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Universidade de São Paulo Faculdade de Saúde Pública

Determinação de grupos filogenéticos e pesquisa de genes de virulência em isolados de Escherichia coli

obtidos de amostras de queijo Minas

Suzete Contrera de Moura Pedro

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública para obtenção do título de Doutor em Saúde Pública.

Área de concentração: Serviços de Saúde Pública.

Orientadora: Professora Associada Maria Helena Matté.

São Paulo 2009

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Determinação de grupos filogenéticos e pesquisa de genes de virulência em isolados de Escherichia coli

obtidos de amostras de queijo Minas

Suzete Contrera de Moura Pedro

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública para obtenção do título de Doutor em Saúde Pública.

Área de concentração: Serviços de Saúde Pública.

Orientadora: Professora Associada Maria Helena Matté.

São Paulo 2009

3

É expressamente proibida a comercialização deste documento, tanto na sua forma impressa como eletrônica. Sua reprodução total ou parcial é permitida exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, desde que na reprodução figure a identificação do autor, título, instituição e ano da tese.

4

Dedico este trabalho a minha amada família,

ternos companheiros de vida.

5

AGRADECIMENTOS

Cada etapa da vida vem repleta de sentimentos e emoções. Nos

decepcionamos, sentimos tristeza, há momentos de alegria e animação, as

descobertas nos surpreendem, as dúvidas causam angústias, fazemos inúmeros

sacrifícios e também obtemos prazer e satisfação. Viver intensamente cada momento,

extrair o melhor de cada aprendizado torna a vida muito especial. Agradeço a Deus a

oportunidade de mudar com cada experiência. Agradeço aos meus companheiros de

jornada que vibram comigo nos contentamentos e me amparam nas consternações.

Agradeço ao meu marido Cláudio, infatigável co-participante, meu maior

incentivador, aos nossos filhos, Felipe e Frederico, pelo constante apoio e carinhoso

estímulo.

Aos meus pais, Zinho e Flora, ao meu irmão Silvio, aos meus saudosos sogro

e sogra, cunhados e cunhadas, sobrinhos e sobrinhas, agradeço a torcida e entusiasmo

nas vitórias alcançadas.

Meus agradecimentos aos meus saudosos, vovó Maria e Angel, que mesmo

sem entenderem muito, vibravam ao ouvir as novidades.

A Professora Associada Maria Helena Matté meus sinceros agradecimentos

pela orientação prestada, pelo incentivo em transpor barreiras e obstáculos.

Ao Professor Titular Pedro Manuel Leal Germano agradeço imensamente a

confiança e a oportunidade ímpar de crescimento profissional.

Aos Professores Associados Maria Helena e Glavur Rogério Matté agradeço

o amistoso acolhimento no Laboratório de Saúde Pública possibilitando de todas as

formas minha atualização e aprimoramento.

A Professora Associada Maria Cecília e Américo Pelicioni eternamente

agradecida pela generosa amizade e confiança que foram fundamentais para meu

progresso.

A Professora Doutora Nicolina Silvana Romano Lieber agradeço o constante

incentivo, nossa afetuosa convivência e sempre simpática amizade.

6

A Miriam Lopes da Silva agradeço a terna amizade, o firme apoio, o reiterado

auxílio e a vibração em todas as conquistas.

A Milena Dropa jovial amizade, agradeço a torcida e a freqüente ajuda no

laboratório.

Agradeço a agradável convivência e a todos os colegas que direta ou

indiretamente auxiliaram na execução deste trabalho: Ana Maria, Andréa, Angélica,

Agnes, Cláudia, Gillian, Lívia, Lícia, Lúcia, Elaine, Fernanda, Elenice, Karla,

Magali, Marisa, Maria do Carmo, Maria Tereza, Martha, Mônica, Rita, Rosinha,

Ronalda, Silvia, Silvana, Solange, Suzi, Therezinha, Thiago, Vandréa, Vera Cecília e

Viraneide.

Agradeço aos funcionários da Biblioteca, do Departamento de Prática de

Saúde Pública e do Departamento de Pós Graduação da Faculdade de Saúde Pública

a importante colaboração e o simpático convívio.

Agradeço o carinhoso apoio dos queridos amigos do Laboratório de Saúde

Pública da Lapa e da Supervisão de Saúde Lapa-Pinheiros.

Agradeço a paciência, a torcida e o incentivo na correção final do trabalho

dos amigos da Vigilância Ambiental, em especial a Teresa, Giuliano, Stela, Edna,

Valquíria, Celinha, Regina, Léo, Dirceu e Angélica.

A cada membro da banca Professora Doutora Maria Inês Zanoli Sato,

Professor Doutor Waldir Pereira Elias Júnior, Professora Doutora Maria Tereza Pepe

Razzolini, Professora Doutora Lúcia Baldassi e a Professora Doutora Márcia Regina

Franzolin, agradeço a atenção e a consideração em dispor de seu valioso tempo para

prestar uma inestimável e fundamental colaboração na correção do trabalho.

7

“Quem mexeu no meu queijo?”

Spencer Johnson

8

RESUMO

Pedro SCM. Determinação de grupos filogenéticos e pesquisa de genes de

virulência em isolados de Escherichia coli obtidos de amostras de queijo Minas

[Tese Doutorado]. São Paulo. Faculdade de Saúde Pública da USP. 2009.

Introdução. A pesquisa de Escherichia coli em alimentos é relevante para a Saúde

Pública porque indica a contaminação fecal e a qualidade do produto oferecido ao

consumidor. A determinação do grupo filogenético e de fatores de virulência de E.

coli permite identificar a existência de cepas patogênicas que poderiam causar

doença. Objetivos: Determinar o grupo filogenético e fatores de virulência de

isolados de E. coli pertencentes aos patotipos ETEC, EIEC, EPEC, STEC e EAEC

usando métodos moleculares, obtidos de amostras de queijo Minas, discutir a

presença dos patotipos nas amostras e o significado para Saúde Pública. Métodos.

250 isolados de Escherichia coli provenientes de 10 amostras de queijo Minas foram

utilizados para a realização do estudo. O DNA genômico foi extraído e neste foi

realizado a reação de PCR multiplex. Resultados. Os resultados demonstraram que

dos 250 isolados, 93,2% foi classificado como grupo filogenético A, 3,2% como B1,

2,8% como B2 e 0,8% como D. Dos 250 isolados estudados, em 96,8% (242) foram

encontrados fatores de virulência, sendo 91,6% de marcadores para ETEC, 0,4% para

EPEC e 4,8% para EAEC. Conclusões. Houve predominância de fatores de

virulência do patotipo ETEC e do grupo filogenético A. A presença de fatores de

virulência indica que as amostras de queijo estavam contaminadas e poderiam causar

doença, evidenciando a necessidade de medidas de controle efetivas por parte das

autoridades sanitárias, bem como campanhas educativas.

9

Descritores: Saúde Pública, queijo Minas, Escherichia coli enteropatogênica, grupos

filogenéticos, fatores de virulência.

10

ABSTRACT

Pedro SCM. Determinação de grupos filogenéticos e pesquisa de genes de virulência

em isolados de Escherichia coli obtidos de amostras de queijo Minas. [Determination

of phylogenetic groups and search of virulence genes in isolated Escherichia coli

from Minas cheese samples [Tese de doutorado]. São Paulo. Faculdade de Saúde

Pública da USP. 2009.

Introduction. The search of Escherichia coli in foods is relevant for the Public

Health because it indicates the fecal contamination and the product quality offered to

the consumer. The determination of phylogenetic group and virulence factors of E.

coli, allows the identification of the existence of pathogenic strains that could cause

disease. Objectives: Determine the phylogenetic group and the pathogenic of

Escherichia coli belonging to the patotipos isolated occurrence ETEC, EIEC, EPEC,

STEC and EAEC using molecular methods obtained from Minas cheese samples, to

discuss the presence of the patotipos in the samples and the meaning for Public

Health. Methods. 250 isolates of Escherichia coli from 10 Minas cheese samples

was used for the accomplishment of the study. Genomic DNA was extracted and in

this the multiplex reaction PCR was accomplished. Results. The results

demonstrated that the isolates 250, 93.2% were classified as phylogenetic group A,

3.2% as B1, 2.8% as B2 and 0.8% as D. Of the isolates 250 studied, in 96.8% (242)

were found virulence factors, being 91.6% of markers for ETEC, 0.4% for EPEC and

4.8% for EAEC. Conclusions. There was predominance to virulence factors of the

patotipo ETEC and the phylogenetic group A. The presence of virulence factors

indicates that the cheese samples were contaminated and they could cause disease,

11

put in evidence the need of effective control measures on the part of the sanitary

authorities, as well as educational campaigns.

Descriptors: Public Health, Minas cheese, enteropathogenic Escherichia coli,

phylogenetic group, virulence factors.

12

ÍNDICE

1.INTRODUÇÃO 16

1.1. JUSTIFICATIVA 16

1.2. ANÁLISE DA LITERATURA 17

1.2.1. Legislação de alimentos no Brasil 17

1.2.2. Coliformes em alimentos- Escherichia coli 19

1.2.3. Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) 22

1.2.4. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) 24

1.2.5. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) 26

1.2.6. Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) 27

1.2.7. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) 31

1.2.8. Grupos Filogenéticos 34

1.2.9. Reação de polimerização em cadeia (PCR) 37

2.OBJETIVOS 38

3.MATERIAL E MÉTODOS 39

3.1. ISOLADOS BACTERIANOS- Escherichia coli 39

3.2.REISOLAMENTO E CONFIRMAÇÃO DA VIABILIDADE E PUREZA DAS CEPAS

40

3.3.MÉTODOS MOLECULARES 40

3.3.1. Extração do material genético 40

3.3.2. Reação em cadeia pela polimerase (PCR) 41

3.3.3. Eletroforese em gel de agarose 44

4.RESULTADOS 45

4.1. GRUPOS FILOGENÉTICOS 45

4.2. DETECÇÃO DE MARCADORES DE VIRULÊNCIA 48

13

5. DISCUSSÃO 56

6. CONCLUSÕES 62

7. REFERÊNCIAS 63

Lista de Quadros

Quadro 1. Tipo de queijo Minas e local de aquisição das amostras

utilizadas para obtenção dos isolados de E. coli. São Paulo, 2003

(PEDRO, 2003).

39

Quadro 2. Seqüência dos iniciadores da PCR e tamanho esperado dos

produtos que foram utilizados na determinação filogenética e de fatores

de virulência dos isolados de E. coli.

44

Lista de Figuras

Figura 1. Diagrama de Venn ilustrando patotipos de E. coli, EHEC/

VTEC/ EPEC (baseado no estudo de NAYLOR e col., 2005). 30

Figura 2. Esquema representando os grupos filogenéticos utilizando

iniciadores para os genes chuA, yjaA e o fragmento de DNA TSPE4.C2

(CLERMONT e col., 2000).

35

Figura 3. Gel de agarose contendo os fragmentos obtidos para isolados

de Escherichia coli representativos dos perfis filogenéticos. M-

Marcador de peso molecular 100pb, 1- isolado 298 Grupo A, 2- isolado

299 Grupo A, 3 - isolado 300 Grupo B1, 4- isolado 302 Grupo D, 5 -

isolado 303 Grupo A, 6 - isolado 309 Grupo D. São Paulo, 2009.

46

14

Figura 4. Proporção de E. coli do total dos isolados estudados por

grupo filogenético nas 10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009.

47


fatores de virulência nas 10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009.

48

Figura 6. Diferentes perfis obtidos de isolados de Escherichia coli

utilizadas como controle positivos. M- Marcador de Peso molecular, 1 –

E. coli Verotoxigenica, 2 – IAL339, 3 – IAL399, 4 – IAL 1893, 5 –

IAL1895, 6 – IAL1896, 7 – IAL1848, 8 - E. coli enteroinvasiva

(isolado clínico), 9 - E. coli enteroagregativa (isolado clínico).

50


patotipos nas 10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009.

51

Lista de Tabelas

Tabela 1. Número e proporção dos isolados de E. coli nas amostras de

queijo Minas. São Paulo, 2009. 45

Tabela 2. Número dos isolados de E. coli por grupos filogenéticos nas

10 amostras de queijo Minas. São Paulo. 2009. 47

Tabela 3. Número dos isolados de E. coli por fatores de virulência nas

10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009. 49

Tabela 4. Número e proporção dos isolados de E. coli por patotipo nas

10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009. 51

Tabela 5. Número de isolados de E. coli por patotipo e por filogrupo na

amostra 1 de queijo Minas. São Paulo, 2009. 52





15





Tabela 10. Número de isolados de E. coli por patotipo e por filogrupo

na amostra 6 de queijo Minas. São Paulo, 2009. 54









16

1. INTRODUÇÃO

1.1. JUSTIFICATIVA

O queijo Minas é um produto de paladar suave que agrada desde crianças até

idosos, e é muito utilizado como componente de dietas, de preço acessível, alimento

facilmente encontrado em diversos pontos de venda, desde o comércio informal até

em grandes redes de hipermercados.

É um produto de alto valor nutritivo e que possui condições de pH e umidade

que favorecem o crescimento microbiano. Esses fatores quando associados às

deficientes condições da produção artesanal, de transporte, que na maioria das vezes

não é refrigerado, ao armazenamento em locais inapropriados e também à

comercialização do produto fracionado, podem representar um risco ainda maior de

contaminação microbiana.

Na dissertação de Mestrado (PEDRO, 2003) os resultados indicaram um

número expressivo de amostras de queijo Minas contaminadas por coliformes fecais

acima do permitido pela legislação em vigor, e desses foram isolados Escherichia

coli.

A presença de Escherichia coli em um alimento é um indicador da falta de

qualidade higiênico sanitária, pesquisando a literatura observa-se que há poucos

trabalhos publicados sobre E. coli enteropatogênica em alimentos.

A E. coli é habitante natural da microbiota humana e de animais

homeotérmicos, e quando presente no alimento sugere que outros patógenos

17

intestinais podem estar presentes e que o mesmo teve em algum momento contato

com fezes.

Os isolados de E. coli podem ser pesquisados por meio de métodos clássicos

(fenotípicos) e por meio de métodos moleculares (genotípicos).

O método molecular permite a identificação de genes de virulência e de

grupos filogenéticos presentes em microrganismos isolados, inclusive obtidos de

amostras de queijo, indicando a possibilidade da ocorrência de doença a partir da

ingestão desse alimento.

Os fatores descritos justificam a importância de se realizar um estudo na área

da Saúde Pública, visando avaliar a contaminação por E. coli enteropatogênica do

queijo Minas oferecido ao consumidor.

1.2. ANÁLISE DA LITERATURA

1.2.1. Legislação de alimentos no Brasil

Alguns estudos têm revelado uma deficiente qualidade higiênico sanitária dos

queijos comercializados. Todas as etapas de fabricação do queijo devem obedecer a

normas operacionais pré-estabelecidas, desde a recepção do leite utilizado como

matéria prima até o produto final, de modo a impedir a contaminação do produto ou

alterações em sua composição normal.

No Brasil, há uma legislação vigente que estabelece limites de tolerância para

microrganismos em alimentos, a Resolução da Diretoria Colegiada da Agência

18

Nacional de Vigilância Sanitária 12 de 2 de janeiro de 2001 (RDC 12/ 2001)

(BRASIL, 2001).

Pesquisas realizadas no Brasil, em queijo Minas e água demonstraram que

muitos produtos comercializados estavam fora dos padrões da legislação citada.

PERESI e col. (2001) realizaram análise microbiológica em 30 amostras

artesanais de queijo Minas frescal em feiras livres de São José do Rio Preto (SP) e

em 30 amostras industrializadas coletadas em supermercados revelando que 23,3%

das amostras industrializadas e 76,7% das amostras de produção artesanal estavam

em desacordo com a legislação vigente devido à presença de coliformes fecais e

cepas de estafilococos coagulase positiva acima do permitido.

SILVA e col. (2001) observaram que 95,7% do queijo Minas frescal artesanal

produzido em São José do Rio Preto (SP) e comercializado em feiras livres estavam

em desacordo com a legislação em vigor.

RABELO e col. (2001) analisaram 160 amostras de queijo Minas frescal no

Estado de Goiás, revelando que 43% das amostras apresentaram contaminação por

coliformes fecais e por estafilococos coagulase positiva em desacordo com a

legislação em vigor.

AMARAL e col. (2003) em um estudo realizado na região Nordeste do

Estado de São Paulo, determinaram que o número mais provável de coliformes

estava fora dos padrões microbiológicos de potabilidade para água destinada ao

consumo humano. Os autores concluíram que a água utilizada nas propriedades

rurais, que também pode ser utilizada na fabricação do queijo, é um importante fator

de risco à saúde dos seres humanos que a utilizam sendo necessário à adoção de

medidas preventivas.

19

BORGES e col. (2003) pesquisaram queijo coalho produzido em diferentes

regiões do Ceará e verificaram que cerca de 90% das amostras estavam acima do

permitido pela legislação para contagem de coliformes fecais.

Em um estudo realizado em São Paulo foi observado que do total de amostras

estudadas, estavam em desacordo com a legislação em vigor, 26,7% devido à

presença de estafilococos coagulase positiva e foi identificado Staphylococcus

aureus, 73,3% pela presença de coliformes fecais (PEDRO, 2003).

SALOTTI e col. (2006), em estudo realizado no município de Jaboticabal

(SP) com amostras de queijo Minas frescal, encontraram 83,4% das amostras

artesanais e 66,7% das amostras industriais em desacordo com a legislação para

coliformes, demonstrando risco potencial para a saúde da população consumidora.

QUINTANA e CARNEIRO (2007), pesquisando o queijo Minas

comercializado na cidade de Morrinhos (GO), detectaram amostras impróprias para

consumo, com contagens para coliformes fecais acima do permitido pela legislação.

Todos os estudos descritos são importantes para a Saúde Pública, pois visam

demonstrar a contaminação, do queijo comercializado, por coliformes e sugerir a

veiculação de agentes que possam causar doença.

1.2.2. Coliformes em alimentos – Escherichia coli

A contagem dos coliformes nos alimentos, sobretudo os de origem fecal,

indica as condições de higiene em que os queijos foram processados, o encontro

desse grupo implica em deficiências ou falhas no processamento industrial dos

20

alimentos, matéria prima inadequada ou uma contaminação pós-processo

(GRÜNSPAN e col., 1996; PEDRO, 2003; PEDRO e col., 2005).

As bactérias do grupo coliforme estão constituídas por gêneros classificados

na família Enterobacteriaceae dentre os quais se destaca o gênero Escherichia que

são bastonetes Gram-negativos, não esporulados, anaeróbios facultativos,

fermentadores da glicose com produção ou não de gás (TORTORA e col., 2005).

O habitat é o intestino do homem e estudos relatam que Escherichia coli

coloniza o trato intestinal do recém nascido a partir de 40 horas de vida localizando-

se na camada de muco do intestino grosso (FORBES e col., 1998; TORTORA e col.,

2005).

Do gênero Escherichia, E. coli é utilizada como indicador higiênico sanitário

de contaminação fecal, indicando a incidência de contato direto ou indireto dos

alimentos com matéria fecal. A presença de uma bactéria de origem fecal em

alimentos sinaliza também a possibilidade da presença de outras bactérias

patogênicas entéricas como Salmonella spp, Shigella spp (LECLERC e col., 2001;

TODAR, 2002; TORTORA e col., 2005).

Embora E. coli faça parte da biota intestinal humana e de animais

homeotérmicos, alguns organismos desta espécie podem ser patogênicos para ambos

(TODAR, 2002; KAPER e col., 2004).

Escherichia coli comensal pode adquirir específicos atributos de virulência

que são codificados em elementos genéticos, e tornar-se patogênica, as cepas

patogênicas de Escherichia coli são denominadas de patotipos (KAPER e col.,

2004).

21

Didaticamente, o resultado da infecção com um patotipo de E.coli pode ser

dividida em três síndromes gerais: entérica/diarréia, urinária e séptica/meningite

(RODRIGUEZ, 2002; TRABULSI e col., 2004; KAPER e col., 2004). Todas as

síndromes são devido a patotipos de E. coli oriundos do intestino.

A síndrome entérica é ocasionada por seis patotipos: E. coli enteropatogênica

(EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli

produtora de Shiga toxina (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli

difusamente aderente (DAEC) (GUTH, 2000; KAPER e col., 2004, KARCH e col.,

2005).

Para ocorrer à diarréia pelos enteropatotipos de E. coli, três paradigmas são

descritos: produção de enterotoxina (ETEC e EAEC) ou invasão (EIEC) ou aderência

íntima com a membrana (EPEC e EHEC) (KAPER e col 2004).

Os patotipos entéricos apresentam fatores de virulência que proporcionam

que a bactéria cause a infecção no hospedeiro como, por exemplo, as adesinas que

permitem que as bactérias colonizem a mucosa ileal como a intimina de EPEC e

EHEC; as enterotoxinas como a ST1 de ETEC e fatores de invasão que permitem a

invasão da mucosa, semelhante a pInv de EIEC (KAPER e col. 2004).

Os patotipos entéricos apresentam características diferentes, descritas a

seguir, relacionadas a patogenicidade, síndrome clínica e epidemiológica.

22

1.2.3. Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC)

É geralmente associada à “diarréia dos viajantes”. Afeta crianças de países

em desenvolvimento e é uma importante causa de diarréia também nos animais

homeotérmicos. O reservatório é o homem. Os sintomas são similares aos da cólera,

afetando o intestino delgado provocando cólicas, vômitos e febre baixa, diarréia

profusa aquosa, tipo água de arroz, sem sangue, podendo ocorrer a desidratação e o

choque (NATARO e KAPER, 1998).

A dose infectante é alta estando entre 108 e 1010 microrganismos/g ou ml. O

período de incubação varia entre 8 e 44 horas, com média de 26 horas e a duração da

doença é curta, aproximadamente de 24 a 30 horas (NATARO e KAPER, 1998).

A contaminação fecal de água e alimentos é a principal razão da alta

incidência de infecção por ETEC em países em desenvolvimento (NATARO e

KAPER, 1998).

O patotipo ETEC coloniza o intestino delgado por meio de fatores de

colonização que são adesinas e produz uma ou mais toxinas, induzindo a liberação de

fluído intestinal (KAPER e col., 2004).

As toxinas produzidas são a termo estável (ST) e termo lábil (LT),

codificadas por plasmídios (KAPER e col., 2004).

A toxina termo-estável (ST) é uma proteína de 5kDa, tem esse nome porque

pode resistir à temperatura de 100°C por 30 minutos. Há dois tipos que diferem

biológica e quimicamente a ST I e ST II (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col.,

2004).

23

A STI é solúvel no metanol, seu mecanismo de ação aciona a guanilato

ciclase alterando o metabolismo celular e aumentando a secreção (GUTH, 2000;

TRABULSI e col., 2004; BRITO e col., 2004).

Há duas variantes genéticas com diferenças nas seqüências de aminoácidos:

STIh que ocorre em humanos e STIp observada em porcos (GUTH, 2000;


A STII é insolúvel em metanol. Estudos divergem quanto à ocorrência de

casos em humanos. Atuam elevando as concentrações de cálcio estimulando a

prostaglandina e serotonina que aumentam a secreção de íons (GUTH, 2000;


A toxina termo-lábil LT é inativada por aquecimento a 100°C por 30

minutos. É muito semelhante à toxina colérica, com atividade de adenilato ciclase. É

denominada de citotonina porque causa um bloqueio das funções. É uma proteína de

cerca de 80 kDa composta por 5 subunidades B arranjadas em forma de anel e uma

subunidade A que é responsável pela atividade enzimática da toxina, que estimula a

excreção de cloro e bicarbonato de sódio com acúmulo de líquido e diarréia

(NATARO e KAPER, 1998).

24

1.2.4. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)

É conhecida como agente de diarréia infantil ou diarréia neonatal causando

surtos em berçários hospitalares por acometer neonatos de 0 a 6 meses e crianças que

não se alimentam do leite materno é freqüente nos países em desenvolvimento

(NATARO e KAPER, 1998).

Muitos adultos possuem EPEC no trato intestinal, porém não expressam os

sintomas da doença o que sugere a ocorrência de imunidade a este microrganismo. O

reservatório é o homem, ressalta-se o papel das mães e enfermeiras como portadoras

assintomáticas (NATARO e KAPER, 1998; TORRES e col., 2005).

A transmissão ocorre por contato pessoal, água e alimentos contaminados. O

sítio de infecção é o intestino delgado ocasionando má absorção dos nutrientes e

conseqüente diarréia, outros sintomas são febre baixa e vômitos (TORRES e col.,

2005).

A lesão histológica que EPEC causa no epitélio intestinal recebe a designação

de Attachment/ Effacement ou lesão A/E, que ocorre também no patotipo EHEC. O

diferencial é que EPEC não produz Shiga toxina (STx) ou também chamada de

Verotoxina (VT) (NATARO e KAPER, 1998).

A lesão A/E envolve o gene eae e de outros que estão localizados na ilha de

patogenicidade denominada de LEE (locus of enterocyte effacement) (NATARO e

KAPER, 1998).

O LEE é organizado em 5 operons policistrônicos LEE 1 a LEE 5. Os

produtos codificados por ele são: o sistema de secreção tipo III (LEE 1 A LEE 3); o

25

sistema de translocação de proteínas (LEE 4) e os genes do operon eae e tir no

operon LEE 5 (BARBA e col., 2005; GYLES, 2007).

A adesina intimina, codificada pelo gene eae é uma proteína de 94-kDa, da

membrana externa da bactéria, responsável pela aderência íntima às células

hospedeiras (NATARO e KAPER, 1998).

Na lesão A/E, o receptor da intimina é denominado de Tir ("translocated

intimin receptor") e é um produto bacteriano que é inserido na célula hospedeira

durante a infecção, a descoberta de diferentes tipos de intimina demonstrou que há

um tropismo pelo tecido do hospedeiro (TORRES e col., 2005).

A EPEC adere intimamente à membrana das células intestinais e formam

pedestais com a condensação de actina (TRABULSI e col., 2004; KAPER e col.,

2004; SCHIMDT e HENSEL, 2004).

KAPER (1996) descreveu no Segundo Simpósio Internacional sobre EPEC

(1995) as denominações:

• EPEC típica para as cepas que:

o produzem lesão A/E (gene eae),

o não produzem a toxina Stx,

o contém o plasmídio EAF (EPEC adherence factor plasmid) o

qual codifica a produção do pili BFP (bundle-forming pili)

que produz a característica de aderência a célula epitelial

chamada de aderência localizada (LA) (Figura 1)

• EPEC atípica foi atribuída para as cepas:

o produzem lesão A/E (gene eae),

o não produzem a toxina Stx,

26

o não contém o plasmídio EAF.

1.2.5. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC)

Como o próprio nome sugere e a característica que diferencia Escherichia

coli enteroinvasiva dos outros patotipos é a invasão da célula sendo, portanto um

patógeno intracelular (NATARO e KAPER, 1998).

A EIEC apresenta uma patologia muito semelhante à Shigella spp, sendo que

a disenteria causada por ambas é clinicamente indistinguível.

Vários biossorotipos são responsáveis por infecções de EIEC, caracterizados

geralmente por serem imóveis, não descarboxilizarem a lisina e não fermentarem a

lactose diferente dos outros patotipos (NATARO e KAPER, 1998).

Acometem crianças maiores de 2 anos de idade e adultos. Os sintomas da

doença causada por EIEC são calafrios, febre, dores abdominais e diarréia que pode

ou não ser sanguinolenta com presença de leucócitos e muco, devido à inflamação e

necrose do cólon (NATARO e KAPER, 1998).

O reservatório é o homem, e a transmissão se dá por ingestão de alimentos e

águas contaminados (NATARO e KAPER, 1998).

Outro diferencial é a dose infectante que para Shigella spp é em torno de

5.000 microrganismos/g ou ml, e para EIEC é geralmente entre 106 a 108

microrganismos/g ou ml (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col., 2004).

O período de incubação varia de 8 a 24 horas com média de 11 horas e a

duração da doença é de vários dias (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col.,

2004).

27

O microrganismo invade células do epitélio intestinal, multiplica-se dentro

destas células e invadem células epiteliais adjacentes provocando ulcerações do

cólon, resultando em diarréia sanguinolenta. Os genes responsáveis pela penetração

localizam-se num plasmídio pInv de 120-140 MDa (megadaltons), que desencadeiam

a penetração na célula epitelial, ocorrendo a lise do vacúolo endocítico, multiplicação

intracelular, atingindo a célula epitelial adjacente (NATARO e KAPER, 1998;

KAPER e col., 2004).

Na infecção severa estes eventos causam uma forte reação inflamatória com

ulcerações. A invasão e disseminação induzem a apoptose, durante a infecção, do

macrófago, embora seja invasiva é raro encontrá-la na submucosa intestinal

(NATARO e KAPER, 1998; TRABULSI e col., 2004).

1.2.6. Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC)

O patotipo EHEC é considerado como subgrupo de STEC (KARCH e col.,

2005; NAYLOR e col., 2005).

Ocorre em países desenvolvidos (sorotipo 0157:H7) e em desenvolvimento.

O sítio de infecção é o intestino grosso (NATARO e KAPER, 1998; TRABULSI e

col., 2004).

A transmissão ocorre através da ingestão de alimentos mal cozidos, tais

como hambúrguer. A dose infectante é baixa, de 10 a 100 microrganismos já podem

causar a doença. O período de incubação é de 3 a 4 dias (NATARO e KAPER, 1998;

TRABULSI e col., 2004).

28

Os sintomas são de dor abdominal, vômitos, diarréia que inicialmente é

aquosa podendo progredir para colite hemorrágica e síndrome urêmico hemolítico e

morte (NATARO e KAPER, 1998; TRABULSI e col., 2004).

A virulência se dá pela produção de uma ou duas citotoxinas semelhantes a

Shiga toxina produzida pela Shigella dysenteriae tipo 2 a (toxina de Shiga ou Stx ou

também chamada de Verotoxina-VT) (NATARO e KAPER, 1998; TRABULSI e

col., 2004).

São toxinas termolábeis, cujo peso molecular varia de 70.000 a 88.500

daltons. Similarmente à LT do patotipo ETEC, elas são constituídas por uma

subunidade A, enzimaticamente ativa, e cinco subunidades B, com função de

acoplamento a receptores celulares (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col.,

2004).

O mecanismo de ação da Vero toxina consiste na subunidade B se ligar ao

receptor Gb3, a subunidade A é internalizada na célula, inibindo desta forma a

síntese protéica e ocorrendo a morte celular, o efeito citotóxico caracteriza-se por

arredondamento celular, morte e descolamento do tapete de células (NATARO e

KAPER, 1998; KAPER e col., 2004).

Estas toxinas se classificam em dois tipos: Stx I e II, que são sorologicamente

distintas e apresentam efeito citotóxico em células de rim de macaco verde africano

(VERO) e células de adenoma de útero humano (HeLa) (NATARO e KAPER, 1998;


Os genes que codificam as Stx I e II estão relacionados a bacteriófagos

(NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col., 2004).

29

O subgrupo EHEC também contém a ilha de patogenicidade LEE e aderência

da bactéria à célula intestinal é devido ao gene eae (NATARO e KAPER, 1998;


Utiliza-se o termo STEC ou VTEC para as cepas de E. coli que:

• produzem a toxina VT e

• não possuem a ilha de patogenicidade LEE (referente a produção da

adesina intimina).

O termo EHEC é utilizado para as cepas de E. coli que:

• produzem toxina VT e

• possuem a ilha de patogenicidade LEE (lesão A/E).

Também são denominadas de: (Figura 1)

• EHEC típica as cepas que:

o causam colite hemorrágica ,

o causam síndrome urêmico hemolítica ,

o contém a ilha de patogenicidade LEE causam a lesão A/E,

o produzem toxina VT e

o contém o plasmídio de 60MDa que codifica uma hemolisina.

• EHEC atípica as cepas que:

o causam colite hemorrágica ,

o causam síndrome urêmico hemolítica ,

o não contém a ilha de patogenicidade LEE,

o produzem toxina VT e

30

o e/ou não contém o plasmídio de 60MDa que codifica uma

hemolisina (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col., 2004,

NAYLOR e col., 2005; KARCH e col., 2005).

AEEC- E. coli com lesão A/E VTEC- E. coli produtora de verotoxina

EPEC típica- E. coli enteropatogênica típica VT- verotoxina

EHEC atípica- E. coli enterohemorrágica atípica pEAF- plasmídio EAF

LEE- ilha de patogenicidade LEE CH-SUH-colite hemorrágica/ síndrome urêmica

hemolítica

pEHEC- plasmidio de E. coli enterohemorrágica EHEC típica- E. coli enterohemorrágica típica

Figura 1. Diagrama de Venn ilustrando os patotipos de E. coli, EHEC/ VTEC/

EPEC (baseado no estudo de NAYLOR e col., 2005).

31

1.2.7. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)

EAEC é um grupo de bactérias que abrange sorogrupos de E. coli que aderem a

linhagens celulares "in vitro", tais como células HeLa e HEp-2 (células de carcinoma

laríngeo humano) formando agregados bacterianos, localizados na superfície celular

e em regiões da lamínula livres de células, em um arranjo semelhante a tijolos

empilhados (denominado de aderência agregativa) (NATARO e col., 1987).

A configuração em “pilha de tijolos” é considerada condição obrigatória para o

padrão típico de aderência agregativa (AA). Anteriormente denominada com a sigla

EaggEC, atualmente EAEC. Esse microrganismo causa uma diarréia aquosa e que

dura até 14 dias e que está relacionada com a formação de um biofilme (NATARO e

KAPER, 1998; OKEKE e NATARO, 2001).

Escherichia coli enteroagregativa acomete crianças e adultos e está implicada

em surtos causados por ingestão de alimentos (NATARO e col., 1998).

Além de diarréia aguda EAEC está fortemente associada como agente de diarréia

persistente (HARRINGTON e col., 2006).

A persistente diarréia causada pela EAEC pode ser explicada devido a sua

sobrevivência intracelular por até 72hs, esse nicho intracelular protege as cepas dos

mecanismos de defesa do hospedeiro e tratamento por antibióticos (PEREIRA e col.,

2008).

Por ser muito heterogênea em relação aos fatores de virulência e embora estes

fatores sejam freqüentes na categoria, não há uma prova sensível para identificação

32

genética (NATARO e col., 1998; ELIAS e col., 2002), porém CERNA e col. (2003)

afirmam em seu estudo terem desenvolvido uma reação de PCR multiplex rápida,

fácil e sensível para três genes do plasmídio de virulência pAA.

KAPER e col. (2004) sugerem o uso da denominação EAEC típica para as cepas

que contém o gene regulador aggR e denominação EAEC atípica para as que não

contém.

Como meio diagnóstico é utilizada a pesquisa do gene aatA do plasmídio pAA,

que está relacionado com a aderência agregativa (AA) (BAUDRY e col., 1990;

NISHI e col., 2003).

Muitos pesquisadores têm utilizado métodos moleculares para verificarem a

presença de fatores de virulência dos enteropatotipos de Escherichia coli em

amostras de alimentos, água e fezes de doentes, com intenção de determinar o

patotipo, a fonte de infecção e associar a doença.

JACKSON e col. (1998) estudaram um caso de diarréia com sangue ocorrido em

uma fazenda da cidade de Ontário, Canadá. Os autores analisaram as fezes da criança

doente, do gado e da água da fazenda, através de eletroforese de campo pulsado e

demonstraram que tanto o gado como a água eram fontes potenciais de E. coli

O157:H7.

E. coli O157:H7 foi encontrado em espinafres para consumo em 26 estados

dos Estados Unidos, resultando em 199 pessoas doentes e 3 mortes. Segundo relato

de MAKI (2006), mesmo utilizando a técnica de enzimas de restrição não foi

possível determinar o modo de contaminação do vegetal se foi por contato com os

animais homeotérmicos das fazendas produtoras, pela manipulação ou pela água.

33

PERELLE e col (2007) realizaram um estudo visando à prevenção de surtos

de intoxicação gastrintestinal por meio da reação de PCR multiplex para detecção da

presença de STEC a partir de matérias-primas de origem bovina.

PANETO e col. (2007) utilizando a reação de PCR multiplex, determinaram a

ocorrência de ETEC e VTEC em amostras de queijo Minas frescal colhidas na região

Centro Oeste do Brasil.

Os resultados obtidos no trabalho realizado por STEPHAN e col. (2008)

utilizando a reação de PCR multiplex em cepas de amostras de queijo Suíço

fabricado com leite cru, sugerem que o queijo pode ser um potencial veiculo de

transmissão de STEC para o homem.

No estudo, realizado por OUNDO e col. (2008), utilizando eletroforese de

campo pulsado em cepas obtidas de amostras de alimentos, água e de manipuladores

de alimentos dos hotéis no Quênia, África, foi possível determinar que os

manipuladores são importantes na transmissão da EAEC.

SCAVIA e col. (2008), estudando surtos de gastroenterite causados por

alimentos, concluíram que os casos por EAEC que ocorrem nos países europeus são

subnotificados devido à falta de treinamento do pessoal de laboratório e que as boas

práticas de higiene e manipulação dos alimentos são importantes para a prevenção

dos surtos. Sugerem também a possibilidade do leite não pasteurizado utilizado na

fabricação de queijo ser a origem da contaminação do alimento.

Com o objetivo de determinar a ocorrência de Escherichia coli produtora de

toxina Shiga (STEC) em carne moída e leite cru no sul do Brasil, TIMM e col.

(2009), utilizando PCR multiplex concluíram que a baixa prevalência de STEC em

alimentos e as características das cepas encontradas em bovinos podem estar

34

relacionadas, e explicaria a baixa prevalência de enfermidades de origem alimentar

causadas por STEC no Brasil.

Outra forma de pesquisa de E. coli é agrupar os isolados em filogrupos.

1.2.8. Grupos Filogenéticos

Utilizando a técnica de multilocus enzimático e ribotipagem SELANDER e

col. (1986) e HERZER e col. (1990) caracterizaram quatro grupos filogenéticos de

Escherichia coli: A, B1, B2 e D.

Os autores concluíram que cepas pertencentes aos grupos B2 são relacionadas

à doença extra intestinal, em menor frequência as do grupo D, e possuem mais

fatores de virulência. As cepas do grupo A e B1 são consideradas como linhagens

intestinais comensais e também foram descritas como patogênicas (PUPO e col.,

1997; CLERMONT e col., 2000; GIRARDEOU e col., 2005; TIBA e col., 2009).

Para se determinar o filogrupo utiliza-se à reação de PCR multiplex

empregando três marcadores: o gene chuA que é relacionado com o transporte de

ferro na EHEC O157:H7 (TORRES e PAYNE, 1997); o gene yjaA de função

desconhecida mas identificado na E. coli K-12 e um fragmento anônimo de DNA

designado de TSPE4.C2 (CLERMONT e col., 2000)

Os perfis para os grupos filogenéticos estão apresentados na Figura 2.

35

Figura 2. Esquema representando os grupos filogenéticos utilizando iniciadores para

os genes chuA, yjaA e o fragmento de DNA TSPE4.C2 (CLERMONT e col., 2000).

Várias pesquisas têm agrupado as cepas de E. coli em filogrupos, porém a

maioria dos trabalhos encontrados na literatura é de isolados clínicos e de ambiente.

Utilizando a reação de PCR triplex, DURIEZ e col. (2001), estudaram cepas

de E. coli isoladas de fezes de três populações humanas distintas geograficamente e

os dados obtidos mostraram que os grupos filogenéticos A e B1 são mais freqüentes,

36

seguidos do grupo filogenético D. Os autores concluíram que as linhagens do grupo

filogenético B2 são raras.

KOTLOWSKI e col. (2006), relacionam em seu estudo a ocorrência dos

grupos filogenéticos B2 e D de E. coli em pacientes com doença intestinal

inflamatória e colite ulcerativa.

O estudo filogenético de cepas de E. coli provenientes de amostras de esgoto

de origem humana e de origem animal, indicou que o grupo B2 é associado ao esgoto

de origem humana, e os grupos A, B1 e D estão em ambos os esgotos, SABATÉ e

col. (2008), sugerem também que o uso abusivo de antibiótico utilizado na produção

animal pode promover a resistência nos filogrupos de E. coli e que pode ser

transmitido depois para a população humana através do alimento de origem animal.

Num estudo epidemiológico com crianças saudáveis e com diarréia, AFSET e

col. (2008) relatam que os grupos filogenéticos A, B1 e D não apresentaram

associação significativa com diarréia. E que cepas pertencentes ao filogrupo B2

foram mais comuns em crianças saudáveis do que em crianças com diarréia.

NOWROUZIAN e col. (2009), compararam cepas do filogrupo B2 obtidas de

crianças suecas e paquistanesas e observaram que as cepas encontradas nas crianças

paquistanesas carregam um número significativamente menor de genes de virulência.

Concluem os autores que cepas de E. coli isoladas de diferentes populações humanas

podem diferir na distribuição filogenética.

HANNAH e col. (2009), pesquisando amostras de carne e amostras clínicas

de humanos de uma comunidade rural nos Estados Unidos, encontraram grupos

filogenéticos de E. coli similares, os autores sugerem que alimento pode ser o veículo

de transmissão da E. coli.

37

1.2.9. Reação de polimerização em cadeia (PCR)

A reação de PCR é um método que permite a amplificação de um fragmento de

DNA em poucas horas, teve início na década de 80, foi desenvolvida pelo

pesquisador Kary Mullis e sua equipe, tem mostrado grande aplicabilidade,

principalmente no diagnóstico de doenças (SCHUTZBANK e STERN, 1993;

RUPPENTHAL, 1999).

É considerada uma reação de grande sensibilidade para detectar os fatores de

virulência (NATARO e KAPER, 1998; RUPPENTHAL, 1999).

A reação da PCR consiste em um processo de replicação de DNA, utiliza

alterações de temperatura que contribuem para a separação da molécula de DNA,

ocorrendo à associação dos iniciadores com a atuação da DNA polimerase e

finalmente a síntese da cadeia complementar (RUPPENTHAL, 1999).

Vários autores a utilizaram por meio do multiplex (múltiplos iniciadores) para

determinarem a presença dos patotipos de E. coli (PASS e col., 2000; TOMA e col.,

2003; SARANTUYA e col., 2004; ARANDA e col., 2004; NGUYEN e col., 2005;

FRANZOLIN e col., 2005; VIDAL e col., 2005; ARANDA e col., 2007).

Em isolados de amostras de alimentos a PCR multiplex é muito utilizada nas

pesquisas de fatores de virulência (PERELLE e col., 2007; PANETO e col., 2007;

STEPHAN e col., 2008; TIMM e col., 2009).

VICENTE e col. (2005), confirmando a importância da reação da PCR

multiplex, demonstraram que um surto clinicamente diagnosticado como cólera em

vilarejos da floresta Amazônica, era na realidade causado por cepas de ETEC.

38

2.OBJETIVOS

Caracterização molecular dos isolados de E. coli obtidos de amostras de

queijo Minas:

• Verificar a freqüência com que ocorrem os grupos

filogenéticos: A, B1, B2 e D.

• Determinar a ocorrência dos fatores de virulência nos

isolados de E. coli pertencentes aos patotipos: ETEC,

EIEC, EPEC, STEC e EAEC.

• Discutir a presença dos referidos patotipos de E. coli nas

amostras de queijo Minas e o significado para a Saúde

Pública e Vigilância Sanitária.

39

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. ISOLADOS BACTERIANOS – Escherichia coli

Foram utilizadas para o estudo, 250 isolados de Escherichia coli oriundas de

10 amostras de queijo Minas frescal e meia cura, adquiridas em supermercados,

feiras livres, vendedores ambulantes e mercados municipais da cidade de São Paulo

isoladas durante o período de 2001 a 2002 (PEDRO, 2003), e mantidas a -70oC em

caldo Luria Bertani (LB) contendo 15% de glicerol (Quadro 1).

Quadro 1. Tipo de queijo Minas e local de aquisição das amostras utilizadas

para obtenção dos isolados de E. coli. São Paulo, 2003 (PEDRO, 2003).

Amostra queijo Minas frescal Queijo Minas meia cura 1 supermercado 2 supermercado 3 supermercado 4 supermercado 5 supermercado 6 feira livre 7 ambulante 8 ambulante 9 mercado municipal

10 mercado municipal

40

3.2. REISOLAMENTO E CONFIRMAÇÃO DA VIABILIDADE E

PUREZA DOS ISOLADOS

Uma alíquota de cada uma dos isolados proveniente da coleção de cultura foi

cultivada em caldo LB, incubado 35oC ±0,5 por 24 horas. Os tubos que apresentaram

turvação foram subcultivados em ágar McConkey e incubados por um período de 24

horas a 37oC ±0,5 para isolamento das colônias.

Após o período de incubação, as colônias características de E. coli que

apresentaram coloração rosa, pela utilização da lactose, foram selecionadas e

submetidas à confirmação do posicionamento taxonômico com emprego de métodos

fenotípicos convencionais.

As provas bioquímicas empregadas foram as seguintes: produção de Indol e

prova de Vermelho de Metila (VM) que são positivas para E. coli e utilização de

Citrato segundo Simmons, prova de Voges – Proskauer (IMVC) também a prova da

citocromo oxidase que são negativas para E. coli (SILVA e col., 2001).

3.3.MÉTODOS MOLECULARES

3.3.1. Extração do material genético

O material genético (DNA genômico e plasmidial) foi extraído por meio de

choque térmico segundo a técnica descrita por CHAPMAN e col. (2001), os isolados

41

de Escherichia coli foram cultivadas em 10 mL de caldo LB por 24 horas a 35oC. As

culturas foram centrifugadas por 10 minutos em velocidade de 5.000 rpm à

temperatura ambiente, os sobrenadantes descartados e o precipitado correspondente

às células bacterianas foi lavado duas vezes com 1 mL de água MilliQ® estéril,

ressuspenso em 200 µL de água MilliQ® e transferido para microtubos do tipo

eppendorf estéreis. Os tubos contendo as suspensões bacterianas foram levados por

10 minutos em banho-maria fervente (95oC) e em seguida mantidos por 30 minutos a

-20oC. Após esse período, os tubos foram mantidos em temperatura ambiente por

aproximadamente 5 minutos e então foram submetidos à centrifugação por 10

minutos em velocidade de 12.000 rpm. O sobrenadante contendo o material genético

foi transferido para um novo microtubo e conservado até o momento do uso a -20oC.

3.3.2.Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Foram realizadas três reações de PCR multiplex:

• PCR para determinação do grupo filogenético de E. coli foi realizada baseada no

estudo realizado por CLERMONT e col. (2000), com a utilização simultaneamente

(multiplex) de três iniciadores específicos, para a identificação dos grupos

filogenéticos A e B1(comensais) e B2 e D (patogênicos). Os iniciadores

denominados chuA, para detecção do gene relacionado com o transporte ferro

(enterohemorrágicas), yjaA que detecta o gene fortemente relacionado com cepas

responsáveis por casos de meningite neonatal e TSPE4C gene de função

42

desconhecida observado em cepas de K12 representantes comensais de E. coli. As

seqüências dos iniciadores que foram utilizados para este estudo estão descritas no

Quadro 2.

As condições de ciclo e concentração de reagentes para a detecção de genes

relacionados à filogenia de E. coli foram os seguintes: para cada reação de 25 µL

foram utilizados 2,5 µL de tampão de reação 10x; 1,5 mM de cloreto de magnésio;

200µM de solução de DNTP; 200µM de cada um dos iniciadores; 1,25 U de Taq

DNA polimerase e 5 µL de DNA. Foram empregados para amplificação um ciclo de

desnaturação inicial a 94oC por 4 minutos, 30 ciclos compostos de desnaturação a

94oC por 5 segundos, anelamento a 59oC por 10 segundos e extensão a 72oC por 2

minutos, e ainda um ciclo único final a 72oC por 5 minutos, em um termociclador

Mastercycler gradient Eppendorf.

Os produtos de reação para estes iniciadores são fragmentos de 279, 211, e

152 pares de base (bp) para os genes chuA, yjaA e TSPE4C respectivamente.

• PCR para determinação da presença de fatores de virulência de E. coli foi

realizada com base no estudo realizado por KONG e col. (1999). Utilizou-se o

sistema multiplex com iniciadores específicos para amplificação de fragmentos

correspondentes a genes responsáveis pela produção de toxina termolábil 2 (LT2),

toxina termolábil 1 (LT1), toxina termoestável (ST1), verotoxina (VT1 e VT2) e

ainda o gene que codifica a adesina intimina (eae).


relacionados à virulência de E. coli foram os seguintes: para cada reação de 25 µL

foram utilizados 2,5 µL de tampão de reação 10x; 1,5 mM de cloreto de magnésio;


43

DNA polimerase; e 5 µL de DNA. A reação composta por um ciclo inicial de

desnaturação a 94oC por 2 minutos, seguida por 40 ciclos composto de desnaturação

a 94oC por 1 minuto, anelamento a 52oC por 1 minuto e extensão a 72oC por 1

minuto, e ainda uma extensão final por 5 minutos a 72oC.

Os produtos de reação esperados para estes iniciadores são fragmentos de

720, 523, 360, 275 e 175 pares de base (bp) para os iniciadores LT2, VT (VT1 e

VT2), eae, LT1 e ST1 respectivamente (Quadro 2).

• A pesquisa de fatores virulência em E. coli foi complementada com a utilização

dos iniciadores Einv que detectam o gene ipaH do plasmídio de invasão (pInv) e

Eagg que detecta o gene aaTa do plasmídio pAA da aderência agregativa (AA),

presentes nos patotipos de E. coli enteroinvasiva e enteroagregativa de acordo com o

trabalho de ORLANDI e col. (2006).


relacionados à virulência de E. coli foram os seguintes: para cada reação de 25 µL

foram utilizados 2,5 µL de tampão de reação 10x; 2 mM de cloreto de magnésio;


DNA polimerase; e 5 µL de DNA. A reação constou de 30 ciclos composto de

desnaturação a 92oC por 30 segundos, anelamento a 57oC por 1 minuto e extensão a

72oC por 1 minuto, e ainda uma extensão final por 5 minutos a 72oC.

Os produtos de reação esperados para estes iniciadores são fragmentos de 140

e 194 pares de base (bp) para os iniciadores Einv e Eagg, respectivamente (Quadro

2).

44

Quadro 2. Seqüência dos iniciadores da PCR e tamanho esperado dos produtos que

foram utilizados na determinação filogenética e de fatores de virulência dos isolados

de E. coli.

Patotipo/

Filogrupo

Iniciador Seqüência Tamanho do produto (bp)

Referência

chuAF 5` GAC GAA CCA ACG GTC AGG AT 3’ B2 e D chuAR 5` TGC CGC CAG TAC CAA AGA CA 3’ 279

yjaAF 5` TGA AGT GTC AGG AGA CGC TG 3’ A e B2 yjaAR 5` ATG GAG AAT GCG TTC CTC AAC 3’ 211

TSPE4CF 5` GAG TAA TGT CGG GGC ATT CA 3’ B1, D e B2 TSPE4CR 5` CGC GCC AAC AAA GTA TTA CG 3’ 152

CLERMONT e col. (2000).

LT2 F 5` ATA TCA TTT TCT GTT TCA GCA AA 3’ ETEC LT2R 5` CAA TAA AAT CAT CTT CGC TCA TG 3’ 720

VTF 5` GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG 3’ STEC VTR 5` CCT GAT GAT GGC AAT TCA GTA 3’ 523

eaeF 5` GGA ACG GCA GAG GTT AAT CTG CAG 3’ EPEC/ EHEC eaeR 5` CGA AGC CAT TTG CTG GGC GCT C 3’ 360

LT1F 5` TTA CGG CGT TAC TAT CCT CTC TA 3’ ETEC LT1R 5` GGT CTC GGT CAG ATA TGT GAT TC 3’ 275

ST1F 5` CTT TCC CCT CTT TTA GTC AG 3’ ETEC ST1R 5` TAA CAT GGA GCA CAG GCA GG 3’ 175

KONG e col. (1999).

Einv F* 5' TGG AAA AAC TCA GTG CCT CTG CGG 3' EIEC Einv R 5' TTC TGA TGC CTG ATG GAC CAG GAG 3' 140

Eagg F** 5' AGA CTC TGG CGA AAG ACT GTA TC 3' EAEC Eagg R 5' ATG GCT GTC TGT AAT AGA TGA GAA C 3' 194

ORLANDI e col. (2006).

*Einv=gene ipaH do pInv. **Eagg= gene aatA do pAA.

3.3.3. Eletroforese em gel de agarose

Os produtos da PCR foram visualizados em eletroforese em gel de agarose

3% em tampão TAE 1x (Tris-ácido acetico-EDTA, pH 8.0), corado com brometo de

etídeo, em uma intensidade de corrente de 6V/cm por 1 hora. O peso molecular de

cada fragmento foi calculado com base na comparação com um marcador incluso em

cada gel (100bp MassRuler™ DNA Ladder, Fermentas). As imagens foram

capturadas sob iluminação Ultra Violeta em equipamento Chemi II Darkroom (UVP)

e gravadas utilizando o programa Labworks (UVP, Inc Upland, CA, USA).

45

4. RESULTADOS

Foram avaliados quanto aos grupos filogenéticos e seu potencial patogênico

utilizando métodos moleculares, 250 isolados de Escherichia coli, provenientes de

10 amostras de queijo Minas (PEDRO, 2003), a distribuição dos isolados nas

amostras estão demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1. Número e proporção dos isolados de E. coli nas amostras de queijo

Minas. São Paulo, 2009.

Amostra nº isolados(%) 1 42(16,8%) 2 21(8,4%) 3 46(18,4%) 4 24(9,6%) 5 110(44%) 6 1(0,4%) 7 2(0,8%) 8 2(0,8%) 9 1(0,4%)

10 1(0,4%) Total 250(100%)

4.1. GRUPOS FILOGENÉTICOS

Os isolados foram agrupados em filogrupos utilizando a reação de PCR

multiplex tendo como base a presença de fragmentos correspondentes aos genes

chuA, yjaA e o fragmento de DNA TSPE4.C2 (CLERMONT e col., 2000).

Na Figura 3 estão apresentados os perfis obtidos para cada grupo filogenético

em gel de agarose.

46

Figura 3. Gel de agarose contendo os fragmentos obtidos para isolados de

Escherichia coli representativos dos perfis filogenéticos. M- Marcador de peso

molecular 100pb, 1- isolado 298 Grupo A, 2- isolado 299 Grupo A, 3 - isolado 300

Grupo B1, 4- isolado 302 Grupo D, 5 - isolado 303 Grupo A, 6 - isolado 309 Grupo

D. São Paulo, 2009.

Das 10 amostras de queijo Minas estudadas foi possível classificar os isolados

em pelo menos um dos grupos filogenéticos, embora se tenha observado

concomitantemente 2 e 3 grupos presentes numa mesma amostra de queijo, conforme

a Tabela 2.

47

Tabela 2. Número dos isolados de E. coli por grupos filogenéticos nas 10 amostras

de queijo Minas. São Paulo, 2009.

Amostra/

filogrupo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Total

A 41 18 42 23 105 1 - 1 1 1 233

B1 1 - - 1 5 - - 1 - - 8

B2 - 3 3 - - - 1 - - - 7

D - - 1 - - - 1 - - - 2

Total 42 21 46 24 110 1 2 2 1 1 250

Os resultados demonstraram que o grupo filogenético A foi o mais freqüente

nas amostras estudadas onde 93,2% dos 250 isolados foram classificados como

grupo filogenético A, 3,2% como B1, 2,8% como B2 e 0,8% como D (Figura 4).

Figura 4. Proporção de E. coli do total dos isolados estudados por grupo

filogenético nas 10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009.

93%

3%1%2,8%

A

B1

B2

D

48

4.2. DETECÇÃO DE MARCADORES DE VIRULÊNCIA

Os resultados do estudo dos 250 isolados de E. coli para os marcadores de

virulência demonstraram a presença de marcadores em 242 isolados (96,8%) (Tabela

3), as porcentagens dos isolados encontrados foram: 5,8% para ST1, 1,2% para LT1

+ ST1, o marcador para intimina (eae) em 0,4%, ST1+ aatA em 57,9% dos isolados,

ST1+ aatA +LT1+LT2 em 0,8%, ST1+ aatA +eae em 2,1% dos isolados, ST1+eae,

ST1+LT1+ aatA +eae e ST1+LT1+eae ambos foram detectados em 0,4% dos

isolados, ST1+LT1+ aatA em 25,6%, o marcador para o patotipo EAEC (aatA) em

5,0%, enquanto que para Verotoxina (VT) e o mecanismo enteroinvasivo (ipaH) não

foram detectados em nenhum dos isolados estudados (Figura 5).

.

Figura 5. Proporção de E. coli do total dos isolados estudados por fatores de

virulência nas 10 amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009

0,4% 5,0%

5,8% 1,2%

57,9% 0,8%

2,1%

0,4%

0,4%

0,4%

25,6%

eae aatA

ST1

LT1+ST1

ST1+aatA ST1+aatA+LT1+LT2

ST1+aatA+ eae

ST1+eae

ST1+LT1+aatA+eae

ST1+LT1+eae

ST1+LT1+aatA

49

Tabela 3. Número dos isolados de E. coli por fatores de virulência nas 10 amostras


Marcador/ Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Total

ST1 2 - - 5 5 - 2 - - - 14

LT1+ST1 - 2 - - 1 - - - - - 3

LT1+ST1+LT2 - - - - - - - - - - -

eae 1 - - - - - - - - - 1

aatA 9 1 1 - 1 - - - - - 12

VT - - - - - - - - - - -

ipaH - - - - - - - - - - -

ST1+ aatA 18 13 18 14 73 1 - 1 1 1 140

ST1+ aatA +LT1+LT2 1 - - 1 - - - - - - 2

ST1+ aatA + eae 4 - - - 1 - - - - - 5

ST1+eae 1 - - - - - - - - - 1

ST1+LT1+ aatA +eae 1 - - - - - - - - - 1

ST1+LT1+eae 1 - - - - - - - - - 1

ST1+LT1+ aatA 1 3 27 4 26 - - 1 - - 62

Total 39 19 46 24 107 1 2 2 1 1 242

50

Na Figura 6 é possível visualizar os perfis de bandas obtidos em gel de

agarose para os diferentes marcadores de virulência.

Figura 6. Diferentes perfis obtidos de isolados de Escherichia coli utilizadas como

controle positivos. M- Marcador de Peso molecular, 1 – E. coli Verotoxigenica, 2 –

IAL339, 3 – IAL399, 4 – IAL 1893, 5 – IAL1895, 6 – IAL1896, 7 – IAL1848, 8 - E.

coli enteroinvasiva (isolado clínico), 9 - E. coli enteroagregativa (isolado clínico).

Com base nos resultados obtidos foi possível classificar os isolados de

Escherichia coli estudados de acordo com os diferentes patotipos, a saber: EHEC

(enterohemorrágica), ETEC (enterotoxigênica), EPEC (enteropatogênica), e EAEC

(enteroagregativa) e EIEC (enteroinvasiva) (Tabela 4).

Na Figura 7 é possível visualizar que os marcadores de virulência estavam

presentes em 242 isolados (96,8%) e mostra que o patotipo ETEC foi o mais

freqüente (91,6%) seguido por EAEC (4,8%) e por EPEC (0,4%). Não foram

observados marcadores indicativos da presença dos patotipos EIEC e EHEC.

51

Figura 7. Proporção de E. coli do total dos isolados estudados por patotipos nas 10

amostras de queijo Minas. São Paulo, 2009.

Tabela 4. Número e proporção dos isolados de E. coli por patotipo nas 10 amostras


Amostra/

Patotipo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Total %

ETEC 29 18 45 24 106 1 2 2 1 1 229 94,6%

EPEC 1 - - - - - - - - - 1 0,4%

EHEC - - - - - - - - - - - -

EIEC - - - - - - - - - - - -

EAEC 9 1 1 - 1 - - - - - 12 5%

Total 39 19 46 24 107 1 2 2 1 1 242 100,0%

0%10%20%30%40%50%

60%70%80%90%

100%

ETEC EPEC EHEC EIEC EAEC Total

patotipos

% isolados

52

As tabelas seguintes expressam o que foi detectado em cada amostra de

queijo Minas relativo aos grupos filogenéticos e patotipos (Tabela 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12,13 e 14).

Tabela 5. Número de isolados de E. coli por patotipo e por filogrupo na amostra 1 de

queijo Minas. São Paulo, 2009.

Amostra 1 A B1 B2 D Total ETEC 29 - - - 29 EPEC 1 - - - 1 EAEC 9 - - - 9 EHEC - - - - 0 EIEC - - - - 0 Total 39 - - - 39



Amostra 2 A B1 B2 D Total ETEC 15 - 3 - 18 EPEC - - - - - EAEC 1 - - - 1 EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 16 - 3 - 19

53



Amostra 3 A B1 B2 D Total ETEC 41 - 3 1 45 EPEC - - - - - EAEC 1 - - - 1 EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 42 - 3 1 46



Amostra 4 A B1 B2 D Total ETEC 21 3 - - 24 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 21 3 - - 24



Amostra 5 A B1 B2 D Total ETEC 104 2 - - 106 EPEC - - - - - EAEC 1 - - - 1 EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 105 2 - - 107

54

Tabela 10. Número de isolados de E. coli por patotipo e por filogrupo na amostra 6


Amostra 6 A B1 B2 D Total ETEC - 1 - - 1 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total - 1 - - 1



Amostra 7 A B1 B2 D Total ETEC - - 1 1 2 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total - - 1 1 2



Amostra 8 A B1 B2 D Total ETEC 1 1 - - 2 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 1 1 - - 2

55



Amostra 9 A B1 B2 D Total

ETEC 1 - - - 1 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 1 - - - 1



Amostra 10 A B1 B2 D Total

ETEC 1 - - - 1 EPEC - - - - - EAEC - - - - - EHEC - - - - - EIEC - - - - - Total 1 - - - 1

56

5. DISCUSSÃO

A detecção de agentes patogênicos em alimentos faz-se necessária para que

possam ser definidas estratégias de prevenção e controle mais efetivas

(HANASHIRO e col., 1999; ARAUJO e col., 2002; BALLAL e RAMAMURTY,

2005; SABATÉ e col., 2008; HANNAH e col., 2009).

Escherichia coli é um importante agente causador de diarréia e infecções

extra-intestinais em humanos em todo o mundo (SABATÉ e col., 2008; HANNAH e

col., 2009). Esses organismos pertencem a diferentes classes de patotipos e são

classificados com base em características observadas na clínica, mecanismos de

virulência e sorotipos (MAREK e col., 2004; BALLAL e RAMAMURTY, 2005;

SCAVIA e col., 2008).

Diferentes formas de classificar Escherichia coli, provenientes de amostras

clínicas, de alimentos ou ambientais, foram descritas a fim de determinar uma

melhor forma de diferenciar as cepas patogênicas de não patogênicas (KONG e col.,

1999; CLERMONT e col., 2000; ORLANDI e col., 2006; SKYBERG e col., 2007;

AFSET e col., 2008; SCAVIA e col., 2008; HANNAH e col., 2009; GRAZIANI e

col., 2009).

SELANDER e col. (1986) utilizaram a técnica de multilocus enzimático para

caracterizar quatro grupos filogenéticos de Eschericha coli, A, B1, B2 e D (HERZER

e col., 1990).

57

CLERMONT e col. (2000) utilizaram a técnica de PCR multiplex para

caracterizarem isolados de Escherichia coli nesses quatro grupos. Diversos estudos

vêm aplicando este tipo de disposição para isolados de Escherichia coli, de amostras

clínicas e ambientais, com a finalidade de elucidar a distribuição dos diferentes

grupos (CLERMONT e col., 2000; WALK e col., 2007; GRAZIANI e col., 2009).

Estudos demonstraram que os grupos filogenéticos de Escherichia coli mais

freqüentemente relacionados com doenças extra-intestinais são do grupo B2 e com

menor freqüência o grupo D e o grupo filogenético A e B1 são mais habituais em

isolados intestinais (CLERMONT e col., 2000; GIRARDEOU e col., 2005;

KOTLOWSKI e col., 2006; SABATÉ e col., 2008; HANNAH e col., 2009;

MORENO e col., 2009; TIBA e col., 2009).

Os limites de coliformes termotolerantes em amostras de alimentos são

definidos pela legislação sanitária vigente (BRASIL, 2001). Contagens elevadas de

coliformes em amostras de alimento indicam que o produto não é adequado para o

consumo (HANASHIRO e col., 1999; ARAUJO e col., 2002; PEDRO e col., 2005).

No presente estudo, 250 isolados de Escherichia coli (Tabela 1) foram

caracterizados nos diferentes grupos filogenéticos de acordo com a metodologia

descrita por CLERMONT e col. (2000). Os resultados demonstraram que o grupo A

foi o mais freqüente (93,2%) (Figura 4), que corroboram com a literatura pesquisada

que demonstra que esse grupo é o mais freqüentemente isolado de amostras não

clínicas (CLERMONT e col., 2000; KOTLOWSKI e col., 2006; SABATÉ e col.,

2008; HANNAH e col., 2009; MORENO e col., 2009; TIBA e col., 2009). As

linhagens patogênicas intestinais pertencem geralmente aos grupos A, B1 e D

58

(Tabela 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) (PUPO e col., 1997; GIRARDEOU e col.,

2005).

Estudos mostram, a presença dos grupos filogenéticos B2 e D, como

principais responsáveis por doenças extra-intestinais em amostras derivadas de

esgoto (SABATÉ e col., 2008), amostras de carne (HANNAH e col., 2009) e água

doce (WALK e col., 2007) mesmo que em baixos números (Tabela 2).

No presente estudo foi possível observar que o grupo B2 estava presente em

três amostras e o grupo D em duas amostras (Tabela 2, 6, 7 e 11).

Não foi possível observar na literatura pesquisada estudos que agrupassem,

em grupos filogenéticos, isolados de Escherichia coli provenientes de amostras de

queijo, sendo este o primeiro estudo demonstrando a distribuição dos grupos

filogenéticos de Escherichia coli em amostras de queijo Minas.

O estudo de marcadores de virulência demonstrou que os fatores de virulência

para ETEC foi o mais freqüente correspondendo a 91,6% (Figura 7) dos isolados

seguido dos fatores de virulência para os patotipos EPEC e EAEC. Escherichia coli

enterotoxigênica representa um importante patógeno responsável por diarréia

principalmente em países em desenvolvimento (MULLER e col., 2007; SUZUKI,

2007).

A detecção de isolados de ETEC portadores de marcador sugerindo a

produção de enterotoxina termoestável ST1 em maior número (Figura 5), como

pode ser observado na Tabela 3, indica que os produtos de onde foram obtidos os

isolados representam um perigo aos consumidores uma vez que cepas com essas

características podem produzir diarréia principalmente em crianças, sendo

59

responsáveis pela maioria dos casos endêmicos (NATARO e KAPER, 1998;

RODAS e col., 2009).

É importante ressaltar a presença de isolados classificados como Escherichia

coli enteroagregativa (EAEC) (Tabela 4). Conforme orientação da literatura

consultada, foram considerados como EAEC aqueles isolados que apresentaram o

gene aatA indicando a presença do plasmídio de virulência de EAEC e que não

apresentavam outro fator como ST ou LT onde foi observada uma baixa freqüência

desse patotipo (4,8%) (Figura 7) (NATARO e col., 1998)

Não há relatos na literatura sobre a ocorrência do gene aatA vinculado com o

marcador de ST1.

Pesquisas mostram que marcadores de EAEC podem ser também obtidos no

patotipo ETEC, pode conter em um plasmidio o gene homólogo ao da EAEC

produzindo reação positiva para os isolados de ETEC (YAMAMOTO e

ECHEVERRIA, 1996).

Esse fato foi observado no presente estudo, porém com outro marcador de

EAEC, foi utilizado o iniciador desenhado com base em seqüências descritas por

PASS e col. (2000).

Vários estudos com amostras clínicas apresentaram resultados com

freqüência de Escherichia coli enteroagregativa (ARANDA e col., 2004;

RODRIGUES e col., 2004; VAZ e col., 2004; SARANTUYA e col., 2004; REGUA-

MANGIA e col., 2004; NGUYEN e col., 2005, FRANZOLIN e col., 2005;

ORLANDI e col., 2006; MORENO e col., 2009).

Os resultados obtidos no estudo de NALÉRIO e col.(2004) demonstraram que

a técnica de PCR, com a utilização de seqüência do gene eae, apresentou maior

60

capacidade discriminatória que a técnica de cultivo celular em células HEp-2 para a

identificação do sorogrupo Escherichia coli enteropatogênica clássica. No presente

estudo foi detectado o marcador para intimina em um isolado, e associado a outros

fatores de virulência com ST1, LT1 e aatA em 8 isolados, não havendo relato

semelhante na literatura (Tabela 3).

Esses estudos, em sua maioria, buscam a etiologia da doença diarréica em

crianças, porém do ponto de vista da vigilância sanitária, conhecer a etiologia das

doenças diarréicas em adultos é primordial, pois estes são considerados os potenciais

manipuladores de alimento. Um estudo buscando a etiologia das diarréias em adulto

foi realizado por SUZUKI (2007) onde o autor observou que na maioria dos casos de

doença diarréica aguda, atendidas nos serviços de emergência na cidade de Itapevi

(SP) de agosto a setembro de 2006, E. coli enterotoxigênica foi o único organismo

isolado das fezes dos pacientes.

Alguns dos queijos utilizados no presente estudo não tinham procedência, não

sendo possível identificar, nos produtos, dados sobre a origem e data de validade.

Outro fato a ser considerado é a exposição do produto nos pontos de venda e a

inadequação da manipulação principalmente devido à falta de condições higiênico

sanitárias nos pontos de comercialização. A prevenção depende de medidas sanitárias

que evitem a transmissão fecal-oral, através da lavagem das mãos antes de manipular

os alimentos, cloração de água para abastecimento público e tratamento e disposição

de esgoto (NATARO e KAPER, 1998; KAPER e col., 2004).

Neste estudo muitos isolados apresentaram a toxina termo-estável ST1

(Figura 5) e são associadas a cepas que causam os casos endêmicos (NATARO e

KAPER, 1998). Com menor freqüência foram observados isolados com a toxina

61

termo-lábil LT1 ambas podem causar diarréia aquosa ao consumidor do queijo

Minas. Em poucos isolados foram encontrados a toxina termolábil LT2 que também

causa diarréia aquosa e é associada a cepas isoladas de animais homeotérmicos e em

alimentos (STELLA e col., 2008). O veículo mais comum de infecção por ETEC é a

água e alimento contaminado tanto para os casos endêmicos quanto para a diarréia do

viajante (NATARO e KAPER, 1998).

Considerando a alta freqüência de isolados com fatores de virulência

observados no presente estudo que pertençam ao grupo filogenético A que pode ser

de linhagens patogênicas intestinais (PUPO e col., 1997) e ainda que Escherichia

coli enterotoxigênica é responsável por surtos endêmicos no Brasil, também que a

transmissão de EPEC e EAEC ocorre pela manipulação de alimentos por portadores

sintomáticos ou assintomáticos (NATARO e KAPER, 1998), os resultados obtidos

demonstram que grande parte dos isolados tem potencial para causar doença.

Estudos adicionais com mais fatores de virulência dos patotipos encontrados

são necessários para melhor caracterizar os isolados de ETEC, EPEC e EAEC, pois

os marcadores utilizados só revelam que estão presentes nos isolados e não

necessariamente que esses organismos conseguem causar doença no consumidor.

De qualquer forma, independente do patotipo caracterizado, o consumo de

queijo Minas pode representar um risco à saúde do consumidor final, sendo

necessário maior rigor na fiscalização realizada pela vigilância sanitária visando

coibir a venda de produtos sem procedência e uma higiênica manipulação do queijo e

também campanhas educativas que alcancem tanto consumidores como

comerciantes, para que tenham consciência dos perigos envolvidos desde a produção

até o consumo desse tipo de alimento.

62

6. CONCLUSÕES

• A caracterização dos isolados de E. coli provenientes do queijo Minas

revelou maior freqüência do grupo filogenético A, sendo que os grupos B2 e

D também foram identificados.

• Foi possível observar que o fator de virulência para o patotipo ETEC foi o

mais freqüente nas amostras analisadas.

• É possível concluir que o queijo Minas comercializado pode representar um

risco à saúde do consumidor, devido à presença dos diferentes grupos

filogenéticos e fatores de virulência dos enteropatotipos de Escherichia coli

observados.

• São necessárias ações de vigilância sanitária que definam estratégias de

prevenção e controle efetivas na disseminação de doença diarreica causada

pelos queijos Minas comercializados e principalmente os de origem

desconhecida.

• Divulgar por meio de campanhas educativas a população, aos produtores e

vendedores de queijo os riscos envolvidos pelo consumo de alimentos

produzidos e comercializados fora das normas vigentes que garantam a

inocuidade do produto.

63

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