UBAIII Biologia Molecular

1º Ano2012/2013

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Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde

Capítulo XIV. Técnicas básicas para o estudo de ácidos nucleicos. Isolamento e purificação de ácidos nucleicos Separação de ácidos nucleicos Visualização Tecnologia de DNA recombinante

Capítulo XV. Biotecnologia Aplicada às Ciências da Saúde Microarrays princípios da técnica

O que são microarrays? Vários tipos de sondas (DNA, cDNA, RNA, proteínas) Hibridização Leitura Aplicações dos microarrays em medicina:

Expressão diferencial de genes Biomarcadores Marcadores de alvos clinicos, funções biológicas semelhantes, ligação entre genes Detecção de agentes patogénicos

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Purificação dos ácidos nucleicos Homogeneização das células Lise nuclear com solução tamponada de NaCl

com SDS.

Precipitação proteica com fenol/clorofórmio Centrifugação Adição de etanol precipitação dos ácidos

nucleicos17Jan/2013MJC-T144

Separação das

proteínas e RNA

Obtido o DNA em filamentos brancos É novamente dissolvido em solução aquosa Tratado com RNAse Pode ser também obtido RNA se o tratamento

for feito com DNAse RNAse ou DNAse removidas com protease Lavagem com fenol (para remover .....) Precipitação com etanol.

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Mais recentemente.... Colunas para isolamento de DNA

Membranas e matrizes que ligam DNA especificamente

Lisado de células + matriz lavado e centrifugado Eluição da matriz.

http://www1.qiagen.com/jump/QIAampKits/QIAampKitsReferences.aspx

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Separação do DNA Tamanho Composição de

bases Topologia Sequência de

nucleótidos

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Electroforese Ultracentrifugação

Electroforese

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http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Ultracentrifugação – Velocidade de sedimentação

Unidades S influência da massa.

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Ultracentrifugação – Centrifugação equilibrada

Separa também moléculas com radioisótopos.

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Hibridização de ácidos nucleicos

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Hibridização de ácidos nucleicos

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Tecnologia do DNA recombinante – enzimas de restrição

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Formação do DNA recombinante

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Clonagem do DNA em bactérias

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Clonagem do DNA em bactérias

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Clonagem do DNA em bactérias

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Clonagem do DNA em bactérias

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Clonagem do DNA em bactérias-screening

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Clonagem do DNA em bactérias-screening

Separação dos Plasmideos por centrifugação

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Corte com as enzimas

de restrição iniciais

Clonagem do DNA em vírus

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Clonagem do DNA em vírus

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Clonagem do DNA em vírus

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O que significa Microarray?

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O que é posto nas lâminas? Sondas (?)

Moléculas com capacidade de se ligar a outras hibridizar DNA cu RNA Proteínas

Qual a origem deste material? Bibliotecas de DNA

Genómicas cDNA

DNA RNA

Proteínas17Jan/2013MJC-T1428

Escolha das sondas a utilizar Comprimento

20-100 bases Especificidade Impressão da lâmina

Orientação do fragmento Hibridização pretendida

As sondas hibridizam com a amostra que é marcada com fluorescência. Assim um sinal fluorescente no resultado o que

significa?

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Condições de hibridização Quantidade e qualidade da amostra

Replicação com [amostra] Solução de hibridização e lavagem

Normalmente é definida pelo fabricante do chip Tempo de incubação

Gerido em função de estudos piloto e também definido pelo fabricante

Temperatura de incubação Depende por vezes da sequência (conteudo GC) Porquê?

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Leitura do chip Depende de ter sido utilizado 1 ou 2 corantes

diferentes

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Expressão diferencial de genes

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Expressão diferencial de genes

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Expressão diferencial de genes

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Recursos utilizados

Capítulo 18 Karp secções 18.9-18.11. e secção 18.13.

Capítulo 12 Karp secção 12.4 http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomic

s/chip/chip.html (Microarray de DNA de leveduras).

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