UFF – UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro

CAROLINA ANTUNES TERRA SECA

CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFICIE DE AÇO

INOXIDÁVEL DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE PESCADO

UTILIZADOS NA CULINÁRIA JAPONESA.

Trabalho de Conclusão de Curso

Apresentado como requisito parcial

Para obtenção do grau de

Bacharel em Nutrição.

ORIENTADORA: Prof. Dr. Luciana Maria Ramires Esper

CO-ORIENTADORA: MSc. Brigitte Marie Angele Bertin

Niterói

2015

CAROLINA ANTUNES TERRA SECA

CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFICIE DE AÇO

INOXIDÁVELDE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE PESCADO

UTILIZADOS NA CULINÁRIA JAPONESA

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao curso de graduação em

Nutrição da Faculdade de Nutrição Emília de

Jesus Ferreiro da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial para

obtenção do título de Nutricionista.

Aprovado em 14 de julho de 2015.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________Profª Dra Luciana Maria Ramires Esper – Orientadora

Universidade Federal Fluminense – UFF

__________________________________________________________Profª Drª Claudete Corrêa de Jesus Chiappini

Universidade Federal Fluminense – UFF

__________________________________________________________Prof Dr Paulo Gomes de Lima

Universidade Federal Fluminense - UFF

Niterói

2015

A Deus por me abençoar com sabedoria e

perseverança, aos meus pais, Carlos e

Rosângela, aos meus irmãos Fábio e

Sophia, ao meu companheiro Vagner por

sempre apoiarem as minhas decisões e

me incentivarem durante toda minha vida,

pelo carinho e palavras amigas.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelas bênçãos, sabedoria, perseverança e força permitindo-me alcançar as

metas almejadas até aqui com esforço, dedicação e sem fraquejar.

Aos meus pais Rosângela e Carlos, que sempre foram exemplo de força, caráter,

integridade e perseverança, que nunca mediram esforços para que eu completasse

meu caminho, pelo carinho, amor, apoio, companheirismo em todos os momentos,

principalmente ao longo desta trajetória sempre me incentivando, e acreditando que

iria conseguir realizar esse trabalho. Essa vitória é de vocês também! Eu amo muito

vocês!

Ao meu marido, Vagner, pela compreensão, carinho, apoio e disposição em ajudar

no que fosse necessário e pela paciência nos meus momentos de tensão. Eu te

amo!

Aos meus irmãos Fábio e Sophia Victória pelo carinho, incentivo e palavras de

conforto e superação. Eu os amo muito!

A todos da minha família, de modo geral, que sempre torceram/torcem por mim. Eu

os amo e serei eternamente grata.

A minha orientadora, Profª Drª Luciana Maria Ramires Esper pela paciência, pelo

carinho, disposição, incentivo, apoio, também pelas risadas e momentos

descontraídos. Contribuiu muito para que esse trabalho fosse realizado desde o

planejamento até a execução me passando todo o conhecimento e me incentivando.

A minha Co-orientadora, MSc Brigitte Marie Angele Bertin, por ser paciente,

disposta, presente e grande incentivadora. Muito obrigada pelo apoio e

ensinamentos. Contribuiu muito para minha formação tanto profissional como

pessoal.

Ao Prof. Paulo pela confiança, carinho e disponibilidade em passar seu

conhecimento.

A todos do laboratório de Higiene e Microbiologia de Alimentos da Universidade

Federal Fluminense, que ajudaram nas pesquisas realizadas para conclusão deste

trabalho, em especial a Técnica Lúcia.

Aos meus amigos, pelo carinho e força em todos os momentos. Por entenderem

minha ausência e me apoiarem. As minhas amigas de faculdade, com certeza não

teria sido a mesma coisa sem vocês!

A minha amiga de madrugadas escrevendo, Renata Alves, pela ajuda, pelos

conselhos, por dividir os momentos bons e ruins.

A todos que direta ou indiretamente fizeram parte desta trajetória, que contribuíram

para minha formação, vou levar todos em minha memória e coração. Muito obrigada!

“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos

mantemos fiéis a nós mesmos.”

Friedrich Nietzsche

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Fases, modificações e crescimento microbiano em

pescados.................................................................... 21

Figura 2 - Etapas de adesão, formação e dispersão do

Biofilme....................................................................... 25

Figura 3 - Exemplo e detecção de E.coli em placas 3M

Petrifilm™.................................................................... 23

Figura 4 e 5 - Confirmação da pureza em TSA e crescimento em

EMB............................................................................ 28

Figura 6 - Inoculação do líquido em placa de

Petrifilm™.................................................................. 28

Figura 7 - Fluxograma da etapa de diluição seriada para

contagem de células sésseis aderidas ao cupom..... 31

Figura 8 - Diluições por hora e diluições

semeadas.................................................................... 31

Figura 9 - Evolução da população (log UFC/cm2) de células

sésseis aderidas sobre cupom de aço inoxidável por

hora de incubação......................................................35

Figura 10 - Evolução da população (log UFC/cm2) de células

sésseis aderidas sobre cupom de aço inoxidável por

hora de incubação......................................................35

Tabela 1 - Contagem de cepas de E.coli padrão, isoladas de

alimentos e superfícies...............................................

32

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ALA - alfa-linolênico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APHA – American Public Health Association

ATCC – American Type Culture Collection

BPF – Boas Práticas de Fabricação

BPM – Boas Práticas de Manipulação

cm2 – centímetro quadrado

DHA – Docosaexaenoico

DTA – Doenças Transmitidas por Alimentos

EED2 2V - Esteira de Evisceração nº 2 Durante processamento – segunda visita

EED2 3V - Esteira de Evisceração nº 2 Durante processamento – terceira visita

EMB – Eosin Methylene Blue – ágar Eosina Azul de Metileno

EPA – Eicosapentaenoico

g – grama

ICMS – International Commission on Microbiological Specifications for Foods

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

ml – mililitros

ºC – grau Celsius

PBS – Phosphate buffered salt

POP´s – Procedimentos Operacionais Padrões

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

spp - espécies

TRD1 1V - Tanque de Recepção nº 1 Durante o processamento – primeira visita

TRD2 1V - Tanque de Recepção nº 2 Durante o processamento – primeira visita

TSA – Tryptone Soya Ágar – ágar triptona de soja

TSB – Tryptone Coya Broth – caldo tripitona de soja

UFC – Unidade Formadora de Colônia

UFC/cm2 – Unidade Formadora de Colônia por centímetro quadrado

UFC/ml – Unidade Formadora de Colônia por mililitro

UFF – Universidade Federal Fluminense

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO.......................................................................... 14

2 - OBJETIVOS.............................................................................. 17

2.1 - Objetivo geral......................................................................... 17

2.2 - Objetivos específicos............................................................ 17

3 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................... 18

3.1 - Importância nutricional do pescado................................... 18

3.2 - Culinária japonesa................................................................ 19

3.3 - Programa de Higienização de Superfícies.......................... 20

3.4 - Pescado.................................................................................. 21

3.5 - Escherichia coli..................................................................... 24

3.6 - Biofilmes microbianos.......................................................... 25

4 - MATERIAIS E MÉTODOS....................................................... 27

4.1 - Amostra.................................................................................. 27

4.2 - Análises microbiológicas..................................................... 27

4.2.1 - Identificação e confirmação de E.coli...................................... 27

4.3 - Formação de Biofilmes Microbianos.................................... 30

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................. 32

6 - CONCLUSÃO......................................................................... 36

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................... 37

RESUMO

O pescado é uma fonte proteica importante e bastante consumido por serem ricos

em eicosapentaenoico (EPA), docosaexaenoico (DHA) e ácido alfa-linoleico (ALA)

que são precursores do ômega 3. A carne e alguns órgãos internos de pescados

sadios e recém-capturados são normalmente estéreis, mas, no intestino, brânquias,

pele e muco superficial encontra-se grande concentração de microrganismos. A

presença de bactérias patógenas na microbiota dos pescados depende de vários

fatores e podem variar de acordo com as boas práticas implementadas. A

gastronomia japonesa é conhecida por valorizar o sabor e a pureza de cada

ingrediente. A utilização do pescado cru para consumo humano implica em uma

série de cuidados visando evitar doenças à população. O pescado ao ser

manipulado, em geral, permanece em temperatura ambiente e em contato com

diversas superfícies da área de preparo que podem estar previamente contaminadas

com microrganismos formadores de biofilmes. A crescente preocupação com a

formação de biofilme bacteriano se dá pelo comprometimento da inocuidade dos

alimentos. A pesquisa objetivou avaliar a capacidade de formação de biofilme em

superfície de aço inoxidável das cepas isoladas de pescados utilizados na culinária

japonesa e de superfícies do ambiente de produção na indústria. Este trabalho

evidenciou a contaminação de filés de pescado cru, tradicionalmente utilizados na

culinária japonesa, comercializado no Estado do Rio de Janeiro e da superfície de

ambientes da indústria. Comprovou-se a capacidade das cepas de E.coli oriundas

da superfície de indústria de pescados e cepa padrão em formar biofilmes em

superfícies de aço inoxidável segundo recomendação do “Compendium of Methods

for the Microbiological Examination of Foods” da APHA. Estes dados demonstram o

risco da utilização dos pescados para o consumo cru e a importância da

higienização das superfícies para evitar a formação de biofilmes microbianos,

resistência aos agentes de higienização, contaminação cruzada dos alimentos e

risco à saúde do consumidor.

Palavras-chave: biofilme, Escherichia coli, superfície, pescado, aço inoxidável.

ABSTRACT

The fish is a very important protein source and consumed to be rich in

eicosapentaenoic (EPA), docosahexaenoic (DHA) and alpha-linolenic acid (ALA)

which are the precursors of omega 3 Meat and some internal organs of healthy fish

and newly caught are usually sterile, but in the gut, gills, skin and mucous surface is

large concentration of microorganisms. The presence of pathogenic bacteria in the

microbiota of fish depends on several factors and may vary according to good

practices implemented. Japanese cuisine is known to enhance the flavor and the

purity of each ingredient. The use of raw fish for human consumption implies a lot of

care in order to avoid diseases to the population. The fish to be handled, in general,

remain at ambient temperature and in contact with various surfaces of staging area

that may be contaminated with previously biofilm-forming microorganisms. The

growing concern with the formation of bacterial biofilms is through compromise food

safety. The research aimed to evaluate the biofilm formation capacity in stainless

steel surface of the isolated strains of fish used in Japanese cooking surfaces and

the production environment in the industry. This work showed contamination of raw

fish fillets, traditionally used in Japanese cuisine, marketed in the State of Rio de

Janeiro and surface industry environments. It demonstrated the ability of E. coli

strains originating from the fish industry surface and standard strain to form biofilms

on stainless steel surfaces as recommended by the "Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods" of APHA. These data demonstrate the risk of

using fish for raw consumption and the importance of cleaning the surfaces to avoid

the formation of microbial biofilms, resistance to cleaning agents, cross

contamination of food and risk to consumer health.

Keywords: biofilm, Escherichia coli, surface, fish, stainless steel

14

1 INTRODUÇÃO

O pescado é uma fonte proteica importante e bastante consumido por serem

ricos em eicosapentaenoico (EPA), docosaexaenoico (DHA) e ácido alfa-linoleico

(ALA) que são precursores do ômega 3. O ômega 3 é importante no auxílio da

diminuição dos níveis de triglicerídeos e colesterol ruim (LDL). Possui ainda,

importante papel em alergias e processos inflamatórios, pois são necessários para a

formação das prostaglandinas inflamatórias, tromboxanos e leucotrienos.

A carne e alguns órgãos internos de pescados sãos e recém-capturados são

normalmente estéreis, mas, no intestino, brânquias, pele e muco superficial a

microbiota encontram-se grande concentração de microrganismos, tais como:

Pseudomonas spp, Alteromonas spp, Moraxella spp, Acinetobacter spp,

Flavobacterias spp, Cytophaga spp e Vibrio spp, sendo estes os tipos

predominantes, cerca de 80% (ICMS, 1980).

A presença de bactérias patógenas na microbiota dos pescados depende de

vários fatores, como, por exemplo, o local de captura. Se o local de captura for de

áreas costeiras, há influencia de dejetos humanos, animais ou contaminantes

industriais e agrícolas, assim como de rios. Se o local de captura for de mar alto a

contaminação é bem reduzida.

Durante a captura o pescado entra em contato com redes, cordas, arpões,

mãos e roupas dos pescadores. O contato com as mãos continua durante as demais

etapas do processamento. Não é de se surpreender, portanto, que o pescado

recentemente capturado, tenha número significativo de bactérias Gram + e

Coliformes. Estas bactérias são provenientes do ambiente humano a bordo que se

somam às da microbiota dos pescados.

Os tipos e quantidades podem variar de acordo com as boas práticas

implementadas desde sua captura até o consumo final.

A utilização do pescado cru para consumo humano implica em uma série de

cuidados visando evitar o crescimento exacerbado de microrganismos,

principalmente os patogênicos, adquiridos no ambiente aquático e também durante a

captura, transporte e distribuição.

15

Considerando a grande importância nutricional dos pescados e a tendência

da busca por uma alimentação saudável, o consumo dos pescados tem aumentado

significativamente.

A gastronomia japonesa é conhecida por valorizar o sabor e a pureza de cada

ingrediente. Por isso é comum a adoção de métodos de cocção menos intensos,

preservando assim o sabor natural de cada ingrediente (DEMETRIO, 2009).

O pescado é a maior fonte de proteína da culinária japonesa e, na maior parte

das preparações, é servido cru.

Além dos cuidados que devem ser seguidos desde a seleção do fornecedor,

recebimento até a distribuição, o estabelecimento que oferece o pescado cru como

produto final, deve garantir que métodos higiênico-sanitários na manipulação sejam

efetivamente cumpridos de acordo com o que está preconizado na RDC nº216/2004.

Deve-se é evitar a proliferação dos microrganismos presentes, tanto para que

não ocorra alteração sensorial (pela multiplicação dos microrganismos deteriorantes)

quanto para que níveis inseguros de patógenos não sejam alcançados e

prejudiquem a saúde do consumidor.

Tendo em vista que, na culinária japonesa, o pescado será consumido cru,

deve ser mantido em condições de armazenamento seguro, implementando um

controle do tempo e da temperatura até o momento do seu consumo.

Outro ponto crucial na segurança para o consumo dos pescados é o cuidado

que se deve ter no ambiente da preparação.

O pescado ao ser manipulado, em geral, permanece em temperatura

ambiente e em contato com diversas superfícies da área de preparo. Estas

superfícies podem estar previamente contaminadas com microrganismos

formadores de biofilmes o que aumentaria a carga microbiana e consequentemente

acelerando a deterioração do produto. Quanto mais esta superfície for rugosa, mais

aderência de microrganismos ocorrerá. Por isso, é fundamental garantir uma

higienização eficaz e com a utilização de produtos adequados.

A crescente preocupação com a formação de biofilme bacteriano se dá pelo

comprometimento da inocuidade dos alimentos, já que se adere fortemente a

superfícies variadas, incluindo o aço inoxidável, sendo focos permanentes de

16

introdução de microrganismos patogênicos e deteriorantes, além de aumentar a

resistência aos agentes de higienização comumente utilizados.

Essa pesquisa teve como objetivo avaliar a capacidade de formação de

biofilmes em superfície de aço inoxidável, de cepas de Escherichia coli isoladas de

pescados tradicionalmente utilizados na culinária japonesa e ambiente de produção

em indústria de pescado.

17

2 OBJETIVOS

2.1Objetivo geral

Detectar a presença de Escherichia coli em pescados tradicionalmente

utilizados na culinária japonesa e avaliar a capacidade de formação de biofilmes em

superfície de aço inoxidável dessas cepas e de cepas de ambiente de produção em

indústria de pescado.

2.2 Objetivos específicos

- Detectar e isolar E.coli em filés de pescados adquiridos no comércio. Atum

(tribo Thunnini), Salmão (Oncorhynchus gorbuscha) e Namorado (Pseudopercis

numida).

- Determinar a capacidade de formação de biofilme das cepas de Escherichia

coli isoladas de pescados e da superfície de indústria de pescado em superfície de

aço inoxidável.

- Comparar a capacidade de formação de biofilmes entre as cepas isoladas

dos pescados, isoladas da superfície no ambiente de produção de indústria de

pescado e cepa padrão ATCC.

18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Importância nutricional do pescado

Os peixes são compostos basicamente por água, lipídios e proteínas, e as

quantidades variam de acordo com as espécies. A fração lipídica é a que mais oscila

durante o ciclo de vida e a fração de carboidratos no músculo dos peixes é baixa.

O pescado é uma fonte proteica importante, tanto quantitativa, quanto

qualitativamente. Considerando uma variação entre as espécies, o teor sobre a

composição total é alto – entre 15% e 25% (SARTORI, 2012).

Na composição proteica dos pescados encontramos todos os aminoácidos

essenciais e alto valor biológico. Em geral são boas fontes de vitaminas do

complexo B, vitaminas A e D que também podem variar de acordo com

determinadas espécies como, por exemplo, sardinha e salmão.

A carne de pescado também é fonte de cálcio, ferro, fósforo, cobre e selênio

além de iodo particularmente nos peixes de água salgada. Contudo, para os peixes

oriundos da aquicultura o conteúdo dessas vitaminas e minerais é equivalente ao

recebido através da ração (KIRSCHNIK, 2007).

O consumo de pescado, particularmente de peixes gordurosos, uma ou duas

vezes por semana é recomendado, por serem ricos em EPA e DHA. Essa

recomendação é especialmente importante para gestantes e para mulheres que

planejam engravidar, pois, a partir do terceiro trimestre até o segundo ano de vida,

uma criança necessita de um suprimento constante de DHA para a formação do

cérebro e de outras partes do sistema nervoso (SARTORI, 2012).

Os três ácidos graxos ômega-3 mais importantes para a dieta humana são: o

eicosapentaenoico (EPA) e docosaexaenoico (DHA), provenientes principalmente de

peixes marinhos e, ainda, o alfa-linolênico (ALA).

19

As evidências mais fortes de um efeito benéfico dos ácidos graxos ômega-3 estão

relacionadas com doenças cardíacas (SANTOS, 2013).

3.2 Culinária japonesa

A culinária japonesa é comumente associada a pratos feitos com peixe cru.

Porém, ela é rica em ingredientes e rituais milenares.

A refeição comum no Japão é um verdadeiro ritual, segundo ditames da

tradição milenar. Toda a refeição é feita com o hashi, conhecidos como “palitinhos”

(ORNELLAS, 2003).

A sequência dos alimentos é de extrema importância, porque os japoneses

acreditam que a boa digestão depende da combinação e da ordem correta dos

alimentos ingeridos (ORNELLAS, 2003).

A filosofia desta culinária visa limitar ao mínimo possível a interferência da

tecnologia industrial na produção de seus alimentos, que devem ser consumidos na

forma mais natural possível (SALZER, 2001).

Os alimentos oriundos da culinária japonesa, mais difundidos no mundo, são

o sushi e o sashimi. O sushi é preparado com fatias finas de peixe cru, em bolinho

de arroz temperado com molho de vinagre, açúcar e sal, envolto por alga, preparado

manualmente. Já o sashimi consiste de peixe cru, cortado em fatias finas e servido

com molho shoyu (molho de soja) e raiz forte, também preparado manualmente

(MARTINS, 2006).

Estes tipos de alimentos (sushi e sashimi) possuem risco sanitário devido à

grande manipulação e ausência de cocção, mas, há fatores de proteção que são

utilizados para reduzir este risco, como a acidificação do arroz que mantêm o pH a

níveis inferiores a 4.5 impedindo a proliferação dos patógenos no sushi e a

manutenção sob refrigeração para os sashimis.

20

Estes pratos requerem elevado padrão de higiene e um manipulador bem

treinado uma vez que possuem altos riscos de contaminação por agentes biológicos,

físicos e químicos considerados um risco a saúde dos consumidores

(VASCONCELOS et al., 2010).

3.3 Programa de Higienização de Superfícies

De acordo com a RDC 216 de 15 de setembro de 2004 da Agência Nacional

de Vigilância Sanitária – ANVISA, o processo de higienização de superfícies

compreende duas etapas, a limpeza e a desinfecção, obedecendo a essa ordem.

A limpeza consiste na remoção de substâncias minerais e/ou orgânicas

indesejáveis, como terra, poeira, gordura, resíduo de alimentos, já a desinfecção

consiste reduzir o número de microrganismos ao nível que não comprometa a

qualidade higiênico-sanitária do alimento por método físico e/ou agente químico.

Todo agente químico utilizado deve ser registrado na ANVISA e usado de

acordo com as instruções contidas nos rótulos respeitando a concentração a ser

utilizada, forma de diluição caso necessário e a utilização ou não de força mecânica

e agentes físicos.

As operações de higienização devem ser realizadas por funcionários

comprovadamente capacitados e com frequência que garanta a manutenção dessas

condições e minimize o risco de contaminação do alimento.

O plano de limpeza e os procedimentos operacionais padrões (POP´s) de

higienização, contidos no Manual de Boas Práticas do estabelecimento, precisam

estar descritos de acordo com a realidade do local. Nesse documento deve conter a

natureza da superfície a ser higienizada, o método de higienização, o princípio ativo

do agente químico selecionado e a sua concentração, tempo de contato dos agentes

químicos e/ou físicos utilizados na operação de higienização.

21

Habitualmente, o método de limpeza é manual e simples, feito com esponjas,

escovas etc. Os detergentes utilizados apresentam baixa alcalinidade com

temperatura de no máximo 45 °C.

Para a etapa de desinfecção há diversas opções de agentes químicos e a

escolha depende da finalidade de cada princípio ativo, as características da

superfície e a frequência de utilização. Os mais utilizados nos serviços de

alimentação são: álcool 70º, quaternário de amônio, liberadores de cloro ativo,

peróxido de hidrogênio, ácido peracético e a combinação dos dois últimos.

O álcool etílico em uma concentração de 70% do princípio ativo é o mais

utilizado por apresentar ação antimicrobiana mais eficiente, desnaturando a proteína

e removendo o lipídeo na membrana celular dos microrganismos (ANDRADE, 2008).

Atua também, como bactericida contra formas vegetativas de bactérias Gram-

negativas e Gram-positivas, fungos, vírus e micobactérias, no entanto, não são

esporicidas e perde a eficácia em presença de matéria orgânica, o que exige uma

eficiente etapa de limpeza (PAULINO, 2010).

3.4 Pescado

Pescado compreende peixes, crustáceos, moluscos, anfíbios, quelônios e

mamíferos de água doce ou salgada, usados na alimentação humana (BRASIL,

1997).

Os peixes são alimentos altamente perecíveis, e se forem estocados,

processados, embalados e/ou distribuídos inadequadamente, deterioram-se

rapidamente e tornam-se inseguros para o consumo devido ao crescimento

microbiano (MALAVOTA, 2008).

A deterioração do peixe depende de diversos fatores externos tais como, BPF

dos barcos pesqueiros, condições da água e BPM. No entanto, um desses fatores,

produção de mucina, é intrínseco ao pescado. Mucina é uma glicoproteína liberada

22

por glândulas subcutâneas como reação do organismo ao entrar em contato com um

ambiente adverso. É um excelente meio de desenvolvimento de microrganismos o

que contribui para deterioração acelerada (FERREIRA et al., 2012).

A grande concentração de compostos nitrogenados não proteicos em sua

musculatura, principalmente moléculas pequenas e soltas nos líquidos tissulares são

muito utilizadas pelas bactérias durante a alteração do pescado. Além disso, a

musculatura dos peixes frescos são um excelente substrato para o desenvolvimento

microbiano devido a sua grande atividade de água, pH neutro e nutrientes solúveis

(ICMS, 1980).

A partir do rigor mortis as alterações bioquímicas que ocorrem também

influenciam o crescimento de diversos microrganismos como mostrado na Figura 1.

Fase Modificações nos tecidos Contagem bact.

Fase I

(0 a 5 dias em gelo)

● Rigor Mortis

● Modificações em tipos de

bactérias

● Oxidação de compostos

orgânicos (odor)

102 – 103 UFC/cm2

Fase II

(5 a 10 dias em gelo)

● Aparente crescimento

microbiano

● Aumenta NH3

103 – 106 UFC/cm2

Fase III

(10 a 14 dias em gelo)

● Crescimento microbiano

rápido

● Penetração tissular

● Aumento da oxidação de

compostos orgânicos

● Ácidos e Bases voláteis

aumentam

106 – 108 UFC/cm2

Fase IV

(mais de 14 dias em gelo)

● Carga bacteriana estabiliza

● Modificações de espécies

Acima de 108

UFC/cm2

23

bacterianas

● Bases e ácidos voláteis

aumentam rapidamente

● Oxidação de compostos

orgânicos aumenta ou estabiliza

● Proteólise

● Formação de H2S e outros

produtos

Figura 1. Fases, modificações e crescimento microbiano em pescados.

Fonte: ICMS, 1980.

A legislação brasileira atual, RDC nº12, de 02 de janeiro de 2001, da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA – exige a análise de Salmonella spp,

Coliformes a 45°C.

O principal representante dos Coliformes a 45ºC de importância em saúde

coletiva é a E.coli e Estafilococos coagulase positiva, os quais são comumente

associados a Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA).

O Brasil constitui um dos grandes importadores de pescado no mercado

internacional, portanto, parte dos pescados utilizados em restaurantes brasileiros

especializados em culinária japonesa chega ao restaurante congelado,

principalmente o salmão. Algumas espécies, porém, são comercializados frescos,

como por exemplo, o namorado e atum. Para garantir a qualidade do alimento faz-se

necessário a utilização de métodos que desacelerem as reações enzimáticas

naturais e a deterioração microbiana após a captura pelo fornecedor. (MACEDO,

1993)

Além do momento da captura e distribuição, o estabelecimento que fornece o

pescado como produto final precisa atender as Boas Práticas de Fabricação

preconizadas em Portaria 326/97 (MAPA) e resolução (RDC 275/2002) para

indústria de alimentos e RDC 216/2004 para Serviços de Alimentação, como os

restaurantes garantindo que o produto final atinja os padrões aceitáveis para o

consumo humano.

24

3.5 Escherichia coli

Foi descrita em 1885 por Theodore Escherich, pediatra alemão, como Bacillus

coli comune. Após revisão, foi denominada Escherichia coli referindo-se ao

pesquisador que a descobriu.

A bactéria é um bacilo Gram-negativo facultativo, pertence à família

Enterobacteriaceae, é mesófilo capaz de se desenvolver entre 7 e 46º C, tendo

temperatura ótima de 37º C. É um dos microrganismos mais comum no trato

gastrointestinal humano e animal (FRANCO et al., 2005).

Apesar de serem membros da microbiota humana/animal, algumas delas

podem causar doenças, devido à aquisição de fatores de virulência por transferência

horizontal (NATARO et al., 1998).

Essas cepas capazes de causar doenças são denominadas patogênicas e

podem causar infecções intestinais e extra intestinais. Por isso, essa bactéria é de

grande importância em análises de alimentos.

Lima et al. (2010) realizaram análises de 40 amostras de sushis e sashimis

comercializados na cidade de Recife, sendo vinte delas provenientes de

estabelecimentos especializados na culinária japonesa e vinte de estabelecimentos

não especializados. Das amostras oriundas dos estabelecimentos não

especializados, 40% apresentaram valores acima do permitido para Coliformes

Termotolerantes (45 ºC) pela Legislação vigente (102 UFC/g) e 20% provenientes

dos estabelecimentos especializados apresentaram contaminação com E.coli.

Martins (2006) demonstrou um alto número de amostras contaminadas. Do

total de vinte amostras analisadas, 45% (nove amostras) apresentaram contagem de

E. coli acima do limite aceitável, apontando o risco deste produto à população.

3.6 Biofilmes microbianos

25

Os biofilmes são complexos conglomerados de células envoltos em uma

matriz de exopolissacarídeo (EPS), formados nos mais variados tipos de superfície,

inclusive as utilizadas na produção de alimentos (BOARI, 2008).

A adesão das células planctônicas (células livres) se inicia pelo acúmulo de

material orgânico e inorgânico em uma superfície sobre as quais pode se

desenvolver conglomerados bacterianos. Essa adesão inicial pode ser reversível

(OLIVEIRA, 2009).

Posteriormente, essa interação torna-se cada vez mais forte entre a superfície

e as células, com a produção da matriz EPS. Esta fase é irreversível. As células

fortemente aderidas à superfície, constituindo o biofilme são denominadas células

sésseis. Após a formação do biofilme, a aplicação de força mecânica é necessária

para romper sua estrutura e permitir a ação dos agentes de higienização para sua

eliminação (OLIVEIRA, 2009).

A matriz protege as células do biofilme contra a ação de biocidas e outros

produtos tóxicos garantindo a coesão das células no interior do biofilme e a

associação de outros microrganismos – biofilmes mono ou multi-espécies -

(COSTERTON et al., 1994).

Além dessa proteção as bactérias que estão crescendo desenvolvem

diferenças fenotípicas, bioquímicas e morfológicas comparado com as planctônicas

(ITO et al., 2009). Essas diferenças possibilitam que bactérias como E.coli possam

viver fora do hospedeiro por certo tempo (PAWAR et al., 2005)

Posteriormente, as células maduras podem se desprender e contaminar

outros alimentos e superfícies, como as de utensílios. Essa habilidade de

transferência independe da quantidade de células e é denominada potencial de

biotransferência (COSTA, 1999).

26

Figura 2. Etapas de adesão, formação e dispersão do Biofilme.

Fonte: Stoodley et al., 2002.

A biotransferência permite, também, a formação de novos pontos de

aderência celular e a formação de um novo biofilme tornando um ciclo de

contaminação cada vez maior (MIDELET et al., 2004).

Já foi observado que amostras de E.coli que apresentam padrão de adesão

agregativa produzem biofilme regularmente (SHEIK et al., 2001) e estão

relacionadas com infecções persistentes, as vezes por mais de 14 dias (CRAVIOTO

et al., 1991). De acordo com Poulsen (1999) Pseudomonas, Alcaligenes,

Enterobacter, Staphylococcus, Bacillus, Flavobacterium e Escherichia coli tem maior

tendência em formar biofilme.

27

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostras

Foram analisadas amostras de filé de peixe fresco sem pele das espécies de

peixe Namorado, Salmão e Atum, adquiridos em mercados variados localizados no

Estado do Rio de Janeiro.

Foram retirados 25g de cada filé com auxílio de colher estéril adicionados em

225ml de Água peptonada em seguida foram colocado em stomacher por 10

minutos seguindo as análises microbiológicas descritas abaixo.

4.2 Análises Microbiológicas

4.2.1 Isolamento

A pesquisa foi realizada utilizando-se placas 3M Petrifilm™, segundo

recomendação do “Compendium of Methods for the Microbiological Examination of

Foods” da APHA (KORNACKI;JOHNSON, 2001). Nesta pesquisa realizou-se a

determinação E.coli.

28

4.2.2 Identificação e confirmação de E.coli

Este grupo de bactérias foi detectado a partir de placas 3M Petrifilm™.

As Placas 3M Petrifilm™ para Contagem de E.coli e Coliformes contêm

nutrientes do meio Vermelho Violeta Bile, um agente geleificante solúvel em água

fria, um indicador de atividade glicuronidásica e um indicador que facilita a

enumeração da colônia. A maioria das E.coli (cerca de 97%) produz beta-

glicuronidase cuja presença é indicada pela formação de precipitado azul associado

a colônia. O filme superior retém o gás formado pelos coliformes e E.coli que são

fermentadores de lactose. Cerca de 95% das E.coli produzem gás e esta produção é

indicada pela coloração azul a vermelho azulada das colônias, associadas ao gás

retido na Placa Petrifilm (dentro de, aproximadamente, o diâmetro de uma colônia).

Foi pipetados 1 mL do inóculo homogeneizado em placas de Petrifilm™,

incubadas a 35ºC por 48 horas. As colônias típicas de E.coli foram isoladas e

semeadas em ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). As placas foram incubadas a

35°C por 48 horas e após apresentando colônias verdes brilhantes. A partir das

placas de EMB, as colônias foram semeadas em TSA para verificação da pureza e

em TSB para congelamento a -80ºC com glicerol.

Figura 3. Exemplo e detecção de E.coli em placas 3M Petrifilm™.

Fonte: Guia de Interpretação Placas 3M Petrifilm™ para Contagem de E.coli e Coliformes

29

Figura 4 e 5. Confirmação da pureza em TSA e crescimento em EMB.

Figura 6. Inoculação do líquido em placa de Petrifilm™.

Fonte: Guia de Interpretação Placas 3M Petrifilm™ para Contagem de E.coli e Coliformes

30

4.3 Formação de biofilmes microbianos

Foram utilizados cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4. Este material é o

mais utilizado na construção de equipamentos para o processamento de alimentos.

Cada cupom tem dimensões de 10 x 10 x 1 mm de espessura e foram limpos e

descontaminados individualmente com acetona pura, lavados com água destilada e

finalmente limpos e secos com álcool 70%. Após esta etapa os cupons foram

esterilizados em autoclave a 121°C por 30 minutos.

Para a determinação da capacidade de formação de biofilmes microbianos,

foram utilizadas 1 cepa isolada de salmão, 1 isolada de atum, 4 cepas isoladas da

superfície da indústria de pescado (EED2 2V, EED2 3V, TRD1 1V e TRD2 1V)

(JOSÉ, 2014), e uma cepa ATCC de E.coli 29222.

Os cupons limpos foram colocados em tubos Falcon contendo 9 ml de TSB

que foi previamente inoculado com suspensão de E.coli. O número de células

iniciais foi de 103 UFC/ml. Os tubos foram incubados por 25°C (mimetizar a

temperatura ambiente) por 48 horas e avaliados imediatamente para confirmar a

contagem inicial, e após 4 horas (4h), 8 horas (8h), 24 horas (24h) e 48 horas (48h).

Após os períodos estabelecidos, o cupom foi retirado com o auxílio de uma

pinça estéril e adicionado em tubo com 10 ml de PBS e agitado levemente por 1

minuto para retirar as células planctônicas. Em seguida o cupom é retirado

novamente com pinça e adicionado a um tubo com 5 ml de PBS e por 2 minutos no

vórtex. Diluições decimais sucessivas foram realizadas a partir deste último tubo de

PBS conforme a Figura 8.

31

Figura 7. Fluxograma da etapa de diluição seriada para contagem de células

sésseis aderidas ao cupom.

As diluições foram semeadas por spread plate em TSA e posteriormente

incubadas a 35ºC por 48 horas.

Hora Diluição Diluição Semeada

4h 100 – 10-1 100 – 10-1

8h 10-1 – 10-4 10-2 – 10-4

24h 10-1 – 10-5 10-3 – 10-5

48h 10-1 – 10-5 10-3 – 10-5

Figura 8. Diluições por hora e diluições semeadas

4.4 Análise Estatística dos Dados

Todos os experimentos foram realizados em duas repetições independentes

em duplicata. Os resultados das médias aritméticas foram expressos em UFC/cm2.

O tratamento estatístico dos resultados obtido foi realizado pela análise de variância

(ANOVA) em delineamento inteiramente casualizado, com nível de significância de

32

5% (p>0,05). Para comparação entre as médias foi utilizado o teste de comparação

múltipla de Tukey. Para tal, foi utilizado o programa GraphPad Prism, versão 5.01.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram isoladas E.coli da amostra de atum e de Salmão. A amostra de

Namorado não apresentou o microrganismo em questão.

Diferente dos resultados obtidos do presente estudo no isolamento de E.coli

de pescados nas amostras de salmão e atum, Farias e Freitas (2008) verificaram em

estudo da qualidade microbiológica de pescado beneficiado em indústrias, que não

foi confirmada a presença de E.coli entre os coliformes termotolerantes em amostras

de peixe eviscerado, filé de peixe congelado peixe inteiro congelado.

33

Uddin et al. (2013) e Basti et al. (2006) em pesquisa com peixes recém-

capturados demonstraram que tal microrganismo não faz parte da microbiota natural

de peixes e aparece, em decorrência de falhas no processo de higiene durante a

manipulação.

Na avaliação da capacidade de formação de biofilmes a 25 °C houve

formação de biofilme por todas as cepas de E.coli em cupom de aço inoxidável a

partir das primeiras 4 horas (Figura 9).

Foi observada uma tendência exponencial de aumento de células sésseis ao

longo das 48 horas pesquisadas. Esses resultados corroboram com Stoodley et al.

(2002), que demonstraram que este aumento de células faz parte do próprio

processo de maturação do biofilme, podendo acontecer em até dez dias após a

adesão inicial das células planctônicas.

A evolução do número de células sésseis aderidas à superfície do cupom de

aço inoxidável após remoção das células planctônicas, caracterizando a formação

de biofilmes de E.coli é apresentada na Tabela 1 e Figuras 9 e 10.

De uma forma geral, a contagem média de células de E.coli sobre superfícies

de aço inoxidável atinge valores superiores a 4 log UFC/cm2 após 24 horas de

contato atingindo no máximo 5 log UFC/cm2 após 48 horas.

Tempo/cepas

ATCC SALMÃO ATUM EED2 2V EED2 3V TRD1 1VTRD2

1VContagem (log UFC/cm2 *± DP**)

4 h2,021aA ±

0,0912,146aB ±

0,1572,070aC ±

0,0132,021aAC ±

0,3611,860aBD ±

0,2472,051aA ±

0,2472,011aA

± 0,354

8 h2,352bA ±

0,0642,720bB ±

0,0912,903bC ±

02,176bD ±

02,243bE ±

02,439bF ±

0,0572,439bF

± 0,057

24 h4,051cA ±

0,1064,204cB ±

0,1774,273cC ±

0,1954,447cD ±

0,0714,061cA ±

0,0784,114cA ±

04,495 cD

± 0,042

48 h5,021dA ±

0,0294,796dB ±

0,1254,954dC ±

0,0694,720dC ±

0,0854,677dD ±

0,0994,477dE ±

04,778dB

C ± 0

Tabela 1. Contagem de cepas de E.coli padrão, isoladas de alimentos e superfícies.

34

*Média de duas repetições em duplicata. **Desvio Padrão (DP). Diferença entre letras minúsculas nascolunas indica presença de diferença estatística (p>0,05) entre os tempos analisados. Diferença entreletras maiúsculas na mesma linha indica presença de diferença estatística (p>0,05) entre as amostras.

Em todas as cepas analisadas houve diferença significativa (p>0,05) entre os

tempos analisados, demonstrando uma progressão constante no crescimento

microbiano do biofilme (Figura 9)

Em uma avaliação de formação de biofilmes em aço inoxidável por cepas de

E.coli, Rivas et al. (2007), observou que a capacidade de adesão teve diferença

significativa entre as cepas, tanto para 24 horas como para 48 horas de incubação,

não tendo sido constatada diferença significativa após 48 horas. As contagens

variam de <3 log UFC/cm2 a 5 log UFC/cm2 para 24 e 48 horas, respectivamente. As

contagens de UFC/cm2 são similares ao do presente trabalho.

Em relação à diferença de comportamento entre as cepas no mesmo tempo

de incubação, ocorreram diferenças significativas (p>0,05) entre diferentes cepas

analisadas, embora em alguns casos esta diferença não foi observada (Tabela 1).

As diferenças entre as cepas demonstram que podem ocorrer adaptações de acordo

com as fontes de isolamento, evidenciando a importância de pesquisa dos

microrganismos encontrados no ambiente de estudo e não generalização do gênero

e espécie microbiana, para que assim o programa de higienização seja mais

eficiente.

Observa-se um aumento na formação de biofilme pelas cepas isoladas de

pescados em comparação com a cepa padrão (ATCC) até 24 horas de contato. Até

8 horas de contato evidencia-se que as cepas isoladas da superfície de indústria de

pescado e a ATCC apresentaram menor formação de biofilme do que as demais

cepas. No tempo de 48 horas somente a cepa ATCC alcançou 5 log UFC/cm2, como

observado no Figura 9.

35

Figura 9. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis aderidas sobre cupom de

aço inoxidável por hora de incubação. Cada barra corresponde à média aritmética de duas

repetições em duplicata.

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 480.0

0.8

1.6

2.4

3.2

4.0

4.8

ATCC

SalmaoAtumEED2EED2 3VTRD1 1VTRD2

tempo (horas)

log

UFC

/cm

2

Figura 10. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis aderidas sobre cupom de

aço inoxidável por hora de incubação.

O maior número médio de células sésseis de E.coli foi encontrado na cepa

ATCC após 48 horas, sendo este de 5 log UFC/cm2, e o menor número foi

encontrado na cepa TRD1 1V 4 log UFC/cm2, sendo apenas um logaritmo inferior.

36

Individualmente verificamos que há um aumento maior da formação de

biofilme até 24 horas do que entre 24 a 48 horas, como mostra as figuras 8 e 9.

Segundo alguns autores esse fenômeno pode ser observado em biofilmes maduros

e pode ocorrer em algumas horas até semanas, quando passam a apresentar

padrões de crescimento alterados, as células podem se desprender e contaminar o

que entrar em contato, tanto alimento como outras superfícies (KASNOWSKI et al.,

2010; OLIVEIRA et al., 2010).

Em um estudo, Ortega et al. (2010) avaliou o comportamento da adesão de

cepas de Escherichia coli em superfície de aço inoxidável e observou que as células

sésseis atingiram a fase estacionária com 3 a 4 horas de incubação, tempo menor

do que o evidenciado nesse estudo.

Este estudo foi realizado com biofilmes mono–especies (E.coli), porém os

comportamentos dos microrganismos podem variar conforme a associação com

outros microrganismos, fato este comum na produção de alimentos. Sasahara e

Zottola (1993) verificaram que a formação de biofilmes por Listeria monocytogenes

foi aumentada na presença de Pseudomonas fragi. Os resultados neste trabalho

evidenciam que mesmo biofilmes mono-espécies são preocupantes em uma

indústria de alimentos, porém é importante para trabalhos futuros, estudar a

associação com outros microrganismos.

É de suma importância estudar especificamente os microrganismos presentes

nas superfícies de indústrias e restaurantes e como reagem a diferentes princípios

ativos dos agentes químicos, tempo de ação, modo de aplicação, frequência de uso

e a necessidade de ação mecânica para que a higienização seja eficaz evitando a

formação de biofilme bacteriano e a contaminação dos alimentos, garantindo a

qualidade higiênico-sanitária das preparações que chegam ao consumidor.

O presente trabalho evidenciou que a frequência da higienização das

superfícies de aço inoxidável em que são manipulados pescados, precisa ser menor

que 4 horas, tendo em vista que a partir de 4 horas, verificamos a aderência de

E.coli a temperatura ambiente.

6 CONCLUSÃO

37

Este trabalho evidenciou a presença de E.coli, importante indicador de

qualidade higiênico sanitário, em pescado comercializado no Estado do Rio de

Janeiro, demonstrando contaminação. Comprovou-se a capacidade destas cepas e

de E.coli oriundas da superfície de indústria de pescados e cepa padrão em formar

biofilmes em superfícies de aço inoxidável AISI 304 #4.

Estes dados demonstram o risco da utilização dos pescados para o consumo

cru e que sua manipulação sem a correta higienização pode levar a formação de

biofilmes microbianos, com a contaminação crônica das superfícies de

equipamentos e instalações utilizadas no processamento de pescados, com maior

resistência aos agentes de higienização, acarretando em contaminação cruzada dos

alimentos e risco à saúde do consumidor.

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