isoladas pelo meio Histopaque (densidade 1,119), utilizado de acordo com as

instruções do fabricante (Sigma Chemical, St. Louis, MO). O sangue coletado foi

adicionado a um tubo contendo Histopaque, na proporção de 5,0 ml sangue/4,5 ml

Histopaque. Os tubos foram centrifugados (150 x g), em temperatura ambiente, até a

completa separação das bandas celulares (Figura 4 ). A camada de neutrófilos foi

coletada com o auxílio de micropipeta, e, a seguir, as células foram lavadas com

meio de cultura RPMI-1640 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) contendo soroalbumina

bovina (BSA) 0,01%, por meio de centrifugação (150 x g, 10 min, temperatura

ambiente), procedimento que foi repetido outras duas vezes. Logo após, as células

foram ressuspensas em 1,0 ml do mesmo meio.


40

Figura 4 : Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo anti-coagulante. A) Tubos de centrífuga mostrando as camadas das subpopulações de leucócitos isolados. B) Esquema demonstrativo da purificação de neutrófilos.

Foi realizada a contagem total e diferencial das células purificadas. Para a

contagem total, 20 µl da solução de células foram adicionados à solução de Turk

(400 µl), e as células foram contadas em câmara de Neubauer. A contagem

diferencial foi feita em lâmina preparada com 20 µl da solução de células em

citocentrífuga (150 x g, 5 min, Cito-Spin). A lâmina foi corada (corante de Rosenfeld)

e observada em microscópio de luz com objetiva em óleo de imersão (100x). Foram

contadas 100 células, diferenciando-se os tipos celulares – mononucleares,

neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Uma solução final de neutrófilos foi preparada

contendo 1,0 x 106 neutrófilos/ml RPMI-BSA.

4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia

A quimiotaxia foi efetuada em microcâmara de 48 poços (Neuro Probe, Cabin

John, MD), separados por membrana de policarbonato com poros de 5 µm de

A B

PLASMA

MONUCLEARES

NEUTRÓFILOS

HISTOPAQUE

HEMÁCIAS


41

diâmetro (Figura 5 ). Na câmara inferior, foram colocados 28,5 µl do meio de cultura

RPMI-BSA 0,01% (controle) ou de um dos estímulos quimiotáticos: fMLP, LTB4 ou

IL-8, diluídos em RPMI-BSA. Uma solução (50 µl) de células purificadas (1,0 x 106

células/ml) foi colocada na câmara superior. O ensaio foi feito em triplicata para cada

uma das amostras (paciente e controle). As câmaras foram incubadas por 60 min, a

37ºC e 5% CO2. Em seguida, a membrana de policarbonato foi removida, fixada e

corada (kit de coloração Hema 3 Stain set, Biochemical Sciences, Bridgeport, NJ).

O número de células emigradas para a parte inferior do filtro foi contado

(objetiva 100x) em 10 campos aleatórios (Prancha 1) . Os resultados foram

expressos com base no número de neutrófilos por campo. As células que migraram

em direção aos estímulos quimiotáticos foram consideradas como migração

direcionada, e as células que migraram em direção ao RPMI foram caracterizadas

como de controle (migração randomizada ou aleatória).

Foi realizado um ensaio inicial para avaliar o grau de migração de neutrófilos

induzida por diferentes concentrações dos estímulos quimiotáticos fMLP, LTB4 ou IL-

8. Para isso, foram utilizados neutrófilos obtidos de voluntárias sadias e foi

quantificada a resposta quimiotática de neutrófilos frente a diferentes concentrações

(10-8, 10-7 e 10-6 M) das substâncias quimioatraentes. A Figura 6 mostra o número

de neutrófilos emigrados em resposta ao fMLP, LTB4 e IL-8, sendo que a

concentração de 10-7 M, que promoveu efeito máximo, foi selecionada para uso nos

demais experimentos.


42

Figura 5: Microcâmara de quimiotaxia: os neutrófilos (106 células/ml) foram colocados na câmara superior e os estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 na câmara inferior.

50 µl de neutrófilos

Membrana de policarbonato

28,5 µl de RPMI ou estímulos (fMLP, LTB4 e IL-8, 10-7M)


43

Prancha 1

1

2

3


44

Prancha 1

Foto 1. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-10X-400-VEZES.jpg

Foto 2. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-50X-2000-VEZES.jpg

Foto 3. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS -100X-4000-VEZES.jpg

Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.

Microscópio KS-300, Laboratório de Patologia Geral, UFTM.


45

(M)

RPMI 10 -8 10 -7 10 -60

10

20

30

40

50

60

fMLP (M)

N°° °°

DE

NE

UT

RÓ

FIL

OS

/ C

AM

PO

��

�

RPMI 10 -8 10 -7 10 -60

10

20

30

40

50

N°° °°

DE

NE

UT

RÓ

FIL

OS

/ C

AM

PO

LTB 4

��

��

�

RPMI 10 -8 10 -7 10 -60

10

20

30

40

50

60

IL-8

��

��

�

N°° °°

DE

NE

UT

RÓ

FIL

OS

/ C

AM

PO

fMLP (M)

LTB 4 (M)

Figura 6. Curva Dose-Efeito do Número de Neutrófilos Emigrados. As barras indicam a migração de neutrófilos, obtidos de voluntárias, em resposta a diferentes concentrações (10-6, 10-7 ou 10-8M) de fMLP, LTB4 ou IL-8. O meio de cultura RPMI foi utilizado como controle. *p<0,01, **p<0,001 comparado ao RPMI (ANOVA + Teste de Bonferroni).


46

4.4.4. Ensaio de Fagocitose

Para o ensaio de fagocitose, os neutrófilos purificados foram utilizados na

concentração de 2,0 x 106/ml, e o zimosan sensibilizado (com plasma normal fresco

a 10%) foi utilizado como partícula fagocítica. As partículas de zimosan foram

pesadas e diluídas em PBS (1,0 ml). Desta suspensão, foram pipetados 10 µl e

colocados em 1,0 ml de plasma (10%) e incubados (37ºC, 5% CO2) sob agitação

para sensibilização das partículas. Esta mistura foi centrifugada (150 x g, 10 min) e

adicionada sobre o concentrado de células (1,0 ml). A solução de células e

partículas foi incubada durante 60 min (37ºC, 5% CO2), e, após esse tempo, as

células foram citocentrifugadas e coradas. Foram contadas 100 células em cada

lâmina, com e sem fagocitose, como também o número de partículas fagocitadas

(Prancha 2) . Os resultados foram expressos por meio do Índice Fagocítico (IF):

IF = % neutrófilos em fagocitose x número médio de partículas fagocitadas


47

Prancha 2

1

2

3


48

Prancha 2

Foto 1. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -10x-jpg.jpg

Foto 2. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS-100x-jpg.jpg

Foto 3. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -100X.-jpg.jpg

Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.

Microscópio KS-300, Laboratório de Patologia Geral, UFTM.


49

4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagent es e Drogas

4.5.1. Meios de Cultura e Soluções

a) Meio de cultura RPMI-1640 simples, com glutamina, sem bicarbonato de

sódio:

RPMI 1640 (Sigma) 10,4 g

Bicarbonato do sódio (Merck) 2,2 g

Água bidestilada e deionizada q.s.p. 1,0 l

O pH do meio foi acertado para 7,45 e a solução foi filtrada (filtros de Milipore

0,22 µm) e armazenada em geladeira antes do uso.

b) Meio de cultura RPMI-1640 contendo BSA 0,01%:

O meio de cultura foi preparado conforme descrito no item a, acrescido de

BSA fração V (Sigma), na concentração de 0,01g/100 ml, imediatamente antes do

uso, e esterilizado por filtros Milipore 0,22 µm antes do uso.

c) Solução salina tamponada com fosfato (PBS):

Cloreto de sódio P.A. (Merck) 80,0 g

Cloreto de potássio P.A. (Merck) 2,0 g

Fosfato de sódio dibásico P.A. (Merck) 11,5 g

Fosfato de potássio monobásico P.A. (Merck) 2,0 g


O pH da solução final foi acertado para 7,45 com NaOH 0,1 N, e a solução

autoclavada (127°C) antes do uso.


50

4.5.2. Corantes e Reagentes

a) Corante pancrômico de Rosenfeld

Giemsa-azul-eosina-azul de metileno 97 mg

May-Grunwald-eosina-azul de metileno 53 mg

Metanol (Merck) 100 ml

Após o preparo, o corante foi filtrado e estocado em temperatura ambiente.

b) Solução de Turk

Ácido acético glacial P.A. (Merck) 20,0 ml

Azul de metileno (Merck) 0,5 g


c) Azul de Tripan

Azul de Tripan (Reagen) 100 mg

PBS q.s.p. 100 ml

4.5.3. Drogas e Citocinas

a) fMLP (Sigma): a solução-mãe foi preparada na concentração de 5mg/ml,

diluída em 10% de DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma) e água estéril. A solução

utilizada nos experimentos foi, a seguir, diluída em RPMI-BSA.

b) LTB4 ou IL-8 (Sigma): foram diluídos em RPMI-BSA para obter a

concentração empregada.


51

4.5.4. Zimosan

Partículas de zimosan, na concentração de 5,0 mg/ml, foram diluídas em 1,0 ml

de PBS e estocadas em geladeira antes do uso.

4.6. Análise Estatística

Os resultados foram avaliados mediante o programa SigmaStat 2.0 e

apresentaram distribuição não paramétrica. As diferenças entre dois grupos e três ou

mais grupos não pareados foram comparadas por meio do teste de Mann-Whitney e

teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn, respectivamente. Diferenças

entre dois grupos pareados (pré e pós-tratamento) foram comparadas por meio do

teste de Wilcoxon. Os resultados foram expressos por medianas e percentis, valores

mínimo e máximo. A significância estatística foi estabelecida em p<0,05.

______________________________________________ RESULTADOS

Resultados _______________________________________________________________

53

5. RESULTADOS

5.1. População de Estudo

Foram avaliadas 23 pacientes com neoplasia de colo uterino, registrando

idade (média ± DP) de 47,8 ± 13,8 anos, sendo a média menor no grupo

apresentando estadiamento inicial (42 ± 12 anos) e maior no grupo com diagnóstico

de estádio mais avançado (53 ± 14 anos), porém sem diferenças estatisticamente

significativas. Os controles foram 21 mulheres adultas, voluntárias, na faixa etária de

34,9 ± 9,5 anos. Dentre as pacientes, 11 tiveram diagnóstico de NIC e/ou carcinoma

microinvasivo e 12 apresentaram carcinoma invasivo.

5.2. Avaliação do Leucograma

A análise deste exame, no momento do diagnóstico, mostrou que apenas

uma (10%) paciente do grupo NIC/MICRO apresentou RNL ≥5, comparado a 8

(67%) pacientes do grupo INV (p<0,05) (Figura 7 ). Em 22 pacientes o leucograma

foi avaliado, sendo que 1 paciente do grupo NIC/MICRO não apresentava

leucograma no momento do diagnóstico.

Analisando o número absoluto de neutrófilos, foi observado aumento nas

pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO (p<0,05) (Figura 8). A

análise de outros parâmetros de neutrofilia mostrou que quando esta foi considerada

como número absoluto de neutrófilos ≥70% do número de leucócitos totais, 9

pacientes (90%) em estadiamento inicial não apresentaram neutrofilia, enquanto que

Resultados _______________________________________________________________

54

em mais de 80% das pacientes do grupo INV a neutrofilia foi observada (Figura 9) .

Considerando neutrofilia como número absoluto de neutrófilos ≥6.500/mm3, de

acordo com o padrão do Laboratório de Patologia Clínica da UFTM, não foram

observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos NIC/MICRO e

INV (Figura 10) .

Resultados _______________________________________________________________

55

Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A RNL foi determinada pela divisão entre o número absoluto de neutrófilos e linfócitos apresentados no leucograma. *p<0,05 (Teste exato de Fisher).

NIC/MICRO

10%

90%

RNL

RNL

INV

67%

33%

RNL

RNL

≥≥≥≥ 5 (n=1)

< 5 (n=9)

≥≥≥≥ 5 (n=8)< 5 (n=4)

Resultados _______________________________________________________________

56

(n=10) (n=12)0

5000

10000

15000

20000

25000

NIC/MICRO INV

�

No.

de

abso

luto

de

neut

rófil

os

Figura 8 : Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo

uterino em estadiamento inicial (NIC/MICRO) e avançado (INV). p<0,05 (Mann-

Whitney)

Resultados _______________________________________________________________

57

Figura 9. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida como número de neutrófilos ≥70% em relação ao número de leucócitos totais apresentado no leucograma. *p<0,01 comparado aos grupos NIC/MICRO e INV (Teste exato de Fisher).

Figura 10. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida com número absoluto de neutrófilos >6.500/mm3 determinado pelo leucograma. p>0,05 (Teste exato de Fisher).

NIC/MICRO

90%

10%

Sem neutrofilia (n=9)

Com neutrofilia (n=1)

INV

83,3%

16,6%



NIC/MICRO

70%

30%



INV

33%

67%



Resultados _______________________________________________________________

58

5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilo s entre Controles e

Pacientes

A função quimiotática foi avaliada em 22 pacientes e 15 controles, sendo que,

em cada ensaio, foi utilizado pelo menos 01 controle. Não foi possível realizar o

ensaio de quimiotaxia na paciente de número 11 pelo número insuficiente de células

obtidas na purificação (Anexo D).

As pacientes (grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos

estímulos quimiotáticos (fMLP, LTB4, IL-8), comparada à migração aleatória (RPMI),

assim como o grupo controle (Figura 11 ). Porém, quando comparados cada

estímulo entre os grupos, essa migração foi menor para LTB4 e IL-8 nas pacientes

com neoplasia de colo uterino comparada ao grupo controle (p<0,05) (Figura 12 ).

Resultados _______________________________________________________________

59

RPMI fMLP LTB4 IL-8 0

5

10

15

20

25 A

��

�

No. d

e ne

utró

filos

/cam

po


5

10

15

20

25

�

�

�

B

No. d

e ne

utró

filos

/cam

po

Figura 11. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle (n=15, painel A) e de pacientes com neoplasia de colo uterino (n=22, painel B) em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,001) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

Resultados _______________________________________________________________

60

0

5

10

15

20

25Controles

Pacientes

RPMI

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

25 fMLP

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

25

�

LTB4

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

25

�

IL-8

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

Figura 12. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle (n=15) e de pacientes com neoplasia de colo uterino (n=22) comparando-se a resposta aos quimioatraentes (10-7M). As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%,e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao grupo controle (Mann-Whitney).

Resultados _______________________________________________________________

61

5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento

Tanto as pacientes do grupo NIC/MICRO quanto do grupo INV apresentaram

significativa migração de neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8,

comparada à migração aleatória (RPMI) (Figura 13 ).

Entretanto quando comparados cada estímulo entre os grupos, foi observado

que as pacientes do grupo INV tiveram migração de neutrófilos reduzida frente a

todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo NIC/MICRO (Figura 14 ).

RPMI fMLP LTB4 IL-80

5

10

15

20

�

�

�

Grupo NIC/MICRO

A

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo


5

10

15

20

� ��

Grupo INV

B

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

Figura 13. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=10, painel A) e INV (n=12, painel B) em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,001) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

Resultados _______________________________________________________________

62

0

5

10

15

20NIC/MICRO

INV

RPMI

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

�

fMLP

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

�

LTB4

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

0

5

10

15

20

�

IL-8

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

Figura 14. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12), comparando-se a resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,01 comparado ao grupo controle (Mann-Whitney).

Resultados _______________________________________________________________

63

5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento

Inicial antes e após tratamento

Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias) manteve-se preservada a

migração dos neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8 em pacientes do

grupo NIC/MICRO, da mesma forma como observado no momento do diagnóstico

(Figura 15 ). Porém a comparação de cada estímulo quimiotático entre os grupos,

mostrou que houve um aumento da migração dos neutrófilos em resposta ao fMLP e

LTB4 , quando comparada ao tempo pré-cirurgia (Figura 16 ).


10

20

30

�

�

�

PRÉA

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

RPMI fMLP LTB 4 IL-8 0

10

20

30

�

��

PÓSB

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

Figura 15. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=4) antes (PRÉ, painel A) e cerca de 30 dias após (PÓS, painel B) tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,05) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

Resultados _______________________________________________________________

64

Figura 16. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=4) antes e cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao tempo pré-tratamento (teste de Wilcoxon).

RPMI

0

5

10

15

20

25Pré-tratamentoPós-tratamento

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

fMLP

0

5

10

15

20

25�

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

LTB4

0

5

10

15

20

25

�

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

IL-8

0

5

10

15

20

25

No.

de

neut

rófil

os/c

ampo

Resultados _______________________________________________________________

65

5.6. Avaliação da Função Fagocítica

O índice fagocítico foi avaliado em 17 pacientes, sendo 09 do grupo

NIC/MICRO e 08 do grupo INV, e em 18 controles.

A função fagocítica avaliada, utilizando zimosan sensibilizado como partícula

fagocítica, não demonstrou diferença entre controles e pacientes (Figura 17, Painel

esquerdo ), mas, considerando o estadiamento, o IF foi menor em pacientes do

grupo INV, comparado ao grupo NIC/MICRO (p=0,015) (Figura 17, Painel direito ).

Não foi observada variação significativa quanto ao IF antes e após cirurgia em

pacientes do grupo NIC/MICRO (Figura 18 ).

CONTROLES PACIENTES NIC/MICRO INV0

10

20

30

40

50

60

70

Pacientes

�

(n=18) (n=17) (n=9) (n=8)

Índi

ce F

agoc

ítico

Figura 17. Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo uterino (painel esquerdo) e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de acordo com o estadiamento (painel direito). As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskall-Wallis (p<0,05) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao grupo NIC/MICRO.

Resultados _______________________________________________________________

66

PRÉ PÓS0

10

20

30

40

50

60

70

Índi

ce F

agoc

ític

o

Figura 18. Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO (n=6) nos tempos antes (PRÉ) e cerca de 30 dias após (PÓS) tratamento cirúrgico. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo.

__________________________________________________ DISCUSSÃO

Discussão _______________________________________________________________

68

6. DISCUSSÃO

Alterações de funções celulares em pacientes com câncer já são estudadas

há algum tempo e constituem-se em tema de controvérsias. Trabalhos específicos

em câncer de colo uterino são escassos, desta forma, no presente estudo, foram

avaliadas as funções quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes de pacientes

com neoplasia de colo uterino, comparando a mulheres voluntárias sem doença

diagnosticada, utilizadas como grupo controle.

A incidência do câncer de colo uterino já é evidenciada em mulheres na faixa

etária de 20 a 29 anos, e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico,

geralmente, na faixa etária de 45 a 49 anos (MS-INCA, 2006). Em acordo, neste

estudo, a idade média do grupo total de pacientes foi de 48 anos, sendo a média

menor no grupo apresentando estádio inicial (43 anos) e maior no grupo com

diagnóstico em estádio mais avançado (53 anos). Porém tem sido observado

aumento da incidência de estadiamentos mais avançados, assim como as lesões

precursoras, em pacientes mais jovens (HERBST et al., 1992; PALO et al., 2002).

Trabalhos clássicos demonstram que o câncer do colo uterino é mais agressivo em

mulheres jovens, com idade inferior a 40 anos (CHAVES et al., 1984).

Recentemente, tem sido proposto que o microambiente tumoral é capaz de

controlar, por meio da liberação de mediadores específicos, como as quimiocinas, a

migração de leucócitos e outras funções desempenhadas por essas células após

sua chegada no sítio tumoral, sendo essencial para o início e a regulação da

resposta inflamatória/imune (FINE et al., 2001; BALKWILL; MANTOVANI, 2001).

Discussão _______________________________________________________________

69

A maioria dos estudos relacionados aos mecanismos envolvidos na

eliminação de células tumorais in vivo tem-se centralizado, principalmente, nas

funções de macrófagos e linfócitos. Porém os neutrófilos também são capazes de

exercer atividade anti-tumoral (KIM et al., 2000, DALLEGRI et al. , 1991; KOGA et

al., 2004).

Os neutrófilos são os mais numerosos leucócitos circulantes, representando

cerca de 50-60% do total dessas células. Seu citoplasma possui grânulos que

contêm enzimas digestivas e proteínas microbicidas denominadas defensinas, estas

com alto potencial tóxico contra os vários tipos de células tumorais. As membranas

plasmáticas podem expressar diversos receptores e outras estruturas necessárias

para o reconhecimento e eliminação de microorganismos. Seus alvos constituem as

bactérias, fungos, protozoários, vírus e células tumorais (KOGA et al., 2004).

Neste estudo, procuramos avaliar possíveis alterações no número e/ou

função de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo uterino,

relacionadas ao estadiamento da doença. Nossos resultados demonstraram clara

associação entre alterações no número de neutrófilos circulantes - neutrofilia - e

estádios mais avançados da doença (figuras 8, 9 e 10 ), em acordo com recentes

relatos.

Outro estudo em pacientes com câncer de colo uterino encontrou leucocitose

com aumento do número de neutrófilos comparado a controles. Ainda, foi observado

aumento nos níveis plasmáticos de IL-10 e redução de IFN-ϒ, caracterizando desvio

na produção sistêmica de citocinas do perfil Th2, no grupo de pacientes com câncer

e, também, já em pacientes com displasia severa (NICIII). Os resultados

demonstravam que a displasia grave apresenta alterações sistêmicas semelhantes

Discussão _______________________________________________________________

70

ao câncer invasivo, e dados clínicos reforçam que a maioria das lesões desse tipo

não regridem espontaneamente e, ao contrário, podem progredir para carcinoma

invasivo se não tratadas (BAIS et al., 2005)

Dentre as várias alterações observadas em pacientes portadores de sarcoma

de partes moles, entre as mais freqüentes, estão a leucocitose e a neutrofilia.

Quanto mais avançada a doença, maior foi a tendência em apresentar alterações

hematológicas. Em pacientes com tumores sólidos malignos, também se observam

freqüentemente, alterações hematológicas (leucocitose, neutrofilia, monocitose,

trombocitose e diminuição da hemoglobina) correlacionadas de maneira significativa

com o prognóstico do paciente (RUKA et al., 2001).

Em pacientes com melanoma metastático, a neutrofilia foi considerada como

fator prognóstico independente, associada à redução da sobrevida, avaliado por

meio de testes estatísticos específicos (SCHMIDT et al., 2005).

Em pacientes com carcinoma renal metastático, o aumento do número de

neutrófilos e monócitos circulantes foi considerado fator determinante para pior

prognóstico (NEGRIER et al., 2005) e também para resposta reduzida ao tratamento

com IL-2 (DONSKOV et al., 2006). Outro recente estudo também mostrou que, em

pacientes com carcinoma pancreático, a neutrofilia esteve associada a um

prognóstico desfavorável (FOGAR et al., 2006).

Em pacientes com vários tipos de câncer - mama, próstata e glioma - a

população de células dendríticas circulantes também demonstrou estar alterada,

sendo constituída, essencialmente, (30-65%) de células imaturas, diferente da

população reconhecida como linhagem mielóide e plasmacitóide normal. Esta

Discussão _______________________________________________________________

71

alteração foi ainda mais evidente em pacientes com a doença em estadiamentos

mais avançados (PINZON-CHARRY et al., 2005).

A relação neutrófilo-linfócito (RNL) tem sido sugerida como um índice da

resposta inflamatória sistêmica em pacientes com doenças críticas (ZAHOREC,

2001). Recentemente, foi demonstrado que pacientes com câncer colo-retal e RNL

elevada (≥5) tiveram menor sobrevida, avaliada em dois anos, comparado a

pacientes com RNL <5. Foi sugerido que a RNL é um método simples para

identificar os pacientes com pior prognóstico (WALSH et al., 2005). Em acordo,

nossos resultados foram semelhantes, em que a RNL ≥5 foi encontrada na grande

maioria das pacientes com neoplasia de colo uterino em estadiamento mais

avançado, em oposto ao observado em pacientes do grupo NIC/MICRO (figura 7 ).

De maneira semelhante, foi observado, em pacientes com câncer de colo de útero,

neutrofilia associada a linfocitopenia (GARCIA-GONZALES et al., 1992), o que fala a

favor de um aumento da RNL.

É possível que, em pacientes com neoplasia de colo uterino, tais parâmetros,

obtidos a partir do leucograma no momento do diagnóstico, sejam de valor

prognóstico, embora isso não tenha sido aqui avaliado. Esses parâmetros podem ser

calculados com base nos dados disponíveis nos serviços de rotina, não requerendo

gasto adicional, além de possuir razoável sensibilidade e especificidade.

Um aspecto intrigante desses relatos é como a progressão do câncer

contribui com alterações no número de populações de células circulantes. Como

possíveis mecanismos estão: 1) produção de fatores por células tumorais, por

exemplo, GM-CSF (Fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos),

capazes de mobilizar precursores pela medula óssea; e 2) produção de fatores por

Discussão _______________________________________________________________

72

células tumorais, VEGF (Fator de crescimento do endotélio vascular), IL-6, M-CSF

(Fator estimulador de colônia de monócitos), prostanóides, capazes de alterar a

diferenciação das células, por exemplo, no caso de células dendríticas a partir de

seus progenitores (PINZON-CHARRY et al., 2005). O conhecimento dos

mecanismos envolvidos nessas alterações pode contribuir para o desenvolvimento

de novas estratégias terapêuticas no câncer.

Considerando as funções de neutrófilos, em todos os ensaios de quimiotaxia,

foi utilizada uma única concentração dos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8, selecionada

por meio da análise da curva dose-efeito (Figura 6 ). Os agentes quimiotáticos

utilizados possuem diferentes vias de produção. O fMLP é identificado como um

peptídeo derivado de bactérias, capaz de estimular monócitos e neutrófilos humanos

e de outras espécies animais (SUGAWARA et al., 1995). As quimiocinas são uma

complexa família de pequenas proteínas, que diferem de fatores quimiotáticos

clássicos, como o fMLP, em relação à especificidade que apresentam para

determinados tipos de leucócitos (PROOST, WUYTS; VAN DAMME, 1996). A IL-8 é

uma quimiocina produzida por vários tipos celulares e reconhecida, particularmente

por sua habilidade em atrair e ativar neutrófilos no sítio inflamatório, promovendo

liberação de enzimas e atividade oxidativa. A IL-8 aumenta a expressão de

moléculas de adesão, como as integrinas, na superfície dos neutrófilos, favorecendo

a adesão leucócito-endotélio, mediante a ligação a receptores (CXCR1 e CXCR2) na

superfície dessas células (FURIE; RANDOLPH, 1995). Os leucotrienos são

mediadores lipídicos resultantes do metabolismo de ácidos graxos poliinsaturados

por uma família de enzimas denominadas lipooxigenases. São sintetizados por

células inflamatórias, notadamente, neutrófilos e macrófagos, após diferentes

estímulos como endotoxina e citocinas. Dentre os tipos de LTs, o LTB4, atua

Discussão _______________________________________________________________

73

especialmente, sobre os neutrófilos, induzindo sua quimiotaxia e ativação (FORD-

HUTCHINSON et al., 1984)

Considerando o grupo total de pacientes houve migração de neutrófilos aos

quimioatraentes (Figura 11 ), embora esta já se mostrasse reduzida (Figura 12 ),

comparada ao grupo controle. Já a fagocitose não mostrou diferenças entre os

grupos controle e pacientes (Figura 17, painel esquerdo) . Em outro estudo,

neutrófilos de pacientes com carcinoma do colo uterino, comparados ao grupo

controle, apresentaram atividade microbicida semelhante. (GARCIA-GONZALES., et

al., 1992). Alterações de funções de leucócitos são descritas em pacientes com

câncer de diferentes sítios primários. Em pacientes com câncer gastrointestinal, foi

observada redução da função quimiotática de neutrófilos, comparada a voluntários

sadios no momento do diagnóstico (DUIGNAN et al.; 1986). Neutrófilos obtidos do

sangue de pacientes com câncer de pulmão apresentam reduzida atividade

citotóxica, demonstrada mediante a redução da produção de radicais superóxidos

por essas células (HARA et al., 1992).

A atividade fagocítica de neutrófilos de pacientes com câncer de diferentes

origens e em idade mais avançada encontrou-se aumentada, comparada ao grupo

de pacientes jovens e saudáveis (GÖÇER et al., 2005). Também em pacientes com

carcinomatose peritoneal, foi observado aumento da atividade fagocítica quando

comparada com controles saudáveis (BASKIC et al., 2003).

Em pacientes com câncer de mama, foi verificada redução na atividade

microbicida de monócitos (LUKAC et al., 1994). Porém outros trabalhos não

encontraram diferenças na função quimiotática de neutrófilos avaliada no momento

do diagnóstico, comparada a mulheres voluntárias (MENDONÇA et al., 2006).

Discussão _______________________________________________________________

74

Uma possível explicação para as diferenças constatadas, quanto a alterações

em funções de leucócitos descritas em literatura, pode ser decorrente do

estadiamento do tumor. Já foi sugerido que o aumento de funções leucocitárias

poderia ser resultado da ativação do sistema imune celular em resposta à célula

tumoral, em fases iniciais (SUSS, BAKACS; RINGWALD, 1984), enquanto que a

redução nessas funções seria, principalmente, conseqüência da progressão da

doença (GEBHARD et al., 2000)

Neste trabalho, no grupo de pacientes com estadiamento avançado, embora

tenha ocorrido resposta quimiotática aos estímulos inflamatórios (Figura 13 ), esta foi

reduzida para todos os estímulos testados, comparada ao grupo em estadiamento

inicial (Figura 14 ).

Em mulheres com câncer ginecológico de diferentes origens, incluindo o colo

uterino, foi encontrada redução na produção de radicais superóxidos, já em estádios

iniciais e de forma mais marcada com a evolução da doença. Não está claro se as

alterações na produção de superóxidos apresentam relação causal ou se seriam

conseqüência do desenvolvimento da doença (PÓKA et al., 2000). Neste contexto,

um estudo prospectivo, que avaliou funções de neutrófilos e monócitos em pacientes

com câncer de mama, demonstrou que, após seguimento de 3 anos, o grupo com

alterações funcionais detectadas no momento do diagnóstico revelou pior

prognóstico (LUKAC et al., 1994).

A avaliação de pacientes com câncer gástrico em diversos estádios não

demonstrou diferenças na função fagocítica, quando comparada com pacientes

portadoras de patologias benignas (YAMAUE et al., 2000). Em nosso estudo,

quando as pacientes foram avaliadas como grupo total, não foram observadas

Discussão _______________________________________________________________

75

diferenças significantes no IF comparado ao grupo controle. Em experimentos

utilizando ratos com nefroma mesoblástico, foi notado em fases iniciais do

desenvolvimento tumoral, aumento da atividade fagocítica. Posteriormente, houve

redução desta, coincidindo com o aparecimento de metástase (SZÜCS et al., 1996).

De forma semelhante, em nosso trabalho, pacientes com estadiamento avançado

apresentaram redução dessa função celular.

Após o tratamento cirúrgico do grupo em estádio inicial (Grupo NIC/MICRO,

houve aumento significativo da quimiotaxia em resposta ao fMLP e LTB4 (Figura 16 ),

sugerindo que a retirada do agente lesivo (célula tumoral) aumentou a função

quimiotática do neutrófilo. Esses resultados, em conjunto com a redução da função

de neutrófilos nas pacientes com neoplasia de colo uterino, sugerem que as células

neoplásicas estimulam a produção de mediadores circulantes, capazes de interferir

no número e na função de leucócitos.

O acúmulo de células circulantes imaturas ou com sua capacidade funcional

reduzida poderia facilitar uma disfunção imune sistêmica, assim como a presença

dessas células no sítio tumoral poderia facilitar a progressão da neoplasia (PINZON-

CHARRY et al., 2005). É proposto que, em termos de resposta inflamatória, as

neoplasias constituem um paradoxo. Os tumores produzem citocinas e quimiocinas

que recrutam leucócitos. Entretanto existe uma deficiência em promover respostas

inflamatórias em outros sítios que não o tumoral. O mais provável é que as

quimiocinas produzidas pelo próprio tumor, quando presentes na circulação, possam

dessensibilizar os leucócitos ou, ainda, o tumor pode produzir citocinas

antiinflamatórias. Assim, uma capacidade defeituosa em promover uma resposta

inflamatória para outro local poderia coexistir com o contínuo recrutamento de

leucócitos para o sítio tumoral (BALKWILL; MANTOVANI, 2001).

Discussão _______________________________________________________________

76

Os neutrófilos podem exercer atividade anti-tumoral por meio de apoptose

(KIM et al., 2000), morte celular direta causada por liberação de radicais superóxidos

(DALLEGRI et al., 1991), e expressão de genes indutores de apoptose em células

malignas (KOGA et al., 2004). Foi demonstrado que o gene denominado ligante

indutor de apoptose, relacionado ao fator de necrose tumoral (TNF-α, TRAIL, TNF-

related apoptosis-inducing ligand) encontra-se expresso em nível 10 vezes superior

ao detectado em células mononucleares. Ainda, foi demonstrado que o efeito

citotóxico de neutrófilos sobre células leucêmicas é mediado em parte via TRAIL

(KOGA et al., 2004). Estudos pré-clínicos, avaliando o tratamento combinado de

carcinoma renal avançado, utilizando anticorpos anti-receptores tumorais específicos

e G-CSF ou GM-CSF, demonstraram que os granulócitos são a população de

células efetoras mais ativa (ELSASSER et al., 1996). O GM-CSF é capaz de

aumentar a citotoxicidade dos neutrófilos frente a células de melanoma,

neuroblastoma e de carcinoma colo-retal (DI CARLO et al., 2001). A observação de

que existe número substancial de neutrófilos em ascites (LICHTENSTEIN & KAHLE,

1985) e líquidos císticos (TAVARES-MURTA et al., 2004) de pacientes com câncer

pode sugerir que os neutrófilos desempenham papel ativo na depuração de células

tumorais (DI CARLO et al., 2001).

Apesar de apresentar potencial para controlar um tumor, o sistema imune,

freqüentemente, falha em prevenir a progressão tumoral. Defeitos em funções de

células dendríticas são peça chave nesse processo (PINZON-CHARRY et al., 2005).

Nossos resultados também evidenciam que a redução da função quimiotática e

fagocítica de neutrófilos foi associada ao estadiamento avançado, sugerindo a

participação dessas células na resposta imune ao carcinoma cervical.

Recentemente, foi demonstrado que α-defensinas, conhecidas como peptídeos de

Discussão _______________________________________________________________

77

neutrófilos humanos, bloqueiam a infecção pelo HPV, o que leva a crer que a

presença local dessas substâncias seria uma barreira natural à transmissão sexual

do HPV (BUCK et al., 2006).

Novas perspectivas têm sido abertas para explorar a função dos neutrófilos

no tratamento do câncer. A elaboração de sistemas capazes de direcionar e ativar

os neutrófilos no microambiente tumoral poderia ser uma proposta de estratégia

terapêutica (DI CARLO et al., 2001).

________________________________________________ CONCLUSÃO

Conclusão _______________________________________________________________

79

7. CONCLUSÃO

As alterações observadas, 1) em número e capacidade funcional de

neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo uterino e 2) após a

retirada cirúrgica da lesão com aumento da migração de neutrófilos, sugerem a

produção de mediadores circulantes pelas células tumorais, ainda em estadiamentos

iniciais. Além disso, as alterações em número e função dos neutrófilos associadas

ao estadiamento invasivo indicam a participação dessas células circulantes na

resposta imune ao tumor.

A neoplasia de colo uterino, mesmo em estadiamentos pré-invasivos, poderia

ser vista como uma doença com repercussões sistêmicas.

__________ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas __________________________________________________

81

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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_________________________________________________________ ANEXOS

Anexos __________________________________________________________________

93

ANEXOS

Anexo A

Pacientes com Neoplasia de Colo de Uterino

PACIENTES IDADE COR DA PELE* ESTADIAMENTO** TRATAMENTO

1 67 B NIC III Cirurgia





6 52 NB I A1 Cirurgia

7 32 B I A1 Cirurgia





12 67 B II B Quimioterapia




16 67 B III B Quimioterapia






22 48 B III A Quimioterapia

23 52 B IV B Quimioterapia *COR DA PELE: B=Branco NB=Não Branco **ESTADIAMENTO: Neoplasia Intraepitelial Alto Grau/Carcinoma in situ= NICIII IA1= Carcinoma Microinvasivo

Anexos __________________________________________________________________

94

Anexo B

Leucograma das Pacientes com Neoplasia de Colo Uter ino no momento do

diagnóstico

PACIENTES ESTADIAMENTO NÚMERO DE LEUCÓCITOS TOTAIS/mm 3

NÚMERO DE NEUTRÓFILOS TOTAIS/mm 3

70% DO NÚMERO DE LEUCÓCITOS TOTAIS/mm 3

RNL

1 NICIII 6200 3782 4340 1,8

2 NICIII 3300 1683 2310 1,2

3 - - - - -

4 NICIII 12900 8514 9030 4,1

5 NICIII 4600 2852 3220 1,9

6 IA1 4400 1584 3080 0,6

7 IA1 11100 6771 7770 2

8 IA1 14300 11869 10010 6,3

9 IA1 6380 3636 4466 1,7

10 NIC III 6000 3060 4200 1,2

11 NIC III 6000 2820 4200 1,3

12 IIB 6600 4488 4620 2,8

13 IIB 8250 5775 5775 3,3

14 IIB 7300 5840 5110 5,7

15 IIB 7490 3595 5243 1,5

16 IIIB 9600 7680 6720 5,3

17 IIIB 12700 9652 8890 6,9

18 IIIB 12300 10824 8610 14,3

19 IIIB 8667 7020 6066 5,7

20 IIIB 25500 19500 17500 5,2

21 IIB 8800 6864 6160 7,1

22 IIIB 9000 6570 6300 2,9

23 IVB 8200 6724 5740 6,8 RNL= Relação Neutrófilo/Linfócito

Anexos __________________________________________________________________

95

Anexo C

Quimiotaxia de neutrófilos em mulheres do grupo con trole

CONTROLES RPMI fMLP LTB 4 IL-8

2 0,7 6 4,9 5,5

3 2,4 13,3 11,7 12

5 1,5 9,9 20,2 19,4

6 1,9 4,2 4,4 12,7

9 1,8 10,7 12,4 13,2

11 1,8 10,2 11,1 8,9

12 3,4 13,3 12,4 13,8

13 2,9 12,8 19,5 14,2

14 6,5 12,2 11,7 11,1

16 5,3 12,1 12,1 13,6

17 1,1 10,5 10,4 13,4

18 1,3 7,9 9,7 11

19 1,6 18,2 19 18

20 1,3 6,5 7,9 10,7

21 1,1 4,9 3,1 6,3

Os valores indicam os números de neutrófilos emigrados por campo em resposta ao RPMI e aos estímulos fMLP, LTB4, e IL-8. (objetiva 100 x)

Anexos __________________________________________________________________

96

Anexo D

Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com Neoplas ia de Colo Uterino em

diferentes estadiamentos

Pacientes Estadiamento RPMI fMLP LTB 4 IL-8

1 NICIII 1,7 8,7 9,2 12,2

2 NICIII 2,4 12,9 9,8 9,1

3 NICIII 2,6 12,9 10,5 12

4 NICIII 2,2 16,5 18,6 15,7

5 NICIII 3,3 9,9 10,5 11,4

6 IA1 0,8 10,7 9,3 10,3

7 IA1 3,2 10,5 10,9 9,4

8 IA1 1,2 11,2 11,9 15,6

9 IA1 2,2 7,3 10,3 7,3

10 NICIII 1,4 7,5 9,3 12,1

11 - - - - -

12 II B 1,3 4,9 8,3 8,8

13 II B 2 9,6 10,6 8,8

14 II B 1,5 8,5 4,4 7,3

15 II B 1,5 6,3 4,7 5,3

16 III B 1,3 8,7 8,5 9

17 III B 3,3 6,9 10 7,3

18 III B 1,3 6,4 4,7 5,9

19 III B 3 3,1 3,4 9,8

20 III B 1,2 1,6 2,1 2,3

21 II B 2,9 9,7 8,4 5,5

22 III A 0,8 1,6 1,5 1,6

23 IV B 1 1,6 2,3 2,4 Os valores indicam os números de neutrófilos emigrados por campo em resposta ao RPMI e aos estímulos fMLP, LTB4, e IL-8. (objetiva 100 x)

Anexos __________________________________________________________________

97

Anexo E

Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com estadia mento inicial antes e após

o tratamento cirúrgico

PACIENTES Estadiamento* RPMI pré

fMLP pré

LTB 4 pré

IL-8 pré

RPMI pós

fMLP pós

LTB 4 pós

IL-8 pós

1 NICIII 1,7 8,7 9,2 12,2 - - - -

2 NICIII 2,4 12,9 9,8 9,1 3,6 21,8 17,2 22,9

3 NICIII 2,6 12,9 10,5 12 4,7 22 14,1 23,2

4 NICIII 2,2 16,5 18,6 15,7 - - - -

5 NICIII 3,3 9,9 10,5 11,4 2,4 12,1 14,3 12,7

6 IA1 0,8 10,7 9,3 10,3 - - - -

7 IA1 3,2 10,5 10,9 9,4 3,5 16,2 19,6 15,1

8 IA1 1,2 11,2 11,9 15,6 - - - -

9 IA1 2,2 7,3 10,3 7,3 - - - -

10 NICIII 1,4 7,5 9,3 12,1 - - - -

Número de neutrófilos por campo (objetiva 100x)

*ESTADIAMENTO: Neoplasia Intracervical Alto Grau/Carcinoma in situ= NICIII

IA1= Carcinoma Microinvasivo

(-) Não foi realizado o ensaio

Anexos __________________________________________________________________

98

Anexo F

Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com estadia mento avançado antes e

após o tratamento quimioterápico

Pacientes Estadiamento RPMI pré

fMLP pré

LTB 4 pré

IL-8 pré

RPMI pós

fMLP pós

LTB 4 pós

IL-8 pós

12 II B 1,3 4,9 8,3 8,8 - - - -

13 II B 2 9,6 10,6 8,8 - - - -

14 II B 1,5 8,5 4,4 7,3 - - - -

15 II B 1,5 6,3 4,7 5,3 2 3,1 6,7 10

16 III B 1,3 8,7 8,5 9 0,9 7,1 4,2 2,1

17 III B 3,3 6,9 10 7,3 - - - -

18 III B 1,3 6,4 4,7 5,9 - - - -

19 III B 3 3,1 3,4 9,8 2,4 10,5 6,7 10,2

20 III B 1,2 1,6 2,1 2,3 - - - -

21 II B 2,9 9,7 8,4 5,5 - - - -

22 III A 0,8 1,6 1,5 1,6 - - - -

23 IV B 1 1,6 2,3 2,4 - - - -

Número de neutrófilos por campo (objetiva 100x)


Anexos __________________________________________________________________

99

Anexo G

Índice Fagocítico em Mulheres do Grupo Controle

NÚMERO ÍNDICE FAGOCÍTICO

1 20

2 34

3 31

4 35

5 34

6 33

7 34

8 38

9 48

10 46

11 25

12 29

13 24

14 42

15 27

16 48

17 23

18 38

Índice Fagocítico = % neutrófilos em fagocitose x n° médio de partículas fagocitadas

Anexos __________________________________________________________________

100

Anexo H

Índice Fagocítico em Pacientes com estadiamento ini cial antes e após o

tratamento cirúrgico

NÚMERO ÍNDICE FAGOCÍTICO PRÉ – OP

ÍNDICE FAGOCÍTICO PÓS-OP

1 40 -

2 40 13,5

3 27 26

4 28 -

5 39 20

6 65 -

7 34 27

8 42 67

9 43 28



Anexo I

Índice Fagocítico em pacientes com estadiamento ava nçado antes e após o

tratamento quimioterápico

NÚMERO ÍNDICE FAGOCÍTICO

PRÉ-QT

ÍNDICE FAGOCÍTICO

PÓS-QT

12 23 -

13 55 -

14 23,8 -

15 21 10

16 20 -

17 13 -

18 22,1 -

19 32 19



Anexos__________________________________________________________________

101

Anexo J

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) e term o de consentimento livre e esclarecido

TESE DE MESTRADO - PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

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