UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP€¦ · Efeitos da conservação de mamão (Carica papaya cv....

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos

Área de Bromatologia

Efeitos da conservação de mamão (Carica papaya cv. Golden) a baixa

temperatura sobre os compostos voláteis constituintes do aroma

Bruna Lima Gomes

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Purgatto

São Paulo

2012



Bruna Lima Gomes

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Purgatto

São Paulo

2012

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Bruna Lima Gomes



Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Prof. Dr. Eduardo Purgatto

Orientador/presidente

____________________________

1º. Examinador

____________________________

2º. Examinador

São Paulo, ______________ de _____.

A meus pais e minhas irmãs, pelo apoio e amizade.

A Bruno, pelo companheirismo.

AGRADECIMENTOS

A meu orientador, Eduardo Purgatto, pelo incentivo, pela amizade, pelas tardes

estudando comigo e por tudo que ele fez que foi tão importante para minha formação e

crescimento ao longo do curso;

A Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, pela

oportunidade cedida à realização deste mestrado e a todos os funcionários;

A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pelo

concedimento da bolsa, necessária ao desenvolvimento deste trabalho;

A meu pai, Bruno Maia, por valorizar minha educação e viabilizar minha vinda à São

Paulo e a realização deste mestrado;

A minha mãe, Rose Lima, pela amizade, pelas conversas e pela força de sempre;

As minhas irmãs, Bárbara Lima e Brena Lima, pelo carinho, amor e motivação;

A Victor Castro, Talita Pimenta, Sabrina Broetto, Mariana Foresto, Helena Chiebao,

Laís Moro, Regina Stanquevis, Renata Shitakubo, Geovana Sagrado, Juliana Nunes, Fernanda

Peroni, Ana Sansone, Claudinéia Soares, Virginia Facundo, Gabriela Schmitz, Florence

Castelan, Lorenzo Saraiva, pelos momentos descontraídos no laboratório;

A Sabrina Broetto e a Helena Chiebao, pela grande ajuda com os experimentos de

Biologia Molecular;

A João Paulo Fabi, pela imensa contribuição às etapas de Biologia Molecular deste

trabalho;

A Tânia Shiga e a Lúcia Justino, pelo apoio técnico e amizade;

Aos professores João Roberto Oliveira do Nascimento e Ricardo Kluge pelas

sugestões dadas ao trabalho;

À amiga Gabriela Fullin pelo companheirismo e pela convivência amigável, tão

importante no meu dia-a-dia;

Ao amigo Biro, pela força em todos os momentos;

A todos as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para este trabalho e estiveram

me apoiando nesse período.

RESUMO

GOMES, B.L. Efeitos da conservação de mamão (Carica papaya cv. Golden) a baixa

temperatura sobre os compostos voláteis constituintes do aroma. 2012. 67p. Dissertação

de mestrado [Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos – Área de Bromatologia

da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo].

O mamão é uma importante cultura tropical no Brasil, sendo a cultivar Golden

exportada para os Estados Unidos e Europa, onde é bastante apreciada por suas características

sensoriais. Neste caso em particular, o uso da cadeia de frio desde a colheita, transporte e

armazenamento pré-consumo contribui de maneira efetiva para o prolongamento da vida de

prateleira dos frutos, uma vez que retarda o amadurecimento, o que é fundamental para que o

fruto possa alcançar tais mercados em boas condições de comercialização. No entanto,

embora se conheça que a redução de grande parte da atividade metabólica causada pelo frio

possa alterar a emissão de substâncias voláteis e comprometer o aroma do fruto, a extensão e

os detalhes de quais vias são afetadas não está totalmente claro. Assim, destacou-se como

objetivo deste trabalho avaliar os efeitos do armazenamento a baixa temperatura sobre o perfil

de compostos voláteis ao longo do amadurecimento e sobre a expressão gênica de enzimas

relacionadas à biossíntese de componentes de impacto para o aroma do mamão. Foram feitas

análises de cor da casca, firmeza da polpa e produção de etileno e CO2, a fim de caracterizar o

amadurecimento dos frutos durante os experimentos. Os compostos voláteis foram extraídos

através da técnica de microextração em fase sólida (SPME), separados por cromatografia

gasosa e identificados por espectrometria de massa e a expressão gênica foi analisada por

PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que o armazenamento refrigerado, mesmo

sob temperaturas consideradas seguras para a conservação do fruto, nas quais não há

desenvolvimento de injúria pelo frio, afetou o perfil geral de compostos voláteis. O composto

linalool, identificado como majoritário nas amostras controle, foi detectado em menor

abundância nos frutos submetidos ao frio e, de acordo com análise estatística, foi significativo

na diferenciação dos perfis dos dois grupos. Houve redução também dos níveis de transcritos

de LIS, gene identificado como suposto codificador da enzima linalool sintase envolvida na

formação de linalool no mamão. Estes dados indicam que modificações na transcrição de tal

gene afetam a síntese de linalool, mas parecem existir outros fatores que participam da

regulação de sua expressão gênica e das respostas ao efeito das baixas temperaturas. Assim,

mais estudos acerca do assunto serão conduzidos pelo grupo a fim de compreender os

mecanismos regulatórios do metabolismo do fruto submetido a baixas temperaturas e obter

respostas que auxiliem no desenvolvimento de protocolos de conservação pós-colheita

capazes de preservar as características do aroma, importante atributo de qualidade para esta

cultura.

Palavras-chave: pós-colheita, mamão papaia, amadurecimento, voláteis, linalool sintase,

expressão gênica.

ABSTRACT

GOMES, B.L. Effects of cold storage during ripening of papaya cv. Golden on flavor

volatile biosynthesis. 2012. 67p. Dissertação de mestrado [Programa de Pós-Graduação em

Ciência dos Alimentos – Área de Bromatologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo].

Papaya is an important tropical crop in Brazil and cultivar Golden is exported to the

United States and Europe, which is highly appreciated for its sensory characteristics. In this

case, using low temperature from harvest, transport and storage contributes effectively to

prolong the shelf life of fruits, since delays ripening, which is essential for good quality fruits

in marketing. However, although it is known that the reduction of much of the metabolic

activity caused by cold can alter the emission of volatile compounds and compromising the

flavor of the fruit, the extent and details of which pathways are affected remains unclear.

Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of storage at low temperature on

the profile of volatile compounds during the ripening papaya fruit and on expression of a

volatile related gene. Skin color, firmness and ethylene and CO2 production were measured in

order to characterize fruit ripening during the experiments. The volatile components were

extracted by the technique of solid phase microextraction (SPME), separated by gas

chromatography and identified by mass spectrometry and gene expression was analyzed by

real-time PCR. According to statistical analysis, the results showed that cold storage affected

the general profile of volatile compounds, even under temperatures considered safe for

chilling injury. The compound linalool, identified as major on control samples, was detected

in lower abundance in fruits submitted to cold. There was also a reduction in transcript levels

of a putative gene encoding linalool synthase involved in biosynthesis of linalool in papaya,

predicted by in silico analysis. These data indicate that changes in gene transcription affect the

synthesis of linalool in papaya fruit, but possibly other factors also participate in gene

expression regulation. Thus, further studies will be conducted by the group in order to get

better understanding of the regulatory mechanisms of fruit metabolism subjected to low

temperatures and these answers are important to support development of postharvest

technologies that preserve the flavor fruit, an essencial quality attribute for this crop.

Keywords: postharvest, papaya fruit, ripening, volatile, linalool synthase, gene expression.

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................................13

1.1 AMADURECIMENTO...................................................................................................................13 1.2 COMPOSTOS VOLÁTEIS.............................................................................................................16

1.3 CONTROLE DO AMADURECIMENTO......................................................................................19

2 OBJETIVO..........................................................................................................................................24

3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................... ..............25

3.1 AMOSTRAS VEGETAIS................................................................................................................25

3.2 ARMAZENAMENTO A BAIXA TEMPERATURA.....................................................................25

3.3 RESPIRAÇÃO E PRODUÇÃO DE ETILENO...............................................................................26 3.4 ANÁLISE DE COR..........................................................................................................................27

3.5 ANÁLISE DE FIRMEZA DA POLPA............................................................................................27

3.5 ANÁLISE DO PERFIL DE COMPOSTOS VOLÁTEIS................................................................27 3.7 ANÁLISES in silico.........................................................................................................................28

3.8 ANÁLISES MOLECULARES.........................................................................................................29

3.8.1 Extração do RNA total...................................................................................................................29 3.8.2 Purificação.....................................................................................................................................29

3.8.3 Quantificação dos ácidos nucleicos...............................................................................................30

3.8.4 Síntese de cDNA............................................................................................................................30

3.8.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR).......................................................................... ..............30 3.8.6 Clonagem e sequenciamento.........................................................................................................31

3.8.7 Análise da expressão gênica por PCR em tempo real...................................................................31

3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................................................33

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................... ..............34

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO AMADURECIMENTO DOS FRUTOS..............................................34 4.1.1 Respiração e produção de etileno..................................................................................... .............34

4.1.2 Firmeza da polpa............................................................................................................................36

4.1.3 Cor da casca...................................................................................................................................37

4.2 ANÁLISE DO PERFIL DE COMPOSTOS VOLÁTEIS................................................................39 4.2.1 OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE VOLÁTEIS POR SPME.........................39

4.2.2 Perfil de compostos voláteis..........................................................................................................41

4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR EM TEMPO REAL.......................................48

5 CONCLUSÕES................................................................................................................. ..................53

6 REFERÊNCIAS................................................................................................................ ..................54

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema da biossíntese de linalool através da via do metileritritol fosfato em tomates (Adaptado de Lewinsohn et al., 2001)...........................................................................................................................................17

Figura 2: Perfis de produção de etileno para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a 10°C por 10 dias

seguido de transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os frutos do grupo Controle (mantidos a 22°C por 7

dias). Traço vertical pontilhado indica o último dia de armazenamento refrigerado. Barras verticais indicam o

erro padrão da média (n=5).....................................................................................................................................35

Figura 3: Perfis de respiração para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a 10°C por 10 dias seguido de

transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os frutos do grupo Controle (mantidos a 22°C por 7 dias). Traço

vertical pontilhado indica o último dia de armazenamento refrigerado. Barras verticais indicam o erro padrão da

média (n=5).............................................................................................................................................................35

Figura 4: Medidas de firmeza para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a 10°C por 10 dias seguido de



média (n=5).............................................................................................................................................................37

Figura 5: Cor da casca para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a 10°C por 10 dias seguido de



média (n=5).............................................................................................................................................................38

Figura 6: Cromatogramas obtidos a partir da análise de voláteis por SPME de mamão ‘Golden’ sob as seguintes condições de captura dos voláteis: tempo de equilíbrio de 30 minutos; tempo de exposição da fibra ao headspace

de 30 minutos; agitação da amostra durante os períodos de equilíbrio e exposição; adição de solução saturada de

NaCl. A: Com aquecimento da amostra a 50 °C. B: Sem

aquecimento............................................................................................................................................................40

Figura 7: Análise de Componentes Principais obtidos a partir das áreas normalizadas dos compostos voláteis

identificados em mamão ‘Golden’ para os grupos Frio e Controle (F e C representam os grupos, seguidos dos

números que identificam o dia de experimento e a repetição,

respectivamente)......................................................................................................................................................43

Figura 8: Representação das curvas de dissociação referente ao fragmento de LIS. A imagem foi obtida a partir do software Rotor Gene 6.0 - Corbett.....................................................................................................................48

Figura 9: Expressão relativa do gene LIS que codifica a suposta enzima linalool sintase em mamão ‘Golden’ a

partir de reações de PCR em tempo real. Barras verticais indicam erro padrão da média

(n=5).............................................................................................................................. .........................................49

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Sequência dos oligonucleotídeos específicos para a suposta sequência codificadora de LIS identificada no mamão papaia.....................................................................................................................................................31

Tabela 2: Substâncias detectadas por SPME em mamão cv. Golden dos grupos Frio e Controle em estádio

maduro....................................................................................................................................... ..............................42

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 AMADURECIMENTO

O ciclo vital dos órgãos vegetais é composto basicamente por três fases fisiológicas

que correspondem ao crescimento, à maturação e à senescência. O desenvolvimento das

plantas e seus órgãos ocorre seguindo uma série dinâmica de processos fisiológicos

geneticamente programados, culminando com a morte celular (CHITARRA; CHITARRA,

2005). Nos frutos, o desenvolvimento corresponde às seguintes etapas: multiplicação e

expansão celular, maturação fisiológica, amadurecimento e senescência. Essas etapas, no

entanto, não estão rigidamente marcadas no tempo, havendo superposição dos eventos que as

definem, quando da passagem de uma fase para outra.

O amadurecimento, por sua vez, pode ser definido como um processo irreversível e

coordenado de eventos bioquímicos e reorganizações metabólicas que, de acordo com Watada

et al. (1984), determinam as características de qualidade, evidenciadas por mudanças na

composição, coloração, textura, aroma e outros atributos sensoriais. Sob o ponto de vista

biológico, tais mudanças são fundamentais à atração de agentes dispersores e à propagação de

sementes na natureza, bem como à nutrição dos animais. Além disso, sob o ponto de vista

horticultural e comercial, os resultados de um desenvolvimento e amadurecimento correto dos

frutos são o ponto chave para atração e satisfação dos consumidores.

Os frutos do mamoeiro (Carica papaya L.) são considerados climatéricos. Como todo

fruto deste grupo, tem seu amadurecimento caracterizado pelo aumento transiente na

produção de etileno e na taxa respiratória (BIALE; YOUNG, 1981). A necessidade de etileno

no período pós-colheita de frutos climatéricos já está bem estabelecida (ABELES et al.,

1992), bem como a participação do hormônio como regulador dos eventos fisiológicos do

amadurecimento. Após a colheita, o aporte de nutrientes aos frutos torna-se limitado, mas

nesse período as reações metabólicas que promovem as alterações sensoriais dos frutos

ocorrem intensamente. Assim, a obtenção de energia passa a decorrer das reservas

acumuladas durante o crescimento e maturação fisiológica, da energia química liberada pela

respiração e de componentes oriundos do próprio metabolismo. Dessa forma, o aumento da

síntese de etileno na fase climatérica e da demanda de energia é acompanhado do aumento da

14

respiração, embora se ambos os processos constituem uma relação de causa-efeito ainda hoje

não está esclarecido.

A via de biossíntese do etileno foi descrita por Yang e Hoffman (1984) sendo a

primeira das duas etapas finais a conversão da S-adenosil-metionina em ácido 1-carboxílico-

1-aminociclopropano (ACC) pela ação da enzima ACC sintase. O ACC é então metabolizado

pela enzima ACC oxidase para produzir etileno. O hormônio se difunde livremente pelos

tecidos e se liga aos seus receptores associados predominantemente à membrana do retículo

endoplasmático, desencadeando as alterações fisiológicas que culminam com o

amadurecimento e senescência do fruto (LELIÉVRE et al., 1997). Tais modificações ocorrem

segundo uma cascata de eventos moleculares que iniciam com a ativação de vias de

sinalização de etileno, sendo reguladas por fatores de transcrição que coordenam a expressão

de genes relacionados diretamente aos processos bioquímicos do amadurecimento (BARRY;

GIOVANNONI, 2007; LIN et al., 2009). Contudo, os detalhes da transdução do sinal e da

percepção do hormônio pelo fruto ainda não estão claramente definidos.

As principais transformações metabólicas que ocorrem no amadurecimento do mamão,

além do aumento da taxa respiratória e da síntese de etileno, são: modificação da textura do

fruto, mudança de cor da casca e polpa, síntese de compostos voláteis e alteração do teor de

açúcares e ácidos orgânicos.A mudança de coloração no mamão de verde para amarelo

alaranjado deve-se ao decréscimo de clorofila na casca e a síntese e revelação de carotenóides,

pigmentos naturais responsáveis pela cor do fruto. O paralelo entre a atividade da clorofilase,

enzima que atua na degradação de clorofila, e o processo de amadurecimento tem sido

estabelecido, sabendo-se que à medida que decresce a concentração de clorofila, o fruto se

aproxima do climatério e do ponto ótimo de colheita (COSTA; BALBINO, 2002). Dessa

forma, a coloração da casca é uma variável física bastante utilizada para a determinação do

estádio de maturação e se observa que mamões colhidos no estádio adequado atingem as

condições de consumo in natura em torno de uma semana, quando armazenados a

temperaturas acima de 22°C (BRON; JACOMINO, 2006; FABI et al., 2007).

A mudança de textura é atribuída à degradação e despolimerização de pectina e

hemiceluloses da parede celular por meio da ação de enzimas específicas, como as

poligalacturonases, as pectina-metil esterases e transglicosidades, entre outras (FABI et al.,

2009, FONTES et al., 2008). Tais atividades contribuem para o amolecimento da polpa e

palatabilidade do fruto, mas diminuem a espessura da casca, tornando o mamão bastante

15

sensível a danos durante o transporte e armazenamento. Por conta disso, a perda de firmeza é

um dos fatores determinantes tanto para a qualidade do fruto, como também para sua curta

vida pós-colheita.

No decorrer do amadurecimento, há um aumento no teor de açúcares solúveis na

polpa, principalmente a sacarose, resultando no adoçamento do fruto. Como não há reservas

significativas de amido para a devida conversão em açúcares, é provável que o fruto utilize

carboidratos da parede celular como fonte de carbono para esse metabolismo. O

amolecimento da polpa também facilita a liberação e detecção do sabor doce no fruto maduro

durante a mastigação (GOMEZ et al., 1999, 2002).

O sabor e aroma são atributos importantes para a qualidade dos frutos e se entende

como flavor a combinação dessas duas sensações. Sendo assim, o flavor característico e

particular de cada fruto resulta de uma mistura complexa de açúcares, ácidos, sais, compostos

amargos, como alcaloides e flavonoides, e compostos voláteis (SONG; FORNEY, 2008).

Os componentes voláteis produzidos pelas plantas em geral são úteis como mecanismo

de proteção e defesa contra o ataque de microrganismos e herbívoros, para comunicação entre

as plantas, bem como para atração de agentes dispersores (MARÍN-LOAIZA; CÉSPEDES,

2007). Por outro lado, tais substâncias contribuem imensamente para a percepção do aroma do

fruto pelo homem, pois mesmo aqueles produzidos em pequenas concentrações, podem ser

detectados pelo olfato humano (BRÜCKNER, 2008).

A composição diversa de voláteis sintetizados ao longo do amadurecimento do mamão

tem bastante impacto sobre a qualidade do fruto e quanto aos ácidos orgânicos, que também

contribuem para a composição do flavor, o ácido cítrico é predominante no mamão, seguido

do ácido málico, e seus teores diminuem com a maturação (ARRIOLA; MENCHU; ROLZ,

1980).

16

1.2 COMPOSTOS VOLÁTEIS

O primeiro estudo detalhado sobre componentes voláteis do mamão foi feito por Flath

e Forrey (1977) usando técnicas de destilação para o isolamento dos voláteis. Diferentes

classes de substâncias foram identificadas, incluindo hidrocarbonetos, alcoóis, aldeídos,

cetonas, ésteres, lactonas e terpenos. Nesse estudo, o linalool e o isotiocianato de benzila

foram detectados como os compostos mais abundantes. Flath et al.(1990) examinaram a

emissão de voláteis em mamão da variedade Solo por técnica de headspace em quatro

estádios diferentes do amadurecimento. Vários ésteres e monoterpenos apareceram apenas no

fruto maduro e o linalool, seguido pelos seus óxidos, acetato de etila, fenilacetonitrila e

isotiocianato de benzila foram encontrados em todos os estádios, com aumento progressivo

nas suas concentrações até o estádio maduro. Além desses, outros componentes como

butanoato de metila, butanoato de etila, octanoato de etila, α-terpineol, 3-metilbutanol e álcool

benzílico também são tipicamente encontrados em outros estudos acerca da emissão de

voláteis durante o amadurecimento do mamão (FUGGATE et al., 2010; ALMORA et al.,

2004; PINO et al., 2003; HEIDLAS et al., 1984).

O linalool é um álcool monoterpênico de cadeia aberta bastante volátil e, além de ser

um dos componentes majoritários do aroma de mamão, também já foi detectado em diversas

frutas como maracujá, abacaxi (BERNREUTHER; SCHREIER, 1991; WERKHOFF et al.,

1998), uva (PATIL et al.,1995), tomate (BALDWIN et al., 2000), morango (AHARONI et al.

2004) e damasco (GUICHARD et al., 1990).

Os terpenos compreendem isoprenos (C5), monoterpenos (C10) e sesquiterpenos

(C15), representando uma classe importante de compostos voláteis em plantas. Um dos papéis

biológicos desses compostos está na defesa direta ou indireta contra patógenos e herbívoros e

na atração de agentes polinizadores e dispersores de sementes (YUAN et al., 2008;

DUDAREVA et al., 2006). Todos os terpenos são derivados da via do ácido mevalônico

(MVA) no citosol, a partir de unidades de acetil-coA que formam difosfato de isopentila

(IPP), precursor de cinco carbonos, e da via do metileritritol fosfato (MEP) nos plastídios,

formando difosfato de dimetilalila (DMAPP), oriundos de unidades de piruvato e

gliceraldeído-3-fosfato (RODRIGUEZ-CONCEPCION; BORONAT, 2002). O linalool, por

sua vez, é sintetizado pela via do MEP nos plastídios, sendo derivado diretamente de geranil

17

difosfato (GPP), precursor também da síntese de carotenoides e outros metabólitos, através da

ação da enzima linalool sintase (LIS) segundo o modelo proposto para o tomate (Figura 1).

Figura 1 - Esquema da biossíntese de linalool através da via do metileritritol fosfato

em tomates (Adaptado de Lewinsohn et al., 2001).

Devido à presença de carbono assimétrico na sua estrutura química, podem existir nos

frutos os enantiômeros (R)-linalool e (S)-linalool, os quais possuem especificidades de aroma

diferentes: o primeiro com notas de lavanda e o último com notas florais, frutais e levemente

cítricas (disponível em: http://www.thegoodscentscompany.com/allprod.html). Quando

caracterizadas, cada LIS produz apenas um dos enantiômeros e ainda não foi identificada uma

enzima que produzisse os dois ao mesmo tempo (CHEN X. et al., 2010).

Os óxidos furanóide e piranóide de linalool e os seus isômeros cis e trans são

derivados da biotransformação do linalool, que parece ocorrer por reações oxidativas

mediadas pelo citocromo P450 (MEESTERS et al., 2007). Esses compostos apresentam notas

aromáticas florais, cítricas e mentoladas (disponível em:

http://www.thegoodscentscompany.com/allprod.html) e também são detectados em muitos

frutos como constituintes do flavor.

18

A LIS foi identificada primeiramente por Pichersky et al., (1995) em flores de Clarkia

breweri. Desde então, o mesmo grupo tem obtido resultados sobre a caracterização e

expressão do gene que codifica a enzima presente nessas flores (DUDAREVA et al., 1996;

CSEKE et al., 1998; DUDAREVA; PICHERSKY, 2000), sendo que este gene também já foi

descrito em outras flores (CHEN X. et al., 2010; NAGEGOWDA et al., 2008; SHELTON et

al., 2004; CROWELL et al., 2002). Muitos estudos tem sido conduzidos acerca da expressão

de LIS envolvendo transformações em Arabidopsis thaliana (YANG et al.,2008; AHARONI

et al., 2003), em flores do gênero petúnia (LÜCKER et al., 2001) e flores de cravo (LAVY et

al., 2002) a fim de potencializar a formação de linalool nas espécies citadas.

Em frutos, no entanto, há poucos dados sobre LIS. Wang & Fan (2009) caracterizaram

uma LIS em frutos de damasco e observaram que o gene que codifica a enzima é expresso no

fruto. Em koubo (Cereus peruvianus L.), fruto não-climatérico em que o linalool e seus

metabólitos representam 99% do perfil de voláteis (NINIO et al., 2003), foi observado

aumento da atividade de LIS concomitante com o aumento dos níveis de linalool ao longo do

amadurecimento (SITRIT et. al., 2004).

Duas enzimas reconhecidas como terpeno sintases foram encontradas em tomate, onde

uma delas produziu linalool na presença do precursor GPP (VAN SCHIE et al., 2007).

Também em tomate, Lewinsohn et al. (2001) introduziram um gene que codifica LIS sob

controle do promotor do gene fruto-específico E8 e observaram aumento nos níveis de

linalool e seus metabólitos durante o amadurecimento. Embora, esse aumento não tenha

contribuído para a percepção geral do flavor pelos provadores em uma análise sensorial, o

estudo sugere caminhos para intervenções metabólicas que possibilitem a conservação do

aroma dos frutos.

Em mamão papaia, Devitt et al., (2006) identificaram genes associados ao

amadurecimento pelas sequências de EST’s (Expressed Sequence Tags) geradas através da

construção de bibliotecas de cDNA. Uma dessas sequências apresentou similaridade com uma

enzima de Arabidopsis thaliana identificada como linalool sintase, indicando um possível

gene LIS expresso no fruto.

Apesar deste precedentes, não há dados na literatura acerca dos fatores que regulam a

expressão do gene LIS e a atividade da enzima codificada durante o amadurecimento do

mamão. Da mesma forma, inexistem dados, até o momento, acerca dos efeitos das várias

19

tecnologias empregadas para conservação de frutos (atmosferas modificadas, cadeia de frio,

entre outras) sobre a expressão de LIS.

1.3 CONTROLE DO AMADURECIMENTO

O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e atualmente é o segundo

maior produtor mundial de mamão, colocando este fruto em lugar de destaque na fruticultural

ropical do país. Sua produção (cerca de 1.900.000 toneladas por ano) se concentra na Bahia e

Espírito Santo e, desse total, 32.000 toneladas são para exportação (AGRIANUAL, 2012). A

cultivar Golden, genótipo resultante de seleções da cv. ‘Sunrise Solo’ (COSTA; PACOVA,

2003), é exportada para os Estados Unidos e Europa, onde é bastante apreciada pelo aroma e

sabor, assim como pela cor e textura da polpa. Contudo, a comercialização em maior escala

impõe desafios, pois o mamão é um fruto de alta perecibilidade, apresentando índices de

perdas pós-colheita entre 30% e 40% (AGRIANUAL, 2012).

A cadeia de frio durante o transporte e armazenamento constitui um conjunto de

soluções tecnológicas largamente utilizado para o controle do amadurecimento e,

consequentemente, para ampliar a vida de prateleira dos frutos e a oferta tanto no mercado

interno quanto externo. A exportação via marítima representa redução dos custos quando

comparada ao transporte aéreo, mas exige maior tempo de conservação dos frutos, sendo

necessária a estocagem sob refrigeração por um período, em média, de 15 dias.

Com a diminuição da temperatura, as reações enzimáticas ocorrem mais lentamente,

reduzindo o metabolismo e, assim, retardando o amadurecimento e senescência. Contudo, o

frio pode causar distúrbios fisiológicos irreversíveis, promovendo efeitos deletérios no fruto,

conhecidos como injúria pelo frio ou chilling injury (CI), que reduz a aceitação do fruto pelo

consumidor ou até impede sua comercialização.

A Temperatura Mínima de Segurança (TMS) para o resfriamento de um fruto é

determinada pela sua suscetibilidade ao dano causado pelo frio, dependendo de fatores como

estádio de maturação, tipo de cultivar e condições ambientais de produção (CHEN; PAULL,

1986). Em geral, frutos tropicais são mais sensíveis e o efeito pode variar com a temperatura e

20

com o tempo de exposição (RAISON; LYONS, 1986). Para o mamão, temperaturas

compreendidas entre 9ºC e 12°C são geralmente as mais utilizadas. Abaixo desses valores, foi

verificada injúria pelo frio em frutos da cultivar Golden (ALMEIDA et al., 2005).

Os mecanismos que levam à CI ainda não estão totalmente definidos, mas acredita-se

que a resposta primária seja a alteração na estrutura e fluidez da fase lipídica das membranas

celulares que altera também a atividade de proteínas associadas, a propriedade de

permeabilidade e a compartimentação de íons e metabólitos (LYONS, 1973). Em nível de

ultra-estrutura, ocorrem mudanças funcionais em mitocôndrias, cloroplastos e núcleo celular

(KRATSH, WISE; 2000). As disfunções resultantes podem ser reparadas se o fruto retornar às

condições adequadas, antes que a desordem se torne permanente. Do contrário, como efeitos

secundários, pode haver a intensificação do estresse oxidativo, por alterar o equilíbrio entre a

geração e a remoção de espécies reativas de oxigênio (DAT, 2000; HODGES et al., 2004). Os

radicais livres gerados passam a promover a peroxidação lipídica e proteica e,

consequentemente, a desestabilização das membranas, perda de funções celulares e

enzimáticas, distúrbios metabólicos e até a morte celular. Alguns dos sintomas são externos e

visíveis nos frutos, como a descoloração da polpa e casca, desenvolvimento de cor marrom ou

preta, depressões na casca, flavor desagradável, entre outros.

No entanto, a exposição a temperaturas toleradas pelos frutos, nas quais não há

indução de CI, também pode alterar o equilíbrio metabólico, pois à medida que a homeostase

é afetada pelo frio, diversas rotas bioquímicas mudam seu padrão de atividade, desviando a

síntese de alguns produtos, gerando metabólitos diferentes ou mesmo acumulando

intermediários tóxicos. A biossíntese de compostos voláteis, por exemplo, é bastante sensível

ao resfriamento. Experimento utilizando kiwi armazenado a temperaturas normalmente

utilizadas para sua conservação mostrou redução na produção de etileno e de ésteres voláteis,

assim como no nível de transcritos de genes que codificam as álcool aciltransferases (AAT),

enzimas correlacionadas à síntese de ésteres voláteis. Quando os frutos foram transferidos

para a temperatura ambiente, houve restituição da produção de etileno e os níveis de ésteres e

de transcritos de AAT foram apenas parcialmente restaurados (GÜNTHER et al.,2010),

possivelmente prejudicando o flavor do fruto.

Louw e Theron (2012), analisando variedades de ameixa armazenadas a baixas

temperaturas sem indução de injúria pelo frio, observaram que uma das variedades apresentou

concentrações menores de linalool e dos óxidos cis e trans de linalool. Outro trabalho

21

analisou duas variedades de tangerinas submetidas ao frio, com exposição à TMS e a

temperaturas não toleradas pelos frutos e foi observado que houve mudanças nos perfis de

voláteis, mesmo nos frutos armazenados em temperaturas consideradas seguras. A formação

de terpenos mostrou-se bastante sensível ao frio em uma das variedades, com diminuição na

concentração de alguns compostos, como o linalool, e aumento na concentração de outros

como o óxido cis de linalool. Essas alterações foram perceptíveis em análise sensorial,

diminuindo a aceitação pelos provadores (TIETEL et al., 2012).

Pêssegos expostos a temperaturas acima da TMS e àquelas indutoras de injúrias

tiveram seus perfis de voláteis alterados em ambos os casos, sendo esse efeito mais marcante

quanto mais próximo da temperatura de injúria (ZHANG et al., 2011). Nesses frutos, também

foi observado redução dos níveis de transcritos de AAT, álcool desidrogenases (ADH),

hidroperóxido liases (HPL) e lipoxigenases (LOX), enzimas envolvidas com a biossíntese de

compostos do aroma em frutos (DEFILIPPI et al., 2009). Os autores sugerem que mudanças

na produção de etileno causadas pelo frio podem estar envolvidas com a expressão de genes

relacionados ao aroma.

O papel do etileno no mecanismo de tolerância do fruto ao frio e no desenvolvimento

de injúria ainda é pouco compreendido. Contudo, considerando que os receptores de etileno

estão localizados principalmente na membrana do retículo endoplasmático (CHEN Y. et al.,

2002; MA et al., 2006; ZHONG et al., 2008), mudanças na estrutura das membranas celulares

podem comprometer a percepção do hormônio pelo fruto e alterar a cascata de eventos

subsequentes. Nessa perspectiva, muitos estudos tem sido conduzidos a fim de relacionar

elementos da via de sinalização do etileno com as respostas à baixa temperatura.

Através de um ensaio para medir a capacidade relativa de ligação ao etileno (SISLER,

1979), Jiang et al., (2004) observaram que bananas expostas a temperatura indutora de injúria

tiveram sua ligação ao etileno reduzida, tornando os frutos menos responsivos ao hormônio.

Em outro experimento, as bananas foram tratadas com 1-metilciclopropeno (1-MCP), potente

inibidor da ação do etileno, e em seguida armazenadas à baixa temperatura. Esses frutos

apresentaram sintomas de CI mais severos, sugerindo que o efeito do frio é influenciado pela

capacidade do tecido de responder ao etileno.

Estudo em kiwi mostrou que genes associados à via de sinalização do etileno, desde

receptores a fatores de transcrição relacionados à resposta ao hormônio, mudam seu padrão de

expressão em resposta ao frio (YIN et al., 2009). Em maçãs foi observada que a expressão de

22

genes relacionados à síntese e à sinalização de etileno é influenciada pela temperatura, pela

presença de 1-MCP e pela atmosfera modificada (ASIF et al., 2009). Outro resultado

interessante foi visto em nêspera, um fruto não-climatérico, no qual genes específicos de

sinalização de etileno tiveram sua expressão alterada com a estocagem refrigerada, indicando

um possível envolvimento do hormônio com a tolerância do fruto ao frio (WANG et al.,

2010).

Na literatura, já está bem consolidado que o resfriamento afeta a produção de voláteis

em frutos como maçãs (ECHEVERRIA et al., 2004), mangas (SHIVASHANKARA et al.,

2006), pêssegos (INFANTE et al., 2008) e estudos recentes acerca do efeito do frio sobre a

caracterização do amadurecimento tem sido conduzidos (RIVERA-PASTRANA et al., 2010;

COSTA et al., 2012; CANO-SALAZAR et al., 2012). Contudo, embora haja resultados sobre

as desordens metabólicas ocasionadas pelo frio em mamão, afetando as características

químicas do fruto (ALMEIDA et al., 2006) e sua maturação (BRON; JACOMINO, 2009;

KARAKURT; HUBER, 2003; 2007), o efeito da baixa temperatura sobre a emissão de

voláteis e sobre a expressão de genes relacionados ao aroma ainda não foi muito explorado.

Em pawpaw, um fruto climatérico que por muito tempo foi confundido na literatura

com papaia (POMPER; LAYNE, 2005), o resfriamento causou o aparecimento de off-flavors,

redução da quantidade de ésteres voláteis e da atividade de AAT e LOX, bem como redução

da respiração e produção de etileno, diminuição do pH e aumento da concentração de

açúcares solúveis, com efeito mais intenso em períodos maiores de armazenamento (GALLI

et al., 2008). Todavia, em mamão, mesmo com diversos estudos sobre voláteis que

caracterizam terpenos como componentes de impacto para o aroma, não há dados que os

relacionam ao efeito do frio.

Sabendo da importância do flavor como fator de qualidade do mamão papaia, interesse

particular deste projeto, e que a manutenção do aroma após o período de conservação no frio é

fundamental para obter bons resultados durante a comercialização, o conhecimento sobre

quais vias metabólicas de biossíntese de voláteis são afetadas e sobre seus pontos de

regulação podem proporcionar o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas pós-colheita

capazes de aumentar a vida de prateleira dos frutos e ao mesmo tempo garantir a qualidade até

o consumidor final.

Nesse contexto, a hipótese deste trabalho é que o armazenamento do mamão a baixa

temperatura, mesmo àquelas toleradas pelo fruto, onde não há desenvolvimento de injúria,

23

altera o perfil de compostos voláteis durante o amadurecimento e que modificações na

expressão de genes que codificam enzimas ligadas às vias de biossíntese de compostos

voláteis deve ser parte relevante do mecanismo responsável por tal efeito.

24

2 OBJETIVO

O presente estudo teve como objetivos avaliar os efeitos do armazenamento a baixa

temperatura sobre o perfil de compostos voláteis no mamão cv. Golden e sobre a expressão

gênica de enzimas relacionadas à biossíntese de componentes de impacto para o aroma do

fruto.

25

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAS VEGETAIS

Foram obtidos 100 frutos ‘Golden’ provenientes da região de Linhares-ES, junto a

Brasfruit Distribuidora em Itapevi-SP, que foram transportados até o laboratório sob

refrigeração (10°C), chegando no 3º dia pós-colheita em estádio 1 de maturação (fruto com

até 15% da casca com coloração amarela), de acordo com a descrição dos estádios de

maturação feita por Folegatti e Matsuura (2002). Os frutos foram lavados com água corrente,

mantidos por 1 minuto em solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) para redução da carga

microbiana superficial, lavados novamente com água e secos.

3.2 ARMAZENAMENTO A BAIXA TEMPERATURA

Para os experimentos acerca dos efeitos do frio sobre a produção de voláteis e

expressão gênica de enzimas, 60 frutos escolhidos de forma aleatória, foram armazenados

imediatamente após higienização em câmara B.O.D. a 10°C e U.R. de 80% durante 10 dias.

Em seguida, a temperatura foi elevada para 22°C, permanecendo até completo

amadurecimento, o que totalizou 5 dias, pois após este período foi observado o aparecimento

de fungos. Tal protocolo visou simular as condições de transporte a longa distância,

exportação e armazenamento para posterior comercialização. Paralelamente, para o grupo

controle, 40 frutos foram armazenados em câmara B.O.D. a 22°C e U.R. de 80% durante 7

dias, tempo no qual os primeiros sinais de senescência dos frutos apareceram, como o

desenvolvimento de fungos. Os frutos de ambos os grupos tiveram seu amadurecimento

acompanhado diariamente através de análises de respiração, produção de etileno, cor e

firmeza. Considerou-se o 1º dia de experimento como o 4º dia pós-colheita. As polpas foram

congeladas em N2 líquido e armazenadas a –80ºC para as análises posteriores.

Assim, o experimento ficou definido em:

a) Grupo Controle: frutos mantidos a 22ºC por 7 dias.

b) Grupo Frio: frutos mantidos a 10ºC por 10 dias, seguidos de 5 dias a 22°C.

26

3.3 RESPIRAÇÃO E PRODUÇÃO DE ETILENO

Para cada dia de experimento, foram utilizados 5 frascos hermeticamente fechados

contendo 2 frutos em cada com aproximadamente 500g, totalizando 10 frutos analisados por

dia. A estimativa de CO2 foi realizada pela injeção de amostras de ar do interior de frascos

contendo 2 frutos, pesando aproximadamente 500g, em um cromatógrafo a gás da Hewlett-

Packard modelo GC-6890 equipado com detector de condutividade térmica (TCD). A coluna

utilizada foi a HP-Plot Q (30 m, D.I. 0,53 mm).

As condições para a corrida cromatográfica foram: injeção com divisor de amostra

(split) em taxa de 50:1 e temperatura de 250°C; volume de injeção 1ml; corrida isotérmica a

30°C empregando hélio como gás carregador em fluxo constante de 4ml/min; temperatura do

detector em 250°C utilizando como referência fluxo de hélio a 7ml/min. A estimativa da

quantidade de CO2 foi feita em relação a injeção de 1 mL de padrão de CO2 326 L/L em ar

sintético da Air Liquid.

Para a análise de etileno, foi empregado o mesmo equipamento e a mesma coluna

cromatográfica, porém com detecção por ionização de chama (FID). O volume de injeção foi

de 10 mL e para injetar tal quantidade de ar, foi empregado o modo de injeção pulsed

splitless, desenvolvido pela Hewlett-Packard, opcional das válvulas de injeção com EPC

(Electronic Pressure Control) utilizadas nos modelos de cromatógrafo a gás desta empresa.

As condições de injeção foram: pressão de 20 psi por 2 minutos, fluxo de ventilação

de 20 ml/min após 30 segundos de injeção e temperatura do injetor em 200°C. As demais

condições cromatográficas empregadas foram: corrida isotérmica a 30ºC empregando hélio

como gás carregador em fluxo constante de 1 ml/min; temperatura do detector em 250°C,

fluxo de ar e hidrogênio no detector em 450 ml/min e 50 ml/min, respectivamente. A

estimativa da quantidade de etileno produzida pelos frutos foi feita em relação à injeção de

um padrão de 0,1 L/L de etileno em ar sintético da Air Liquid.

27

3.4 ANÁLISE DE COR

A cor da casca dos frutos foi analisada conforme descrito por FABI et al. (2007)

utilizando um colorímetro HunterLab ColorQuest XE (Hunter Associated Laboratories). A

cor foi expressa em relação ao valor de matiz (Hue) calculado pela fórmula H=tan-1(b/a),

onde b (quantidade de amarelo e azul) e a (quantidade entre vermelho e verde) são valores

fornecidos pelo aparelho, levando em conta o plano de cores descrito pelo método Hunter.

3.5 ANÁLISE DE FIRMEZA DA POLPA

A firmeza da polpa dos frutos foi determinada através de um penetrômetro manual,

sendo possível medir a resistência da polpa à penetração. Os frutos foram descascados

superficialmente e medidos 5 pontos da região equatorial de 3 frutos a cada dia. Os dados

foram expressos em Newton (N), considerando a média das leituras.

3.6 ANÁLISE DO PERFIL DE COMPOSTOS VOLÁTEIS

Para análise de voláteis utilizou-se a técnica de micro-extração em fase sólida (SPME)

empregando uma fibra de polidimetilsiloxano de 100µm de espessura da Supelco®. As

amostras das polpas de mamão foram preparadas e armazenadas em vials específicos para esta

técnica, onde os componentes voláteis foram extraídos do headspace segundo parâmetros

otimizados para este experimento (resultados da otimização no item 4.2.1).

Foi utilizado o cromatógrafo Hewlett-Packard modelo 6890 acoplado a um detector

seletivo de massas da mesma empresa modelo 5973. A coluna cromatográfica empregada foi

a Supelcowax 10 (tamanho 30 m, 0,25 mm de diâmetrointerno, 0,25 µm de espessura do

filme). O programa de temperatura utilizado foi: 50ºC até 150ºC seguindo uma rampa de

temperatura de 2ºC por minuto permanecendo por 5 minutos. A temperatura da interface entre

o cromatógrafo e o detector seletivo de massas foi de 230ºC e a ionização foi feita por

impacto de elétrons (70 eV) com a fonte de íons mantida a 150°C, com faixa de varredura de

28

50 a 550 m/z. A amostra foi dessorvida da fibra pela exposição ao calor do injetor do

cromatógrafo (200ºC) por 15 minutos.

Para o grupo Frio, foram feitas análises em 5 pontos cobrindo a fase pré-climatérica, o

climatério e o pós-climatério: dia de experimento 1 (DE1), DE6, DE11, DE13 e DE15. O

grupo Controle foi analisado durante todos os 7 dias de experimento, totalizando 7 pontos:

DE1 a DE7. Todas as análises, em ambos os grupos, foram realizadas em triplicata, utilizando

um pool da polpa fresca de 3 frutos para cada replicata.

A identificação dos componentes detectados foi feita através da comparação dos

espectros de massas obtidos com os dados da biblioteca NIST98, sendo considerados com

identificação positiva aqueles com índice de similaridade acima de 70%.Para a confirmação

da identidade do linalool, utilizou-se o tempo de retenção relativo ao padrão externo autêntico

desse constituinte (Linalool - 51782, 98% de pureza, Sigma-Aldrich).

3.7 ANÁLISES in silico

Devitt et al., (2006) identificaram genes associados ao amadurecimento de mamão

pelas sequências de EST’s (Expressed Sequence Tags) geradas através da construção de

bibliotecas de cDNA. Tais sequências apresentaram similaridade com possíveis proteínas

relacionadas à maturação. Dentre essas sequências parciais, um contig apresentou

similaridade com uma linalool sintase de Arabidopsis thaliana (Acesso GenBank:

AAL24105). Utilizou-se asequência de aminoácidos deduzida a partir deste acesso como

molde para identificar candidatos a genes homólogos no genoma do mamão através da

ferramenta tBlastn (disponível em: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), uma base de dados

de nucleotídeos traduzidos que gera como resultado sequências genômicas codificadoras de

proteínas livres de íntrons.

Foram identificadas duas sequências de DNA correspondentes a dois prováveis genes

de linalool sintase (Acessos GenBank: ABIM01007557 e ABIM01025787) que parecem estar

localizadas em cromossomos diferentes. A sequência ABIM01007557 apresentou maior

similaridade com o EST encontrado em mamão, com alguns pares de bases diferentes ou

ausentes. Uma vez que o sequencimento de Shotgun (Whole Genome Shotgun), técnica

utilizada para finalizar o genoma do mamão (disponível em:

29

http://asgpb.mhpcc.hawaii.edu/papaya), é mais rigoroso que o sequenciamento de EST’s,

optou-se por utilizar a sequência de bases correspondentes ao genoma do mamão.

O desenho dos primers para a sequência foi feito utilizando o programa Primer3plus,

(disponível em: http://primer3plus.com) tendo como critérios a temperatura de dissociação

(Tm), a diferença máxima de 1°C entre as Tm do par de primers, aquantidade de CG na

sequência, a ausência de primer-dimer ou hairpin. Aavaliação da qualidade dos primers foi

verificada por meio da ferramenta Oligo Analysis Tool (disponível em:

http://www.operon.com/technical/toolkit.aspx) que possibilitou analisar a presença de primer-

dimer, bem como determinar a quantidade (em torno de 50%) de CG e a Tm. A presença de

hairpins dentro da sequência foi verificada através do programa Mfold (disponível em:

http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form).

3.8 ANÁLISES MOLECULARES

3.8.1 Extração do RNA total

Para a extração de RNA total da polpa do fruto foram utilizadas amostras congeladas e

armazenadas a -80°C. O tecido foi pulverizado em nitrogênio líquido e foi utilizado o

Concert™ Plant RNA Reagent (Invitrogen™) gelado, seguindo o protocolo descrito pelo

fabricante. Foram selecionados 6 pontos do Grupo Frio (DE1, DE6, DE10, DE11, DE13 e

DE15) e 6 do Grupo Controle (DE1, DE2, DE3, DE4, DE5 e DE6). Para cada amostra

referente a cada ponto de análise, foi feita triplicata de extração.

A verificação da qualidade do RNA total foi feita através de eletroforese em gel de

agarose 1% corado com GelRed™ - concentrado na diluição 1:500 (v/v) e visualizado no

transiluminador sob luz ultravioleta, observando a integridade das bandas 18S e 28S do RNA

ribossomal.

3.8.2 Purificação

http://www.operon.com/technical/toolkit.aspx













http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form



















30

As amostras foram tratadas com DNase seguindo o kit Ambion® DNA-free™ DNase

Treatment & Removal Reagents (Invitrogen) e o manual fornecido pelo fabricante. Também

foi avaliada a integridade do RNA após essa etapa, pelo método descrito no item 3.8.1.

3.8.3 Quantificação dos ácidos nucleicos

A quantidade de RNA foi calculada por espectrofotometria (SAMBROOK et al.,

1989) considerando que uma amostra contendo 40 μg/mL de RNA apresenta valor de

absorbância igual a 1,0 a 260 nm. Somente amostras de RNA total com razões A260/A280 entre

1,8 e 2,0 foram utilizadas na síntese do DNA complementar (cDNA).

3.8.4 Síntese de cDNA

Para a síntese do cDNA utilizado nas reações de PCR quantitativa, o protocolo

utilizado foi o descrito no kit ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega), baseado

na utilização de uma transcriptase reversa e de Oligo(dT)15 como primer para a síntese do

cDNA a partir do RNA total. Para o início da reação, partiu-se de 500 ng de RNA total

quantificado nas amostras.

3.8.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para testar a especificidade dos primers desenhados antes de iniciar as análises de PCR

em tempo real foram feitas amplificações do fragmento por PCR convencional com 35 ciclos,

consistindo das seguintes etapas: desnaturação inicial a 94°C / 4 min, desnaturação a 94 °C /

30s, pareamento dos primers a 60°C por 30s, extensão a 72°C / 1 min e 30s e extensão final a

72 °C/4 min. A reação de amplificação consistiu de uma alíquota de 1μL da reação de cDNA,

1μL de solução 10 μM de cada primer, dNTP 2,5μM, MgCl2 4 mM e 1 unidade da enzima

Taq polimerase em um volume total de 20 μL de reação.

Para a confirmação da amplificação, as amostras foram submetidas a eletroforese em

gel de agarose 1% em tampão TAE (SAMBROOK et al., 1989), contendo SYBR Safe. Foi

utilizado o marcador de peso molecular 1kb DNA Ladder (Invitrogen®) como padrão.

Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação do fragmento de LIS no mamão

papaia estão descritos a seguir:

31

Tabela 1. Sequência dos oligonucleotídeos específicos para a suposta sequência codificadora

de LIS identificada no mamão papaia.

Gene Sentido Sequência

LIS forward

reverse

5’-CGT TGC TTC ACC CTT CAA AC -3’

5’-GAG GAA TCT GTA TTG AAG AGG C -3’

3.8.6 Clonagem e sequenciamento

Para confirmação da identidade do produto amplificado na reação de PCR, o

fragmento de DNA obtido foi ligado ao vetor pTZ57R/T (InsTAclone PCR Cloning Kit-

Fermentas). Para a transformação e propagação do DNA plasmidial, as reações de ligação

foram utilizadas para transformação de células competentes de Escherichia coli (linhagem

TOP 10 - Invitrogen, Carlsbad, CA) por choque térmico, segundo as instruções do fabricante.

A etapa de sequenciamento foi realizada no Centro de Estudos do Genoma Humano-

CEGH/USP através de reação de terminação com dideoxinucleotídeos e os eletroferogramas

gerados foram analisados através do Sequence Scanner Software para determinação das

sequências. Os resultados obtidos foram submetidos à comparação com os dados do GenBank

para confirmação da identidade da sequência por meio da ferramenta BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990) disponível na Internet, sendo inicialmente

verificados quanto à presença de fragmentos de vetor no resultado através do sistema

VecScreen.

3.8.7 Análise da expressão gênica por PCR em tempo real

Para as reações foram utilizados os primers específicos para amplificação de trechos

das sequências de LIS.

O método de PCR em tempo real foi realizado utilizando o kit Platinum® SYBR

®

Green qPCR Supermix-UDG with ROX (Invitrogen), de acordo com o protocolo descrito

pelo fabricante. As reações foram conduzidas em aparelho termociclador Rotor-Gene 6000

(Corbett research), em triplicata técnica, tanto para o controle negativo quanto para cada

amostra analisada. Foi utilizado o gene constitutivo da β-actina como controle endógeno e

32

normalizador dos cálculos de expressão relativa de LIS, e um controle negativo NTC (No

Template Control) contendo todos os reagentes exceto o cDNA. A partir dos cDNAs

provenientes da reação da transcriptase reversa foram utilizados 2 µL nas reações de

amplificação, às quais acrescentaram-se 5,0 µL de Platinum® SYBR

® Green qPCR Supermix-

UDG with ROX, 0,2 µL de cada primer 5 µM e água DEPC em quantidade suficiente para um

volume final de 10 µL.

A programação utilizada no termociclador foi de 95°C/5 min para ativação da Taq

Polimerase, 40 ciclos de 95°C/15s para desnaturação, 60°C/30s para pareamento dos primers,

72°C/30s para extensão.

Para a verificação da especificidade da amplificação e confirmação da ausência de

formação de dímeros do primer ou qualquer outro produto inespecífico, as reações foram

finalizadas com a determinação da temperatura da curva de dissociação do produto, que

utilizou uma rampa de variação de 72 °C a 95 °C. A temperatura apresentada na curva de

dissociação de cada gene deve ser a mesma para todas as reações, de modo a indicar a pureza

do produto gerado. O software (Rotor Gene 6.0 - Corbett) utilizado para as análises do Cycle

threshold (Ct) e da temperatura de dissociação foi o do próprio equipamento.

A eficiência das reações foi calculada a partir das curvas geradas nas reações de

calibração de cada gene. Nessas reações foram utilizadas diluições seriadas até 1:100 do

material sem diluição (SD) de um pool de cDNA de todos os pontos amostrados. A partir do

resultado das reações foi traçada uma curva de eficiência levando-se em consideração o

logaritmo da quantidade de RNA, referente às diluições do cDNA e o Ct da reação. Foi

determinada a equação da reta através de regressão linear, integrando os valores de Ct no eixo

das ordenadas e o logaritmo da quantidade de RNA no eixo das abscissas. A fórmula da

regressão linear desta reta-padrão (y=mx + b) serviu de base para os cálculos posteriores na

determinação do R², cujo valor máximo é igual a 1, e da Eficiência (E) da reação, calculada a

partir da inclinação da reta (Slope) e que é expressa pela equação: E= 10(-1/slope)

.

A expressão gênica foi determinada pelo cálculo da expressão relativa a partir dos

valores de razão determinados para o Dia 0, ou seja, o dia em que frutos chegaram ao

laboratório, anterior ao início dos experimentos, adotado como valor de referência para os

pontos de análise. Para o cálculo da quantificação relativa do gene alvo foi utilizada a

seguinte equação, proposta por Pfaffl (2001):

33

R = 2- [∆Ct amostra - ∆Ct controle]

R = 2-∆∆Ct

Nessa equação, a razão representa a expressão relativa do gene alvo, onde ΔCtamostra é a

diferença entre o Ct do gene alvo (LIS) e o Ct do gene constitutivo (β-actina) nas amostras de

cada ponto analisado, ΔCtcontrole é a diferença entre o Ct do gene alvo e o Ct do gene

constitutivo nas amostras de referência (Dia 0).

3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para avaliação dos dados obtidos através da análise dos compostos voláteis por SPME

foi aplicada Análise de Componentes Principais (PCA) com uso do Software STATISTICA

8.0 (StatSoft , Tulsa, Oklahoma, EUA).

34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO AMADURECIMENTO DOS FRUTOS

4.1.1 Respiração e produção de etileno

Os frutos dos grupos Frio e Controle tiveram suas taxas respiratórias e de produção de

etileno monitoradas diariamente durante todo o experimento (Figuras 2 e 3). Para as amostras

controle, foi observado pico de etileno característico de frutos climatéricos, coincidente com o

pico da taxa respiratória. Fabi et al. (2007) analisando frutos da mesma variedade, observaram

pico de etileno em torno do 4º dia pós-colheita, precedendo em um dia o pico na respiração.

Vale ressaltar, porém, que pequenas variações na atividade respiratória e na produção de

etileno são aceitáveis, pois se sabe que esses fatores dependem, além da variedade do fruto,

das condições ambientais de cultivo (LEVIÉVRE et al., 1997), pois a incidência de luz, as

características do solo e a quantidade de chuva, para citar alguns exemplos,podem influenciar

no metabolismo da planta como um todo, refletindo também no fruto.

Pode-se observar no gráfico da Figura 3 que as amostras armazenadas a baixa

temperatura apresentaram diminuição das atividades respiratórias, com valores em torno de

10 mg.Kg-1

.h-1

até o 10º dia de experimento (DE10), enquanto estavam mantidas a 10°C. Da

mesma forma, como pode ser visto na Figura 2, a produção de etileno foi reduzida durante a

exposição ao frio em comparação ao grupo controle. Após a elevação da temperatura,

observou-se aumento na capacidade respiratória já no primeiro dia a 22°C (DE11), como

também na emissão de etileno, que aumentou por volta do DE12, atingindo valores próximos

às amostras controle. Resultados semelhantes foram relatados em estudo com frutos da

cultivar Golden submetidos à refrigeração a 10°C por 20 dias, com posterior transferência das

amostras para temperatura de 23°C (BRON; JACOMINO, 2009; BRON, 2006), onde os

frutos sob armazenamento refrigerado tiveram suas taxas respiratórias e de produção de

etileno diminuídas nesse período, com restituição da respiração após a elevação da

temperatura. Entretanto, foi visto que o frio prejudicou a capacidade do fruto para recuperar a

produção de etileno, pois foram obtidos valores de emissão do hormônio bem abaixo do

esperado, mesmo quando as amostras passaram para 23°C.

35

Figura 2 - Perfis de produção de etileno para mamão cv. Golden do grupo Frio

(mantidos a 10°C por 10 dias seguido de transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os

frutos do grupo Controle (mantidos a 22°C por 7 dias). Traço vertical pontilhado indica o

último dia de armazenamento refrigerado. Barras verticais indicam o erro padrão da média

(n=5).

Figura 3 - Perfis de respiração para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a

10°C por 10 dias seguido de transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os frutos do

grupo Controle (mantidos a 22°C por 7 dias). Traço vertical pontilhado indica o último dia de

armazenamento refrigerado. Barras verticais indicam o erro padrão da média (n=5).

Tais resultados reforçam ainda mais o fato de que o tempo de exposição dos frutos ao

frio é crucial para que os efeitos das alterações metabólicas causada pelo resfriamento se

-1

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

µL

C2H

4 .K

g-1.h

-1

Dia de experimento

Grupo Controle

Grupo Frio

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

mg

CO

2 .K

g-1.h

-1

Dia de experimento

Grupo Controle

Grupo Frio

36

tornem permanentes, já que no trabalho citado as amostras foram submetidas a 20 dias de

armazenamento refrigerado, diferentemente do protocolo utilizado no presente estudo, em que

os frutos foram armazenados por 10 dias. É importante salientar que, apesar do prejuízo na

produção de etileno, os autores observaram que houve perda de firmeza e mudança de

coloração nos frutos até níveis adequados para o consumo. Os compostos voláteis, contudo,

não foram avaliados. Com isso, considerando que o período de 10 dias de refrigeração foi

suficiente para promover alterações no perfil de componentes do aroma (resultados obtidos

neste trabalho que estão discutidos no item 4.2.2) e sabendo que a síntese de voláteis em

frutos é bastante sensível aos efeitos do frio, é factível pensar que o armazenamento por um

tempo maior também afete esses metabolismos. Esse fato dá mais ênfase à importância de se

estabelecer um protocolo seguro para conservação em baixas temperaturas que preserve o

aroma do fruto, garantindo sua qualidade.

Em geral, os dados obtidos para respiração e produção de etileno estão dentro das

expectativas, uma vez que para o mamão, como fruto tropical, o amadurecimento ocorre

normalmente em temperaturas mais elevadas e a exposição ao frio pode alterar a atividade

ótima das enzimas do fruto, gerando como resposta reações enzimáticas mais lentas e

diminuição dos processos metabólicos.

4.1.2 Firmeza da polpa

Os frutos do grupo Controle apresentaram perda de firmeza a partir do DE3 (Figura

4), coincidente com o aumento da produção de etileno. Para o grupo Frio, o armazenamento

refrigerado retardou a redução da firmeza em comparação às amostras controle e após o DE10

nota-se que esse decréscimo foi mais acelerado, atingindo nos frutos maduros, ao final do

experimento, valores semelhantes ao grupo Controle. Esses dados estão consistentes com

outros trabalhos em frutos da mesma variedade sob exposição ao frio: o retardo no

amaciamento durante o período de refrigeração e a aceleração da perda de firmeza da polpa

após o aumento da temperatura, chegando a valores adequados para o consumo e próximos às

amostras controle (BRON; JACOMINO, 2009; BRON, 2006; JACOMINO et al., 2003).

Contudo, é interessante notar que, apesar da menor velocidade na queda de firmeza, esta

37

ocorreu durante o período de armazenamento a baixa temperatura, mesmo com os baixos

níveis de produção de etileno observados neste grupo. O resultado sugere a presença de um ou

mais componentes etileno-independentes no metabolismo de modificação da parede celular

em mamões.

Figura 4 - Medidas de firmeza para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a

10°C por 10 dias seguido de transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os frutos do

grupo Controle (mantidos a 22°C por 7 dias). Traço vertical pontilhado indica o último dia de

armazenamento refrigerado. Barras verticais indicam o erro padrão da média (n=15)

4.1.3 Cor da casca

Após análise de cor da casca dos frutos (Figura 5), foi observado que as amostras

controle apresentaram mudança da cor verde para amarelo-alaranjado nos frutos maduros,

representada por diminuição no valor do ângulo de matiz. Os frutos do grupo Frio, enquanto

armazenados sob refrigeração, mantiveram a coloração em tom verde-amarelado com valores

em torno de 100. Entretanto, já no DE10, o primeiro dia a 22°C, a mudança de cor foi

acelerada até valores próximos ao controle. Pode-se notar que a perda da cor verde foi um

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Firm

eza

da

po

lpa

(N)

Dia de tratamento

Grupo Controle

Grupo Frio

38

pouco mais discreta para os frutos submetidos ao frio, os quais apresentaram certa

desuniformidade da cor. Tais resultados foram bem semelhantes àqueles obtidos por Bron

(2006), inclusive no que diz respeito à não uniformidade da cor. Diferentemente do observado

para a firmeza, a mudança na cor da casca parece ser um metabolismo com maior

dependência da sinalização do etileno, pois durante todo o período em que o etileno esteve

com produção reduzida nos frutos do grupo Frio, os frutos permaneceram com a coloração

verde na casca. O aumento dos níveis de etileno e as mudanças na coloração foram

concomitantes e começaram logo após a transferência para 22°C.

Figura 5 – Cor da casca para mamão cv. Golden do grupo Frio (mantidos a 10°C por

10 dias seguido de transferência para 22°C por mais 5 dias) e para os frutos do grupo Controle

(mantidos a 22°C por 7 dias). Traço vertical pontilhado indica o último dia de armazenamento

refrigerado. Barras verticais indicam o erro padrão da média (n=15).

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

110.0

120.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Hu

e

Dia de tratamento

Grupo Controle

Grupo Frio

39

4.2 ANÁLISE DO PERFIL DE COMPOSTOS VOLÁTEIS

4.2.1 OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE VOLÁTEIS POR SPME

O método de extração por SPME empregou uma fibra de carboxeno, divinilbenzeno e

polidimetilsiloxano de 100µm de espessura da Supelco®. Esta combina amostragem e pré-

concentração das substâncias voláteis num único processo, além de possibilitar a dessorção

direta no sistema cromatográfico. Entretanto, as condições de liberação e captura dos voláteis

variam para cada de tipo de amostra e, por conta disso, foi necessário otimizar a técnica para o

mamão papaia de modo a torná-la o mais eficiente possível.

Os frutos que serviram de amostras para adequação dessa metodologia foram obtidos

da mesma região dos frutos utilizados nos outros experimentos e todos os testes foram feitos

em triplicata. A coluna e condições cromatográficas utilizadas também foram as mesmas, já

descritas anteriormente na metodologia.

Foram avaliados os seguintes parâmetros: tempo de equilíbrio entre os voláteis no

headspace do vial e a amostra; tempo de exposição da fibra ao headspace; agitação da

amostra durante os períodos de equilíbrio e exposição; aquecimento a 50ºC; adição de solução

saturada de NaCl.

O critério utilizado para avaliação foi a eficiência em capturar os voláteis, baseada na

qualidade dos cromatogramas gerados, considerando o número de picos, maior área e maior

resolução desses picos. Assim, tendo em vista os resultados obtidos, os seguintes parâmetros

foram definidos para as análises posteriores:

1. Tempo de equilíbrio: 30 minutos

2. Tempo de exposição da fibra ao headspace: 30 minutos

3. Agitação da amostra durante os períodos de equilíbrio e exposição

4. Aquecimento a 50ºC

5. Adição de solução saturada de NaCl

40

O fator que mais contribuiu para a emissão dos voláteis foi o aquecimento a 50°C,

aumentando significativamente a área dos picos, principalmente dos compostos majoritários

(Figura 6). Entretanto, optou-se por manter a adição de NaCl, uma vez que o sal, além da

função de saturar a solução e facilitar a liberação dos voláteis para o headspace, contribui

para prevenir a eventual oxidação de compostos da amostra, através da inativação enzimática.

A agitação também foi mantida para homogeneização da polpa com o sal durante o processo.

Figura 6 - Cromatogramas obtidos a partir da análise de voláteis por SPME de mamão

‘Golden’ sob as seguintes condições de captura dos voláteis: tempo de equilíbrio de 30

minutos; tempo de exposição da fibra ao headspace de 30 minutos; agitação da amostra

durante os períodos de equilíbrio e exposição; adição de solução saturada de NaCl. A: Com

aquecimento da amostra a 50 °C. B: Sem aquecimento.

41

Esses resultados possibilitaram a utilização da técnica de extração de voláteis por

SPME para o mamão papaia durante os experimentos com baixa temperatura, bem como em

estudos futuros com o fruto em questão.

4.2.2 Perfil de compostos voláteis

A análise de voláteis por SPME foi feita diariamente para o grupo Controle,

totalizando 7 pontos, sendo possível cobrir todo o amadurecimento dos frutos e, assim,

determinar o perfil de emissão de voláteis. Foram identificados 19 compostos voláteis,

levando em conta os critérios já citados no item 3.6, e todos apresentam características

odoríferas, com as descrições dos odores apresentados na Tabela 2. Todas as substâncias

foram detectadas nos 7 pontos analisados, desde o início até o final do amadurecimento,

variando apenas na concentração.

Nesse experimento, identificou-se apenas um composto como linalool e a limitação da

técnica utilizada na detecção dos compostos não permite distinguir entre os possíveis

isômeros. Assim, optou-se por manter a denominação geral. Do mesmo modo, para os óxidos

detectados,os quais possuem isômeros cis e trans, não foi possível diferenciá-los, sendo

estabelecida a denominação A e B, conforme mostra a Tabela 2.

As amostras do grupo Frio foram analisadas em dois pontos enquanto mantidas a 10°C

(DE1 e DE6) e em 3 pontos após o décimo dia de experimento, quando a temperatura foi

elevada para 22°C (DE11, DE13 e DE15). Os mesmos compostos identificados no grupo

Controle também foram detectados no grupo Frio, com exceção do β-mirceno, butirato de

benzila, δ-octalactona, γ-octalactona e γ-caprolactona. Já os compostos hotrienol e 2-

feniletanol foram detectados apenas nos dias em que estavam sob refrigeração, não sendo

possível detectá-los nos frutos maduros após o aumento da temperatura.

Para avaliação desses resultados e dos efeitos da exposição ao frio sobre os voláteis foi

empregada a Análise de Componentes Principais (PCA) através do Software STATISTICA.

Trata-se de um método estatístico que pode ser aplicado sobre dados multivariados, reduzindo

o número de variáveis e possibilitando a visualização das correlações existentes entre elas. O

42

objetivo principal dessa análise é a obtenção de combinações lineares entre os componentes

principais, as novas variáveis que são geradas a partir do conjunto de dados amostrais, as

quais detêm maior parte da informação contida nas variáveis originais.

Tabela 2: Substâncias detectadas por SPME em mamão cv. Golden dos grupos Frio e

Controle em estádio maduro*. Substâncias detectadas Grupo Frio Grupo Controle Descrição do odor**

Nonanal + + Cítrico

Decanal + + Cítrico, alcoólico

2-etil-1-Hexanol + + Cítrico, fresco, floral

6-metil-5-hepten-2-ona + + Frutal, doce

Linalool +++ ++++ Floral, cítrico, frutal

Linaloolxido piranóide A ++ +++ Floral, cítrico

Linaloolxido piranóide B ++ +++ Floral, cítrico

Linaloolxido furanóide A + ++ Cânfora, mentol

Linaloolxido furanóide B + ++ Cânfora

β-mirceno - + Herbáceo, amadeirado

Hotrienol - + Doce, erva-doce, gengibre

Isotiocianato de benzila ++ + Agrião, herbáceo

Butirato de benzila - + Frutal, doce, fresco

Álcool benzílico + + Doce, floral, frutal

2-Feniletanol - + Floral seco

Fenilacetonitrila + + Floral, frutal

γ-Caprolactona - + Coco/Pera

γ-Octalactona - + Coco/Pera

δ-Octalactona - + Coco/Pera

+ (<10x106 unidades de área), ++ (>10x106 e < 10x107 unidades de área), +++ (> 10x107 e <10x108 unidades de

área), ++++ (>10x108), - (não detectado).

*Cor da casca: 80 graus Hue; Firmeza 30N ;Etileno: 3,5 µL.Kg-1.h-1; Respiração: 25 mg.Kg-1.h-1.

**Fonte: http://www.thegoodscentscompany.com/.

Tratando cada substância identificada como uma variável e utilizando o conjunto de

dados formado pelas áreas obtidas pelos cromatogramas e normalizadas pela média de cada

replicata analisada (normalização interna), foram obtidos os componentes principais. Dentre

as combinações possíveis entre eles, dois componentes foram selecionados, fatores 1 e 2, por

explicarem juntos a maior variabilidade existente entre as amostras, aproximadamente 65%. A

distribuição bidimensional dos dados sobre os fatores está representada graficamente na

Figura 7.

43

Figura 7 - Análise de Componentes Principais obtidos a partir das áreas normalizadas

dos compostos voláteis identificados em mamão ‘Golden’ para os grupos Frio e Controle (F e

C representam os grupos, seguidos dos números que identificam o dia de experimento e a

repetição, respectivamente).

44

A figura 7A representa a disposição das amostras sobre os fatores 1 e 2 a partir das

variáveis originais utilizadas, as substâncias identificadas. Estas foram projetadas no gráfico

na forma de vetores, com a decomposição de cada vetor sobre os fatores na figura 7B. Quanto

maior a decomposição do vetor sobre o eixo (distância em relação ao centro), mais

significativa é a variável para diferenciar as amostras. Os sinais (positivo e negativo) indicam

a que quadrante pertence cada vetor.

O que determinou, portanto, a distribuição das amostras sobre os componentes

principais foram as substâncias voláteis. A interpretação da análise deve ser feita

visualizando-se uma sobreposição dos dois gráficos, onde os vetores das substâncias

localizam-se próximos às amostras as quais elas caracterizam. Por exemplo, os compostos 7,

8, 13, 14, 15 referentes a linalool, hotrienol, 2-feniletanol, β-mirceno e butirato de benzila,

respectivamente, dispostos em Q2 onde apresentam valores positivos, estão presentes nas

amostras localizadas próximo a essa região do gráfico, no caso, a maior parte do grupo

Controle e os pontos F1 e F6 do grupo Frio. Por outro lado, amostras distribuídas exatamente

opostas a esses compostos, como os pontos F11, F13 e F15, não são caracterizadas por essas

substâncias, implicando dizer que esses compostos estão presentes em menores quantidades

ou mesmo ausentes nessas amostras (ver Tabela 2).

Da mesma forma, os compostos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 16 e 18 estão dispostos entre os

quadrantes Q1 e Q4 com valores negativos e esse valor negativo significa que as amostras

próximas a essa região tem a tendência a apresentar essas substâncias em concentrações

menores. Já aquelas do grupo Controle dispostas do lado oposto, pelo contrário, apresentam

tais compostos em maior quantidade.

A interpretação da figura 7A indica que amostras localizadas próximas umas às outras

no gráfico apresentam alta correlação positiva, ou seja, apresentam características

semelhantes entre si, levando em conta os compostos voláteis identificados. O contrário

também é verdadeiro: amostras localizadas em regiões opostas possuem alta correlação

negativa, sendo distintas. Com isso, pode-se observar que as amostras do grupo controle não

tiveram perfis muito diferentes quanto a emissão de voláteis durante os 7 dias de experimento

em que foram monitoradas. As amostras F1 e F6, enquanto estavam sob refrigeração, se

localizaram próximas às amostras do Controle, com as replicatas de F6 já um pouco mais

afastadas do grupo. Os pontos relativos aos frutos que amadureceram após o aumento da

temperatura, F11, F13 e F15, estão localizados em uma região diferente no gráfico. Assim, a

45

disposição das amostras no gráfico da PCA indica que as substâncias detectadas, embora não

correspondam a totalidade de compostos voláteis encontrados nos frutos, foram capazes de

explicar as diferenças entre as amostras dos dois grupos (como evidenciam os círculos na

figura 7A). Frente a isso, pode-se dizer que ao completo amadurecimento dos frutos de ambos

os grupos, o perfil geral de voláteis das amostras controle apresentou-se diferente do perfil

daquelas submetidas à refrigeração. Este resultado aponta que os frutos do grupo Frio tiveram

seu metabolismo afetado pela baixa temperatura, com reflexos irreversíveis sobre a emissão

de voláteis.

Os terpenos identificados foram bastante significativos nessa diferenciação dos dois

grupos, uma vez que eles foram mais bem representados pelo fator 1, o qual explica maior

parte da variabilidade das amostras (44,48%, como mostra a figura 7B) e pelo fato de o

linalool e os óxidos derivados terem sido detectados bem mais abundantes no grupo Controle.

Já o hotrienol e o β-mirceno, compostos terpênicos também, nem sequer foram detectados nos

frutos submetidos ao frio (ver Tabela 2).

Esses resultados mostram que as vias do MEP e do MVA, rotas de biossíntese de

terpenos, de um modo geral foram bastante sensíveis ao frio. Em estudo com ameixas

armazenadas a baixas temperaturas normalmente utilizadas para sua conservação, a síntese de

terpenos também foi afetada pelo frio, com redução da síntese de linalool e dos óxidos

derivados, detectados como compostos majoritários para esse fruto (LOUW; THERON,

2012). A formação dos terpenos em tangerinas também foi modificada pelo armazenamento

refrigerado e tais alterações foram perceptíveis em análise sensorial, diminuindo a aceitação

pelos provadores (TIETEL et al., 2012). Levando em conta estes resultados e os dados obtidos

no presente trabalho, pode-se admitir que a formação de terpenos em frutos é muito afetada

pela exposição ao frio, inclusive a temperaturas não indutoras de injúria.

É importante levar em consideração que a formação desses componentes depende da

disponibilidade no citosol e nos plastídios de substratos como acetil-coA, piruvato e

gliceraldeído-3-fosfato, que são metabólitos primários provenientes das reações de glicólise,

do metabolismo de carboidratos, de ácidos graxos e de aminoácidos (HEMMERLIN et al.,

2012). Nessa perspectiva, é possível que a alteração da atividade respiratória e da homeostase

do fruto causada pelo resfriamento possa ter prejudicado a formação e utilização dos

substratos necessários para a biossíntese de terpenos, ou mesmo ter desviado esses

precursores para outras rotas. O hotrienol e β-mirceno, por exemplo, foram detectados nos

46

frutos armazenados à baixa temperatura apenas nos dias em que estavam a 10°C, não sendo

detectados nos frutos maduros desse grupo após o aumento da temperatura, o que não foi

observado nas amostras controle.

É interessante salientar que os compostos γ-caprolactona, γ-octalactona, δ-octalactona,

representados pelos números 10, 17 e 19, aparecem no Q3 com valores negativos, ou seja,

apresentam maior decomposição sobre o fator 2, o qual detém maior parte da informação

dessas variáveis. Pode-se observar que os pontos C5, C6 e C7, os dias já próximos do

completo amadurecimento, aparecem um pouco mais afastados dos demais e mais próximos

da região de Q3, o que significa que a emissão de lactonas tende a diminuir nos frutos mais

maduros do Controle. Para os frutos armazenados a baixa temperatura, onde essas substâncias

não foram detectadas, as amostras se encontram no gráfico em região diametralmente oposta,

com sinal negativo, o que é indicativo de diminuição mais acentuada do que no grupo

Controle ou mesmo ausência dessas substâncias.

As lactonas em geral possuem aroma frutal, semelhantes a coco e pera, e estão

presentes em diversos frutos fazendo parte do flavor (TOKITOMO et al., 2005; ALMORA et

al., 2004). Assim como foi observado para o mamão neste estudo, a formação dessas lactonas

voláteis também se mostrou muito sensível aos efeitos de baixas temperaturas em

experimentos com pêssegos (ZHANG et al., 2010, 2011; RAFFO et al., 2007). Considerando

que esses componentes são derivados do metabolismo de ácidos graxos (HUSAIN, 2010),

Wan-Peng et al. (2012) sugeriram que o frio influencia a síntese de lactonas em pêssegos por

afetar o perfil de expressão gênica e atividade da acil-coA oxidase, enzima envolvida nas

etapas iniciais das reações de β-oxidação, apontando-a como possível ponto de regulação

dessas vias.

Esse contexto suscita algumas questões interessantes sobre o metabolismo dos ácidos

graxos em frutos. Sabe-se que são importantes componentes de membranas e também

precursores de compostos voláteis (SCHWAB et al., 2008) e as concentrações de ácido

linoleico e linolênico tem sido associadas à produção de ésteres voláteis em pêssegos

(ZHANG et al., 2010). Um estudo de Domínguez et al. (2010) em tomate, mostrou que a

superexpressão de genes que codificam enzimas conversoras de ácido linoleico em linolênico

alterou o perfil de voláteis do fruto e, mais ainda, aumentou sua tolerância ao frio, uma vez

que os frutos modificados tiveram redução nos sintomas de injúria quando armazenados à

baixa temperatura. Embora não se saiba exatamente como isso ocorre, tais resultados apontam

47

que o grau de insaturação das membranas lipídicas está relacionado ao mecanismo de resposta

ao efeito do resfriamento e alterações nesses componentes afetam também a síntese de

voláteis.

No caso do presente estudo, é possível que o frio tenha modificado a fluidez das

membranas celulares do fruto, alterando a disponibilidade dos ácidos graxos como

precursores para as reações iniciais de β-oxidação que levam à formação das lactonas. Existe

também a possibilidade do frio ter afetado a expressão gênica e atividade de enzimas

relacionadas, como acil-CoA oxidades, assim como foi observado em pêssegos no trabalho

citado anteriormente. Rugkong et al. (2011) também observaram em tomates submetidos ao

armazenamento refrigerado que a expressão de genes que codificam LOX, ADH e AAT,

enzimas correlacionadas à essa mesma via biossintética, foi afetada nas amostras tratadas e as

alterações foram associadas a perda de compostos voláteis nos frutos. Esses resultados

sugerem caminhos a serem investigados no mamão em estudos futuros.

Outro composto que apresentou um comportamento interessante foi o 9, isotiocianato

de benzila, que está em Q1 (Figura 7B) com valor positivo, caracterizando as amostras do

grupo Frio, o que está de acordo com os resultados mostrados na tabela 2, em que esse

composto aparece em maior quantidade nos frutos armazenados à baixa temperatura. Rosseto

et al. (2008) observaram que o isotiocianato de benzila é produzido na polpa, casca e

sementes dos frutos de mamão durante o amadurecimento e que essa síntese não parece ser

regulada por etileno, já que após o tratamento com o hormônio e com 1-MCP não houve

mudanças significativas nas concentrações encontradas. Essa substância atua na defesa do

fruto contra patógenos (SEO et al., 1983), porém o resultado obtido sugere que o isotiocianato

de benzila também estaria ligado a respostas a estresses abióticos.

O butirato de benzila e 2-feniletanol, compostos cujas sínteses são derivadas do

metabolismo de fenilalanina (DUDAREVA et al., 2006), não foram detectados nos frutos do

grupo Frio. Este resultado aponta outra rota biossintética afetada pela exposição ao frio a ser

estudada de forma mais detalhada em trabalhos futuros.

48

4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR EM TEMPO REAL

A sequência correspondente ao fragmento amplificado está representada a seguir, na

qual estão indicadas as regiões de ligação dos oligonucleotídeos desenhados (ver Tabela 1).

Esta sequência também corresponde ao que foi obtido como resultado do sequenciamento

(após isolamento, clonagem e análise da sequencia):

5’CGTTGCTTCACCCTTCAAACAATACCATAACAGCAGGATAAATATTGTTGCTAC

GCACCAGATTTCTAAGCCGCCTCTTCAAGTGTTTGCTTATAATAACAAAATGGCCT

CTTCAATACAGATTCCTC 3’

Considerando o contig identificado como possível LIS no mamão papaia (Acesso

GenBank: ABIM01007557), para o qual os primers foram desenhados, tal fragmento

corresponde a região de 1977 a 2104 pares de bases (pb).

A curva de dissociação (melting curve) é um dos parâmetros utilizados para avaliação

da eficiência e especificidade dos primers. A Figura 8 representa graficamente a dissociação

referida e mostra amplificação de apenas um fragmento, devido a presença de apenas um pico

em definido acima do limite mínimo definido para o sinal de amplificação (Threshold):

Figura 8 - Representação das curvas de dissociação referente ao fragmento de LIS. A

imagem foi obtida a partir do software Rotor Gene 6.0 - Corbett.

Obteve-se a quantificação da expressão a nível transcricional do suposto gene que

codifica a enzima linalool sintase em mamão papaia pelo cálculo da expressão relativa

utilizando como parâmetro o dia 0, ou seja, o dia em que frutos chegaram ao laboratório,

49

anterior ao início dos experimentos, adotado como valor de referência para os pontos de

análise (Figura 9).

Figura 9 - Expressão relativa do gene LIS que codifica a suposta enzima linalool

sintase em mamão papaia a partir de reações de PCR em tempo real. Barras verticais indicam

erro padrão da média (n=5).

Com os seis pontos analisados do grupo Controle, foi possível avaliar o padrão da

transcrição de LIS durante o amadurecimento e foi observado que a expressão relativa

aumenta a partir do DE3, chegando a quase o dobro da amostra de referência no DE6.

Também ficou claro que o armazenamento a baixa temperatura afetou a expressão nos frutos,

jáque logo no primeiro dia de experimento foram encontrados valores mais baixos do que o

grupo controle, com os menores valores no DE10, enquanto os frutos ainda estavam a 10°C.

A partir da transferência para 22°C no DE11, os níveis de transcritos encontrados foram

gradativamente maiores, mas mesmo no DE15, com os frutos já entrando no período de

senescência, os valores ainda apareceram menores que nas amostras controle e próximos

àqueles encontrados nos frutos verdes do dia 0.

Os dados obtidos para a expressão gênica se correlacionam com o que foi observado

acerca da emissão de linalool detectado por SPME: os frutos submetidos ao frio tiveram

redução na abundância desse composto em relação às quantidades detectadas nas amostras

controle. Considerando isso, pode-se admitir que alterações nos níveis de transcritos de LIS

afetam também a formação de linalool no mamão, o que indica que possivelmente a regulação

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Dia de experimento

Grupo Controle

Grupo Frio

50

da biossíntese desse monoterpeno ocorre na etapa da transcrição. O fato de o linalool ser

formado diretamente do GPP pela ação da linalool sintase, sem etapas intermediárias, e desse

mesmo precursor ser comum a outras vias metabólicas, reforçam a ideia de que o controle da

reação seja mesmo em torno da LIS.

No fruto koubo, apesar de não ter sido analisada a expressão gênica a nível

transcricional, foi observado aumento da atividade de LIS concomitante com o aumento dos

níveis de linalool ao longo do amadurecimento (SITRIT et al., 2004). Considerando este

resultado e o que foi obtido aqui neste estudo, é provável que com a redução da transcrição de

LIS, haja um decréscimo na síntese do metabólito. O contrário também deve ser verdadeiro.

Há poucos dados sobre expressão gênica de LIS em frutos e menos ainda sob o efeito

de baixas temperaturas, mas um trabalho recente investigou a expressão de genes associados

ao amadurecimento de tomates submetidos a diferentes períodos de armazenamento a 3°C,

temperatura abaixo do limite de tolerância para este fruto (RUGKONG et al. 2011). Através

da técnica de microarray, foi visto que genes relacionados à síntese e sinalização de etileno

tiveram seu padrão de expressão modificado em decorrência da exposição ao frio e tais

alterações influenciaram a sensibilidade ao etileno e os atributos de qualidade do fruto como

cor e firmeza.

Nesse mesmo estudo, foi observada redução da expressão de LeMADS-RIN, gene

pertencente à família multigênica MADS-box que codificam fatores de transcrição

necessários ao amadurecimento (VREBALOV et al., 2002). Os autores apontam tal gene

como fator regulador do amadurecimento e sugerem que a alteração de sua expressão causada

pelo resfriamento pode ter contribuído para a modificação da expressão de outros genes

associados ao amadurecimento.

Em estudo a fim de identificar alvos diretos do fator de transcrição RIN no tomate, foi

observado que ele modula a formação de compostos voláteis derivados da via da lipoxigenase

a partir da regulação de elementos específicos, como os genes TomloxC e ADH2, que

codificam as enzimas lipoxigenase e álcool desidrogenase, respectivamente (QIN et al.,

2012).

Trazendo esse contexto para o mamão, é possível que essa família de genes MADS-

box, que já foram identificados em Carica papaya (MING et al., 2008), também atuem na

regulação da sinalização do etileno e dos eventos relacionados ao amadurecimento, bem como

51

na resposta às baixas temperaturas. No caso do presente estudo, foi observado que os frutos

restabeleceram a atividade respiratória e a produção de etileno após o período no frio, mas o

perfil geral de voláteis e a emissão de linalool foram prejudicados de forma permanente

quando comparados os frutos maduros dos dois grupos. Como a expressão de LIS a partir de

DT11 não aumentou o suficiente para restituir a síntese de linalool nos frutos armazenados à

baixa temperatura é provável que haja outros fatores regulando esse processo e que tenham

sido afetados pelo frio. Pesquisas acerca do provável envolvimento de um homólogo do fator

de transcrição RIN, a exemplo do que foi verificado em tomates, parecem ser promissoras no

sentido de entender melhor a regulação dos mecanismos moleculares que estão na base dos

eventos associados à diminuição da expressão de genes relacionados à biossíntese de

compostos do aroma em frutos submetidos ao armazenamento à baixa temperatura.

Em síntese, a exposição ao frio alterou o perfil de compostos voláteis nos frutos, onde

o linalool, componente majoritário, foi detectado em menor abundância. Este efeito parece ser

decorrente da redução do nível de transcritos de LIS nesses frutos, mas é possível que existam

outros fatores envolvidos na regulação da expressão de tal gene e na resposta ao efeito do

resfriamento. Assim, faz-se necessário investigar os mecanismos moleculares relacionados a

esse processo, como foi citado anteriormente.

De uma forma geral, esse tipo de estudo é fundamental, por exemplo, para

compreensão das propriedades de regulação das vias de formação de compostos secundários,

como as substâncias voláteis, e para detecção de genes alvo para desenvolvimento de plantas

transgênicas e modificação de características de interesse. O gene codificador de LIS tem sido

utilizado em muitos trabalhos com foco na transformação de plantas expressando tal gene e

todos resultaram na biossíntese de linalool ou de seus derivados (LÜCKER et al., 2001;

LAVY et al., 2002; AHARONI et al., 2003; YANG et al., 2008). Em tomates, foram obtidos

frutos transgênicos com superexpressão do gene que codifica a geraniol sintase (GES), uma

enzima responsável pela síntese de geraniol, outro composto monoterpênico e volátil, obtido a

partir do GPP, o mesmo precursor de linalool e outros metabólitos, como os carotenoides.

Houve aumento da concentração de geraniol nos frutos transformados e, após análise

sensorial, eles tiveram maior aceitação entre os provadores (DAVIDOVICH- RIKANATI et

al., 2007). Entretanto, houve redução na quantidade de licopeno e fitoeno nesses frutos e os

autores apontam que a superexpressão de GES pode ter desviado uma maior quantidade de

GPP para a síntese de geraniol em detrimento do licopeno, uma vez que ambos são

sintetizados a partir do mesmo precursor. Em outro estudo semelhante em que tomates foram

52

transformados com gene de LIS de flores de Clarkia breweri sob o controle do promotor

fruto-específico E8 (LEWINSOHN et al., 2001) foram obtidas concentrações menores de

linalool nos frutos, quando comparadas às de geraniol (citadas no trabalho anterior), e essas

alterações não foram perceptíveis durante análise sensorial, bem como as quantidades de

licopeno não foram afetadas.

Frente a esses resultados, percebe-se que a transformação de plantas visando

potencializar a formação de linalool ainda requer maior conhecimento sobre a complexa rede

de genes envolvidos no metabolismo do fruto para que se obtenham resultados satisfatórios e

seguros. A identificação de genes reguladores da biossíntese de compostos voláteis e dos

eventos metabólicos relacionados pode proporcionar intervenções genéticas pontuais que

modifiquem as características de interesse e que sejam viáveis do ponto de vista biológico e

horticultural.

Além disso, o entendimento sobre a regulação do metabolismo do fruto pode

direcionar o desenvolvimento de protocolos de conservação pós-colheita que permitam

usufruir dos benefícios da refrigeração, retardando o amadurecimento, mas preservando os

atributos de qualidade. Para citar um exemplo, o uso da cadeia de frio combinado com a

aplicação de etileno pode ser uma possibilidade interessante no sentido de conhecer como o

hormônio pode atuar em conjunto com o uso de baixas temperaturas e em que momento a

exposição ao etileno pode interferir de forma positiva sobre o metabolismo do fruto. Em

trabalho recente utilizando etileno exógeno durante o armazenamento refrigerado de kiwi foi

observado que o hormônio influenciou a perda de firmeza e mudança de coloração, com

impacto sobre a qualidade dos frutos (PRANAMORNKITH et al., 2012). Mais ainda,

consideráveis estudos têm sido conduzidos a fim de desenvolver tecnologias capazes de

promover tolerância de frutos ao frio, como a exposição a temperaturas moderadas ou

elevadas por determinado período de tempo antes da refrigeração, ou mesmo de associar o uso

do frio à aplicação de reguladores vegetais como o ácido jasmônico, o ácido salicílico ou 1-

MCP. Os resultados ainda são pouco conclusivos, porém tais linhas de pesquisa são bastante

promissoras e podem ser auxiliadas por trabalhos com abordagem molecular relacionada à

bioquímica dos eventos que ocorrem no amadurecimento.

53

5 CONCLUSÕES

Embora a cadeia de frio seja largamente utilizada para conservação e retardo do

amadurecimento do mamão papaia, os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as

temperaturas consideradas seguras para o armazenamento refrigerado, nas quais não há

desenvolvimento de injúria pelo frio, afetam o perfil geral de compostos voláteis do fruto.

O linalool, segundo a PCA, foi bastante significativo na diferenciação do perfil de

voláteis dos frutos submetidos ao frio em relação às amostras controle, nos quais tal composto

foi detectado em menor abundância. É possível que esse efeito seja decorrente da redução do

nível de transcritos de LIS, mas parecem existir outros fatores que participam da regulação de

sua expressão gênica e das respostas ao efeito das baixas temperaturas.

Como perspectivas futuras deste estudo, pretende-se avaliar o envolvimento do fator

de transcrição RIN, assim como outros fatores de transcrição da família MADS-box, na

regulação dos mecanismos moleculares associados à diminuição da expressão de genes

relacionados à biossíntese de compostos do aroma do mamão, como linalool e outros

componentes derivados de outras vias metabólicas, em frutos submetidos ao armazenamento à

baixa temperatura.

54

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