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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE IMUNOLOGIA E BIOQUMICA
CARYNE MARGOTTO BERTOLLO
MECANISMOS DE MORTE CELULAR INDUZIDA
PELA RADIAO E EXPRESSO DE PROTENAS
NAS NOVAS LINHAGENS DE CNCER DE MAMA
HUMANO MACL-1 E MGSO-3
Belo Horizonte
2010
-
CARYNE MARGOTTO BERTOLLO
MECANISMOS DE MORTE CELULAR INDUZIDA
PELA RADIAO E EXPRESSO DE PROTENAS
NAS NOVAS LINHAGENS DE CNCER DE MAMA
HUMANO MACL-1 E MGSO-3
Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao
em Bioqumica e Imunologia do Instituto de Cincias
Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial para obteno do ttulo de
Doutor em Bioqumica e Imunologia.
Orientador: Alfredo Miranda Ges
Co-orientador: Adriano Monteiro de Castro Pimenta
Belo Horizonte
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS
2010
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INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Este trabalho foi realizado no laboratrio de Imunologia Celular e
Molecular, Departamento de Bioqumica e Imunologia, Instituto de
Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais, sob
orientao do Dr. Alfredo Miranda Ges e co-orientao do Dr. Adriano
Monteiro de Castro Pimenta.
APOIO FINANCEIRO:
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq);
- Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES);
- Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).
COLABORADORES:
- Dr. Agenor Valadares
- Dra. Cristiane Rodrigues Correa
- Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes
- Dra. Hlida Andrade
- Dr. Mrio da Silva Giusta
-
Ao Giovanni e Suellem, com saudades impossveis.
Agora est to longe/ ver a linha do horizonte me distrai/
Dos nossos planos que tenho mais saudade/
Quando olhvamos juntos/ Na mesma direo/
Aonde est voc agora/ Alm de aqui dentro de mim.../
Agimos certo sem querer/ Foi s o tempo que errou/
Vai ser difcil sem voc/ Porque voc est comigo/ O tempo todo.
Renato Russo
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AGRADECIMENTOS
A Deus, fonte de fora.
Ao prof. Alfredo, por seus ensinamentos e por sua humanidade.
Ao prof. Adriano pela oportunidade e colaborao.
s professoras Elaine e Hlida por dividirem seus conhecimentos, idias e materiais.
Ao prof. Dawidson e todos os integrantes de seu laboratrio, pela parceria.
Cris, por ter me mostrado que eu sou capaz de realizar muito mais do que eu
imaginava.
s colegas do LICM, pelo companheirismo e pelos ensinamentos. Betinha, Cntia,
Alessandra, Carol, Dbora, Elis, Estefnia, Luara, Luiza, Jankerle, Ju Lott, Ju
Barbosa, Marina, Naira, Natssia, Natalia, Priscilla, Patrcia, Paula, Silviene, Suzana,
Vivi Cristina, Vivi Gomide, etc.
Ao Mrio e ao Agenor, pela pacincia e pela ajuda em tantos experimentos.
Tati e rica, pela indispensvel ajuda no FACS.
Aos colaboradores do LIG-CDTN, Ferracine, Perptua, Pablo, Mrcio e Timteo,
pelo auxlio nas irradiaes.
Aos professores, colegas e funcionrios do Departamento de Bioqumica e
Imunologia.
Aos professores do curso de Farmcia da UFMG.
-
Aos amigos do Laboratrio de Farmacodinmica: Prof. Mrcio Coelho, Prof. Antnio
Carlos, Profa. Karina, Prof. Elias, Prof. Leonardo e Profa. Adriana, por tudo o que
representaram e representam na minha vida profissional e pessoal.
minha querida me, uma mulher feita de flores e de ao.
Ao meu pai, pelo apoio e confiana.
Ao Rossano e Luciana. Dizem que amigos so os familiares que podemos
escolher. Se eu precisasse escolher minha famlia, certamente teria escolhido vocs!
Obrigada por todos os momentos de imensa alegria! E, tambm, pela companhia
nos momentos complicados!
linda Laura, que mostrou to rpido que recomear possvel.
Ao Giovanni, pelo exemplo de dedicao e competncia. A sua presena na minha
vida sempre foi indispensvel.
Suellem, por ter me ensinado a valorizar o poder de sonhar. Onde quer que esteja
voc continua vivendo em nossos sonhos.
Ao Alisson, obrigada por existir e estar em minha vida.
famlia Luzia, pelo carinho e por terem me recebido.
Tula, ao Haynner e a Geovana, por terem ficado por perto.
Aos Margottos e Bertollos, pela ajuda indispensvel para a concluso desse
trabalho.
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Donde concluo que um dos ofcios do homem fechar
e apertar muito os olhos a ver se continua pela noite
velha o sonho truncado da noite moa.
Machado de Assis
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RESUMO
O cncer representa uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estima-
se que em 2008 7,6 milhes de pessoas morreram em conseqncia dessa
condio patolgica. No Brasil, o cncer de mama o segundo tipo de cncer mais
comum e so esperados 49 mil novos casos em 2010. O diagnstico e o tratamento
desse tipo de cncer permanecem como desafios. A caracterizao de novas
linhagens celulares uma ferramenta importante para a compreenso dos
processos biolgicos envolvidos no cncer e as respostas induzidas pelos
tratamentos disponveis. No presente estudo foram usadas duas novas linhagens de
clulas de cncer de mama humano estabelecidas a partir de fragmentos de tumor
primrio: MACL-1 e MGSO-3. A susceptibilidade dessas linhagens ao tratamento
com radiao ionizante (RI) foi comparada com aquela da linhagem comercial MDA-
MB-231, derivada de stio de metstase. A RI (10 ou 20 Gy) induziu reduo da
viabilidade celular e morte, mensurada por meio do ensaio de fragmentao do
DNA, 48 e 72 h aps o tratamento. Alm disso, aps 48 h, foi observado aumento da
porcentagem de clulas apoptticas. O tratamento com 20 Gy reduziu, tambm, a
sobrevivncia clonognica. Porm, quando mantidas em cultura aps o tratamento
com RI (20 Gy), as clulas das trs linhagens recuperaram-se em 21 dias e a
viabilidade celular dessas culturas foi semelhante quela das culturas que no foram
previamente expostas radiao, sugerindo que apresentam fentipo
radiorresistente. O inibidor de caspases zVAD-FMK inibiu a fragmentao do DNA e
a reduo de viabilidade celular induzidas pela RI, sugerindo o envolvimento de
caspases na morte celular induzida pela RI. De fato, o tratamento com RI (20 Gy, 24
h) ativou caspase-9 nas linhagens MACL-1 e MDA-MB-231, mas no em MGSO-3.
Alm disso a RI (20 Gy, 30 h) induziu ativao das caspases 8 e 3 nas trs
linhagens usadas. Apesar de ter sido demonstrado que a RI induz citotoxicidade,
no foi detectada alterao na expresso protica, avaliada por eletroforese
bidimensional, 24 ou 30 h aps o tratamento de clulas da linhagem MDA-MB-231
com 20 Gy. Por meio de eletroforese bidimensional e espectrometria de massas foi
demonstrado que existem diferenas no perfil de expresso protica das linhagens
MACL-1 e MGSO-3 em relao a clulas obtidas a partir de tecido de mama
saudvel. Em conjunto, esses resultados sugerem que as novas linhagens de
cncer de mama humano MACL-1 e MGSO-3 podem ser teis em estudos para
compreender a radiobiologia do cncer de mama e contribuir para o
desenvolvimento racional de modelos para o estudo do tratamento do cncer bem
como para a identificao de marcadores para esse tipo de cncer.
PALAVRAS CHAVE: cncer de mama, linhagem celular, radiao ionizante, morte
celular, apoptose, proteoma.
-
SUMMARY
Cancer represents a major cause of death worldwide. It is estimated that in 2008 7.6
million people died as a consequence of this disease. In Brazil, breast cancer is the
second most common type of cancer and 49 000 new cases are expected in 2010.
The diagnosis and treatment of this cancer remain as challenges. The
characterization of new cell lines is an important tool to understand the biological
processes involved in cancer treatments. In the present study we used two newly
established epithelial human breast cancer cell lines from primary sites MACL-1 and
MGSO-3 and compared their susceptibility to the treatment with ionizing radiation
(IR) with the commercial cell line MDA-MB-231. In the doses used (10 or 20 Gy), IR
induced a reduction in cell viability and cell death, measured as DNA fragmentation,
at 48 and 72 h after treatment. In addition, 48 h after treatment with IR we observed
an enhancement in the percentage of apoptotic cells. The broad-range caspases
inhibitor zVAD-FMK inhibited IR cytotoxicity, suggesting the involvement of caspases
in cell death induced by this treatment. After 24h, treatment with IR activated
caspase-9 in MACL-1 and MDA-MB-231 but not in MGSO-3 cells. Thirty hours after
treatment with IR (20 Gy), we observed an activation of caspases 8 and 3. Although
it was shown that IR induces cytotoxicity no alterations were detected in protein
expression, assessed by two-dimensional electrophoresis, 24 or 30 h after treatment
of MDA-MB-231 with 20 Gy. Through two-dimensional electrophoresis and mass
spectrometry it was shown that there are differences in protein expression profile of
strains MACL-1 and MGSO-3 when compared to cells obtained from healthy breast
tissue. Together, these results suggest that the newly established human breast
cancer cell lines, MACL-1 and MGSO-3, may be useful in studies of breast cancer in
defining basic mechanisms in molecular and cellular radiobiology and may contribute
to the rational design of future models of cancer therapies as well as the identification
of markers for this type of cancer.
KEY WORDS: breast cancer, cell line, ionizing radiation, cell death, apoptosis,
proteome.
-
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Representao esquemtica dos principais mecanismos
envolvidos na oncognese......................................................
23
Figura 2 Representao esquemtica da enzima telomerase.............. 24
Figura 3 Representao esquemtica da anatomia da mama.............. 26
Figura 4 Representao esquemtica do ciclo celular e dos pontos
de verificao na transio entre diferentes fases..................
30
Figura 5 Representao esquemtica das fases da mitose.................. 31
Figura 6 Representao esquemtica das vias de ativao de
caspases durante a apoptose..................................................
34
Figura 7 Representao esquemtica das alteraes morfolgicas
caractersticas dos diferentes tipos de morte celular...............
35
Figura 8 Representao esquemtica do fluxo de informao dos
genes para a funo................................................................
39
Figura 9 Aspecto morfolgico ao microscpio ptico das clulas das
linhagens MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231.........................
44
Figura 10 Visualizao das colnias formadas a partir do
plaqueamento de clulas de cncer de mama no irradiadas
nas densidades de 100, 200 e 300 clulas em placas de 6
poos.......................................................................................
47
Figura 11 Histograma representativo da anlise do contedo de DNA
subdiplide...............................................................................
50
Figura 12 Efeito induzido pela RI (10 ou 20 Gy) sobre a metabolizao
de MTT pelas clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231......
62
Figura 13 Imagens representativas da formao de colnias das
linhagens de cncer de mama MACL-1, MGSO-3 e MDA-
MB-231 10 dias aps o tratamento com RI (10 ou 20 Gy)......
63
Figura 14 Efeito induzido pela RI (10 ou 20 Gy) sobre a sobrevivncia
clonognica das clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231..
64
Figura 15 Efeito induzido pela RI (10 ou 20 Gy) sobre a metabolizao
de MTT pelas clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231
controle e recuperadas............................................................
65
-
Figura 16 Perfil de clulas da linhagem MACL-1 em mitose................... 66
Figura 17 Imagens representativas de clulas da linhagem MACL-1
em diferentes fases do ciclo celular.........................................
67
Figura 18 Distribuio da populao de clulas MACL-1, MGSO-3 e
MDA-MB-231 coradas com iodeto de propdeo 24 horas
aps tratamento com RI (10 ou 20 Gy)....................................
68
Figura 19 Efeito induzido pela RI (20 Gy) sobre a porcentagem de
clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231 em mitose 24
horas aps o tratamento..........................................................
69
Figura 20 Imagens representativas de clulas da linhagem MACL-1
em diferentes fases do ciclo celular 24 horas aps o
tratamento com RI (20 Gy)......................................................
69
Figura 21 Distribuio da populao de clulas MACL-1 coradas com
iodeto de propdeo 48 e 72 horas aps tratamento com RI
(10 ou 20 Gy)...........................................................................
70
Figura 22 Distribuio da populao de clulas MGSO-3 coradas com
iodeto de propdeo 48 e 72 horas aps tratamento com RI
(10 ou 20 Gy). .........................................................................
71
Figura 23 Distribuio da populao de clulas MDA-MB-231 coradas
com iodeto de propdeo 48 e 72 horas aps tratamento com
RI (10 ou 20 Gy). ....................................................................
71
Figura 24 Fragmentao do DNA em clulas MACL-1, MGSO-3 e
MDA-MB-231 induzida pela RI (10 ou 20 Gy).........................
72
Figura 25 Exposio de fosfatidilserina em clulas MACL-1, MGSO-3 e
MDA-MB-231 48 horas aps o tratamento com RI (20 Gy).....
74
Figura 26 Efeito induzido pela RI (20 Gy, 48 h) sobre a metabolizao
de MTT pelas clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231 na
ausncia ou presena de um inibidor de caspases (80 M,
1h)............................................................................................
75
Figura 27 Fragmentao do DNA em clulas MACL-1, MGSO-3 e
MDA-MB-231 induzida pela RI (20 Gy, 48 h) na ausncia ou
presena de um inibidor de caspases (80 M, 1h)..................
76
-
Figura 28 Efeito induzido pela RI (20 Gy) sobre a atividade de caspase
8 em clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231 24 e 30
horas aps o tratamento..........................................................
77
Figura 29 Efeito induzido pela RI (20 Gy) sobre a atividade de caspase
9 em clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231 24 e 30
horas aps o tratamento..........................................................
78
Figura 30 Efeito induzido pela RI (20 Gy) sobre a atividade de caspase
3 em clulas MACL-1, MGSO-3 e MDA-MB-231 30 horas
aps o tratamento....................................................................
79
Figura 31 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MDA-MB-231 controle (Cy 3) e tratado
(Cy 5; 20 Gy, 24h) obtido por 2D-DIGE...................................
80
Figura 32 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MDA-MB-231 controle (Cy 5) e tratado
(Cy 3; 20 Gy, 24h) obtido por 2D-DIGE...................................
80
Figura 33 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MDA-MB-231..........................................
81
Figura 34 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MDA-MB-231 obtido 30 horas aps o
tratamento com RI (20 Gy)......................................................
81
Figura 35 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MACL-1 (Cy5) e clulas saudveis
(Cy3) obtido por 2D-DIGE.......................................................
83
Figura 36 Visualizao grfica da protena galectina 1 no programa
DeCyder 7.0.............................................................................
85
Figura 37 Visualizao grfica da protena anexina V no programa
DeCyder 7.0. ...........................................................................
86
Figura 38 Gel bidimensional representativo de extrato protico de
clulas da linhagem MGSO-3 (Cy3) e clulas saudveis
(Cy5) obtido por 2D-DIGE.......................................................
87
Figura 39 Visualizao grfica da protena HSP 27 no programa
DeCyder 7.0. ...........................................................................
88
-
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Protenas identificadas com expresso diferente entre
clulas MACL-1 e de tecido de mama saudvel.....................
84
-
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Colorao de amostras proticas usadas nos gis 2D-DIGE
para comparao da expresso protica de clulas MDA-
MB-231 controle e tratadas com 20 Gy...................................
56
Quadro 2 Colorao de amostras proticas usadas nos gis 2D-DIGE
para comparao da expresso protica de clulas
saudveis e das linhagens MACL-1 e MGSO-3......................
56
Quadro 3 Programa de focalizao para tiras de Immobiline Drystrip
Gel de 13 e 18 cm na unidade de focalizao isoeltrica
Ettan IPGphor II.......................................................................
57
-
LISTA DE ABREVIATURAS
2D Eletroforese bidimensional
2D-DIGE Eletroforese bidimensional diferencial por fluorescncia
Apaf-1 Fator ativador de protease apopttica (Apoptotic protease
activating factor 1)
ATCC American Type Culture Collection
ATM Protena cinase mutada de Ataxia telangiectasia (Ataxia
telangiectasia-mutated protein kinase)
ATP Trifosfato de adenosina
BAK Bcl-2 antagonist/killer-1
BAX Protena X associada a Bcl-2 (Bcl-2 associated X protein)
BCL Protena de leucemia de clula B (B cell leukemia protein)
BID BH3 domain-only death agonist protein
BRCA Protena supressora de crescimento de cncer de mama (breast
cancer growth supressor protein)
BSA Albumina bovina
CDTN Centro de Desenvolvimento de Tecnologia Nuclear
Chk Cinase de ponto de verificao (checkpoint kinase)
CNEN Comisso Nacional de Energia Nuclear
DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium
DNA cido desoxirribonuclico
DTT Ditiotreitol
EGFR Receptor de fator de crescimento epidermal
Fas Receptor da superfamlia do TNF (TNF superfamily receptor 6)
FADD Domnio de morte associado a Fas (Fas associated death
domain)
FITC Isotiocianato de fluorescena
FS Frao de sobrevivncia
Gy Grays
HCl cido clordrico
HER-2 Fator de crescimento epidermal
HFS Soluo fluorocrmica hipotnica
HSP Protena de choque trmico (heat shock protein)
-
H3PO4 cido fosfrico
INCA Instituto Nacional de Cncer
MALDI Dessoro/ionizao a laser assistida por matriz (matrix
assisted laser desorption/ionization)
MAPK Protena cinase ativada por mitgeno (mitogen-activated protein
kinase)
MTT Metiltiazoltetrazlio
MUC-1 Mucina 1
OMS Organizao Mundial de Sade
PBS Tampo salina fosfato
PE Eficincia de plaqueamento
PI Iodeto de propdeo
RI Radiao ionizante
RIP Protena que interage com receptor de morte (receptor-
interacting protein)
RNA cido ribonuclico
SDS Dodecil sulfato de sdio
SDS-PAGE Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida
SFB Soro fetal bovino
TNF Fator de necrose tumoral
TOF Tempo de vo (time of flight)
TRAIL Ligante inductor de apoptose relacionado ao TNF (TNF-related
apoptosis-inducing ligand)
Zvad Z-Val-Ala-Asp(OCH3)-fluorometilcetona
-
SUMRIO 1 INTRODUO........................................................................................ 20
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVO............................................................... 42
2.1 Justificativa.............................................................................................. 42
2.2 Objetivo geral.......................................................................................... 43
2.3 Objetivos especficos.............................................................................. 43
3 MATERIAL E MTODOS....................................................................... 44
3.1 Linhagens celulares................................................................................ 44
3.2 Cultura celular......................................................................................... 44
3.3 Tratamento das clulas com radiao .................................................. 45
3.4 Avaliao de morte celular...................................................................... 45
3.4.1 Avaliao de viabilidade celular pelo ensaio de metabolizao de
metiltiazoltetrazlio (MTT).......................................................................
45
3.4.2 Ensaio de clonogenicidade..................................................................... 46
3.4.3 Recuperao de clulas aps a irradiao............................................. 48
3.4.4 Determinao do contedo de DNA subdiplide por citometria de fluxo 49
3.4.5 Determinao do ndice mittico............................................................. 50
3.5 Avaliao dos mecanismos de morte celular.......................................... 52
3.5.1 Ensaio de dupla colorao com anexina V-FITC e PI............................ 52
3.5.2 Tratamento com inibidor de caspases.................................................... 52
3.5.3 Ensaio de deteco de ativao de caspases 8 e 9............................... 53
3.5.4 Deteco de caspase 3 ativa por citometria de fluxo............................. 53
3.6 Cultura de clulas de mama saudvel.................................................... 54
3.7 Eletroforese bidimensional...................................................................... 54
-
3.7.1 Extrao de protenas............................................................................. 54
3.7.2 Marcao de protenas para eletroforese bidimensional diferencial por
fluorescncia (2D-DIGE).........................................................................
55
3.7.3 Focalizao isoeltrica............................................................................ 56
3.7.4 Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)......... 57
3.7.5 Deteco de protenas e anlise dos gis bidimensionais.................... 58
3.7.6 Digesto trptica em gel bidimensional................................................... 59
3.7.7 Identificao de protenas por espectrometria de massa....................... 59
3.8 Anlise estatstica................................................................................... 60
4 RESULTADOS....................................................................................... 61
4.1 Citotoxicidade induzida pela radiao nas linhagens de clulas de
cncer de mama.....................................................................................
61
4.2 Recuperao das linhagens aps tratamento com radiao ............... 64
4.3 Bloqueio do ciclo celular induzido pela radiao .................................. 66
4.4 Fragmentao do DNA induzida pela radiao .................................... 70
4.5 Exposio de fosfatidilserina induzida pela radiao ........................... 73
4.6 Envolvimento de caspases nos efeitos induzidos pela radiao .......... 75
4.7 Avaliao da expresso protica por eletroforese bidimensional aps
tratamento com radiao ......................................................................
79
4.8 Anlise comparativa do perfil de expresso protica de clulas de
tecido de mama saudvel e das linhagens MACL-1 e MGSO-3.............
82
5 DISCUSSO........................................................................................... 89
6 CONCLUSO......................................................................................... 104
7 PERSPECTIVAS.................................................................................... 105
-
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................... 106
ANEXO A DESCRIO DA LINHAGEM MDA-MB-231................................... 128
ANEXO B PARECER DO COMIT DE TICA EM PESQUISA DA UFMG...... 131
ANEXO C RELATRIO DE EXAME ANATOMOPATOLGICO MACL-1........ 132
ANEXO D RELATRIO DE EXAME ANATOMOPATOLGICO MGSO-3....... 133
ANEXO E ARTIGO CIENTFICO...................................................................... 134
-
20
1 INTRODUO
O cncer uma condio patolgica que atinge milhares de indivduos a cada ano e
que aflige a espcie humana desde tempos remotos. O primeiro relato de cncer foi
descoberto em um papiro egpcio de 1600 a.C. em que esto descritos oito casos de
tumores no seio para os quais no havia tratamento. A origem do termo cncer
atribuda ao mdico grego Hipcrates, em 400 a.C., que denominou certos tumores
de carcinomas, devido semelhana dos vasos sanguneos desses tumores com o
formato das patas de caranguejos. Cncer, a palavra latina para caranguejo, foi um
termo introduzido pelo mdico romano Celsus e o termo oncos, palavra grega para
tumor, foi associado ao cncer por outro mdico romano, Galeno (The history of
cancer, 2010).
A oncologia como cincia surgiu em 1761, com os estudos de Giovanni Morgagni de
Padua os quais relacionavam a doena dos indivduos a achados patolgicos aps a
morte. Nessa mesma poca, o cirurgio escocs John Hunter sugeriu que alguns
tipos de cncer poderiam ser tratados por remoo cirrgica do tumor, o que se
tornou um procedimento corriqueiro cerca de um sculo depois, com o surgimento
da anestesia (The history of cancer, 2010). Em 1952, o oncologista britnico Willis
definiu o cncer como uma massa anormal de tecido, cujo crescimento ultrapassa e
no coordenado com o dos tecidos saudveis e persiste na mesma maneira
excessiva depois da interrupo dos estmulos que deram origem mudana (Willis,
1952).
Apesar do volume de estudos que abordam o cncer, a compreenso dos
mecanismos responsveis pelo estabelecimento dessa condio patolgica continua
incompleta. Diferentes teorias tentam explicar o surgimento de clulas neoplsicas e
o desenvolvimento do tumor. Uma delas, a teoria da evoluo clonal, tem sido
amplamente discutida e defende que o surgimento do cncer anlogo a um
processo de evoluo darwiniana. Nesse processo, clulas somticas adquirem
-
21
mutaes aleatoriamente e os fentipos resultantes so gradualmente selecionados.
Alguns desses fentipos so deletrios e as clulas com a mutao morrem. Por
outro lado, certas mutaes conferem clula maior capacidade de proliferar e
sobreviver em condies pouco favorveis. Ocasionalmente, uma clula adquire
mutaes suficientemente vantajosas que conferem capacidade invasiva s clulas
tumorais e permitem sua multiplicao mais intensa em relao s demais clulas do
tecido. O conjunto dessas e outras alteraes resulta na formao de uma neoplasia
(Stratton et al, 2009).
Sabe-se que a relao entre alteraes no genoma e o surgimento do cncer foi
descrita entre o final do sculo 19 e o incio do sculo 20 por David Von Hansemann
e Theodor Boveri. Em seus estudos, esses pesquisadores observaram a presena
de aberraes cromossmicas em clulas tumorais. Mais tarde, foi demonstrado que
agentes mutagnicos e que causam danos no DNA tambm causam cncer. Por
fim, a importncia do genoma foi demonstrada pela converso de clulas de fentipo
normal em clulas cancergenas por meio da introduo do DNA genmico de
clulas tumorais em clulas normais (Krontiris, Cooper, 1981; Shih et al, 1981).
Atualmente, estudos demonstram que o tipo e o nmero total de mutaes que
podem ser observadas em diferentes tumores so bastante amplos podendo variar
de 1.000 a 100.000 (Stratton et al, 2009).
Apesar de as alteraes genticas serem bastante freqentes em cnceres, existem
questionamentos sobre o conceito de que seriam as nicas responsveis pelo
surgimento das neoplasias. Outra teoria visa explicar a formao de tumores e sua
resistncia aos tratamentos clnicos baseada na existncia de uma populao de
clulas tronco tumorais. Elas representariam uma sub-populao de clulas
iniciadoras que dariam origem s clulas mais diferenciadas da massa tumoral
(Wicha et al, 2006). Por terem a capacidade de se auto-renovar e por serem pouco
diferenciadas, as clulas tronco tumorais podem dar origem a diferentes tipos
celulares. Essas clulas so resistentes apoptose e, portanto, apresentam maior
resistncia s terapias convencionais (Gil et al, 2008). De fato, existem estudos que
demonstram a existncia de clulas com caractersticas de clulas tronco em
tumores de mama (Al-Hajj et al, 2003), cabea e pescoo (Prince et al, 2007) e
-
22
pncreas (Li et al, 2007), entre outros (Harper et al, 2010). Porm, os vrios tipos de
cncer podem ter seu surgimento atribudo a causas distintas e complementares e
apresentam fatores de risco variados. Alm disso, apresentam freqncia e
distribuio desigual na populao e, independente dos mecanismos responsveis
por sua formao, consistem em uma condio patolgica complexa que pode afetar
diversos tecidos e rgos.
Atualmente, o termo cncer refere-se a mais de 100 tipos de doenas (Stratton et al,
2009). At 2008, a Agncia Internacional para a Pesquisa do Cncer, rgo ligado
Organizao Mundial de Sade (OMS), relacionou cerca de 100 fatores fsicos,
qumicos e biolgicos como carcinognicos. Entre os fatores fsicos, a exposio
radiao ultravioleta est associada, por exemplo, ao desenvolvimento de cncer de
pele (Massari et al, 2007). Asbestos, hidrocarbonetos aromticos e tabaco
representam importantes fatores qumicos de risco para o desenvolvimento de
cncer de pulmo (Veglia et al, 2007). Alm de fatores ambientais, que so
responsveis por cerca de 95% dos carcinomas, fatores genticos esto associados
a 5% dos cnceres em humanos (Sonnenschein, Soto, 2008). Nesses casos,
alteraes genticas hereditrias favorecem o surgimento de neoplasias. Como
exemplo, mutaes nos genes BRCA-1 e 2 aumentam a susceptibilidade aos
cnceres de mama e ovrio (Lynch et al, 2008). Por sua vez, a translocao entre os
cromossomos 9 e 22, est relacionada a um tipo especfico de cncer, a leucemia
mielide crnica (Nowell, Hungerford, 1960).
Essas alteraes genticas presentes em neoplasias resultam em diferentes graus
de alterao fenotpica (Figura 1). Como exemplo, pode haver aumento da
expresso de receptores para fatores de crescimento (Adriaenssens et al, 2008;
Dawood et al, 2008), favorecendo a proliferao celular. Dois membros da famlia do
receptor de fator de crescimento epidermal (EGF ou HER) tiveram sua
superexpresso descrita em diferentes tipos de cncer. O EGFR est superexpresso
em at 80% dos tumores de cabea e pescoo e de clulas escamosas do pulmo
(Kumar et al, 2005, p.281) enquanto o HER-2 est amplificado em aproximadamente
25% dos carcinomas de mama (Hayes, Thor, 2002).
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23
Figura 1 Representao esquemtica dos principais mecanismos envolvidos na
oncognese. Modificado de Hanahan e Weinberg (2000).
Outra alterao fenotpica importante em clulas tumorais a reduo da apoptose
(Wendt et al, 2006; Toillon et al, 2007) e o desenvolvimento de mecanismos que
tornam possveis a sobrevivncia e a proliferao de clulas com DNA danificado.
No cncer de mama, por exemplo, genes associados a apoptose, entre eles BRCA-1
e BRCA-2 podem estar mutados. Alm disso, inmeras protenas reguladoras da
apoptose tem a expresso alterada, o que tambm resulta em desregulao do
controle da morte celular programada (Di Pietro et al, 2009).
Tambm comum ocorrer reativao da enzima telomerase (Yano et al, 2002; Ernst
et al, 2006; Calcagnile, Gisselsson, 2007), uma transcriptase reversa responsvel
pela adio de seqncias TTAGGG extremidade 3 do DNA formando os
telmeros (Figura 2). A principal funo dos telmeros proteger a poro terminal
dos cromossomos prevenindo a fuso dos mesmos e a degradao de regies
codificadoras (De Lange, 2005). A cada diviso celular, uma parte do telmero
perdida uma vez que a DNA polimerase no capaz de copiar a poro terminal dos
cromossomos. medida que divises celulares se sucedem h encurtamento dos
telmeros nas clulas somticas que no possuem a telomerase ativa (Harley et al,
1990) e as clulas param de se dividir indefinidamente. A reativao da telomerase
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em clulas de neoplasias previne o encurtamento dos telmeros e,
conseqentemente a senescncia replicativa e a apoptose que resultam da intensa
proliferao dessas clulas (Hahn et al, 1999).
Figura 2 Representao esquemtica da enzima telomerase evidenciando o molde de
RNA necessrio para a sntese dos telmeros na extremidade do DNA.
Alm de se dividir intensamente, as clulas de cncer podem ter capacidade
invasiva e formar metstases. Uma vez que adquirem essa habilidade, as clulas
cancergenas atingem a circulao linftica e sangunea e se estabelecem em
tecidos distintos daquele de origem, dando incio a novos tumores (Hanahan,
Weinberg, 2000). Sabe-se que alteraes na expresso de molculas de adeso
clula-clula desempenham papel importante na invasividade de clulas tumorais
(Johnson, 1991).
Nesse aspecto, a ativao de um programa gnico de transio epitelial-
mesenquimal apontada como grande facilitadora da metstase. Alguns
reguladores de transcrio, entre eles SNAI1 e SNAI2, inibem a expresso de genes
que codificam protenas epiteliais: citoqueratinas, E-caderina, -catenina entre
outras. Concomitantemente, induzem a expresso de vimentina e N-caderina,
caractersticas de clulas mesenquimais (Thiery, Sleeman, 2006). Estudos tm sido
realizados com o objetivo de ampliar os conhecimentos a respeito das metstases
(Gupta et al, 2007; Minn et al, 2007; Gjerdrum et al, 2010) uma vez que as mesmas
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esto relacionadas a grande parte das mortes de pacientes com cncer (Hanahan,
Weinberg, 2000; Gupta et al, 2005).
Esse amplo conjunto de dados obtidos a partir de avaliaes experimentais e
clnicas demonstram que, de forma geral, as clulas de cncer apresentam defeitos
em vias de regulao de proliferao celular e homeostase. Entretanto, apesar dos
rpidos avanos na pesquisa do cncer, essa condio patolgica permanece como
um grande desafio para os sistemas de sade. Atualmente, o cncer representa
uma das principais causas de morte em todo o mundo. De acordo com a OMS, cerca
de 7,6 milhes de pessoas morreram em conseqncia do cncer em 2008 e
estima-se que os bitos ultrapassem 11 milhes em 2030 (WCR_2008). No Brasil,
de acordo com dados do Instituto Nacional de Cncer (INCA), 17% dos bitos
registrados em 2007 tiveram como causa o cncer. Esse percentual s foi superado
pelas doenas que afetam o aparelho circulatrio.
Dentre os diferentes tipos de cncer, aquele com maior nmero de casos previstos
no Brasil o cncer de pele no-melanoma (114 mil casos em 2010). Nas mulheres,
o cncer de mama o segundo tipo de cncer mais comum e estima-se que em
2010 sejam registrados 49 mil novos casos, cerca de 10% de todos os casos de
cncer previstos para esse perodo no pas (ESTIMATIVA, 2010). O cncer de
mama afeta, principalmente, mulheres acima dos 40 anos (Mcpherson et al, 2000).
Grande parte desses tumores se inicia no epitlio de revestimento dos ductos ou dos
lbulos, glndulas individualizadas separadas por tecido conjuntivo denso e
constitudas por inmeros ductos (figura 3) (Junqueira e Carneiro, 2008, p. 448).
Quando o carcinoma de mama restringe-se sua origem o cncer considerado in
situ. Por sua vez, o tumor de mama invasivo espalha-se no tecido adjacente, sendo
que o grau de comprometimento est relacionado ao estdio da doena. Do ponto
de vista clnico, podem ser identificadas diversas subclasses de cncer de mama
com diferenas nas caractersticas histopatolgicas, no padro de organizao
celular e na expresso de receptores hormonais (INSTITUTO NACIONAL DE
CNCER, 2004). Esses fentipos tumorais esto associados a fatores genticos e
epigenticos (Dejeux et al, 2010). Tambm existem evidncias de que podem ser
determinados pelo tipo celular do qual o tumor deriva (Ince et al, 2007).
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Apesar de ser considerado como um cncer de bom prognstico, a mortalidade por
cncer de mama continua elevada e a sobrevida aps cinco anos mantm-se
reduzida (61% dos pacientes). Em parte, a dificuldade no controle desse tipo de
cncer pode ser atribuda ao fato de muitas pacientes evitarem o acompanhamento
mdico. Isso porque a deteco do cncer de mama tem resultados devastadores
na auto-estima da mulher e, freqentemente, acompanhada por depresso,
ansiedade e outras desordens psquicas (Bish et al, 2005; Harbeck, Haidinger,
2007). Entretanto, os principais problemas no controle do cncer de mama so
associados ao diagnstico.
Figura 3 Representao esquemtica da anatomia da mama evidenciando os lbulos e
ductos que formam a glndula mamria e o linfonodo sentinela.
Atualmente, a abordagem anatomopatolgica a principal ferramenta usada para
diagnosticar e classificar o cncer de mama. O Ministrio da Sade em parceria com
o INCA publicou em 2004 um consenso que se baseia em documentos
internacionais para definio de protocolos de diagnstico, tratamento e
acompanhamento de pacientes com cncer de mama. De acordo com o consenso, o
diagnstico deve incluir a descrio de determinadas caractersticas do tumor como:
tamanho, tipo e grau histolgicos e invaso vascular peritumoral. Alm disso, a
identificao de linfonodos comprometidos e a avaliao do grau de
comprometimento dos mesmos e das margens cirrgicas de resseco so
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importantes para definio de diagnstico e prognstico (INSTITUTO NACIONAL DE
CNCER, 2004).
Outra ferramenta de grande utilidade para auxiliar na classificao do cncer de
mama a investigao de marcadores moleculares. Esse tipo de anlise concentra-
se na dosagem de receptores de estrgeno e progesterona, sendo que o tumor
considerado positivo para esses marcadores quando mais de 1% das clulas
expressam essas protenas. Alm disso, deve-se considerar a expresso de HER-2
na definio do tratamento (Abramovitz, Leyland-Jones, 2006).
Em conjunto, as informaes obtidas com a avaliao histopatolgica e a
investigao de marcadores moleculares permitem classificar o tumor de mama e
definir seu estadiamento. Assim, possvel estabelecer a modalidade teraputica a
ser usada com base no quadro de cada paciente (INSTITUTO NACIONAL DE
CNCER, 2004). Uma das possibilidades de tratamento a remoo cirrgica do
tumor. A paciente pode, tambm, ser submetida radioterapia, quimioterapia,
imunoterapia e terapia hormonal. O uso de quimioterapia ou radioterapia associada
cirurgia tem se tornado cada vez mais comum devido s crescentes evidncias de
que esse tipo de abordagem aumenta a sobrevivncia e a sobrevida das pacientes.
Alm disso, a associao de quimioterpicos tambm tem se mostrado til nos
casos em que h metstases ou resistncia a algum tipo de tratamento (Cox et al,
2006; Narayanan, Taylor, 2007; Chargari et al, 2009).
A quimioterapia do cncer de mama tem apresentado evolues significativas nos
ltimos anos. Entre os frmacos mais amplamente usados no tratamento desse tipo
de neoplasia, podem ser citados a doxorrubicina, a ciclofosfamida e os taxanos,
como o paclitaxel (INSTITUTO NACIONAL DE CNCER, 2004;(Seidman et al, 1995;
Seidman et al, 2008). Entretanto, esses e outros quimioterpicos tradicionais
apresentam mecanismos de ao inespecficos, o que resulta na ocorrncia de
graves reaes adversas. Como exemplo, pode-se citar os taxanos, que induzem
seus efeitos por meio da estabilizao de microtbulos causando inibio da diviso
celular. A ao dessas substncias em clulas de tecidos saudveis pode causar
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neuropatia, estomatite, queratopatia e trombocitopenia (Ibrahim et al, 2002; Seidman
et al, 2008), reaes adversas graves que debilitam bastante a paciente.
Entretanto, esto disponveis frmacos mais seguros e eficazes que interferem com
alvos associados a fentipos caractersticos de clulas tumorais como a expresso
de receptores de hormnio (Lewis et al, 2010) ou para fator de crescimento
(Cobleigh et al, 1999). Como exemplos desses tipos de quimioterpicos podem ser
citados o trastuzumab e o pertuzumab, anticorpos monoclonais que se ligam ao
HER-2, inativando-o. Estudos demonstram que cerca de 25% das neoplasias de
mama superexpressam essa protena (Hayes, Thor, 2002) a qual pode contribuir
para um mau prognstico (Sawaki et al, 2006). Quando associado ao paclitaxel, o
trastuzumab reduz de forma significativa a evoluo da doena e mesmo a terapia
apenas com este frmaco eficaz nos casos em que h superexpresso de HER-2.
Por sua vez, o pertuzumab associado ao inibidor de tirosina cinase, erlotinib, eficaz
em modelos de diversos tipos de cncer independente da expresso de HER-2
(Hatake et al, 2007).
Apesar das evolues na terapia do cncer de mama, o tratamento de pacientes
com tumores que no podem ser completamente removidos ou de pacientes que
apresentam alto risco de recorrncia e metstases ainda representa um desafio. Por
ser uma doena complexa e multifatorial, o tratamento do cncer de mama requer a
associao de diferentes abordagens teraputicas. Alm da quimioterapia, a
radioterapia freqentemente usada, sendo associada ou no a outras terapias
(Dewar, 2006; Fayanju et al, 2007). A radioterapia baseia-se na exposio da parte
do corpo afetada pelo tumor a uma fonte de raios ou X.
Essas radiaes so ondas eletromagnticas de alta energia. Ao interagir com a
matria, induzem ionizao dos tomos e molculas e, por essa razo, so
denominadas radiaes ionizantes (RI). Ao interagir com clulas e tecidos, a RI
induz a formao de espcies reativas de oxignio que, por sua vez, danificam,
entre outras molculas, o DNA (Mozdarani et al, 2007). Entre as alteraes
observadas no DNA, podem ser citadas trocas de bases e quebras simples e duplas.
Os danos causados pela RI so mais intensos em clulas pouco diferenciadas, que
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apresentam intenso metabolismo e alta taxa de proliferao. Assim, clulas tumorais
seriam mais afetadas pela radioterapia do que clulas diferenciadas, conforme a lei
de Bergonie e Tribondeau (1906). Os danos no DNA induzidos pela RI so
detectados por protenas nucleares que desencadeiam mecanismos de reparo. Os
inmeros mecanismos destinados manuteno da estabilidade genmica
asseguram a transmisso precisa da informao gentica no seu fluxo at a sntese
de protenas (Lazzaro et al, 2009).
Alm disso, uma vez que o DNA a molcula responsvel pela hereditariedade, sua
integridade indispensvel para a formao de novas clulas. Portanto, quando as
clulas tem o DNA danificado durante o processo de diviso celular, so ativadas
vias de bloqueio do ciclo (Kao et al, 2001; Lazzaro et al, 2009). Dessa forma, evita-
se a transferncia de material gentico danificado para clulas filhas. O controle do
ciclo celular tambm importante para evitar que o mesmo progrida antes de uma
etapa ter sido concluda de forma adequada. Nos eucariotos, o ciclo celular
composto por quatro fases principais: G1, S, G2 e M e a transio entre elas
altamente regulada. As clulas que esto quiescentes se mantm em um estado
especial denominado G0 (Figura 4). Quando a clula em G0 recebe estmulo para se
dividir, progride at G1. Nessa fase, h sntese de protenas necessrias para a fase
S, durante a qual h duplicao do DNA. A clula prossegue, ento, para a fase G2
e, em seguida, para a mitose (fase M) (Alberts et al, 2004, p. 983).
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Figura 4 Representao esquemtica das fases do ciclo celular e dos pontos de
verificao existentes na transio entre as diferentes fases (traos vermelhos) (Fonte:
Houtgraaf et al., 2006).
Apesar de ser considerada como uma fase da diviso celular, a mitose pode ser
dividida em vrios estgios (Figura 5). Na prfase os cromossomos, cada um
composto por duas cromtides irms, sofrem intensa condensao em conjunto com
protenas cromossmicas e histonas. Durante a metfase, feixes de protenas do
citoesqueleto promovem o alinhamento dos cromossomos em um plano central da
clula para que as cromtides irms sejam separadas de forma organizada durante
a anfase. Em seguida, na telfase, observa-se a presena de cromossomos
descondensados e o envelope nuclear reconstrudo antes do incio da citocinese,
etapa na qual o citoplasma dividido e duas clulas filhas so formadas (Lodish et
al, 2008, p. 847).
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Figura 5 Representao esquemtica das fases da mitose. Modificado de
http://www.biology.iupui.edu/biocourses/N100/images/8mitosiscropped.jpg
Para que as clulas filhas sejam cpias exatas da clula inicial, as transies entre
as diferentes fases do ciclo celular devem ser altamente reguladas. Isso se d por
um sistema de controle que consiste em uma srie de eventos bioqumicos
interconectados. Os componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular
so as cinases dependentes de ciclinas. A atividade dessas enzimas varia durante
as diferentes fases do ciclo graas ao das protenas reguladoras ciclinas, cuja
sntese e degradao estabelecem o carter cclico do ciclo celular. Esse sistema
inclui, tambm, trs pontos principais de verificao: o primeiro ao final da fase G1, o
segundo entre as fases G2 e M e o terceiro na transio entre a metfase e a
anfase (Houtgraaf et al, 2006).
A progresso entre as fases G2 e M s pode ocorrer aps o trmino da replicao do
DNA. E a clula s poder progredir da metfase para a anfase quando os
cromossomos estiverem aderidos ao fuso mittico. Alm disso, mesmo que esses
requisitos sejam atendidos, a ocorrncia de leses no DNA bloquear a progresso
do ciclo celular (Lazzaro et al, 2009). Esse dano pode resultar de falhas na
replicao ou de exposio a agentes qumicos ou a radiao. Nesses casos, o
bloqueio ocorre, freqentemente, na transio entre as fases G1 e S ou entre G2 e M
e permite a remoo das leses (Kao et al, 2001). Quando no possvel reparar o
DNA, o bloqueio permanente do ciclo seguido da ativao de mecanismos de
apoptose (Houtgraaf et al, 2006). Porm, clulas tumorais freqentemente
apresentam alteraes nos mecanismos de deteco de leses e de reparo do DNA
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(Concin et al, 2000; Nadin et al, 2003), sendo capazes de ignorar a existncia de
aberraes cromossmicas.
A capacidade das clulas tumorais de se manterem viveis apesar da presena de
danos no DNA tambm pode estar relacionada a alteraes nas vias de apoptose
(Wendt et al, 2006). A apoptose um tipo de morte celular que ocorre de forma
organizada e controlada, com mnima ativao do sistema imune. Esse processo de
morte celular programada tem papel fundamental no desenvolvimento e na
manuteno dos organismos. A apoptose tambm est envolvida na formao de
tecidos, no desenvolvimento do sistema imune e na manuteno da homeostase
uma vez que permite a eliminao de clulas e tecidos lesados (Kerr et al, 1972). As
clulas que entram em apoptose, inicialmente, sofrem retrao e a membrana
celular envolve partes do citoplasma formando vesculas chamadas corpos
apoptticos. Ao final, os fragmentos das clulas so removidos por fagcitos sem
haver perturbao das clulas adjacentes (Wyllie et al, 1980; Savill, Fadok, 2000).
Durante a apoptose observa-se, tambm, condensao e fragmentao do ncleo
(Robertson et al, 1978; Wyllie et al, 1980). Organelas como o complexo de Golgi, o
retculo endoplasmtico e as mitocndrias so fragmentadas (Frank et al, 2001;
Lane et al, 2002). A fragmentao atinge no apenas estruturas, mas molculas
como o DNA e protenas. Sabe-se que a clivagem de protenas durante a apoptose
realizada, principalmente, por caspases (Nicholson, 1999; Creagh et al, 2003).
As caspases so sintetizadas como zimognios praticamente inativos (Stennicke et
al, 1998; Stennicke, Salvesen, 1998) e sua ativao resulta, em geral, de estmulos
apoptticos. Tais estmulos podem ser o passo inicial de uma das trs vias de
apoptose conhecidas (Figura 6). Na via extrnseca, alguns ligantes como Fas ou
TNF interagem com receptores de morte na membrana celular e recrutam
protenas adaptadoras como a FADD. Por sua vez, as protenas adaptadoras
recrutam e agregam molculas de caspase 8 promovendo auto-processamento e
ativao dessa caspase iniciadora. A caspase 8 ativa promove protelise e ativao
das caspases efetoras 3 e 7, o que resulta na degradao de inmeros substratos e,
finalmente, em morte celular (Taylor et al, 2008; Walsh et al, 2008).
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Em algumas situaes, a via extrnseca pode estabelecer comunicao com a via
intrnseca por meio da protelise de BID mediada por caspase 8. BID promove,
ento, a liberao de citocromo c e a formao do apoptossomo. Esse agregado
protico tem, alm do citocromo c, molculas de caspase 9 e Apaf1. BID parte de
uma famlia de protenas que funcionam como sensores de estresse celular. Quando
as protenas que compem essa famlia so ativadas acima de certo limiar, superam
a ao inibidora dos membros de outra famlia, BCL-2, e promovem a formao de
oligmeros de BAK-BAX na membrana mitocondrial (Taylor et al, 2008). Atravs
dessas estruturas ocorre o efluxo de componentes do espao intramembranar da
mitocndria para o citoplasma, entre eles o citocromo c. Com a subseqente
ativao de caspase 9, desenvolve-se uma cascata proteoltica e a ativao de
caspases efetoras (Slee et al, 1999).
Essas caspases tambm podem ser ativadas por uma via dependente de granzima
B, uma protease presente em grnulos de linfcitos T citotxicos e clulas NK
(Anthony et al, 2010). Alm de granzima B, os grnulos contm uma protena
formadora de poros, a perforina, que se polimeriza na membrana das clulas alvo
formando poros e permitindo a entrada da granzima (Masson, Tschopp, 1985;
Podack et al, 1985). Aps entrar na clula, a granzima B cliva seus substratos, entre
eles BID, caspase 3 e 7, dando incio apoptose (Adrain et al, 2005).
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Figura 6 Representao esquemtica das vias de ativao de caspases durante a
apoptose (Fonte: Taylor et al, 2008).
Entretanto, a reduo da morte celular programada ocorre em diversos tipos de
cncer e, geralmente, a expresso de indutores de apoptose est reduzida. Alm
disso, cada tumor apresenta um padro diferente de expresso de protenas
associadas a esse tipo de morte celular. Sendo assim, a compreenso dos
mecanismos envolvidos na reduo da apoptose importante para o
desenvolvimento de estratgias eficazes de combate a cada tipo de neoplasia (Di
Pietro et al, 2009). Atualmente, grande parte das pesquisas sobre cncer tem tido
como objetivo desenvolver estratgias para superar a resistncia das clulas
tumorais aos tratamentos em uso clnico e induzir apoptose nas clulas tumorais.
Porm, existem outras vias de morte celular que podem estar intactas nessas
clulas e ser ativadas com o objetivo de superar a resistncia induo de morte
por apoptose. Entre esses mecanismos, podem ser citadas a senescncia, a
autofagia, a catstrofe mittica e a necrose (Okada, Mak, 2004) (Figura 7).
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Figura 7 Representao esquemtica das alteraes morfolgicas caractersticas dos
diferentes tipos de morte celular. Apoptose: formao de corpos apoptticos, exposio de
fosfatidilserina e condensao da cromatina. Autofagia: presena de vesculas autofgicas
formadas pela fuso de lisossomos e estruturas celulares. Catstrofe mittica: formao de
microncleos, aumento do volume celular e presena de fuso mittico anmalo.
Senescncia: aumento da granulosidade do citoplasma, clulas apresentam-se esticadas e
achatadas. Necrose: aumento do volume celular e perda da integridade da membrana
plasmtica. Modificado de De Bruin e Medema (2008) e Gewirtz et al. (2008).
A senescncia celular foi descrita em 1961 por Hayflick e Moorhead. Nesse
processo, a diviso celular bloqueada de forma irreversvel, mas as clulas
permanecem metabolicamente ativas. Do ponto de vista bioqumico, a clula em
senescncia apresenta alteraes metablicas tpicas, como a induo de -
galactosidase (Dimri et al, 1995). A senescncia pode ser iniciada pelo
encurtamento dos telmeros, uma propriedade bastante conhecida de clulas de
mamferos, ou por algum tipo de estresse (Singh et al, 2010). No caso de clulas
tumorais, a senescncia pode ser considerada um tipo de morte cuja importncia
pode ser comparada quela da apoptose (Narita, Lowe, 2005).
Apesar de no haver eliminao da clula tumoral em decorrncia da senescncia, o
controle da neoplasia pode ser alcanado uma vez que no h proliferao (Ohtani
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et al, 2009). Por essa razo, estudos tm sido conduzidos com o objetivo de
desenvolver estratgias teraputicas que induzam senescncia em clulas de
cncer. Um estudo recente demonstrou que a inibio farmacolgica do complexo
Skp2-SCF, que tem atividade oncognica, induz senescncia em clulas de cncer
de prstata e reduz o crescimento de tumores in vivo (Lin et al, 2010), corroborando
com o potencial uso desse tipo de abordagem teraputica no cncer.
Outro mecanismo envolvido na destruio celular, a autofagia, pode ser descrito
como uma espcie de auto-canibalismo no qual os lisossomos degradam estruturas
celulares como organelas e membranas. A autofagia um processo envolvido na
manuteno da funo celular ao destruir estruturas desgastadas ou mal-formadas
(Gu et al, 2004; Iwata et al, 2006; Levine, 2007). Porm, tambm pode ser
desencadeada por inmeros tipos de estresse metablico ou teraputico como o
bloqueio de vias de sinalizao de fatores de crescimento (Lum et al, 2005), a
ativao de vias de sinalizao de MAPK (Corcelle et al, 2006), o acmulo de clcio
intracelular (Hoyer-Hansen et al, 2007) e de espcies reativas de oxignio (Scherz-
Shouval et al, 2007). Enquanto alguns estudos demonstram efeitos protetores contra
o desenvolvimento de tumores (Koneri et al, 2007; Miracco et al, 2007), outros
apontam que a autofagia pode funcionar como mecanismo de resistncia a terapias
contra o cncer (Ding et al, 2008; Dalby et al, 2010).
Tambm tem sido amplamente investigado um tipo de morte celular denominado
catstrofe mittica. Esse processo resulta da tentativa de diviso de clulas com
DNA danificado (De Bruin, Medema, 2008). Sabe-se que a presena de danos no
DNA promove bloqueio do ciclo celular. Quando esse bloqueio no eficiente e
clulas com DNA danificado entram em mitose, ocorre morte por catstrofe mittica
(Roninson et al, 2001). Do ponto de vista morfolgico, as clulas apresentam
alteraes caractersticas durante a catstrofe mittica. comum observar-se a
presena de clulas gigantes, multinucleadas e com cromossomos descondensados
(Singh et al, 2010). Alm disso, pode ocorrer diviso em mais de duas clulas filhas
com distribuio desigual de citoplasma, DNA e cromossomos (Castedo et al,
2004b).
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A catstrofe mittica pode ocorrer aps exposio a frmacos que induzem
hiperpolimerizao de microtbulos, como os taxanos, ou que causam
despolimerizao, como os alcalides vincristina e vimblastina (Castedo et al,
2004a). Alm disso, a catstrofe mittica representa um dos principais mecanismos
de morte celular associado radioterapia (Chang et al, 1999). Os mecanismos
moleculares responsveis pela morte das clulas por catstrofe mittica no foram
completamente esclarecidos. Entretanto, sabe-se que diferentes tipos celulares
entram em apoptose em conseqncia da catstrofe mittica (Roninson et al, 2001).
Alm disso, a catstrofe mittica pode resultar em morte celular por necrose
(Mansilla et al, 2006; Vakifahmetoglu et al, 2008).
A necrose , geralmente, considerada um tipo de morte celular no programada.
Nesse processo, h aumento do volume celular, hidrlise do DNA e perda da
integridade de membranas, inclusive de lisossomos. Com a lise da clula, o
contedo intracelular liberado e induz resposta inflamatria e imune no tecido
adjacente (Kumar et al, 2005, p.3). Apesar de ser normalmente tida como um
processo desordenado, estudos demonstram que a necrose controlada pela
interao de diferentes vias de sinalizao (Festjens et al, 2006; Golstein, Kroemer,
2007). A protena que interage com receptor de morte (RIP), bem como o fator 2
associado ao receptor de TNF, so importantes reguladores da necrose celular
induzida por receptores de morte (Holler et al, 2000; Lin et al, 2004). Quando RIP
ativada, translocada para a mitocndria e promove o acmulo de espcies reativas
de oxignio e depleo de ATP (Temkin et al, 2006).
Outra via que reduz a produo de ATP em clulas com DNA danificado envolve a
ativao da poli-ADP-ribose polimerase a qual depleta o cofator da gliclise NAD+
(Zong et al, 2004). O subseqente aumento do contedo intracelular de clcio e de
espcies reativas de oxignio promove a ativao de calpanas, proteases
citoplasmticas, e de fosfolipase A2. A protelise e a peroxidao das membranas
que resultam da atividade dessas enzimas levam permeabilizao da clula e
morte por necrose (Amaravadi, Thompson, 2007).
-
38
Apesar de se sobrepor apoptose em clulas submetidas ao tratamento com RI e
quimioterpicos, a necrose possui sistemas regulatrios e conseqncias diferentes
da morte programada. Por exemplo, a resposta do sistema imune necrose
bastante diferente daquela que ocorre em conseqncia da apoptose (Gallucci et al,
1999; Shi et al, 2000). Durante a necrose h liberao das chamadas alarminas,
molculas endgenas normalmente ausentes no meio extracelular (Oppenheim,
Yang, 2005; Chen et al, 2007). As alarminas podem ser molculas de RNA, DNA
genmico, protenas de choque trmico ou cido rico e recrutam macrfagos,
clulas NK e dendrticas iniciando um processo inflamatrio no stio da necrose
(Scaffidi et al, 2002; Shi et al, 2003). As clulas dendrticas, por sua vez, estimulam
linfcitos T e a resposta imune adquirida (Matzinger, 2002; Trinchieri, Sher, 2007). A
estimulao da resposta imune pode favorecer o controle do tumor. Entretanto,
estudos com frmacos que interferem com estimuladores das vias de necrose ainda
no esto disponveis, em parte devido falta de marcadores moleculares de
necrose de utilidade comprovada (Amaravadi, Thompson, 2007).
Os estudos que investigam os mecanismos de morte celular, bem como aspectos
variados sobre a biologia das clulas tumorais, so bastante relevantes. A partir
deles so obtidas informaes teis para o desenvolvimento de novas terapias.
Alm disso, permitem o estudo de estratgias que visam superar a resistncia de
clulas de cncer aos tratamentos atualmente disponveis. Esses estudos se
beneficiam da identificao de novos alvos moleculares, em sua maioria protenas
cuja expresso apresenta-se alterada em clulas tumorais em relao a clulas de
tecidos saudveis.
A identificao de novos alvos teraputicos tem sido facilitada pelos avanos em
estudos de genma, transcriptoma e proteoma (Figura 8). O seqenciamento do
genoma humano criou grande expectativa sobre a descoberta da cura de pacientes
com cncer. Entretanto, sabe-se que, graas ao processamento ps-transcricional
do mRNA e ps-traducional das protenas, um gene pode dar origem a inmeras
protenas. Portanto, a partir da anlise gnica isolada no se obtm um panorama
completo das protenas presentes em uma clula. Por sua vez, a anlise protemica
fornece informaes mais precisas a respeito da interao entre o genoma celular e
o ambiente (Banks et al, 2000). Dessa maneira, por estabelecer uma ligao entre a
-
39
seqncia gnica e a fisiologia celular, a anlise protemica complementa a anlise
do genoma em pesquisas sobre novos marcadores para diagnstico, prognstico e
avaliao da resposta ao tratamento (Clarke et al, 2008; Gast et al, 2009).
Figura 8 Representao esquemtica do fluxo de informao dos genes para a funo
(fentipo). Modificado de Goodacre (2005).
Apesar dos inmeros estudos que abordam o cncer de mama, as ferramentas
usadas atualmente para o diagnstico e definio de prognstico desse cncer, em
muitos casos, no determinam o sucesso do tratamento (Ries et al., 2007;(Jemal et
al, 2008). Por essa razo, so necessrios estudos para estabelecer marcadores
adequados para esse tipo de neoplasia (Gast et al, 2009).
-
40
O estudo protemico do cncer de mama tem, portanto, como principais objetivos a
identificao de marcadores que possam ser teis no diagnstico, na avaliao de
prognstico, na definio de tratamento e no monitoramento das pacientes durante e
aps a terapia. Tambm busca identificar molculas relacionadas ao
desenvolvimento do cncer ou resistncia de clulas tumorais a diferentes
abordagens teraputicas (Espinosa et al, 2006; Clarke et al, 2008). Estudos
protemicos permitiram a identificao de protenas superexpressas em clulas de
cncer com aumento na expresso de HER-2, um receptor associado ao mau
prognstico no cncer de mama. Entre essas protenas podem ser citadas a HSP
27, a triosefosfato isomerase, envolvida no metabolismo intermedirio, alm de
protenas com atividades antioxidante e detoxificante (Zhang et al, 2005). Esse tipo
de anlise tambm demonstrou que a expresso reduzida da isoforma da protena
14-3-3, envolvida no controle do ciclo celular, na diferenciao e na apoptose, no
apresenta relao com o desenvolvimento do cncer de mama (Moreira et al, 2005),
como assumido anteriormente.
A anlise protemica tem sido aplicada tanto a linhagens celulares de cncer de
mama (Hathout et al, 2004; Pucci-Minafra et al, 2006; Crugliano et al, 2007) quanto a
amostras coletadas de pacientes durante o tratamento (Celis et al, 2005; Pucci-
Minafra et al, 2008) e tem se mostrado til por fornecer grande volume de
informaes a respeito da expresso protica nessas amostras. Muitos desses
estudos so realizados com culturas de clulas as quais so ferramentas
importantes e, relativamente, de fcil aplicao (Lacroix, Leclercq, 2004). No
presente estudo foram usadas duas linhagens de cncer de mama humano, MACL-1
e MGSO-3, estabelecidas por Correa e colaboradores (2009) a partir de fragmentos
de tumores primrios de mama. As clulas dessas linhagens apresentam morfologia
epitelial, so capazes de crescer em meio semi-slido e so tumorignicas em
camundongos imuno-suprimidos. Ambas expressam telomerase e apresentam
expresso de MUC-1 superior quela da linhagem comercial MDA-MB-231 (Correa
et al, 2009).
O uso de diferentes linhagens em estudos de cncer de mama importante uma vez
que existe grande variedade genotpica e fenotpica nesse tipo de neoplasia (Vargo-
Gogola, Rosen, 2007). Alm disso, devido s suas caractersticas, as linhagens
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41
MACL-1 e MGSO-3 demonstram potencial para serem usadas como modelos no
estudo de aspectos moleculares e celulares do cncer de mama. Entretanto, no h
conhecimento a respeito da resposta das clulas dessas linhagens radiao
ionizante. Portanto, a investigao dessas respostas bem como dos mecanismos
envolvidos seria relevante para a determinao da possvel utilidade dessas clulas
em pesquisas inovadoras no campo do desenvolvimento de frmacos, terapia
hormonal e radioterapia.
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2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVO
2.1 Justificativa
Uma parte considervel do conhecimento a respeito do cncer de mama baseia-se
em estudos in vitro e in vivo realizados com culturas de clulas desse tipo de cncer.
Entretanto, mais de dois teros dos estudos que usam clulas de cncer de mama
foram realizados com trs linhagens derivadas de metstases: MCF-7, MDA-MB-231
and T-47D. Para superar essa limitao, as culturas estabelecidas a partir de
fragmentos de tumores primrios de pacientes com cncer de mama so
ferramentas importantes. Isso porque as clulas metastticas apresentam inmeras
alteraes em relao quelas presentes no tumor primrio.
Recentemente, duas linhagens de cncer de mama humano foram estabelecidas e
caracterizadas em nosso laboratrio: MACL-1 e MGSO-3. Em funo de no haver
conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos na morte induzida pela
radiao ionizante nessas linhagens, a conduo de um estudo que investigue de
forma ampla esse aspecto importante para estabelecer o potencial uso dessas
linhagens celulares em estudos de biologia celular e molecular e para o
desenvolvimento racional de modelos para investigao de terapias do cncer de
mama.
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43
2.2 Objetivo geral
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito induzido pela radiao ionizante
sobre as linhagens de cncer de mama humano MACL-1 e MGSO-3 e o perfil de
expresso protica dessas clulas.
2.3 Objetivos especficos
1. Avaliar a morte celular induzida pela radiao .
2. Avaliar os mecanismos envolvidos na resposta celular induzida pela radiao .
3. Avaliar o envolvimento de caspases na resposta celular induzida pela
radiao .
4. Avaliar ocorrncia de alterao na expresso protica induzida pela radiao
nas clulas da linhagem MDA-MB-231 por eletroforese bidimensional.
5. Comparar o perfil de expresso protica de culturas de clulas de cncer de
mama e de clulas saudveis por eletroforese bidimensional.
6. Identificar protenas diferencialmente expressas por espectrometria de massa.
-
44
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Linhagens celulares
Foram usadas duas linhagens celulares estabelecidas por Correa e colaboradores
(2009) a partir de amostras de tumores primrios de pacientes com cncer de
mama: MGSO-3 e MACL-1 (Figura 9). Tambm foi usada uma linhagem comercial
de clulas de cncer de mama da American Type Culture Collection (ATCC): MDA-
MB-231 (Anexo A). Esse projeto foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da
UFMG sob Parecer n ETIC 404/06 (Anexo B).
Figura 9 - Aspecto morfolgico ao microscpio ptico das clulas das linhagens MACL-1,
MGSO-3 e MDA-MB-231 (aumento de 300x) (Correa et aI, 2009).
3.2 Cultura celular
As clulas foram mantidas em frascos de cultura celular T-75 (TPP) contendo meio
de cultura Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM GIBCO) suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SFB) (GIBCO) e com os antibiticos gentamicina (50
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45
g/L), penicilina (500 U/mL) e estreptomicina (500 mg/mL) (GIBCO). As culturas foram
mantidas em estufa mida, contendo 5% de CO2, a 37 C. As culturas foram
observadas diariamente em microscpio ptico e repicadas sempre que atingiram
80% de confluncia.
3.3 Tratamento das clulas com radiao
As clulas foram coletadas dos frascos de cultura por meio do uso de tripsina
(GIBCO) que foi, posteriormente, inativada com DMEM + 10% SFB. A suspenso de
clulas foi centrifugada e suspensa em 1 mL de meio de cultura. Aps a contagem
no hemocitmetro as clulas foram inoculadas em meio de cultura na densidade de
5 x 104 clulas/poo em placas de 24 poos ou 1 x 105 clulas/poo em placas de 6
poos e mantidas em estufa mida, contendo 5% de CO2, a 37 C por 24 horas.
O tratamento das clulas com radiao nas doses de 10 e 20 Grays (Gy) foi
realizado com uma fonte de 60Co, no Laboratrio de Irradiao Gama do
CDTN/CNEN. As clulas foram transportadas em placas ou garrafas de cultura
vedadas e recolocadas em estufa mida, contendo 5% de CO2 a 37 C,
imediatamente aps o tratamento. As culturas usadas como controles dos
experimentos foram transportadas nas mesmas condies e recolocadas na estufa
simultaneamente com as clulas tratadas.
3.4 Avaliao de morte celular
3.4.1 Avaliao de viabilidade celular pelo ensaio de metabolizao de
metiltiazoltetrazlio (MTT)
O ensaio de metabolizao de MTT um mtodo colorimtrico sensvel e
quantitativo que mensura a viabilidade, proliferao e estado de ativao das clulas
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46
(Mosmann, 1983). Esse ensaio baseia-se na capacidade de enzimas
desidrogenases, presentes na mitocndria de clulas viveis, de converter o
substrato MTT, solvel em gua, no cristal de formazan, produto insolvel em gua.
Uma vez que a quantidade de formazan produzida diretamente proporcional ao
nmero de clulas viveis, esse modelo pode ser usado com o objetivo de avaliar
citotoxicidade e proliferao celular induzidas por diferentes estmulos.
As clulas cultivadas em placas de 24 poos foram submetidas ao tratamento com
radiao (10 ou 20 Gy) e os ensaios de viabilidade foram realizados 24, 48 ou 72
horas aps a irradiao. Nos tempos indicados o meio de cultura das placas foi
removido e foram adicionados 170 L de soluo de MTT (5mg/mL) e 210 L de
DMEM + 10% SFB em cada poo. As amostras foram mantidas na estufa por duas
horas para metabolizao do MTT. Aps esse perodo, foram adicionados 210 L de
SDS/HCl 10%/poo e as placas foram incubadas por 18 horas para solubilizao
dos cristais de formazan. Foram coletados 100 L de cada poo e a leitura dos
valores de absorbncia da soluo resultante foi realizada a 595 nm em um leitor
automtico de microplacas (Anthos 2010, Biochrom, UK). O valor de densidade
ptica do grupo controle foi considerado como 100% para clculo da porcentagem
de alterao da viabilidade celular induzida pela irradiao.
3.4.2 Ensaio de clonogenicidade
O ensaio de clonogenicidade ou sobrevivncia clonognica permite a avaliao da
capacidade das clulas formarem colnias em placas de cultura (Figura 10). Esse
ensaio detecta as clulas que mantm a capacidade de gerar um nmero
considervel de clulas filhas aps um tratamento que induz morte associada
diviso celular (Franken et al, 2006).
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47
Figura 10 Visualizao das colnias formadas a partir do plaqueamento de clulas de
cncer de mama no irradiadas nas densidades de 100, 200 e 300 clulas em placas de 6
poos. Imagens obtidas aps 10 dias de incubao. As colnias foram fixadas com
glutaraldedo e coradas com cristal violeta.
Nesse ensaio, as clulas foram inoculadas em meio de cultura na densidade de 2 x
105 clulas em frascos T-25 (TPP), incubadas em estufa mida contendo 5% de
CO2 37 C por 24 horas e, posteriormente, irradiadas com 0, 10 ou 20 Gy.
Imediatamente aps o tratamento as clulas foram coletadas dos frascos de cultura
por meio do uso de tripsina. Aps a contagem no hemocitmetro as clulas foram
inoculadas nas densidades de 100, 200, 300, 400 e 600 clulas/poo em placas de 6
poos e incubadas por 10 dias para avaliar o crescimento celular. Aps esse
perodo, o meio de cultura foi cuidadosamente removido e os poos foram lavados
com tampo salina fosfato (PBS). As colnias foram, ento, fixadas adicionando a
cada poo 2 mL de soluo contendo 6% (v/v) de glutaraldedo e 0,5% (p/v) de
cristal violeta em gua. As placas foram incubadas por 30 minutos a temperatura
ambiente. A soluo fixadora foi removida, as placas foram lavadas cuidadosamente
com gua corrente e mantidas a temperatura ambiente at secagem completa. As
colnias com mais de 50 clulas foram contadas com auxlio de microscpio
invertido.
-
48
O nmero de colnias formadas a partir das culturas controle foi usado no clculo de
eficincia de plaqueamento (PE) de acordo com a equao abaixo:
PE = nmero de colnias formadas x 100%
nmero de clulas plaqueadas
O valor de PE e o nmero de colnias formadas a partir das culturas tratadas com
10 ou 20 Gy foram usados para o clculo da frao de sobrevivncia (FS) de acordo
com a equao:
FS = nmero de colnias formadas aps o tratamento
nmero de clulas plaqueadas x PE
3.4.3 Recuperao de clulas aps a irradiao
Para a realizao do ensaio de recuperao de clulas aps a irradiao as clulas
foram cultivadas em placas de 6 poos, tratadas com radiao (20 Gy) e mantidas
em cultura at atingirem confluncia. Essas clulas que no entraram em processo
de morte celular foram transferidas para frascos de cultura T-25 e, posteriormente,
para frascos T-75 (Tyrsina et al, 2005). Aps 21 dias as clulas recuperadas (R) e as
clulas controle (no expostas previamente RI) foram semeadas em placas de 24
poos (5 x 104 clulas/poo) e irradiadas com 0, 10 ou 20 Gy. Posteriormente, a
viabilidade dessas clulas foi avaliada por meio do ensaio de MTT, conforme
descrito no item 3.4.1.
-
49
3.4.4 Determinao do contedo de DNA subdiplide por citometria de fluxo
A fragmentao do DNA induzida pela radiao foi avaliada por meio da anlise,
por citometria de fluxo, de ncleos corados com iodeto de propdeo (PI), um agente
intercalante fluorescente que se liga ao DNA corando-o de vermelho. Essa
substncia amplamente usada no estudo de morte celular, pois no penetra
atravs da membrana celular ntegra e, portanto, diferencia clulas normais de
clulas apoptticas e necrticas (Aubry et al, 1999). O PI permite, tambm, analisar
a distribuio de uma populao de clulas entre as diferentes fases do ciclo celular.
Isso porque a interao entre o corante e o DNA segue uma relao estequiomtrica
(uma molcula de PI a cada 4 a 5 pares de bases) e o contedo de DNA varia
durante as diferentes fases do ciclo celular (G1 2n; G2 - 4n). Alm disso, a
fragmentao do DNA pode ser observada por meio dessa colorao, pois, quando
ocorre, o contedo de DNA torna-se menor que 2n (subdiplide) (Nicoletti et al,
1991).
As clulas cultivadas em placas de 24 poos foram submetidas ao tratamento com
radiao (10 ou 20 Gy) e os ensaios foram realizados 24, 48 ou 72 horas aps a
irradiao. Nos tempos indicados, as placas foram centrifugadas a 330 g por cinco
minutos e o meio de cultura foi cuidadosamente removido. Foram adicionados 300
L de uma soluo fluorocrmica hipotnica (HFS) contendo 50 g/mL de PI
(Calbiochem-Novabiochem Corporation, USA) e 0,5% de Triton X-100 (Sigma, USA)
em citrato de sdio 0,1% (Merck, Brasil). As placas foram incubadas por 4 horas a 4
C e as amostras foram submetidas anlise por citometria de fluxo (FACScan,
Becton Dickinson). A delimitao da populao celular foi feita em grficos de pontos
de tamanho versus granulosidade. Para determinao do contedo de DNA
subdiplide, a distribuio dos ncleos foi analisada no programa CellQuest (Becton
Dickinson) em histogramas que representam o nmero de eventos em funo da
fluorescncia, como exemplificado na figura 11.
-
50
Figura 11 - Histograma representativo da anlise do contedo de DNA subdiplide,
representado no grfico pelo marcador M1.
3.4.5 Determinao do ndice mittico
A histona 3 uma protena que se liga ao DNA e auxilia no enovelamento desse
cido nuclico. Essa histona fosforilada apenas durante a mitose, o que permite
seu uso para identificar clulas nessa fase do ciclo celular (Rodrigues et al, 2007).
Nesse ensaio, as clulas foram semeadas na densidade de 2 x 105 clulas em
lamnulas de vidro, mantidas em estufa mida, contendo 5% de CO2, a 37 C por 24
horas e submetidas ao tratamento com radiao (20 Gy). O ensaio de
imunofluorescncia foi realizado 24 horas aps a irradiao.
Nesse momento o meio de cultura contido em cada poo foi delicadamente aspirado
e as clulas foram lavadas duas vezes com PBS. As clulas foram fixadas com
soluo de paraformaldedo 4% (p/v) em PBS por 15 minutos, a temperatura
ambiente. Depois de lavadas trs vezes (5 minutos cada) com PBS as clulas foram
permeabilizadas com PBS + Triton-X 100 0,1% (v/v) por 10 minutos a temperatura
ambiente e novamente lavadas com PBS. As lamnulas foram, ento, incubadas
com soluo de bloqueio contendo 1% (p/v) de albumina bovina (BSA) e 5% (v/v) de
soro de cabra em PBS por uma hora, a temperatura ambiente. Aps nova lavagem
com PBS as lamnulas foram incubadas com o anticorpo primrio de coelho anti-
-
51
histona-3-fosforilada (Upstate, USA). O anticorpo foi diludo 1:200 em PBS contendo
1% (p/v) de BSA. As lamnulas foram retiradas dos poos e colocadas em uma
superfcie limpa e impermevel sobre 100 l da soluo contendo o anticorpo
primrio, deixando as clulas em contato com a soluo por 18 horas em cmara
mida, a 4 C. Foi preparado, tambm, um controle negativo que foi incubado na
ausncia do anticorpo primrio.
Aps a incubao com o anticorpo primrio, as lamnulas foram lavadas trs vezes
com PBS por 5 minutos cada lavagem. Em seguida, as clulas foram colocadas em
contato com 100 l da soluo de anticorpo secundrio diludo 1:500 em PBS
contendo 1% (p/v) de BSA por uma hora em cmara mida, ao abrigo da luz e a
temperatura ambiente. Foi usado o anticorpo de cabra anti-coelho conjugado a
Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). As lamnulas foram novamente lavadas trs
vezes com PBS por 5 minutos cada lavagem. A marcao nuclear foi realizada com
PI diludo em PBS (0,5 g/ml) e as clulas foram marcadas seguindo os mesmos
procedimentos anteriores, por 5 minutos, ao abrigo da luz, em cmara mida e a
temperatura ambiente. Em seguida as lamnulas foram lavadas trs vezes por 20
minutos e as lminas montadas com Hydromount (National Diagnostics, EUA). Ao
final deste processamento, as lminas foram analisadas por meio de microscopia
confocal (Zeiss LSM 510 Meta) no Centro de Microscopia Eletrnica do
Departamento de Morfologia do ICB/UFMG, usando-se os programas Carl Zeiss
Laser Scanning Microscope LSM 510 e Adobe Photoshop CS.
As imagens para contagem de clulas em mitose foram adquiridas aleatoriamente.
Foram contadas pelo menos 200 clulas/lamnula e o experimento foi realizado em
triplicata. O clculo do ndice mittico foi realizado conforme a equao a baixo:
nmero de clulas em mitose x 100
nmero total de clulas
-
52
3.5 Avaliao dos mecanismos de morte celular
3.5.1 Ensaio de dupla colorao com anexina V-FITC e PI
Esse ensaio baseia-se na afinidade da anexina V pelo fosfolpide de membrana
fosfatidilserina. Esse fosfolpide encontra-se voltado para a face interna da
membrana celular e exposto na face externa durante os estgios iniciais da
apoptose. Nessa fase as clulas mantm a integridade da membrana celular, o que
impede a penetrao do PI. A permeabilizao da membrana nos estgios mais
avanados da apoptose permite a penetrao desse corante e as clulas tornam-se
duplo-marcadas. Portanto, esse ensaio permite a quantificao de clulas em
estgios iniciais de apoptose bem como sua diferenciao daquelas em estgios
tardios de apoptose ou em necrose (Aubry et al, 1999).
Para a realizao desse ensaio, as clulas foram coletadas por meio do uso de
tripsina 48 horas aps o tratamento com 20 Gy. Aps serem lavadas com PBS, as
clulas foram suspensas em 100 L de tampo de ligao (BD Pharmingen, USA) e
incubadas com 10 L de PI (50 g/mL) e 5 L de anexina V-FITC (BD Pharmingen,
USA) por 15 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. As amostras foram
imediatamente submetidas anlise por citometria de fluxo (FACScan, Becton
Dickinson) utilizando o programa CellQuest (Becton Dickinson) para determinao
da porcentagem de clulas marcadas com anexina V-FITC, PI ou duplo-marcadas.
3.5.2 Tratamento com inibidor de caspases
Antes do tratamento das clulas com radiao o meio de cultura foi removido e
foram acrescentados 300 L de DMEM + 10% SFB contendo 80 mol/L do inibidor
de caspases Z-Val-Ala-Asp(OCH3)-fluorometilcetona (zVAD-FMK - Biomol
International LP, UK). As placas de cultura foram incubadas durante uma hora em
-
53
estufa mida de CO2 (Souza-Fagundes et al, 2003). Aps esse perodo foram
acrescentados 700 L de DMEM + 10% SFB em cada poo e as placas foram
submetidas ao tratamento com radiao (20 Gy). O contedo de DNA subdiplide
e a viabilidade celular foram determinados 48 horas aps a irradiao, conforme
descrito nos itens 3.4.4 e 3.4.1, respectivamente.
3.5.3 Ensaio de deteco de ativao de caspases 8 e 9
A ativao das caspases 8 e 9 foi detectada por meio do kit ApoTarget (Invitrogen,
USA), sendo que o experimento foi realizado de acordo com a orientao do
fabricante. As clulas foram coletadas por meio do uso de tripsina 24 ou 30 horas
aps o tratamento com 20 Gy. A lise foi realizada com Caspase Assay Kit Cell Lysis
Buffer (Invitrogen, USA) e a concentrao de protenas foi determinada pelo mtodo
de Bradford. Para o ensaio de atividade de caspase foram usados 200 g de
protenas. Nesse ensaio, foram usados substratos conjugados a cromforos
especficos para caspases 8 e 9, IETD-pNA e LEHD-pNA, respectivamente. Aps
incubao por duas horas em estufa mida, a 37 C, a absorbncia das amostras foi
analisada a 405 nm em um leitor de placas (Anthos 2010, Biochrom, UK). O
resultado foi expresso como unidades relativas de absorbncia em comparao com
os valores do grupo controle (no irradiado).
3.5.4 Deteco de caspase 3 ativa por citometria de fluxo
As clulas foram coletadas por meio do uso de tripsina 30 horas aps o tratamento
com 20 Gy. Aps lavagem com PBS as clulas foram fixadas e permeabilizadas com
o tampo Cytofix/CytopermTM (BD Pharmingen, USA) por 20 minutos a temperatura
ambiente. Em seguida, foi realizada a marcao com o anticorpo anti-caspase 3
ativa conjugado a FITC (BD Pharmingen, USA) em tampo Perm/WashTM (BD
Pharmingen, USA) por 30 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. As
-
54
amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACScan, Becton Dickinson). A
porcentagem de clulas com caspase 3 ativa foi determinada por meio do programa
CellQuest (Becton Dickinson) em histogramas que representam o nmero de
eventos em funo da fluorescncia.
3.6 Cultura de clulas de mama saudvel
A cultura transitria de clulas de mama saudvel foi obtida em nosso laboratrio a
partir de fragmentos de tecido de mamoplastia. O tecido foi gentilmente doado pelo
Dr. Evaldo Lacerda Vilaa com o consentimento livre e esclarecido da paciente. O
material foi processado imediatamente aps a cirurgia. Todos os procedimentos
foram realizados em ambiente estril. Inicialmente, o tecido foi lavado com DMEM e
fragmentado com o auxlio de uma tesoura. Em seguida, foi imerso em soluo
contendo 2% de colagenase (Sigma-Aldrich, USA) em PBS e mantido em estufa
mida a 37 C com 5% de CO2 durante 24 horas. Aps esse perodo, o material foi
filtrado em gaze estril para remoo dos fragmentos de tecido. O filtrado contendo
clulas foi transferido para trs frascos de cultura T-25 que foram incubados em
estufa mida a 37 C com 5% de CO2. As culturas foram observadas diariamente e o
meio de cultura foi substitudo a cada trs dias. Quando atingiram confluncia, as
clulas foram transferidas para trs frascos T-75. Aps doze semanas as clulas
foram coletadas conforme descrito no item 3.7.1.
3.7 Eletroforese bidimensional
3.7.1 Extrao de protenas
O meio de cultura das garrafas T-75 foi coletado em tubos de 50 mL estreis. Em
seguida, foram adicionados 5 mL de DMEM a cada garrafa e, com o auxlio de um
-
55
raspador de clulas estril, as clulas foram desprendidas. O contedo de cada
garrafa foi transferido para os tubos correspondentes. As garrafas foram lavadas
duas vezes com 5 mL de DMEM, que tambm foi recolhido. Os tubos foram
centrifugados a 330 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado de clulas foi lavado com 5 mL de DMEM. Aps nova centrifugao, as
clulas foram suspensas em 1 mL de DMEM. A suspenso foi transferida para tubos
de 2 mL e centrifugada a 12800 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi
cuidadosamente removido a fim de que o precipitado de clulas estivesse livre de
DMEM. Esse material foi submetido ao processo de lise conforme descrito a seguir.
Ao precipitado de clulas foi adicionado um volume de tampo de lise (uria 7 M;
tiouria 2 M; CHAPS 4%) equivalente ao volume estimado do material inicial. As
clulas foram suspensas com o auxlio de um vortex e mantidas em gelo, sob
agitao, durante 2 horas. A fim de melhorar o processo de lise, o contedo de cada
tubo foi passado dez vezes por uma agulha de 12 G com o auxlio de uma seringa.
O material foi, ento, centrifugado por 30 minutos a 12800 g a 4 C. O sobrenadante
foi coletado em um novo tubo, a concentrao de protenas fo