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TOXINAS DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS.

INTERAÇÃO PROTEÍNA - PROTEÍNA E CINÉTICA DE

TROCA ISOTÔPICA HIDROGÊNIO - TRICIO

José Roberto Rogero

DISSERTAÇÃO E TESE - IEA 119

IEADT-119ABRIL/1979

CONSELHO DELIBERATIVO

MEMBROS

Klaus Reinach — PresidenteRoberto D'Utr.i VazHelcio Modesto da CostaIvano Humbert MarchesiAdmar Cervellini

PARTICIPANTES

Regina Elisabete Azevedo Beretta

Flávio Gori

SUPERINTENDENTE

Rõmulo Ribeiro Pieroni

DISSERTAÇÃO E TESE-IEA 119 ABRIL/1979

IEA- DT- 119

TOXINAS DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS.

INTERAÇÃO PROTEÍNA - PROTEÍNA E CIN£TtCA DE

TROCA ISOTOPICA HIDROGÊNIO - TRfCIO

Josá Roberto Rogero

Ta«a para obtançlo do Tftulo da "Doutor am CMnciai" -Araa da Bioquímica - Oriantador: Prof. Dr. Joié MouraGonçalvti Aprwantada a dafandida am 26 da agottoda 1978, no Instituto da Química da Univanidada da

Sao Paulo

INSTITUTO DE ENERGIA ATÔMICASAO PAULO-BRASIL

Série DISSERTAÇÃO E TESE IE A

INIS Categories and Ovscriptora

C45

Snakc*

Venoms

Toxins

Proteins

Interact k*v_

Hydrogen

Tritium

Isotopic «xehangt

Nota: A radaçfo, ortografia • ooncaltot ifo da raiponttWIklida dot autor*.

SUMARIO

Página

I - INTRODUÇÃO E PROPÓSITOS 1

|| _ MATERIAIS E MÉTODOS 3

11.1 - Purificação de Crotamina, Crotapotin e Fosfolipase A 3

11.2 — Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 4

11.2.1 - Eletroforese de Crotapotin 4

11.2.2 - Eletroforese de Crotamina e Fosfolipase A 5

11.3 - Análise de Aminoácidos 5

11.3.1 - Análise do Padrão de Aminoácidos 511.3.2 - Análise das Proteínas 5

11.4 - Medida da Atividade Enzimática da Fosfolipase A 5

11.5 - Determinação da Presença de Fatores Coagulantes 6

11.6 — Dosagens das Proteínas 6

11.7 — Curvas de Absorbância das Pro temas 6

11.8 - Determinação de Grupos SH Livres 7

11.9 - Marcação de Crotapotin com 1 2 S I 7

11.9.1 - Controle Eletroforético do Pico de Crotapotin I 2 5 I 7

11.10 — Determinação da DLg Q das Proteínas 7

11.11 - Medida da Velocidade de Troca Hidrogênio-Trfcio 8

11.11.1 - Medida do "Exchange Out" da Crotamina 9

11.11.2 - Medida do "Exchange Out" da Fosfolipase A 10

11.11.3 - Medida do "Exchange Out" da Crotapotin 10

11.11.4 - Medida do "Exchange Out" da Crotoxina 10

11.11.5- Medida da Radioatividade 11

11.11.6 - Cálculo da Eficiência de Contagem 11

11.11.7 - Cálculo *> Número de Hidrogénios Teoricamente Trocáwii 11

11.11.8 - Ajustes aos Dados Obtidos p ela Troca Isotoplca Hidrogtnio-Trício 12

11.12 - Interaçffo das Proteínas 12

11.12.1 - Mídida da Area dos Picos 12

11.12.2 - Interação entre Fosfolipase A e Crotapotin 13

11.12.3 - Cromatografia de Crotoxina 13

11.12.4-InteracSo entre Fosfolipase A n Crotapotin Contendo Crotapotin111!

como Traçador 13

M.12.6 - InteracSo entre Crotamina t Crotapotin 13

11.12.6 - Interacfo entre Crotamina a Crotapotin Contando Crotapotin-1 a * I como

Traçador 13

Página

IM - RESULTADOS 14

111.1 - Purificação de Crotamina, Crotapotin e Fosfolipase A 14

111.2 - Ele^roforese em Gel de Poliacrilamida 20

1(1.3 - Presença de Fatores Coagulantes 20

\\\.A - Dosagem das Proteínas 20

111.5 - Análise de Aminoácidos 20

111.6 - Absorção das Proteínas no UV 20

111.7 - Medida da Atividade Enzimática da Fosfolipast A 20

II 1.8 - Determinação de Grupos SH Livres 24

If 1.9 - Interação entre Fosfolipase A e Crotapotin '. 24

111.10 - Interação entre Crotapotin e Crotamina 24

111.11 - Interação entre Fosfolipase A e Crotamina com Crotapotin Contando

Crotapotin-12SI como Traçador 24

111.12 - DeterminaçSo da DL g 0 30

111.13- Medida da Velocidade de Troca Hidrogftnio-Trício 30

111.13.1 - Troca H/T da Fosfolipa» A 32

111.13.2 - Troca H/T da Crotapotin 32

111.13.3 - Troca H/T da Crotoxina 37

111.13.4 - Troca H/T da Crotamina 37

111.14 - Medida da Radioatividade 37

IV - DISCUSSÃO 42

V - CONCLUSÕES 48

APÊNDICE 1 60

APÊNDICE 2 71

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 78

TOXINAS DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS.

INTERAÇÃO PROTEÍNA - PROTEllMA E CINÉTICA DE

TROCA ISOTÔPICA HIDROGÊNIO - TRICIO

José Roberto Roger o

RESUMO

A Fosfolipase A, Crotapotin e CroMirmu tuidm purificadas a part» do veneno de Crotalus duriaui MrrHkuf.Mediante análise de aminoácidos das proteínas ficou estabelecido um pero molecular 13400 para Fosfolipase A. 8300para Crotapotin e 4880 para Crotamina. Crotapotin interage com Fosfolipase A (DLgg = 0,55 mg/Kg peso) dando umcomplexo estável durante a filtraçSo em gel Sephadex G 75 fino, quando a proporção molar de interação é 1:1. O

complexo for mo do é cerca de 10 vezes mais tóxico do que a Fosfolipase A so2inha, quando injetado i.p. em

camundor.gos (DLJ-J-, = 0,05 mg/Kg peso). Estes fato;, levam a supor que a Crotoxina, toxina neurotôxica cristalizavel doveneno de Crotalus d. terrificus, resulta da interação Crotapotin-Fosfolipase A na proporção molar 1:1. A Crotapotin

interage com Crotamina (OL r , " 0,'' mg/Kg peso), formando um complexo dissociável durante a filtração emgtl

Sephadex G 75 fino. Quando o complexo formado " in vitro" na proporção molar de 1 1 é injetado em camundongosapresenta uma toxicidade cerca de 4 ve/cs maior do que a Crotamina sozinha ( D L , Q = 0,2 mg/Kg peso). O estudo d»cinética de troc? isotópica H/T foi feito em Fosfolipase A, Crotapotin, Crotamina e Crotoxina, utilizando o método d»filtraçSo em colunas de Sephadex G 20 "coarse". O melhor ajuste dos dados experimentais de troca H/T de Fosfolipase

A apresenta uma equação que é composta de duas expon*nciais, caracterizando duas classes de hidrogênios. Mostra

também que a Fosfolipase A tem 68% dos hidrogênios teoricamente trocáveis, muito rápidos e, nSo apresenta

hidrogênios com velocidades de troca próxima daqueles envolvidos em alfa-hélice. A Crotapotin pela mesma análise nSo

apresenta hidrogênios envolvidos em alfa-hélice e 83% dos teoricamente trocáveis, sá"o rapidamente trocados com o

solvente. A Crotamina pela medida da cinética de troca H/T, apôs um aquecimento inicial com H 2 0 a 70°C por 2

horas, mostra que dos hidrogênios teoricamente trocáveis, 31% sSo lentos. Quando o aquecimento inicial é prolongado

na mesma temperatura por 18 horas, os hidrogênios lentos diminuem para 11%. A aplicação da técnica da medida da -

cinética de troca H/T na Crotoxina, mostra o aparecimento de 26 hidrogênios que trocam com velocidades semelhante»

aqueles envolvido- em alfa-hélice. Este fato sugara que possivelmente ocorreria uma mudança conformacional após a

interação Fosfolipase A - Crotanitin, originando a Crotoxina.

I - INTRODUÇÃO E PROPÓSITOS

A Crotoxina, proteína neurotôxica do veneno Crotalus duriuus terrificus, foi pela primeira vezisolada e cristalizada por Stotta e í raenkel-Conrat , em 1 938. Estudos por eletroforese com aparelho

de Tíselius'601 e por ultraoentrifugaçlo137', mostraram ser a Crotoxina uma proteína homogênea depeso molecular aproximadamente 30000.

Durante algum tempo a Crotoxina permaneceu como uma proteína homogênea • cristalizavelapesar de apresentar além da neurotoxicidade, atividade fosfolipasica ' .

Em 1 955, Neumann e Habermanrv ' prcjrando retirar da Crotoxina a atividade

fosfolipásica, identificaram uma nova proteína que continha a mesma açlo tóxica da Crotoxina, porém

Aprovada para publicaclo em agosto/1978.

com uma atividade fosfolipásica menor.'A esta nova proteína eles denominaram Crotactina. Entretantoesta nova toxina não pode ser purificada e isolada em quantidade que possibilitasse sua caracterizaçãomais detalhada139'401

A primeira evidência definitiva da existência na Crotoxina de duas proteínas diferentes,apareceu com o tratamento da proteína pelo fluordinitrobenzeno, que em função da solubilidade emágua possibilitou o isolamento de duas dinitrofenil-proteínas que se diferenciavam em muito nas suascomposições de aminoácidos .

(43 81 82 83\Após um longo período onde so lemus trabalhos realizados por Vital brasil et aiií •'•"'•o*-°*'

sobre a farmacologia da Crotoxina, dois grupos de pesquisadores liderados por Hendon eFraenkel-Conrat 9 Rubsamen et alii publicam no mesmo ano de 1 971, o fracionamento daCrotoxina em coluna de troca iònica, isolando e caracterizando duas p. oteínas diferentes.

Estas proteínas se diferenciavam em primeiro lugar pela composição de aminoácidos, umaextremamente ácida e outra extremamente básica e, pela toxicidade, que mostrava que a proteína ácidanão era tóxica e a proteína básica tinha toxicidade baixa. A proteína ácida potenciava a básica e por issofoi chamada Crotapotin. A proteína básica foi identificada como sendo uma Fosfolipase A (EC 3.I.I.4.).As duas proteínas se recombinavam dando origem à Crotoxina.

As características das subunidades da Crotoxina e a interação entre elas, têm merecido umasérie de publicações no* últimos anos1 5 '4 2-4 8-4 9 7 0 1 .

A Crotamina, proteína tóxica de uma variedade de veneno de Crotalus d. terrificus, foi isolada 4caracterizada por eletroforese por Gonçalves e Vieira'361, em 1 950.

A Crotamina anteriormente, purificada por Amberlite IRC50 u 2 ) e SP Sephadex C25 ( 5 9 ) ,estudada quanto ao seu peso molecular'33 '34 ' e quanto a sua ação farmacológica'10 '31 '32 ' , teve suaseqüência de aminoácidos determinada recentemente mostrando um peso molecular de 4880* 5 8 ) .

É uma proteína muito básica de pi: 10,3 que apresenta, quase sempre, na purificação doveneno global por filtraçâo em gel Sephadex G 75 uma contaminação com uma fração ácida revelada porCheymol et alii após cromatografia em troca iònica com Carboximetil Sephadex C 25.

Os propósitos deste trabalho foram em primeiro lugar pela técnica de filtraçâo em gel, definirnas toxinas purificadas as estequiometrias das interações Crotapotin-Fosfolipase A eCrotapotin-Crotamina, bem como, a toxicidade dos complexos formados;em segundo lugar aplicando atécnica de troca isotópica hidrogênio-trício, estudar as possíveis mudanças conformacionais queocorreriam pela interação entre as proteínas citadas.

A técnica de filtraçâo em gel para determinar constantes de associação de proteínas, interaçõesproteínas-peptídeos, etc. tem sido muito usada com base no trabalho de Hummel e Dreyer1501 com ochamado "método do poço"* 1 ' 2 8 ' 5 6 1 .

No nosso caso a intenção primordial foi a de tentar isolar o complexo formado e daídeterminar as proporções molares de interações. As participações da Crotapotin nos complexos com aFosfolipase A e com Crotamina, foi melhor visualizada com o uso de Crotapotin marcada com I J 5 I ,como traçador.

O estudo do comportamento estrutural de uma proteína em solução pela técnica de trocaisoiópíca hidrogftnio-deutério, foi feito pela primeira vez na Insulina por Llnderstrom-Lang(61), am1955.

Vários trabalhos se seguiram, utilizando sempre o mesmo método inicial, aplicando-o amproteínas como Riboni-clea$e(61> e a Lisozima'5 2 '5 3 ' . Oestes trabalnos foi possível destacar qua

peptídeos simples ou polipeptídeos com conformação ao acaso em solução aquosa, trocavam seushidrogênios labels (aqueles ligados a O, N, S) cem o solvente, em poucos m>nutos. Por outro lado, umaproteína nativa troca os hidrogênios peptídicos com uma velocidade consideravelmente mais baixa. Esteshidrogênios da proteína que trocavam com o solvente com velocidades muito baixas, foram inicialmentedefinidos como participantes das pontes de hidrogênio de uma alfa hélice. Mais tarde porém, com o usoda técnica de RX para esclarecer as estruturas conformacionais de alçjmas proteínas, verificou-se quenão havia concordância entre as porcentagens de alfa hélice e as porcentagens de hidrogênios lentosobtidos pela troca H/D ou H/T.

A técnica original de Linderstrom-Lang que envolvia uma série muito grande de operações, taiscomo, I iofilização, aquecimento a 60°C, congelamento, etc. foi elegantemente modificada porEnglander1201, em 1 963.

O autor passou a utilizar trício e a retirar o excesso do isótopo por filtração rápida em

pequenas colunas de gel Sephadex G 25 "coarse". Pela quantidade de trício carregada pela proteína,

podia-se calcular o número de hidrogênios que foram trocados.

A técnica desenvolvida por Englarder passou a ser muito utilizada no estudo da conformação demuitos compostos, tais como polipeptídeos'2 4 '3 0 '6 9 '8 4 1 , proteínas'7 '1 4 '1 5 -8 8 1 , ácidos nucléicos'731 ehormônios de crescimento . As colunas de gel Sephadex foram algumas vezes substituídas por umamicrodiálise rápida, com resultados muito semelhantes .

No nosso trabalho aplicamos a técnica de medida da velocidade de troca isotópica

hidrogênio-trício, com a utilização de colunas de gel Sephadex G 25 "coarse".

A técnica foi inicialmente empregada às proteínas isoladas, para nos dar uma idéia daconformação destas em solução e, em seguida foi usada no estudo das possíveis mudançasconformacionais que ocorreriam pela interação Fosfolipase A-Crotapotin.

II - MATERIAIS E MÉTODOS

11.1 — Purificação de Crotamina, Crotapotin e Fosfolipase A

As proteínas usadas neste trabalho foram purificadas a partir do veneno bruto e seco decascavel brasileira (Crotalus durissus terrificus)

Foram trabalhados dois tipos de venenos, sendo que só um deles denominado por Gonçalves em

1 9 5 6 ( 3 2 ) variedade crotaminicus, continha crotamina. Em ambos os casos a tecnologia de purificação

foi a mesma, diferenciando-se apenas sobre qual proteína se desejava obter.

Os métodos utilizados para essa purificação foram os empregados em 1 971, por Hendon a

Fraenkel-Conrat'47' e Rubsamen et alii , com algumas modificações.

Cerca de 200 mg de veneno bruto seco, foram dissolvidos em 10 ml de ácido aoétioo 0,1 M,separando sobrenadanto por centrifugação a 10 000 rpm, e desprezando o precipitado. O sobrenadantefoi submetido â filtração em uma coluna de 3 cm x 80 cm de gel Sephadex G 75 fino. Com um fluxo de0,5 ml por minuto recolheu-se 10 ml por tubo de efluente num coletor de frações Gilson, acompanhandoo perfil cromatoyiatico com um >nonitor de UV equipado cum filtro para 280 nm e regisuaaut.

A maior quantidade em massa e consequentemente, o maior pico de absorbância a 280 nm doperfil cromatográfico, pertence a Crotoxina.

Os tubos correspondentes ao pico de Crotoxina foram separados, juntados e liofilizadot num

l iof i l izador V i t t i s , modelo 10-100. Quando o veneno contém Crotamina, aparece no perfil

cromatográfico mais um pico logo após a Crotoxina, ocasionando uma separação mais difícil, quase

sempre com contaminação cruzada, das duas proteínas.

A Crotoxina liofilizada foi algumas vezes recromatografada nas mesmas condições usadas para oveneno, sem porém mostrar melhoria no seu estado de pureza.

O segundo passo da purificação foi o fracionamento da Crotoxina em coluna de troca ibnica,

realizada a 4°C.

Cerca de 100 mg de Crotoxina foram dissolvidos em 5 ml de tampão ácido formico-formiato de

amônio 0,05 M, pH 3,5. A esta mistura levemente turva, acrescentou-se algumas gotas de ácido fórmico

diluído até obtenção de uma solução límpida.

A amostra assim trabalhada, foi colocada sobre uma coluna de 0,9 cm x 40 cm de SP Sephadex

C 25, equilibrado com tampão formiato 0,05 M, pH 3,5. A eluição foi feita com volume total de 400 ml

de um gradiente linear salino de 0 a 3 M de NaCI.

O perfil cromatográfico foi acompanhado através de um monitor UV Gilson equipado com

registrador e, frações de 4 ml do efluente foram coletadas num coletor de frações também Gilson, com

um fluxo de 0,2 ml/minuto.

Os picos correspondentes a Crotapotin, Fosfolipase A e Crotamina, foram recolhidos •

separadamente dialisados contra água deionizada até reação negativa para cloreto com nitrato do prata.

Os sacos de diálise utilizados foram previamente tratados com uma mistura de anidridoacéticc-piridina, na proporção de 1:1, por 12 horas, para redução do diâmetro dos poros, afim de evitarperda de proteínas no processo de diálise.

A Crotamina e a Fosfolipase A foram recromatografadas várias vezes em SP Sephadex C 25 nas

mesmas condições anteriores, até obter-se um pico único e homogêneo de cada proteína.

A Crotapotin foi recromatografada várias vezes em colunas de 0,9 cm x 30 cm de DEAE

Sephadex A 25, equilibrado com tampão formiato 0,05 M, pH 3,5 e aluída com 300 ml de um gradient»

linear salino de 0 a 3 M de NaCI, afim de se obter um pico único e homogêneo de Crotapotin.

As proteínas cromatograficamente puras foram dialisadas, liofilizadas e estocadas sob vácuo em

dessecadores mantidos na geladeira.

11.2 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

O processo empregado foi o descrito por Davis112' em 1 964, usando-* equipamento específico

da Canalco, modelo 120, com tubos de vidro de 0,4 cm por 7,5 cm.

11.2.1 - EletrofomM d* Crotapotin

A eletroforese foi feita em tubos contendo gel de poliacrilamida a 7%. Em cada tubo colocou-st50 MI de amostra na concentração de 2 mg de Crotapotin por ml de tampfo Tris-gliclna pH9,6. Acorrida foi efetuada utilizando-se o mesmo tampfo nas cubas, o eletrodo colocado na posição normal(polo positivo na part* inferior) e uma corrente de 3 mA por tubo, dwani» UWÍ hora.

Após a corrida o gel fci retirado dos tubos e colocado por 30 minutos em ácido tricloroaoétkco

(TCA) a 12% para fixaçSo da proteína. Em seguida, o gel foi lavado varias vezes com água o corado comComassie Brilliant blue R 250. A descoloroçSo foi feita com lavagens seguidas com uma mistura demetanol :ácido acético:HaO na proporçSo em volume uc •50:75:875.

Após a descoloração os géis foram fotografados.

11.2.2 - Eletroforese de Crotamina e Fosfolipase A

A eletroforese foi realizada em tubos contendo gel de poliacrilamida a 15%. O tampSo utilizadofoi o de beta alanina - ácido acético, pH 4,3 e a concentração da amostra de 2 mg/ml do mesmotampão. Efetuou se a corrida com 3 mA por tubo, durante uma hora. Os géis foram fixados, cor ados edescorados como no item 11.2.1.

11.3 — Análise de Aminoácidos

A composição de aminoácidos foi determinada nas proteínas que mostraram apenas uma bandana eletroforese em gel de poliacrilamida. Utilizou-sf analisador de aminoácidos Beckman, modelo 120 C.

11.3.1 - Análise do Padrão de Aminoácidos

Uma solução estoque padronizada (Aminoacid Calibration Mixture Beckman' serviu de padrão

pa ra determinar as constantes relativas às áreas correspondentes a cada aminoácido.

Amostras contendo 0,1 /jmol de cada aminoácido foram diluídas em tampão citrato 0,2 N,

pH 2,2 e analisadas nas colunas contendo: resina PA 35 (Custom Resin type PA 35 - Beckman) eluídas

com tampão citrato 0,35 M, pH 5,8 para os aminoácidos básicos; resina AA 15 (Custom Resin type

AA 15 - Beckman) eluídas com tampão citrato 0,2 M, pH 3,28 e, em seguida com mesmo tampão com

pH 4,25, para os aminoácidos neutros e ácidos.

11.3.2 - Análise das Proteínas

Dois miligramas das proteínas (Cro tapo tin, Fosfolipase A e Crotamina) foram dissolvidos em1,0 ml de ácido clorídrico 6 N , em ampolas especiais que permitiram, após dissolução das proteínas, oseu fechamento sob vácuo. Em seguida, as amostras foram colocadas a 120° C por 10 h, 20 h e 24 h,para a hidrólise.

Após o tratamento as amostras foram lavadas três vezes com água bidestilada e secadas sobvácuo na presença de pentóxido de fósforo. Em seguida dissolvidas em 0,5 ml de tampão citrato •analisadas segundo procedimento usual.

11.4 - Medida da Atividade Enzimática da FosfolipaM A

O processo empregado foi o descrito por Kibermann et a l . ( 4 1 > onde uma suspensão de gema da

ovo 4 utilizada como substrato. A Fosfolipase A age na lecitina presente na gema, dando a lisolecitina

que na presença de glóbulos vermelhos provoca hemólise, que é quantificada pela absorblncia a 578 nm.

Foi utilizado para as leituras de absorbflncia um espactrofotometro Carl Zeiss, modelo PMQ I I .

A curva padrío de hemólise foi obtida com a Fosfolipase A pura da seguinte maneira: Q, 6, 20,

30, 40, 50 ^g de Fosfolipase A por 60^1 de solução fisiológica foram pipetados sobre 60pi de gema de

ovo fresca e, logo após agitação as amostras foram incubadas a 37°C por duas horas. Em seguida, 4 mlde suspensão de glóbulos vermelhos a 0,6% em soluçSo fisiológica foram adicionadas aos tubosprá-incubados de Fosfolipase A de gema de ovo. Os glóbulos vermelhos utilizados foram obtidos desangue de rato, lavados com soluçSo fisiológica e separados por centrifugação repetindo-se essa operaçãopor três ve/es.

Os tubos contendo Fosfolipase A, gema de ovo e glóbulos vermelhos foram agitados eincubados a 37°C por 40 minutos, ogo a seguir as amostras foram centrifugadas a 1500 rpm por 10minutos, e os sobrenadantes foram lidos a 578 nm.

Todos os outros testes de atividade enzimática de Fosfolipase A foram realizados usando-sesolução contendo 1 mg de Fosfolipase A/ml solução fisiológica, calculando-se porcentagem de hemôliseatravés da curva padrão.

11.5 — Determinação da Presença de Fatores Coagulantes

O veneno de Crotalus d. terrificus é muito rico em enzimas que tem a capacidade de coagular

outras proteínas. A estas enzimas ou complexos enzimáticos proteolfticos denomina-se "coagulase" ou

"fatores de coagulaçSo".

Para certificar-se de que a Crotamina, Crotapotin e Fosfolipase A não apresentavam

contaminação pela "coagulase", aplicou-se nas proteínas puras o teste descrito por Gonçalves'32' em

1 956, que usa a coagulação do fibrinogénio: a 0 , 100, 200, 500nq de Fosfolipase A, Crotamina e

Crotapotin, adicionou-se 1 ml de solução de fibrinogénio humano a 1 mg/ml de solução fisiológica.

Usou-se como padrão positivo 100/ig de veneno bruto de cascavel.

As amostras foram incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos e observadas quanto ao

aparecimento do coágulo.

11.6 — Dosagem das Proteína»

A determinação do conteúdo protéico foi feito pelo • tétodo descrito por Lowry et a l i i ( 6 2 ) em

1 951, usando-se soro albumina bovina para curva padrão.

O coeficiente de extinção molar foi determinado pela absorbência a 280 nm de soluções de1 mg/ml, em cubas de quartzo com um cm de percurso óptico, no espectrofotômetro Carl Zeiss PMQ l i .

11.7 - Curvas de Absorbêneias das Proteína*

As curvas de absorbancfas da Fosfolipase A, Crotamina a Crotapotin foram realizadas noespectrofotômetro Carl Zeiss, modelo PMQ II utilizando-se cubas da quartzo com 1 cm da percursoóptico. Para Fosfolipase A e Crotapotin, absorbánda foi medida em tampão Trls 0,06 M, pH 8,06, na'concentração de t,36 mg/rm a 0,8 mg/ml respectivamente. Para a Crotamina, usou-se tampão tostato0,01 M, pH 7,3, na concentração de 1 mg/ml.

I I J - Detefmlnaçfo cte Grupos SH Livras

Para a constatação da existência da grupos SH livres nas proteínas, utlllzou-ss o mtftodo descritopor E l l m a n ' 1 * 1 ~ãm~ 1 9 6 9 , que usa a cistefna como padr fo • o reegente ácido6,6'dlt.obis-2-n!trobenz6ico-SJgma.

Inti(M)UZIU-SH na técnica as modificações piopostas nor Simizu em 1972, que seguem: a0,5 ml d d solução de pmteínas i:un tendo 0,1 mij, juntou-se 0,88 ml de tampão Tris 0,1 M, pH 8,0,0,03 ml d«í solução de EDTA 0,1 M no mesmo tampão e 3,0 ml de água destilada para completar ovolume, t m seguida, adicionou-se à mistura 0,02 ml do reativo de Ellrnan (20 mg de ácido5,S'ditiol>i$'2-mtrohKn7Óico em 5 ml de tampão Tris 0,1 M, pH 8,0).

Após 10 minutos fez-se a leitura de absorbância em 412 nm contra branco contendo somenteTris, EDTA, água e OTNB.

Para esclaiecer a existência cm yrupos SH livres, porém "escondidos" e não acessíveis aoreagente, adicionou-se ao meio 0,06 ml de uréia 0,01 M, na tentativa de expor à reação os SH livresporventura existentes.

11.9 - Marcação de Crotapotin com ''s I

O método para marcação de proteína com I 3 I I , foi publicado por Greenwood et alii , em1963.

A seqüência das reações foi a seguinte: a 5 M9 àe Crotapotin dissolvidos em 0,5 ml de tampãofosfato 0,25 M, de pH 7,4, juntou-se um mCi de N a 1 2 5 l contidos em aproximadamente 2/JI. A seguir,juntou-se 20 pI de urna solução (2,65 mg/ml de tampão fosfato) do oxidante cloraminaT.Imediatamente após, juntou-se 20pi de uma solução de metabissuifito de sódio (4,8 mg/ml de tampãofosfato), porá parar a reação.

A proteína marcada foi então purificada por filtraçâo em gel Sephadex G 50, empacotado numa

coluna de 35 cm:1 cm, previamente equilibrado com o mesmo tampão utilizado para marcação e que

serviu para eluir a coluna num fluxo de 1 ml/minuto.

Os tubos resultantes da eluicão, contendo aproximadamente 1 ml cada um, foram contados nocontador de radiação gama Tobor (Nuclear Chicago) para a identificação do pico de proteína radioativa.

11.9.1 - Controle Eletroforético do Pico de Crotapotin I 1 5 I

Pa.a controle da existência de iodeto livre ou de material radioativo degradado na amostracoletada, foi efetuada uma eletroforese da seguinte maneira; alíquotas das amostras foram colocadas emfitas (papel Whatman n° 1) de 2,5cm:33cm e submetidas a eletroforese por uma hora em tampiofosfato 0,25 M, pH 7,4, com 3 m A por fita. Utilizou-se Nal como carregador para localizar o 1 1 S I livraporventura existente.

Após a eletroforese, as fitas foram reveladas com solução de acetato da chumbo a 10%. Em

seguida, as fitas foram cortadas no sentido transversal, em pedaços de 1 cm e, contados no contador d *

radiação gama (Nuclear Chicago - série 1185).

Foram utilizados produtos marcados contendo no máximo 5% de iodo na forma de iodeto e

com ausência de frações protéicas degradadas.

11.10 - Determinação da DL g Q das Proteínas

A determinação da toxicidade da Crotapotin, Fosfolipase A • Crotamina foi feita pelo calculo

da dose letal 60% pelo método de Reed e Muench'7 4 ' , em 1 937.

A medkia da Dl S() foi tealtzada em camundongos suissos com peso aproximado de 25g cada

um, pela via intru|tt>Mtoneal, utilizando 6 grupos de 6 camundoiigos cada, mais um grupo controle.

De cada protefna foram feitas as seguintes diluições: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, e 1/32, sendo adiluição inicial da proteína 1/1 de 500/ ig/ml de solução fisiológica.

A : seis diluições acima foram injetadas num volume de 0,2 ml usando para cada diluiçSo umgrupo de 6 animais.

As mortes e sobrevidas foram anotaoas 24 horas após as injeções. O cálculo foi feito da seguintemaneira:

X = % de mortalidade na diluiçSo logo acima do valor que provocou 50% de morte ou

mais.

Y = % de mortalidade na diluiçSo logo abaixo do valor que provocou 50% de morte ou

mais.

Z = diluição inferior ao valor que provocou 50% de morte,

d.p. = distância proporcional,

log 2 = logarítmo decimal do fator de diluição, no nosso caso 2.

50 - Yd.p. =

X - Y

C = logZ + (dp. x log 2)

O antilog de C forneceu a diluição exata em que ocorreu 50% de morte, e, consequentemente aconcentração em mg/Kg de peso.

Quando da medida da D L 5 0 dos complexos Crotapotin-Fosfolipase A e Crotapotin-Crotamina,realizou-se sempre a mistura das proteínas mantendo a primeira ailuíçáo 500pg de proteína total, obtidapela soma das massas das duas proteínas misturadas, mas em proporções molares de 1:1. 0 cálculo daD L 5 0 do complexo foi feito da mesma maneira descrita, porém deu-se maior importância è quantidadede proteína tóxica injetada (Crotamina ou Fosfolipase A), comparando-se o resultado obtido, com oencontrado pela injeçSo da proteína tóxica sozinha.

11.11 - Medida da Velocidade de Troca Isotopica Hidrogênio-Trlcio

A medida da velocidade de troca do trício incorporado a proteína com o solvente, "exchange

out", foi realizada usando-se a técnica descrita por Englander(20), em 1 963. A técnica foi aplicada a

Crotamina, Fosfolipase A, Crotapotin a Crotoxina cristalizada 3 vazas a gentilmente fornecida pela

equipe do professor Oswaldo Vital Brasil da UNICAMP-SP.

A técnica publicada por Englandar consta dos seguintes pastos: Inicialmente a proteína 4

Incubada am determinadas condições de pH e temperatura na presença de áflua triciada numa

concentraçlo aproximada de 10* cpm/ml (contagens por minuto), a seguir o excesso de trício tf retirado

pela filtreçfo rápida em coluna de gel Sephadex G 25 grosso de 3 cnr.8 cm, empacotada a equilibrada

o

com o tampão escolhido. Os tuhos que contém a proteína triciada sSo recolhidos e os seus volumesjuntados; a partir il«ste instante inicia-se a contagem do tempo de "exchange out". Retira-se alíquotas detempos em tempos e f iltta se cm outra coluna nas mesmas condições anteriores. Após a eluiçSo, nostubos que contém o pico de proteína determina se a absorbância a 280 nm e a quantidade deradioatividade; o cálculo do número de hidrogênios por mol de proteína que permaneceram nãotrocados, ou seja, cujo It feio nãn passou para o solvente decorrido determinado tempo, é feito daseguinte maneir.i:

C/An° Ha/mol = — x 111 x t

onde:

Ha = hidrogênios aparentes

C - contagem da radioatividade em cpm/ml carregada pela proteína

CQ = radioatividade inicial de incubaçlo em cpm/ml

A = absorbância das amostras a 280 nm

111 = concentração de átomos de hidrogênio na água

e = coeficiente de absorção molar

Na realidade, o número de hidrogênio por mol é calculado utilizando-se um valor médio dasatividades específicas (C/A) dos tubos que compõem o pico da proteína. £ possível obter na região demaior concentração de proteína, pelo menos 4 valores de C/A que variam entre si num máximo de 5%e, somente a média destes valores é que foi utilizada para calcular o n? Ha/mol, no tempo escolhido.

11.11.1 - Medida do "Exchange-Out" em Crotamina

As colunas para separação do excesso de 3 H2 0 foram empacotadas com gel Sephadex G 25grosso, previamente equilibrado com tampão formiato 0,1 M, pH 3,0. Contendo 3 cm x 8 cm de gel. ascolunas foram mantidas à temperatura de 3°C por meio de um banho de circulação Savant e eluídascom o mesmo tampão mantido também a 3°C.

0 fluxo das colunas foi sempre fixado em 1 ml/10 segundos e a troca dos tubos foi feitamanualmente de 10 em 10 segundos.

Foram utilizadas duas experiências com Crotamina, variando apenas o tempo de incubaçSo daproteína com água triciada.

Na primeira, 12 mg de Crotamina foram dissolvidos em. 1 ml da tampão formiato 0,1 M,pH 3,0, e em seguida adicionou-se gotas de 3H2O na concentração aproximada de 4 mCi/ml dando unwmedida da radioatividade inicial de aproximadamente 10* cpm/ml. Uma alíquota desta amostra foiretirada para determinação da radioatividade inicial. Em seguida a amostra foi incubada por 2 horas tmbanho termostatizado a 70°C. Apôs a incubacão e resfriamento, a amostra foi colocada em banho dtgelo.

Na segunda experiíncia, o procedimento foi o mesmo mudando» apenas o tampo dt Incubaçlopara 18 hora? a 70°C.

to

Os passos seguintes foram: filtração na primeira coluna de G 25, reunião dos volumes dos tubosque contém o pico de proteína, iniciando-se o tempo de contagem de saída do trício da proteína para osolvente; d«? tempos em tempos retirou se 1 ml deste "pool" para filtração numa segunda coluna e,final.netite, calculou-se a atividade específica C/A de cada tubo, a seguir usada para obtenção do n9 de

H/mol ile proteína.

O coeficiente de extinção inoiar usado tot de 11650 M~' x cm'*, calculado pela absorção a

280nrn de uma solução de 1 mg de Crotamina por ml de tampão formiato 0,1 M, pH 3,0, i.sondo-se um

peso molecular 48B01581 .

11.11.2 - Medida do "Exchange-Out" em Fosfolipase A

Cerca de 16 mg de Fosfolipase A foram dissolvidos em 1 ml de tampão formiato 0,1 M, pH 3,0.

Adicionou se gotas de água tricíada suficientes para dar uma radioatividade inicial próxima de 10s

cpm/ml e, incubou-se a 70°C por 2 horas.

Os passos seguintes foram os mesmos descritos nc item 11.11.1, utilizando-se as mesmas

condições para a fiitração.

O valor do coeficiente extinção molar usado no cálculo do n? H/mol, foi calculado pela

abscrçlo a 280 nm de uma solução 1 mg de Fosfolipase A/ml de tampão formiato 0,1 M, pH 3,0. Este

valor foi 22512 VT ' x c m ' ' , baseado num peso molecular 13400 calculado por análise de aminoácidos.

11.11.3 - Medida do "Exchange-Out" em Crotapotin

Cerca de 20 mg de Crotapotin foram dissolvidos em 1 ml de tampão formiato, 0,1 M pH 3,0.Adicionou-se a seguir gotas de 3 H 2 O para obter uma contagem de radioatividade final próxima de 10s

cpm/ml. A amostra foi então colocada para incubar em banho de água mantido a 60°C por 2 horas.

As colunas para filtração, bem como, os demais detalhes de procedimento, foram estabelecidosnos itens anteriores.

0 valor usado do coeficiente de extinção molar da Crotapotin foi 9074 M ' 1 x c m ' 1 , calculado .da mesma maneira descrita nos itens anteriores, usandose um peso molecular de 8300 calculado combase na análise de aminoácidos.

11.11.4 - Medida do "Exchange-Out" em Crotoxina

Cerca de 20 mg de Crotoxina foram dissolvidos em 1 ml de tampão formiato 0,1 M, pH 3,0,dando uma solução levemente turva, pois o valor do pH fica próximo do pi da Crotoxina: 4,7.Adicionou-se então gotas de ácido fórmico diluído para acertar o pH, tornando a solução límpida. Emseguida, colocou-se gotas de 3 H 2 O para dar ao meio uma radioatividade de aproximadamente 10*cpm/ml. A incubação foi feita em banho a 70°C por 2 horas.

Os passos seguintes de filtraçSo em gel, leitura de absorbflncía • medida de rad atividade, foramefetuados da maneira descrita nos itens anteriores.

0 valor do coeficiente de extinção molar da Crotoxina foi de 30597 M"1 x cm* ' calculado domesmo modo descrito, utilizando um valor para peso molecular de 21700, obtido pelas anáfiMS daaminoácidos de Fosfolipase A e Crotapotin, considerando a Crotoxina corto resultant» da inttraçlo da»duas proteínas, na proporção molar de 1:1.

11

11.11.5 — Medida da Radioatividade

Pata twins os rasos em que se necessitou medir a tadioatividade do trício presente na proteína,utilizou se o líquido de untilrição de Biay em 1 960.

Este líquido de cintilação é comporto drs secitiirii.fs renitentes:

Naftaleno

PPO

POPOP

Metanol

Etifenoglicol

Dioxano q.s.p.

60 g

4 9

0,2 g

100 ml

20 ml

10C0 ml

Nesta formulação temos: como soluto primário fluorescente o PPO (2,5 difenil-oxazol), comosoluto secundário fluorescente o POPOP {p-bis [ 2-(5-feniloxazolil) J benzeno} e o dioxano, etilenoglícol, metanol e naftaleno como solventes.

Para medida da radioatividade foi utilizado um contador de cintilação Nuclear Chicago, modeloISOCAP 300.

A radioatividade dos itens 11.1 a 11.4 foi medida da seguinte maneira: 5 /J I da amostraincubada foram adicionados a 5 ml do líquido de cintilaçJo, agitados e contados por 10 minutos.

Após a segunda filtracão na coluna de gel Sephadex G 25, dos tubos que continham a proteínaradioativa foram retirados 100pi adicionados a 5 ml de líquido de cintilaçSo, após a agitação, colocadopara contar por 10 minutos.

11.11.6 - Cálculo da Eficiência de Contagem

Para o .cálculo da eficiência de contagem, foram utilizados vários padrSes fornecidos pelaNuclear Chicago que continham valores de "quenching" diferentes. Com os valores obtidos nas contagens

destes padrões, estabeleceu-se a curva de eficiência do aparelho, usando o método de relação de canais.

Assim, com os yaiores de contagens no canal A/ contagens no canal B em abcissa e a % de eficiência em

ordenada, traçou-se uma curva de eficiência.

Quando da contagem das amostras, os valores da relação de canais A/B foram colocados na

curva padrSo e daí estabelecidas as eficiências de contagens, extrapolando-as para 100% da eficiência.

Tomou-se o cuidado, de tempos em tempos, da refazer a curva de eficiência padrlo paraverificar, as possíveis mudanças ocorridas nas condições de medida do cintilador líquido.

11,11.7 - Calculo do Número da Hidrogênio Teoricamente Trocaveis

Os hídrogtnios que teoricamente slo trocaveis com o solvente a uma velocidade mensurável sloaqueles ligados a ' xigênio, enxofre e nitrogênio. Os hidrogênios ligados a carbono têm uma velocidadetroca isotópica muito lenta e, nfo foram considerados no nosso trabalho.

12

O cálculo do número de hidrocjenios que teoricamente são troráveis pelo ti (cio foi feito com

base na análise de aminoáciiios, levando se em consideração os hidrogênios de cadeia lateral e os

peptftlicos.

Em todas as experiências de traça isotópica hidrogênio-trírio foram usadas condições próprias

de incubação, supondo-se que todos os hidrogênios teoricamente trocáveis foram substituídos pelo trírio.

11.11.8 - Ajuste dos Dados Obtidos pela Troca I so tópica H/T

Os dados obtidos pela medida da velocidade de troca de trfcio pelo hidrogênio, colocados emgráfico contra os respectivos tempos, delineavam uma curva que aparentemente representa uma funçãoexponential. Segundo Hvidt e Nielsen , a curva que representa a velocidade de troca isotópica H/T, éa resultante de urna soma de exponenciais do tipo de decaimento radioativo. Considerando este fato, foifeito para os pontos obtidos neste trabalho um ajuste para obtenção da melhor curva que passa pelospontos experimentais. Este ajuste de soma de exponenciais foi realizado com' auxílio do computadorIBM/370, modeio 155.

O programa utilizado foi desenvolvido pelo National Institute of Health, Laboratory ofTheoretical Biology, por Mones Berman e Marjory F. Weiss em 1 974. Este programa é denominadoSAAM (Simulation Analyses and Modeling) e foi utilizado na versão n? 25.

Todas as análises e ajustes foram realizadas no Centro de Processamentos de Dados do Institutode Energia Atômica.

11.12 — Interação das Proteínas

O estudo da interação entre as proteínas, Fosfolipase A + Crotapotin e Crotamina + Crotapotin,foi realizado com o intuito de definir as proporções mulares de interação. Para tanto foi utilizada acromatografia em coluna de gel Sephadex G 75 fino com a intenção de isolar os complexos formados. Acoluna usada para este estudo foi sempre a mesma, com as seguintes características: coluna refrigerada daPharmacia Uppsala de 100cm x 0,9 cm, e.iipacotada com Sephadex G 75 fino até altura de 80 cm,eluída com tampão formiato 0,1 M, pH 3,5 que previamente equilibrou o gel. O fluxo foi sempremantido em 0,2 ml/minuto. Os efluentes passavam por um monitor de UV LKB, modelo Uvicord.li 8300, sendo a absorbancia evidenciada com auxílio de registrador gráfico e recolhidos em coletor defrações LKB, modelo Ultrorac 7000.

Nos efluentes recolhidos foi doseada, pelo método de Lowry, a concentraçío das proteínas,utilizada depois no cálculo da proporção molar de interação.

11.12.1 - Medida das Areas dot Picos

Um outro método usado para o cálculo das proporções de interação foi o da medida das áreasdos picos obtidos pela tbsorçSo a 280 nm dos efluentes da coluna.

Mantendo-se sempre as mesmas condições de cromatografia, foi realizada, em primeiro lugar, amedida da área obtida por uma solução de concentraçío conhecida da Crotamina, Fosfolipase A aCrotapotin.

Nas experiências de interaefo utilizou-se excesso de uma proteína em relaçlo à outra obtendo-seportanto um pico que correspondia ao da proteína que nfo participou do complexo. Pela comparaçãocom os valores de áreas da quantidades da proteína conhecidas e, sabendo-se o total colocado na coluna,

13

pode sfi ':ali'liar (|ti.into «I» pmlfina p.'t tii inou do coinplttxo e i:uiiSH(|ueiitemente quanto constituiu

excesso.

As mudid.is daí ár«as foram efetuadas mm um planfmetro da KEU FEEL & ESSER Co. N. Y.,modelo 423R M.

11.12.2 — Interação entre Fosfolipase A e Crotapotin

O estudo da iníeração que ocorre entre a Fosfolipase A e Crotapotin foi realizado comodescrito nos itens 11.12 e 11.12.1. Foram realizadas uma série de experiências nas quais se procurou variara concentração de proteínas na coluna, modificando o excesso de uma ou de outra. Uma dasexperiências foi: 2,6 mg de Fosfolipase A foram dissolvidos em 0,5 ml de tampão formiato 0,05 M,pH 3,5; 0,8 mg de Crotapotin foram dissolvidos em 0,5 ml de tampão formiato 0,05 M, pH 3,5; a colunaa 4°C de ccl Sephadex G 75 fino, equilibrada e empacotada com o mesmo tampão, foi de 80 cm:0,9 cm; as soluções de Crotapotin e Fosfolipase A foram juntadas e colocadas na coluna; a eluição foifeita com o tampão citado mantendo-se um fluxo de 0,2 ml por minuto.

Os efluentes foram coletados, doseados, e a área do pico de Fosfolipase A em excesso foimedida. Os doseamentos e os valores de área foram utilizados p::ra a determinação da proporção molarde interação.

11.12.3 — Cromatografia de Crotoxina

Com o intuito de comparar o volume efluente obtido para o complexo Crotapotin-FosfolipaseA com o da Crotoxina, fez se a seguinte experiência: 2 mg de Crotoxina cristalizada três vezes, dandouma só banda na eletroforese em gel de poliacrílamid?. foram dissolvidos em 1 ml de tampão formiato0,05 M, pH 3,5 e colocados na mesma coluna descrita no item anterior. A eluição foi feita com o mesmotampão e o fluxo mantido a 0,2 ml por minuto.

11.12.4- Interact) entre Fosfolipase A e Crotapotin Utilizando Crotapotin - ' J 5 I como Tracador

Para confirmar a participação efetiva da Crotapotin na interação com Fosfolipase A. utilizou-se

Crotapotin - ' 2 51 misturada à proteína fria, como tracador.

A experiência foi a seguinte: 1,5 mg de Fosfolipase A foram dissolvidos em 0,5 ml de tamplo

formiato 0,05 M, pH3 ,5 ; 1,0 mg de Crotapotin dissolvidos em 0,5 ml do mesmo tampão e 60/ i l de

Crotapotin - I 2 5 I , foram juntados e a amostra resultante colocada na coluna de gel Sephadex nas

mesmas condições anteriores.

As absorbâncias dos efluentes foram lidas a 280 nm e as radioatividade» foram determinadas no

contador gama.

11.12.6 - Interaçfo entre Crotamina e Crotapotin

Para o estudo da interaçflo entre estas duas proteínas utilizou-se a mesma tecnologia empregada

nos itens 11.12.1., 11.12.2. e 11.12.3.

14

A cmmatoqiafia foi feita em roluna cte pel Seph.idex G 75 de 80 cm: 0,9 cm, equilibrada e

(•inp.HoiHfirt coin tmnpfo fnrmiato 0.0S M, pH 3,5, que tamtam serviu para eluir a coluna com um f'uxo

<le 0,? ml/mimito.

For am realizadas várias experiências na tentativa de isolar o complexo formado e elucidar a

proporçã.) molar (ie interação.

11.12 .6 - Interação entre Crotamina e Crotapotin Usando Crotapotin - l í s l como Traçador

Para demonstrar que realmente a Crotamina interape com Crotapotin, utilizou se Crotapotin —

' J * I como traçíirior.

As rondiçoes de cromatogiafia foram as mesmas descritas no item anterior. Uma das

experiências realizadas foi a seguinte: 3,0 mg de Crotamina foram dissolvidos em 0,5 ml de tamplo

fnrmiato 0,05 M pH 3,5; a 0,8 mg de Crotapotin dissolvidos em 0,5 ml do mesmo tampão, adicionou-se

20JJI d° Crotapotin - I 2 S I ; as soluções foram juntadas e colocadas na coluna. A concentração e

radioatividade -los cftientes foram determinadas.

I l l - RESULTADOS

•11.1 - Purificação da Crotamina, Fosfdipase A e Crotapotin

As proteínas utilizadas neste trabalho foram isoladas e purificadas a partir do veneno bruto •

seco de cascavel brasileira (Crotalus d. terrificui).

A individualização rias proteínas no veneno foi feita pela filtração em Sephadex G 75 como

mostra a Figura 1. Esta representa um perfil cromatográfico de amostra de veneno contendo crotamina

e, onde os picos III e IV correspondem à Crotoxina e Crotamina respectivamente.

Procurou se sempre reunir somente amostras dos tubos da região de maior concentração de cada

pico, para se evitar contaminações cruzadas. As proteínas assim recolhidas foram liofilizadas e

separadamente submetidas aos próximos passos de purificação.

A Figura 2 mostra os padrões de absorção a 280 nm obtidos pelo fracionamento da Crotoxina

em coluna de gel SP Sephadex C 25. Nesta figura podem ser visualizados, pelo menos seis picos onde os

I e VI correspondem respectivamente a Crotapotin e Fosfolipase A. Os picos I I , lit e IV são picos

intermediários de proteínas não identificadas. Os picos que correspondem à Crotapotin e Fosfolipase A

s3o recolhidos, dialisados contra água deionizada e liofilizados.

A Figura 3 mostra a recromatografia final da Fosfolipase A, apôs várias passagens em SP

Sephadex C 25, evidenciando apenas um pico que foi considerado cromatograficamente homogêneo.

A Crotapotin como não se liga ao SP Sephadex, foi recromatcçirafada várias vezes em DEAE

Sephadex A 25, até que se obteve um pico único e homogêneo, o que é nostrado na Figura 4.

A Crotamina isolada na filtração do veneno em Sephsdex G 76 foi também recromatografada

em coluna de gel SP Sephadex C 25 a seu perfil cromatográfico «stá mostrado na Figura 5. Pela

observação característica, após injeção, do afeito da Crotamina em cemundongos, ou seja, paralizaçfo das

patas posteriores, foi possível identificar no gráfico da Figura 5 os picos I I I , IV e V com atividade dt

Crotamina. O material do pico V, obtido com » cromatografia de vária» «mostras dt Crotamina em SP

Sephadex, foi recolhido, dialisado e liofilizado. A proteína foi seguidas vezes repassada no mesmo gel até

ohtençffo de pico único • homogêneo, como está mostrado com traço cheio na Figura 5.

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Figurai — Filtraçio do Veneno Global em Coluna de Gel Sephadex G 75. Perfil Cromatográfico da Filtração de 300 mg de Veneno Total/10 ml de ÁcidoAoitioo 0.1 M. Fluxo de 0,5 ml/min oom Recolhimento de 10 ml/tubo. Coluna de Gel Sephadex G 75 Fino, de 3 cm: 80 cm. Equilibrada e Eluidacom Ácido Acético 0,1 M

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2 — Cromatoyafia de Crotoxina em SP Sephadex C 25. Perfil Cromatográfioo Obtido pelo Fracionamento de 100 mg Crotoxina/5 ml de TampãoFormiato 0,05 M. pH 3.5 em SP Sephadex C 25, Equilibrado com Tampão Formiato 0,05 NI, pH 3,5 e Elui'do com Gradiente Linear Salino de0a3MdeNeCI . Coluna de0,9 cm: 40 cm, Fluxo de 0,2 ml/min com Recolhimento de 4 ml/tubo.

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I10 20 40

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— Recromatografia de Fosfolipase A em SP Sephadex C 25. Recromatografia de 100 mg de Fosfolipase A/2 ml de Tampão Formiato 0,05 M oH 3,5em Coluna de SP Sephadex C 25 Equilibrado com Tampão Formiato 0,05 M, pH 3,5 e Elui'do com Gradiente Linear Salino de 0 a 3 M de NaCl.Flum de0.2 ml/mm com Recolhimento de 4 ml/tubo. Coluna de 0,9 cm: 40 cm

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Figura* - Recromatografia de Crotapotin em DEAE Sephadex A 25. Coluna de DEAE Sephadex A 25, Equilibrada com Tampão Formiato 0,05 M, pH 3,5e Elufdo oom um Gradiente Linear Salino de 0 a 3 M de NaCI. Fluxo de 0,2 ml/min oom Recolhimento de 4 ml/tubo. Amostra Contendo 100 mgda Crotapotin/2 ml d* Tampèo Formiato 0,05 M, pH 3,5. Coluna de 0,9 cm: 30 cm

2 . 0

1 .0

. • *

S — Cromatografia d« Crotamina em SP Sephadex C 25. Com Linha Tracejada Ternos a Cromatograf ia de 200 mg de Crotamina/3 ml de Tampão For-miato 0.05 M. pH 3.5 • Elufda com um Gradiente Linear Salino de 0 a 3 de NaO. Com Traço Cheio Temos a Recromatografia Final de 100 mgdo Pico V/ml do Metmo Tampék» Após Varias Passagens. Os Picos I I I , IV e V têm Atividade de Crotimina tn

20

111.2 Eletroforese em Gel de Poliacrila'mida

Diante da possibilidade das proteínas cromatograficamente homogêneas nSo estarem realmentepuras, foram realizadas eletioforeses em gel de poliacrilamida para verificar a pureza ao níveleletrntorétiro. A Figura 6 mostra o aparecimento de uma única banda para Fosfolipay> A, Crotamina eCrotapotin indicando proteínas eletroforeticamente puras.

111.3 — Presença de Fatores Coagulants*

Nas proteínas consideradas puras realizou-se o teste de coagulação do fibrinogínio descrito porGonçalves132', em 1 956.

O teste revelou ausência completa de fatores coagulantes contaminando as proteínas. Comoreferência usou-se veneno bruto que apresenta alto poder de coaau lição sotre o fibrinogêniq.

f 11.4 - Oosagens das Proteínas

O doseamento das proteínas consideradas puras realizou-se pelo método convencional Lowry et

ali' usando soro albumina bovina, Sigma, pira se construir a curva padrSo.

Todos os pontos da curva padrSo bem como das amostras a serem doseadas, foram feitos em

triplicata. Os resultados mostraram que após a liofilizacio as proteínas ainda continham cerca de 10 a

15% de água.

111.5 - Análise de Aminoécidos

A Tabela I mostra os dados obtidos pela análise de aminoácidos num analisador Beckman

120 C. Os resultados evidenciam que s8o desprezíveis as diferenças encontradas com a variaçSo do tempo

de hidrôlise de 10 h, 20 h e 24 horas.

A soma dos valores médios para cada aminoácido, serviu para o cálculo do peso molecular das

proteínas.

Para cada partida nova das proteínas purificadas, realizou-se uma série de análises de

aminoácidos obtendo concordância com os dados mostrados na Tabela I.

Os pesos moleculares calculados com tose na análise de aminoácidos foram os seguinte*: 8300

para Crotapotin, 13400 para FosfoHpese A e 4880 par» a Crotamina.

111.6 - Absorçfo das Proteínas no UV

As curvas da absorção no UV da Fosfolipa» A, Crotapotin e Crotamina estlo mostradas na

Figura 7.

A Crotemina e • Fosfolipase A apresentam um máximo ds absorçfo em 280 nm, enquanto que

• Crotapotin tem um máximo em 278 nm. Estes máximos foram utilizados para o cálculo dos

coeficientes de absorçlo molar das três proteínas, ou seja, 9 O 4 7 M ' 1 x c m ' 1 para Crotapotin,

2 2 6 1 2 M ' 1 x c m * 1 para Fosfolipase A e 11660M"' x c m ' 1 para Crotamina.

111.7 - MedkJe da Atividade Enrimétiee da Fotfolipft» A

21

B•f

c+

'•V«#•'

Figura 6 - Eletroforesa em Gel de PoliacrilaminaA -Eletroforese de 50 JJI de Crotapotin (2 mg/ml) am Tampfo TRIS-glicina pH 9,5.

Corrida de 1,0 hora oom 3 m A/tubo, Utilizando o Meimo Tampfo nai Cubai a Gel daPoliacrilamida a 7%.

8 -Eletroforese de SOjil de Foifolipasa A (2 mg/ml) em Tampfo Bata-alamina pH 3,4.Corrida do 1,0 hora oom 3 m A/tubo, Utilizando o Mesmo Tampfo nas Cuba* a Gal d#Polu»crilamidae16%.

C -Eletroforese de 60/il de Crotamina (2 mg/ml) am Tampfo Beta-alamina pH 4,3. Corridada 1,0 hora oom 3 m A/tubo, Utilizando o Mesmo Tampfc nas Cubas a Gel daPoliacrilamida a 16%.Após as Corridas as Amostras Foram Fixadas oom TCA a 12% por 30 minuto*, Coradasoom Comaisie Brilliant Blue R 260 a Descoradas oom uma Mistura de Metanol: ÁcidoAoétioo: H,0

r?

Ta'iela I

Análise de Aminoácidos de Fosfolipase A, Crotapotine Crotamina*

pint\

a.a. \

Lys

His

Arg

Asp

Thr

Ser

G»u

Pro

Gly

Ala

Cys

Vai

Met

lie

Leu

Tyr

Phe

T r p "

10 h

9.3

1.8

9.3

9.0

6,5

5.5

9,0

4,3

11,0

5.8

11,8

2,0

2,3

4.0

5,8

9,5

6,5

—

Fosfolipase A

20 h

9,0

-

8,8

9,0

6,3

6,0

9,3

4,8

10,8

5,8

13,0

1,8

2,0

4,0

6,0

10,0

5,8

-

24 h

9,5

1.7

9.5

9,0

6,4

6,2

9.2

4.6

10,8

5,7

12.2

1.9

1.9

3.6

6.5

9.4

6.4

-

M

9.3

1.7

9.2

9,0

6.4

5,9

9,2

4,6

10,9

5,8

12,3

I.f

2.1

3.9

5,8

9,6

5.9

2.0

lOh

1,8

0,8

1.7

10.0

3.5

4.3

12,6

4,0

8,8

5.3

11.6

0,6

0,7

2.1

0,8

1,7

2.5

—

Crctapotin

20 h

1,7

0,7

1,4

10,0

3,6

4.3

12,4

4.3

8,3

5,0

12.0

0,5

0,7

1.7

1,0

2.4

2.1

-

24 h

1,7

1.0

1,7

10,0

3,6

4,3

12,6

4,3

8,8

5,0

11,9

0.5

0,7

1.7

1.0

2,4

2.1

-

M

1,7

0,8

1,6

10,0

3,6

4,3

12,5

4,2

8,6

5,1

11,8

0,5

0,7

1.8

0,9

2,2

2,2

1,0

10 h

8,8

2,0

1,7

1,9

-

2,5

1,8

3,1

4,9

-

5,4

-

0,8

1.2

0,7

0,8

1,7

-

Crotamina

20 h

9,0

2.0

2,0

2,1

-

2.7

2.0

3.1

5.0

—

5,6

—

1.0

0.9

0.9

0.9

2.0

—

24 h

9,1

2.2

1,9

1,9

-

2.6

1,8

3,2

6.0

-

5.5

-

0,8

1,1

0,9

0,7

1.9

-

M

8.9

2,0

1,8

1,9

-

2,6

1.8

3.1

4.9

-

5.5

-

0,8

1.0

0.8

0.8

1.8

2.0

* A tabela mostra os v&lores obtidos nas análises de aminoácidos pela hidrólise das protefnw a 120°C,

durante 10 h, 20 h e 24 horas num analisador de aminoácidos Beckman, modelo 120 C. Mostra

também os valores médios (M) para cada aminoáoido após as análises

' * Dados obtidos espectrofotometricamente.

23

2,5

2.0

o

03CgOiS)CO•X

1,5

..

0,5

-I L.

230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

COMPRIMENTO DC ONDA (nm)

Figura 7 - Curvai da Abtorbinciai da Crotamina (O, Fotfolipata A (B) a CroUpottn (A). EipactrosdaAbiorçêo da Crotapotin (0,6 mg/ml da Tampio Trli 0,06 M, pH 8,06), Fo«folipa« A(0,5 mg/ml da Tampio Trii 0,06 M, pH 8,06) a Crotamina (1 mg/ml da Tamplò Fosfato0,01 M, pH 7.3)

24

A Figura 8 mostia a curva-padrão de atividade enzimálica da Fosfolipase A pura, tendo comosubstrato uma suspensão de gema (le ovo fresca. Em todas as experiências, tanto de purificação quantode interação, em que se suspeitou da presença de Fosfolipase A, mediu-se a atividade enzimática pelamesma técnica, usando a curva padrão para comparação.

111.8 - DeterminaçSo de Grupos SH Livres

Foram realizados para Fosfolipase A, Crotamir.a e Crotapotin puras, os testes de presença de SH

livres, utilizando o método colorimétrico de Eüman modificado por Simizu , que usa ácido

5,5'-ditiohis 2-nitrobenzóico, Sigma, como reagente e a cistefna como padrão.

Os resultados mostraram que mesmo em presença de uréia não aparecem SH livres, devendo

estar todos comprometidos nas pontes S-S das cadeias polipeptídicas.

111.9 - Interação entre a Fosfolipase A a Crotapotin

O estudo da interação entre as proteínas foi realizado pela filtração em gel Sephadex G 75,

mantendo-se sempre as mesmas condições de fluxo, temperatura, altura do gel, volume de amostras,

volume recolhido por tubo. etc. variando apenas as concentrações das proteínas colocadas na coluna.

Foram realizadas uma série muito grande de experiências, onde se procurou através o doseamento das

proteínas e a medida das áreas dos picos, evidenciar a proporção molar de interação.

Na Figura 9 tem-se os padrões de filtração na coluna de Sephadex G 75. O gráfico A representaa fíltraçjo de uma amostra de Crotoxina cristalizada e eletroforeticamente pura. O gráfico B representa acromatografia de uma amostra contendo excesso de Fosfolipase A e, no gráfico C uma amostra contendoexcesso de Crotapotin.

Na Tabela II tem-se dados obtidos para um grupo de experiências de interações entreFosfolipase A e Crotapotin, usando a técnica de filtração em gel Sephadex G 75. Os dados deconcentração da amostra, concentração do complexo formado e do excesso de proteína, foramcalculados pelo método Lowry e confirmados pela medida da área dos respectivos picos.

111.10 - Interação entre Crotapotin e Crotamina

A Figura 10 mostra uma das experiências de interação Crotapotin-Crotamina realizada com •

técnica de filtração em gel Sephadex G 75.

A Tabela I I I mostra os dados obtidos para concentração de amostra, concentração de proteína*

dos picos, medidas pelo doseamento de Lowry e confirmadas pela medida das áreas dos picos.

A Tabela I I I mostra também os valore* da proporção molar de interação entre

Crotapotin-Crotamina nas experiências realizadas, evidenciando uma inconstância para os valore* obtido*

ds proporção molar de interação.

111.11 - Interação entre Fotfolipaw A a Crotamina com Crotapotin Contendo Crotapotin i a * l como

Treçadof

Para demonstrar a participação de Crotapotin no* complexo* Crotapotín-Fosfolipast A •

Crotapotin-Crotamina, realizamos experilncia* de interação em gel Sephadex G 76, utilizando na.

composição das amostra* colocada* na coluna, Crotapotin marcada com " * l . Neste» < «so» a proteína

marcada foi misturada ante* da interaçflo com a proteína fria.

25

0,9

0,7

0,5

0,3

0,1

010 20 30 40 50 60

uq de F0SF0LIPASE A

Figura 8 - Curva da Atividade Hemolftlca da Foifollpc*» * . Incubado Inicial da Foifollpe» A amSoluçio Fisiológica com Gama da Ovo Fraica por 2 horai a 37*C. A eita MitturaJ unta«auma Suipanilo a 0,8% da Glóbulot Vermelho» da Rato am Sotuçio fisiológica a Incube-tepor 40 minuto» a 38°C.Apói Centrifugaçlb, ai Amoitrti tio Lida» Quanto 4 Abaorblncla em 678 nm

26

I.i

n.S

0.!

0,5

A

AJ U.38 4S

TUBO NQ

Figura 9 - Interação entre Crotapotin e Fosfolipaie A . Perfi l Cromatográfico» Obtidos pala Fittraçfo e mGel Sephadex G 75 Fino, Coluna de 0,9 cm: 8 0 cm, Equilibrado e Elufdo com TamplòFormiato 0,05 M, pH 3,5.A -Cromatograf ia de 2 mg de Crotoxina/ml de Tampffo Formiato 0,05 M pH 3,6.B -Cromatografia de 3,25 mg de Foifolipaie AA>,5 ml de Tamplò Formiato 0,06 M, pH 3,5

+ 1,6 mg de Crotapotin/0,5 ml do Meimo Tamplò.C -Cromatografia de 1,6 mg de Crotapotin/0,5 ml de Tamplò Formiato > 1,3 mg de Fotfoli-

pe» A A), 5 ml do Mesmo Tampão.Para ai Experiência» A, B e C Foram Mantido* Fluxo de 0,2 ml/min, e 4 ml/tubo de VolumeF fluente.

27

Tabela II

Interação Crotapotin-Fosfolipase A na Filtraçío em Sephadex G 75*

Exper.

rr?

1

2

3

4

5

6

7

8

Prot. total

(mg)

2,9

3,4

4,8

2,5

2,5

2,5

2.5

2,5

Proporções

na amostra

A:B

(pmoles)

2

1

1

1,1

1.1

1.1

1.1

1.1

1

2

1.2

1

1

I

1

I

Complexo

(mg)

2,1

2.1

3,46

2.34

2,24

2,05

2,32

2,13

Proporções

de interação

B:A

(/imoles)

1

1

1

»

1

1

1

1

1

t

1.03

1.04

0,81

1,05

0.89

1.6

A tabela mostra os valores de proteína total na amostra, proporções molares de Crotapotin (A) para

Fosfolipase A (B) colocadas na coluna de gel Sephadex G 75 mg do complexo formado e proporções

de interação após a filtraçSo.

1.0

o00CM

c

0,5

0

>

t

i

i*.y

AC

/ V/ \

\' \\\\

A

i

ii

i

ii1

;

0 '

/

/

/

/

/Ê

1i

1

f

c

\í

\

\

\\

\

\

V

\

\

\vV

1

V

• \

• \

30

10

35 40 45 50 55TUBO

Intaraçfo antra Crotapotin a Crotamina. Perfil Cromatográfico Obtido pela Filtracão em Coluna de 0.9 cm: 80 cm de Gel SeDhadex G 75 Fino,de Amostra Contendo 3 mg de Crotamina/0,5 ml de Tampão Formiato 0,05 M pH 3,5 + 0,8 mg de Crotapotin/0,5 ml do Mesmo Tampão. Equi-librado « Elufdo com Tampão Formiato 0.05 M. pH 3.5. AC é o Complexo Formado. Fluxo de 0,2 ml/min., com Recolhimento de 4 ml/tubo.

29

Tabela I I I

Interação Crotapotin-Crotamina na Filtraçffo em Gel Sepnadex G 75*

Exper.

no

1

2

3

4

6

Prot. total

(mg)

6,68

3,80

3.06

2,81

3,62

Proporções

na amostra

C:A

(pmoles)

4:1

6:1

0,6:1

4:1

6:1

Complexo

(mg)

1.6

1.12

0,50

0.48

0,98

Proporções

de. interação

C:A

(^moles)

1:1

V«V1.11:1,1

1:2,1

A tabela mostra ot valores de proteína total na amostra, proporções molares de Crotamina (C) para

Crotapotin (A) colocadas na coluna de gel ãephadex G 76 mg do complexo formado t proporções

de interaçio após a filtraçfo.

30

A Fiijura 11 mostra os jwif/s i.-romalotpáfiim « radioativo obtidos nas interações realizadas. Ográfico A representa o resultado da interação Ciotapotin Fosfolipase A e no B a interaçãoOotat'otin Ctotaniina.

ujiira evidencia claramente H participação da Ciutapotin nos dois complexos.

111.12 - Determinação da DL 5 Q

A determinação da D L 5 0 foi feita para Crotamina, Crotapotin, Fosfolipase A e para os

complexos Crotapotin Fosfolipase A, Crotapotin Crotamina na proporção molar de 1:1.

A Tabela IV apresenta as porcentagens de mortalidades para as várias diluições de cada proteínaou dos complexos, assim como os valores da Dl_ 5 0 obtidos.

Tabela IV

Toxicidade de Crotamina, Fosfolipase A e dos Complexos AB e AC"

Diluições

1: '

I . i

1:41:81:161:32

D L 60

% Mortalidade

Fosfolipase A

100

83,3

66,6

50,0

16,6

0

0,55 mg/Kg

Crotamina

10083,3

50,0

33,3

00

0,8 mg/Kg

%

AB

10083,3

83,3

66.6

33.3

0

0,05

mg/Kg

Mortalidade

AC

10010083,3

16,6

00

0,20

mg/Kg

* A tabela mostra as porcentagens de mortalidade para cada diluição obtidas pela injeçio i.p.

em camundongos, de Fosfolipase A, Crotamina e dos Complexos Crotapotin-Fosfolipaw A

(AB), Crotapotin-Crotamina (AC). Mos.ra também as D L 6 0 calculadas pelo método de

Reed e Muench, das proteínas isoladas e dos complexos AB, AC.

111.13- Medida da Velocidade de Troca HWroflenlo-Trícto

0 método utilizado foi descrito por Englander'20', em 1 963. Para os tempos pequenos como 1minuto, 2 minuto* e 3 minutos utilizou-se a técifca com ume coluna so, ou seja a amostra apôscolocada na coluna de G 26 era aluída até aproximadamente 2/3 da altura total para eliminar o excessode J H j O e, em seguida o fluxo da coluna era interrompido durante o tempo de 1 min., 2 min. e 3 min.,

logo apôs, iniciar se novamente a eluiçfo.

31

oco

<

0.2

. 2

TUBO N9

Figura 11 - Intersçfo Crotapotin-Fosfolipase A, Crotapotin-Crotamina Contendo Crotapotin-1 * * I,em Gel Sephadex G 75. Coluna de 80 cm: 0,9 cm de Gel Sephadex G 75 Fino, Equilibradoe Eluído com Tampfo Formiato 0,05 M, pH 3,5. Fluxo de 0,2 ml/min Recolhendo-M4 ml/tubo.A - Amostra Contendo 3 mg de Cfotimini/0,5 ml do Mesmo Tampfo • 0,8 mg de Crota-

potin + 20 jil de Crotapotin-1 l l l / m l do meimo Tampfo.8 - Amostra Contendo 1,5 mg de Fosfolipase A/0,6 ml de Tampfo • 1,0 mg de Crotapotin

• 80jil de Crotapotin-1 ' ' 1/0,6 ml do mesmo Tampfo Usado na Cromatografif

32

A Figura 12 mostra a separação que ocorre quando se utiliza a técnica descrita acima. Para ostempos mais longos de incubaçSo, utilizou-se a técnica de duas colunas, que sem dúvida é muito maiseficiente na separação.

III.13.1 - Troca d» Htdrogênio-Trlcio na Fotfolipaw A

A Figura 13 mostra a curva obtida através de um ajuste dos dados de n? H^/mol de proteína,contra tempo de saída do trício da proteína para o solvente. Os dados sobre os quais foi feito o melhorajuste são encontrados na Tabela V.

O tratamento dos dados pela computação, assim como os valores obtidos, encontram-se no

Apêndice 2.

A equação que representa a soma de duas exponenciais e que melhor ss ajusta nos dados

experimentais da troca H/T da Fosfolipase A foi a seguinte:

H ( t ) = 71 x e 0 - 9 * ' O ' * « + 59 x e " 0 0 5 5 t

onde 0,055 e 0,9 x IO* 4 representam as constantes de velocidade de trocas e, 59 e 71 os números de

hidrogênio* de cada classe.

Os dados de radioatividade inicial, radioatividade carregada pela proteína e absorbèncias a280 nm das amostras, que originaram os valores médios C/A e conseqüentemente o n? Hg/mol deproteína, para cada tempo considerado, podem ser vistos no Apêndice 1.

111.132 - Troca da Hidrogtnio-Trício na Crotapotin

Os dados experimentais obtidos para o n9 H /mol de Crotapotin com os respectivos tempos daincubaçSo, sSo mostrados na Tabela V.

O melhor ajuste obtido pela computação dos dados experimentais foi pala soma de duas

exponenciais, o que é mostrado na Figura 14.

0 modo como foi feito o ajuste é o mesmo do item anterior e os seus parâmetros podam ser

encontrados no Apêndice 2.

A equação da soma de duas exponenciais que originou a Figura 14 foi:

M ( | , = 22 x e o n * ' O ' 2 « • 84 x

Os valores 0,11 x 10~a • 0,22 slo as constantes da velocidade das d a n t t com 22 a 84

hidrogênio* respectivamente.

Os valores de n9 Ha/mol de Crotapotin, nos respectivos tampos òe incubaclo, originaram do*

resultados de radioatividade inicial, radioatividade carregada pala proteína a absorUnciM a 280 nm das

amostras que podem ser encontrados no Apêndice 1.

33

1,0

0.R

0.6

0.2

10

7 8 9 10 I I !,! I.) 14 IS 16

TIIÜO It?

Figura 12 - Separação da Radioatividade Carregada Pela Proteína do Excesso de *HjO na Filtraceoem Sephadex G 25 "Coarse". Amostra Contendo 3,42 mg de Fosfolipne A/ 0,8 ml daTampão Formiato 0,1 M, pH 3,0 • J H , 0 Dando uma Radioatividade Inicial da10" cpm/ml, foi Incubada por 2 h a 70°C e Resfriada. Filtracao em Coluna dt 8 cm: 3 cmde Gel Sephadex G 25 "Coarse" Resfriada a 3°C com Fluxo de 1 ml/10 segundos, Reco-lhendo-»» 1 ml/tubo. Após a Amostra ter Percorrido 2/3 da Coluna, o Fluxo foi Interrom-pido Durante 2 min para Logo em Seguida ser Restabelecido

34

1H0

f«0

SO

0 TOO SOO 1000 1500

TCMPO(mfn)

Figura 13 - Curva de Troca T/H da Fosfolipaw A. Ajuste Obtido pala Computação dos Dados Experi-mentai* de rrf> hidrogênio* Aparente* (H§) por mol de Fo*folipa*e A. A Curva Rapreientta* VelocidadM da Saída do Trício Incorporado é Proteína, para o Solvente (Exchange out)Obtidat pelo Método de Filtracfo em Coluna* de Sephadex G 25 "Coaria", Mantida*a 3°C, Equilibrada*« Eluída* com Templo Formiato 0,1 M, pH 3,0

Tabela V

Troca Isotópica H/T da Fosfolipaie A e Crotapotin'

36

Tmln

1

2

3

4

5

6

15

20

27

30

56

72

75

90

Fosfol

2h a

H.

156

128

123

113

104

106

100

98

89

78

77

73

69

70

pase A

70°C

Tmin

102

140

150

240

300

360

420

1110

1200

1440

1470

1500

1800

-

H.

74

69

71

70

70

69

64

69

68

64

62

58

60

-

Tmln

1

2

5

10

30

60

90

120

170

210

240

270

300

410

Cratapotin

2h a

H.

85

83

54

30

27

23

22

19

18

19

15

15

16

15

60°C

Tmin

1320

1380

1440

-

-

—

—

-

-

-

-

-

-

—

1

H .

5

6

4

-

-

—

-

-

-

-

-

-

-

-

' A tabela mostra o número de hidrogênio» aparentes ( H § | por mol da Fosfolipaie A a Crotapotin nos

respectivos tempos de "txcbar.yi out".

A incubaclo inicial com J H , 0 foi de 2 h a 70°C para Fosfolipaie A a 2 h a 60°C para Crotapotin.

36

i no

so

10

f,00 1000 1400

TEWO(min)

Figura 14 - Curvt de Troca T/H da Crotapotin. A|u~te Obtido pela Computaçlò do* Dados Experi-mentai» de vfí Hidrogênio* Aparentei (H§)/mol de Crotapotin. A Curva Representa aiVelocidades de Saída do Trfcio Incorporado i Proteína, para o Solwite (Exchange out),Obtidas pelo Método de Filtracfo em Colunai de Gel Sephadex G 26 "Coaria", Mantida*a 3°C, Equilibradas e Elufdas com Tampão Formiato 0,1 M, pH 3,0

37

III.13.3 — Troce de Hidrogênio Trício na Crotoxina

Na Tabela VI t e m » os dados experimentais obtidos para o n° H§/mol de Crotoxina nosrespectivos termos de incubaçfo.

A Figura 16 mostra o ajuste feito pela computação dos dados experimentais da Tabela V I , cujosvalores estão no Apêndice 2.

O melhor ajuste para a Crotoxina foi obtido pela soma de três exponenciais fornecendo aseguinte equação:

H | t , = 9 6 x e ° - 1 3 x 1 0 ~ 3 ' + 26 x «"0.012 t + 3 2 x e0 1 6 >

Os valores de radioatividade inicial, radioatividade carregada pela proteína e absorbftncias queoriginaram os números da Tabela VI estão escritos no Apêndice 1.

A Figura 15 também mostra uma curva teórica obtida pela soma dos dados de troca H/T paraFosfolipase A + Crotapotin com intuito de comparar esta simples soma com os dados experimentais detroca H/T ria Crotoxina que é o produto da recombinaçao entre Fosfolipase A e Crotapotin.

III.13.4 - Troca da Hidrogênio-Trfcio da Crotamina

Os resultados da troca H/T da Crotamina estão escritos na Tabela VI . Foram realizadas paraCrotamina experiências com variação no tempo de incubação inicial: uma com 2 horas de incubaçfo daproteína com 3 H 2 O a 70°C e outra com 18 horas de incubação também a 70°C.

Os dados experimentais foram ajustados no computador e o resultado destas ajustes estfo na

Figura 16.

Os valores de radioatividade inicial, radioatividade carregada pela proteína • absorbtncias quepermitiram o cálculo do n? Hg/mol de Crotamina para cada tempo considerado, estfo no Apêndice 1.

O Apêndice 2 contém os parâmetros encontrados pela computação dos dados.

Os melhores ajustes aos dados experimentais surgiram da soma de duas exponenciais para ambas

as experiências. Para o caso da incubaçfo inicial de duas horas a 70°C, a equação obtida foi:

H m = 26 x e" 0 - 6 6 » 1O' J i + 38 „ , 0 . 2 6 «

Para incubaçfo de 18 horas a 70°C, a equação obtida foi:

H ( f ) - 16 x a " 0 3 3 « '«»"* « • a x e - 0 0 ' « •

I114 - Medida da Radioatividade

A Figura 17 mostra a curva da porcentagem de eficiências para os padrões de radioatividade

38

Tabela VI

Troca Isotópica H/T da Crotoxina e Crotamina*

min

1

2

3

5

12

15

30

35

55

60

70

75

go100

120

130

150

Crotoxina

2h s

H.

143

154

147

132

112

137

119

111

102

107

103

111

104

112

104

97

96

70°C

Tmin

150

240

280

300

310

360

420

480

930

960

1020

1260

1320

1430

1490

-

-

H.

94

94

98

91

93

93

92

87

87

85

88

85

78

81

76

-

-

Tmin

1

5

7

10

15

48

55

88

97

120

180

346

410

480

1410

1490

1650

Crotamina

2h.a

H.

58

47

29

39

29

28

26

30

25

23

22

18

20

20

12

9

10

60°C

Tm!n

5

20

40

55

60

150

165

180

210

220

240

260

270

290

1380

1440

-

H.

24

24

21

19

21

16

15

17

15

13

16

15

16

16

10

10

-

' A tabela mostra o número de hidrogênio» aparentei (Hf) por mol de Crotoxina e Crotamina not

respectivo* tempos de "exchange out".

A incubiçlo inicial comJ HjO foi de 2 h a 70°C para a Crotoxina e 2 h e 18 h a 70°C para Crotamina.

39

100

60

0 100 1000 1300

HMPO(min)

Figura IS - Cruvt da Troca T/H da Crotoxfna. Ajuste Obtido pala Computaçlo dos Dados Experi-mentai! da n<? Hidrogênio* Aparentes (H^l/mol de Crotoxina. A Cura Representa as Veloci-dades de Saída do Trício Incorporado i Proteína, para o Solvente (Exchange out), Obtidaspelo Método de Flttreçfo em Colunas da Gel Sephadex G 26 "Coarsa", Mantidas a 3°C,Equilibradas e Eluídas com Tamplo Formiato 0,1 M, pH 3,0. A Curvi A+B Representaa Soma Teórica da Equação Obtida pelo Ajuste aos Dados Experimentais da n9 H(/molde Crotapotin + a equação Obtida pelo Ajuste aos Dados da n9*Ha/mol da Fotfolipe» A

I'M

t« 50

1000 MOO

TLMPO(min)

Figura 10 - Curva de Troca T/H da Crotamina. Ajutte* Obtido* pala Computaçlo do* Dado* Expari-mantait da n? Hidrogênio* Aparente* (H^l/mol da Crotamina. At Curva* Representam atVelocidade* de Saída do Trício Incorporado è Proteína, para o Solvente (Exchange out),Obtida* pelo Método de Filtracfo em Coluna» da Gal Sephadex G 26 "Coana", Mantida*a 3oC, Equilibradas e Eluída* com Ttmpflb Formieto 0,1 M, pH 3,0. Na Curva I, Temo*os Valore* Obtido* Apót a Incubaçfo Inicial da Proteína com JHjO a 70°C por 2 hora*.Na curva II, Apói a IncubaçSo Inicial com JHjO a 70°C por 18 hora»

41

tjj•—*

O

u

Ui

o

50 .

0 0,2 0,6 1,0 1,2 1,4

CONTAGENS CANAL A/CONTAGENS CANAL B

17 - Curva da % Eficiência Obtida no Contador da Cintilaçfo ISOCAP/300. Curva Padrfo daEficiência Obtida no Contador da Cintilaçlò ISOCAP/300 (Nuclear Chicago) com Radio-atividade Conhecida de Amostra» Padrdei (Nuclear Chicago) Contendo "Quenching",Utilizando o Método da Relaçfò de Canaii para Corrigir a Eficiência dai Amoitrai Tridadat

42

cont»'i:iil,i. t:ontrd os V,IIOIHS da relação cfc? canais A/B. Esta curva foi utili/.-il.i I M I H O cádiilo daspiir .»•! i. i is •!.• cont.igeiis rias amostras i|iit? r.ontinhatn tricio.

IV - DISCUSSÃO

A .inálise dos resultados desle trabalho necessita em primeiro 'ugar que retiremos da literaturaalguns dados sohie as proteínas por nós purificadas.

A Crotapotin é uma proteína muito ácida (A) de ponto isoelétrico por volta de 3,4-3.7 ' ,desprovida de toxicidade, com peso molecular entre 8400-9400 ' .

A Fosfolipase A é uma protein muito básica (B) de ponto isoelétrico entre 8,4-9,7 ' , combaixa toxicidade e peso molecular de 13000 de acordo com Hendon e Fraenkel Conrat e 16294 deacordo com Breithaupt et alii151.

A Crotamina é uma proteína muito básica (C) de ponto isoelétrico 10,3 , altamente tóxica,com peso molecular 4 8 8 0 l 5 8 ) .

Os resultados da análise de aminoácidos da Fosfolipase A e Crotapotin descritos na Tabela I,

apresentam pequenas diferenças dos obtidos por Hendon e Fraenkel-Conrat . Estas diferenças

representam 4 a.a.* a mais na Fosfolipase A e 3 a.a. a mais na Crotapotin. 0 ponto principal discordante

é o número de cisteínas. onde temos 12 para A e para B enquanto que o referido autor encontra 11 .0$

resultados obtidos no item 111.8 mostram que não foi possível detectar grupos SH livres nas proteínas

mesmo em presença de uréia, o que nos leva a crer que o número de cisteínas deva ser par cr os SH

estejam comprometidos em pontes de enxofre.

Na Tabela I temos também dados da composição de aminoácidos da Crotamina que concordam

muito bem com os publicados por Laure . A Crotamina também não apresenta grupos íióis livres

reforçando a hipótese da existência de 3 pontes de enxofre envolvendo as 6 cisteínas.

Gonçalves e Poison ' em 1947. utilizando equipamento de Tiselius, analisaram ocomportamento eletroforético das proteínas do veneno de Crotalus d. terrificus. Usando pH 8,6 a 7,7puderam verificar o aparecimento de uma proteína muito básica mais tarde caracterizada comoCrotamina; nesses valores de pH era evidente a existência de complexos entre proteínas com cargaspositivas e negativas. Para minimizar a interação proteína proteína foi preciso aumentar a força iònica ourealizar a eletroforese a ^H 3,0 onde segundo os autores as proteínas possuíam a mesma carga 0forneciam diagramas eletroforéticos com imagens especulares nos ramos ascendente e descendente dacélula em U.

Com o isolamento e a caracterização da Fosfolipase A e Crotapotin em 1971 por Hendon •Fraenkel-Conrat e Rubsamen et alii'7 ficou evidenciado que a Crotoxina resulta jda interaçãoeletrostática entre as duas proteínas e que ocorre um fenômeno sinergístico quanto a ação neurotóxica.

A possibilidade de ocorrerem interações entre proteínas de cargas opostas que resultem numaumento de toxicidade, foi levantada por Jeng e Fraenkel-Conrat'66', em 1976. Os autores estudando •toxina de um cogumelo (Volvirtolla mrfvaoaa), a volvatoxina, que como na Crotoxina, tem uma aefotóxica resultante da interação de duas proteínas nlo tóxicas só que de mesmos pontos isoelétricot:pi 6,0, denominadas A t e A J ( verificaram que a volvatoxina A j interage com • Fosfolipase Aaumentando cerca da 6 vezes • toxicidade da lecitinase.

Como o complexo só se forma com • proteína A j da volvatoxina • como foi infrutífera •tentativa de se aumentar a toxicidade da Fosfolipase A, pela presença de outras proteínas ácidas, supflemos autores que o sinergisrno n lo pode ser explicado simplesmente por interações poliionicas.

• • ». = •mlnofcido

43

O surgimento destes complexos híbridos, mais o constante aparecimento de um contaminante

proteico uatregado negativamente, durante as purificações de Crotamina por nós realizadas, que mais

tarde identificamos como sendo a Crotapotin, levou-nos a estudar a possível formação de um complexo

Crotamina Crotapotin.

Na Figura 9, mostramos que A e B interagem formando um complexo estável, não dissociávelna filUdção de gel, com um volume efluente igual ao obtido para a Crotoxina pura e não fracionada. Asmudanças quantitativas de uma proteína em relação a outra, ou seja, excesso de B em relação a A ouvice-versa, não alteraram o volume efluente do complexo AB, como mostramos nas partes B e C daFigura 9.

A Tabela II mostra claramente que em qualquer que seja a proporção molar A : B colocada nacoluna, forma-se um complexo AB estável na proporção molar de 1 : 1.

Pela mesma técnica pudemos comprovar como mostramos na Figura 10, Crotamina (C) eCrotapotin (A) interagem formando um complexo que é entretanto dissociável pela filtração em gel, poiscom qualquer proporção molar A : C colocada na coluna, temos sempre como resultado o aparecimentode 3 picos AC, A e C na ordem crescente de volumes efluentes. Desta maneira pela técnica de filtraçãoem Sephadex G 75 foi difícil chegarmos à exata proporção molar de interação como constatamos nosdados da Tabela I I I . Os dados de medida de concentração de proteína e área dos picos forneceramproporções molares variadas, sugerindo que ocorre uma dissociação expontânea do complexo AC,durante a passagem pelo gel.

Este fato não causa surpresa, uma vez que, outros autores como por exemplo Hartley e

Smeaton'46 ' na interação entre Barnase e seu inibidor Barstar e Cuatrecasas e Hollemberg'11' numa

revisão sobre interação proteínas-membranas constataram a impossibilidade de em alguns casos definir as

proporções molares de interação pela filtração em gel Sephadex, devido a dissociação dos complexos

formados.

Entretanto, Nakazone et a | j j 1 6 5 . 6 6 - 6 7 . 7 5 ' e m nosso laboratório demonstraram de maneira

elegante, utilizando técnicas imunológicas, que o complexo AC se forma realmente na proporção molar

de 1:1.

O aumento da toxicidade da Crotamina e da Fosfolipase A, pela interação com Crotapotin podeser verificada na Tabela IV, onde temos as D L 5 0 obtidas para B e C isoladas e para os complexos AB eAC. Nota-se que a ação tóxica da Fosfolipase A é aumentada cerca de 10 vezes pela interação comCrotapotin e a toxicidade da Crotamina é aumentada cerca de 4 vezes, quando está complexada comCrotapotin.

Mais uma evidência da partic!paç3o de A na formação dos complexos AC e AB poda servisualizada na Figura 11 que resulta de experiências nas quais usamos Crotapotin marcada c o m l 2 5 l ,como traçador.

Como já dissemos o fenômeno de sinergismo que ocorre pela interaçlo entre as proteínas, nfo ésomente produzido pela aproximação eletrostática, alguns fatores estruturais devem estar envolvidos paraque a formação dos complexos seja possível.

Do ponto de vista conformacional o que w conhece sobre Crotamina, Crotapotin • Fosfolipase

A, é realmente muito pouco.

Brelthaupt et al í i '8 1 em 1 974, após a reduçio e alquilaçlo da Crotapotin, «pararam por

filtraçlo em gel 3 cadeias peptídicas, sugerindo que a proteína na tua estrutura original contém as 3

cadeias unidas por pontes de enxofre. Sugerem os autores ainda que a Fosfolipase A é uma cadeia

polipsptídica intramolecularmente ligada por pontes de enxofre.

44

Em 1 975, Paradies e Breithàupt' ' ü l atiavés das medidas de sedimentação, viscosidade edifusão, sugerem que a Crotoxina seria uma esfera com taio de Stokes 22,5 A e uma relação axial 1: 3.enquanto que a Fosfolipase A seria assimétrica, com uma relação axial muito alta e a Crotapotinassumiria uma formação de um elipsóide oblatn de revolução.

Em 1 976, Hampe e Gonçalves trabalhando sobre a dispersão óptica rotatória da Crotamina

encontraram um espectro totalmente atípico. Os mesmos autores em 1 978 analisando a dispersão óptica

rotatória em vários valores dp pH, definem a presença de 3 contôrmeros diferentes, com pH de transição2,6 do confòrmero I para o II e 9,7 do confôrmero II para o III .

A análise dos confòrmeros pelos autores sugerem que a Crotamina seria uma esfera com grau de

compactação decrescente com o aumento do pH.

0 estudo do comportamento estrutural de proteínas em solução, pela medida da velocidade de

troca hidrogênio/trício, tem merecido um certo destaque nos últimos anos. Assim podemos citar

importantes trabalhos com mioglobina e hemoglobina ' ' , conformação'do virus de Mosaico do

Tabaco , ácidos nuclêicos , anidrase carbônica e outras, que utilizam a tecnologia da filtração

em Sephadex G 25 e a interpretação matemática originalmente aplicada por Linderstrom-Lang ' , em

1 955. Esta análise considera que a velocidade de troca hidrogênio-trício (ou deutério) é representada,

para a lisozima, como uma soma de 4 exponenciais do tipo de decaimento radioativo.

0 número de exponenciais encontrado representa o número de classes de hidrogênios

caracterizadas pelos parâmetros destas exponenciais.

0 mesmo tipo de análise tem sido utilizada por outros autores como por exemplo:Englander , em 1 963, estudando a ribonuclease encontra o melhor ajuste na soma de 4 expanenciaispara a curva de velocidade troca H/T definindo 4 classes de hidrogênios, ou seja, uma classe I que seriarapidamente expostos ao solvente com ty, da ordem de segundos; uma classe II que seria hidrogêniospeptídicos em "random-chain" com ty} entre 4-10 minutos; uma classe I I I seria composta porhidrogênios peptídicos envolvidos em alfa-hélice com ty2 por volta de 160 min. e a classe IV hidrogêniospeptídicos ou de cadeias laterais, escondidos na estrutura protéica.

Duas críticas principais surgiram IOS trabalhos mais recentes, a primeira se refere i relaçãodireta da porcentagem de alfa-hélice ao número de hidrogênios da classe I I I , uma vez que, as medidasrealizadas por diversas técnicas não forneciam os mesmos resultados1541. Hoje já se procura associar avelocidade de troca H/T de uma proteína à localização dos seus hidrogênios, se estão mais ou menosexpostos ao solvente.

A segunda crítica está muito bem fundamentada no trabalho de Laiken e Printz'6 7 ' . Os autoras

ss referem è obtenção do melhor ajuste dos pontos experimentais pela computação dos dados,

constatando que é possível, a partir dos mesmos dados, obter-se ajustes razoáveis contendo duas ou três

exponenciais. Fica evidente que, a escolha entre a existência de duas ou de três exponenciais, leva •

erros na interpretação dos resultados.

Entretanto consideramos qua as críticas nío invalidam os bons resultados obtidos por trabalhos

mais recentes, principalmente aqueles que procuram analisar as curvas exponenciais do ponto da vista

comparativo.

Outro fato que devemos considerar é a existência dos afeitos isotópico químico a cinético nas

experiências de troca isotópíca H/T e H/D. A existência do efeito isotópico cinético já havia lido

demonstrada por Englander'201 «m 1 963 na ribonucleest, ou seja, a protafna dauterada pardia dautério

para o solvent» mais lentamente do que a tríciada.

Em 1 969, Englander e Poulsen'241 trabalhando com poliaminoácidos confirmaram a existência

de um efeito itotópico de equilíbrio para os hidrogênios das ligações peptídlcas ou seja, o equilíbrio

45

entre T/H no polímero é 21% maior rio que T/H no solvente. A partir deste feito os autores passaram aincluir na equação utilizada para o cálculo do número de hidrogfnios por mol, o valor 1,21.

H = (111e/1,21Co) (C/A)

Nos cálculos destes trabalhos não consideramos os possíveis efeitos ísotópicos, passando a nosreferir ao número H/mol como número de hidrogênios aparentes por mol(H /mol).

Considerando também que se a computação dos resultados não fornecem números exatos paraos hidrogênios ou constantes de velocidades, com certeza ela nos dá uma imagem do comportamentoestrutural da proteína em solução e essa imagem é que nós utilizamos para analisar os resultados destetrabalho.

Duas linhas de pensamentos diferentes sobre a interpretação do aparecimento de hidrogênioslentos nas proteínas, tem sido austeramente discutidas nos últimos anos.

A primeira linha admite que ocorre na proteína em solução o que é chamado de "respiração"ou flutuações da estrutura protéica, ou ainda desnaturações reversíveis e localizadas, acompanhadas pordestruiçOes de pontes de hidrogênios e conseqüentemente exposição ao solvente para at roca'2 5 '2 7 '5 4 '6 3».

Desta linha destacamos o trabalho de Nakanishi e Tsuboi164' sobre a flutuação da estrutura dalisozima. Após experiências com troca H/D com ou sem a presença de LiBr como desnaturante, osautores sugerem que existe na lisozima uma conformação N e uma conformação D. Na conformação Nocorre 44 pontes de hidrogênios peptídeo-peptídeo, as mesmas encontradas no estado cristalino. Naconformação D as pontes são quebradas e os 44 hidrogênios estão livres. Em solução, a conformação Nestá presente, mas quando é adicionado LiBr a quantidade da conformação D aumenta. Os autoresimaginam ainda um número de diferentes conformações D,, D2, etc. nas quais algumas das 44 pontes dehidrogênio da lisozima estariam quebradas e outras intactas.

A segunda linha de pensamento interpreta o aparecimento de hidrogênios lentos, pelasdiferentes acessibilidades ao solvente dos vários hidrogênios, ou seja, o número de hidrogênios lentosnuma proteína nativa é igual ao número de hidrogênios com acessibilidade ao solvente restrita, e estespodem ou nSo estar envolvidos em pontes de hidrogênios intra-moleculares. Dentro ainda desta linha, omecanismo de exposição ao solvente pode e provavelmente deve, envolver flutuações da proteína, masestas flutuações nSo envolvem necessariamente quebra de pontes de hidro^ín •

Desta linha destacamos os trabalhos de Browne et a l l 6 ) , Wickett et a l l i ' 8 7 ' * principalmente aspublicações de Ellis e Woodward" 8 ' 9 0 ' 9 " que aplicam a técnica de troca isotopica H/T no inibidor datripsina de soja, na tripsina e no complexo formado pela interação das duas proteínas.

A idéia fundamental do trabalho reside na obtençio das curvas cinéticas das proteínas isoladas,para a seguir após a Interação das proteínas, analisar o comportamento cinético da troca H/T nocomplexo. Os autores observam que ocorre uma grande diferença entre a cinética do complexo » •simples soma das cinéticas das proteínas isoladas. A cristalografia da RX descartou a possibilidade doretardamento da velocidade de troca, ser explicado pelo aparecimento de pontes de hidrogênio.

Numa discusslo multo bem feita os autores propõem que a atanuecfo da cinética de troca apósa formeçlo do complexo é devido primariamente as mudanças na distrlbuiçlo das velocidades de trocaem funçlo das mudanças da acessibilidade ao solvente, mas uma pequena contribuiçfo por formeçlo depontes de hidrogênio nío é descartada pelos autores.

46

Um fato importante que é aceito pelos dois grupos de pesquisadores é de que o transporte dehidrogênio <*> far segundo a teoria de E i g e n 1 1 6 ' 1 " , que determina três fases para a reação detramfeiência: a pumeira fase seria a colisão por difusão do doador de hidrogênio com o aceptor para aformação de uma ponte de hidrogênio no complexo; a segunda seria o equilíbrio de redistribuição dopróton entre os dois membros; e a terceira seria a dissociação do complexo com o proton, se a reaçãoteve sucesso, indo para o aceptor.

A análise dos resultados de cinética de troca H/T, aplicada a Crotapotin, Crotamina, FosfolipaseA e Crotoxina, pode ser feita considerando os fatos citados acima, mas não pode decidir sobre uma ououtra explicação das cinéticas encontradas, pela falta de maiores informações sobre as referidasproteínas.

Pela análise de aminoácidos temos que o número de hidrogênios teoricamente trocáveis da

Fosfolipase A é 223, sendo que destes, 122 são hidrogênios peptídicos e, 101 são hidrogênios de cadeias

laterais e de grupos terminais. A Figura 13 nos mostra o ajuste feito sobre os. dados experimentais de

troca H/T da Tabela V, cujo desenvolvimento matemático pode ser visto no Apêndice 2.

A equação que originou este ajuste nos fornece a existência de duas classes de hidrogênios.

sendo que aqueles mais rápidos, impossíveis de serem determinados pela técnica, são obtidos por simples

subtrações do total teórico. Assim teríamos

Classe I = 93 H muito rápidos

Classe II = 59 H com t,/a = 12,6 minutos

Classe I I I - 71 H com t% = 128 horas

Não aparece na Fosfolipase A a ciasse de hidrogênios envolvidos em alfa-hélice cujo t ^ seria de2 a 2,5 horas. Observa-se também que 68% dos hidrogênios teoricamente trocáveis slo rápidos, mesmoconsiderando o fato de trabalharmos a pH 3,0 que está próximo do pH mínimo ou do pH onde •velocidade de troca isotópica é mínima, que está entre pH 2 e pH 4 < 2 7 ' . Por outro lado sabemos que •Fosfolipase A i uma enzima que produz » hidrólist de ésteres de ácidos graxos ligados è posição 2 de1,2 díacilsn-fosfoglicfdeos > 4 < 7 6 > . Sabemos também que estes substratos sfo insolúveis e se encontramna forma micelar.

Estudos sobre mecanismos de ação da Fosfoüpast A de Naja'1 3 1 , de veneno de Crotatut

adamanteui'8 6 '8 6 1 e principalmente sobre a Fosfolipase A de pancreas de porco'71 > 7 2 > 8 9 1 , tem

mostrado que a enzima tem preferência sobre substratos na forma micelar e, que neste caso necessita

penetrar na micela para hidrolisar a ligação ésteres.

O número grande de hidrogênios rápidos encontrados na troca H/T da Fosfolipase A, portanto

acessíveis ao solvente e possivelmente solvatados. facilitariam a interação com o substrato na forma

micelar também solvatado.

Na Figuia 14 temos o melhor ajuste feito para a Crotapotin pela computação dm dados

experimentais da troca H/T da Tabela V, cuios parlmetros slo encontrados no APÊNDICE 2.

0 número de hidrogênios teoricamente trocáveis calculados pela análise de aminoácidos é 130,sendo que destes, 81 slo hidrogênios peptídicos e, 49 slo das cadeias laterais • d* grupos terminais. Daequação que originou o ajuste temos:

Classe I = 24 H muito rápidos

Classe II = 84 H com t)/4 = 3,5 minutos

47

Classe III = 22 H com t,- 10 5 horas

Não aparece na Crotapotin a exponenc.ial cai;icti»c(stica da alfa-hélice com ty de 2,5 horas e83'.Y dos hidrogênios teóticos são rapidamente trocados com o solvente.

Paradies e Breithaupt mostraram qun a Crotapotin é composta de três cadeias polipeptídicasunida? por pontes de enxofre e que a proteína em solução apresenta-se na forma de um elipsóide ofcdatode revolução com relação a/b = 3. Este fato mostra que a Crotapotin é mais esférica que a Fosfolipase Ao que poderia explicar o aparecimento de um maior número de hidrogênios rápidos na Crotapotin.

Por outro lado, do ponto de vista de acessibilidade ao solvente segundo Welch e Fasmann ,proteínas pequenas devem trocar seus hidrogênios com velocidades maiores do que proteínas de altopeso molecular e sem dúvida tanto a Crotapotin quanto a Fosfolipase A são consideradas proteínaspequenas.

O fenômeno de sinergismo que ocorre na interação não é inespecífico ou somente umaaproximação entre proteínas de cargas opostas; devem ocorrer algumas mudanças estruturaispossibilitando a formação de um complexo altamente tóxico que é a Crotoxina.

Na Figura 15 temos o melhor ajuste aos dados experimentais (Tabela VI) da troca H/T daCrotoxina cujos parâmetros podem ser encontrados no Apêndice 2.

O número de hidrogênios teoricamente trocáveis, calculados pela análise de aminoácidos é 353,sendo que destes, 203 são hidrogênios peptídicos e, 150 são de cadeias laterais e grupos terminais. Daequação que originou o ajuste temos:

Classe I = 199 H muito rápidos

Classe II = 32 H com Xy} = 4,3 minutos

Classe III - 26 H com \y} = 58 minutos

Classe IV = 96 H com t,/a = 90 horas

Na Figura 15 temos também a curva que representa a soma teórica das exponenciais da

Crotapotin + as da Fosfolipase A, considerando a interação com proporção molar 1 : 1 .

Em primeiro lugar devemos ressaltar que pela simples comparação das curvas da Figura 15,vemos que a Crotoxina apresenta uma curva mais lenta do que a da soma das duas proteínas que acompõem. Em segundo lugar pelos dados obtidos peio ajuste, temos o aparecimento de uma nova classede hidrogênios com tya = 58 min. podendo ser identificados como participantes de pontes de hidrogêniosque surgiriam da interação Fosfolipase A-Crotapotín.

No geral podemos dizer que pela interação Fosfolipase A - Crotapotin aparecem ra Crotoxina

cerca de 13% a mais de hidrogênios lentos que a simples soma das proteínas isoladas.

Segundo Paradies e Breithaupt'70' pela interação da Fosfolipase A-Crotapotin, a liberação daágua é acompanhada por uma liberação de ions H* da Fosfolipase A resultando num decréscimo na cargapositiva, pelo estabelecimento de pontes de hidrogênios entre grupos carboxil da Crotapotin por volta depH 6,0. Por outro lado os 26 hidrogênios que trocam com velocidade próxima daqueles participantes daalfa-hélice poderiam sugerir a presença de aproximadamente 8 voltas de uma espiral constituindo-senuma razoável alteração estrutural e que seria, quem sabe, o ponto de lígaçSo aos receptores econseqüentemente responsável pelo grande aumento de toxicidade.

48

Na Figura 16 temos os ajustes aos dados experimentais (Tabela VI) da troca H/T da Crotamina

em duas condições iniciais de incubação: uma com 2 horas a 79° C e outra com 18 horas a 70° C.

Na Crotamina temos 86 hidrogénios teoricamente trocáveis, sendo que destes, 44 sfo peptídicose 42 sa"o hidrogênio sm cadeias laterais e de grupos terminais. Das equações que originaram os ajustesteremos:

Classe I = 22 H muito rápidos

2 h a 70°C Classe II = 38 H com ty2 = 3 minutos

Classe I I I = 26 H com t % = 18 horas

Classe I = 61 H muito rápidos

18 h a 70°C Classe II = 9 H com t % = 43 minutos

Classe I I I = 16 H com t,/} = 35 horas

A Crotamina é uma proteína compacta e altamente resistente à temperatura ' . Com

aquecimento de 70°C por 18 horas, a Crotamina manteve sua toxicidade plenamente.

Os valores de troca H/T nos mostram que a Crotamina nSo apresenta hidrogénios envolvidos em

pontes, concordando com os dados já publicados de ORD ' . Os 3 1 % de hidrogénios lentos que

aparecem após a incubaçSo de duas horas a 70°C, diminuem para 18% se a incubaçlo prossegue até 18

horas e, há o aparecimento de um grupo de 9 hidrogénios com ti^ = 43 minutos, quê tf intermediário

entre os encontrados para hidrogSnios peptfdicos livres ou aqueles comprometidos em pontes de

hidrogénios'20'.

Estes fatos podem sugerir uma "abertura" da proteína sem no entanto levar a uma

desnaturaçfo.

Por outro lado, do ponto de vista de acessibilidade ao solvente podemos dizer que a Crotamina,como uma proteína pequena de peso molecular 4880, troca seus hidrogénios rapidamente mantendo umnúdeo contendo 26 H lentos, que diminuem para 16 H quando o aquecimento passa de 2 horas a 70°Ca 18 horas na mesma temperatura.

V - CONCLUSÕES

1) A Crotapotin interage com Fosfolipase A, formando um complexo estável, na proporclo

molar de 1 : 1 , aumentando a toxicidade da Fosfolipase A cerca d* 10 vazas.

2) A Crotapotin interage com Crotamina, formando um complexo dissociávtl pala filtraçlò

am gel, cuja toxicidade quando a proporclo molar do complexo é 1 : 1 , ê cerca da 4

vazes maior que a Crotamina sozinha.

3) A Crotapotin, Fosfolipase A a Crotamina quando estudadas pala medida da velocidade da

troca H/T, apresentam comportamento cinético qua pode sar representado pala soma da

duas exponenciais.

49

4) A cinética da troca isotòpira H/T da Crotamina submetida a um aquecimento com 3 H 2 O

a 70uC por duas horas e 18 horas, mostra que para um maior tempo de incubacSo ocorre

um aumento do número de hidroyênios rápidos com conspquente diminuição dos lentos.

5) A cinética de troca H/T da Crotoxina difere da cinética obtida pela simples soma

Fosfolipase A + Crotapotin, evidenciando o aparecimento de uma terceira exponencial

cujos parâmetros se assemelham aos característicos de hidrogênios envolvidos em

alfa-hélice.

50

APÊNDICE 1

O Apêndice 1, contém os valores de Absorbância (A), contagens por minuto (cpm/ml) e

contagens por minuto/Absorção (C/A) para cada tubo após a filtraclo das amostras contendo proteína +

'H2O.

Contém também, os valores de radioatividade inicial da incubação proteína + 3 H 2 O(C ) e os

tempos de "exchange out".

Finalmente o Apêndice 1 contém o n9 de hidrogênios calculados para cada amostra (H)

submetida à filtraçãV), com base na equação:

H/mol = ( E x 1 1 1 / C 0 ) (C/A)

Foram utilizados para o cálculo do n? H/mol, valores médios de C/A qua tinham uma variaçSo

entre si de no máximo 5%.

CROTOXINA

tubo

A

cpm/ml

C/A

H m

tubo

A

cpm/ml

C/A

co

20

0.60

20016

33360

C o

19

0.17

6617

38923

= 7 , 8 6 K

21

0,78

22516

28866

= 9.29x

20

0.1 S

6553

43686

10* cpm/ml tempo = 1

22 23 24

0.70 0.56 0.37

23319 18561 11834

33312 33144 31983

143

min

25

0.23

8117

34540

10* cpm/ml tempo = 5 min

21 22 23

0.15 0.11 0.08

5184 4008 2665

34560 36436 32812

132

24

0.05

1608

32160

co

17

0,56

19392

34628

C o

14

0.06

1890

31«»00

= 7.18x

18

0,72

22948

31872

= 9,29x

15

0.13

4252

32707

10* cpm/ml tempo = 2 min

19 19

0.69 0.55

21479 18323

31128 33314

154

20

0,39

13742

35235

10* cpm/ml tempo = 12

16 17

0,19 0.20

6193 6341

32594 31705

112

10

0,15

5786

38573

21

0,27

9227

3*174

min

19

0,10

3052

30520

Co

19

0,35

11390

32542

Co

16

0,12

5473

45623

= 7,24 >

20

0.50

14655

29310

= 9,5x

17

0,18

7387

41038

t 10* cpm/ml tempo = 3

21 22

0,48 0.42

15247 13368

31764 31828

147

23

0,33

11620

35212

min

24

0.25

9126

36504

10* cpm/ml tempo =15 min

18 19

0.22 0,17

8576 6396

38981 37623

137

20

0,11

4476

40690

21

0,08

3220

40250

OI

CROTOXINA

tubo

A

cpm/ml

C/A

Hm

tubo

A

cpm/ml

C/A

"m

Co

15

0.15

4879

32526

co

18

0.19

6210

32684

»9.5x

16

0.22

7499

34016

= 9.5x

19

0.22

6634

30154

10a cpm/ml tempo = 30 min

17 18

0.22 0.18

7543 5968

34286 33155

119

19

0.14

4820

34428

20

0.10

3903

39030

10a cpm/ml tempo = 60 min

20 21

0.21 0.17

6240 5543

29714 32605

107

22

0.12

3621

30175

23

0.08

2848

35600

18

0.18

5738

31877

Co

18

0,09

2431

27011

= 9.29x

19

0.17

5404

31788

= 9,29

19

0,15

4381

29206

10a cpm/ml tempo = 35

20 21 22

0,15 0,15 0,11

5738 4311 3192

38253 28740 29018

111

x 108cpm/ml tempo =

20 21 22

0.20 0,18 0,16

5662 5207 4995

28310 28927 31218

103

min

23

0,09

2737

30411

70 min

23

0,14

3802

27157

V17

0,14

4207

30050

Co

16

0,24

7445

31020

= 9,29 x

18

0,15

3923

26153

= 9,5x

17

0,24

7602

31675

10* cpm/ml tempo = 55 min

19 20

0,12 0,11

3208 2919

26733 26536

102

21

0,09

2523

28033

10* cpm/ml tempo =75

18 19

0,19 0,14

6009 4945

31626 35321

111

20

0,11

3519

30600

22

0,06

1752

29200

min

21

0,07

3106

44471

CROTOXINA

tubo

A

j|i

Co

14

0.12

= 9,29x

15

0.13

10a cpm/ml tempo =

16 17

0.11 0.10

18

0,09

90 min

19

0.09

C o

18

0,19

= 9.5x

19

0.19

10* cpm/ml tempo = 100

20 21

0.19 0,17

22

0.13

min

23

0,09

C o

17

0,06

= 9,29 x

18

0,13

108 cpm/ml tempo

19

0,18

20

0,20 0,

= 120 min j

21 22 !

19 0,14

cpm/ml • 3380 3622 2980 2980 2665 1722 6445 5823 6163 5356 4092 3002 I 1643 4036 5322 5735 5088 4294

C A 28166 27861 27090 29800 29611 24600 33921 30805 32436 31505 31476 33355|27383 31046 29566 27975 28266 30671

104 112 104

tubo

A

cpm/ml

C/A

C o

16

0.15

4036

26906

= 9,5 x 10a cpm/ml tempo =130 min

17

0.122

5183

23559

18 19

0.24 0.22

8003 6129

33345 27859

07

20

0.16

4418

27612

21

0.11

3121

26008

C o

18

0.09

2537

26989

= 9,5 x 10* cpm/ml tempo =150

19

0,16

5090

31812

20

0.23

6207

26986

í

21

0.23

6266

27243

)6

22

0,19

5060

26631

miii

23

0,10

4291

42910

Co =

15

0,14

3740

26714

9,29 x

16

0,19

4848

25515

10* cpm/ml tempo = 190

17 18

0,20 0,17

5191 4476

25955 26329

94

19

0,11

2876

25008

min

20

0,07

2162

26145

s

CROTOXINA

; tubo

A

cpm/ml

! aA

tubo

' A

; cpm/ml

| C/A

C o =

20

0.18

5981

32227

16

0.13

3322

25553

9.29 x

21

0.19

4842

25484

9.29 x

17

0,19

5517

29036

10* cpm/ml tempo - 240 min

22 23

0.18 0.13

4711 3730

26172 28692

94

24

0.11

2719

24718

25

0.07

2212

31600

10* cpm/ml tempo = 310 min

18 19

0.20 0.17

5135 4760

25048 28000

93

20

0,13

3201

24623

21

0.09

2385

26500

Co

I 13

0.17

4776

28094

Co

16

0.18

5232

29066

= 9,5 x 1

14

0.21

5971

28433

= 9,5 x 1

17

0.25

6585

26340

0s cpm/mt tempo = 280

15 16

0,20 0,15

5577 4044

27885 26960

98

17

0,13

2767

21284

0* cpm/ml tempo = 360

18 19

0,23 0,17

6085 4992

26456 29364

93

20

0,13

3456

26584

min

18

0,06

2040

34000

min

21

0,07

1977

24712

Co =

16

Í0.14

3342

23871

Co =

18

0,18

4629

25716

9,5 x

17

0,21

5258

108 cpm/ml tempo = 300

18 19

0,21 0,21

5937 4940

25038 28271 23523

9,5 x

19

0,23

6017

91

20

0,15

4524

30160

10* cpm/ml tempo = 420

20 21

0,23 0,20

6057 4958

26160 26334 24790

92

22

0,14

3974

28385

min

21I

0,12

3034 !

25283

min !

23

0,09 i

3076

34177

CROTOXINA

tubo

A

cpm/ml

i C/A

i

Hm

tubo

A

cpm/ml

C/A

V17

0.09

2935

30572

=.-

18

0.05

1063

21260

= 9.5x

18

0.19

4641

10* cpm/ml tempo = 480 min

19 20

0.26 0.23

6151 6844

2442S 23657 29756

7.18 x

19

0.09

2427

87

21

0.22

5416

24618

22

0.16

3841

74006

10* cpm/ml tempo = 1020 min

20 21

0,13 0.11

3427 2337

26966 26361 21245

88

22

0.11

2204

20036

23

0,08

1855

20611

Co =

18

0.13

2839

21838

Co =

15

0.05

1048

20960

7,18 x

19

0.12

2603

21691

7,18 x

16

0.11

2033

18481

10* cpm/ml tempo = 930 min

20 21

0.11 0.08

2136 1596

19418 19950

87

22

0,06

1192

19866

23

0,03

917

24131

10s cpm/ml tempo = 1260 min

17 18

0.15 0,15

2476 2919

16506 19460

85

19

0,12

2461

20508

20

0,07

1294

18485

Co =

17

0,10

1809

18090

Co =

20

0,11

2036

18509

7,18 x 1

18

0,16

3319

20743

0* cpm/ml tempo = 960 min

19 20

0,14 0.14

3869 2675

27635 19107

85

21

0,09

2172

24133

22

0,06

1307

21783 '

7,18 x 108 cpm/ml tempo = 1320 min

21

0,13

2407

18515

22 23

0,12 0,11

2293 1916

19100 17600

78

24

0,08

1822

21690

25

0,05

1132

19517

CROTOXINA

tubo

A

cpm/ml

C7A

C

16

0.11

2440

22181

:o = 9.29 x

17

0.18

3897

21650

10* cpm/ml tempo =

18

0.20

4533

22765

19

0.19

4343

22857

81

1430 min

20

0.14

3068

21914

21

0.08

2011

25137

C

15

0.10

2199

20942

o = 9' 2 9 x

16

0.18

4133

22961

10* cpm/ml tempo

17

0,22

4840

22000

18

0,20

4083

20415

75

=1490 min

19

0,16

3271

20443

20

0,11

2134

19400

FOSFOLIPASE A

C = 5,9 x 10s cpm/ml tempo = 1 min Co = 5,3 x 108 cpm/ml tempo = 2 min C = 4,05 x 108 cpm/ml tempo = 3 min

tubo 12 13 14 15 16 17 8 9 10 11 12 13 16 17 18 19 20 21

cpm/ml

C/A

0.12

5735

45880

0.18

6772

37622

0.19

7094

37366

0.18

6715

37305

156

0.18

7458

41433

0.18

-

-

0.06

2526

42100

0.43

12072

28074

0.84

21955

26136

0,76

21080

27736

128

0,45

11894

26431

0.28

9423

33653

0,37

8620

22986

0,74

15344

20735

0,89

17572

19743

0,82

15744

19200

123

0,61

12058

19767

0,41

8515

20768

1

tubo

A

cpm/ml

C/A

i

co

17

0.73

14256

19528

= 3.16x

18

1.0

19142

19142

10* cpm/ml tempo = 4 min

19 20

1.2 0.96

21513 17656

17927 18391

113

21

0.65

12064

18560

22

0.38

7570

19921

10

0.16

4048

25300

= 5.9€x

11

0.44

11342

25777

10* cpm/ml tempo = 5 min

12 13

0,69 0,75

16554 18251

23991 24384

104

14

0,64

17097

26714

15

0,40

14545

36362

co

7

0,13

3143

24176

= 5,99 x

8

0,48

15560

32416

IO8 cpm/ml tempo = 6

9 10

0,65 0.55

16542 14992

25449 27258

106

11

0,48

16228

33808

min

12

0,39

i

i

FOSFOLIPASE A

!

tubo

A

cpm/ml

C/A

tubo

A

cpm/ml

C/A

H m

Co

11

0.22

4503

20468

Co =

19

0.08

1988

24850

= 5 x 10* cpm/ml tempo =15 min

12

0.50

10010

20020

9.04 x

20

0.08

2404

30050

13 14

0.49 0.46

9863 9568

20128 20865

100

15 16

0.41 0.30

- -

- -

10* cpm/ml tempo = 30 min

21 22

0.09 0.07

2516 2066

27995 29514

78

23 24

0.05 0.03

1988

39760 -

Co

17

0.04

1932

48300

Co

18

0,06

1463

24383

= 7x

18

0.15

4296

10* cpm/ml tempo = 20 min

19 20

0.21 0.23

6038 5855

28640 28752 25456

= 7x

19

0.14

3051

98

21

0,16

4583

28643

10* cpm/ml tempo = 56 i

20 21

0.30 0,26

6527 5404

21792 21756 20784

77

22

0.21

3934

18733

22

0.09

2862

31800

nin

23

0,14

3051

21792

Co

17

0,07

1777

25385

Co

16

0,08

1700

21250

= 7 x 10* cpm/ml tempo = 27

18

0,16

4037

25231

19 20

0,22 0,24

5527 5800

25122 24166

89

21

0,25

4406

17624

min

22

0,21

2739

13042

= 7 x 108 cpm/ml tempo = 72 min

17

0.16

3877

24231

18 19

0,22 0,22

4334 4864

19700 22109

73

20

0,18

4048

21881

21

0,13

3335

25653

1

i

í1

|

FOSFOLIPASE A

Itubo

! A

cpm/ml

C/A

tubo

A

cpm/ml

C/A

! <=•

• 19

; J.06

1466

= 9,04x

20

0.09

2594

24433 28822

Co

13

0.06

1332

= 9.04x

14

0.09

2227

22200 24744

10* cpm/ml tempo = 75 min

21 22

0.11 0.11

2925 2541

26590 23100

69

23

0,08

1883

23573

24

0.06

1356

22600

10* cpm/ml tempo = 140 min

15 16

0.10 0.08

2333 1791

23330 22387

69

17

0.04

1095

27375

18

—

—

-

Co

18

0,04

1171

= 9.04x

19

0.06

1518

27880 25300

Co

20

0.17

4326

= 7.42 x

21

0.28

6032

25447 21542

10* cpm/ml tempo = 90

20 21

0.06 0,06

1950 1680

29545 26350

70

22

0.07

1761

25157

108 cpm/ml tempo = 150

22 23

0,23 0.23

5689 4946

24734 21504

71

24

0,19

4060

21368

min

23

0.06

-

-

min

25

0.15

3090

20600

Co

20

0,06

1516

25266

Co =

19

0,14

2889

20635

= 7 x 108 cpm/ml tempo = 102 min

21

0,15

3331

22206

7,42 x

20

0,23

5515

23978

22 23

0,21 0,23

4576 4530

21790 19695

74

24

0.23

4939

21473

10s cpm/ml tempo = 240

21 22

0,31 0,30

6303 6182

20336 20606

70

23

0,23

4970

21608

25

0,18

3714

20633

min

24

0,15

2796

18640

FOSFOLIPASE A8

tubo

í A

cpm/ml

C/A

H m

C o =

7

0.06

1287

21450

7.42 x

8

0.57

11859

20805

10* cpm/ml tempo = 300 min

9 10

0.47 0.14

9716 2828

20672 20200

70

11

0.04

-

-

12

0.03

-

-

Co =

11

0.14

2701

19292

7,42 x

12

0,22

4587

20850

108 cpm/ml tempo = 360 min

13 14

0,25 0,19

5416 3542

21664 18642

69

15

0,14

3016

21542

16

0,10

-

-

Co =

20

0,15

10051

67006

7,42 x

21

0,25

4614

18456

10* cpm/ml tempo = 420

22 23

0,28 0.29

5477 5078

19560 18135

64

24

0,21

3884

18495

min

25

0,18 •

2857

15443

tubo

A

cpm/ml

C/A

18

0.04

821

20625

5,25x1

19

0.06

960

16000

IO* cpm/ml tempo = 1110 min

20 21

0.05 0,05

798 831

15960 16620

69

22 23

0.03

473

15766 -

C o =

17

0,06

855

14250

5,25 x 10* cpm/ml tempo = 1200 min

18

0,08

1256

15700

19 20

0,07 0,07

1037 1013

14814 14471

68

21 22

0,03 0,02

- -

- -

Co

20

0.19

2852

15010

= 7x 10'

21

0,20

3653

18265

cpm/ml tempo

22 23

0,23 0,17

4204 3016

18278 17976

64

= 1440

24

0,12

2325

19375

min

25

0,08

1683

21037

FOSFOLIPASE A

tubo

A

"t

19

0.06

• 5.52 x

20

0.08

10* cpm/ml tempo = 1470 min

21 22

0.08 0.06

23

0.04

24

0.03

C o

19

0.11

= 7x 10"

20

0,20

cpm/ml

21

0.23

tempo

22

0,25

= 1500 min

23 24

0,18 0,14

C o

19

0,03

*7x1Q*

20

0,06

cpm/m

21

0,07

tempo

22

0,07

= 1800

23

0,06

min

24

0,05

cpm/ml i

C/A

- . !

1127

18783

1059

13237

1098 927

13725 15450

62

595

14875

422

14066

1093

15390.

3879

19395

3464 4093

15060 16372

58

2790

15500

1990

14214

709

23633

1116

18600

1411 1337

20157 ^9100

60

1128

18800

1049

20980

CROTAPOTIN

1tubo

í A

cpm/ml

1 C/A

co

17

0.20

12789

63945

= 5.57 x

18

0.26

12777

49142

10* cpm/ml tempo = 1

19 20

0.22 0.14

10333 6444

46968 46028

85

21

0.08

3645

45562

min

22

0.04

2506

62250

co

12

0.15

7227

48180

= 5.73 x

13

0,25

12949

51796

10* cpm/ml tempo = 2

14 15

0.30 0.25

14811 12880

49370 51520

83

16

0.13

8960

68923

min

17

0,08

-

-

co

21

0.06

1708

28466

= 8,3Jx

22

0,06

2809

47150

10* cpm/ml tempo = 5

23 24

0,10 0,08

4500 3838

45000 47975

54

25

0,07

3309

47271

min

26

-

-

-

; tubo

A

cpm/ml

C/A

co

18

0.04

674

16850

= 6.31 x

19

0.05

1060

21200

10* cpm/ml tempo = 10 min

20 21

0.05 0.04

954 846

19080 21150

30

22 23

0.03

557

18566 -

co

20

0,07

2740

38055

= 8.33x

21

0.15

3593

23953

10* cpm/ml tempo = 30 min

22 23

0.16 0.16

3916 3426

24123 21412

27

24

0.13

2887

?1385

25

0,09

2.22

22574

co

19

0,02

560

28000

= 6,31 x

20

0,05

791

15820

10* cpm/ml tempo = 60

21 22

0,04 0,04

676 615

13520 15375

23

23

0,03

419

13966

min

24

-

-

-

CROTAPOTIN

tub»

!

cpm/ml

C/A

co =

17

0.08

1617

20212

«.33 x

18

0.16

3228

20175

10* cpm/ml tempo = 90 min

19 20

0.23 0.19

4320 3261

18782 17163

22

21

0.10

1875

18750

22

0.04

1006

25150

co =

20

0.10

1726

17260

8.33 x

21

0,12

2132

17766

10s cpm/ml tempo = 120

22 23

0.13 0.12

1834 2101

14107 17508

20

24

0.11

1709

17354

min

25

0,10

1770

17700

Co =

16

0.09

1527

16966

8.33 x

17

0,10

1494

14940

108 cpm/ml tempo =170 min

18 19

0,08 0.07

1257 1230

15712 15375

18

20 21

0,06

937

15616 - f

tubo

A

cpm/ml

C/A

M m

Co

20

0.08

411

5137

= 6.85x

21

0.12

1275

10BI'S

10* cpm/ml tempo-210 min

22 23

0,11 0.10

1315 1122

11954 11220

16

24

0.09

878

9755

25

0.05

565

11300

Co

17

0.06

537

8950

= 6.85x

18

0.08

749

936?

10s cpm/ml tempo = 240

19 20

0,09 0,09

922 997

10244 11077

15

21

0,08

776

9700

min

22

0,07

503

7185

Co =

17

0,09 ,

1461

16233

8,33 x

18

0,14

1752

1k514

10s cpm/ml tempo = 270 mini

19 20

0,15 0,14

1969 2078

13126 14842

15

21

0,12

1496

12466

22

0,07

918i

13114

2CROTAPOTIN

I' tubo

A

cpm/ml

C/A

H m

1

c.-

14

0.11

1548

14072

8.33 x

15

0.17

2394

14082

10* cpm/ml tempo = 300 min

16 17

0.19 0.09

2619 1342

13784 14911

16

18

0.07

410

5857

19

0.05

342

6840

Co =

16

0,03

239

7966

6.31 x

17

0.05

447

8940

10* cpm/ml tempo = 410

18

0.04

372

9300

19

0.05

446

8920

15

20

0,04

203

5075

min

21

0,04

193

4825

Co =

17

0.04

249

6225

6,85 x

18

0.08

253

3162

10* cpm/ml tempo = 1320 min

19

0.10

281

2810

20

0,12

223

1858

5

21

0,11

351

3190

22

0.08

255

3187

: tubo

A

cpm/ml

C/A

C o • 6.85 x

20 21

0.08 0.10

294 381

3675 3810

10* cpm/ml tempo3 1380min

22

0.11

406

3690

23

0.10

259

2590

5

24 25

0.07

258

3685

Co =

16

0.09

222

2466

6.85 x

17

0.10

267

2670

10* cpm/ml tempo

18

0,11

288

2618

19

0.09

185

2055

4

= 1440 min

20 21

0.06

149

2483

CROTAMINA - 2 horn d* Incubaçio a 70°C

tubo

A

i cpm/ml

C/A

1

tubo

A

cpm/ml

C/A

C = 9.01 xO

20

0.11

2111

19190

21

0.14

2846

20328

C o = 9.01x

16

O.OS

945

18900

17

0.13

2425

18653

1C* cpm/mi tempo = 7

22 23

0.16 0.10

3287 2055

20543 20550

29

24

0.07

1484

21200

min

25

0.03

892

29733

10s cpm/ml tempo = 55 min

18 19

0.17 0.17

3075 3061

18018 18005

26

20

0,08

1804

22550

21

0.07

164c

23514

Co

13

0.02

-

-

Co

20

0.03

1130

37666

= 9.01 x

14

0.13

2801

21546

= 9.01 x

21

0.09

1772

19688

10s cpm/ml tempo = 15 min

15 16

0.13 0.08

2731 1617

21007 20212

29

17 18

0.03

792

26400 -

10s cpm/ml tempo = 88 min

22 23

0,14 0.12

2918 2546

20842 19584

30

24 25

0,10

2040

20400 -

20

0,06

1302

21700

C =o

18

0,10

1818

18180

= 9,01 x

21

0,10

2045

20450

= 9,01 x

19

0,16

2961

18506

10" cpm/ml tempo = 48

22 23

0,11 0.11

2273 2187

20663 19881

28

24

0,10

2000

20000

10* cpm/ml tempo = 97

20 21

0,16 0.Í1

2657 1990

14731 18090

25

22

0,05

948

18960

min

25

0,06

1608

26800

min

23

0,03

777

22852

CROTAMINA - 2 hom d* Incutucio • 70°C

' tubo

A

cpm/ml

C/A

Co

13

0.11

1998

18163

= 3.93x

14

0.18

3316

18422

10* cpm/ml tempo = 1

15 16

0.30 0.36

5210 6090

17366 16916

58

17

0.40

6907

17267

min

18

-

—

—

Co

20

0.12

2163

18025

= 5,O4x

22

0.46

8589

18671

10* cpm/ml tempo = 5 min

23 24

0.57 0.59

10173 10806

17487 18315

47

26

0.35

6479

18511

27

0,22

3917

17804

V19

0,46

8261

17958

= 5,76 x

20

0,59

10243

17361

10* cpm/ml tempo = 10

21 22

0,61 0,45

10210 7786

16737 17302

39

23

0,34

5625

16544

min

24

0,25

4110

16440

tubo

A

cpm/ml

C/A

Hm

24

0.10

1222

12220

9.01 x

25

0.12

786

6550

10* cpm/ml tempo = 1490 min

26

0.13

593

7561

27

0.11

683

6209

S

28

0.07

471

6728

29

0.04

272

6800

19

0.07

486

6942

9.01 x

20

0.12

915

7625

10* cpm/ml tempo = 1550 min

21

0,15

975

6500

22

0,15

1117

7446

10

23

0,11

803

7300

24

I0,07

611

8728

CROTAMINA - 2 horas dt Incubaçio • 70°C

tubo

A

cpm/ml

C/A

Co = 9 ,0 ix

23 24

0.11 0.12

1720 1962

15636 16350

10a cpm/ml tempo = 120 min

25 26

0.11 0.09

2305 1517

20954 16855

23

27

0.07

1138

16257

28

0.04

770

18333

co =

19

0.05

1021

20420

= 9.01 x

20

0,10

1534

15340

10* cpm/ml tempo = 180

21 22

0.11 0,10

1604 1671

14581 16710

22

23

0,08

1557

19462

min

24

0.05

768

15360

co =

19

0.05

615

12300

= 9,01 x

20

0,10

1343

13430

10* cpm/ml tempo = 345

21 22

0,20 0.10

2425 1487

12125 14870

18

23

0,09

1040

11555

min

24

0,04

-

-

•

tubo

A

cpm/ml

C/A

C o =

21

0.06

816

13600

9.01 x

22

0.08

1069

13237

10* cpm/ml tempo = 410 min

23 24

0.10 0.11

1355 1897

13550 172*5

20

25 26

0.09

1302

14466 -

Co =

20

0.07

942

13457

9.01 x

21

0.09

1256

13955

10* cpm/ml tempo = 480

22 23

0.09 0.10

1285 1342

14277 13420

20

24

0.08

1091

13637

min

25

0.05

999

19980

Co

21

0,07

593

8471

= 9,01 x

22

0.10

873

8730

108 cpm/ml tempo = 1410 min

23

0.11

937

8518

24

0,10

1236

12360

12

25

0,08

679

8487

CROTAMINA - 18 horas d* Incubacão • 70°Cs

Co = 8.36 x 10* cpm/ml tempo = 5 min | CQ = 8.36 x 10a cpm/ml tempo = 20 min C =8,36 x 108 cpm/ml tempo = 40 min i

tubo 18 19 20 21 22 23 15 16 17 18 19 20 19 20 21 22 23 24

0.04 0.09 0.14 0,12 0.09 0.07 10.06 0.12 0,18 0,16 0.13 0.08 0,09 0,12 0,17 0,12 0,11 0,08 j

cpm/ml

C/A

"n.

670

16730

1470

16333

2225 1858

15892 15816

24

2388

25866

1795

25642

909

15150

1715

14291

2351 2502

13061 15637

24

1957

15053

872

10900

1981

22011

1S06

13383

2314

13670

21

1634

13616

1575

14318

1060

13250

tubo

A

cpm/ml

C/A

Co

17

0.12

1180

9833

= 8.39 x

18

0.27

3445

12759

10s cpm/ml tempo = 55 min

19 20

0.20 0.15

2570 1851

12850 12340

19

21

0.08

829

10362

22

0.05

552

11040

co

17

0,08

1660

20750

= 8,36 x

18

0,14

1783

12735

108 cpm/ml tempo = 60

19 20

0,17 0,16

2238 2693

13164 16831

21

21

0,12

1778

14816

min

22

0,07

1026

14657

co =

21

0,06 .

644

10733

8,39 x

22

0,11

1104

10036

108 cpm/ml tempo = 150

23 24

0,13 0,13

1406 1321

10815 10161

16

25

0,14

1492

10657

min

26

0,11

-

-

CROTAMINA - 18 hora de Incubarão a 70°C

tubo

A

cpm/ml

C/A

H m

tubo

cpm/ml

C/A

Co =

17

0.06

1006

17100

14

0.08

1235

15437

8.39 x

18

0.15

1472

9813

8.39 x

15

0.12

1055

8791

10* cpm/ml tempo =165 min

19

0.20

1986

9930

20

0.18

1900

10555

15

21

0,11

1121

10190

22

0.06

588

8966

10* cpm/ml tempo = 220 min

16

0.13

1121

9623

17

0.12

1082

9016

13

18

0.10

807

8070

19

0.09

893

9922

Co =

17

0,12

1677

13985

Co =

18

0.07

722

10314

8,36 x

18

0.19

2115

11131

8.36 x

19

0,10

1486

14860

10* cpm/ml tempo = 180

19 20

0,17 0,14

1811 1478

10652 10557

17

21

0,06

972

16200

10* cpm/ml tempo = 240

20 21

0.14 0,13

1808 1497

12914 11515

16

22

0,11

1358

12345

min

22

0.05

872

17740

min

23

0,09

850

10625

Co =

24

0,12

1201

10008

Co =

23

0,10

968

9680

= 8,39 x

25

0,13

1658

12753

= 8.39 x

24

0.14

2044

14600

10* cpm/ml tempo = 210 min

26

0,14

1344

9600

1

27

0,12

1230

10250

5

28

0,09

916

10177

29

0,07

744

10628

IO8 cpm/ml tempo = 260 min

25

0,13

1515

11807

26

0,13

1384

10646

15

27

0,12

1149

9575

28

0,09

854

9488

I

j

j

I

CROTAMINA - 18 hom de Incubaçfo • 70 C

1 1

tubo í

! A :

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i H- í

Co = 8.36 x

19 20

0.11 0.18

1151 1917

10463 10650

10* cpm/ml tempo = 270 min

21 22

0.20 0.15

2092 1819

10460 12126

16

23 24

0.10

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: 8,36 X

16

0.14

1538

10985

IO8 cpm/ml tempo = 290

17 18

0,15 0,16

1611 1773

10740 11081

16

19

0,12

1730

14416

min

20

0,09

1611

17500

co =

20

0,11

739

6718

8,36 x

21

0,12

726

6050

10* cpm/ml tempo = 1380 min

22

0,12

636

5300

23

0,09

608

6755

10

24

0,08

483

6037

25

0,05

263 !

5260 I

tubo

í A

cpm/ffil

C/A

Co =

10

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6500

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11

0.18

1274

7077

10* cpm/ml tern

12

0.24

1544

6433

13

0.19

1220

6421

10

po- 1440 min

14

0,10

1138

11380

15

0.04

707

1767S

71

APÊNDICE 2

O Apêndice 2, contém os parâmetros obtidos pela computação dos dados experimentais do n?de H/mol de cada proteína.

Os ajustes foram alcançados num Computador IBM/370, modelo 155 do Centro deProcessamento de Dados do IEA, atrave's um programa denominado SAAM (Simulation, Analysis andModeling) na versão n? 25, desenvolvido pelo National Institutes of Health no Laboratory of TheoreticalBiology por Mones Berman e Marjory F. Weiss.

72

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ABSTRACT

Phosphohpase A, Crotapotin and Crotamine mere purified from the venom uf Crotalus duritsut terrificui Tfw

aminoacid ramposttton» oi (Hottms shovwd rrtolecular weigths. 13400 ft» Phfupliiilip/w A, 8300 fer GreMpotin andAnnr>it%K rtntnniinr I M W ) Seph.idex gel filtration (G 1ft tine) Experiment», stable complex is formed by interaction

_ o - . l t - A - •.-.-. *f - • *v

(1:1 molar i.niul of Phospholip.i» A ILDj-f, 0,5b mg/Kg), in mice) and Crotapotin, Heoomoiimlion of Crotapotin

with Phospholip.K» A in 1:1 molar ratio, increase»», ttie toxicity of Phospholipase A appuMtimatety 10 fold to

LDe- - 0 , 0 5 mg/Kg. These facts indicate Crotoxin as a product of 1:1 molar ratio interaction of Crotapotin and

Phospholip.ise A, Ffemf Sephadex gel filtration (fr?6 f?rre) •xpemnems, unstable complex is formed by interaction of

Crotapotin and Crotamine ILD^-j ~0 ,8 mg/Kg, in mice), The-"m vitro" combination of Crotapotln and Crotamine tiTim " ' a r rf l l '"4 inueasi«^the toxiritv of Crotamine approximately 4 fold to L D c r i

= 0,2 mg/Kg. In pro f in

tritium-hydrogen exchange experiments, the back exchange kinetic of^tritium labelled o^"Mphff"p^y *w rririapntitr.

Cretamirra and C»oto»tn were measured in gel filtration columns of Sephadex G 25 "coarse'V Thy- best fit o f

experimental data of H/T exchange of Phospholipase A tbet>» two clearly distinguishable kinetic classes of

exchangeable hydrogens. From the exchangeable hydrogens only 68% were rapidly exchanged and the occurrence of

hydrogens envolver! in alpha-helix was practically absent. The Crotapotin has no hydrogens of alpna-helix and 83% of

exchangeable hydrogens were rapidly exchanged with solvitnt. The H/T exchange ki íetics of Crotanine^after a initial

heating in trmau'd water at 70.C for 1 imun.showedjthat 31% qf exchangeable hydrogens were slowly exchanged with

mlvent, \neteaimg trte intitai hratinij-W^ 18 hours, ma rawwbet of iloi»ly ewehangina pcotont diminished for 11%.

Fitting- corves of mperimentsi dattt o4 H/T exerianrjo o) Crotoxin showed three exponential classes of exchangeable

hydrogens and about 26 protons have alpha-helix characteristic exchange rate. These tactl suggest £ possibl*

conformational change after Phospholipas* A-Crotapotin interaction^-1 . ' . v / < ; <J.*_ : •( .

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