Tradução de mRNA em Tradução de mRNA em sistemas acelularessistemas acelulares

Biologia MolecularBiologia Molecular

Relembrando a tradução do mRNARelembrando a tradução do mRNA

O que é tradução de mRNA em O que é tradução de mRNA em sistemas acelulares?sistemas acelulares?

Síntese Síntese in vitroin vitro PtnasPtnas Extratos acelulares/sistemas acelularesExtratos acelulares/sistemas acelulares

Importante ferramentaImportante ferramenta Variedade de aplicaçõesVariedade de aplicações

Identificação rápida Identificação rápida produtos genéticos produtos genéticos Localização de mutaçõesLocalização de mutações Estudos de enovelamento de ptnasEstudos de enovelamento de ptnas Incorporação de aminoácidos modificadosIncorporação de aminoácidos modificados

Estudos funcionaisEstudos funcionais

O que é tradução de mRNA em O que é tradução de mRNA em sistemas acelulares?sistemas acelulares?

Vantagens x Sistema Vantagens x Sistema in vivoin vivo Alta produção Alta produção ptnas tóxicas ptnas tóxicas

Produtos insolúveis / corpos de Produtos insolúveis / corpos de inclusãoinclusão

Ptnas Ptnas rapidamente degradadas rapidamente degradadas (proteases)(proteases)

Preparo dos extratos acelularesPreparo dos extratos acelulares

A princípioA princípio Extratos Extratos tradução tradução in vitroin vitro de mRNAs de mRNAs

Qualquer tipo celularQualquer tipo celular

Na práticaNa prática Poucos sistemas desenvolvidosPoucos sistemas desenvolvidos

Regra geral básicaRegra geral básica escolha escolha Células alto índice de síntese protéicaCélulas alto índice de síntese protéica

Preparo dos extratos acelularesPreparo dos extratos acelulares

Sistemas acelulares mais utilizadosSistemas acelulares mais utilizados ExtratosExtratos

Reticulócitos de coelhoReticulócitos de coelho Gérmen de trigoGérmen de trigo Escherichia coliEscherichia coli ( (E. coliE. coli))

reticulócito

Preparo dos extratos acelularesPreparo dos extratos acelulares

PreparoPreparo Todos os componentes Todos os componentes

macromolecularesmacromoleculares Tradução de RNA exógenoTradução de RNA exógeno

RibossomosRibossomos tRNAstRNAs Aminoacil-tRNA sintetasesAminoacil-tRNA sintetases Fatores de iniciação, alongamento e terminaçãoFatores de iniciação, alongamento e terminação AminoácidosAminoácidos Fontes de energia (ATP/GTP)Fontes de energia (ATP/GTP) Outros co-fatores (MgOutros co-fatores (Mg+2+2, K, K++, etc.), etc.)

ribossomo

Diferentes abordagens:Diferentes abordagens:RNA / DNARNA / DNA

Sistemas padrões de tradução Sistemas padrões de tradução RNA RNA moldemolde Ex: extratos de reticulócito/gérmenEx: extratos de reticulócito/gérmen

Sistemas Sistemas DNA DNA 1º. 1º. TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO mRNA mRNA

2º. 2º. TRADUÇÃO TRADUÇÃO ptnas ptnas

Tradução de mRNA em Sistemas Acelulares:Tradução de mRNA em Sistemas Acelulares:EXTRATO DE RETICULÓCITOS DE COELHOEXTRATO DE RETICULÓCITOS DE COELHO

ReticulócitosReticulócitos Altamente especializados Altamente especializados hemoglobinas hemoglobinas Uso eficiente Uso eficiente tradução de RNA exógeno tradução de RNA exógeno RNA RNA natural / gerado natural / gerado in vitroin vitro

Reticulócitos Reticulócitos não possuem núcleo não possuem núcleo Quantidade adequada de mRNAQuantidade adequada de mRNA Maquinário completo Maquinário completo tradução tradução

mRNA endógeno mRNA endógeno eliminado eliminado NucleasesNucleases Kits: tratadosKits: tratados

Não possuem mRNA endógenoNão possuem mRNA endógeno Bastante utilizados Bastante utilizados eficiência na tradução eficiência na tradução

Nível de síntese Nível de síntese próximo células próximo células

Tradução de mRNA em Sistemas Acelulares:Tradução de mRNA em Sistemas Acelulares:EXTRATO DE EXTRATO DE Escherichia coliEscherichia coli

Sistemas acelulares Sistemas acelulares E. coliE. coli Extrato natural de Extrato natural de E. coliE. coli

Rico em mRNA endógenoRico em mRNA endógeno

Dessa forma Dessa forma incubado durante incubado durante preparopreparo mRNA endógeno mRNA endógeno traduzido/degradado traduzido/degradado

Níveis de mRNA endógenoNíveis de mRNA endógeno Baixos no preparadoBaixos no preparado Produto exógeno Produto exógeno facilmente identificado facilmente identificado

Comparação x Sistemas celulares Comparação x Sistemas celulares eucarióticoseucarióticos Extrato de Extrato de E. coliE. coli aparato de tradução simples aparato de tradução simples Principalmente Principalmente controle da iniciação controle da iniciação Sistemas Sistemas eficiente síntese ptnas eficiente síntese ptnas

No entantoNo entanto Presença endonucleases Presença endonucleases degradação mRNAs degradação mRNAs Mais eficientes Mais eficientes DNA molde (transc/trad) DNA molde (transc/trad)