UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE ODONTOLOGIA

BRENDA ZULIAN DE LIMA

VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR

DE UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM

CALOTA CRANIANA DE RATOS

Itajaí, (SC) 2011.

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BRENDA ZULIAN DE LIMA

VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR

DE UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM

CALOTA CRANIANA DE RATOS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de cirurgião-dentista do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí. Orientador: Prof. David Rivero Tames

Itajaí, (SC) 2011.

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BRENDA ZULIAN DE LIMA VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR DE UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM

CALOTA CRANIANA DE RATOS

O presente Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de cirurgião-dentista do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí, aos 20 dias do mês de setembro do ano de dois mil e onze, é considerado aprovado.

1. Prof. Dr. David Rivero Tames___________________________ Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) 2. Prof. Dr. Telmo José Mezadri ___________________________ Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) 3. Prof. Msc. João Carlos Müller Filho ______________________ Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)

[Digite uma citação

3

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais em primeiro lugar, que se doaram inteiros e

abdicaram dos seus sonhos para tornar realidade os meus, pelo amor, carinho,

dedicação e compreensão em alguns momentos, por terem me dado o dom da

vida e me ensinado tudo o que precisei para estar aqui hoje, vencendo mais

uma batalha, conquistando um sonho.

A minha irmã Bêtania Zulian de Lima por me ensinar outra forma de

amor, que jamais imaginei sentir.

Aos meus dindos Elisa e Raphael Deluchi, aos meus primos Leonardo e

Rafaele Deluchi pelo carinho, amizade, pelos momentos de alegria

proporcionado e por estarem ao meu lado durante esta jornada.

Ao professor David Rivero Tames por sua paciência, dedicação,

empenho, e pela orientação durante todo o trabalho.

As funcionárias do laboratório Beatriz, Maria e Vanessa, pela ajuda,

momentos de risada, por tornarem minhas idas ao laboratório mais felizes.

Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, me ajudando,

apoiando, escutando e dando forças para a conclusão deste trabalho.

Muito obrigada a todos.

Brenda Zulian de Lima

Agradeço á minha família pelo apoio e perseverança em todos os

momentos.

Agradeço ao professor David Tames pela pessoa extraordinária que é.

Aos amigos e colegas que tornaram o convívio diário mais alegre.

As funcionárias do laboratório pela dedicação e ajuda no nosso trabalho.

A todos àqueles professores que passaram seus ensinamentos com

amor e dedicação.

Vanessa Rodrigues Fernandes

[Digite uma citação do

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“Sonhe com o que você quiser. Vá para onde você queira ir. Seja o que você quer ser, porque você possui apenas uma vida

e nela só temos uma chance de fazer aquilo que queremos. Tenha felicidade bastante para fazê-la doce. Dificuldades

para fazê-la forte. Tristeza para fazê-la humana. E esperança suficiente para fazê-la feliz."

Clarice Lispector

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ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR DE UMA C HALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM CALOTA CRANIANA DE RATOS

Brenda Zulian De LIMA e Vanessa Rodrigues FERNANDES Orientador: Prof. Dr. David Rivero TAMES Data de defesa: Setembro de 2011

Resumo:

Com o objetivo de acrescentar dados ao estudo prévio que sugeriu a existência de potencial osteogênico da Chalcona em feridas críticas de calota craniana de ratos, este estudo foi conduzido para observar a possibilidade do reparo completo da ferida crítica no mesmo modelo de estudo. Com esta finalidade foram realizadas feridas críticas de 5mm de diâmetro, no osso parietal direito de 20 ratos fêmeas. Dentre estas, 10 foram tratadas com aplicação única de Chalcona sintética (grupo experimental) e as outras 10 feridas não foram tratadas (grupo controle). Após 48 dias os ratos foram sacrificados para posterior confecção das lâminas para análise em microscopia de luz transmitida da área da ferida craniana, a fim de se observar a morfologia tecidual. Na análise microscópica, o grupo tratado com Chalcona mostrou em 9 feridas reparo total e em um caso uma pequena área remanescente da ferida. No grupo controle o reparo não foi significativo em todas as feridas. Os dados obtidos permitiram concluir que a Chalcona possui potencial osteogênico capaz de promover o reparo total de feridas críticas. Entretanto é necessário mais estudos com a finalidade de indicar seu uso clínico.

Palavras- chave: Chalcona, Ferida crítica, Plantas medicinais, Reparo ósseo.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 07

2 REVISAO DE LITERATURA.................................................................. 08

3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 20

3.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS.................................................... 20

3.2 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS................................................ 21

3.3 ANÁLISE QUANTITATIVA................................................................. 21

3.4 ANÁLISE QUALITATIVA.................................................................... 22

4 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS............................................... 23

5 DISCUSSÃO.......................................................................................... 27

6 CONCLUSÃO........................................................................................ 32

7 REFERÊNCIAS .................................................................................... 33

7

1 INTRODUÇÃO

O ganho de volume ósseo ou reparo de feridas traumáticas extensas

com impossibilidade de reparo espontâneo, tem sido uma das preocupações

de especialidades odontológicas como periodontia, implantodontia e cirurgia

bucomaxilofacial.

Com esta finalidade são realizados inúmeros procedimentos, tais como

homeotransplante, heterotransplante, implantes de substâncias químicas

inorgânicas e/ou orgânicas. Apesar da existência de investigações com plantas

medicinais, relatando sua capacidade indutora de reparo tecidual, se conhece

pouco sobre seu uso no reparo de feridas ósseas. Neste contexto, as

propriedades antibacterianas, antioxidantes, antitumorais, e antiinflamatórias já

divulgadas da Chalcona, que são compostos da via de biossíntese dos

flavonóides extraídos de caules e de todos os tipos de flores, permitem sugerir

uma possível ação no reparo tecidual (BANDGAR, et al 2010; CHIARADIA, et

al 2008; KIM, et al 2007); entretanto, a literatura não relata dados sobre seu

potencial indutor de osteogênese e, portanto, se faz necessário a realização de

experimentos que confirmem ou não esta indicação (TRAN, et al 2009).

Um dos modelos mais utilizados para estudar o potencial indutor de

reparo ósseo é o da ferida crítica, que consiste em promover uma ferida cujas

dimensões não permitem seu reparo espontâneo e completo (HONMA , et al

2009), assim, o modelo permite estudar, com relativa segurança, a capacidade

de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas de induzir o reparo ósseo quando

implantadas dentro delas.

Desta forma, o estudo do potencial indutor de reparo ósseo em feridas

críticas de calota craniana em ratos, poderá fornecer dados importantes para

várias especialidades da área de conhecimento da Odontologia. Por isso, o

objetivo deste trabalho foi estudar o potencial osteogênico indutor e condutor

da Chalcona e verificar o comportamento celular, a qualidade do tecido ósseo

formado e a provável redução total do tamanho da ferida.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

Ripamont e Reddi (1992) explicaram que a matriz óssea

desmineralizada possui potencial na neoformação óssea. Este estudo procurou

descobrir novos agentes reguladores e com potencial terapêutico. Foram

usados 48 babuínos adultos machos, com uma ferida crítica de 25mm de

diâmetro no crânio. Foram feitos enxertos autógenos provenientes do ilíaco

incluindo matriz extracelular e a proteína osteogênica isolada e purificada da

matriz óssea. Os autores concluíram que a proteína osteogênica tem potencial

para diferenciação em osso endocondral, o que evidencia sua aplicação

terapêutica para reconstrução de osso humano.

Peng et al. (2002) analisaram a interação entre o fator angiogênico

VEGF e o fator osteogênico BMP4 durante os processos de regeneração e

formação óssea utilizando células tronco derivados de tecido muscular e

geneticamente manipulados para expressar BMP4 e VEGF. Para tanto usaram

feridas críticas na calota craniana de 24 camundongos machos com 12

semanas de idade, divididos em 3 grupos: Feridas tratadas com células tronco

expressando somente BMP4 (N=8), expressando BMP4 e VEGF (N-8) e

controle tratado com VEGF acoplado a um inibidor específico (N=8). Seis

semanas após o implante, as observações radiológicas mostraram que as

feridas tratadas somente com BMP4 e BMP4 + VEGF estavam totalmente

fechadas sendo que o volume e a densidade óssea foram maior no grupo

tratado com BMP4+VEGF; no grupo controle não houve nenhuma formação

óssea. Estes resultados foram confirmados pelas análises histológicas que

mostraram uma união completa dos defeitos ósseos e nenhum reparo ósseo

no grupo controle. Este estudo abre caminhos para pesquisa de novas

estratégias de estimulação de cicatrização óssea baseado na terapia celular e

genética.

Balooch et al. (2005) com a finalidade de identificar fatores que regulam

a massa óssea e a arquitetura da matriz óssea, com métodos de alta resolução

para propriedades biomecânicas e de imagem, investigaram o papel das

sinalizações do TGF-β na regulação da composição e propriedades mecânicas

da matriz óssea independentemente de seus efeitos sobre massa óssea e

arquitetura . Essas propriedades da matriz óssea foram avaliadas utilizando

9

camundongos transgênicos (3 por grupo estudado) com alterações na

sinalização de TGF em seus osteoblastos. Os fenótipos utilizados foram D4,

D5, DNTβRII. Neste modelo de estudo os autores observaram que a redução

dos níveis de sinalização do TGF-β, através do seu efetor intracelular Smad3,

aumenta as propriedades mecânicas e a concentração de mineral da matriz

óssea, bem como a massa óssea, melhorando a resistência do osso à fraturas.

Assim, com os resultados obtidos concluíram que as propriedades da matriz

óssea são controladas pela sinalização de fatores de crescimento.

Gómez et al. (2006) avaliaram o reparo ósseo em feridas críticas de

6mm em calotas cranianas de 18 ratos, usando Fator de Crescimento derivado

de Fibroblastos (FGF-1) contido numa membrana biodegradável de poly-L/D-

lactide (PLDLA). Os animais foram divididos em três grupos: 1) grupo controle

sem tratamento, 2) só a membrana e 3) membrana com FGF-1.

Radiograficamente, a forma da ferida do grupo controle mudou da forma

redonda para oval e nos demais grupos esta se apresentou redonda com

bordas irregulares. Histologicamente, após 8 semanas, os exames revelaram

que nos grupos 1 e 2 houve pouco ou nenhum pré-osso, enquanto que no

grupo 3 houve pouca ou moderada formação de osso. Concluíram, portanto,

que não houve benefícios no reparo ósseo com a combinação do FGF-1 e

poly-L/D-lactide (PLDLA).

Kneser et al. (2006) com a finalidade de estudar o potencial osteogênico

do osso esponjoso bovino processado (PBCB), em feridas críticas de calota

craniana de ratos, implantaram discos de osso esponjoso bovino recobertos

com complexo de gel de fibrina e osteoblastos (N=40), ou sem osteoblastos

(N=28). Feridas não tratadas serviram como controle (N=28). As análises

histológica e morfométrica mostraram que um mês após os implantes a

formação óssea esteve limitada a pequenas áreas periféricas. Dois e quatro

meses após houve formação expressiva de osso nas feridas que receberam os

implantes, bem como reabsorção de matriz e integração do implante com o

tecido receptor. No grupo controle não houve regeneração significante nas

feridas críticas. A análise morfométrica não evidenciou diferenças na formação

de osso entre os grupos que receberam implantes (com e sem osteoblastos).

Sugerindo que o osso esponjoso bovino é um biomaterial com potencial indutor

de reparo de feridas críticas de calota craniana.

10

Mankani et al. (2006) estudaram o potencial osteogênico de células da

medula óssea, previamente cultivadas, transplantadas em feridas críticas na

calota craniana de cães. Para tanto realizaram duas feridas críticas com 35 mm

de diâmetro na calota craniana de cada um dos 6 cães, numa das feridas foi

implantado uma mistura de células e partículas de hidroxiapatita e fostato

tricálcico e na outra as mesmas partículas misturados com o meio de cultura

utilizado para as células. Dois e três meses após os transplantes, de três cães

em cada período, foram obtidas biópsias e processadas pela técnica

histológica para análise histomorfométrica em microscópio. Os resultados

mostraram que as feridas tratadas com a mistura de células do estroma da

medula e partículas de hidroxiapatita e fosfato tricálcico tiveram formação de

quantidades significativas de osso novo enquanto que as tratadas somente

com as partículas mostraram tecido fibro-vascular rodeando estas partículas e

sem formação de osso novo.

Werkman et al. ( 2006) estudaram feridas críticas de tíbias de ratos com

osteoporose (1 mês após castração). Foram utilizados 4 grupos de 21 animais,

sendo 3 grupos submetidos à castração e um grupo a falsa cirurgia. Os animais

foram tratados com risedronato (medicamento alopático) e com calcárea

fosfórica 6CH (medicamento homeopático). Aos 7, 14 e 28 dias após iniciado o

tratamento medicamentoso os ratos foram sacrificados e as tíbias foram

removidas. Radiografias digitais foram realizadas e avaliadas para obter a

densidade óptica na área do defeito. Em seguida, foram descalcificadas e

processadas para análise histológica e histomorfométrica. Os resultados

mostraram que, no 7º dia em todos os grupos, um grande calo ósseo de osso

trabeculado foi formado; no 14º dia a reabsorção do calo foi menor nos animais

tratados com risedronato e calcárea fosfórica e no grupo controle não castrado

foi mais intenso; no 28º dia o risedronato promoveu um reparo com muito osso

trabecular estendendo-se para a medula; o grupo tratado com calcárea

fosfórica mostrou um reparo formado por delgada camada de osso compacto;

os animais controle mostraram um reparo com osso esponjoso contendo

pequenas áreas de osso compacto. Os autores concluíram que os tratamentos

com medicamentos alopáticos e homeopáticos conduzem reparos com

qualidade diferente de osso.

11

Chu et al. ( 2007) concluíram que o tratamento de defeitos ósseos

provenientes de traumas ou outras injúrias tem sido um desafio clinicamente

importante, pois o osso não cicatriza espontaneamente, necessitando de

enxerto. Devido às limitações encontradas nos enxertos ósseos autólogos e

alogênicos, há necessidade de alternativas para o tratamento de defeitos

ósseos, como técnicas de engenharia tecidual. Sabendo da capacidade

osteoindutora da BMP-2 pelo processo endocondral, observaram a

necessidade de uma estrutura biocompatível e reabsorvível onde possa ser

facilitada a retenção da BMP-2 no local de tratamento e, assim, reduzir rejeição

tecidual e exposição. Este estudo propõe uma estratégia de engenharia

tecidual usando a rhBMP-2 contida numa matriz biodegradável. Com esta

finalidade foram confeccionadas matrizes com um compósito de polipropileno

fumarato + fosfato tricálcico e adicionadas de rhBMP-2 + dicálcio fosfato

desidratado (DCPD) para o grupo experimental e matrizes semelhantes

adicionadas somente com dicálcio fosfato desidratada (DCPD) para o grupo

controle. As matrizes foram implantadas e estabilizadas em defeitos ósseos no

fêmur de 24 ratos machos divididos em dois grupos, radiografados e

sacrificados após 6 e 15 semanas. Avaliação histológica e tomografia

computadorizada foram realizadas. O grupo com BMP mostrou efetividade na

regeneração óssea; já o grupo controle, após 15 semanas, não mostrou reparo

ósseo significante. Os autores concluíram que as matrizes contendo BMP-2

promoveram reparo significantemente maior.

Marzouk et al. (2007) estudaram o potencial osteogênico de

microesferas de vinil estireno como agente carregador de fator de crescimento

derivado de plaquetas. Para tanto, feridas críticas na calota craniana de 73

ratos foram realizados e os animais foram divididos em quatro grupos: grupo

controle, grupo com microesferas de vinil estireno (VSM), grupo com fator de

crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB), e grupo com VSM e PDGF-BB.

Os animais foram sacrificados 2, 4 e 16 semanas após a cirurgia. Nas feridas

tratadas somente com as microesferas ou misturadas com fator de crescimento

derivado de plaquetas, houve um preenchimento estatisticamente maior da

ferida do que os grupos sem VSM em todos os tempos pós-cirurgia. Nas

análises radiográficas, o grupo VSM/PDGF mostrou menor volume ósseo

quando comparado com os outros grupos, exceto quando comparada com a

12

quarta semana do grupo VSM. E o grupo PDGF mostrou possuir o maior

volume ósseo, menos quando comparado com a quarta semana do grupo

VSM, mostrando que o VSM com PDGF não é capaz de melhorar a

capacidade de regeneração óssea quando comparada com o VSM sozinho.

Por et al. ( 2007) estudaram a melhor combinação de biomateriais com

potencial osteogênico já conhecido na reconstrução óssea em feridas críticas

em calota craniana de cães. Foram utilizados 6 grupos de 3 cães com a ferida

crítica de 6x2 cm na calota craniana. O material biológico utilizado no estudo

foi: biópsias de matriz óssea submetidas à desmineralização (DBM), rhBMP2

(proteína morfogenética óssea recombinante humana) e plasma autólogo

enriquecido com plaquetas (PRP); também foram utilizadas placas de cromo-

cobalto e material reabsorvível para fixação óssea comercialmente obtidas. As

misturas de biomateriais colocadas nas feridas críticas foram: DBM+metal,

DBM + PRP + metal, DBM + PRP + placa reabsorvível, DBM + rhBMP2 +

metal, DBM + rhBMP2 +PRP + metal, DMB + rhBMP2 + placa reabsorvível. Os

animais foram sacrificados 3 meses após a cirurgia. Os resultados foram

obtidos por meio de análises macroscópicas, histológicas e com tomografia

computadorizada. Somente no grupo com rhBMP2 foi observada uma completa

regeneração óssea. O grupo livre de rhBMP2 teve mínimo crescimento ósseo

na borda do defeito e na duramáter, o que foi confirmado pela tomografia

computadorizada e histologicamente. No grupo PRP não teve regeneração

óssea. Os autores chegaram à conclusão que o rhBMP2 promoveu reparo

mais acelerado do que o PRP, e o DMB misturado com rhBMP2 foi substituído

por novo osso trabeculado.

Kamakura et al. (2007) implantaram discos de fosfato octacálcio +

esponja colágena porcina (OCP/Col), fosfato beta-tricálcio + compósito

colágeno (beta-TCP/Col) e hidroxiapatita + compósito colágeno (HA/Col) em

feridas críticas em calotas cranianas de ratos que foram sacrificados 4 e 12

semanas depois da implantação destes. Através de análises

histomorfométricas, histológicas e radiográficas relataram que a formação de

osso novo foi mais significante no grupo com OCP/Col do que nos grupos beta-

TCP/Col ou HA/Col. Em contrapartida, os grânulos remanescentes em

OCP/Col foram significantemente menores do que nos grupos com beta-

TCP/Col ou HA/Col. A regeneração óssea pelo OCP/Col foi baseada em

13

colágeno calcificado, enquanto isso a regeneração óssea induzida por beta-

TCP/Col ou HA/Col foi iniciada por colágeno pobremente calcificado e

osteoconduzida pelo beta-TCP ou HA. Com esses resultados concluíram que o

OCP/Col regenerou mais osso do que o beta-TCP/Col e HA/Col.

Pripatnanont et al. ( 2007) avaliaram o potencial osteocondutivo de 3

hidroxiapatitas bovinas (HA) sintetizadas em 3 temperaturas diferentes (800ºC,

1200ºC e 1350ºC). Foram preparados 2 defeitos críticos em cada calota

craniana de 10 coelhos. Nos animais controle (N=04), os defeitos foram

preenchidos com osso autógeno numa ferida e a contralateral ficou sem

preenchimento; nos outros 6 coelhos, com um total de 12 feridas, 4 foram

preenchidas com HA 800, 4 com HA 1200 e 4 com HA1350. Todos os animais

foram sacrificados 8 semanas após o implante. A neoformação óssea foi

analisada com densitometria radiográfica e histomorfometria. Os resultados da

densitometria óptica e histomorfometria indicaram que a síntese da

hidroxiapatita em temperaturas altas, aumenta o reparo ósseo, e a sintetizada

a 1200°C tende a proporcionar maior formação óssea quando comparada com

as outras duas hidroxiapatitas.

Buzzi et al. (2007) compararam a atividade analgésica das chalconas

sintéticas com a do ácido acetilsalicílico e acetaminofen, drogas analgésicas

tradicionais no uso da medicação contra dores e foi observado que as

chalconas inibiram as manifestações de dor em níveis de 84 a 94% contra 35 e

38% das drogas conhecidas.

Estudando o mecanismo da atividade antiinflamatória de Chalconas

sintéticas, Kim et al. (2007) identificaram que muitas delas, inibem a atividade

do óxido nítrico sintetizado durante a produção do óxido nítrico sugerindo a

possibilidade da utilização destas Chalconas, no desenvolvimento de novas

fórmulas medicamentosas antiinflamatórias.

Chiaradia et al. (2007) comparando a atividade inibitória do óxido nítrico

sintetizado induzido de algumas Chalconas sintéticas, com o composto 1400W,

um inibidor altamente seletivo desta enzima, constataram que o potencial

inibitório foi igual ou superior ao do composto 1400W.

Honma et al. (2008) explicaram que uma ferida óssea que não é

reparada completamente é denominada de defeito sem união ou defeito de

tamanho crítico sendo que o mecanismo biológico que regula este processo

14

não é conhecido e que por isto, estudos realizados com este modelo,

comparando o comportamento celular osteoblástico e de osteócitos, podem

proporcionar dados importantes para a pesquisa clínica sobre reparo ósseo.

Neste modelo estudaram o reparo em feridas críticas (8,8mm diâmetro) e não-

críticas (3,8mm diâmetro), em calota craniana de ratos e observaram que a

formação de osso reparador cessa dentro de 24 semanas em ambas as feridas

(críticas e não-críticas), ou seja, osteoblastos e osteócitos cessam a formação

óssea, bem como a diferenciação dos osteoblastos de células progenitoras.

Além disso, a reparação óssea procede do periósteo, localizado em ambos os

lados do osso parietal, mas não a partir da superfície do rebordo ósseo ao

redor do defeito original.

Intini et al. (2008) usou 25 ratos que foram divididos em cinco grupos,

cujas feridas críticas foram tratadas com: osso descalcificado e liofilizado

(DFDBA); proteínas derivadas de matriz de esmalte (EMD); rhBMP-2 carregado

em colágeno (controle positivo); sem nenhum material implantado (controle

negativo); e um grupo com a calota intacta. Todos os animais foram

sacrificados 8 semanas após a cirurgia e as feridas avaliadas

microscopicamente. O grupo negativo e o grupo EMD não mostraram formação

óssea no centro do buraco, mas mostraram reparação na margem da ferida.

No grupo DFDBA, grãos do DFDBA ainda estavam presentes na oitava

semana, e uma pequena quantidade de osteoindução foi vista no centro do

defeito. Diferente do rhBMP-2 que mostrou regeneração óssea por todo o

buraco, o DFDBA e EMD mostraram ter uma habilidade limitada para formar

osso, não sendo portanto, efetivos na regeneração óssea.

KHOJASTEH; ESLAMINEJAD; NAZARIAN (2008) estudaram o efeito

das células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (MSCs) na

regeneração óssea e comparam com o plasma rico em plaquetas (PRP),

quando usados juntamente com osso natural mineral (Bio-Oss) e B-TCP

(Kasios), no reparo de feridas críticas de 5 mm de diâmetro em calota craniana

de 22 ratos adultos machos, divididos em dois grupos. No grupo 1 foram feitas

duas feridas críticas, sendo adicionado o Bio-Oss+PRP em uma ferida e na

outra Bio-Oss+ células tronco mesenquimais. No segundo grupo, foi usado o

Kasios como substituto do Bio-Oss. Os ratos foram sacrificados 6 semanas

após a cirurgia e a regeneração óssea avaliada histologicamente e

15

histometricamente. Na avaliação histológica, os dois grupos apresentaram

formação óssea variáveis. No novo osso formado observaram osteócitos e

células semelhantes a osteoblastos ativos, sugerindo uma continuação de

formação óssea. Na análise histométrica, as feridas tratadas com

Kasios+MSCs mostraram maior dimensão óssea quando comparado com o

outro grupo contendo Bio-Oss. Nos dois grupos as células mesenquimais

mostraram percentual maior de formação óssea em comparação com os

grupos que continham PRP. Concluíram sugerindo que a engenharia tecidual

pode ser uma alternativa eficaz para enxertos em cirurgias orais e maxilo-

faciais.

Oliveira et al. (2008) estudaram em feridas críticas com 8mm de

diâmetro em calota craniana de 50 ratos, o potencial reparador do osso bovino

desmineralizado (DBB) e de osso autógeno (AB) implantados nas feridas, em

períodos de 7, 14, 21, 30 e 90 dias pós-cirurgia. A análise histológica mostrou

cicatrização total dos defeitos em 90 dias no grupo AB, sem alterações

marcantes durante os períodos experimentais e com melhor neoformação

óssea. No grupo DBB ocorreu a substituição do biomaterial por tecido fibrótico

no período experimental de 21 dias, uma rápida reabsorção do material

implantado e um reparo incompleto das feridas.

Park et al. (2008) efetuaram feridas críticas de 8mm de diâmetro na

calota de 75 ratos. Estes foram divididos em 4 grupos experimentais e um

grupo controle (sem tratamento). As feridas dos grupos experimentais foram

preenchidas com partículas de dentina de porco (grupo 1), o grupo 2 com uma

mistura de partícula de dentina e gesso Paris, o grupo 3 com partícula de

dentina e chitosan e o grupo 4 só com chitosan. Os animais foram sacrificados

2, 4 e 8 semanas depois da cirurgia. Todos os grupos experimentais mostraram

maior formação óssea quando comparada com o grupo controle. Todos os

grupos exibiram crescimento maior na 8o semana do que na 4o semana.

Concluiram que as feridas tratadas com a mistura de partícula de dentina com

chitosan apresentam um excelente efeito na regeneração óssea.

Öztürk et al. ( 2008) avaliaram quais os efeitos do fitoestrogeno na

cicatrização de fraturas em modelos experimentais de ratos. Utilizaram a planta

Verbenaceae, encontrada nas regiões do meio oeste e sul da Europa, que

contem os flavonóides chamados fitoestrogenos. Foram utilizados vinte ratos,

16

com os animais sedados e anestesiados foram criadas fraturas na tíbia direita e

separados em dois grupos aleatoriamente. Após o preparo do extrato da planta

Verbenaceae foi administrado na dose intramuscular de 0.75mg 5 vezes a

cada 2dias no grupo 1, em cada rato. O grupo 2 foi utilizado para controle. As

fraturas foram avaliadas semanalmente baseada no nível de fosfatase alcalina

no sangue, radiografias das extremidades e 99m-Tc MDP cintiligrafia.

observaram que a utilização de fitoestrogênios, promove melhoria na resposta

do reparo ósseo nos primeiros períodos, 7 e 14 dias pós-fratura, e que em

períodos tardios, 25 dias, não apresenta nenhuma modificação. O trabalho

conclui que o fitoestrogeno afeta positivamente a cascata de cicatrização e

futuros estudos podem ser feitos utilizando maiores dosagens do extrato

utilizado.

Porter, Rack e Popart (2009) com a finalidade de verificar o estado atual

dos estudos sobre bioengenharia de substitutos do osso, fundamentado nos

critérios de biomecânica e fisicoquímica, destacaram que vários materiais

sintéticos já foram estudados para este uso, mas devido às propriedades

fisicoquímicas, biocompatibilidade, biodegradabilidade e fixação somente as

cerâmicas e os polímeros se tornam viáveis. Porém, destacam que o desafio

ainda é encontrar um material biodegradável que funcione como entregador de

moléculas bioativas e drogas no local da injúria, e assim, acelere a cicatrização

e regeneração do tecido enquanto previne patologias. As tecnologias e

estratégias analisadas neste estudo, para o desenvolvimento de um

componente sintético capaz de reproduzir os atributos fisioquímicos do osso,

não obtiveram um tecido com engenharia que fosse ao encontro de todos os

requisitos. Entretanto, salientam que os avanços na tecnologia em calotas

ósseas sintéticas têm superado vários obstáculos, mas ainda assim existem

lacunas a ser preenchidas. Concluem que a melhor estratégia para

desenvolver calotas ósseas, vai ser aquela com abrangência interdisciplinar no

processo de desenvolvimento ósseo.

Pripatinanont, Nuntananont e Vongvatcharemon ( 2009) afirmaram que o

osso bovino desproteinizado tem sido usado em enxertos ósseos juntamente

com osso autólogo por ter características similares ao osso humano, assim

como propriedades de osteocondução e biocompatibilidade. Este compósito é

bastante usado clinicamente, pois combina as propriedades osteogênicas e de

17

osteocondução. A proporção de osso bovino e osso autólogo no compósito

podem variar. Este estudo avaliou a qualidade e a quantidade de formação

óssea usando três diferentes proporções, 1:1, 1:2 e 1:4, em defeitos na calota

de coelhos. Foram usados 15 coelhos brancos de 5 a 7 meses onde foram

feitas 2 feridas críticas na calota craniana de cada animal. Os coelhos foram

divididos em 3 grupos. No grupo 1, uma ferida foi deixada como controle e na

outra foi adicionado osso autólogo, no grupo 2, osso bovino desproteinizado e

na outra compósito com a proporção de 1:1, no grupo 3, o compósito com

proporção de 1:2 e na outra ferida 1:4. Os animais foram sacrificados após 8

semanas e avaliados radiograficamente e histomorfometricamente. Quanto à

densidade, os grupos não tiveram diferenças estatisticamente significativas.

Histomorfometricamente, os enxertos com proporções 1:1 e 1:2 são melhores

que 1:4 referente à neoformação óssea. A diferença entre os outros grupos não

pode ser demonstrada devido a grande variação de dados. No grupo em que

não foi adicionado nenhum enxerto, houve somente uma fina camada de tecido

fibroso. Neste estudo, os enxertos com compósitos mostraram-se hábeis para

promover neoformação óssea e cobrir o defeito como demonstrado

qualitativamente. As proporções 1:1 e 1:2 mostraram-se confiáveis quando

comparadas as outras proporções em termos de neoformação óssea.

Tran et al. (2009) mostraram que algumas modificações na molécula de

chalconas pode especificar uma das suas atividades biológicas, assim as

chalconas que sintetizaram, se mostraram mais efetivas como anti-

inflamatórios, inibindo a produção de prostaglandina-2, do que sua atividade

citotóxica. Apesar das várias atividades biológicas, das chalconas sintéticas,

relatadas na literatura consultada, não se encontra nenhuma relacionada com

a atividade osteogênica.

Pugalendhi et al. ( 2009) ao avaliarem a frequência de micronúcleos e

alterações em células da medula óssea, ajuda a monitorar o alto risco para o

câncer na população humana. Mutações cancerígenas induzidas em células

somáticas levam à instabilidade genética, fato considerado importante na

carcinogênese. Agentes que inibem a formação de DNA, estimulam os

mecanismos de reparo do DNA e possuem funções antioxidantes são

considerados agentes antigenotóxicos. A genisteína e a isoflavona são

produtos da soja que, experimentalmente, protegem os animais contra câncer

18

de mama e próstata. DMBA, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, são

amplamente usados para induzir genotoxicidade em medula óssea de ratos. O

DMBA é um potente carcinógeno específico que induz a mutação no DNA

através do seu metabólito ativo, o epoxido diidrodiol, o que é um passo crucial

na iniciação do câncer. Neste estudo, foi investigado o efeito da genisteína

antigenotóxica contra a genotoxicidade induzida por DMBA, analisando a

frequência dos eritrócitos policromáticos micronucleados (MnPCEs) e

citogenética de aberrações cromossômicas como end-points. O potencial

antigenotóxico da genisteína foi avaliado pela frequência de MnPCEs,

aberrações cromossômicas e pela mensuração da peroxidação de lipídios,

antioxidantes e agentes desintoxicantes em DMBA-induzida genotoxicidade,

em ratos fêmeas Wistar. Elevada frequência de MnPCEs, aberrações

cromossômicas e elevado estado de peroxidação lipídica, antioxidantes e

agentes desintoxicantes foram observados em animais tratados com DMBA.

Pré-tratamento oral com genisteína a 20mg/kg, por cinco dias, em animais

tratados com DMBA reduziu significamente a frequência de formação de

micronúcleos e anormalidades cromossômicas assim como inverteu o estado

de variacções bioquímicas. Os resultados sugerem que a genisteína tem

potente efeito antigenotóxico contra genotoxicidade induzida de DMBA.

Uprety et al. (2010) destacaram que nos últimos tempos, o interesse

pela fitomedicina vem crescendo e com isso os estudos sobre seu potencial

farmacológico. As pesquisas científicas são necessárias para avaliar as plantas

medicinais quanto seu principio ativo e bio eficácia. Dados foram coletados

através de entrevista a 50 chefes de família na região de Chilime no distrito de

Rasuwa, a fim de recolher informações sobre uso da planta, partes usadas e

modo de utilização. As ervas foram separadas em espécies e seu uso para

cada doença. Ao total 56 plantas medicinais foram identificadas em uso na

medicina de Rasuwa. Uma vasta gama de plantas são usadas para tratamento

de doenças gastrointestinais, febre, dor de cabeça, feridas, tosse. Os estudos

fitoquímicos e farmacológicos mostraram-se coerentes com a visão empírica

sobre as propriedades das plantas em 90% dos casos, mas estes estudos

mostraram-se ainda limitados para algumas espécies usadas nesta região.

Bandgar et al. (2010a) prepararam chalconas sintéticas e avaliaram seu

potencial anticancerígeno contra 5 tipos celulares de câncer; anti-inflamatória

19

e anti-oxidante. Observaram a inibição das células cancerosas humanas com

uma eficiência semelhante ou maior às obtidas por compostos conhecidos

como flavopiridol e gecitabine; a atividade antiinflamatória foi também

promissora comparando a capacidade inibitória de TNF-ά e IL-6, com

antiinflamatórios conhecidos como a dexametasona; também foi obtida

atividade antioxidante.

Bandgar et al. (2010b) observaram que as chalconas sintetizadas

mostraram atividade antiinflamatória inibindo efetivamente a atividade das

enzimas: ciclooxigenase-2, tripsina e ß-glucoronidase; sua capacidade

antioxidante foi moderada.

Nascimento e Tames (2010) estudaram o potencial osteogênico da

chalcona em feridas críticas de calota craniana de ratos, para tanto foram

utilizados 10 ratos Norvegicus albinus, fêmeas, com 60 dias de idade. Em

todos os animais sob anestesia, foram realizadas feridas únicas na calota

craniana; depois, 05 foram tratados com gel de Chalcona e 05 não foram

tratados. Trinta dias após, foram sacrificados por perfusão, sob anestesia, com

paraformaldeído a 7% em tampão fosfato. Para mensuração da área de ferida

foi utilizado o programa imagetool. As calotas foram desmineralizadas com

EDTA e preparadas para inclusão em parafina e obtenção de cortes com 7µm

de espessura e corados com H.E. Os resultados obtidos mostraram que as

feridas tratadas com chalcona tiveram uma redução significantemente maior do

que as feridas não tratadas. Os dados obtidos permitiram concluir que a

formulação farmacológica da chalcona utilizada neste estudo promove estímulo

do reparo ósseo demonstrado pela presença de osteoblastos ativos.

Batovska; Todorova. (2010) afirmaram que as Chalconas são um grupo

de compostos que são intermediários ou produtos finais na biosíntese de

flavonóides. Funcionam como substâncias defensivas, participando nas inter-

relações planta/insetos e contribuem com o potencial medicinal das plantas.

Estudos farmacológicos de várias Chalconas isoladas de plantas têm mostrado

potencial medicamentoso para tratamento de câncer, desordens virais e cárdio-

vasculares ou como ingredientes de preparados cosméticos. As Chalconas

sinteticamente derivadas podem conter um ou mais radicais aryl substituintes;

muitos desses grupos funcionais influenciam em certo grau atividades

biológicas específicas.

20

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Neste estudo foram utilizados 20 ratos, Norvegicus Albinus, fêmeas,

com idade de 45 dias, que foram divididos em dois grupos: experimental,

tratados com Chalcona ( N= 10) e controle sem tratamento (N= 10).

Em estudo prévio foi observado (Sheila e Luana, 2010) que a aplicação

do veículo da Chalcona nas feridas, trinta dias após, não promove reparo

significativo; por este motivo, no presente estudo, este grupo foi abolido.

Composição molecular da chalcona sintética.

3.1 Procedimentos cirúrgicos

Em todos os animais e sob anestesia com cloridrato de ketamina

10mg/kg, após incisão na linha média da calota craniana e rebatidos os planos

cutâneo e periosteal, foram realizadas feridas críticas, utilizando trefina com

5mm de diâmetro e sob abundante irrigação com soro fisiológico, tomando-se o

cuidado de remover somente as corticais ósseas e o diploe.

Imediatamente antes da finalização do procedimento cirúrgico e com a

finalidade de obter conforto pós-cirúrgico, foi administrado, por via subcutânea,

Bupremorfina 0,05mg/kg e repetidos a cada 12 horas durante 2 dias. Durante

todo o período experimental os animais foram observados diariamente a fim de

identificar prováveis infecções e observar as características macroscópicas do

fechamento da ferida.

21

3.2 Procedimentos histológicos

Transcorridos quarenta e oito dias da intervenção cirúrgica, todos os

animais foram sacrificados por perfusão intracardíaca sob anestesia e retirada

a área da ferida critica a ser analisada.

O material coletado foi fixado por imersão em paraformaldeído a

4% em tampão fosfato, pH 7,4 por 72 horas. Após a fixação, iniciou-se o

processo de desmineralização com EDTA a 10% em tampão fosfato,

analisando semanalmente o nível de desmineralização, utilizando uma ponta

de agulha hipodérmica e a facilidade ou não de sua penetração no osso.

Após verificar o nível ótimo de desmineralização as peças ósseas

contendo as feridas foram desidratadas progressivamente em alcoóis de

concentração crescente (70, 90 e 100%), diafanizadas com xilol e incluídas em

parafina: deste material foram obtidos cortes semisseriados (1: 10) com

espessura de 7 micrometros e corados com hematoxilina e eosina para

observar a morfologia tecidual. Estas análises foram realizadas em microscopia

de luz transmitida, sendo feita uma análise qualitativa do tecido de reparo

observando os tipos celulares e teciduais e uma análise quantitativa para

verificarmos a quantidade de osso que regenerou nesta ferida crítica.

3.3. Análise quantitativa

Para avaliar e mensurar os tamanhos de todas as feridas críticas, para

explicitar valores fornecidos macroscopicamente e para comparar as distâncias

entre as bordas do tecido ósseo de reparo, foi utilizado o programa Image Tool.

Foi a partir deste mesmo programa que se definiu uma média de 18.413,00

como total de pixels para uma área correspondente a 5mm de diâmetro (Figura

1), para posterior comparação com os demais resultados. Os dados

quantitativos obtidos foram analisados estatisticamente usando o método de

Tukey.

22

Figura1: Programa Image Tool. Ferida crítica com 5mm de diâmetro e sua conversão para pixels. 3.4. Análise qualitativa

Foi analisado, utilizando microscópio de luz transmitida, o tipo de

tecido preenchendo a área da ferida crítica tratada com Chalcona (grupo

experimental) e não tratada (grupo controle).

O projeto de pesquisa foi submetido e aprovado, pela Comissão de Ética

em Pesquisa da Univali, sob o número 342/09A.

23

4 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS

A análise macroscópica das feridas mostra que o tratamento com

Chalcona permite o reparo completo da ferida crítica (Fig. 2B); nas feridas não

tratadas na houve reparo ósseo significativo (Fig. 2A)

B Fig 2.- Macrofotografia da ferida do grupo controle (A) e experimental (B), escala em mm. Observar o fechamento completo da ferida (asterisco) tratada com chalcona (B).

Os valores médios da área da ferida, utilizando o Image Tool (Programa

com funções de análise de imagem como distância, ângulo, perímetro, área; e

medições em escala de cinza como ponto, linha e histograma estatístico),

mostrou que a ferida remanescente no grupo controle foi muito maior que a do

grupo experimental e mantém o valor da ferida original. No grupo experimental

somente em um animal remanesceu uma área muito pequena da ferida. A

análise estatística mostrou que as diferenças com o grupo experimental são

altamente significantes (P<0,005) sugerindo reparo total estimulado pela

aplicação de dose única de Chalcona nas feridas críticas (Fig 3).

* *

B

24

Fig. 3.- Gráfico das médias da área de ferida em mm². Observar que os valores médios das áreas das feridas críticas do grupo controle (2) e das feridas originais (1) sâo significantemente maiores que do grupo experimental (3).

Comparando os valores médios iniciais da área da ferida crítica

(18.413,00mm2) e os valores observados no grupo controle (18,078,00 mm2)

observou-se que houve um reparo espontâneo porém insignificante no grupo

controle.

As análises histológicas mostraram que o reparo nas feridas tratadas

com Chalcona foi com tecido ósseo de aparência esponjosa em toda sua

extensão (Fig 4), nas feridas controle se observou a presença de tecido

conjuntivo denso preenchendo o espaço da ferida (Fig. 5).

Fig 4 Montagem de 05 fotomicrografias do reparo do grupo experimental. Coloração H.E. Aumento no original 4x. Observar o reparo completo da ferida com tecido ósseo (entre setas).

A

25

Fig 5.- Montagem de 05 fotomicrografias do reparo do grupo controle. Coloração H.E. Aumento no original 4x. Observar o preenchimento da ferida com tecido conjuntivo denso. As setas indicam as margens da ferida.

No grupo tratado com Chalcona, no tecido ósseo de reparo observou-se,

presença de osso primário, osso secundário, osteoblastos ativos e inativos e

em algumas áreas, a presença de osso com morfologia semelhante ao osso

primário devido à presença de corpúsculos esferoidais pouco corados pelo

H.E., sem nenhuma orientação e numerosos, porém sem nenhuma

semelhança com osteócitos (Fig. 6).

Fig.6 Área de osso de reparo do grupo experimental. Coloração H.E. Aumento no original 10x. Observar: presença de inclusões de forma eferoidal pouco corados e sem orientação definida (setas pretas). Osteoblastos ativos, e inativos (seta branca), osso primário e osso secundário.

OSSO PRIMÁRIO

26

Aparentemente as inclusões esferoidais são o resultado de um mecanismo de englobamento pela matriz óssea secreta pelos osteoblastos (Figs 7 e 8).

Fig 7.- Área de osso de reparo do grupo experimental. Coloração H.E. Aumento no original 20x. Observar o englobamento dos corpúsculos esferoidais (setas) pela matriz óssea secretada pelos osteoblastos

Fig 8.- Magnificação maior (40x) das inclusões observadas na área inferior direita da figura 7.

27

DISCUSSÃO

É ampla a produção de dados utilizando as feridas críticas (vide revisão

da literatura), como modelo de estudo dos mecanismos envolvidos na

osteogênese, reparo, bioengenharia com a aplicação de medicamentos

alopáticos, homeopáticos, células tronco, plantas medicinais, etc. Isto permite

dar um bom grau de confiabilidade aos dados que obtivemos em nosso estudo

utilizando uma Chalcona sintética como indutora do reparo ósseo.

É amplamente conhecido que em feridas críticas de calota craniana de

ratos e/ou de outros mamíferos, não ocorre o reparo espontâneo. Isto permite

afirmar com muita confiabilidade que o material incluído na ferida crítica tem

potencial osteogênico, quando é observado o fechamento da ferida. Embora,

em nosso estudo, não tenhamos dados sobre a cascata de eventos

moleculares vinculados à osteogênese, como relata o estudo de Ripamont e

Reddi (1992), em implantes heterotópicos de matriz óssea desmineralizada,

que a proteína morfogenética óssea está envolvida no mecanismo de reparo,

podemos sugerir a sua ocorrência, em nosso estudo, induzida pela Chalcona.

É provável que a Chalcona utilizada neste estudo, tenha um potencial

osteogênico melhor que algumas moléculas bioativas como o FGF1, estudada

por Gómez et al (2006) que relata que esta molécula não evidenciou

benefícios no reparo ósseo de feridas críticas de calota craniana de ratos, pois

ao contrário, nossos resultados mostraram fechamento completo da ferida em

9 ratos e somente em um rato permaneceu uma área insignificante de ferida.

O grau de atividade celular comprometida com a osteogênese no

reparo, foi avaliada pelo grau de diminuição das dimensões da ferida crítica

como encontrado por Gómez et al. (2006), em feridas críticas de calota

craniana de ratos.

Kneser et al. (2006) relatam que discos de osso esponjoso bovino

revestidos com gel de fibrina contendo osteoblastos, após 4 meses ocorre

neoformação óssea significativa e que a presença dos osteoblastos não

modifica o potencial de reparo do disco de osso esponjoso. Nossos resultados

indicam que em tempo bem menor a aplicação do gel de Chalcona permite o

reparo total, sugerindo uma efetividade biológica melhor que o uso de células

obtidas de cultivo e com um procedimento cirúrgico mais simples e

I

28

economicamente viável, por não necessitar do preparo de um disco de osso e

cultivo de células aplicadas a uma matriz condutora.

Werkman et al. (2006), estudando reparo ósseo em lesões corticais na

tíbia de ratos experimentalmente osteoporóticos (castrados), observaram que o

uso de medicamentos homeopáticos como a calcarea phosphorica (3

gotas/dia) podem ser mais eficientes que os medicamentos alopáticos como o

risedronato (1mg/kg/dia), formando osso primário 30 dias pós início do

tratamento. Em estudo prévio, Nascimento; Tames (2010), em animais

normais, 30 dias após a aplicação local do gel Chalcona, obtiveram, não

somente a formação de osso primário, mas também a sua substituição parcial

por osso secundário; somente este dado já indica um maior benefício no uso

do gel de Chalcona e mais ainda quando se leva em consideração nossos

resultados indicando que em 48 dias ocorre o reparo total e utilizando um

protocolo experimental muito mais cômodo do que o utilizado por Werkman et

al. (2006).

Kamakura et al. (2007), em feridas críticas de calota craniana em ratos

tratados com implantes de discos de compósitos de colágeno e fosfato

octocálcico, fosfato tricálcico e hidroxiapatita, mostrou que 3 meses após o

compósito de colágeno e fosfato octocálcico promoveu um reparo mais

acentuado que os outros compósitos, porem não relata reparo total. Desta

forma, fica evidente que o uso do gel de Chalcona é muito mais eficiente por

promover reparo total em tempo menor que o relatado por eles.

Da mesma forma, os dados que obtivemos em nosso estudo mostram

maior eficiência da Chalcona frente aos resultados obtidos por Marzouk et al.

(2007) que utilizando superfícies de microesferas de polivinil estireno tratadas

com fator de crescimento derivado de plaquetas e implantadas em feridas

críticas de calotas cranianas de ratos, relatam que 4 meses após ocorre um

reparo estatisticamente mais acentuado sem evidenciar reparo total.

Os meios utilizados na produção do material a ser implantado em feridas

críticas para estudo do reparo ósseo é importante; assim, Pripatnanont et al.

(2007) relatam que as hidroxiapatitas sintetizadas a 1200°C promove uma

maior formação óssea do que as sintetizadas a 800°C e 135°C. Estes dados

nos abrem a perspectiva de que modificando a formulação do gel de Chalcona

29

possamos obter respostas mais efetivas, pois neste estudo utilizamos o gel de

Chalcona em vaselina somente na concentração de 10%.

Honma et al. (2008), relataram que tanto as feridas críticas como as não

críticas, em calota craniana de ratos, a neoformação óssea durante o reparo

cessa dentro de 24 semanas e que o reparo ocorre da superfície do periósteo e

não a partir dos bordos da ferida. Nossos resultados concordam com o fato de

que a ferida crítica não tem reparo espontâneo e que embora tenha ocorrido

uma diminuição da área da ferida, esta não foi significante. Por outro lado, em

nenhum dos casos foi observado indícios de reparo a partir do periósteo, pois

não encontramos osteogênese no centro da ferida. Isto nos sugere que o

fechamento da ferida 48 dias após aplicação única de gel de Chalcona, ocorreu

da periferia para o centro da ferida, discordando dos dados de Honna et al.

(2008).

Por outro lado, nossos resultados nos permitem sugerir que a Chalcona

pode ter uma performance medicamentosa semelhante ao fator de crescimento

osteogênico mais conhecido, a ponto de este fator ser utilizado como controle

positivo em estudos como os de Intini et al. (2008), que relataram reparo total

em 8 semanas nas feridas tratadas com rhBMP-2. Cabe salientar que o reparo

total que obtivemos foi 48 dias após aplicação da Chalcona.

O uso de células tronco mesenquimais (Khojasteh, Eslaminejad e

Nazarian, 2008), isoladas ou em combinação com biomateriais como o Bio-Oss

(osso liofilizado), tem também mostrado um sucesso maior na indução de

reparo ósseo, entretanto devemos salientar que, assim como os fatores de

crescimento, sua obtenção para posterior utilização numa formulação

medicamentosa, é muito dispendiosa inviabilizando seu uso em programas de

saúde coletiva quando comparadas a moléculas bioativas de plantas

medicinais como é caso da Chalcona usado neste estudo.

Durante o reparo de feridas críticas, promovidas pelo implante de osso

autógeno e osso bovino desmineralizado, Oliveira et al. (2008) mostraram que

o osso bovino desmineralizado, 21 dias após, é substituído por tecido fibrótico

e que em períodos posteriores (90 dias) o reparo é incompleto. Cabe salientar

que em nosso estudo encontramos a permanência de tecido fibrótico somente

nas feridas não tratadas e o mecanismo de reparo induzido pela aplicação de

Chalcona permitiu o reparo total em 48 dias, indicando uma atividade indutora

30

muito mais eficiente que o implante de osso autógeno e osso bovino

desmineralizado.

Os dados que encontramos na literatura consultada, mostram a

preocupação de descobrir um material que melhore o mecanismo de reparo de

feridas críticas. Neste contexto, Park et al. (2008) observaram que a mistura de

partículas de dentina e chitosana, sessenta dias pós, apresenta um excelente

efeito na regeneração óssea, embora não relate um reparo completo da ferida.

Acreditamos que a Chalcona possa ser relacionada com a mesma, ou melhor,

eficiência e em período inferior, pois nossos resultados relatam dados obtidos

em 48 dias.

Da mesma forma, Por et al. (2007), estudaram implantes de cromo

cobalto cobertas com misturas complexas de matriz óssea desmineralizada,

rhBMP-2 e plasma enriquecido com plaquetas; seus resultados mostraram que

os complexos contendo rhBMP-2 promoveram reparo mais acentuado e que os

complexos contendo plasma enriquecido com plaquetas não tem efeito

significativo no reparo. Estes dados permitem sugerir estudos futuros utilizando

complexos de metais com a Chalcona, cujos resultados eventualmente

poderiam ser aproveitados na implantodontia com um custo inferior aos

complexos metal/rhBMP-2 que a literatura já consagrou como o melhor agente

osteogênico.

A etnobotânica tem uma contribuição importante na descoberta de

drogas e no desenvolvimento socioeconômico assim, Uprety et al. (2010), em

estudo realizado no Nepal, relataram que as plantas medicinais são

encontradas nas próprias residências e utilizadas principalmente para resolver

problemas de saúde relacionadas com distúrbios gastrointestinais, menstruais,

febre, dor de cabeça, dor de dente, problemas oftalmológicos e renais. Apesar

dos vários estudos já realizados, são poucos os que comparam o uso de

plantas indígenas com as propriedades fitoquímicas e farmacológicas, neste

aspecto, as Chalconas estão sendo estudadas pelo grupo de investigadores do

curso de Farmacologia da UNIVALI e no presente momento se encontra na

fase de sua manipulação molecular para descobrir novas aplicações

medicamentosas, sendo que nosso estudo salienta a possibilidade de

utilização medicamentosa para reparo de feridas ósseas.

31

As Chalconas são flavonóides de cadeia aberta, importantes na

pigmentação de flores agindo como atraentes para a polinização, estes

flavonóides despertaram interesse na fitoterapia devido a suas propriedades

biológicas como antioxidante, citotóxica, anticancerígena, antimicrobiano,

analgésica, antiúlcera, antihistamínico e antiinflamatório (KIM et al., 2007;

CAMPOS-BUZZI et al., 2007; TRAN et al., 2009; BANDGAR et al., 2010). Por

outro lado a sua síntese, mantendo o esqueleto de Chalcona e mudando

apenas alguns radicais, tem se observado clinicamente a manutenção e

melhoria de algumas das propriedades medicamentosas, entretanto a sua

potencialidade farmacológica ainda não está esgotada (BATOVSKA;

TODOROVA, 2010). Neste aspecto a molécula de Chalcona sintetizada que

utilizamos sugere um potencial reparador de feridas ósseas que poderá ser

utilizada pela indústria na formulação de um medicamento osteogênico

eficiente.

Õztürt et al. (2008) observou, em fratura de tíbia de coelhos, que

fitoestrogênios contidos em extratos de Vitex agnus- castus L (Verbenaceae),

administrados por via intramuscular, melhoram o reparo somente nas fases

iniciais (7 e 14 dias); Em nosso estudo, o gel contendo Chalcona surge como

uma alternativa medicamentosa mais eficiente que os fitoestrogênios uma vez

que 48 dias após aplicação única nas feridas críticas mostra reparo total em

quanto as feridas não tratadas mantêm suas dimensões iniciais.

Historicamente entender a regeneração tem sido uma preocupação dos

pesquisadores permitindo avanços importantes nas intervenções cirúrgicas,

transplantes entre outros. Recentemente, Neste contexto, podemos considerar

que a Chalcona (molécula sintetizada a partir de plantas medicinais) é uma

molécula bioativa com potencial indutor do reparo ósseo, como é sugerido em

nosso estudo, e que poderá ser utilizada como uma opção entre outras

moléculas cujo potencial indutor de osteogênese já está comprovado, com a

vantagem de ser economicamente viável devido ao baixo custo de sua

obtenção quando comparado às extrações de moléculas bioativas de tecidos

animais.

32

6 CONCLUSÃO

Os dados obtidos neste trabalho, nas condições em que foi realizado,

nos permitem concluir.

- A aplicação única de Chalcona sintética a 10% em vaselina, promove

reparo total de feridas críticas em calota craniana de rato.

- As feridas críticas não tem reparo espontâneo significante.

- As dimensões das feridas críticas não tratadas, após quarenta e oito

dias são significantemente semelhantes às feridas inicias.

- Existe a possibilidade de formulação medicamentosa eficiente para o

reparo de feridas ósseas críticas.

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7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BALOOCH, G. et al. TGF-B Regulates the Mechanical Properties and Composition of Bone Matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A ., Washington, v. 102, n. 52, p. 18813- 18818, Dec. 2005. BANDGAR, B. P. et al. Synthesis and Biological Evaluation of Simple Methoxylated Chalcones as Anticancer, Anti- inflammatory and Antioxidant Agents. Bioorg. med. chem. , Oxford, v.18, n.3, p.1364-1370, Feb. 2010a. BANDGAR, B. P. et al. Synthesis and Biological Evaluation of Nitrogen-Containing Chalcones as Possible Anti-inflammatory and Antioxidant agents. Bioorg. med. chem. , Oxford, v.20, n.2, p.730-733, Jan. 2010b. BATOVSKA, D, I.; TODOROVA, I. Trends in utilization of the pharmacological potential of chalcones. Current Clinical Pharmacology , v.5, n.1, p.1-29, 2010. BUZZI, F. C. et al. Acetamidochalcone Derivatives as Potential Antinociceptive Agents. Molecules online ., Berlin, v.12, p.896-906, 2007. CHIARADIA, L. D. et al. Synthesis and Pharmacological Activity of Chalcones Derived from 2,4,6-Trimethoxyacetophenone in RAW 264.7 Cells Stimulated by LPS: Quantitative Structure–activity Relationships. Bioorg. med. chem ., Oxford, v.16, n.2, p.658-667, Jan. 2008. CHU, T-M. G. et al. Segmental Bone Regeneration Using a Load Bearing Biodegradable Carrier of Bone Morphogenetic Protein-2. Biomaterials, Guildford , v. 28, n.3, p. 459- 467, Jan. 2007. GÓMEZ, G. et al. Effect of FGF and Polylactide Scaffolds on Calvarial Bone Healing with Growth Factor on Biodegradable Polymer Scaffolds. Journal of Cranio-Maxillofacia l Surgery, Madri, v.17, n.5, 935-942, Sept. 2006. HONMA, T. et al. Bone Formation in Rat Calvaria Ceases Within a Limited Period Regardless of Completion of Defect Repair. Oral dis., Houndmills , v.14, n.5, p.457-464, July 2008. INTINI, G. et al. A Comparative Analysis of Bone Regeneration Induced by Human Demineralized Freeze-Dried Bone and Enamel Matrix Derivate in Rat Calvaria Critical-Size Bone Defects. J. periodontol. , Indianápolis, v. 79, n. 7, p. 1217- 1224, July 2008. KAMAKURA, S. et al. The primacy of octacalcium phosphate collagen composites in bone regeneration. Journal Biomedical Mater Res A ., Sendai, v.83, n.3, p.725-33, Dec. 2007. KHOJASTEH, A.; ESLAMINEJAD, M. B.; NAZARIAN, H. Mesenchymal stem cells enhance bone regeneration in rat calvarial critical size defects more than platelete-rich plasma. Oral Surgery Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod ., v.106, n. 3, p.356-362, Sept. 2008. KIM, Y. H. et al. Anti-inflammatory Activity of the Synthetic Chalcone Derivatives: Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase-Catalyzed Nitric Oxide Production from

34

Lipopolysaccharide-treated RAW 264.7 Cells. Biol. pharm. bull ., Tokyo, v. 30, n.8, p.1450- 455, 2007. KNESER, U. et al. Evaluation of Processed Bovine Cancellous Bone Matrix Seeded with Syngenic Osteoblasts in a Critical Size Calvarial Defect Rat Model. J. cell. mol. med. , Bucharest, v.10, n.3, p.695-707, July/Sept. 2006. MANKANI, M. H. et al. Canine Cranial Reconstruction Using Autologous Bone Marrow Stromal Cells. Am. j. pathol ., New York, v. 168, n. 2, p. 542- 550, Feb. 2006. MARZOUK, K. M.et al. Osteoconductive effects of vinyl styrene microbeads in rat calvarial defects. Journal Oral and Maxillofacial Surgeons, Assiut, v.65, n.8, p.1508-1516, Aug. 2007. NASCIMENTO, L.; TAMES, S. F. A. Estudo (in vivo) do Potencial Osteogênico da Chalcona em Ferida Crítica de Calota Craniana de Ra tos. f. Trabalho de Conclusão de Curso. ( Graduação). Curso de Odontologia- Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2010. OLIVEIRA, R. C. et al. Morphometric Evaluation of the Repair of Critical-Size Defects Using Demineralized Bovine Bone and Autogenous Bone Grafts in Rat Calvaria. Clin. oral implants res. , Copenhagen, v.19, n.8, p.749–754, Aug. 2008. ÖZTÜRK, A. et al. The Effects of Phytoestrogens on Fracture Healing: Experimental Reaserch in New Zealand White Rabbits. Ulus. travma acil cerrahi derg ., Istanbul, v. 14, n. 1, p. 21-27, 2008. PARK, S. S. et al. Osteogenic Activity of the Mixture of Chitosan and Particulate Dentin. J. biomed. mater. res. A .. Hoboken, v.87, n.3, p.618-23, Dec. 2008. PENG, H. et al. Synergistic Enhancement of Bone Formation and Healing by Stem Cell–Expressed VEGF and Bone Morphogenetic Protein-4. J. clin. invest . , New York, v. 110, n. 6, p. 751- 759, Sept. 2002. POR, Y. C. et al. Bone Generation in the Reconstruction of a Critical Size Calvarial Defect in an Experimental Model. J. craniofac. surg ., Boston, v. 36, n. 11, p. 911-919, Nov. 2007. PORTER, J. R. et al. Bone Tissue Engineering: A Review in Bone Biomimetics and Drug Delivery Strategies. AIChE j ., New York, v. 25, n. 6, p 1539- 1560. Oct. 2009. PRIPATNANONT, P. et al. Osteoconductive Effects of 3 Heat-Treated Hydroxyapatites in Rabbit Calvarial Defects. J. oral maxillofac. surg ., Philadelphia, v. 65, n. 12, p. 2418- 2424, Dec. 2007. PRIPATNANONT, P. et al. Proportion of Deproteinized Bovine Bone and Autogenous Bone Affects Bone Formation in the Treatment of Calvarial Defects in Rabbits. Int. j. oral maxillofac. surg. , Copenhagen, v. 38, p. 356–362, Mar. 2009. PUGALENDHI, P. et al. Antigenotoxic Effect of Genistein Against 7,12 Dimethylbenz[a]Anthracene Induced Genotoxicity in Bone Marrow Cells of Female Wistar Rats. Pharmacol. rep ., Krakow, v. 61, p.296-303, 2009. RIPAMONT, U.; REDDI, A. H. Growth and Morphogenetic Factors in Bone

35

Induction: Role of Osteogenin and Related Bone Morphogenetic Proteins in Craniofacial and Periodontal Bone Repair. Crit. Rev. Oral Biol. Med ., Boca Raton, v. 3, n.1/2, p. 1-14, 1992. TRAN, T. D. et al. Inhibitory Activity of Prostaglandin E2 Production by the Synthetic 20-Hydroxychalcone Analogues: Synthesis and SAR Study. Bioorg. med. chem ., Oxford, v.19, n.6, p.1650-1653, Mar. 2009. UPRETY, Y. et al. Indigenous Use and Bio-Efficacy of Medicinal Plants in the Rasuwa District, Central Nepal. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, Brussels, v. 6, n.3, p. 1- 10, Jan. 2010. WERKMAN, C. et al. Comparative Therapeutic Use of Risedronate and Calcarea Phosphorica – Allopathy versus Homeopathy – in Bone Repair in Castrated Rats. Braz. oral res ., São Paulo, v. 20, n. 3, p. 196- 201, July/Sept. 2006.

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