UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA REGINA YANAKO MORIYA Uso de xilanases e lacases de microrganismos no branqueamento de polpas organosolv de palha de cana-de-açúcar e estudo dos derivados celulósicos obtidos Lorena –SP 2007
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
REGINA YANAKO MORIYA
Uso de xilanases e lacases de microrganismos no branqueamento de polpas organosolv
de palha de cana-de-açúcar e estudo dos derivados celulósicos obtidos
Lorena –SP
2007
REGINA YANAKO MORIYA
Uso de xilanases e lacases de microrganismos no branqueamento de polpas organosolv
de palha de cana-de-açúcar e estudo dos derivados celulósicos obtidos
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial.
Área de Concentração: Conversão de biomassa Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves
Lorena - SP
2007
Este trabalho eu dedico a:
Minha família mãe Satiko, pai João, minha filha Kamila e irmãos Francisco e Roberto e irmã
Edilene pelo carinho e compreensão e apoio em todos os momentos de minha vida.
Ao Jânio pela presença e apoio para alcançar este objetivo.
AGRADECIMENTOS
À Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP), em especial ao Departamento de
Biotecnologia pela oportunidade do curso de doutorado.
Ao Prof. Dr. Adilson Roberto Gonçalves, pela orientação e apoio ao longo de todo o trabalho,
inclusive pelos ensinamentos na área prática, acadêmica e de pesquisa.
A todos os professores, em especial ao Prof. Dr. George Jackson de Morais Rocha, que me
auxiliaram durante esse trabalho.
Às professoras Profª Drª. Adriane Maria Ferreira Milagres, Profª Drª Maria Bernadete de
Medeiros, Profª Drª Fabrícia de Faria e Profª Drª Marta Cristina Duarte pelo gentil
fornecimento de enzimas, sem as quais não seria possível fazer este trabalho.
A todos os funcionários da Escola de Engenharia de Lorena, em especial aos funcionários do
Departamento de Biotecnologia José Carlos Tavares, Jussara, José Moreira e Cibele.
À Novozymes pela gentil doação de enzima.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de
doutorado concedida.
RESUMO
MORIYA, R.Y. Uso de xilanases e lacases de microrganismos no branqueamento de polpas organosolv de palha de cana-de-açúcar e estudo dos derivados celulósicos obtidos. 2007. 141 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007. O objetivo deste trabalho foi estudar o branqueamento enzimático e químico de polpas organosolv de palha de cana-de-açúcar e obter a carboximetilcelulose de polpa de palha branqueada por uma seqüência de branqueamento livre de cloro. A palha de cana apresentou a composição química de 36% de glucana, 28% de pentosana, 26% de lignina total e 2% de cinzas. Foram feitos estudos de otimização das polpações acetosolv e etanol-água da palha. A polpação acetosolv foi feita na temperatura de refluxo do solvente ácido acético 93% (v/v) com 0,4% de HCl (relação massa polpa) como catalisador. As melhores condições para a polpação acetosolv da palha foram: relação palha/solvente 1/30 (m/v) e tempo de polpação de 3 h, com rendimento de 49%. A polpa acetosolv de palha apresentou a composição química de 50% de glucana, 16%
de polioses, 26% de lignina total e 5% de cinzas com viscosidade 5,5 cP e número kappa 58. Os estudos de otimização da polpação etanol-água da palha foram feitos em reator de 200 mL utilizando a relação palha/solvente 1:10 (m/v) e mistura solvente etanol:água 1:1 (v/v). Foi feita uma ampliação de escala para a polpação etanol-água da palha em reator de 40 L com rendimento da polpação de 36%. A polpa apresentou 55% de glucana, 3% de polioses, 25% de lignina total e 3,6% de cinzas com viscosidade 3 cP e número kappa 61. Uma outra polpação etanol-água foi feita na temperatura de 160ºC com rendimento de polpação de 39%. A polpa foi classificada com rendimento de 87%. A polpa apresentou a composição química de 52% de glucana, 10% de polioses, 26% de lignina total e 2% de cinzas, com viscosidade de 14 cP e número kappa 53. As polpas foram submetidas ao biobranqueamento com xilanase de três origens microbiológicas: fungo Thermoascus aurantiacus, bactéria Bacillus pumilus e fungo termofílico recombinante Humicola grisea var.thermoidea produzida por levedura Pichia pastoris. Em polpas acetosolv, o uso de xilanase de Bacillus pumilus proporcionou melhora na viscosidade e a xilanase de Thermoascus aurantiacus proporcionou redução do número kappa. Na polpa etanol-água (3% de polioses e viscosidade 3 cP) o uso de xilanase foi ineficaz, no entanto na polpa etanol-água (10% de polioses e viscosidade 14 cP) o uso de 1 unidade de xilanase de Bacillus pumilus se mostrou adequado no biobranqueamento da polpa. Foi utilizada a lacase comercial e foram avaliados os mediadores 1-hidroxibenzotriazol (HBT) e o ácido violúrico (AV) em polpas etanol-água, sendo que o ácido violúrico foi mais eficiente do que o HBT na deslignificação da polpa. A polpa etanol-água foi branqueada de acordo com uma seqüência de branqueamento totalmente livre de cloro juntamente com enzimas. O uso de xilanase melhorou a propriedade de alvura e o sistema lacase-mediador deslignificou a polpa. O efeito combinado dos dois sistemas enzimáticos permitiu branquear a polpa etanol-água de palha e obter a carboximetilcelulose.
Palavras-chave: Palha de cana. Polpação organosolv. Xilanases. Lacases. Branqueamento. Carboximetilcelulose
ABSTRACT
MORIYA, R.Y. Use of microbial xylanases and laccases in the bleaching of organosolv pulps from sugacane straw and study of the cellulosic derivatives obtained. 2007. 141 f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007. The objective of this work was to study the enzymatic and chemical bleaching of organosolv pulps of straw and to obtain carboxymethylcellulose, using totally chlorine-free sequence. Sugarcane straw presented the chemical composition 36% glucan, 28% pentosan, 26% total lignin and 2% ashes. The acetosolv pulping was carried out reflux temperature of acetic acid solvent mixture 93% (v/v) with 0.4% (w/w) HCl as catalyst. The best conditions for the acetosolv pulping of the straw were: relation straw/solvent ratio 1/30 (w/v) and 3 h pulping, with 49% pulp yield. The acetosolv straw pulp presented the chemical composition 50% glucan, 16% pentosan, 26% total lignina and 5% ashes and with viscosity 5.5 cP and number kappa 58. The studies of optimization of the ethanol-water pulping had been made in 200-mL reactor using the 1:10 (m/v) ratio straw/solvent and solvent mixture ethanol/water 1:1 (v/v).The scale-up of ethanol-water pulping of the straw was carried out in 40-L reactor and the yield pulping was 36%. The reproduction of the results that were obtained in 200-mL reactor did not occurred, having great degradation of pentosan of the straw leading to pulps with 55% glucan, 3% pentosan, 25% total lignin and 3.6% ashes, viscosity 3 cP and kappa number 61. Another ethanol-water pulping reaction was performed at 160ºC with 39% yield pulping. The pulp was classified with 87% yield. The pulp presented the chemical composition 52% glucan, 10% pentosan, 26% total lignin and 2% ashes with viscosity 14 cP and kappa number 53. The pulp was submitted to the xylanase biobleaching coming from three microbiological origins: fungal xylanase from Thermoascus aurantiacus, thermophylic bacterial Bacillus pumilus and fungal recombinant Humicola grisea var. thermoidea produced by Pichia pastoris yeast. In acetosolv pulps, the use of xylanase from Bacillus pumilus provided improvement in viscosity and xylanase from Thermoascus aurantiacus provided the reduction of the kappa number. In the ethanol/water pulp (3% pentosan and viscosity 3 cP) the use of xylanase was inefficient, however in the ethanol-water pulp (10% pentosan and viscosity 14 cP) the use of 1 unit of xylanase of Bacillus pumilus showed adequate in the biobleaching of the pulp. The ethanol-water pulp was submitted to the bleaching with the laccase-mediator system. Commercial laccase was used and it had been evaluated the mediators 1-hidroxybenzotriazole (HBT) and the violuric acid (VA). VA was more efficient than HBT to delignify the pulp. The use of xylanase improved the brightness property and the laccase-mediator delignificated the pulp, the use of two enzymatic system allowed to bleach the ethanol/water straw pulp and to get carboxymethylcellulose. Keywords: Sugarcane straw. Organosolv pulping. Xylanases. Laccases. Pulp bleaching. Carboxymethylcellulose.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AMA Ácido Monocloro Acético ASTM American Standart Test Methods ATR Reflexão Atenuada (Atenuated Reflexion Technique) AV Ácido Violúrico CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CMC Carboximetilcelulose DNS Ácido 3,5 Dinitrossalicílico ECF Livre de Cloro Elementar (Elemental Chlorine Free) FTIR Infravermelho com Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared) GS Grau de Substituição HBT 1-hidroxibenzotriazol (1-Hydroxybenzotriazole) MEV Microscopia Eletrônica de Varredura LMS Sistema Lacase Mediador (Laccase Mediator System) PCA Análise por Componentes Principais (Principal Component Analysis) TAPPI Tecnical Association of Pulp and Paper Industry TCF Totalmente Livre de Cloro (Totally Chlorine Free) X Xilanase XE Xilanase seguida de Extração Alcalina
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Simbologia das etapas de branqueamento..............................................................35
Tabela 6.1. Composição química de palhas de cana, trigo e arroz ..........................................59
Tabela 6.2. Resultados de rendimento de polpação, viscosidade, número kappa e composição química de polpas acetosolv de palha de cana .........................................................................62
Tabela 6.3. Perda de componentes na polpação acetosolv ......................................................62
Tabela 6.4. Valores de tempo e temperatura e matriz do planejamento fatorial ..................... 63
Tabela 6.5. Resultados de rendimento de polpação, viscosidade, número kappa e composição química de polpas etanol-água obtidas no segundo planejamento fatorial ..............................64
Tabela 6.6. Composição química de palha de cana e polpa acetosolv 82
Tabela 6.7. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de H. grisea ....82
Tabela 6.8. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus ..82
Tabela 6.9. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T.aurantiacus .82
Table 6.10. Perda de componente etapa polpa-tratamento xilanolítico ...................................83
Tabela 6.11. Perda de componentes etapa polpa branqueada com xilanase-branqueamento químico 83
Tabela 6.12. Rendimento dos tratamentos enzimáticos de polpas acetosolv 87
Tabela 6.13. Rendimento global do processo de transformação de palha em polpa acetosolv branqueada 87
Tablea 6.14. Resulatados de composição química de polpas etanol-água (1) tratadas com xilanase de B. pumilus 89
Tabela 6.15. Resultados de viscosidade, número kappa e lignina total de polpas etanol-água (1) tratadas com lacase de P. ostreatus ou lacase comercial e mediador HBTou AV 94
Tabela 6.16. Resultados de número kappa de polpas branqueadas com o sistema a lacase mediador 97
Tabela 6.17. Planejamento fatorial completo 23 para a otimização das condições de branqueamento de polpas etanol-água de palha 102
Tabela 6.18. Resultados de número kappa de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador/HBT por 4 h de reação 102
Tabela 6.19. Resultados de número kappa e lignina total de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase-mediador/HBT 103
Tabela 6.20. Valores obtidos e valores preditos pelo modelo matemático do planejamento fatorial da otimização do sistema lacase mediador/HBT de polpas etanol-água (2) 106
Tabela 6.21. ANOVA para o número kappa (LE) de polpas tratadas com sistema lacase mediador(HBT) por 1 h de reação 107
Tabela 6.22. Resultados de número kappa e lignina total de polpas etanol-água tratadas com o sistema lacase-mediador/AV 111
Tabela 6.23. ANOVA para o número kappa (LE) de polpas tratadas com sistema lacase mediador/AV) por 1 h de reação 113
Tabela 6.24. Valores obtidos e valores preditos pelo modelo matemático para polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase-mediador/AV 113
Tabela 6.25 Bandas de oscilações características na região do infravermelho para a celulose (SILVERSTEIN e BASSLER, 1974) 121
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Hipóteses propostas para a ação da xilanase como auxiliar no branqueamento de polpas químicas: (A) cromóforos derivados de xilana; (B) complexo lignina-carboidrato; (C) xilana redepositada e (D) inchamento das fibras, em que (L= lignina, X= xilana) (WONG et al., 1997b) 27
Figura 2.2. Mecanismo de oxidação realizado pela lacase e subseqüentes reações não enzimáticas 31
Figura 2.3. Possíveis reações de oxidação da lignina pela lacase (ARCHIBALD et al., 1997) 32
Figura 2.4. O papel do mediador na atividade da lacase 32
Figura 2.5. Reação de despolimerização de lignina 36
Figura 2.6 Reações de degradação oxidativa de sistemas aromáticos 36
Figura 2.7. Formação de novas estruturas cromóforas 37
Figura 4.1. Representação esquemática do processo de branqueamento de polpas organosolv e obtenção de carboximetilcelulose. 43
Figura 4.2. Estruturas dos mediadores 1-hidroxubenzotriazol (HBT) e do ácido violúrico (VA) 46
Figura 6.1. Micrografia eletrônica de varredura (A) palha in natura (ampliação de 100x), (B) palha in natura (ampliação de 500 x) e (C) palha in natura (ampliação de 10.000 x). 59
Figura 6.2. Micrografia eletrônica de varredura (A) polpa etanol-água (2) não classificada (ampliação de 100 x), (B) polpa etanol-água (2) não classificada (ampliação de 500 vezes) 67
Figura 6.3. Micrografia eletrônica de varredura do rejeito grosso da classificação da polpa etanol-água (2) (a) ampliação de 100 vezes e (b) ampliação de 500 vezes 67
Figura 6.4. Micrografia eletrônica de varredura (A) polpa etanol-água (2) classificada, (ampliação de 1000 x), (B) polpa etanol-água (2) classificada (ampliação de 2000 x) e (C) polpa etanol-água (2) classificada (ampliação de 10.000 x) 67
Figura 6.5. (A) viscosidade e (B) Número kappa de polpas acetosolv de palha tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina 68
Figura 6.6. Seletividade (relação viscosidade/número kappa) de polpas acetosolv de palha tratadas com diferentes cargas enzimáticas e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina 69 Figura 6.7. Açúcares redutores liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv com xilanase de H. grisea 70
Figura 6.8. Espectros de UV de materiais coloridos (cromóforos) liberados durante o tratamento enzimático (A) tratamento de polpas acetosov somente com diversas cargas de xilanase e (B) tratamento de polpas com xilanase seguida de extração alcalina 71
Figura 6.9. Espectros de infravermelho de polpas acetosolv tratadas com xilanase de Humicola grisea 72
Figura 6.10. Correlação entre os scores PC 1x PC2 dos espectros FTIR de polpas acetosolv tratadas (A) tratadas com xilanase de Humicola griseae e (B) tratadas com xilanase seguida de extração alcalina 72
Figura 6.11. Loading obtido dos espectros de FTIR de polpas acetosolv de palha de cana tratadas com xilanase Humicola grisea 73
Figura 6.12. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas de xilanase de B. pumilus 74
Figura 6.13. Seletividade de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus 75
Figura 6.14. Açúcares redutores liberados no filtrado dos tratamentos de polpas acetosolv tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina (xilanase de B. pumilus) 75
Figura 6.15. Cromóforos liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus (X) e xilanase seguida de extração alcalina (B) 76
Figura 6.16. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus 77
Figura 6.17. Seletividade (relação viscosidade e número kappa) de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus 78
Figura 6.18. Açúcares redutores liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv com xilanase de T. aurantiacus 79 Figura 6.19. Cromóforos liberados no filtrado de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus (A) xilanase e (B) xilanase seguida de extração alcalina 79
Figura 6.20. Viscosidade de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas enzimáticas e com diferentes xilanases de diferentes origens microbiológicas 80 Figura 6.21. Número kappa de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas enzimáticas e com diferentes xilanases de diferentes origens microbiológicas 81
Figura 6.22. Perda de componentes (A) glucana, (B) xilana e (C) lignina total no processo total: da polpação da palha a polpa biobranqueada com xilanase e com extração alcalina 84
Figura 6.23. (A) seletividade (relação perda de glucana/perda de lignina) e (B) seletividade (relação perda de xilana/perda de lignina) de polpas acetosolv tratadas com diferentes xilanases 86
Figura 6.24. Viscosidade e número kappa de polpas etanol-água 1 de palha de cana tratadas com diferentes cargas de xilanase de B. pumilu s (X) e polpas tratadas com xilanase de Bacillus pumilus seguidas de extração alcalina 90
Figura 6.25. Espectros de infravermelho de polpas etanol-água (1) tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina 91
Figura 6.26. Correlação entre os scores PC 1x PC2 dos espectros FTIR de polpas etanol-água tratadas com xilanase de Bacillus pumilus 92
Figura 6.27. Loading obtido dos espectros de FTIR de polpas etanol-água de palha de cana tratadas com xilanase Bacillus pumilus 92
Figura 6.28. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpa etanol-água (2) tratadas com xilanase de B. pumilus 95
Figura 6.29. Açúcares redutores liberados nos filtrados dos tratamentos de polpas etanol-água (2) com xilanase de B. pumilus 96
Figura 6.30. Cromóforos liberados no filtrado de polpas etanol-água (2) tratadas com xilanase de B. pumilus (A) xilanase e (B) xilanase seguida de extração alcalina 97
Figura 6.31. Mecanismo de transferência de elétron (TE) (FABBRINI et al., 2002) 98
Figura 6.32. Ciclo voltamétrico do ácido violúrico 99
Figura 6.33. Ciclo voltamétrico do ABTS 99
Figura 6.34. Mecanismo radicalar com transferência de hidrogênio atômico de uma estrutura da lignina 100
Figura 6.35. Formação do radical aminoxil em mediador que possuem >N-OH 101
Figura 6.36. Acompahamento do biobranqueamento de polpas etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/HBT 105
Figura 6.37. Diagrama de pareto com os valores dos efeitos de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador (HBT) por 1 h de reação 107
Figura 6.38. Gráfico dos valores preditos versus resíduos para o tratamento lacase mediador/HBT de polpas etanol-água (2) 108
Figura 6.39. Superfície de resposta e contorno em função da quantidade de lacase, mediador e consistência para o número kappa (LE) de polpas etanol-água (2) 109
Figura 6.40. Acompanhamento do biobranqueamento de polpas etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV 112
Figura 6.41. Diagrama de pareto com os valores dos efeitos de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador (AV) por 1 h de reação 114
Figura 6.42. Gráfico dos valores preditos versus resíduos para o tratamento lacase mediador/AV de polpas etanol-água (2) 114
Figura 6.43. Superfície de resposta e curvas de contorno para o sistema lacase mediador/AV de polpas etanol-água (2) 115
Figura 6.44. Espectros de UV dos filtrados de tratamento de polpa etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV : 80 UI/g de lacase, 2,25% de Av e 6% de consistência 116
Figura 6.45. Espectros de UV dos filtrados de tratamento de polpa etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV : 80 UI/g de lacase, 0,5% de Av e 6% de consistência 117
Figura 6.46. Alvura de polpas etanol-água (2) branqueadas com uma seqüência de branqueamento enzimático e com reagentes de branqueamento livre de cloro 120
Figura 6.47. Número kappa de polpas etanol-água branqueadas com uma seqüência de branqueamento enzimático e com reagentes de branqueamento livre de cloro 120
Figura 6.48. Espectros de infravermelho de carboximetilcelulose de palha de cana branqueada, da polpa de palha branqueada 133 Figura 6.49. Espectro de infravermelho de duas carboximetilceluloses comerciais 134
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18
2.1. Palha de Cana-de-Açúcar 18
2.2. Processos de Polpação 21
2.3. Polpa de Dissolução 23
2.4. Branqueamento Enzimático de Polpas 24
2.4.1. Biobranqueamento de Polpas com Xilanases 24
2.4.2. Biobranqueamento de Polpas com Lacase 29
2.5. Branqueamento Químico de Polpas 33
2.6. Derivados de Celulose 38
3. OBJETIVOS 42
4. MATERIAIL E MÉTODOS 43
4. 1. Otimização dos processos de polpação organosolv 44
4. 1. 1. Polpação acetosolv da palha de cana-de-açúcar 44
4. 1. 2. Polpação etanol-água da palha de cana-de-açúcar 44
4. 2. Determinação de atividade enzimática 45
4. 2. 1. Atividade de xilanase 45
4. 2. 2. Atividade de lacase 45
4. 3. Estudo da branqueabilidade das polpas organosolv 45
4.3. 1. Biobranqueamento com xilanases 45
4. 3. 2. Biobranqueamento com lacase 46
4. 3.3. Análise da ação enzimática através do balanço de massa 47
4. 4. Branqueamento químico 49
4. 4.1. Estágio com peróxido de hidrogênio 49
4. 4. 2. Estágio com hidróxido de sódio 50
4. 5. Obtenção de derivado de celulose 50
5. ANÁLISE DOS RESULTADOS 52
5. 1. Determinação do rendimento de polpação 52
5. 2. Viscosidade 52
5. 3. Número kappa 53
5. 4. Alvura 54
5. 5. Hidrólise ácida da polpa 55
5. 5. 1 .Determinação de carboidratos e ácidos orgânicos por CLA 56
5. 5.2. Determinação de lignina insolúvel (lignina Klason) 56
5. 5. 3. Determinação do teor de cinzas (lignina Klason) 56
5. 5. 4. Determinação da lignina solúvel 57
5. 5. 5. Determinação de furfural e hidroximetilfurfural 57
5. 6. Espectros no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) 57
5. 7. Análise por componentes principais (PCA) dos espectros FTIR 58
5. 8. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 58
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 59
6. 1. Polpação acetosolv da palha de cana 60
6. 2. Polpação etanol-água da palha 62
6 .3. Tratamento enzimático da polpa acetosolv 66
6. 3. 1. Xilanase de Humicola grisea 66
6. 3. 2. Xilanase de Bacillus pumilus 73
6.3.3.Xilanase de Thermoascus aurantiacus 76
6. 3. 4. Estudo comparativo do uso das xilanases nas polpas acetosolv de palha 80
6. 3. 4. 1. Análise de perdas de componentes das polpas acetosolv tratadas com três
xilanases de origens microbiológicas diferentes 81
6. 4. Sistema lacase mediador (LMS) 87
6. 5. Tratamento enzimático das polpas etanol-água (1) 88
6. 6. Polpas etanol-água (2) branqueadas com xilanase de Bacillus pumilus 94
6. 7. Otimização das condições de biobranqueamento das polpas etanol-água (2)
com o sistema lacase comercial/HBT 101
6 .8. Otimização das condições de biobranqueamento de polpas etanol-água (2) tratados
com lacase comercial e mediador ácido violúrico 110
6. 9. Seqüência de branqueamento de polpas etanol-água (2) de palha 118
6. 10. Obtenção de Carboximetilcelulose de polpa etanol-água de palha branqueada
com seqüência livre de cloro 131
7. CONCLUSÕES 125
RECOMENDAÇÕES FUTURAS 126
REFERÊNCIAS 127
1.INTRODUÇÃO
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar. A cana é plantada para a
obtenção de açúcar e de álcool. O potencial de produção de resíduos da cana-de-açúcar
(matéria seca) representa em média 14% da massa de colmos. Dessa forma, para cada
tonelada de cana (colmos) produzida têm-se a produção de 140 kg de bagaço e igual
quantidade de palha de cana.
O desenvolvimento de um processo eficiente e economicamente viável, com o intuito
de converter biomassa (palha de cana) de baixo valor agregado em produtos de alto valor
comercial, pode proporcionar substanciais benefícios econômicos, ambientais e sociais. A
transformação da biomassa requer processos de pré-tratamento e conseqüente separação dos
constituintes da biomassa. Os processos ideais de tratamento da biomassa devem não somente
romper a estrutura celular da planta, mas também utilizar produtos químicos baratos, requerer
equipamentos simples e não causar impacto ambiental negativo.
Na cultura da cana-de-açúcar é comum a prática da queimada dos campos de cultivo,
eliminando a palha e facilitando a colheita manual da cana, porém essa prática da queimada
dos canaviais que antecede a colheita da cana causa sérios problemas ambientais e danos à
saúde da população das cidades produtoras de cana. No Estado de São Paulo existe lei que
proíbe a prática das queimadas e assim há grande quantidade desse resíduo agrícola.
Para o uso integral e racional da biomassa lignocelulósica é necessário fazer a
separação de seus constituintes macromoleculares: celulose, poliose e lignina. O processo de
polpação organosolv é um processo alternativo aos processos tradicionais kraft e sulfito e que
permite o aproveitamento integral da biomassa produzindo menos danos ao meio ambiente,
além da polpa obtida ser mais facilmente branqueada (remoção de cromóforos e lignina).
As xilanases são enzimas hidrolíticas e que catalisam a reação de degradação das
xilanas. As xilanases podem ser produzidas por fungos ou bactérias. Para a aplicação na
indústria de polpa e papel são interessantes xilanases termoestáveis e alcalofílicas e que sejam
livres de celulase para não degradarem a celulose da polpa. A enzima xilanase produz
modificações superficiais na fibra de celulose, proporcionando a melhor remoção de lignina
residual presente na polpa. Essa ação xilanolítica proporciona a redução do consumo de
reagentes de branqueamento.
As lacases são enzimas oxidativas que catalisam reações de polimerização e
despolimeração da lignina, são capazes de oxidar uma variedade de compostos fenólicos e
substâncias inorgânicas presentes em efluentes industriais.
Estudos de pré-branqueamento de polpas com as enzimas xilanase e lacase obtidas de
diferentes microrganismos têm sido feitos juntamente com o uso de agentes químicos de
branqueamento livres de cloro, nos quais são utilizados derivados de oxigênio, peróxido de
hidrogênio e extração alcalina com hidróxido de sódio. O tratamento enzimático das polpas
permite a redução da quantidade desses reagentes de branqueamento para obter polpa com
mesma alvura ou ainda proporcionam melhoras nas propriedades da polpa.
A polpa branqueada pode ser usada para a fabricação de diversos derivados de
celulose, como por exemplo, acetato de celulose, raion, carboximetilcelulose, etc. A
carboximetilcelulose é o derivado de celulose de maior valor econômico, por possuir vasta
aplicação em indústria alimentícia, farmacêutica, etc.
No presente trabalho, através de processsos tecnológicos e biotecnológicos, foi
possível transformar a biomassa (palha de cana), resíduo agrícola sem valor econômico, em
carboximetilcelulose (derivado de celulose) com alto valor agregado.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Palha de Cana-de-Açúcar
A cana-de-açúcar é uma gramínea pertencente ao gênero Saccharum, originária da
Índia e foi introduzida no Brasil logo após seu descobrimento. A cana-de-açúcar cresce na
maioria dos países tropicais e subtropicais e é usada principalmente para a obtenção de açúcar
e álcool. Na safra de 2006/07 a produção de cana foi de 476 milhões de toneladas (AGROL
NOTÍCIAS, 2007), sendo que a região Centro-Sul é responsável por 87% da produção
nacional. São Paulo é o maior produtor, cabendo ao estado 60% da colheita nacional e ao
Norte e Nordeste contribuindo com 13% da produção total. Dos 476 milhões de toneladas de
cana produzidos, 423 milhões de toneladas serão destinados à indústria sucro-alcooleira,
sendo 237 milhões de toneladas para produção de açúcar. A industrialização total de álcool
(hidratado, anidro e neutro) vai consumir 186 milhões de toneladas de cana, gerando 18
bilhões de litros de álccol e o restante da produção de cana (46 milhões de toneladas) será
destinado a outros fins, como cachaça, rapadura, ração animal e replantio (O GLOBO, 2006).
O potencial de produção de resíduos da cana-de-açúcar (matéria seca) representa em
média 14% da massa da cana. Dessa forma, para cada tonelada de cana (colmos) produzida
têm-se 140 kg de resíduo seco (CENBIO, 2003), assim o Brasil está produzindo por safra
anual mais de 60 milhões de toneladas de palha de cana.
Para fazer-se a colheita da cana nos campos de cultivo, faz-se o uso da queima da
palha, prática prejudicial à saúde e ao meio ambiente. Dados da Cetesb de Araraquara,
comprovam que, em 1998, a queima da palha da cana-de-açucar produziu quatro vezes mais
fuligem do que o emitido pelos veículos da Região Metropolitana de São Paulo naquele ano.
Estima-se que no ano de 2004 foram jogadas na atmosfera cerca de 55 mil toneladas de
material particulado, em que 94% corresponde a partículas finas e ultrafinas, capazes de
provocar problemas pulmonares, como inflamações no sistema respiratório, crises de asma e
efisema pulmonar (MORAIS, 2004).
Mais de 70 produtos químicos já foram identificados na fumaça resultante das
queimadas, sendo que muitos desses produtos são tóxicos ou têm ação cancerígena. De modo
geral, os componentes básicos da poluição atmosférica resultante das queimadas são
constituídos de material particulado (MP). Mais de 90% da massa de partículas encontradas
na fumaça produzida pela queima de produtos vegetais, como é o caso das queimadas nos
canaviais e das queimadas urbanas, consiste de partículas finas, justamente a fração de MP
que maior prejuízo traz à saúde. Essas partículas medem menos do que 10 micrômetros, são
invisíveis a olho nu, e podem ser levadas para dentro dos pulmões através do ar inalado na
respiração. As partículas maiores não chegam a penetrar profundamente no aparelho
respiratório, pois ficam retidas nas narinas e nas vias aéreas superiores, mas nem por isso
deixam de ser prejudiciais. As partículas maiores, visíveis a olho nu, representam o
“carvãozinho” que se deposita no chão e nos objetos quando ocorrem queimadas. As
partículas descritas acima contêm, além do elemento carbono (principal constituinte do
carvão), um número muito elevado de substâncias químicas, que formam o grupo de Material
Orgânico Particulado (MOP). A combustão de matéria orgânica, como nas queimadas, é uma
das principais fontes do MOP encontrado na atmosfera. Entre as substâncias presentes no
MOP há os compostos conhecidos pelo nome de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
(HPAs), muitos deles com propriedades carcinogênicas, como é o caso do benzopireno,
benzofluoranteno, benzoantraceno e benzofenantreno. A queima produz também SO2,
responsável pela chuva ácida, e ozônio que, em baixas altitudes, causa problemas
respiratórios (MORAIS, 2004).
Um aumento médio de 10 mg/m3 de fuligem na atmosfera, provoca um acréscimo de
9% na procura pelas inalações nos hospitais de Araraquara, mostrando que a queima desse
tipo específico de biomassa (cana-de-açúcar) é realmente prejudicial à saúde. A cidade de
Araraquara é responsável por 8 a 10% da produção de cana no Estado de São Paulo, este por
sua vez, responde por mais de 50% da produção nacional (EDUCACIONAL, 2004).
O governo do Estado de São Paulo, pela lei nº 11.241 de 19 de setembro de 2002,
dispõe que a eliminação da queima seja gradativa, de modo que em 2006 30% da queima seja
eliminada e que até 2021 a eliminação da queima da palha seja de 100% (MCT, 2003). A
queimada consiste em atear fogo no canavial de forma que aproximadamente 30% da
biomassa (folhas secas e verdes) existente sejam destruídas. As folhas da cana (palha) não
participam diretamente da produção de açúcar ou álcool, assim considera-se essa biomassa
matéria-prima descartável (AGÊNCIA FOLHA, 2007). No período da safra de cana, o setor
canavieiro é o que mais gera emprego, com a maioria da mão-de-obra vindo de outros estados
de São Paulo. Terminada a colheita os cortadores de cana são dispensados e voltam aos seus
estados de origem. Com o fim das queimadas no Estado de São Paulo os trabalhadores
imigrantes deverão se deslocar para outros estados produtores de cana, onde a queimada ainda
é perrmitida. No Estado de São Paulo o próprio setor sucro-alcooleiro acabará absorvendo
grande parte da mão de obra, mas se faz necessário o desenvolvimento de programas de
qualificação e culturas que absorvam mão-de-obra (SAMPAIO, 2007).
Nas indústrias sucro-alcooleiras, após a moagem da cana, o principal subproduto é o
bagaço. Tradicionalmente, o bagaco de cana tem sido usado como combustível na própria
usina, produzindo vapor e gerando energia. Com uma eficiência de 80 - 85% nas caldeiras
chega-se a obter um excedente de 30 - 50% do bagaço gerado (SILVÉRIO, 1988; ARMAS e
BIANCHI, 1990).
O bagaço atualmente usado no abastecimento das caldeiras para a co-geração de
energia elétrica para consumo próprio nas usinas/destilarias poderá ser destinado à produção
de álcool pela utilização de uma tecnologia chamada de DHR (Dedini Hidrólise Rápida). O
método consiste na utilização do processo de hidrólise, transformando o bagaço da cana em
açúcares, que, fermentados e destilados, resultam em álcool. Embora o sistema já tenha
alcançado pleno desenvolvimento tecnológico, ainda está em fase de aumento de escala para
ser implantado em escala industrial. O DHR, patenteado em vários países do mundo, tem
inúmeras vantagens, a principal é que vai incrementar substancialmente a produtividade de
uma destilaria, que hoje produz 7.740 l/hectare: com o pleno desenvolvimento da tecnologia
DHR, a produção de álcool de bagaço será de 13.800 l/hectare. A palha da cana, que
atualmente é queimada para facilitar o corte no campo, substituirá o bagaço na geração de
energia para consumo próprio. O processo DHR permite ainda a utilização de dois
subprodutos que são combustíveis: a lignina e a vinhaça, que poderão ser acrescentadas à
palha no abastecimento das caldeiras (UDOP, 2004). Outros processos de hidrólise estão
sendo amplamente estudados, com destaque para o Projeto BIOETANOL, financiado pela
FINEP –Convênio Chamada Pública 4183-05.
Os produtos da cana tiveram aumento de 9,7% na oferta interna em 2006, em relação
ao ano anterior, chegando a 33,1 milhões de toneladas equivalentes de petróleo. A produção
de álcool cresceu 10,8% no período chegando a 17,8 bilhões de litros. O bagaço e o açúcar
tiveram crescimento de 17,7% na produção, chegando a 310 milhões de toneladas. Estudo
feito pelo Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social (BNDES) aponta para a
produção de álcool a partir de resíduos como bagaço de cana e palha de milho (SAMPAIO,
2007). Quando se avalia a produção de etanol a partir de matérias-primas renováveis,
questiona-se sobre o uso da terra em detrimento à produção de alimentos. Segundo PEREIRA
(2007) é exatamente neste aspecto que reside o maior interesse na utilização de biomassas
residuais. “Não há necessidade de se aumentar a extensão de áreas agricultáveis para a
produção de matérias-primas. O objetivo é transformar resíduos sólidos em fontes valiosas de
carboidratos, visando a produção de combustíveis e de uma variedade de substâncias
químicas”. Para que o bagaço ou palha de cana seja utilizado como matéria-prima de
produção de etanol é necessário desorganizar o complexo lignocelulósico. Para tal fim são
necessárias etapas de pré-tratamento físicos, químicos ou biológicos. O pré-tratamento de
maior interesse industrial é a explosão a vapor, devido seu baixo custo e emprego em escala
comercial (PEREIRA, 2007).
Os processos de sacarificação e fermentação simultâneos (hidrolisados podem ser
fermentados a etanol) é uma forte tendência de aproveitamento de celulose para a produção de
etanol (PEREIRA, 2007).
Além do bagaço e da palha de cana serem utilizados para a geração de energia, existe
ainda o grande interesse da sociedade e das indústrias em utilizar recursos renováveis para a
obtenção de produtos químicos, como por exemplo, polpa celulósica para fabricação de papel
e derivados de celulose como carboximetilcelulose, xantato de celulose, etc. Esse interesse é
devido à disponibilidade de grande quantidade de resíduos agrícolas e porque cada vez mais
vêm sendo estudados métodos que utilizem resíduos agrícolas.
2.2. Processos de Polpação
O desenvolvimento de um processo eficiente e economicamente viável, com o intuito
de converter biomassa de baixo valor agregado em produtos de alto valor comercial, pode
proporcionar substanciais benefícios. Um pré-tratamento ideal deve não somente romper a
estrutura celular da planta, mas também utilizar produtos químicos baratos, requerer
equipamentos simples e não causar impacto ambiental.
Para que se possa fazer o uso integral dos resíduos lignocelulósicos é necessária a
separação de seus constituintes, sendo o processo de polpação um dos mais eficientes para tal
propósito.
A grande demanda da produção de polpa, principalmente, em países desenvolvidos,
tem levado à falta de matéria-prima lenhosa e a um gradual desmatamento de algumas áreas
do planeta. Assim, como matéria-prima alternativa, possuem um particular interesse os
materiais não lenhosos como palha de trigo e outros resíduos agrícolas (JIMÉNEZ et al;
1999). A fabricação de polpa para papel através de palhas de cereais é um processo delicado
para ser feito pelos processos industriais tradicionais papeleiros devido à presença de
derivados de sílica presentes na matéria-prima que dificultam a reciclagem dos reagentes de
polpação contidos no licor negro. A polpação organosolv em meio ácido é capaz de resolver
esse tipo de problema (PAN et al; 1999; SEISTO e POPPIUS-LEVLIN, 1997).
O processo de polpação organosolv é um processo alternativo à produção de polpa que
usa solventes orgânicos e apresenta vantagens em relação à polpação tradicional sulfito e
sulfato (kraft) que geram grande quantidade de efluentes poluentes do meio ambiente
(JIMÉNEZ et al; 1997). A polpação organosolv apresenta vantagens, tais como: a melhora na
eficiência da polpação, ao usar álcool basicamente não ocorre perda de celulose, a
reprecipitação de lignina sobre a superfície das fibras é mínima (PASZNER e CHO, 1989),
existe a possibilidade de recuperação do solvente orgânico por destilação e as polioses e a
lignina também podem ser recuperadas e utilizadas como insumos químicos; desse modo o
processo organosolv possibilita o uso integral da biomassa (GOYAL et al., 1992;
JONHANSSON et al., 1987). O processo organosolv apresenta ainda vantagens quanto ao
baixo capital de investimento, possibilitando a instalação de plantas para a produção em
pequena escala (BENDZALA e KOKTA, 1995; MCDONOUGH, 1993), a inexistência de
problemas relacionados com odores fortes próximos às indústrias (RAYMOND e AKHTAR,
1998) e a facilidade na adequação de etapas de branqueamento utilizando reagentes não
clorados (RAYMOND e AKHTAR, 1998, CURVELO et al., 1994).
Na deslignificação organosolv utilizam-se solventes classificados distintamente em
solventes de baixo e alto ponto de ebulição. Com os solventes de alto ponto de ebulição,
podem ser realizadas deslignificações a temperaturas iguais ou inferiores à de refluxo, sem a
necessidade de pressão. Incluem-se nesta classe ácido acético, ácido fórmico e glicóis. A
outra classe de solventes compreende os álcoois metanol, etanol, isopropanol e cetonas de
baixo ponto de ebulição. Nesse caso as reações de deslignificação são desenvolvidas a
pressões elevadas (SARKANEN, 1990).
É necessário avaliar e estudar as condições de processo específicas para a produção de
vários tipos de polpa de acordo com a viabilidade local de diferentes países. Em Maharashtra
(Índia), a cana-de-açúcar é abundantemente plantada e o bagaço é uma das maiores e mais
barata matéria-prima para a produção de papel (KULKARNI e RAO, 1996).
A qualidade da polpa produzida, usando como matéria-prima uma gramínea ou palha,
varia com o processo e com as condições de polpação. No entanto, indiferentemente à espécie
de matéria-prima e condições de processo, há indícios de que as polpas produzidas a partir de
materiais não lenhosos apresentam baixa qualidade, principalmente baixa resistência para
fabricar papel. A grande freqüência com que polpas de não lenhosos têm sido usados no
mundo, apesar delas não serem apropriadas para um grau de papel, é devido a falta de polpa
de madeira adequada e a adaptação as circunstâncias, ou seja, há uma razão lógica e um
interesse consciente, na Europa, pela polpação de não lenhosos, pois na falta de polpas de
fibra curta e com uma abundante colheita agrícola é razoável que se usem os abundantes
resíduos agrícolas (THYKESSON et al.; 1997).
Atualmente a palha de trigo é uma importante matéria-prima para a produção de polpa
e papel através do processo de polpação soda com a obtenção de polpa na China. No entanto,
o processo convencional de polpação soda causa sério problema de poluição dos efluentes
líquidos (ZHAO et al.; 2001).
2.3. Polpa de Dissolução
Após o processo de polpação, a polpa obtida pode ser usada na fabricação de papel ou
ser utilizada na fabricação de polpas de dissolução.
A polpa de dissolução é uma polpa química branqueada, de baixo rendimento (30-
35%), com um alto conteúdo de celulose pura, tecnicamente referida como α-celulose (95-
98%), e relativamente baixo conteúdo de poliose (1-10%) e lignina (<0,05%), adequada para
uso em derivados de celulose como raion e acetato de celulose (BIERMANN, 1996, LEWIN
e GOLDSTEIN, 1991).
A eficiência na conversão da celulose em um específico derivado depende do
conteúdo de lignina e de poliose presente na polpa de dissolução. Alta alvura (baixo conteúdo
de lignina residual na polpa) é um requisito para a produção da maioria dos derivados de
celulose, por exemplo, a alvura das polpas de dissolução está relacionada com a cor do
produto final, o raion. Excessiva quantidade de poliose na polpa de dissolução pode afetar
seriamente o entumescimento da polpa no processo de mercerização, prejudicar a
filtrabilidade da viscose e diminuir propriedades de resistência da viscose (HINCK et al.,
1985).
2.4. Branqueamento Enzimático de Polpas
Nos meados dos anos 70 foi detectada a presença de substâncias organocloradas, de
dioxinas e de furanos nos efluentes de fábricas de celulose branqueada (MOUNTEER, 1992).
As substâncias organocloradas possuem ligações carbono-cloro, que não são comuns na
natureza e são de difícil degradação, causando efeito negativo ao meio ambiente (REEVE e
EARL, 1989). Os compostos organoclorados são formados durante o processo de
branqueamento da polpa celulósica como resultado do uso de cloro molecular. As substâncias
organocloradas dibenzodioxinas e dibenzofuranos policlorados e seus isômeros tetra clorados
são bioacumulativos, potencialmente tóxicos e persistentes no meio ambiente (BERRY et al.,
1991; DE SOUZA et al., 1989).
Recentemente, o aumento das pressões ambientais e leis mais rigorosas tem
fortalecido a proteção ao meio ambiente, de modo que é necessário pesquisar métodos
alternativos para as plantas industriais de polpação e branqueamento visando à redução de
efluentes poluentes. Essas pressões têm levado ao desenvolvimento de técnicas que visam
melhorar os processos de polpação e reduzir a quantidade de lignina contida na polpa e nas
plantas de branqueamento (ZHAO et al; 2001).
Modificações nos processos de polpação e nos estágios de branqueamentos têm sido
desenvolvidos implicando na extensão do tempo de cozimento e na introdução de uma etapa
de pré-branqueamento com oxigênio para a remoção de lignina residual. Alternativas
biológicas para minimizar o conteúdo de hemiceluloses e lignina na polpa de dissolução estão
sendo investigadas.
2.4.1. Biobranqueamento de Polpas com Xilanases
As enzimas que atuam nos polissacarídeos formados por xilana são classificadas em
dois grupos: endo-β-1,4-xilanases (EC 3.2.1.8 xilana xilanoidrolase) e exo-β-1,4-xilanases
(EC 3.2.1.37 D-xilana xilanoidrolase). As endoxilanases microbianas são classificadas em
dois grupos de acordo com a seqüência de aminoácidos homólogos em família 10 e 11. Em
termos de propriedades catalíticas a diferença encontrada entre as famílias 10 e 11 é que as
enzimas da família 10 exibem maior versatilidade catalítica do que a família 11, pois a
endoxilanase da família 10 mostra melhor capacidade em clivar as ligações glicosídicas das
cadeias de xilana, tais como ácido metil-glucurônico, ácido acético e α-L-arabinofuranosídeo
(BIELY et al., 1997).
Pesquisas têm focado o uso de xilanases (CHRISTOV e PRIOR, 1997; CHRISTOV et
al., 1997) e fungos de degradação branca (CHRISTOV et al., 1996) no biobranqueamento de
polpas sulfito para melhorar a seletividade e remoção de lignina nas polpas de dissolução.
A aplicação de xilanases alcalinas na indústria de papel e polpa tem ganho importância
por ser uma tecnologia não produtora de compostos organoclorados. A primeira publicação
sobre xilanase alcalofílica de bactéria foi feita por HORIKOSHI e ATSUKAWA (1973).
Outras publicações foram feitas com xilanases alcalofílicas, como xilanase produzida por
Aspergillus fischeri (CHANDRA e CHANDRA, 1996) que exibe estabilidade a pH 9,0, ou
ainda xilanase de fungo alcalofílico que possui atividade em pH 6,5 a 9,0 (BANSOD et al.,
1993) e o Bacillus sp (NCIM 59) que produz dois tipos de xilanases ativas em pH 10 e 50ºC
(DEY et al., 1992).
Xilanases de diferentes origens têm sido avaliadas quanto a sua interação com polpas
de vários tipos. Em escala de laboratório, xilanases de microrganismos como Streptomyces
roseiscleroticus (PATEL et al., 1993), actinomycetes (DAVIS et al., 1992), T. harzianum
(SENIOR et al., 1988) e Humicola sp (SILVA et al., 1994) têm sido usadas no tratamento de
polpas e sua habilidade no branqueamento tem sido estudada. O biobranqueamento de polpas
de bagaço de cana usando xilanase alcalofílica e termofílica de Bacillus sp com subseqüente
branqueamento com peróxido resultou na diminuição do número kappa em 10 unidades e um
aumento na alvura de 2,5% (KULKARNI e RAO, 1996). A xilanase termoestável de
Thermotoga maritima foi comparada com a xilanase comercial Pulpzyme HC e resultou numa
eficiente liberação de lignina em polpa kraft (CHEN et al., 1997). As xilanases clonadas
expressas em Bacillus cereus (TREMBLAY e ARCHIBALD, 1993) e E. coli (PAICE et al.,
1988) também aumentaram a deslignificação de polpas kraft não branqueadas.
Nos processos de branqueamento enzimático das polpas, um pH alto (meio alcalino) e
temperatura ótima de ação de cada enzima são de maior importância. Muitas linhagens álcali-
tolerantes de Bacillus produzem xilanase com pH ótimo em torno de 9,0 e foram usadas no
biobranqueamento (OKAZAKI et al., 1985). Xilanase termoestável de Bacilus
sterarothermophilus T-6 apresentou ótimos resultados a 65ºC e pH 9,0 e tem sido usada com
sucesso em testes em escala industrial (LAPIDOT et al., 1996).
De acordo com KALOGERIS et al. (1999) ao se tratar xilana de madeira mole (4-O-
metil-D-glucoronoxilana) com a xilanase termoestável (peso molecular 33 kDa) de
Thermoascus aurantiacus foram identificados como produtos de hidrólise principalmente, a
xilose, xilobiose e oligossacarídeos ácidos, possivelmente ácido aldotetraurônico. Além disso,
esta xilanase foi capaz de atacar os terminais não redutores, propriedade não encontrada nas
xilanases da família 11. A endoxilanase da família 10 requer dois resíduos não substituídos de
xilopiranosil entre as ramificações, enquanto que as endoxilanases da família 11 requerem
três resíduos não substituídos de xilopiranosil consecutivos (BIELY et al., 1993). Com
acetilxilana e xiloligossacarrídeo acetialado foram observados produtos de hidrólise
(oligossacarídeos) com maior mobilidade cromatográfica (gel de eletroforese) do que a xilose
e estão presentes nos hidrolisados das xilanases da família 10. A endoxilanase investigada por
BIELY (1993) foi capaz de liberar grande quantidade de produtos não acetilados, xilose,
xilobiose, xilotriose e oligossacarídeos isômeros com ligações β-1,3, que possui mobilidade
cromatográfica de um isômero de xilotriose.
São propostos mecanismos para a obtenção dos efeitos de branqueamento das polpas:
a) Remoção de cromóforos derivados de xilana: no cozimento alcalino as moléculas de
xilose e xilana podem sofrer modificações, formando estruturas parcialmente aromáticas e
coloridas. Esses cromóforos derivados da degradação de xilana podem ser removidos mais
facilmente pelo uso de xilanase do que por reagentes químicos (WONG et al., 1997b).
b) Complexo lignina-carboidrato: assume-se que há uma ligação entre lignina e polioses
na polpa que restringe a remoção da lignina residual. O rompimento das cadeias de xilana
pela xilanase separa as ligações de lignina-carboidrato, melhora o acesso dos reagentes de
branqueamento e facilita a remoção da lignina em subseqüentes seqüências químicas de
branqueamento (BAJPAI e BAJPAI, 1996; ERIKSSON, 1997;YOUNG e AKHTAR, 1998;
WONG et al., 1997 b).
c) Xilana redepositada: A ação das xilanases como auxiliar no branqueamento também
têm sido atribuída à remoção de xilana redepositada sobre as fibras durante o processo de
polpação. Parte das xilanas que foram inicialmente dissolvidas no processo de polpação kraft
pode reprecipitar sobre as fibras da polpa. Isso ocorre principalmente no final do processo
kraft convencional quando a alcalinidade do licor de cozimento diminui. A xilana
redepositada sobre a superfície da polpa pode encobrir a lignina residual tornando-a
inacessível aos reagentes de branqueamento. A xilanase hidrolisa parte da xilana
redepositada, permitindo melhor acesso dos reagentes de branqueamento até a lignina
residual, tornando mais fácil a remoção dessa lignina (BAJPAI e BAJPAI, 1996; YOUNG e
AKHTAR, 1998; ERIKSSON, 1997; FARREL et al., 1996; WONG et al., 1997b).
d) Inchamento das fibras: interações entre a celulose e a xilana podem contribuir para a
integridade das fibras da polpa dificultando a remoção da lignina presente no interior dessa
estrutura. O uso de xilanase pode romper essa estrutura facilitando uma subseqüente remoção
da lignina residual. Ocorre também o inchamento das fibras que gera poros maiores do que as
macromoléculas de xilanas removidas (WONG et al., 1997b).
A figura 2.1 mostra hipóteses propostas para a ação da xilanase.
Figura 2.1. Hipóteses propostas para a ação da xilanase como auxiliar no branqueamento de polpas químicas: (A) cromóforos derivados de xilana; (B) complexo lignina-carboidrato; (C) xilana redepositada e (D) inchamento das fibras, em que (L= lignina, X= xilana) (WONG et al., 1997b).
Dentre os mecanismos citados, os mais aceitos para explicar o efeito do uso da
xilanase no branqueamento das polpas celulósicas são a remoção das xilanas redepositadas
sobre as fibras e a quebra do complexo lignina-carboidrato.
Estudos detalhados feitos em laboratório mostram que não são caros os investimentos
necessários para adaptar o tratamento enzimático às condições fabris existentes, com exceção
ao ajuste de pH. O tratamento enzimático tem se mostrado completamente compatível com os
equipamentos industriais existentes. A pioneira no mundo foi a companhia finlandesa, que
começou testes em escala fabril em 1988.
Desde 1991, o biobranqueamento, juntamento com processos ECF (elemental chlorine
free) ou TCF (totally chlorine free), tem sido continuamente usado em escala industrial na
Finlândia. A quantidade de cloro requerida no branqueamento é reduzida de 20-30% e como
resultado tem-se a redução da carga de AOX nos efluentes de branqueamento de 15-20%.
Maior número de testes industriais têm sido feitos na Europa, principalmente na
Escandinávia, onde a maioria da polpa kraft é produzida (KULKARNI et al., 1999).
Na última década têm sido feitos muitos estudos de biopolpação e biobranqueamento
de madeiras mole e dura (AKHTAR et al.; 1993; BHANDARI e SRIVASTAVA; 1992).
Cavacos de madeira são tratados com fungos degradadoras de lignina, fungos de degradação
branca (CAMARERO et al., 1998; YASHIMORI et al.; 1993) e polpas têm sido tratadas com
xilanases antes da etapa convencional de branqueamento (JIMÉNEZ et al. 1999; VALCHEV
et al., 1998).
O pré-tratamento com fungo reduz tanto a energia necessária para o refino como o
consumo de reagentes de polpação ou ainda, as polpas apresentam melhor qualidade e o
impacto negativo causado ao meio ambiente é reduzido. O inconveniente de se usar o
tratamento fúngico é que leva muito tempo (cerca de 2 a 4 semanas) e ocorre perda de
rendimento devido à degradação de polissacarídeos e lignina. Para superar esses problemas,
parece ser mais interessante usar enzimas isoladamente, pois o tratamento enzimático
apresenta como vantagem levar apenas horas, ao invés de muitos dias como requer o
tratamento fúngico (ZHAO et al., 2001).
Enzimas como xilanases, mananases e enzimas oxidativas, como lacase e manganês-
peroxidase também têm sido aplicados com sucesso no branqueamento de polpas,
proporcionando diminuição de agentes químicos e aumentando a alvura da polpa (GÜBTIZ et
al., 1996 b; VIIKARI et al., 1994). As endo-1,4-β-xilanases (β-1,4-D-xilana hidrolase, EC
3.2.1.8) têm mostrado considerável potencial na redução de xilana contida nas polpas de
dissolução. Por exemplo, 50% de xilanas presentes em polpas branqueadas podem ser
removidas pela xilanase produzida pelo fungo Aureobasidium pullulans (CHRISTOV e
PRIOR, 1996).
2.4.2. Biobranqueamento de Polpas com Lacase
Os métodos de branqueamento enzimáticos têm recebido muita atenção por não
causarem danos ao meio ambiente.
Enzimas tais como lignina peroxidase (LiP EC. 1.11.1.14), manganês peroxidase
(MnP EC.1.11.1.13) e lacase (EC.1.10.3.2) são enzimas responsáveis pela degradação e
despolimerização da lignina (KIRK e CULLEN, 1998). Segundo dados da literatura a
manganês peroxidase e as lacases atuam mais efetivamente na degradação da lignina do que
as ligninas peroxidases. Assim a manganês peroxidase tem sido usada para aumentar a alvura
das polpas (PAICE e BOURBONNAIS, 1995) e as lacases no branqueamento de polpas
(WONG et al., 1999).
Em adição a xilanase, a lacase tem sido investigada no biobranqueamento de polpas
kraft, pois reduzem o número kappa e aumentam a branqueabilidade da polpa quando usada
com um mediador químico e oxigênio (BOURBONNAIS e PAICE, 1992). A lacase pode ser
produzida em grande quantidade e a um preço razoável e usa como receptor de elétrons o
oxigênio que é barato. No entanto, para o uso de lacase em polpas celulósicas com a
finalidade de reduzir o número kappa, requer-se um mediador redox e este sim, é caro e ainda
é uma barreira na implantação de lacase em branqueamento de polpas (LI et al., 1999).
A lacase pertence a uma família de oxidases multi-cobre e contém quatro átomos de
cobre classificados em três tipos; cobre do tipo 1 (cobre “azul” paramagnético e que apresenta
absorbância a 610 nm), tipo 2 (cobre paramagnético “não azul”) e tipo 3 (diamagnético que
apresenta absorbância a 330 nm) (COUTO e HERRERA, 2006, CLAUS, 2004). Os cobres
dos tipos 1 e 2 estão envolvidos na captura e transferência de elétrons. Os cobres 2 e 3 estão
envolvidos na ligação com o oxigênio (CALL e MÜCKE, 1997). As lacases catalizam a
reação de redução de 4 elétrons do oxigênio (O2) a 2 moléculas de água.
A lacase é largamente encontrada em numerosos fungos, em várias espécies de plantas
(MAYER, 1987), na bactéria Azospirillum lipoferum (FAURE et al., 1994) e em uma dúzia de
insetos (THOMAS et al., 1989). A lacase possui várias funções, como participar da
biossíntese da lignina (O’MALLEY et al., 1993), conferir patogenicidade às plantas
(SBAGHI et al., 1996), degradar a parede celular de plantas (MACHUCA e DURAN, 1993;
KATASE e BOLLAG, 1991), melanizar bactérias (FAURE et al., 1994) e causar a melanina
virulenta em humanos (WILLIAMSON, 1994). Quimicamente, todas essas funções da lacase
estão relacionadas à oxidação de substâncias aromáticas; no entanto, o efeito oxidativo é
diferente em cada situação podendo ocorrer em situações opostas, por exemplo, em plantas, a
lacase oxida monolignóis para polimerizar a lignina e a lacase de fungos de degradação
branca degradam e despolimerizam a lignina (LI et al., 1999).
Fungos de degradação branca realizam a deslignificação oxidativa seletiva dos tecidos
da madeira secretando muitas enzimas (HAVE e TEUNISSEN, 2001), como a lignina-
peroxidase (LiP) (TIEN e KIRK, 1983), manganês - peroxidase (MnP) (KUWAHARA et al.,
1984) e lacase (EC 1.10.3.2) (MESSERSCHMIDT, 1997). Acredita-se que o potencial redox
das enzimas lignina degradadoras desempenha papel crucial em subunidades não fenólicas,
subestruturas predominantes na madeira, com alto potencial redox. A lignina peroxidase é
capaz de oxidar compostos aromáticos não fenólicos com um alto potencial de ionização
como o 1,2-dimetoxibenzeno (E1/2= 1.500 mV) e álcool veratrílico (KERSTEN et al., 1990) e
desse modo se torna uma enzima chave na degradação fúngica da lignina. No entanto,
acredita-se que a lacase tenha um papel menos importante, possuindo um potencial redox de
800 mV, não podendo oxidar o álcool veratrílico (um típico composto modelo não fenólico da
lignina). Porém, a lacase é capaz de oxidar alguns compostos (mediadores) com potencial
redox maiores do que o dela (BOURBONNAIS e PAICE, 1990; BOURBONNAIS et al.,
1998). A acessibilidade e a manipulação da lacase é maior do que da lignina peroxidase e da
manganês peroxidase e o sistema lacase-mediador apresenta aplicações práticas (LI et al.,
1999) como a deslignificação de polpa química e no branqueamento de corantes índigo
(KIERULFF, 1997).
A oxidação de substratos pela lacase leva a formação de radicais que podem reagir de
três maneiras (CLAUS, 2004):
- ligação cruzada de monômeros: a oxidação enzimática pela lacase de compostos fenólicos e
anilinas gera radicais que reagem entre si formando dímeros, oligômeros ou polímeros com
ligações covalentes entre C-C, C-O e C-N,
- degradação de polímeros: lacases estão envolvidas na degradação de polímeros complexos
naturais, como a lignina ou ácidos húmicos (CLAUS e FILIP, 1998). Os radicais gerados
levam a quebra de ligações covalentes e a liberação de monômeros,
- abertura de anéis aromáticos: em muitos casos a lacase cataliza a abertura do anel aromático.
Esta reação é de interesse na degradação de xenobióticos como nitroaromáticos e tintas
sintéticas (DURÀN e ESPOSITO, 2000).
As lacases são capazes de quebrar algumas das ligações da lignina e catalisar a
oxidação de uma larga variedade de compostos aromáticos como substratos fenólicos e íons
inorgânicos ligados a moléculas redutíveis pelo oxigênio presentes na água (YAROPOLOV et
al., 1994). Compostos fenólicos podem ser oxidados por agentes oxidantes com potencial
redox suficiente para a remoção de um elétron do fenol, no entanto esta reação de oxidação
pode ser feita enzimaticamente, por exemplo, pelas lacases ou peroxidases (REN e
BUSCHLE-DILLER, 2007), como mostra a figura 2.2.
lacase não enzimático
Figura 2.2. Mecanismo de oxidação realizado pela lacase e subseqüentes reações não
enzimáticas.
A lacase somente é capaz de oxidar o álcool veratrílico, ou outros dímeros de lignina
não fenólicos (BOURBONNAIS e PAICE, 1990; ARCHIBALD et al., 1997). O grupo
hidroxila do fenol e/ou o carbono α (α-C) pode ser oxidado ao correspondente aldeído ou
grupo funcional cetona (figura 2.3).
A lacase apresenta uma grande especificidade ao substrato, especificidade que pode
ser aumentada pela adição de mediadores redox (CALL e MUCKE, 1997).
O número kappa é uma medida da quantidade de lignina residual na polpa e a
diminuição do número kappa após a polpa tratada com o sistema lacase-mediador sugere que
a deslignificação ocorreu. Assim como outros sistemas enzimáticos, o sistema lacase-
mediador pode ser altamente seletivo, causando perdas no rendimento devido à pequena
degradação de carboidratos (WONG et al., 1999).
No sistema lacase-mediador, a enzima oxida o mediador (BAIOCCO et al., 2003) e a
espécie resultante Medox (mecanismo ilustrado na figura 2.4) pode oxidar substratos não
fenólicos, mecanismo que difere da simples transferência de elétrons pela enzima
(MESSERSCHMIDT, 1997).
Lignina
Lignina
Lignina
Lignina
Lignina Lignina
Lignina
Lignina
Lignina Lignina
O Lignina –C-H
Lignina
Figura 2.3. Possíveis reações de oxidação da lignina pela lacase (ARCHIBALD et al., 1997).
O2 Lacase Medox Substrato
H2O Lacaseox Med Substratoox
Figura 2.4. O papel do mediador na atividade da lacase.
Mediadores artificiais de lacase têm sido descritos (FABRINNI et al., 2002;
BOURBONNAIS et al., 1997; CALL e MÜCKE, 1997). Mediadores que possuem a função
N-OH possuem melhor desempenho (D’ACUNZO et al., 2002; JOHANNES e
MAJCHERCZYK, 2000).
A lacase está limitada a oxidar a lignina que se encontra na fase aquosa ou na
superfície da fibra, pois a enzima não pode penetrar na parede da fibra de madeira
(GOODELL et al., 1998).
Aplicando um mediador há a possibilidade da lacase oxidar substratos inacessíveis na
parede da fibra, bem como estruturas não fenólicas e assim o substrato distante
(BOURBONNAIS et al., 1997; XU et al., 1997).
O tratamento de deslignificação não é completo, ou seja, uma pequena quantidade de
lignina ainda permanece em contato íntimo com a celulose. Essa lignina remanescente é
responsável pela tonalidade apresentada pela polpa, precisa ser removida, não só para obter
uma celulose completamente pura, mas também para dar um aspecto de alvura elevado
(HEITZ et al., 1991), característica fundamental para proporcionar uma alta qualidade ao
produto final. Para satisfazer estas exigências é utilizado o processo chamado branqueamento,
ou seja, levar a fibra ao seu estado natural de alvura que é branco. Ao sair da etapa de
deslignificação, a celulose ainda é marcada não só pela presença de uma certa quantidade de
lignina como também por outras impurezas em menores quantidades como, grupos
cromóforos, íons metálicos, grupos fenólicos, resinas, e outros compostos coloridos oriundos
do material lignocelulósico.
2.5. Branqueamento Químico de Polpas
Branquear é então modificar, reduzir ou, eliminar estes elementos, que absorvem a luz
visível.
A rigor, o branqueamento é o prosseguimento da etapa de deslignificação, com a
principal característica de solubilização da lignina para mais fácil remoção, usando produtos
químicos mais seletivos, porém mais caros.
No caso de produção de polpa chamada de alto rendimento, a lignina é mantida na
fibra e é simplesmente transformada não influindo na cor. Há outros casos em que a remoção
quase completa da lignina torna-se necessária; isto ocorre quando a celulose é matéria-prima
para obtenção de nitrato de celulose, acetato de celulose ou raion. A celulose para esses fins é
chamada de celulose química ou polpa solúvel. Em função do grau de alvura que se deseja
obter, a eliminação da lignina residual se faz em vários estágios, tanto por razões técnicas
quanto econômicas.
Tem-se observado que é possível conseguir um maior grau de alvura da polpa com
uma menor degradação da celulose, ao se aplicar quantidades menores de reagentes de
branqueamento em etapas sucessivas, com lavagens entre elas (KLING, 1985). É considerado
que, a eliminação dos produtos oxidados por lavagens expõe novamente a superfície que não
reagiu a uma nova oxidação, pois a matéria dissolvida não está susceptível a uma oxidação
adicional. Com este tipo de procedimento, ocorre uma eliminação mais acentuada da lignina,
com redução da quantidade de produtos químicos gastos. Normalmente, nas indústrias, são
utilizadas as seguintes etapas: primeiramente uma cloração com o objetivo de degradar a
lignina, seguida de um estágio alcalino para a neutralização e dissolução dos produtos de
degradação, terminando com um ou mais estágios de oxidação com extrações alcalinas
intermediárias.
Os principais agentes de branqueamento são: cloro, hipoclorito de cálcio e sódio,
dióxido de cloro, clorito de sódio, clorato de sódio, peróxido de hidrogênio e ozônio.
A simbologia normalmente usada para representar as etapas mais utilizadas em uma
seqüência de branqueamento é vista na tabela 2.1. É usada a primeira letra de cada substância
para denominar os estágios, assim C=cloro, E=extração alcalina com NaOH, H=hipoclorito
de sódio, D=dióxido de cloro, P=peróxido de hidrogênio e O= branqueamento com oxigênio.
Para escolha de uma seqüência de branqueamento alguns aspectos importantes não
podem ser deixados de lado como manter o custo ao mínimo possível, utilizar reagentes
menos poluidores e diminuir o volume de efluentes.
Polpas químicas de plantas não lenhosas (linho, cânhamo, juta ou sisal) são mais
difíceis de branquear do que as polpas químicas de madeira devido às características químicas
e anatômicas como a presença, na maioria delas, de fibras do xilema lignificadas juntamente
com as fibras do floema que possuem melhores propriedades para as aplicações têxteis ou
para papel (AKIM et al., 1996). Atuais seqüências químicas de branqueamento totalmente
livre de cloro (TCF) que utilizam o peróxido de hidrogênio, oxigênio e/ou ozônio não
conferem adequada alvura às polpas obtidas a partir de fibras não lenhosas e Cl2 e ClO2 estão
sendo usados no branqueamento industrial. No entanto, é necessário e urgente o
desenvolvimento de tecnologias que não causem danos ao meio ambiente para a manufatura
de papéis de fibras não lenhosas em países industrializados e em desenvolvimento. Devem ser
desenvolvidas seqüências de branqueamento que limitem o uso de cloro, devido este causar
um impacto muito negativo no meio aquático (GARCIA et al., 2000).
Industrialmente polpas branqueadas por processos totalmente livres de cloro (TCF)
possuem grau de alvura 88-92% ISO. Para se obter polpas com maior alvura (93% ISO) é
necessário ainda, o desenvolvimento de tecnologias de branqueamento. Comumente a
tecnologia de branqueamento conhecida como TCF utiliza como agentes de branqueamento o
ozônio, o peróxido de hidrogênio e o oxigênio.
Tabela 2.1. Simbologia das etapas de branqueamento.
SÍMBOLO ESTÁGIO DE BRANQUEAMENTO C Cloração E Extração Alcalina H Hipocloração D Dióxido de Cloro P Peróxido de Hidrogênio O Oxigênio Z Ozônio Eo Extração Oxidativa Ep Extração Alcalina com Peróxido
A seqüência de branqueamento em que se usa ozônio ou peróxido depende de cada
fábrica, sendo que os principais fatores influenciadores da seqüência são o tipo de material a
ser processado (madeira mole, dura ou gramínea), a existência de equipamento capacitado, a
alvura final desejada e as propriedades (resistência) da polpa. Traços de metais,
particularmente ferro e manganês, devem ser controlados nos processos de branqueamento
TCF.
Com a finalidade de reduzir a quantidade de lignina residual nas polpas, diferentes
estudos têm sido realizados com oxigênio em uma etapa de pré-branqueamento (ABDULL-
KARIM e RAB, 1995; ALLISON e MCGROUTER, 1995; IRVINE et al., 1993;
MCDONOUGH, 1995).
No pré-branqueamento com oxigênio, é necessário otimizar as condições operacionais
para que se tenha um balanço entre a eliminação de lignina e a preservação das propriedades
físicas e mecânicas das fibras de celulose (TOKOYAMA et al., 1999).
O peróxido de hidrogênio começou a ser usado nos processos de branqueamento para
completar a ação do oxigênio (LACHENAL et al., 1997; SUN e ARGYROPOULOS, 1995).
No branqueamento com peróxido de hidrogênio para se conseguir uma significante redução
de lignina é necessária grande quantidade de peróxido, aumentando o custo do processo que
se justificaria com considerável aumento da alvura das polpas obtidas e se fazendo necessário
o controle de íons metálicos dissolvidos (SOINI et al., 1998).
O efeito branqueante do peróxido de hidrogênio tem sido atribuído a ação oxidativa do
ânion peróxido (HOO-). Segundo LACHENAL e PAPADOPOLOS (1988), as reações do
peróxido com a lignina podem ser divididas em três categorias: despolimerização da lignina,
eliminação de grupos cromóforos e criação de novos cromóforos.
A despolimerização da lignina pode ocorrer através do ataque do ânion HOO- aos
grupos carbonilas das cadeias laterais de lignina (figura 2.5).
Figura 2.5. Reação de despolimerização de lignina.
A eliminação de cromóforos pode ocorrer através da degradação oxidativa de grupos
fenólicos aromáticos e quinonas, também pela degradação do ânion HOO- ou dos produtos de
decomposição do peróxido (figura 2.6).
Figura 2.6. Reações de degradação oxidativa de sistemas aromáticos.
A reação do peróxido de hidrogênio sobre as estruturas quinonas podem resultar na
formação de substâncias cromóforas (figura 2.7).
A dissolução do peróxido de hidrogênio aumenta com o aumento da temperatura e a
concentração do ânion HOO- depende da alcalinidade do meio reacional, sugerindo que as
condições de branqueamento com peróxido de hidrogênio sejam normalmente alcalinas.
A decomposição do peróxido em água e oxigênio é catalisada por certos íons
metálicos. O oxigênio liberado não tem apenas ação branqueante, mas também pode causar
degradação dos componentes celulósicos. Torna-se, assim necessária a utilização de aditivos
estabilizantes e protetores dos carboidratos celulósicos, sendo os aditivos mais utilizados o
silicato de sódio e sulfato de magnésio (LACHENEL e PAPADOPOULOS, 1988).
Figura 2.7. Formação de novas estruturas cromóforas.
Os metais de transição exercem efeito negativo no branqueamento com peróxido de
hidrogênio e/ou ozônio, pois podem decompô-los gerando radicais hidroxilas, que são de
baixa seletividade em relação à celulose (GRATZL, 1990). O manganês, apesar de ter um
efeito catalisador da decomposição do peróxido de hidrogênio, não reduz a seletividade do
branqueamento com peróxido, ozônio e oxigênio, porque não gera radicais hidroxilas durante
a decomposição desses reagentes. No entanto, o ferro, além de catalisar a decomposição
desses reagentes, resulta na formação de radicais hidroxilas, ocasionando perda na
seletividade (BRYANT, 1996).
Os metais de transição Mn, Co, Cu e Fe, os quais possuem uma significativa atividade
catalítica sobre oxidantes derivados de oxigênio, encontram-se na polpa kraft, ligados aos
grupos ácidos metilglucurônicos (polioses) e grupos carboxílicos da celulose e da lignina.
Esses metais devem ser removidos da polpa com quelantes com pH entre 4 a 7, ou por
lavagem ácida a um pH inferior a 3 (DEVENYNS et al., 1994), antes do branqueamento com
oxidantes derivados do oxigênio, isto é, em processos TCF. Os metais alcalinos Mg e Ca
complexam os metais de transição, agindo como estabilizantes do peróxido de hidrogênio
(LAPPIERRE et al., 1995). O cálcio, quando em concentrações suficientemente altas, se
prende aos sítios de ligação do quelante, reduzindo a eficiência do mesmo (BEAUDRY,
1994).
Para que se consiga alvuras satisfatórias (% ISO maiores que 80%) usando somente
peróxido de hidrogênio é necessário combinar altas temperaturas, pressão, pH e tempo de
residência (ANDERSON e AMINI, 1996). No entanto, existem desvantagens como queda de
rendimento, significante investimento de capital, custos adicionais de energia e custos
químicos, existe também o impacto negativo causado à qualidade da fibra, bem como a
corrosão de equipamentos causada pela alta temperatura e alta alcalinidade.
Ao se fazer o uso de tetraacetiletilenodiamina (TAED) o branqueamento com peróxido
se torna vantajoso, pois o tempo de reação é menor e não há a necessidade das condições
agressivas de reação, pois o peróxido é convertido “in situ” em um forte oxidante (ácido
peracético ou o ânion paracético), dependendo do pH e do estágio do branqueamento.
Geralmente, o forte oxidante “in situ” evita dificuldades de controle de processo e requer
menor investimento em capital (CROUND e MATHEWS, 1998; LEDUC et al., 1998).
Há poucos trabalhos que reportam somente o uso de peróxido no branqueamento de
fibras não lenhosas (KHRISTOVA et al., 2003). KORDSACHIA (2000) branqueou polpa
ASAM (alcalino-sulfito-antraquinona-metanol) de cânhamo. A polpa quelada não branqueada
possuía alvura 68,2% ISO (devido à polpação ASAM). Com estágios QP (quelante e
peróxido) com uma carga total de peróxido de 2-3%, a alvura final alcançada foi de 89,9 a
90,8% ISO e houve redução de kappa de apenas 1,5 unidades.
2.6. Derivados de Celulose
A celulose é usada principalmente em maior ou menor grau de purificação, na forma
de papel e papelão, mas derivados celulósicos possuindo proriedades diferentes da celulose
são utilizados em numerosos campos.
A celulose é um polímero feito de unidades de glicose e não pode ser facilmente
convertida em produtos. A cadeia polimérica de celulose interage com outra através das
ligações de hidrogênio e das forças de Van der Waals formando a região cristalina (FENGEL
e WEGENER, 1989). As principais reações que a celulose pode sofrer são: reações de
substituição e oxidação dos grupos hidroxílicos; hidrólise de ligações acetálicas tanto em
meio básico como em meio ácidos; redução e oxidação dos grupos aldeídicos terminais para
formar grupos alcoólicos ou carboxílicos (KOGA, 1988). Os grupos hidroxílicos da celulose
podem reagir como os de um álcool comum para formar vários derivados: ésteres com ácidos
inorgânicos e orgânicos, éteres com outros álcoois, alcoolatos com álcalis, aminas, etc
(KLEMM et al., 1998).
Do ponto de vista técnico, os mais importantes derivados de celulose são os ésteres e
éteres com uma larga faixa de aplicações.
A álcali-celulose é um importante intermediário para a formação de determinados
ésteres e éteres (VARSHNEY e PATEL, 1988).
Mediante tratamentos químicos na celulose é possível obter compostos com
características novas e particulares, entre eles: fibras, plásticos, revestimentos a prova d´agua,
herbicidas, lacas, tintas e vernizes, explosivos, espessadores para produtos acabados,
materiais resistentes à ação de microrganismos, filmes fotográficos, membranas para
hemodiálise e purificação de água, e outros (VARSHNEY e PATEL, 1989; ZOLLINGER,
1988; HORTAL e LLUCIÁ, 1984).
A variedade de produtos derivados de celulose, obtidos por meio de tratamentos
químicos, tem-se elevado a uma tal dimensão que é necessário ter uma classificação dos
grandes grupos de produtos, atendendo a classes de reações pelas quais são obtidos, como por
exemplo, reações homogêneas e heterogêneas.
Com respeito a forma dos produtos três classes são destacadas:
1. Compostos moleculares os quais normalmente não são estáveis,
2. Produtos de substituição que se formam devido à reação química entre os grupos hidroxilas
e os reagentes utilizados,
3. Produtos de oxidação, normalmente muito degradados.
Do ponto de vista técnico, os éteres de celulose (metilcelulose, etilcelulose,
carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose e hidroxipropilcelulose) aparecem como um dos
mais importantes derivados de celulose e possuem um amplo campo de aplicações,
particularmente os éteres solúveis em água possuem vasta aplicação em detergentes, nas
indústrias de alimento, têxteis e cosméticos (NEVELL e ZERONIAN, 1985).
O tipo de reação mais comumente utilizado na preparação de éteres de celulose é a
substuição nucleofílica (INGOLD, 1953). A introdução de grupos éter na molécula de
celulose resulta em um produto solúvel em água (mesmo em água fria). O tipo de substituinte
bem como o grau de substituição determina essa propriedade dos éteres de celulose. Ao se
utilizar substituintes hidrofílicos uma solubilidade em água é alcançada com derivados de
celulose com baixo grau de substituição (GS). Os derivados de celulose obtidos com os
substituintes hidrofóbicos com baixo GS apresentam solubilidade em álcali e em água. Os
derivados de celulose que são solúveis em solventes orgânicos apresentam alto GS (LEWIN e
GOLDSTEIN, 1991).
Na preparação de éteres de celulose, a celulose é convertida para álcali celulose que,
posteriormente, reage com um haleto de alquila para produzir o éter de celulose.
A carboximetilcelulose (CMC) é o éter de celulose comercialmente mais importante,
possuindo amplas aplicações científicas, especialmente devido às suas características
polieletrolíticas. A carboximetilcelulose é largamente produzida tendo uma produção mundial
de 360.000 toneladas por ano (DAPÍA et al., 2003). O processo de obtenção da CMC ocorre
em duas etapas distintas, a alcalinização e a eterificação. Na etapa de alcalinização (promove
o entumescimento das fibras de celulose) ocorre a reação entre a celulose e o hidróxido de
sódio, formando álcali-celulose.
1ª etapa: Alcalinização:
celulose – OH + NaOH celulose –O- + Na+ + H2O
(álcali celulose)
Na etapa de eterificação, a álcali celulose-celulose reage com o ácido
monocloroacético (ou seu sal de sódio) para formar a carboximetilcelulose (FENGEL e
WEGENER, 1989).
2ª atapa: Eterificação:
CH2ClOOH + NaOH CH2ClCOONa + H2O
Celulose – O- + Na + CH2ClCOONa celulose-O-CH2COONa + Na Cl
carboximetilcelulose
Uma reação paralela à síntese do CMC ocorre levando à formação de glicolato de sódio
como subproduto principal (impureza) que é eliminada na etapa de purificação da
carboximetilcelulose:
CH2ClOONa + NaOH CH2OHCOONA + NaCl
glicolato de sódio
A carboximetilcelulose tem vasta aplicação na indústria de alimentos e fármacos. Uma
das aplicações específica da carboximetilcelulose é no pós-operatório de cirurgias a laser para
correção de miopia, evitando os sintomas de ressecamento dos olhos e reduzindo a incidência
de defeitos causados durante a cirurgia com laser. O efeito protetivo do carboximetilcelulose é
provavelmente devido à propriedade de forte mucoadesão dos grupos carbonil da
carboximetilcelulose servindo como lubrificante e protegendo a superfície epitelial de traumas
causados pela passagem de microqueratoma sobre a córnea (AHEE et al., 2002).
3. OBJETIVOS
Este trabalho teve por objetivo estudar o branqueamento enzimático e químico de
polpas organosolv de palha.
Para alcançar tal objetivo foram realizadas as etapas:
1. Estudo e otimização dos processos de polpação etanol-água e acetosolv da palha de cana;
2. Estudar o branqueamento enzimático com xilanases obtidas de diversas origens
microbiológicas e com lacase comercial no sistema lacase mediador.
3. Estudar o branqueamento químico das polpas organosolv e o uso do pré-tratamento
enzimático;
4. Estudar as características apropriadas para a obtenção de polpas de dissolução, tais como
número kappa, alvura e composição química das polpas organosolv;
5. Obter a carboximetilcelulose da polpa de dissolução de palha obtida pelo processo
organosolv.
4. MATERIAL E MÉTODOS
A palha de cana foi fornecida pela Usina Açucareira Ester S. A que está localizada em
Cosmópolis - S.P.
A palha foi seca ao ar até que atingisse umidade de cerca de 10%. Para fazer as
reações de polpação a palha foi cortada manualmente em pedaços de cerca de 3 cm de
comprimento.
Na figura 4.1 está representada a obtenção de derivado de celulose
(carboximetilcelulsose) a partir de palha de cana-de-açúcar.
palha “in natura caracterização
Polpação organosolv (etanol-água e acetosolv)
caracterização
Tratamento Enzimático (xilanase e lacase)
Atividade enzimática
Branqueamento Químico
Peróxido de Hidrogênio
Extração Alcalina
Celulose Branqueada
Eterificação
Carboximetilcelulose caracterização
NaOH/ETANOL (50% AMA e 50%etanol)
Caracterização da polpa
Figura 4.1. Representação esquemática do processo de branqueamento de polpas organosolv e obtenção de carboximetilcelulose.
4. 1. Otimização dos processos de polpação organosolv
4. 1. 1. Polpação acetosolv da palha de cana-de-açúcar
A polpação da palha foi realizada em sistema aberto, com ácido acético 93% (v/v) e na
presença de catalisador (HCl), como descrito por BENAR (1992). Para fins de otimização do
processo de deslignificação da palha foi feito um estudo da melhor relação palha/solvente e
do melhor tempo de cozimento da palha.
Foram feitas polpações utilizando-se a relação palha/solvente de 1:20 e 1:30 (m/v). Na
relação biomasse/solvente de 1:20 foi utilizado um balão de fundo redondo de 1000 mL em
que foram colocados 10 g de palha juntamente com 172 mL de ácido acético glacial, 350μL
de HCl 37% e 11 mL de água destilada. Na relação biomassa/solvente de 1:30 foram
utilizados 10 g de palha, 266 mL de ácido acético glacial, 34 mL de água destilada e 350 μL
de HCl 37%.
Para a determinação do melhor tempo de deslignificação, foram feitas polpações entre
1 e 6 h de cozimento. O balão foi aquecido à temperatura de refluxo do ácido acético (110°C).
Após a polpação, a mistura foi removida e filtrada. A polpa obtida foi lavada com
ácido acético 93% para a remoção da lignina residual. A polpa foi seca ao ar e guardada para
análises posteriores.
4. 1. 2. Polpação etanol-água da palha de cana-de-açúcar
A polpação da palha foi realizada em uma autoclave de 200 mL com agitação
horizontal, provida de manta elétrica de aquecimento, em que foram colocados 10 g de palha,
100 mL de uma mistura etanol-água 1:1 (v/v) [relação licor/palha 10:1(v/m)] (MORIYA,
2003).
Para a determinação das melhores condições de deslignificação da palha, foram
realizadas polpações variando de 150°C a 215°C e os tempos de cozimento variaram de 1 a 4
h de reação.
4. 2. Determinação de atividade enzimática
4. 2. 1. Atividade de xilanase
A atividade da xilanase foi determinada pela medida da quantidade de açúcares
redutores liberados a partir de xilana, de acordo com o método de BAILEY et al. (1992). Os
açúcares redutores foram dosados pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS)
(MILLER, 1959). Uma unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de
enzima necessária para produzir 1μmol de xilose por minuto a 50ºC.
4. 2. 2. Atividade de lacase
A atividade da lacase foi determinada usando siringaldazina 1 mM como substrato,
com tampão citrato-fosfato 0,1 M a pH 5 e a temperatura ambiente. Uma unidade de enzima é
definida como 1,0 μmol de produto formado por minuto nas condições do teste (SUNTIO,
1988).
4. 3. Estudo da branqueabilidade das polpas organosolv
4. 3. 1. Biobranqueamento com xilanases
As polpas organosolv foram submetidas ao tratamento enzimático em concentrações
de enzima que variam de 5 a 50 unidades de enzima por grama de polpa seca por 2 h
(MORIYA, 2003) e um tratamento foi feito aplicando-se 150 unidades de enzima por 20 h. O
tratamento foi efetuado em bolsas plásticas, em banho termostatizado a 50ºC, com polpas com
10% de consistência. Em seguida a polpa foi submetida a uma extração alcalina com NaOH
0,5% (m/v) por 1 h a 60°C.
As xilanases utilizadas no estudo do branqueamento enzimático foram gentilmente
fornecidas por:
• UNICAMP: Xilanase produzida pela bactéria Bacilus pumilus (DUARTE et al.,
2001);
• Universidade de Goiás: Xilanase de fungo termofílico Humicola grisea var
thermoidea produzida em levedura Pichia pastoris (FARIA et al., 2001);
• EEL-USP: Xilanase de fungo Thermoascus aurantiacus (MILAGRES et al., 2004).
4. 3. 2. Biobranqueamento com lacases
Foi utilizado um extrato enzimático produzido por Pleurotus ostreatus (MEDEIROS
et al., 1999) com atividade de 500 UI.L-1. Em erlenmeyer de 125 mL foram colocados 10g de
polpa seca, água destilada de modo que a polpa tenha consistência de 5%, tampão fosfato de
sódio 0,01 M pH 4,5. Foram testados como mediadores o ácido violúrico e o 1-
hidroxibenzotriazol (HBT). A temperatura de tratamento foi de 45°C por 4 h (CAMARERO
et al., 2003). Na figura 4.2. estão apresentadas as estruturas dos mediadores HBT (C6H5N3 e
massa molar 119,13) e do ácido violúrico (C4H3N3O4.H2O e massa molar 175,10).
1- Hidroxibenzotriazol
(HBT) Ácido violúrico
(VA)
Figura 4.2. Estruturas dos mediadores 1-hidroxibenzotriazol (HBT) e do ácido violúrico (VA).
O sistema lacase comercial (fornecida gentilmente pela Novozymes) foi aplicado na
polpa organosolv com cargas que variaram de 10 a 150 unidades de lacase por grama de polpa
seca com os mediadores 1-hidroxibenzotriazol (HBT) ou ácido violúrico (AV) na quantidade
de 0,5 a 4% (realçao massa de polpa) por 1, 4 ou 8 h de reação a 45ºC em shaker com
agitação de 160 rpm com polpas com consistências variadas de 2 a 10% e em tampão fosfato
de sódio 0,01 M pH 4,5.
Após o tratamento enzimático, a polpa foi lavada com água destilada na temperatura
do tratamento enzimático, filtrada em funil de Büchner e foi submetida à extração alcalina
com NaOH 1,5% (m/v) a 60°C por 1 h. Após a extração alcalina a polpa foi filtrada em funil
de Büchner e lavada com água destilada até o filtrado atingir pH neutro e incolor.
4.3.3. Análise da ação enzimática através do balanço de massa
Em um processo de transformação da biomassa (palha de cana) até a obtenção de
polpas branqueadas o material lignocelulósico passa por etapas (processos) químicos ou
biotratamentos. O balanço de massa material leva em consideração a composição química da
biomassa ou das polpas tratadas enzimaticamente e polpas branqueadas químicamente.
A conservação da massa para o tratamento de biomassa de uma única etapa de um
processo é dado por:
PROCESSOM0
M1
M2PROCESSOM0
M1
M2
Pela conservação da massa:
Mo = M1 + M2 (equação 1)
em que M0= massa inicial, M1 e M2 são massas que saem do processo.
A definição de rendimento é dado por:
R (%)= (MF /M0)*100 (equação 2)
em que R (%) = rendimento em porcentagem da etapa, MF = massa final, M0 = massa inicial.
O balanço de massa para uma etapa de um processo é dado por:
M0
Mf Mp
Processo
Mp=M0 - Mf (equação 3)
Multiplicando a equação 3 por 100 e dividindo por M0 tem-se:
P = 100 – 100 * (Mf/M0)
P = 100 – 100 * (CfMTf / C0 MT0 )
P = 100 – (Cf*R)/C0 (equação 4)
em que Cf= componente final,
C0 = componente inicial,
R = rendimento da etapa (%).
Para um processo de transformação da biomassa até a obtenção de uma polpa
branqueada tem-se o balanço global de massa:
Biomassa
Polpa Pré-tratadaPolpa
Polpa Branqueada
Mp = Mo.(1-0,01.Pp)
Mo Mp Mx Me
0,01.Pp.Mo 0,01.Px.Mp 0,01.Pe.Mx
Mx = Mp.(1-0,01.Px) Me = Mx.(1-0,01.Pe)
BiomassaPolpa Pré-tratadaPolpa
Polpa BranqueadaBiomassa
Polpa Pré-tratadaPolpa
Polpa Branqueada
Mp = Mo.(1-0,01.Pp)
Mo Mp Mx MeMo Mp Mx Me
0,01.Pp.Mo 0,01.Px.Mp 0,01.Pe.Mx
Mx = Mp.(1-0,01.Px) Me = Mx.(1-0,01.Pe)
(equação 5)
( ) ( ) ( )
( )
( ) EXPEPXEXPEXPG
XPPXEXPXPG
XPEPXPG
PPPPPPPPPPPPP
PPPPPPPPPP
MPPMPPPPP
4
40
0
1001,0
1001,001,0101,0
01,0101,0101,01
−
−
+++⋅−++=
+−−⋅+−+=
−⋅−⋅⋅+−⋅+= ( ) ( ) ( )
( )
( ) EXPEPXEXPEXPG
XPPXEXPXPG
XPEPXPG
PPPPPPPPPPPPP
PPPPPPPPPP
MPPMPPPPP
4
40
0
1001,0
1001,001,0101,0
01,0101,0101,01
−
−
+++⋅−++=
+−−⋅+−+=
−⋅−⋅⋅+−⋅+=
O rendimento do processo global é dado por: ( )
( ) ( )
( )
( )( )
XPEPEPXPG
XPEPEPXPG
XPEPXPG
XPEPXPG
XE
PXPG
G
XEPXPG
PRPRPRPPP
PRPRPRPPPPRPRPPP
MPMPRPPP
MMP
MMPPP
MPerdidaMassa
MMPMPMPPerdidaMassa
4
0
000
00
1001,001,0
10001,010010001,01100100
01,01100100100
100100_
10001,001,001,0_
−−++=
÷−++=−⋅⋅++=
−⋅⋅++=
×⋅+⋅+==⋅
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛×⋅⋅+⋅⋅+⋅⋅=
R−
(equação 6)
( ) ( ) ( ) (( ) ( )[ ]
[ ]
EXPG
EXPG
XEEXEXPG
XEEXPG
XEPEPXPPG
RRRR
RRRR
RRRRRRRR
RRRRRR
RRRRRRRRR )PComo
4
4
4
4
4
10
10
1001,001,0101,001,01
1001001,001,0101,011
1001001010001,010001,0100100100:
−
−
−
−
−
=
−=−
−++−−−⋅=−
−⋅+−+−+−+−⋅=−
−⋅−⋅−−⋅+−⋅+−=−
=
4. 4. Branqueamento químico
Após o estudo feito nos itens 4.3.1 e 4.3.2 foi escolhida apenas uma xilanase e
determinado o melhor mediador para o sistema lacase-mediador.
O branqueamento combinado, com o uso de enzimas e reagentes químicos de
branqueamento pode ser feito para a obtenção de polpas de dissolução. Os reagentes químicos
de branqueamento utilizados foram o peróxido de hidrogênio e a extração alcalina, assim o
branqueamento químico das polpas foi feito por um processo totalmente livre de cloro (TCF)
de modo a se obter polpas de dissolução.
4. 4.1. Estágio com peróxido de hidrogênio
O branqueamento das polpas organosolv de palha foi feito em sacos de polietileno, em
banho termostatizado, com 30 g de polpa seca, a temperatura de 60°C, por 1 h, com pH entre
8 a 12,2, polpa com consistência 5% e peróxido de hidrogênio 5% (massa relação a polpa).
4. 4. 2. Estágio com hidróxido de sódio
A extração alcalina com hidróxido de sódio tem como objetivos principais remover a
lignina transformada pela reação com peróxido, que não foi totalmente eliminada pelas
lavagens anteriores e reduzirem a quantidade de polioses que, por ventura, ainda estejam na
polpa. Este estágio tem característica depuradora.
A extração alcalina das polpas foi feita em erlenmeyer, em banho termostatizado, com
20 g de celulose (base seca), a temperatura de 65°C, por 1 h, com hidróxido de sódio 3%
(relação massa polpa), pH inicial 11,5-12,0 e polpa com consistência 3-5%. Ao término da
reação, o material foi filtrado em funil de Büchner e lavado exaustivamente até o filtrado não
apresentar mais coloração.
4. 5. Obtenção de derivado de celulose
A metodologia de obtenção de carboximetilcelulose foi adicionar em um frasco de 500
mL com três bocas 5 g de polpa branqueada, 92,5 g de etanol, 3,7 g de água e uma solução de
hidróxido de sódio (5 g de NaOH e 8 g de água); a mistura foi agitada mecanicamente e a
temperatura de reação foi de 15± 5°C por 1 h.
Após a alcalinização, foi adicionada na mistura reacional uma solução de ácido
monocloroacético (AMA) e etanol a 50% em massa (6,5 g de AMA e 6,5 g de etanol). Essa
adição foi feita a 20°± 5°C. Terminada a adição a temperatura foi elevada a 60°C e a reação
foi deixada por 3 h. Terminado o tempo de reação, a mistura foi drenada e a fase sólida
suspensa em metanol a 70% e neutralizada com ácido acético a 90%. A suspensão foi filtrada
e o precipitado foi lavado repetidamente com etanol e seco em estufa a 60°C (SILVA et al.,
1997).
O ganho de massa da carboximetilcelulose foi detrminado pela equação 7.
% GM = [ (MCMC – Mpb )/Mpb] *100 (equação 7)
em que %GM = ganho de massa,
MCMC = massa de carboximetilcelulose (g),
Mpb = massa de polpa branqueada (g).
5. ANÁLISE DOS RESULTADOS
5. 1. Determinação do rendimento de polpação
O rendimento das polpas obtidas no item 4.1.2. foi determinada pela diferença entre a
massa de palha antes da polpação com a massa de polpa obtida após o término da polpação. O
rendimento bruto das polpações pode ser dado por:
R (%) = (m/M)* 100 (equação 8)
em que R (%) = rendimento da polpação em porcentagem, m= massa de polpa, em gramas, M= massa de palha, em gramas.
5. 2. Viscosidade
A viscosidade está relacionada com o grau de polimerização da celulose e
indiretamente, com a resistência do papel.
Para as determinações de viscosidade das polpas obtidas foi utilizado um viscosímetro
Ostwald-Fensk de 200 mL imerso em banho termostatizado a 25,0 ± 0,1°C, seguindo-se a
metodologia padrão TAPPI (1982).
O líquido foi aspirado até ultrapassar as duas marcas de calibração e deixado escoar.
Foi determinado o tempo necessário para o menisco do líquido passar entre as 2 marcas,
utilizando-se um cronômetro. Conhecendo-se os valores de densidade e viscosidade do H2SO4
98% na temperatura de medida, pôde-se calcular a constante do viscosímetro pela equação 9.
A medida foi repetida 3 vezes.
kv = V/(t*d) (equação 9)
em que: k = constante do viscosímetro (cP.s-1
. g-1
. cm3);
V = viscosidade do H2SO4 a 25°C = 19,25 cP (TAPPI, 1982);
d = densidade do H2SO4 a 25°C = 1,84 g.cm-3 (WEAST, 1984);
t = tempo de escoamento (s).
A viscosidade das polpas foi determinada por método padrão (TAPPI, 1982). Em
béqueres pesaram-se exatamente 0,125 g (com precisão de 0,1 mg) de polpa seca e em
seguida adicionaram-se 25 mL de etilenodiamina cúprica (solução 0,5 mol.L-1 em Cu2+). A
mistura foi agitada magneticamente por 30 min. Após esse tempo, a mistura foi filtrada em
cadinho de vidro sinterizado (nº 3) e transferida para o viscosímetro, previamente aferido. A
solução foi aspirada e o tempo de escoamento foi medido com um cronômetro como descrito
anteriormente. O cálculo de viscosidade da polpa foi determinado pela equação 10:
V = k*t*d (equação 10)
em que: V = viscosidade da solução (cP);
k = constante do viscosímetro (cP.s-1
.g-1
.cm3 );
t = tempo de escoamento (s);
d = densidade da solução de celulose (1,052 g.cm-3
- TAPPI, 1982);
5. 3. Número kappa
O número kappa é uma medida do teor de lignina residual na polpa e foi determinado
pela oxidação por permanganato de potássio e titulação com tiossulfato de sódio, seguindo-se
metodologia padrão TAPPI (1985).
Amostras das polpas, com massas entre 0,30 e 0,35 g (com precisão de 0,1 mg), foram
pesadas em béqueres, e cada uma delas foi suspensa em 10 mL de água destilada. Cada
suspensão de polpa foi transferida com 140 mL de água para um erlenmeyer de 500 mL que
foi mantido a 25°C sob agitação magnética.
Misturaram-se 25,00 mL de uma solução padrão de KMnO4 0,1 eq.L-1 (recém
preparada) com 25,00 mL de H2SO4 4 eq.L-1 em um erlenmeyer de 125 mL, que foi mantido a
25°C sob agitação magnética (solução A).
A solução A foi adicionada quantitativamente a cada erlenmeyer contendo a suspensão
de polpa, utilizando-se 50 mL de água destilada para lavar as paredes do erlenmeyer. Após
exatos 10 min (medidos com um cronômetro) foram adicionados 5,0 mL de uma solução de
KI 1,0 eq.L-1. Essa mistura foi titulada com uma solução padronizada de Na2S2O3 0,2 eq.L-1
até próximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor castanha). Foram adicionados 2,5
mL de uma solução de amido 2% (m/v) e a titulação continuada até a viragem de azul a
incolor.
Adicionalmente foi quantificado o consumo de KMnO4 sem a adição de polpa
(branco), substituindo-se a suspensão de polpa por 150 mL de água destilada e seguindo-se o
mesmo procedimento descrito acima.
O número kappa foi determinado pelas equações 11 a 13 (TAPPI, 1985).
P = [(b - a).N]/0,1 (equação 11)
f = 0,0084*P + 0,895 (equação 12)
nº k = P*f* [1 + 0,013.* (25 - T)]/W (equação 13)
em que: P = volume de KMnO4 que reagiu (mL);
a = volume de Na2S2O3 consumido pela amostra (mL);
b = volume de Na2S2O3 consumido pelo branco (mL);
f = fator de correção determinado para cada P;
N = normalidade da solução de Na2S2O3;
T = temperatura da análise (°C);
W = massa da polpa seca (g);
nº k = número kappa.
5. 4. Alvura
A alvura das polpas foi determinada de acordo com a norma TAPPI 452 om-98. Os
corpos de prova foram preparados seguindo a norma TAPPI T- 218 sp-97. Cerca de 3 gramas
de polpa (base seca) foram desagregadas por 5 minutos, a pH 5,5 e consistência de
aproximadamente 0,3%. Após desagregação, a suspensão de polpa foi vertida em um funil de
Büchner de 110 mm de diâmetro e filtrada a vácuo. Após filtração, o funil foi invertido e a
polpa foi liberada utilizando-se fluxo de ar. A folha de prova assim formada foi então
prensada (10-12 kgf/cm2) durante 90 segundos e colocada para secar em ambiente protegido
da luz. A alvura das polpas foi determinada em um aparelho Photovolt modelo 577. A
porcentagem de reflexão foi determinada a 457 nm em cinco pontos diferentes das polpas e os
resultados foram apresentados como média destas medidas. A gramatura, ou seja, a massa por
unidadede área do papel, foi calculada através da equação 14:
g = (m/A)*104 (equação 14)
em que: g = gramatura (g/cm2),
m = massa do corpo de prova (g),
A = área do corpo de prova (cm2).
5. 5. Hidrólise ácida da polpa
Foi feita para a caracterização química da palha ou da polpa para quantificar os
carboidratos presentes e avaliar a extensão da ação enzimática. Foi utilizado o método
modificado de Klason (ASTM, 1956).
Amostras de 2 g de palha (moída a 30 mesh) ou 1 g da polpa seca, pesados com
precisão de 0,1 mg, foram transferidos para um béquer de 100 mL e tratados com 10 mL de
H2SO4 72% (p/p), sob vigorosa agitação, em um banho termostatizado a 45,0 ± 0,5°C por 7
min. A reação foi interrompida com a adição de 50 mL de água destilada. A amostra foi
transferida quantitativamente para um frasco erlenmeyer de 500 mL, elevando-se o volume de
água a 140 mL.
Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, o erlenmeyer foi fechado com
papel alumínio e autoclavado por 30 min a 1,05 bar. Após a descompressão da autoclave, o
frasco foi retirado e resfriado à temperatura ambiente, sendo a mistura reacional filtrada e o
hidrolisado transferido para um balão volumétrico de 250 mL, diluído com água destilada e
armazenado para análise posterior (SILVA, 1995).
5. 5. 1 .Determinação de carboidratos e ácidos orgânicos por CLAE
Uma alíquota de 20 mL do hidrolisado, obtido no item 5.5, foi diluída com água
destilada em balão volumétrico de 25 mL após elevar-se o pH da solução com NaOH 2
mol.L -1 de 0,6 para a faixa de 1 a 3.
O hidrolisado ácido foi extraído em cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18
(Waters), para a remoção de compostos aromáticos e, então, injetado diretamente em uma
coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories Ltd) em um cromatógrafo
Shimadzu LC-10AD. Como fase móvel foi empregado H2SO4 0,005 mol.L-1 com fluxo de 0,6
mL.min-1, a 45°C. Os compostos foram monitorados com um detector de índice de refração
Shimadzu RID-6 A.
5. 5.2. Determinação de lignina insolúvel (lignina Klason)
O material insolúvel retido no papel de filtro obtido no item 5.5. (lignina Klason) foi
lavado com aproximadamente 1,8 L de água destilada e secos em estufa a 110°C até massa
constante. A percentagem de lignina insolúvel (Klason) foi calculada em relação à massa de
polpa seca.
5. 5. 3. Determinação do teor de cinzas (lignina Klason)
O material obtido no item 5.5 foi colocado em um cadinho de porcelana previamente
calcinado e tarado. Em seguida, foi calcinado inicialmente a 400°C e depois por mais 2 h a
800°C. Após a calcinação, o cadinho foi resfriado em dessecador e a massa de cinzas
determinada. A massa de cinzas da lignina foi usada para corrigir o teor de lignina insolúvel
(por diferença).
5. 5. 4. Determinação da lignina solúvel
A quantidade de lignina solúvel foi determinada pela medida de absorbância a 280 nm
em um espectrofotômetro Shimadzu UV-150-02.
Foram colocados 5 mL do hidrolisado (obtido no item 5.5) em um balão volumétrico
de 100 mL. Foram acrescentados 50 mL de água destilada e 40 gotas de NaOH 6,5 eq.L-1.
Após agitação, o volume foi completado com água destilada. A linha base foi medida com
uma solução de NaOH 6,5 eq.L-1 a leitura da solução de hidrolisado foi feita a 280 nm em
celas de quartzo.
5. 5. 5. Determinação de furfural e hidroximetilfurfural
Furfural e hidroximetilfurfural foram determinados por CLAE, em uma coluna
LiChrospher 100 RP-18 (5μm) de 125 x 4 mm (Hewlett-Packard), utilizando-se
acetonitrila/água 1:8 (v/v) com 1% de ácido acético como fase móvel, a uma vazão de 0,8
mL.min-1 a 25°C. O hidrolisado foi previamente diluído com água na razão de 1:100, filtrado
em membrana de diâmetro de poro de 0,47 μm (Milipore), e injetado com uma válvula
Rheodyne equipada com alça de injeção de 20 μL. Os compostos foram detectados a 276 nm,
em um detector UV/Visível Shimadzu SPD-10. As concentrações de furfural e
hidrometilfurfural foram determinadas a partir de curvas de calibração obtidas com os
compostos puros.
5. 6. Espectros no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
Os espectros de FTIR foram obtidos diretamente das amostras de polpa utilizando a
técnica de reflexão atenuada (ATR) em um equipamento Nicolet Avatar 320. Após correção
na linha de base pelo método poligonal (FAIX, 1991), os espectros foram normalizados pela
absorção a 900 cm-1, correspondendo à vibração do grupo O-C-O envolvendo o carbono-1
(anomérico) dos polissacarídeos. A análise por componentes principais (PCA) foi utilizada
para a classificação dos espectros.
A análise dos derivados de celulose também foram feitos por espectrofotometria no
infravermelho.
5. 7. Análise por componentes principais (PCA) dos espectros FTIR
Os espectros de FTIR das polpas branqueadas e não branqueadas foram convertidos
para arquivos texto usando o software OMNIC (Nicolet, Inc.). O conjunto de dados para cada
espectro foi submetido ao cálculo de PCA usando os programas BIOTEC e FAEN
compilados em FORTRAN, que foram escritos em nosso laboratório, adaptados da literatura
(SCARMÍNIO e BRUNS, 1989).
5. 8. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A palha de cana e as polpas etanol-água foram presas em um suporte com auxílio de
fita de carbono e submetidas ao recobrimento metálico com ouro, espessura de 7 μm com
uma voltagem de 40 mA sob atmosfera de argônio. As amostras metalizadas foram
submetidas a análise em microscópio eletrônico de varredura 1450 V (equipamento
disponível no Departamento de Materiais operando a 20 kW e utilizando detector de elétrons
secundários. As amostras foram dispostas de forma que seja possível observar as
modificações superficiais das fibras da palha e das polpas organosolv.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A palha de cana-de-açúcar utilizada neste trabalho foi cedida pela Usina Ester
localizada em Cosmópolis-S.P. A tabela 6.1 traz a composição química da palha utilizada
neste trabalho e dados de palha de trigo e de arroz (PAN e SANO, 2005). De acordo com
PAN e SANO (2005) as palhas de trigo e arroz apresentam teores de glucana e lignina
similares, porém a palha de cana-de-açúcar apresenta menores quantidades de glucana e de
pentosana do que as palhas de trigo e arroz. A palha de arroz apresenta elevado conteúdo de
cinzas (16,5%) e a palha de cana apresenta elevado teor de extrativos (5,27%).
Tabela 6.1. Composição química de palhas de cana, trigo e arroz. Componente (%) Canaa Trigo Arroz Glucana 36,1 ± 0,5 55,4 57,7 Pentosana b 28,3 ± 0,1 40,2 33,0 Lignina total 26.2 ± 0,5 19,0 ± 0,5 18,5 ± 0,6 Cinzas 2,1 ± 0,2 9,6 ± 0,2 16,5 ± 0,3 Extrativos 5,27 ± 0,1 5,3 ± 0,2 3,1 ± 0,1
aPalha de cana utilizada neste trabalho. bPentosanas incluso grupos acetila, grupos acetila= 1,45 ± 0,1
Para o estudo morfológico da palha de cana utilizada neste trabalho foram feitas
microscopias eletrônicas de varredura (MEV). A palha de cana apresenta uma camada na
superfície externa (filme) protetivo.
Na figura 6.1 observam-se vários vacúolos que podem ser bem observados na
micrografia (C) da figura 6.1, que não é comum no bagaço de cana.
(C) (A) (B)
Figura 6.1. Micrografia eletrônica de varredura (A) palha in natura (ampliação de 100x), (B) palha in natura (ampliação de 500 x) e (C) palha in natura (ampliação de 10.000 x).
6. 1. Polpação acetosolv da palha de cana
Na literatura não existem dados sobre a polpação acetosolv de palha de cana e apenas
dados sobre a polpação de outros tipos de palha como palha de trigo com ácido acético (PAN
E SANO, 2005), palha de trigo com acetona-água (JIMÉNEZ et al., 1998), palha de arroz
com ácido fórmico (LAM et al., 2001).
De acordo com VÁZQUEZ e colaboradores (1997) para polpações acetosolv de
madeira o grau de deslignificação é mais evidente para tempos de reação de 4 a 6 h de reação.
Neste trabalho os estudos de polpação acetosolv da palha foram feitos de 1 a 6 h de reação. A
relação biomassa/solvente utilizada nos estudos de polpação acetosolv da palha de cana foram
baseadas nas condições feitas para bagaço de cana de acordo com BENAR (1992), porém
com o uso da relação biomassa solvente de 1:14 (m/v) não houve a formação de polpa. As
polpações acetosolv da palha foram feitas utilizando-se a relação palha/solvente de 1/20
(m/v), 0,4% de HCl (relação à massa de polpa seca) como catalisador, por 6 horas de reação,
no entanto, mas utilizando-se esta relação biomassa/solvente não houve a formação de polpa.
A relação biomassa/solvente foi alterada para 1/30 (m/v) por períodos de reação de 1 a
6 h. Mesmo aumentando a relação biomassa/solvente, nas reações feitas com 1 e 2 h não
houve a formação de polpa. Os resultados de rendimento e as propriedades de viscosidade,
número kappa e a composição química das polpações realizadas com 3 a 6 h de reação estão
apresentados na tabela 6.2.
A palha de cana utilizada neste trabalho possuía 1,45% de grupos acetilas (tabela 6.1)
e pode-se observar que ocorreu a incorporação de grupos acetilas no processo de polpação da
palha, esta incorporação foi aumentada de acordo com o aumento do tempo de polpação,
como pode ser observado na tabela 6.1. De acordo com PAN E SANO (2005) durante a
polpação com ácido acético ocorre a incorporação de grupos acetil em grupos hidroxil da
lignina e nos carboidratos.
De acordo com a tabela 6.2, com 3 h de polpação o rendimento de polpação foi de
45% e aumentando-se o tempo de polpação para 4 a 6 h, o rendimento passou a ser de 54 a
56%. Com o aumento do tempo de polpação ocorreu a diminuição da viscosidade das polpas.
O aumento do tempo de polpação de 3 a 6 h degradou as polioses e conseqüentemente
verificou-se a diminuição da viscosidade das polpas. Verificou-se também o aumento do
número kappa das polpas acetosolv com o aumento do tempo de polpação, ocasionando,
provavelmente a reprecipitação da lignina nas fibras celulósicas (VÁSQUEZ et al., 1997). A
partir de 3 h de polpação não verificou-se o aumento da deslignificação das polpas, atingindo-
se um patamar com 3 horas de reação.
A partir dos resultados apresentados na tabela 6.2, determinou-se que a melhor
condição de polpação acetosolv da palha foi 3 h de reação com relação biomassa/solvente de
1/30 (m/v), pois para polpas celulósicas o ideal é a polpa apresentar uma maior viscosidade
(preservação da celulose), menor número kappa (menor quantidade de lignina residual) e o
maior conteúdo em glucana. Cerca de 30 bateladas de polpação acetosolv da palha foram
feitas na condição determinada como a melhor, obtendo-se um rendimento de 48,84 a 50%
em polpa bruta.
As polpas obtidas nestas bateladas foram homogeneizadas e caracterizadas quanto à
composição química, viscosidade e número kappa. A polpa apresentou a seguinte composição
química: 50,57 ± 0,49% de glucana, 11,09 ± 0,34% de pentosanas 5,54 ± 0,02% de ácido
acético, 25,67 ± 0,34% de lignina total e 5,22 ± 0,16% de cinzas. A viscosidade da polpa
acetosolv foi de 5,55 ± 0,15 cP e o número kappa da polpa foi de 58,02 ± 1,67. A polpa
acetosolv tratada somente com NaOH 0,5 % (m/v) apresentou viscosidade de 6,54 ± 0,43 cP e
número kappa 39,24 ± 0,34. Esta polpa foi utilizada nos estudos de biobranqueamento com
xilanase.
Apesar de poucos dados, há uma correlação quase linear entre número kappa e teor de
lignina residual. Com r2 = 0,8 tem-se a relação % lignina = 0,295 kappa + 16,4. É uma
correlação diferente da obtida anteriormente para o bagaço.
Na polpação acetosolv da palha de cana-de-açúcar existe uma correlação entre a
viscosidade e os componentes da polpa. Através de uma matriz com três incógnitas e três
variáveis foi possível determinar a relação da viscosidade com a glucana, pentosana e lignina
no processo de polpação acetosolv da palha. Dessa forma: viscosidade (cP) = 0,063* glucana
(%) + 0,372 * pentosana (%) -0,096 * lignina total (%). Essa correlação da viscosidade com
os componentes da polpa demonstou que a viscosidade é pouco influenciada pela glucana
(0,063), a pentosana tem grande influência na propriedade de viscosidade e a lignina possui
influência negativa na viscosidade das polpas.
No processo de polpação da palha houve a perda de componentes da palha (glucana,
xilana e lignina total). Conforme a tabela 6.3, no processo de polpação houve a perda de cerca
de 20% de glucana, em tempos maiores de polpação houve a degradação em maior extensão
das polioses, porém o aumento do tempo de polpação não solubilizou a lignina.
O sinal negativo nos valores de perda de grupos acetilas significa que não houve perda
deste componente e sim que houve incorporação destes grupos na polpa, incorporação esta
que aumentou com o aumento do tempo de polpação, fato que pode ser confirmado também
pela composição química da polpa apresentado na tabela 6.2.
A incorporação de grupos acetilas foi observada também em polpações acetosolv de
bagaço de cana, incorporação de até 12% de grupos acetilas nas ligninas isoladas (DE
GROOTE et al., 1991).
Tabela 6.2. Resultados de rendimento de polpação, viscosidade, número kappa e composição química de polpas acetosolv de palha de cana. Tempo de polpação 3 h 4 h 5 h 6 h Rendimento (%) 45,47 ± 2,80 54,43 ± 2,09 54,92 ± 5,44 56,13 ± 4,31 Viscosidade (cP) 7,49 ± 0,82 6,74 ± 0,45 5,59 ± 0,39 4,86 ± 0,39 Número kappa 16,59 ± 0,89 14,0 ± 0,83 29,61 ± 1,62 31,96 ± 2,00 Glucana (%) 59,80 ± 2,76 62,58 ± 2,38 59,31 ± 3,15 59,13 ± 2,89 Pentosana (%) 12,62 ± 0,36 12,47 ± 0,09 11,39 ± 2,19 9,76 ± 0,10 Grupos Acetila (%) 3,14 ± 0,33 3,46 ± 0,80 4,19 ± 0,69 4,61 ± 0,04 Lignina total (%) 23,02 ± 2,33 19,12 ± 2,91 24,75 ± 5,15 25,92 ± 3,50 Cinzas (%) 4,53 ± 0,76 5,81 ± 0,42 4,53 ± 0,19 5,21 ± 0,76
Tabela 6.3. Perda de componentes na polpação acetosolv. Perda de Componente
3 h 4 h 5 h 6 h
Glucana (%) 20,17 ± 3,90 21,93 ± 1,20 24,29 ± 2,91 23,51 ± 2,20 Xilana (%) 77,09 ± 2,46 76,35 ± 3,65 75,86 ± 0,74 86,50 ± 0,12 Lignina Total (%) 69,91 ± 3,12 67,71 ± 0±,89 65,71 ± 2,98 51,29 ± 1,48 Grupos Acetila (%) -32,75 ± 1,26 -33,37 ± 3,10 -54,16 ± 0,47 -58,47 ± 1,43
6. 2. Polpação etanol-água da palha
Segundo TOMAZ (1996) a caracterização morfológica das fibras celulósicas da palha
de tabaco: comprimento médio de 1,24 mm, valor intermediário entre o das fibras do
eucalipto (1,0 mm) e do Pinus (4,0 mm), principais fontes de matérias-primas celulósicas,
para as demais dimensões da fibra, os valores médios obtidos foram de 4,33, 4,15 e 12,80
mm, respectivamente, para a espessura da parede celular, diâmetro do lume e largura da fibra,
embora os rendimentos em fibras, tanto no processo ácido (34,63%) como no básico (33,97%)
tenham sido relativamente baixos, esse material, pelas características micrométricas das
fibras, pode ser utilizado na obtenção de celulose e papel, para usos que requeiram baixos
níveis de resistência. Apesar da possibilidade de fabricar papel com fibras de palha de cana,
neste trabalho optou-se por fazer polpações para a obtenção de polpas de dissolução.
Para os estudos das melhores condições da polpação etanol-água da palha de cana
foram feitos dois planejamentos experimentais. Os parâmetros de tempo e temperatura
escolhidos no primeiro planejamento fatorial foram definidos de acordo com dados da
literatura para estudos de polpação etanol-água de palha de trigo (JIMÉNEZ et al., 1999), pois
não existem dados na literatura sobre polpação etanol-água de palha de cana.
Na tabela 6.4 estão apresentados os valores de tempo e temperatura estudados no
primeiro planejamento fatorial 22.
Nos estudos da polpação etanol-água da palha de cana, nos experimentos realizados a
150 e 170ºC, em reator de 200 mL, não houve a formação de polpa em tempos de 1 a 4 h de
reação, a 190ºC por 1 h houve a formação de polpa com rendimento de 52% e com 4 h de
reação o rendimento de polpação foi de 60%, porém as polpas obtidas eram visualmente
muito escuras e apresentaram respectivamente, o número kappa 52,76 e 59,08.
Tabela 6.4. Valores de tempo e temperatura e matriz do planejamento fatorial.
Temperatura (°C) 150 170 190 Tempo (h) 1 2,5 4 Nível -1 0 +1
Ensaio Temperatura Tempo 1 + + 2 - + 3 + - 4 - - 5 0 0 6 0 0
A partir destes resultados optou-se por fazer um segundo planejamento fatorial, devido
as condições usadas neste primeiro planejamento não terem se mostrado adequadas para a
obtenção de polpas celulósicas com alto teor de celulose e baixo de lignina. O primeiro
planejamento experimental mostrou que para a polpação etanol-água da palha de cana era
necessário utilizar temperaturas maiores que 170ºC e tempos menores que 4 h de reação,
assim no segundo planejamento fatorial foram utilizadas temperaturas que variaram de 185 a
215ºC e tempos de polpação de 1,5 a 2,5 h.
De acordo com a tabela 6.5, para uma mesma temperatura de polpação, o aumento do
tempo de reação, proporcionou aumento do rendimento em polpa. Em polpas obtidas a 185ºC,
o aumento de 1 h no tempo de polpação ocasionou a diminuição da viscosidade das polpas de
12,17 para 10,64 cP. Esta diminuição de viscosidade foi acompanhada pela degradação das
pentosanas, pois a polpa obtida a 185ºC com 1,5 h de reação apresentou 14,12% de pentosana
e a polpa obtida com 2,5 h de reação apresentou 11,83% de pentosana (redução de 16,2%).
Em temperaturas maiores (215ºC) o aumento do tempo de reação, ocasionou a
diminuíção da viscosidadde das polpas em 18,2% (215ºC/1,5 h= 5,38 cP e 215ºC/2,5 h = 4,4
cP). No entanto, a 215 ºC o aumento de uma hora de reação ocasionou a redução de pentosana
de 9,6% (2,49 e 2,25% de pentosana), redução esta menor do que nas polpações realizadas a
185ºC. Na temperatura de 215ºC a polpa apresentou 33% de lignina, quantidade esta maior do
que nas polpações realizadas a 185 e 200ºC, e conseqüentemente, o número kappa da polpa
foi elevado (61). Na temperatura de 215ºC, provavelmente a lignina que foi solubilizada no
processo de polpação já esteja reprecipitando na polpa, ou ainda, nesta temperatura ocorreram
reações de condensação da lignina, acarretando a alta quantidade de lignina insolúvel presente
na polpa. No processo de polpação organosolv ocorre a reprecipitação da lignina sobre as
fibras celulósicas levando ao alto número kappa das polpas (XU et al., 2007).
Tabela 6.5. Resultados de rendimento de polpação, viscosidade, número kappa e composição química de polpas etanol-água obtidas no segundo planejamento fatorial. Temp.(°C)/Tempo (h) 185/ 1,5 185/2,5 200/2,0 200,0/2,0 215/1,5 215/2,5 Rendimento (%) 45,18 47,49 51,67 52,85 53,75 55,61 Viscosidade (cP) 12,17 10,64 6,97 7,46 5,38 4,40 Número kappa 59,14 54,45 58,99 61,02 64,40 61,40 Glucana (%) 57,47 58,64 62,20 63,63 59,65 60,29 Pentosana (%) 14,12 11,83 6,07 6,49 2,49 2,25 Lignina total (%) 25,56 26,11 26,82 25,67 33,31 33,08 Cinzas (%) 2,84 3,41 4,90 4,21 4,55 4,37
Uma correlação da viscosidade pode ser feita com os componentes da polpa etanol-
água da cana: viscosidade (cP) = -0,408* glucana (%) + 2,303 * pentosana (%) + 0,720 *
lignina total (%). Na polpação etanol-água da cana a glucana muito pouco influenciou a
viscosidade, a maior influência foi dada pela pentosana. O alto número kappa das polpas
etanol-água pode ser explicado pela topoquímica de deslignificação. De acordo com
NIKKHIL e PASZNER (1989) na polpação etanol a lignina presente na lamela média e nos
cantos da célula são removidas preferencialmente à lignina da parede secundária.
A partir dos resultados apresentados na tabela 6. 5, para a polpação etanol-água de
palha de cana escolheu-se a temperatura de 200ºC e 2 h de reação, pois nestas condições o
rendimento de polpação foi maior do que na polpação realizada a 185ºC, porém menor do que
a 215ºC. No estudo de polpação devem ser avaliados a composição química das polpas e as
propriedades físicas devem ser levadas em conta de acordo com o destino das polpas. Assim
para a polpação etanol-água da palha foi escolhido a condição de polpação em que a polpa
apresentou menor número kappa, maior rendimento e quantidade de pentosana menor (mesmo
em detrimento da viscosidade da polpa).
A partir dos resultados do segundo planejamento fatorial foi feita uma ampliação de
escala em reator de 40 L, utilizando-se 200ºC e 2 h de polpação. Na ampliação de escala, em
reator de 40 L, o rendimento de polpação foi de 35,8% valor considerado baixo, pois para
polpações químicas o rendimento é em torno de 50% (CURVELO et al., 1991). A
composição química da polpa obtida na ampliação de escala foi 54,8 ± 2,5 % de glucana, 2,7
± 0,1 % de pentosana, 4,0 ± 0.1 % de ácido fórmico, 24,5 ± 0,1 % de lignina total e 3,6 ±
0,1% de cinzas (polpa etanol-água 1). Esta polpa apresentou viscosidade de 3,14 ± 0,11 cP,
viscosidade baixa comparada a polpas kraft de eucalipto (25 cP) (DUARTE et al., 2003) e que
reflete o baixo conteúdo de pentosanas (2,7%). A polpa etanol-água de palha apresentou
número kappa 60,9 ± 2, considerado um valor de número kappa alto devido a precipitação da
lignina na polpa que estava dissolvida no licor de polpação. As polpas organosolv usualmente
possuem número kappa alto mas são facilmente branqueáveis (XU et al., 2007).
Na reação realizada em reator de 40 L não houve a reprodução dos resultados obtidos
na polpação realizada a 200°C por 2 h no reator de 200 mL, pois houve grande degradação
das pentosanas, ou seja, a polpa obtida no reator de 200 mL apresentou em torno de 6% de
pentosana e a polpa obtida na apliação de escala apresentou 2,7% de pentosanas. Esta grande
diferença de composição química da polpa pode ser explicada devido ao reator de 40 L levar
cerca de 3 h para atingir a temperatura de 200ºC e levar cerca de 18 h para esfriar até
temperatura ambiente e poder ser descarregado. Esses fatores de operacionalidade do reator
devem ter influenciado grandemente na degradação da polpa e reprecipitação da lignina sobre
as fibras da polpa. Esta condição de polpação etanol-água para a palha de cana não se mostrou
adequada para obter polpas com alto conteúde de glucana e baixo teor de lignina.
Outra polpação ethanol-água da palha de cana-de-açúcar foi feita no reator de 40 L,
nas mesmas condições descritas anteriormente, no entanto, foi utilizada a temperatura de
160ºC. Após o resfriamento do reator, o reator foi aberto e a palha ainda se encontrava inteira,
porém estava cozida e foi desfibrada por agitação mecânica, lavada com água comum e
classificada. O rendimento de polpa bruta foi de 38,4% e de polpa classificada foi de 87,8%.
A polpa etanol/água classificada apresentou a composição química: 51,8 ± 0,4 % de glucana,
9,9 ± 0,2% de pentosanas, 26,3 ± 0,3% de lignina total e 2,4 ± 0,1% de cinzas. Esta polpa
etanol-água de palha apresentou viscosidade 13,9 ± 1,2 cP e número kappa 52,7 ± 0,30 (polpa
etanol-água 2).
Para uma caracterização morfológica das polpas etanol-água (2) foram feitas
micrografias de varredura eletrônica na polpa etanol-água (2) não classificada, (figura 6.2), do
rejeito da classificação (figura 6.3) e da polpa etanol-água (2) classificada (figura 6.4).
Na figura 6.3 estão apresentadas as micrografias do material que não passou na
peneira do classificador e que foi considerado como rejeito grosso. Na micrografia (A)
existem muitos feixes de fibras unidos que apresentam vacúolos e na micrografia (B) que é
uma ampliação de uma fibra da figura (A) pode-se observar melhor a estrutura na forma de
vacúolo e pode-se observar alguns elementos esféricos que pode ser a lignina reprecipitada na
superfície da fibra.
Na figura 6.4 (A) na micrografia da polpa etanol-água (2) classificada é possível
observar fibras de celulose finas, longas e achatadas (indicado por setas) soltas, na
micrografia (B) a fibra apresenta diversos vacúolos ao longo da fibra e na figura (C) está
mostrada a estrutura de uma célula de um traqueídeo.
6 .3. Tratamento enzimático da polpa acetosolv
6. 3. 1. Xilanase de Humicola grisea
A polpa acetosolv foi submetida ao tratamento com xilanase recombinante de
Humicola grisea var. thermoidea com cargas enzimáticas que variaram de 1 a 50 unidades
por 2 h e 150 unidades de enzima por 20 h. Os resultados de viscosidade e número kappa das
polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas enzimáticas e seguidas de extração alcalina
estão apresentados na figura 6.5.
(A) (B)
Figura 6.2. Micrografia eletrônica de varredura (A) polpa etanol-água (2) não classificada (ampliação de 100 x), (B) polpa etanol-água (2) não classificada (ampliação de 500 vezes).
(A) (B)
Figura 6.3. Micrografia eletrônica de varredura do rejeito grosso da classificação da polpa etanol-água (2) (a) ampliação de 100 vezes e (b) ampliação de 500 vezes.
(A) (B) (C)
Figura 6.4. Micrografia eletrônica de varredura (A) polpa etanol-água (2) classificada, (ampliação de 1000 x), (B) polpa etanol-água (2) classificada (ampliação de 2000 x) e (C) polpa etanol-água (2) classificada (ampliação de 10.000 x).
De acordo com a figura 6.5 (A), com baixa dose (1 unidade) de enzima a polpa tratada
com xilanase apresentou viscosidade 15% maior do que a polpa controle (sem enzima) e o
aumento da carga enzimática para 50 e 150 unidades provocaram queda da viscosidade da
polpa, provavelmente ocorrendo a degradação das polioses pela ação enzimática. Nas polpas
tratadas com xilanase seguida da extração alcalina ocorreu leve queda da viscosidade em
relação à polpa sem enzima, possivelmente a remoção dos produtos de ação enzimática
retirados pela extração alcalina afetem a viscosidade das polpas. As polpas tratadas com
xilanase seguida de extração alcalinas tratadas com cargas de xilanse de 20 a 150 unidades
atingiram um patamar de viscosidade (6,5 cP).
Não se observou a queda do número kappa das polpas acetosolv tratadas com as
variadas cargas enzimáticas e somente com 150 unidades de xilanase pode-se reduzir 7% do
número kappa da polpa quando comparado com a polpa controle (sem enzima). As polpas
tratadas com baixas cargas de xilanase (1 e 2 unidades) apresentaram número kappa maior do
que a polpa somente tratada com extração alcalina e somente com altas doses enzimáticas (50
e 150 unidades de enzima) proporcionaram diminuição de 7 pontos no número kappa
(representando redução de 18%), de acordo com figura 6.5 B.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Vis
cosi
dade
(cP)
X XE (A)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Núm
ero
kapp
a
X XE (B)
Figura 6.5. (A) viscosidade e (B) Número kappa de polpas acetosolv de palha tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina.
A relação viscosidade/número kappa representa a seletividade do tratamento das
polpas. Pela figura 6.6, com baixas cargas de xilanase a seletividade é menor do que ao se
usar altas cargas. No entanto, nas polpas tratadas com xilanase seguida de extração alcalina
pode-se ver que a seletividade, com baixas cargas enzimáticas, (5 e 20 UI/g) a seletividade é
maior do que a da polpa controle e que não é maior do que a seletividade da polpa tratada
com xilanase seguida de extração alcalina por 20 h de tratamento.
A análise dos açúcares redutores liberados nos filtrados dos tratamentos enzimáticos é
um indicativo da ação xilanolítica. Os filtrados dos meios reacionais foram diluídos 1,5 vezes
para a monitoração dos açúcares redutores liberados (Abs540nm).
As polpas acetosolv tratadas com baixas cargas enzimáticas (1 a 5 unidades de enzima
por grama de polpa seca) apresentaram a maior liberação de açúcares redutores e utilizando-
se altas doses de xilanase a liberação de açúcares redutores é a mais alta (figura 6.7).
0 10 20 30 40 50 140 145 150 155
0,08
0,100,14
0,16
0,18
0,20
Sele
tivid
ade
Carga de Enzima (UI/g)
X XE
Figura 6.6. Seletividade (relação viscosidade/número kappa) de polpas acetosolv de palha tratadas com diferentes cargas enzimáticas e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina.
A quantidade de açúcares redutores liberados após a extração alcalina das polpas
tratadas com xilanase é maior do que das polpas tratadas somente com xilanase. Com o uso de
1 a 10 unidades de xilanase a quantidade de açúcar redutor liberado foi de 1,5 mg/g de polpa e
com cargas maiores de xilanase a quantidade de açúcar redutor liberado foi de 1,0 mg/g de
polpa (figura 6.7).
SALLES e colaboradores (2004) trataram polpas Kraft de eucalipto com cargas de 1,5,
2,5 e 5 UI.g-1 de xilanase de H. grisea var. thermoidea por tempos de reação de 1 a 4 h.Com a
carga de 1,5 unidade de enzima por 3 h foi obsevado o máximo de açúcares redutores (1,84
mg/g) e substâncias cromóforas liberadas.
No branqueamento xilanolítico, acredita-se que ocorre a quebra das ligações entre a
lignina e o carboidrato e assim ocorrendo a abertura da estrutura da polpa (PATEL et al.,
1993). Pouco é conhecido sobre a natureza dos compostos que conferem cor à polpa Kraft e
pesquisas atribuem a cor a lignina residual, mas estudos realizados por ZIOBRO (1990 a, b)
indicam que a degradação dos carboidratos é a fonte dos produtos que dão cor a polpa
(PATEL et al., 1993).
0 10 2 0 3 0 40 50 1 40 1 45 1 50 1550 ,0
0 ,1
0 ,8
1 ,0
1 ,2
1 ,4
1 ,6
Açúc
ares
Red
utor
es (m
g/g
polp
a)
C a rga de E n z im a (U I/g )
X X E
Figura 6.7. Açúcares redutores liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv com xilanase de H. grisea.
PATEL e colaboradores (1993) caracterizaram parcialmente os cromóforos liberados
pela ação xilanolítica e observaram que a maioria dos componentes absorve mais fortemente
na região da luz visível.
Os filtrados dos tratamentos xilanolíticos foram diluídos 10 vezes e determinadas as
absorbâncias espectroscopicamente a 237, 254, 280 e 465 nm e foi feito também o espectro
total de 200 a 600 nm de cada filtrado.
A figura 6.8 mostra o perfil de absorção na região do UV das substâncias cromóforas
liberadas no tratamento das polpas acetosolv com xilanase de H. grisea. Na figura 6.8 (A) a
maior carga xilanolítica empregada liberou compostos cromóforos que apresentaram a maior
absorbância. Na figura 6.8 (B) os espectros dos filtrados das polpas tratadas com xilanase
seguida de extração alcalina apresentam uma absorbância forte em 280 nm, indicativo da
presença de compostos fenólicos.
SALLES e colaboradores (2004) trataram polpas Kraft de eucalipto com cargas de 1,5,
2,5 e 5 UI.g-1 de xilanase de H. grisea var. thermoidea por tempos de reação de 1 a 4 h. Na
aplicação de todas as cargas enzimáticas, nas micrografias de varredura foram observados
efeitos similares (peeling) na fibra de celulose.
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,21,31,41,51,61,71,81,92,02,12,22,32,42,5
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 1 2 5 10 20 50 150
00,250,5
0,751
1,251,5
1,752
2,252,5
2,753
3,253,5
3,754
4,254,5
4,755
5,25
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 1 2 5 10 20 50
(B) (A)
Figura 6.8. Espectros de UV de materiais coloridos (cromóforos) liberados durante o tratamento enzimático (A) tratamento de polpas acetosov somente com diversas cargas de xilanase e (B) tratamento de polpas com xilanase seguida de extração alcalina.
Espectros de infravermelho de polpas acetosolv tratadas sem enzima, tratadas somente
com NaOH, tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina foram
feitos e apresentaram perfis semelhantes entre si, como mostra a figura 6.9.
Devido os espectros de infravermelho de polpas acetosolv serem semelhantes fez-se o
tratamento estatístico dos dados, a chamada Análise por Componentes Principais (PCA), para
verificar se seria possível evidenciar alguma diferença entre os espectros. A figura 6.10
mostra os gráficos bidimensionais PC1 x PC2 de polpas tratadas com xilanase recombinante
de H. grisea e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina.
Pelo gráfico dos scores PC 1 x PC 2 das polpas acetosolv tratadas com xilanase, figura
6.10 (A), pode-se diferenciar as polpas tratadas com diferentes cargas enzimáticas: as polpas
tratadas com baixas doses (representadas por pontos na figura 6.10 A) se encontram na parte
inferior do gráfico e estão circuladas por elipse contínua, as polpas tratadas com 50 e 150
unidades de xilanase se encontram na parte superior do gráfico e que não são muito distintas
entre si, devido a proximidade dos pontos (estão circuladas com elipse descontínua).
Apesar dos resultados das propriedades de viscosidade e número kappa das polpas
tratadas com enzima serem próximos à polpa controle a Análise por Componentes Principais
mostrou que estas polpas não são semelhantes. As polpas tratadas com xilanase seguida de
extração alcalina apresentam diferenças entre si (figura 6.10 B), porém estas diferenças não
são tão acentuadas como mostra o gráfico dos scores das polpas tratadas somente com
xilanase, figura 6.10 (A).
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
400900140019002400290034003900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
X 1U X 5U X 10U NaOH XE 5U
Figura 6.9. Espectros de infravermelho de polpas acetosolv tratadas com xilanase de Humicola grisea.
Xilanase
-8-6-4-202468
101214
-30 -20 -10 0 10 20PC1
PC2
controle 1U 2U 5U 10U 20U 50U 150U
(A)
XE
-2
-1
-1
0
1
1
2
2
3
3
-12 -7 -2 3 8PC1
PC2
controle 1U 2U 5U 10U 20U 50U
(B)
Figura 6.10. Correlação entre os scores PC 1x PC2 dos espectros FTIR de polpas acetosolv tratadas (A) tratadas com xilanase de Humicola griseae e (B) tratadas com xilanase seguida de extração alcalina.
Os loadings obtidos a partir dos dados de PCA (componentes principais) possuem as
informações que compõem o gráfico número de onda x absorbância e representam a fração ou
peso de cada componente. Esses loadings são significativos por apresentarem dados de
propriedade química, bem como possíveis modificações em ligações químicas.
Na figura 6.11, o PC 1 traz informações da fibra da polpa e o PC 2 é influenciado
pelas ligações C-O (em torno de 1000 cm-1) característico de éter.
-0,8
-0,7
-0,5
-0,4
-0,2
-0,1
0,1
0,3
0,4
0,6
0,7
50075010001250150017502000
Número de Onda (cm-1)
Load
ing
PC1 PC2
Figura 6.11. Loading obtido dos espectros de FTIR de polpas acetosolv de palha de cana tratadas com xilanase Humicola grisea.
Para as polpas acetosolv, o uso de altas doses de xilanase não melhorara as
propriedades de viscosidade e número kappa das polpas e a análise de açúcares redutores
mostrram que a partir de 20 unidades de xilanase atingiu-se um patamar de açúcares redutores
liberados nos filtrados dos tratamentos xilanolíticos. Pela análise dos cromóforos liberados
nos filtrados das polpas tratadas com xilanase de H. grisea seguida de extração alcalina foi
evidenciado que ocorreu a liberação de compostos fenólicos na presente na polpa (absorção
em 280 nm), apesar desta xilanase não produzir grandes efeitos de redução de número kappa
das polpas.
6. 3. 2. Xilanase de Bacillus pumilus
Polpas acetosolv de palha de cana foram tratadas com xilanase de B. pumilus com
cargas xilanolíticas de 5 a 50 UI/g por 2 h e com 150 UI/g por 20 h de reação.
As polpas acetosolv de palha tratadas com variadas cargas xilanolíticas apresentaram
aumento de viscosidade de 12% em relação a polpa original (polpas tratadas com xilanase
apresentaram viscosidade em torno de 6,2 cP e a polpa original apresentou viscosidade 5,55
cP.
As polpas tratadas com 20 e 50 unidades de xilanase seguida de extração alcalina (XE)
apresentaram aumento de 19,8% na viscosidade (relação polpa somente com NaOH= 6,5 cP e
XE 20 e 50 = 7,84 cP), conforme figura 6.12 (A). As polpas que foram tratadas com 10 e 20
unidades de xilanase apresentaram redução do número kappa de 3,7%, que corresponde a
redução de 2,2 unidades de número kappa (relação polpa original kappa= 58,0 e número
kappa polpas 10 e 20= 55,8). As polpas tratadas com 10 ou 150 unidades de xilanase seguida
de extração alcalina apresentram redução de número kappa de 2 unidades de número kappa e
que representa redução de 5,0% (relação polpa original extraída com NaOH, número
kappa=39,24 e polas XE-10 ou 150, número kappa= 37,22), (figura 6.12 B).
A relação viscosidade/número kappa é dada como a seletividade do tratamento
enzimático, para polpas tratadas com xilanase (X) e polpas tratadas com xilanase seguida de
extração alcalina (XE) o perfil da seletividade dos tratamentos X e XE são semelhantes, a
seletividade das polpas XE são maiores do que das polpas X. A polpa tratada com a carga de
10 unidades de xilanase apresentou a maior seletividade. Ao se utilizar cargas xilanolíticas
maiores que 20 unidades atingiu-se um patamar de seletividade (figura 6.13).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Visc
osid
ade
(cP)
X XE (A)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Núm
ero
kapp
a
X XE (B)
Figura 6.12. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas de xilanase de B. pumilus.
NEETA e RAO (1996) biobranquearam polpas de bagaço de cana quimiomecânicas
com xilanase de Bacillus sp. NCIM 59 com cargas xilanolíticas de 10 a 40 unidades de
xilanase e constataram que com o uso de 10 unidades de xilanase foi o máximo de redução de
número kappa alcançado e que o aumento na carga de enzima não resultou em diminuição do
número kappa das polpas.
0 10 20 30 40 50 140 145 150 1550,08
0,10
0,12
0,16
0,18
0,20
Sel
etiv
idad
e
Carga de Enzima (UI/g)
X XE
Figura 6.13. Seletividade de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus.
O tratamento das polpas acetosolv com xilanase de B. pumilus seguida de extração
alcalina liberou maiores quantidades de açúcares redutores do que somente o tratamento da
polpa com xilanase. No entanto, não houve grande variação da quantidade de açúcar redutor
(0,8 mg por g de polpa) liberado com a variação da carga de enzima (figura 6.14).
0 10 20 30 40 50 140 145 150 155
0,1
0,2
0,7
0,8
0,9
Açúc
ares
Red
utor
es (m
g/g)
Carga de Enzima (UI/g)
X XE
Figura 6.14. Açúcares redutores liberados no filtrado dos tratamentos de polpas acetosolv tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina (xilanase de B. pumilus).
A análise dos cromóforos liberados nos filtrados de polpas acetososolv tratadas com
xilanase mostraram que as polpas tratadas com 5 ou 20 unidades de xilanase produziram
filtrados com a maior absorbância (figura 6.15 (A) e as polpas tratadas com xilanase seguida
de extração alcalina (XE) com as menores cargas enzimáticas apresentaram filtrados com as
maiores absorbâncias e com espectros de UV com forte absorbância em 280 nm (presença de
compostos fenólicos) (figura 6.15 B).
00,30,60,91,21,51,82,12,42,7
220 270 320 370 420 470
Comprimento de onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 5 1020 50 150
(A)
0
0,8
1,6
2,4
3,2
4
4,8
5,6
6,4
220 270 320 370 420 470
Comprimento de Onda (nm)Abs
orbâ
ncia
0 5 1020 50 150
(B)
Figura 6.15. Cromóforos liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus (X) e xilanase seguida de extração alcalina (B).
6.3.3.Xilanase de Thermoascus aurantiacus
Polpas acetosolv de palha foram tratadas com cargas de xilanase de T. aurantiacus de
5 a 50 unidades de enzima por 2 h e com 150 unidades por 20h de reação.
As polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas xilanolíticas não apresentaram
variação da viscosidade em relação à polpa original e a polpa tratada com 5 unidades de
xilanase seguida de extração alcalina (XE) apresentou leve aumento de viscosidade (7,09 cP)
(relação polpa tratada com NaOH, viscosidade 6,5 cP), as demais cargas xilanolíticas
causaram leve queda da viscosidade (6,3 cP) (figura 6.16 A ). As polpas tratadas com 5, 20 ou
50 unidades de xilanase apresentaram redução de 7,8 unidades de número kappa (número
kappa 50,20) comparados com a polpa original (número kappa 58), a polpa tratada com 10
unidades de xilanase apresentou a maior redução de número kappa 16,9% (relação polpa
original) e que corresponde a uma diminuição de 9,8 unidades de número kappa (polpa X-10,
número kappa 48,2) (figura 6.16 A).
A polpa tratada com 150 unidades de xilanase apresentou o mesmo número kappa da
polpa original. As polpas tratadas com 5 e 10 unidades de xilanase seguida de extração
alcalina apresentaram redução de número kappa de 9,62 e 5,55 unidades de número kappa,
respectivamente e que corresponde a uma redução de 24,5 e 15% do número kappa (relação
polpa extraída com NaOH, número kappa 39,24 e polpa XE -5= 29,62 e polpa XE10= 33,36).
O uso de alta carga xilanolítica (150 UI/g) não alterou o número kappa da polpa, de acordo
com a figura 6.17 (B).
012
345678
0 5 10 20 50 150Carga de Enzima (UI/g)
Visc
osid
ade
(cP)
X XE(A)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Núm
ero
kapp
a
X XE(B)
Figura 6.16. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus.
ZHAO e colaboradores (2002) trataram polpas soda de palha de trigo com extrato de
cultura de Aspergillus niger contendo xilanase na dose de 4UI/g de polpa seca, por 6-8 h e
obtiveram polpas com redução de 2 unidades de número kappa. JIANG et al. (2006) trataram
polpas de palha de trigo com diferentes cargas de xilanase de Thermotoga maritima (2,5 a 150
UI/g) e verificaram que altas doses enzimáticas levavam a queda nas propriedades mecânicas
da polpa.
A relação viscosidade/número kappa, ou seja, seletiviade do processo xilanolítico para
polpas tratadas com diferentes cargas de xilanase foi a mesma (0,1), havendo grande
seletividade somente nas polpas tratadas com 5 e 10 unidades de xilanase seguida de extração
alcalina (XE), 0,25 e 0,18, respectivamente como pode ser visto na figura 6.17.
A polpa acetosolv tratada com 150 unidades de xilanase de T. aurantiacus apresentou
as mesmas propriedades de viscosidade e número kappa da polpa original, no entanto, a
análise dos açúcares redutores liberados nos filtrados dos tratamentos enzimáticos (figura
6.18) mostrou que ao se utilizar esta quantidade de enzima houve a maior liberação de
açúcares redutores (0,140 mg/g polpa). Para polpas tratadas com xilanase seguida de extração
alcalina (XE), as cargas enzimáticas de 5 ou 50 unidades foram as que proporcionaram as
maiores liberações de açúcares redutores, 0,385 e 0,366 mg/g polpa), respectivamente.
0 10 20 30 40 50 140 145 150 1550,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
Sel
etiv
idad
e
C arga de E nz im a (U I/g )
X X E
Figura 6.17. Seletividade (relação viscosidade/número kappa) de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus.
A análise de cromóforos liberados nos filtrados dos tratamentos enzimáticos está
mostrada na figura 6.19. As polpas tratadas com 5 ou 50 unidades de xilanase apresentaram
filtrados que apresentaram maior absorbância (figura 6.19 A), nesta figura também é possível
ver que a polpa controle (polpa tratada sem enzima) também libera substâncias cromóforas.
As polpas tratadas com 5 ou 50 unidades de xilanase seguida de extração alcalina liberaram
substâncias cromóforas que absorvem em maiores absorbâncias do que as polpas tratadas com
as demais cargas xilanolíticas (figura 6.19 B) e nesta figura é possível observar uma forte
absorção em 280 nm (presença de compostos fenólicos).
LI e colaboradores (2005) trataram polpas soda antraquinona de palha de trigo com
cargas de xilanase de Thermomyces lanuginosus de 2,5 a 120 unidades de xilanase por grama
de polpa a 60ºC por tempos de 1 a 6h de reação. Estes autores observaram que com o aumento
do tempo de tratamento da polpa ocorreu o aumento na liberação de açúcares redutores e as
substâncias cromóforas (apresentam absorbância na região da luz ultravioleta e visível)
liberadas foram resultantes da ação enzimática sugerindo que houve significante diminuição
da aromaticidade da lignina residual (confirmada pela redução do número kappa da polpa). As
polpas soda antraquinona de palha de trigo possuíam número kappa 22 e alvura 39% ISO e
com a aplicação de 5 unidades de xilanase por 1 h de reação foi observada a redução de 1
ponto no número kappa da polpa. Todas as cargas enzimáticas empregadas proporcionaram
aumento da alvura das polpas de 1,8 a 7,8% ISO, sendo que o uso de 40 UI/g de xilanase de
T. lanuginosus proporcionou a maior alvura. O uso de xilanase provocou pequena queda das
propriedades de tensão e rasgo da polpa. O pré-tratamento da polpa com xilanase permitui a
redução de cloro ativo de 28% para polpa com mesma alvura sem tratamento enzimático.
0 10 20 30 40 50 140 145 150 1550,000,020,040,060,080,100,120,140,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Açúc
ares
Red
utor
es (m
g/g
polp
a)
Carga de Enzima (UI/g)
X XE
Figura 6.18. Açúcares redutores liberados no filtrado do tratamento de polpas acetosolv com xilanase de T. aurantiacus.
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
5
220 270 320 370 420 470
Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 5 10 20 50 150
(A)
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
5
220 270 320 370 420 470Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 5 10 20 50 150
(B)
Figura 6.19. Cromóforos liberados nos filtrados de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T. aurantiacus (A) xilanase e (B) xilanase seguida de extração alcalina.
Em 1993, PATEL e colaboradores mostraram que a xilanase purificada de
Streptomyces roseiscleroticus diferem umas das outras em sua habilidade de reduzir número
kappa e de liberar substâncias cromóforas das polpas Kraft de carvalho. No presente trabalho
foi constatado, que diferentes xilanases produzem diferentes efeitos nas propriedades físicas
das polpas e que atuam de maneiras diferentes de acordo com os açúcares redutores e
substâncias cromóforas liberadas. A redução do número kappa das polpas e a economia de
reagentes de branqueamento é função do tipo de polpa e do tratamento enzimático, ou seja a
seqüência em que o tratamento enzimático e químico é feito influenciam nas propriedades
finais das polpas (JEFFRIES et al., 1998). A literatura reporta que em polpas Kraft, o número
kappa é influenciado pela presença de ácidos hexenurônicos (substâncias insaturadas
formadas a partir do ácido 4-O-metil-D-glucurônico presente na xilana durante a polpação)
(GELLERSTEDT, 1996).
6. 3.4. Estudo comparativo do uso das xilanases nas polpas acetosolv de palha
Xilanases de três diferentes origens microbiológicas (bactéria, fungo e fungo
trabalhado geneticamente) foram utilizadas para o biobranqueamnto de polpas acetosolv.
A figura 6.20 mostra a viscosidade das polpas acetosolv tratadas com as diferentes
xilanases e diferentes cargas enzimáticas. A polpa tratada com 50 unidades de xilanase de B.
pumilus seguida de extração alcalina foi a polpa que apresentou a maior viscosidade (cerca de
8 cP).
A figura 6.21 mostra o número kappa das polpas tratadas com as três diferentes
xilanases e com diferentes cargas enzimáticas. A polpa que apresentou o menor número kappa
foi a polpa tratada com 5 unidades de xilanase de T. aurantiacus seguida de extração alcalina.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Vis
cosi
dade
(cP)
H. grisea (XE) B. pumilus (XE) T. aurantiacus (XE)H. grisea (X) B. pumilus (X) T. aurantiacus (X)
Figura 6.20. Viscosidade de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas enzimáticas e com xilanases de diferentes origens microbiológicas.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 20 50 150Carga de Enzima (UI/g)
Num
ero
kapp
a
H. grisea (X) B. pumilus (X) T. aurantiacus (X)H. grisea (XE) B. pumilus (XE) T. aurantiacus (XE)
Figura 6.21. Número kappa de polpas acetosolv tratadas com diferentes cargas enzimáticas e com diferentes xilanases de diferentes origens microbiológicas.
6. 3. 4. 1. Análise de perdas de componentes das polpas acetosolv tratadas com três
xilanases de origens microbiológicas diferentes
Com dados da composição química da palha, da polpa acetosolv, das polpas
biobranqueadas com xilanase e das polpas branqueadas com NaOH e conhecendo-se o
rendimento de cata etapa é possível fazer o balanço de massa e cálculos da perda de
componentes no processo de transformação da biomassa (palha) até a obtenção de polpa
branqueada.
A tabela 6.6 traz a composição química da palha de cana e da polpa acetosolv obtida
neste trabalho. Nas tabelas 6.7, 6.8 e 6.9 estão apresentadas a composição química das polpas
acetosolv tratadas com as diferentes xilanases e com as cargas enzimáticas de 5, 50 ou 150
unidades de enzima e também estão apresentadas a composição química das polpas XE
(xilanase seguida de extração alcalina). As análises de composição química foram feitas em
duplicata. As polpas acetosolv foram tratadas com variadas cargas de xilanase, com a
finalidade de estudar a ação xilanolítica nas polpas. O estudo do balanço material e perdas de
componentes foi feito usando polpas que foram tratadas com 5, 50 ou 150 unidades de
enzima, por se tratar de cargas enzimáticas que foram baixas, médias e altas.
Com os dados das tabelas 6.6, 6.7, 6.8 e 6.9 e foram feitos os cálculos de perda de
componentes nas etapas de polpação-branqueamento xilanolítico (tabela 6.10) e tratamento
xilanolítico-branqueamento químico (tabela 6.11).
Tabela 6.6. Composição química de palha de cana e polpa acetosolv.
Componente (%) Palha Polpa Acetosolv Glucana 36,1± 0,50 50,57 ± 0,49 Pentosana 28,30 ± 0,1 15,63 ± 0,34 Lignina total 26,2 ± 0,50 25,67 ± 0,34 Cinzas 2,10 ± 0,2 5,22 ± 0,16
Tabela 6.7. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de H. grisea. Polpa
Rendimento (%)
Glucana (%)
Pentosana (%)
Lignina Total (%)
Cinzas (%)
X-5 88,57 40,99 ± 2,10 11,12 ± 0,31 25,32 ± 0,50 5,40 ± 0,11 X-50 96,22 48,62 ± 2,80 9,61 ± 0,20 23,18 ± 0,47 5,88 ± 0,47 X-150 97,51 51,35 ± 2,12 11,63 ± 0,50 23,34 ± 0,65 5,45 ± 0,16 XE-5 89,27 60,94 ± 1,53 12,46 ± 0,35 18,52 ± 0,35 4,04 ± 0,13 XE-50 90,09 58,56 ± 1,12 12,16 ± 0,70 18,49 ± 0,80 4,13 ± 0,13 XE-150 83,25 60,16 ± 1,50 12,57 ± 0,30 18,98 ± 0,70 4,32 ± 0,44 Tabela 6.8. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de B. pumilus. Polpa
Rendimento (%)
Glucana (%)
Pentosana (%)
Lignina Total (%)
Cinzas (%)
X-5 89,48 55,35 ± 3,45 11,30 ± 1,0 24,76 ± 0,44 5,90 ± 0,20 X-50 89,49 45,32 ± 2,98 11,22 ± 0,30 31,80 ± 0,20 5,70 ± 0,20 X-150 90,27 39,91 ± 0,10 10,90 ± 0,70 31,71 ± 0,40 5,79 ± 0,30 XE-5 86,24 45,61 ± 2,80 12,39 ± 0,30 26,72 ± 0,72 4,70 ± 0,07 XE-50 82,68 47,16 ± 1,90 12,92 ± 0,96 26,18 ± 0,50 5,45 ± 0,70 XE-150 85,64 53,57 ± 2,73 9,99 ± 0,13 25,29 ± 0,82 4,72 ± 0.40 Tabela 6.9. Composição química de polpas acetosolv tratadas com xilanase de T.aurantiacus. Polpa
Rendimento (%)
Glucana (%)
Pentosana (%)
Lignina Total (%)
Cinzas (%)
X-5 92,80 54,57 ± 1,50 15,56 ± 0,90 24,00 ± 0,50 5,57 ± 0,10 X-50 81,48 50,28 ± 1,33 11,72 ± 0,30 27,97 ± 0,30 5,85 ± 0,34 X-150 80,23 50,15 ± 0,60 11,32 ± 0,50 30,52 ± 0,16 5,47 ± 0,10 XE-5 82,64 54,57 ± 0,34 14,76 ± 0,84 29,77 ± 0,80 4,46 ± 0,50 XE-50 88,56 50,28 ± 0,59 10,69 ± 0,40 30,14 ± 0,56 4,87 ± 0,10 XE-150 90,94 51,15 ± 0,41 10,47 ± 0,75 29,23 ± 0,86 4,71 ± 0,36
A parttir dos dados de perdas de components em cada etapa do processo: palha de
cana, polpação acetosolv, tratamento xilanolítico de polpas acetosolv e branqueamento
químico, calculou-se a perda global dos componentes no processo geral de transformação da
biomassa. A figura 6.22 mostra a perda dos componentes da biomassa (palha) até obtenção
uma polpa branqueada.
Tabela 6.10. Perda de componente etapa polpa-tratamento xilanolítico. Perda de Glucana (%) Carga de Enzima (UI/g polpa
seca) H. grisea B. pumilus T. aurantiacus 5 14,36 ± 2,92 10,49± 1,66 44,58 ± 3,37 50 15,44 ± 3,31 18,52 ± 0,53 51,06 ± 1,38 150 14,42 ±0,96 21,6 ± 0,53 57,97 ± 1,0
Perda de Pentosanas (%) Carga de Enzima (UI/g polpa seca) H. grisea B. pumilus T. aurantiacus 5 51,66 ± 1,89 32,49 ± 1,07 50,53 ± 0,6 50 43,8 ± 0,24 36,14 ± 0,67 63,37 ± 1,30 150 29,29 ± 0,20 39,48 ± 0,66 68,29 ± 1,0
Perda de Lignina Total (%) Carga de Enzima (UI/g polpa seca) H. grisea B. pumilus T. aurantiacus 5 12,97 ± 0,62 13,64 ± 1,44 13,4 ± 1,62 50 13,05 ± 0,34 4,4 ± 0,59 16,75 ± 0,29 150 11,32 ± 1,46 1,2 ± 0,52 22,95 ± 0,43 Tabela 6.11. Perda de componente etapa polpa branqueada com xilanase-branqueamento químico.
Perda de Glucana (%) Carga de Enzima (UI/g polpa seca)
H. grisea B. pumilus T. aurantiacus
5 31,94 ± 3,37 50,36 ± 2,20 51,64 ± 4,00 50 28,33 ± 2,57 21,71 ± 1,93 57,78 ± 4,19 150 34,74 ± 2,74 41,56 ± 2,56 62,12 ± 3,44
Perda de Pentosanas (%) Carga de Enzima (UI/g polpa seca)
H. grisea B. pumilus T. aurantiacus 5 85,64± 2,79 84,96 ± 1,70 82,04 ± 3,83 50 83,62 ± 1,29 89,48 ±1,07 77,31 ± 2,65 150 85,63 ± 1,25 90,16 ± 2,10 69,85 ± 0,66
Perda de Lignina Total (%) Carga de Enzima (UI/g polpa seca)
H. grisea B. pumilus T. aurantiacus
5 97,79 ± 1,64 61,94 ± 1,43 71,31 ± 2,06 50 78,47 ± 2,20 79,48 ± 0,59 70,68 ± 1,71 150 80,61 ± 2,49 74,23 ± 3,59 69,94 ± 0,85
O uso de 150 unidades de xilanase de B. pumilus degradou cerca de 35% da glucana
no processo global de tansformação da palha em polpa branqueada. A menor degradação das
glucanas foi obtida com o uso das xilanase de H. grisea e cargas de 50 ou 150 unidades de
xilanase de B. pumilus degradaram cerca de 22% das glucanas. De um modo geral, ao se
aumentar a carga de enzima ocorreu a maior degradação das glucanas.
Ao se aumentar a carga de xilanase de T. aurantiacus de 5 a 150 unidades ocorreu,
também maior degradação das pentosanas. A maior degradação das pentosanas ocorreu com o
uso de 150 UI/g de xilanase de T. aurantiacus (cerca de 45%). O uso da xilanase de B.
pumilus também provocou degradação de pentosanas, da ordem de 40%, com variadas cargas
xilanolíticas e a xilanase de H. grisea foi que provocou menor degradação das pentosanas
(cerca de 25%), conforme figura 6.22 (B).
O uso de 5 unidades de xilanase de H. grisea se mostrou extremamente eficiente na
remoção de lignina no processo de transformação da palha à polpa branqueada, pois a perda
de lignina chegou a 90%. O uso de 5 unidades de xilanase de B. pumilus degradou cerca de
50% da lignina e mesmo com o uso de altas doses de xilanase de T. aurantiacus (150 UI/g)
não se observou grande degradação de lignina (cerca de 15%), conforme figura 6.22 (C).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5 50 150Carga de Enzima (UI/g)
Per
da d
e G
luca
na (%
)
T. aurantiacus H. grisea B. pumilus (A)
05
101520253035404550
5 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Per
da de Pen
tosa
na (%
)
T. aurantiacus H. grisea B. pumilus (B)
010
2030
4050
6070
8090
100
5 50 150Carga de Enzima (UI/g polpa)
Perd
a de
Lig
nina
Tot
al (%
)
T. aurantiacus H. grisea B. pumilus (C)
Figura 6.22. Perda de componentes (A) glucana, (B) xilana e (C) lignina total no processo total: da polpação da palha a polpa biobranqueada com xilanase e com extração alcalina
A lignina residual presente nas polpas após o processo de polpação é escura, devido já
estar modificada e oxidada e devido ao fato de estar covalentemente ligada as polioses e
fibras de celulose faz com que seja difícil de remover (SHOLAM et al., 1992).
As perdas de componentes no processo de transformação da palha em polpa
branqueada é devido não somente a ação enzimática (remove xilana de baixa massa molar),
mas também devido aos processos de polpação e branqueamento com NaOH, pois a lignina e
as pentosanas são solúveis em meio alcalino. A extração alcalina das polpas foi feita com
NaOH 0,5% (m/v), esta concentração foi utilizada para possibilitar o estudo da ação
xilanolítica nas polpa, pois ao se utilizar soluções alcalinas em concentrações maiores, o
efeito da ação enzimática pode ser mascarada pela ação da extração alcalina e as polpas,
assim apresentarem mesmas propriedades de viscosidade e número kappa mesmo sendo
tratadas com cargas enzimáticas distintas.
As xilanases livres de celulase possuem grande importância na indústria de polpa e
papel, pois ao hidrolisar a xilana resulta em poros na fibra da celulose e assim, os agentes
oxidantes podem mais facilmente degradar a lignina residual da polpa. Usando esta
tecnologia, polpa branqueada de superior qualidade pode ser produzida com menores
consumos de cloro. Outro importante efeito causado pela ação das xilanases é a hidrólise de
polioses não dissolvidas, que atuam como cromóforos e compostos aromáticos (SHOLAM et
al, 1992; ZIOBRO, 1990).
Tem-se pesquisado microrganismos produtores de xilanase que são ativas em pH alto
(alcalofílicas), termoestáveis e com o mínimo de produção de celulase. No entanto, xilanases
produzidas por fungos invariavelmente, possuem pH ótimo menor que 5,5 (HALTRICH et al.,
1996) e embora produzam xilanase com alta atividade, a presença de quantidade considerável
de celulase e baixo pH torna-as menos adequados para a indústria de polpa e papel. Existem
alguns casos reportados na literatura de produção de alta atividade de xilanase acompanhada,
porém, com também elevada atividade de celulase, como por exemplo, Trichoderma reesei
(atividade de xilanase= 960 UI/ml para 180 ml de filtrado da cultura com 9,6 UI/ml de
celulase) (BAILEY et al., 1993), Schizophillum commune também é um produtor de alta
atividade xilanolítica (1244 UI/ml) e produção de 65,3 UI/ml de CMCase e 5,0 UI/ml de
FPase (STEINER et al., 1987). Fungos que apresentam quantidades negligenciáveis de
atividades celulolíticas (0,01 UI/ml) como Thermomyces lanuginosus são muito raros
(GOMES et al., 1993; PURKARTHOFER, SINNER e STEINER, 1993). A maioria das
culturas produtoras das xilanases que se dizem livres de celulase possuem pequenas
atividades celulolíticas, mesmo cultura de microrganismos como o Bacillus SSP-34
(SUBRAMANIYAN, PREMA e RAMAKRISHNA, 1997). A medida de atividade
celulolítica pode ser afetada por resíduos de xilose presentes nos substratos comerciais da
celulose, usados nos testes de atividade celulolítica (SUBRAMANIYAN e PREMA, 2000).
A figura 6.22 mostrou que existem diferenças na degradação dos componentes da
biomassa ao se utilizar xilanases de fontes microbiológicas distintas. Estudos com xilanases
de fungo têm resultado na redução do consumo de cloro, no entanto ocasiona queda na
viscosidade que não são aceitáveis. Presumivelmente, a queda de viscosidade é devido a
contaminação de celulase nas preparações de xilanase. O uso de xilanases livres de celulase
nas indústrias de polpa deve permitir a produção de raion com qualidade de polpa de
dissolução, pois xilanases livres de celulase são seletivas na remoção de polioses causando
mínimos danos a celulose.
A figura 6.23 (A) mostra a seletividade (relação perda de glucana/perda de lignina)
para as polpas acetosolv tratadas com as diferentes xilanases. Para a polpa acetosolv tratada
com 50 unidades de xilanase de B. pumilus esta relação se mostrou a maior e na figura 6.23
(B) está ilustrada a seletividade (relação perda de xilana/perda de lignina) que é maior para as
polpas acetosolv tratadas com 5 unidades de xilanase de B. pumilus, sendo que o uso de 50
unidades de xilanase proporcionou uma seletividade semelhante para as três xilanases.
0 10 20 30 40 50 140 1500,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Sele
tivid
ade
(glu
cana
/lign
ina)
Carga de Enzima (UI/g)
H.g B.p T.a
(A)
0 10 20 30 40 50 140 1500,85
0,90
0,95
1,00
1,05
1,10
1,15
1,20
1,25
1,30
1,35
1,40
Sel
etiv
idad
e (p
ento
sana
/lign
ina)
Carga de Enzima (UI/g)
H.g B.p T.a
(B)
Figura 6.23. (A) seletividade (relação perda de glucana/perda de lignina) e (B) seletividade (relação perda de xilana/perda de lignina) de polpas acetosolv tratadas com diferentes xilanases.
A partir dos dados de rendimento de polpação da palha (RP= 49,42%), tratamento
xilanolítico e branqueamento químico (mostrados na tabela 6.12) foi possível calcular o
rendimento global do processo de transformação da palha em polpa branqueada.
Tabela 6.12. Rendimento dos tratamentos enzimáticos de polpas acetosolv. Polpa H. grisea B. pumilus T. aurantiacus X-5 88,57 89,48 92,80 X-50 96,22 89,49 81,48 X-150 97,51 90,27 80,23 XE-5 89,27 86,24 82,64 XE-50 90,09 82,68 88,56 XE-150 83,25 85,64 90,94
O rendimento global do processo utilizando diversas cargas enzimáticas e xilanases de
fontes microbiológicas distintas estão apresentados na tabela 6.13. O rendimento do processo
global de transformação da palha em polpa acetosolv branqueada foi maior com o uso da
xilanase de H. grisea e menor com o uso da xilanase de T. aurantiacus. O significado físico
do rendimento global do processo de transformação da palha em polpa branqueada é o
seguinte; partindo-se de 100 g de palha (base seca), consegue-se obter cerca de 39,07 g de
polpa branqueada com 5 UI/g de xilanase de H. grisea .
Tabela 6.13. Rendimento (em %) global do processo de transformação de palha em polpa acetosolv branqueada.
Carga de Enzima (UI/g)
H. grisea B. pumilus T. aurantiacus
5 39,07 38,13 37,90 50 42,84 36,57 35,66 150 40,12 38,20 36,05
A xilanase de H. grisea seria a xilanase mais adequada para ser utilizada em uma etapa
de pré-branqueamento químico de polpas acetosolv, pois baixas doses de enzima se
mostraram eficientes na modificação das propriedades físicas da polpa e o fato do extrato
xilanolítico ter sido produzido por uma enzima recombinante se mostrou eficiente na não
degradação de glucanas e ainda apresentou um rendimento global do processo maior do que
com o uso das demais xilanases.
6. 4. Sistema lacase mediador (LMS)
Polpas acetosolv foram biobranqueadas com o sistema lacase mediador (laccase
mediator system- LMS) com 150 unidades de lacase comercial por grama de polpa, 3,6% (em
relação à polpa) de mediador HBT ou AV com polpas com 2% de consistência por 1 h a 45ºC,
em shaker com agitação de 160 rpm. Após o tratamento com o sistema lacase mediador as
polpas foram submetidas ao branqueamento com NaOH 1,5% (m/v) por 1 h a 60ºC. A análise
de número kappa foi feita nas polpas branqueadas, polpas estas branqueadas na seqüência LE
(L=lacase e E=extração alcalina). Os tratamentos de branqueamento das polpas acetosolv e as
análises de número kappa foram feitos em duplicata.
As polpas acetosolv branqueadas com lacase/HBT apresentaram número kappa 26,08
± 1,00 e as polpas branqueadas com lacase/AV apresentaram número kappa 17,27 ± 1,94,
evidenciando assim, que para polpas acetosolv o sistema lacase mediador/AV se mostrou
mais eficiente na deslignificação da polpa.
Uma relação foi feita entre a lignina total (%) obtida através da hidrólise ácida e o
número kappa de polpas de palha de cana-de-açúcar obtidos através de diversos tratamentos,
tais como tratamento biológico com fungo Ceriporiopus subvermispora, polpação etanol-água
catalisada com ácido sulfúrico, polpação etanol-água catalisada com NaOH e polpas de palha
de cana organosolv (etanol-água e acetosolv) tratadas com xilanase. A relação entre número
kappa e lignina é dado por (SAAD, 2007).
Número kappa = 2,00 * Lignina total (%) + 0,95 , r2= 0,7972 (equação 15)
De acordo com a relação número kappa e lignina, a quantidade de lignina presente nas
polpas branqueadas com lacase/HBT foi de 13,15 ± 0,50 % e com lacase/AV foi de 9,10 ±
0,96.
6. 5. Tratamento enzimático das polpas etanol-água (1)
As polpas obtidas na primeira polpação realizada no reator de 40 L foram submetidas
ao estudo de branqueamento com variadas cargas de xilanase de Bacillus pumilus.
A hidrólise ácida das polpas etanol-água (1) tratadas com xilanase de B. pumilus
(tratamento X) e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina (polpas XE) foi feita para
a determinação da composição química das polpas tratadas enzimaticamente. Os dados da
tabela 6.14.
De acordo com a tabela 6.14, o tratamento da polpa etanol-água (1) com variadas
cargas de xilanase de B.pumilus proporcionou o enriquecimento da polpa em glucana. A carga
enzimática de 10 unidades proporcionou o maior aumento de glucana 11,71% em relação à
polpa controle (controle 61,72% e X,10= 68,95% de glucana) e a extensão do tratamento
enzimático com doses maiores e tempos mais longos de tratamento (20 h e 150 UI/g polpa
seca) levaram a degradação de 15% das polioses em relação à polpa sem tratamento
enzimático (controle 3,27% e X,150 UI= 2,77% de pentosanas). As polpas tratadas com
diferentes cargas xilanolíticas apresentaram 9,7% a menos de lignina do que a polpa controle.
A ação da xilanase pode ser melhor detectada através da extração alcalina das polpas
tratadas com xilanase, pois o hidróxido de sódio dissolve a lignina e os produtos da ação
enzimática facilitando a ação dos reagentes químicos de branqueamento. A extração alcalina
removeu 58% da lignina presente na polpa controle, nas polpas XE a ação enzimática
promoveu a remoção de lignina adicional de 13%. Em polpas etanol-água de palha a xilanase
de B. pumilus degradou 34% das polioses presentes na polpa.
Tablea 6.14. Resulatados de composição química de polpas etanol-água (1) tratadas com xilanase de B. pumilus. Amostra Glucana (%) Pentosana (%) Lignina Total (%) Cinzas (%) Controle (sem enzima)
61,72 ± 2,10 3,27 ± 0,29 31,47 ± 2,39 4,15 ± 0,29
Controle (somente NaOH)
70,08 ± 0,60 2,02 ± 0,10 13,12 ± 2,35 2,71 ± 0,12
X-5 UI 66,47 ± 0,56 3,23 ± 0,01 29,06 ± 1,82 3,53 ± 0,48 XE-5 UI 74,46 ± 2,24 2,26 ± 0,08 12,27 ± 2,44 3,00 ± 0,64 X- 10 UI 68,95 ± 1,20 2,41 ± 0,05 28,97 ± 2,43 3,36 ± 0,25 XE-10 UI 75,38 ± 1,55 2,14 ± 0,10 11,43 ± 0,99 2,85 ± 0,19 X-20 UI 64,22 ± 2,59 3,13 ± 0,23 28,46 ± 1,93 3,34 ± 0,12 XE-20 UI 73,23 ± 2,23 2,01 ± 0,02 11,71 ± 1,34 2,87 ± 0,13 X-50 UI 64,68 ± 1,51 3,38 ± 0,22 26,89 ± 0,80 3,23 ± 0,06 XE-50 UI 75,57 ± 0,61 2,17 ± 0,03 13,46 ± 2,77 3,02 ± 0,07 X-150 UI 61,79 ± 3,01 2,77 ± 0,23 27,96 ± 0,08 3,40 ± 0,35 XE-150 UI 71,01 ± 2,70 1,83 ± 0,09 12,95 ± 0,33 2,77 ± 0,35
Os resultados de viscosidade e número kappa das polpas etanol-água tratadas com
diferentes cargas de xilanase de B. pumilus podem ser vistos na figura 6.24.
De acordo com a figura 6.24 (A), as polpas tratadas com cargas enzimáticas de 5 a 20
unidades de enzima apresentaram a mesma viscosidade da polpa controle (sem enzima) em
torno de 3,10 cP. A polpa tratada com xilanase seguida de extração alcalina apresentou
melhora de 11,8% na viscosidade em relação à polpa controle. A extensão do tratamento
enzimático com doses maiores de enzima (50 e 150 UI/g) causou de 7 a 9% de diminuição na
viscosidade das polpas refletindo a degradação de pentosanas ocorrida com altas doses de
enzima. As polpas tratadas com xilanase seguida da extração alcalina ficaram mais
enriquecidas em glucana, devido a remoção de lignina, conseqüentemente, levando as polpas
com maiores viscosidades do que as polpas somente tratadas com xilanase.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Vis
cosi
dade
(cP
)
X XE (A)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Núm
ero
kapp
a
k X XE (B)
Figura 6.24. Viscosidade e número kappa de polpas etanol-água (1) de palha de cana tratadas com diferentes cargas de xilanase de B. pumilus (X) e polpas tratadas com xilanase de Bacillus pumilus seguidas de extração alcalina (XE).
De acordo com a figura 6.24 (B), a carga enzimática de 20 UI/g proporcionou o menor
número kappa (57) das polpas tratadas somente com xilanase, representando queda do
número kappa de 6,6% em relação à polpa original, porém doses maiores de enzima não
proporcionaram queda de número kappa das polpas. Esta carga xilanolítica proporcionou a
maior viscosidade (3,79 cP). As polpas tratadas com xilanase seguida de extração alcalina
apresentaram número kappa cerca de 8 pontos acima da polpa controle (polpas extraídas com
NaOH). Os produtos da degradação enzimática, podem estar sendo liberados pela extração
alcalina e podem estar interferindo na quantificação do número kappa.
Como os valores da composição química, viscosidade e número kappa são valores
similares para as polpas tratadas com diferentes cargas enzimáticas, foi feito o espectro de
infravermelho das polpas controle, tratadas com xilanase de B. pumilus e tratadas com
xilanase seguida de extração alcalina (XE), (figura 6.25).
-0,40
-0,20
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
400900140019002400290034003900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
c x5 x10 x20 e
xe5 xe10 xe20
Figura 6.25. Espectros de infravermelho de polpas etanol-água (1) tratadas com xilanase e tratadas com xilanase seguida de extração alcalina.
Devido ao perfil dos espectros de infravermelho serem semelhantes entre si, como
pode ser visto na figura 6.25, foi feito um tratamento estatístico destes espectros, chamado
Análise por Componentes Principais (PCA). Na Análise por Componentes Principais 391
variáveis foram transformados em três componentes principais que determinam 96,48% das
diferenças encontradas nos espectros. Nos gráficos bidimensionais cada ponto é
representativo de um espectro de uma polpa e quanto mais próximos se encontrarem estes
pontos significa que as polpas apresentam semelhanças e quanto mais distantes estiverem
significa que as polpas são diferentes.
Pela figura 6.26, a análise dos componentes principais 1 e 2 das polpas etanol-água (1)
tem-se três grupos distintos de polpas: as polpas tratadas com 20 unidades de xilanase estão
marcadas com uma elipse contínua e se encontram na parte inferior do gráfico, as polpas
controle (sem enzima) e as polpas originais se encontram na parte superior e estão marcadas
com elipse descontínua, demonstrando a semelhança encontrada na análise química, o terceiro
grupo de polpas são as polpas que foram tratadas com as maiores cargas enzimáticas (50 e
150 UI/g) que estão demarcadas com elipse tracejada na parte superior esquerda do gráfico.
As polpas tratadas com xilanase seguida de extração alcalina apresentam diferenças
entre si, sendo que as polpas tratadas com baixas cargas de enzima se encontram na parte
inferior do gráfico e as tratadas com doses maiores se encontram na parte superior do gráfico;
de acordo com a figura 6.26 (B).
Xilanase
-15
-10
-5
0
5
10
15
-30 -20 -10 0 10 20 30PC1
PC2
controle X 5 X 10 X 20 X 50 X 150 p. original
Xilanase + NaOH
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
-5 0 5 10 15 20
PC 1
PC 2
NaOH XE 5 XE 10 XE 20 XE 50 XE 150
(A) (B)
50 e 150 UI
20 UI
Figura 6.26. Correlação entre os scores PC 1x PC2 dos espectros FTIR de polpas etanol-água tratadas com xilanase de Bacillus pumilus (A) e (B) xilanase seguida de extração alcalina.
Através do gráfico de loading versus número de onda é possível inferir em que
comprimentos de onda possíveis modificações em ligações químicas poderiam estar
ocorrendo. Pela figura 6.27, nas polpas etanol-água (1) de palha o PC 1 traz informações da
fibra da polpa e o PC 2 é influenciado pelas ligações C-O (em torno de 1000 cm-1),
característica de éter.
-0,8-0,7-0,5-0,4-0,2-0,10,10,30,40,60,7
500650800950110012501400
Número de Onda (cm-1)
Load
ing
PC1 PC2
Figura 6.27. Loading obtido dos espectros de FTIR de polpas etanol-água de palha de cana tratadas com xilanase Bacillus pumilus.
Na tentativa de degradar a lignina presente na polpa etanol-água (1) e
conseqüentemente, diminuir o número kappa desta polpa foi aplicado o sistema lacase
mediador. Os resultados de viscosidade e número kappa das polpas tratadas com lacase estão
apresentados na tabela 6.15 e de acordo com esta tabela, o uso somente de lacase de P.
ostreatus não proporcionou a diminuição do número kappa da polpa. O tratamento da polpa
com o sistema lacase-mediador seguida da extração alcalina proporcionou queda de 13% do
número kappa (número kappa 18,18) da polpa quando comparado à polpa somente extraída
com NaOH (número kappa 20,97). As polpas etanol-água (1) tratadas com o sistema lacase
comercial com HBT ou AV apresentaram número kappa semelhantes (em torno de 35) e que
corresponde a uma diminuição de 57,5% do número kappa em relação à polpa original
(número kappa polpa original 60,9). As polpas tratadas com lacase comercial e mediador,
seguida de extração alcalina apresentaram número kappa em torno de 22, número kappa
maior do que a polpa somente branqueada quimicamente (número kappa 20,97) e que também
são valores maiores do que a polpa tratada com o sistema lacase mediador de P. ostreatus
seguida de extração alcalina, representando aumento de 4 unidades de número kappa.
As polpas etanol-água (1) foram tratadas com o sistema lacase mediador com HBT ou
AV, nas seguintes condições: 4% (em relação à polpa) de HBT ou AV, 30 UI/g lacase e
consistência de 5% por 4 h a 45ºC em shaker com agitação de 160 rpm. A lacase utilizada foi
a lacase comercial. O rendimento do tratamento com lacase foi de 98%. A extração alcalina
das polpas tratadas com o sistema lacase mediador foi feita com NaOH 1,5% (m/v) por 1 h a
65ºC e foi determinado o número kappa das polpas.
Polpa etanol-água (1) tratadas com altas cargas enzimáticas (150 UI/g) e baixa
consistência (2%) com carga de mediador (HBT) similar não apresentou maior redução do
número kappa em relação a polpa tratada com menor carga de lacase (30 UI/g) e com
consistência maior (10 %). Para o sistema lacase mediador com o uso de HBT como mediador
a consistência da polpa em torno de 5% e cargas de lacase menores (30 UI/g) e tempos
maiores (4 h) se mostraram mais eficientes na deslignificação do que o uso de altas doses de
lacase (150 UI/g) por 1 h de tratamento. Para o sistema lacase mediador com o uso de AV
como mediador, diferentes cargas enzimáticas, diferentes quantidades de mediador e
diferentes consistências e tempos de reação diferentes produziram polpas com similares
número kappa. Assim para o sistema lacase comercial e mediador AV é mais interessante
economicamente utilizar as menores condições, ou seja, menores quantidades de lacase e de
mediador e tempo de reação de 1 h e maiores consistências (10%) que em termos industriais
são mais viáveis (ao usar menos água no processo geram-se menos efluentes).
A polpa etanol-água (1) tratadas somente com lacase de Pleurotus ostreatus não
apresentou redução do número kappa, ou seja, aparentemente não houve a deslignificação da
polpa. Porém, ao se analisar o conteúdo de lignina na polpa tratada com lacase de Pleurotus
oestreatus seguida de extração alcalina houve a deslignificação da polpa etanol-água de 14%.
Somente o uso de mediador HBT proporcionou deslignificação da polpa (43%), no entanto, a
polpa tratada com lacase comercial/ HBT e seguida de extração com NaOH apresentou
mesmo conteúdo de lignina que a polpa tratada somente com NaOH (não havendo portanto,
deslignificação da polpa). O mesmo comportamento foi observado com o uso do mediador
AV (tabela 6-15).
A deslignificação da polpa pode ser avalida em termos de variação do número kappa
ou pela quantidade de lignina total (%), como mostra as equações 16 e 17:
% deslignificação = [(nº kappa final – nº kappa inicial)/nº kappa inicial]*100 (equação 16)
ou % deslignificação = [(lignina total final – lignina inicial)/lignina inicial]*100 (equação 17)
Tabela 6-15. Resultados de viscosidade, número kappa e lignina total de polpas etanol-água (1) tratadas com lacase de P. ostreatus ou lacase comercial e mediador HBTou AV. Amostra Viscosidade (cP) Número Kappa Lignina Total (%)c
Controled 2,72 ± 0,04 60,90 ± 2,00 29,97 Controle (NaOH) 3,27 ± 0,03 20,97 ± 0,12 10,01 Lacase P. ostreatus 2,78 ± 0,04 61,77 ± 1,66 30,41 Lacase P. ostreatus+ NaOH 3,37 ± 0,18 18,18 ± 2,34 8,61 Lacase Comercial/HBT - 35,18 ± 2,82 17,11
Lacase Comercial/HBT + NaOH - 22,31 ± 0,80 10,68 Lacase Comercial/AV - 36,10 ± 0,55 17,57 Lacase Comercial/AV + NaOH - 22,65 ± 0,80 10,85 Lacase Comercial/HBT + NaOHa - 38,02 ± 2,61 18,53 Lacase Comercial/AV + NaOHb - 21,81 ± 2,63 10,43
apolpa etanol-água tratada com 150 UI/g lacase, 3,6% (relação polpa) HBT, 2% consistência. bpolpa etanol-água tratada com 10 UI/g lacase, 1,5% (relação polpa) AV, 10% consistência. c Lignina total (%) calculado a partir de nº kappa = 2,00*lignina total (%) + 0,95, r2 = 0,7972. d Lignina total na polpa original: 24,5 ± 0,1 (determinada por hidrólise ácida).
6. 6. Polpas etanol-água (2) branqueadas com xilanase de Bacillus pumilus
Polpas etanol-água (2) foram submetidas ao biobranqueamento com xilanase de B.
pumilus com carga enzimáticas de 1 a 50 unidades de enzima por grama de polpa seca por 2 h
e um tratamento foi feito a exaustão com 150 UI/g por 20 h. Na figura 6.28 estão
apresentados os resultados de viscosidade e número kappa.
A polpa etanol-água (2) original (sem tratamento enzimático) apresentou viscosidade
(13,94 cP), viscosidade cerca de 10 unidades maior do que a polpa obtida na ampliação de
escala realizada a 200ºC (viscosidade 3,14 cP). O uso de uma e duas unidades de xilanase
ocasionaram aumento da viscosidade das polpas de 9,68 e 1,29% respectivamente, em relação
à polpa original (X-1= 15,29 cP e X-2= 14,12 cP). O aumento da carga xilanolítica provocou
redução da viscosidade das polpas etanol-água (2) que atingiu um patamar em 9 cP a partir de
5 unidades de xilanase. As polpas tratadas com 5 ou 50 unidades de xilanase seguida de
extração alcalina apresentaram aumento na viscosidade de 5,9% (relação polpa somente
tratada com NaOH, viscosidade 15,93 cP) (polpas XE-5 ou XE- 50= 16,87 cP) (figura 6.28
A).
As polpas tratadas com as diversas cargas xilanolíticas não apresentaram redução do
número kappa (figura 6.28 B).
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 1 2 3 4 5 10 20 50 150
Carga de Enzima (UI/g)
Vis
cosi
dade
(cP
)
X XE (A)
0102030405060708090
0 1 2 3 4 5 10 20 50 150Carga de Enzima (UI/g)
Núm
ero
kapp
a
X XE (B)
Figura 6.28. Viscosidade (A) e número kappa (B) de polpa etanol-água (2) tratadas com xilanase de B. pumilus.
Apesar de não ter sido observada a redução do número kappa das polpas tratadas com
xilanase de B. pumilus houve a liberação de açúcares redutores nos filtrados dos tratamentos
xilanolíticos, essa liberação foi maior com o uso de maiores cargas de enzima e a quantidade
de açúcares redutores foi maior nos filtrados dos tratamentos das polpas com xilanase seguida
de extração alcalina (XE), se destacando o uso de três unidades de xilanase (figura 6.29).
A análise das substãncias cromóforas liberadas nos filtrados dos tratamentos xilanolíticos
mostrou que o uso de 150 UI/g de xilanase liberou substâncias que possuem maior
absortividade (figura 6.30 A). A figura 6.30 (B) apresenta o espectro na região da luz visível
em que é possível observar que a polpa controle (tratada sem enzima, mas com tampão) libera
substãncias cromóforas, a intensidade de absorbância das substãncias cromóforas liberadas no
tratamento com NaOH é maior do que no tratamento somente com xilanase. Os espectros de
UV apresentam forte absorção no comprimento de onda 280 nm, que é um indicativo da
presença de compostos fenólicos.
0 10 20 30 40 50 140 145 150 1550,0
0,1
0,4
0,5
0,6
0,7
Açúc
ares
Red
utor
es (m
g/g
polp
a)
Carga de Enzima (UI/g)
X XE
Figura 6.29. Açúcares redutores liberados nos filtrados dos tratamentos de polpas etanol-água (2) com xilanase de B. pumilus.
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
220250280310340370400430460
Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 1 2 3 45 10 20 50 150
(A)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
220 250280 310 340 370400 430 460
Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
0 1 2 3 45 10 20 50 150
(B)
Figura 6.30. Cromóforos liberados no filtrado de polpas etanol-água (2) tratadas com xilanase de B. pumilus (A) xilanase e (B) xilanase seguida de extração alcalina.
As polpas etanol-água (2) foram biobranqueadas com o sistema lacase comercial
mediador com dois mediadores HBT e AV com 30 UI/g de lacase, 4% (relação polpa seca) de
mediador e 5 % de consistência. As polpas tratadas com o sistema enzimático foram
branqueadas com hidróxido de sódio 1,5% (m/v) por 1 h a 65ºC e o número kappa e a
quantidade de lignina total das polpas estão apresentados na tabela 6.16.
Tabela 6.16. Resultados de número kappa de polpas etanol-água (2) branqueadas com o sistema a lacase mediador. Amostra Número kappa Lignina total (%)a
Lacase/HBT 35,92 ± 2,22 17,48 Lacase/AV 32,05 ± 2,83 15,55 Lacase /HBT + NaOH 20,86 ± 0,10 9,95 Lacase/AV + NaOH 21,59 ± 0,10 10,32 a Lignina total (%) calculado a paritr de nº kappa = 2,00*lignina total (%) + 0,95, r2 = 0,7972.
Para polpas etanol-água (2) o sistema lacase comercial/AV se mostrou mais eficiente
em deslignificar a polpa do que o sistema lacase/HBT e após o branqueamento químico o
sistema lacase/HBT apresentou pequena melhora em relaçaõ ao sistema lacase/AV na
deslignificação da polpa.
Somente a lacase não é capaz de oxidar o álcool veratrílico ou outros compostos
modelos diméricos não fenólicos de lignina. No entanto, sustâncias tais como ABTS ou
remazol brilhante azul intermediam a oxidação do álcool veratrílico na presença de lacase. A
velocidade da reação de oxidação do álcool veratrílico é dependente da natureza e da
concentração do mediador (BOURBONNAIS e PAICE, 1990). Os requisitos necessários ao
mediador são: ser um composto de baixa massa molecular que possa difundir facilmente na
fibra da polpa e possa oxidar a lignina, a forma radicalar do mediador deve possuir longo
tempo de vida no meio aquoso à temperatura ambiente, o potencial de oxidação requerido
deve ser alto o suficiente para permitir a oxidação dos grupos aromáticos presentes na lignina
(KIM et al., 2001).
A fim de se entender a função do mediador no sistema lacase-mediador, algumas
considerações podem ser feitas. O potencial redox da lacase é independente de sua origem e é
tipicamente 0,7-0,8 V (FABBRINI et al., 2002). O potencial de oxidação (E0) do HBT é de
1,08 V e do ácido violúrico é de 0,916 V, de acordo com KERSTEN e colaboradores (1990)
assim o potencial redox da lacase é maior do que dos mediadores estudados e a lacase possui,
então, potencial redox suficiente para converter os mediadores para o estado oxidado (Medox)
através da abstração de um elétron. No sistema lacase-mediador a função da lacase é oxidar o
mediador e o mediador oxidado em uma etapa subseqüente não enzimática oxida o substrato.
O mecanismo proposto do ciclo catalítico do sistema lacase-mediador então é válido
(figura 2.4). No entanto, de que forma se encontra o Medox é que é .o aspecto relevante nesse
sistema. Para o mediador ácido violúrico (VA) é válido o mecanismo de transferência de
elétron da figura 6.31.
Figura 6.31. Mecanismo de transferência de elétron (TE) (FABBRINI et al., 2002)
O ácido violúrico consiste em um mediador eletroquímico de processos de
branqueamento. A figura 6.32 mostra o ciclo voltamétrico do ácido violúrico. O potencial de
oxidação do ácido violúrico é de 1,02 V e o de redução é de 0,91 V (relação potencial padrão
de hidrogênio) (KIM et al., 2001).
Corrente (µA)
Potencial (V vs Eletrodo Padrão Hidrogênio)
Tampão Acetato
Figura 6.32. Ciclo voltamétrico do ácido violúrico.
Para uma melhor compreensão do ciclo voltamétrico que ocorre nas reações do
sistema lacase-mediador/AV da figura 6.32, pode-se analisar os estudos feitos por
BOUBONNAIS et al (1998) com o ciclo voltamétrico do ABTS (figura 6.33) tendo o álcool
veratrílico como substrato. Os radicais cátion e dicátion do ABTS são relativamente estáveis e
a transferência do elétron no sistema lacase-mediador é completamente reversível.
Corrente (µA)
Figura 6.33. Ciclo voltamétrico do ABTS.
Potencial (mV)
Segundo BOURBONNAIS e colaboradores (1998) na catálise oxidativa, o mediador
ABTS é oxidado ao radical dicátion ABTS2+. O radical dicátion difunde na solução e oxida o
álcool veratrílico. Essa reação é irreversível devido a oxidação do álcool veratrílico a
veratraldeído, que regenera o radical ABTS•+ .
Para o HBT, o mecanismo é radicalar com transferência de hidrogênio atômico, de
acordo com a figura 6.34.
Assim, a etapa inicial de oxidação do HBT a HBT•+ pela lacase, e a desprotonação do
HBT•+ deva seguir como num ciclo voltamétrico. Tanto o HBT quanto o ácido violúrico
possuem o grupo >N – OH e o mediador oxidado é o radical aminoxil (>N- O•) (figura 6.34)
que é capaz de abstrair um hidrogênio atômico do substrato (GALLI e GENTILLI, 2004)
levando a formação de um radical benzílico que, então, é transformado em produtos de
oxidação pela interação com o oxigênio (figura 6.34).
lacase
Figura 6.34. Mecanismo radicalar com transferência de hidrogênio atômico de uma estrutura da lignina.
O ciclo voltamétrico do HBT é de baixa varredura (5 mV/s) indicando que o radical
produzido pela oxidação eletroquímica é muito reativo (POTTHAST et al., 2001) e não é
estável e que se decompõe a compostos não redutíveis (BOURBONNAIS et al., 1998),
indicando que Medox sofre relativa rápida decomposição (FABBRINI et al., 2002). Na
oxidação de substratos não fenólicos com o sistema lacase-mediador, os produtos de
decomposição das espécies do Medox podem levar a reações laterais com o substrato. Como
exemplo de reações laterais, GRECI (1983) mostrou que a espécie >N-O• pode ser adicionada
ao >N-OH original, formando as correspondes espécies >N-H reduzidas.
VA
Figura 6.35. Formação do radical aminoxil em mediador que possuem >N-OH.
6. 7. Otimização das condições de biobranqueamento das polpas etanol-água (2) com o
sistema lacase comercial/HBT
Para a determinação das melhores condições para o biobranqueamento de polpas
etanol-água (2) com lacase e mediador/HBT foi feito um planejamento fatorial 23 em que
foram usadas como variáveis independentes a consistência, quantidade de lacase e quantidade
de mediador. A consistência foi variada de 2 a 10%, a quantidade de lacase estudada foi de 10
a 150 UI/g de polpa seca e o mediador foi estudado na faixa de 0,5 a 4% (relação polpa seca)
com pontos axiais e 4 repetições no ponto central. A tabela 6.17 traz a matriz do planejamento
fatorial.
Para a determinação do melhor tempo de tratamento foram feitos experimentos de
acordo com a matriz do planejamento nos tempos de 1, 4 e 8 h de reação em shaker a 160 rpm
de agitação a 45 ºC. Foi obtido como variável resposta o número kappa das polpas tratadas
com o sistema lacase mediador e extraídas com NaOH 1,5% (m/v), uma vez que as polpas
somente tratadas com lacase mediador, por 4 h, apresentaram número kappa alto (valores
maiores que a polpa original, número kappa 52,7, polpa etanol-água somente com extração
alcalina apresentou número kappa em torno de 20, como mostra a tabela 6.18.
Tabela 6.17. Planejamento fatorial completo 23 para a otimização das condições de branqueamento de polpas etanol-água de palha.
Níveis originais das variáveis Níveis codificados das variáveis Ensaios Lacase (UI/g)
Mediador (%)
Consistência (%)
Lacase Mediador Consistência
1 80 2,25 6 0 0 0 2 38,3 3,29 3,62 -1 1 -1 3 121,6 1,21 8,38 1 -1 1 4 10 2,25 6 -1,68 0 0 5 150 2,25 6 1,68 0 0 6 80 2,25 6 0 0 0 7 121,6 1,21 3,62 1 -1 -1 8 38,3 3,29 8,38 -1 1 1 9 38,3 1,21 8,38 -1 -1 1 10 80 2,25 6 0 0 0 11 80 4 6 0 1,68 0 12 80 2,25 10 0 0 1,68 13 121,6 3,29 3,62 1 1 -1 14 80 2,25 6 0 0 0 15 80 2,25 2 0 0 -1,68 16 80 0,5 6 0 -1,68 0 17 121,6 3,29 8,38 1 1 1 18 38,3 1,21 3,62 -1 -1 -1
Tabela 6.18. Resultados de número kappa de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador/HBT por 4 h de reação. Experimentos Lacase HBT Consistência Número kappa (L) 1 0 0 0 83,62 2 -1 -1 -1 83,92 3 0 0 -1,68 74,81 4 -1 1 -1 76,04 5 0 0 1,68 81,86 6 1 1 1 74,95 7 1 -1 -1 83,15 8 1 -1 1 78,14 9 -1 1 1 66,82 10 0 0 0 80,83 11 0 1,68 0 78,33 12 0 0 0 74,62 13 -1,68 0 0 95,79 14 0 0 0 71,74 15 1 1 -1 77,26 16 -1 -1 1 95,63 17 0 -1,68 0 106,47 18 -1 -1 -1 63,36
A tabela 6.19 mostra os resultados do número kappa LE e de lignina total de polpas
tratadas de acordo com o planejamento fatorial da tabela 6.17. Para polpas etanol-água (2)
tratadas com o sistema mediador/HBT o uso da maior quantidade de mediador, com 1 h de
reação, não proporcionou a maior redução do número kappa das polpas (ensaio 11 da tabela
6.19). A polpa etanol-água apresentou o menor número kappa LE (número kappa 6,52 e
lignina total 2,78%) no ensaio realizado com 2,25% (relação massa de polpa ou 18 mmol) de
mediador, menor consistência e 80 unidades de lacase por 1 h (ensaio 3 da tabela 6,19). Para
as polpas etanol-água o sistema lacase-mediador/HBT com baixas consistências (2%) foi a
que apresentou menor número kappa. Com 1 h de reação, a carga de mediador não foi
relevante no processo de deslignificação da polpa, pois tanto as polpas tratadas com a menor
carga (0,5%) como com a maior carga (4%) apresentaram mesma quantidade de lignina
(16%) e que não apresentaram deslignificação em relação à polpa original (tratada somente
com NaOH). A consistência foi relevante na deslignificação das polpas etanol-água tratadas
com 1 h de reação, pois polpas tratadas com mesma carga de lacase e mediador, apresentaram
diferentes graus de deslignificação: polpas com 2 % de consistência apresentaram 72,0% de
deslignificação enquanto polpas tratadas com 10% de consistência apresentaram 43,2% de
deslignificação.
Tabela 6.19. Resultados de número kappa e lignina total de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase-mediador/HBT.
Lacase Mediador Consistência Kappa Kappa kappa Lignina Lignina LigninaEnsaio (UI/g) (%) (%) 1 h 4h 8h (%) 1 h (%) 4 h (%) 8h1 80 2,25 6 25,03 45,94 33,21 12,04 22,50 16,132 38,3 1,21 3,619 32,35 42,93 27,98 15,70 20,99 13,523 80 2,25 2 6,52 39,64 26,91 2,78 19,35 12,984 38,3 3,29 3,619 26,25 37,58 36,13 12,65 18,32 17,595 80 2,25 10 12,26 38,66 28,44 5,66 18,86 13,756 121,6 3,29 8,38 26,87 39,32 29,55 12,96 19,19 14,307 121,6 2,21 3,619 22,61 42,66 23,74 10,83 20,86 11,398 121,6 1,21 8,38 24,06 41,67 9,10 11,55 20,36 4,079 38,3 3,29 8,38 18,47 34,52 30,03 8,76 16,79 14,5410 80 2,25 6 20,64 41,8 30,68 9,85 20,43 14,8611 80 4 6 33,00 13,29 26,74 16,02 6,17 12,9012 80 2,25 6 25,06 43,22 33,26 12,05 21,14 16,1513 10 2,25 6 14,43 33,41 15,78 6,74 16,23 7,4214 80 2,25 6 32,08 39,94 28,19 15,56 19,50 13,6215 121,6 3,29 3,619 34,40 39,64 32,18 16,72 19,35 15,6116 38,3 1,21 8,38 26,91 42,21 24,03 12,98 20,63 11,5417 80 0,5 6 33,59 42,87 24,82 16,32 20,96 11,9318 150 2,25 6 35,56 46,62 9,87 17,31 22,84 4,46 Polpa original: número kappa 52,69 e lignina total 25,87 e polpa tratada com NaOH; número kappa 20,86 e lignina total 9,96 (valores de lignina calculados de acordo com nº kappa = 2,00*lignina total (%) + 0,7972.
Com 1 h de reação a carga de enzima também foi significativa na deslignificação da
polpa, ou seja, com o uso de 10 unidades de lacase a polpa apresentou 6,74% de lignina e com
o uso de 80 unidades de enzima a polpa apresentou 12% de lignina total. Assim o uso de
menores quantidades de enzima proporcionaram maiores deslignificações da polpa. Portanto,
para a polpa etanol-água o mais interessante economicamente é o uso de baixas cargas de
mediador (devido ao alto custo do mediador), baixa carga enzimática (custo da enzima). No
entanto, o que não se mostrou adequado para uma aplicação industrial foi a baixa consistência
(2%) que seria ideal entre 15 ou 20%. Com 4 h de reação apenas o uso de 80 unidades de
lacase, 4 % de mediador e polpa com 6% de consistência apresentou deslignificação de 38%.
Para longos períodos de tratamento (8 h) o uso de consistências maiores de 2%, ou seja, acima
de 6%, proporcionam a deslignificação da polpa em diferentes extensões: uso de 8,38% de
consistência proporcionou deslignificação de 59,13%, com 6% de consistência a
deslignificação foi de 55,2%, com o uso de altas cargas enzimáticas, respectivamente de
121,6 e 150 unidades e uma deslignificação menor (25,5%) foi obtida com 6% de
consistência, porém com o uso de pouca lacase (10 unidades) (tabela 6.19).
POTTHAST e colaboradores (2001) estudaram a cinética da oxidação do álcool
benzílico com o sistema lacase-mediador HBT. A reação do HBT com a lacase é muito lenta
e a formação do radical HBT•+ é a etapa determinante da reação, assim toda a reação é
controlada enzimaticamente e matematicamente descrita por uma cinética de ordem zero,
contrariamente à reação com o uso do ABTS, como mediador, em que a reção é de segunda
ordem. A formação do benzaldeído também é uma reação de ordem zero, uma vez que a
formação do radical HBT•+ (intermediário oxidado pela lacase) é a etapa determinante da
reação. Todas as reações subseqüentes são cineticamente dependentes deste processo, e assim
a formação do benzaldeído também exibe cinética de ordem zero. A reação é de ordem zero
até cerca de 5 horas de reação e depois desse tempo um aumento da desativação da enzima
desacelera a geração de benzaldeído.
A figura 6.36 apresenta a cinética do sistema lacase mediador/HBT para os estudos
das melhores condições de biobranqueamento de polpas etanol-água (2). Os dados da cinética
de biobranqueamento de polpas etanol-água (2) com mediador HBT mostraram que com 1 e 8
h de reação as polpas apresentaram número kappa similares e que na maioria dos ensaios do
planejamento fatorial as polpas tratadas com 1 h de reação apresentaram número kappa
menores.
Segundo BALAKSHIN e colaboradores (1998) a cinética de deslignificação de polpa
com o sistema lacase mediador é de pseudo primeira ordem em 4 h de reação. No entanto, a
revisão dos dados cinéticos revela que os dados da cinética de deslignificação se ajustam
melhor matematicamente, a uma reação de segunda ordem para períodos reacionais de 24 h.
A cinética de deslignificação é complexa devido não somente a reatividade da lignina residual
presente na polpa, mas também porque a atividade catalítica do sistema lacase mediador pode
mudar com o tempo de reação.
Cinética Lacase Comercial HBT
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo (h)
Núm
ero
kapp
a
123456789101112131415161718
Figura 6.36. Acompahamento do biobranqueamento de polpas etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/HBT.
No tratamento de polpa karft de pinus com o sistema lacase mediador/HBT a atividade
da lacase diminuiu com o aumento do tempo de reação (AMANN, 1997; BOURBONNAIS e
PAICE, 1996). O excesso de mediador pode causar a decomposição da lacase levando a um
menor grau de deslignificação da polpa (AMANN, 1997). Segundo IBARRA e colaboradores
(2006) 50% da atividade da lacase de Pycnoporus cinnabarinus permaneceu depois de 12 h a
50ºC na ausência de HBT, no entanto, na presença de 3,3 mM HBT (concentação molar de
mediador usado no tratamento de polpa), a lacase foi fortemente inativada e somente 9% da
atividade da lacase pode ser recuperada após 12 h de incubação. Mais de 50% de inativação
da lacase por HBT foi produzida nas primeiras 4 h. Na presença de polpa kraft de Eucalyptus
globulus, a inativação da lacase por HBT foi menor cerca de 20%.
Nos branqueamentos de polpas com o sistema lacase mediador o oxigênio (O2) pode
ser consumido pela degradação oxidativa da lignina residual da polpa, resultando na
deslignificação, mas também ocorrem reações laterais com substâncias da lignina já oxidada.
A concentração dos centros reativos dos substratos é relativamente maior do que a
concentração das espécies catalíticas uma vez que os centros reativos do substrato são
constituídos pela lignina residual e pelos fragmentos de lignina solubilizados. De acordo com
resultados da cinética depois de 12 h de reação a deslignificação da polpa chegou ao fim por
razão que pode ser a desativação do sistema catalítico (BALAKSHIN et al., 1999).
A partir dos resultados da cinética do tratamento lacase mediador foi determinado
como melhor tempo 1 h de reação. Com os dados de 1 h de reação e com os valores de
número kappa após extração alcalina das polpas tratadas com lacase mediador foi feito o
modelo matemático com as variáveis codificadas que representa o número kappa (LE) em
função da carga de lacase, quantidade de mediador e consistência:
Número Kappa (LE) = 88,2895 - 0,140117*Lacase - 17,9384*HBT -10,4025*Consistência -
0,00176502*Lacase2 + 0,0476441*Lacase*HBT +0,0358757*Lacase*Consitência +
0,666775*HBT2 +2,22457*HBT*Consitência + 0,113275*Consitência2
O modelo explica 83,82% dos dados e o ajuste dos dados foi de 65,62%.
A tabela 6.20 mostra os valores obtidos e os valores preditos pelo modelo matemático,
com significância de 10%.
De acordo com a tabela 6.20 os valores altos de número kappa obtidos
experimentalmente foram próximos aos valores preditos pelo modelo matemático, no entanto
para valores de número kappa baixos não houve semelhança com os valores propostos pelo
modelo matemático proposto. O ideal no tratamento de polpas com o sistema lacase-mediador
é obter polpas com os menores valores de número kappa, e conseqüentemente as polpas com
baixo número kappa possuem menor conteúdo em lignina residual e que portanto são
interessantes para a produção de polpas de dissolução.
Tabela 6.20. Valores obtidos e valores preditos pelo modelo matemático do planejamento fatorial da otimização do sistema lacase mediador/HBT de polpas etanol-água (2). Ensaio Valor Obtido Valor Ajustado Lim. Conf. – 90% Limit. Conf. +90% 1 25,03 26,29 21,85 30,74 2 32,35 29,83 22,54 37,12 3 6,52 11,32 4,04 18,61 4 26,25 24,63 17,69 31,57 5 12,26 10,63 3,69 17,57 6 26,87 26,29 21,84 30,74 7 22,61 20,79 13,51 28,08 8 24,06 28,16 20,87 35,45 9 18,47 16,66 9,37 23,95 10 20,64 26,29 21,84 30,74 11 33,00 32,21 25,27 39,15 12 25,06 23,42 16,48 30,36 13 14,43 18,52 11,23 25,81 14 32,08 26,29 21,84 30,74 15 34,40 32,21 25,85 39,73 16 26,91 32,79 17,51 31,39 17 33,59 24,45 23,79 38,37 18 35,56 40,35 33,07 47,64
A tabela 6.21 apresenta a análise de variância para o número kappa (LE) de polpas
etanol-água tratadas com lacase mediador/HBT.
Devido a grande variabilidade inerente aos bioprocessos que envolvem enzimas
(RODRIGUES e IEMMA, 2005) foram considerados significativos os parâmetros com p-
valores menores que 10% (p<0,1) (tabela 6.21) e de acordo com a figura 6.37. Assim foram
significativos 5 termos; lacase, consistência, termo quadrático da lacase, interação lacase e
consistência e a interação mediador (HBT) e consistência.
Tabela 6.21. ANOVA para o número kappa (LE) de polpas tratadas com sistema lacase mediador/HBT por 1 h de reação. Soma de
Quadrados Quadrados Médias
FCalc p-valor
A:lacase 236,387 236,387 10,31 0,0124 B: HBT 72,7118 72,7118 3,17 0,1129 C: Consistência 105,834 105,834 4,61 0,0640 AA 118,583 118,583 5,17 0,0526 AB 34,0725 34,0725 1,49 0,2576 AC 101,175 101,175 4,41 0,0689 BB 6,57888 6,57888 0,29 0,6068 BC 242,55 242,55 10,57 0,0117 CC 5,20771 5,20771 0,23 0,6465
Diagrama de Pareto
Efeito padronizado
+-
0 1 2 3 4
CCBBAB
B:HBTAC
C:ConsitênciaAA
A:LacaseBC
Figura 6.37. Diagrama de pareto com os valores dos efeitos de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador (HBT) por 1 h de reação.
Uma das condições exigidas pelo modelo estatístico utilizado na análise de variância é
que os erros de ajustamento sejam independentes e normalmente distribuídos e tal verificação
pode ser feita através do gráfico de valores preditos versus resíduos, em que não é identificada
tendência que poderia invalidar o modelo matemático proposto, como mostra a figura 6.38.
A figura 6.39 mostra a superfície de resposta e curvas de contorno para as condições:
quantidade de lacase e de mediador e a consistência que levam a obter polpas com número
kappa em torno de 5. A quantidade de HBT foi fixada em 3,6% devido ter sido a quantidade
de mediador mostrada como a que leva aos menores valores de número kappa.
Valores Preditos
Res
íduo
s
0 10 20 30 40-6
-4
-2
0
2
4
6
Figura 6.38. Gráfico dos valores preditos versus resíduos para o tratamento lacase mediador/HBT de polpas etanol-água (2).
A figura 6.39 mostra a superfície de resposta e as curvas de contorno em função da
quantidade de lacase, mediador e consistência para o número kappa (LE) de polpas etanol-
água (2). Pela figura 6.39, ao se utilizar a carga de 150 unidades de lacase por grama de polpa
(base seca), obtém polpas com número kappa LE de 4 a 7, com a quantidade de mediador
variando em toda extensão estudada e em consistências de 2 a 4,5%. Como a quantidade de
mediador HBT não se mostrou determinante para o número kappa das polpas etanol-água
tratadas com o sistema lacase-mediador, o uso das menores cargas de mediador é mais
economicamente viável, uma vez que nos processos lacase-mediador, a maior barreira para a
implementação industrial é o preço do mediador.
A condição otimizada dada pelo modelo matemático foi: consistência 9,98%, 150 UI/g
polpa seca de lacase e 0,5% (relação polpa seca) de mediador HBT. Pela análise da superfície
de resposta e curvas de contornos foram escolhidas para a validação do modelo matemático as
condições; 2% de consistência, 150 UI/g lacase e 3,6% de mediador. Foram feitos tratamentos
em triplicata das polpas etanol-água com o sistema lacase mediador e a análise de número
kappa foi feito em polpas após o branqueamento com NaOH 1,5% (m/v) por 1 h a 65ºC. O
número kappa apresentado pela polpa foi de 33,46 ± 0,18, assim não validando o modelo
matemático que nestas condições apresentaria polpa com número kappa 3,77.
CONSISTÊNCIA: 2,0 (%)
1,500 4,588 7,677 10,765 13,854 16,942 20,031 23,119 26,208 29,296 above
CONSISTÊNCIA: 2,0 (%)
LACASE (UI/g)
MED
IAD
OR
(%)
0,5
1
,0
1,5
2
,0
2,5
3
,0
3,5
4
,0
30 60 90 120 150
HBT:3,6 (%)
1,500 4,500 7,500 10,500 13,500 16,500 19,500 22,500 25,500 28,500 above
HBT:3,6 (%)
LACASE (UI/g)
CO
NS
ISTÊ
NC
IA (%
)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
30 60 90 120 150
LACASE: 150 (UI/g)
1,500 4,536 7,57310,60913,64516,68219,71822,75525,79128,827
above
LACASE (UI/g)
CONSISTISTÊNCIA (%)
ME
DIA
DO
R (%
)
0
,5
1,0
1
,5
2,0
2
,5
3,0
3
,5
4,0
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 6.39. Curvas de contorno em função da consistência, quantidade de lacase e mediador para o número kappa (LE) de polpas etanol-água (2).
O modelo exponencial proposto ajustou 65,62% dos dados e assim não se mostrando
um modelo adequado para o sistema lacase comercial mediador/HBT para polpas etanol-água
(2) de palha de cana. Como sugestão de trabalhos futuros, seria continuar fazendo novos
experimentos para a otimização das melhores condições de biobranqueamento com lacase
mediador/HBT ou ainda testar outros modelos matemáticos para os resultados obtidos neste
trabalho.
6 .8. Otimização das condições de biobranqueamento de polpas etanol-água (2) tratados
com lacase comercial e mediador ácido violúrico
O estudo das melhores condições para o tratamento das polpas etanol-água (2) com o
sistema lacase comercial mediador/AV foi feito utilizando a mesma matriz de planejamento
fatorial apresentada na tabela 6.17. Experimentos com 1, 4 ou 8 h de reação foram feitos para
determinar o melhor tempo de reação.
A tabela 6.22 apresenta os resultados de número kappa e lignina total de polpas etanol-
água (2) tratadas com o sistema lacase-mediador/AV, de acordo com os ensaios do
planejamento experimental da tabela 6.17. De acordo com os resultados apresentados na
tabela 6.22 semelhantemente às condições de quantidade de mediador (2,25%) e quantidade
de lacase (80 UI/g) utilizadas no sistema lacase-mediador/HBT, porém com o uso de 6% de
consistência a polpa obtida com 1 h de reação apresentou número kappa 5,21 e lignina total
de 2,13% (ensaio 12), porém não foi com uma hora de reação que a polpa apresentou os
menores número kappa e sim com 8 h de reação. Nos ensaios 14: mediador 2,25% e lacase 80
UI/g e consistência 6% a polpa apresentou número kappa 3,98 com lignina total de 1,51% e
no ensaio 9, também com 8 h de reação, a polpa apresentou número kappa 4,91 e lignina total
de 1,98% com o uso de 38,3 unidades de lacase, 3,29% de mediador e 8,38% de consistência.
As polpas etanol-água tratadas com lacase-mediador/AV por 8 h de reação apresentaram
valores baixos de número kappa (em torno de 4), porém longos períodos de tratamento não
são adequados industrialmente, sendo assim mais adequado optar por 1 h de reação, mesmo
com polpas com número kappa ligeiramente maior do que as polpas obtidas com 8 h de
reação. Com uma hora de reação, o uso de 80 unidades de lacase, 2,25% de mediador e 6% de
consistência proporcionou deslignificação da polpa de 78,6%. Para as mesmas condições de
lacase (80 UI/g) e mediador (2,25%) a consistência não foi relevante na deslignificação da
polpa; já para cargas maiores de lacase (121,6 UI/g) e mediador (3,29%) a consistência foi
relevante com maiores consistências apresentando menores graus de deslignificação. Para
maiores cargas de enzima ocorreu maior deslignifição da polpa, ou seja, ao se utilizar 8 vezes
mais lacase a deslignificação da polpa foi quadruplicada. Para tempo de reação de 4 h, o
aumento da consistência de 2 para 6% diminui a deslignificação da polpa em 50%. A carga de
mediador não foi relevante para 80 unidades de lacase e 6 % de consistência na
deslignificação da polpa. Para 8 h de reação o aumento da carga de lacase de 10 para 80
unidades não aumentou o grau de deslignificação da polpa, o aumento da consistência da
polpa proporcionou maior grau de deslignificação e a variação da quantidade de mediador não
foi relevante para a deslignificação da polpa.
Tabela 6.22. Resultados de número kappa e lignina total de polpas etanol-água tratadas com o sistema lacase-mediador/AV.
Lacase Mediador Consistência Kappa Kappa kappa Lignina Lignina LigninaEnsaio (UI/g) (%) (%) 1 h 4h 8h (%) 1 h (%) 4 h (%) 8h1 80 2,25 6 33,30 17,16 17,14 16,17 8,10 8,102 38,3 1,21 3,619 31,11 15,30 27,79 15,08 7,18 13,423 80 2,25 2 30,38 10,59 24,35 14,71 4,82 11,704 38,3 3,29 3,619 19,39 10,83 23,78 9,22 4,94 11,425 80 2,25 10 25,90 23,75 10,48 12,48 11,40 4,776 121,6 3,29 8,38 14,86 21,86 6,42 6,96 10,46 2,747 121,6 2,21 3,619 16,15 28,57 20,46 7,60 13,81 9,768 121,6 1,21 8,38 23,47 10,36 6,10 11,26 4,71 2,579 38,3 3,29 8,38 8,02 22,80 4,91 3,54 10,92 1,9810 80 2,25 6 27,40 28,01 10,68 13,23 13,53 4,8611 80 4 6 22,38 24,31 18,64 10,71 11,68 8,8412 80 2,25 6 5,21 4,66 20,85 2,13 1,85 9,9513 10 2,25 6 17,85 10,54 8,69 8,45 4,79 3,8714 80 2,25 6 25,95 29,58 3,98 12,50 14,32 1,5115 121,6 3,29 3,619 8,38 20,00 14,90 3,71 9,53 6,9816 38,3 1,21 8,38 16,85 22,45 24,90 7,95 10,75 11,9817 80 0,5 6 22,46 31,72 24,60 10,75 15,38 11,8318 150 2,25 6 29,25 14,58 11,80 14,15 6,81 5,43 Polpa original: número kappa 52,69 e lignina total 25,87 e polpa tratada com NaOH; número kappa 20,86 e lignina total 9,96 (valores de lignina calculados de acordo com nº kappa = 2,00*lignina total (%) + 0,7972.
A figura 6.40 mostra os dados cinéticos do tratamento de polpas etanol-água.
O perfil dos tratamentos das polpas etanol-água (2) com sistema lacase mediador/AV é
semelhante ao perfil apresentado pelas polpas tratadas com o sistema lacase/HBT, no entanto
os valores de número kappa (LE) das polpas tratadas com o sistema lacase mediador/AV são
menores do que os das polpas tratadas com lacase mediador/HBT.
Assim como no sistema lacase mediador/HBT foi escolhido como melhor tempo de
tratamento o tempo de 1h de reação e as análises de número kappa foram feitas nas polpas
tratadas com lacase mediador seguida de extração alcalina com NaOH 1,5% (m/v).
Cinética Lacase Comercial/AV
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 2 4 6 8
Tempo (h)
Núm
ero
kapp
a
123456789101112131415161718
Figura 6.40. Acompanhamento do biobranqueamento de polpas etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV.
O modelo matemático em função das variáveis consistência, quantidade de lacase e
mediador AV e do número kappa (LE) das polpas etanol-água (2) é dado por:
kappa LE ac vilúrico = 60,5816 - 0,250663*Lacase - 28,0755*AV -13,9765*Consitência +
0,000740596*Lacase2 + 0,128105*Lacase*AV +0,0338502*Lacase*Consitência +
2,1803*AV2 + 0,85281*AV*Consitência+ 1,21623*Consitência2
O modelo matemático explicou 88,67% dos dados e ajustou 71,68% dos dados.
A tabela 6.23 mostra a análise de variância para as polpas etanol-água (2) tratadas com
lacase mediador/AV.
A nível de 10% de significância apenas os termos quantidade de mediador, interação
lacase mediador e a consistência quadrática foram significativas, como pode ser observado na
tabela 6.23 e no diagrama de pareto dos efeitos padronizados na figura 6.41.
Os valores de número kappa obtidos e os preditos pelo modelo matemático estão
apresentados na tabela 6.24, a um nível de significância de 10%.
Tabela 6.23. ANOVA para o número kappa (LE) de polpas tratadas com sistema lacase mediador/AV por 1 h de reação. Soma de
Quadrados Quadrados Médias
FCalc p-valor
A:lacase 43,02 43,02 2,13 0,1949 B: AV 102,04 102,04 5,05 0,0658 C: Consistência 1,81 1,81 0,09 0,7747 AA 18,13 18,13 0,90 0,3802 AB 178.,67 178,67 8,84 0,0249 AC 65,33 65,33 3,23 0,1224 BB 61,08 61,08 3,02 0,1328 BC 25,85 25,85 1,28 0,3013 CC 521,35 521,35 25,79 0,0023
De acordo com a tabela 6.24 os valores preditos pelo modelo matemático e os valores
obtidos experimentalmente não diferem muito entre si. Para o maior valor de número kappa
obtido experimentalmente e o valor predito existe uma diferença de 5 pontos e os valores
mais baixos de número kappa obtidos experimentalmente se aproximaram mais aos valores
preditos pelo modelo, mostrando assim que houve um ajuste dos dados ao modelo proposto.
Tabela 6.24. Valores obtidos e valores preditos pelo modelo matemático para polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase-mediador/AV. Experimentos Valor
Obtido Valor Ajustado
Lim. Conf. -90% Lim. Conf. + 90%
1 33,29 28,61 23,57 33,64 2 31,11 29,75 22,59 36,91 3 30,37 28,43 21,04 35,83 4 19,38 21,68 14,25 29,09 5 25,90 28,28 21,42 35,13 6 14,86 28,61 23,57 33,64 7 16,14 16,70 9,54 23,86 8 23,47 19,62 12,23 27,01 9 8,02 6,70 -0,45 13,86 10 27,40 28,61 23,57 33,64 11 22,37 27,02 20,16 33,88 12 5,21 9,80 2,95 16,66 13 17,85 15,86 8,47 23,25 14 25,94 28,61 23,57 33,64 15 8,37 8,44 1,02 15,86 16 16,84 16,86 9,44 24,28 17 22,45 19,16 11,19 27,12 18 29,24 8,38 -4,05 20,83
Gráfico de Pareto
Efeito Padronizado
+-
0 1 2 3 4 5 6
C:ConsitênciaAABC
A:LacaseBBAC
B:AVABCC
Figura 6.41. Diagrama de pareto com os valores dos efeitos de polpas etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador (AV) por 1 h de reação.
A figura 6.42 mostra o gráfico dos valores preditos versus resíduos para as polpas
etanol-água (2) tratadas com o sistema lacase mediador/AV.
Valores preditos
Res
íduo
s
0 10 20 30 40
-4,7
-2,7
-0,7
1,3
3,3
5,3
Figura 6.42. Gráfico dos valores preditos versus resíduos para o tratamento lacase mediador/AV de polpas etanol-água (2).
A validação do modelo foi feita em triplicata usando as condições: 10 % de
consistência, 10 UI/g de polpa seca de lacase e 1,5% (relação polpa seca) de mediador/AV. A
análise do número kappa foi feita após o branqueamento das polpas tratadas com o sistema
lacase mediador/AV e extração alcalina com NaOH 1,5% (m/v). Para estas condições o valor
do número kappa (LE) predito pelo modelo matemático é de 14,79 e o resultado encontrado
foi de 8,12 ± 1,56, sendo que o modelo ajustou 71,68% dos dados. Nos experimentos feitos
com lacase-mediador/AV as variáveis estudadas (quantidade de lacase, quantidade de
mediador e consistência) foram melhores ajustados pelo modelo matemático proposto do que
o modelo proposto para os experimentos realizados com o sistema lacase-mediador/HBT.
A figura 6.43 apresenta a superfície de resposta e de curvas de contorno para o sistema
lacase mediador/AV de polpas etanol-água (2).
CONSISTÊNCIA: 10 (%)
1,500 4,582 7,664 10,745 13,827 16,909 19,991 23,073 26,155 29,236 above
CONSISTÊNCIA: 10 (%)
LACASE (UI/g)M
ED
IAD
OR
(%)
0
,5
1
,0
1
,5
2
,0
2
,5
3
,0
3
,5
4
,0
30 60 90 120 150
HBT: 1,5 (%)
1,500 4,574 7,647 10,721 13,794 16,868 19,941 23,015 26,089 29,162 above
AV: 1,5 (%)
LACASE (UI/g)
CO
NSI
STIS
TÊN
CIA
(%)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
30 60 90 120 150
LACASE: 10 (UI/g)
1,500 4,582 7,664 10,745 13,827 16,909 19,991 23,073 26,155 29,236 above
LACASE: 10 (UI/g)
CONSISTISTÊNCIA (%)
ME
DIA
DO
R (%
)
0
,5
1,0
1
,5
2,0
2
,5
3,0
3
,5
4,0
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 6.43. Superfície de resposta para o sistema lacase mediador/AV de polpas etanol-água (2).
Para o sistema lacase-mediador/AV, segundo a figura 6.43, para se obter polpas com
número kappa LE entre 4 e 7, ou número kappa menores do que 4, seria necessário utilizar
baixas cargas de mediador (1%) e consistências altas (7 a 9%), com o uso de 10 unidades de
lacase por grama de polpa seca. Essas quantidades utilizadas se mostram economicamente
interessantes industrialmente, pois ao se utilizar consistências altas (cerca de 10%) utiliza-se
menos água, gerando menos efluente, baixas doses de mediador (1%) e baixas cargas
enzimáticas (10 UI/g) representam custos menores em uma aplicação industrial do que se
fosse utilizar 150 UI/g de enzima. Em termos comparativos com a xilanase, o uso de 10
unidades de lacase ainda, é uma alta carga enzimática, pois o sistema xilanolítico é eficaz com
doses de uma unidade de enzima.
Foi feito o espectro na região da luz visível (UV) dos filtrados dos tratamentos de
polpas etanol-água (2) com o sistem lacase mediador/AV com 1, 4 ou 8 h de reação. Na figura
6.44 foi utilizado 80 UI/g de lacase, 2,25% (relação massa de polpa seca) de AV e
consistência 6,0%. Na figura 6.44 foi utilizada mesma quantidade de lacase e a mesma
consistência, porém a quantidade de mediador foi menor, 0,5%. Na figura 6.45 nota-se que
com 8 h de reação o espectro de UV apresentou forte absorção em 280 nm (presença de
compostos fenólicos) e existe a aborção em 550 nm (absorção do mediador AV). Com menor
quantidade de mediador (0,5%) (figura 6.38) a maior absorção em 280 nm foi notada com
uma hora de reação. A oxidação do ácido violúrico (AV) na presença de lacase leva a
diminuição da absorbância em 310 nm (XU et al., 2000).
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
11,11,21,31,41,51,61,7
200 300 400 500 600 700 800
Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
1-8h 1-1h 1-4h
Figura 6.44. Espectros de UV dos filtrados de tratamento de polpa etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV: 80 UI/g de lacase, 2,25% de Av e 6% de consistência.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 230 260 290 320 350 380 410 440 470 500 530 560 590
Comprimento de Onda (nm)
Abso
rbân
cia
1h 4h 8h
Figura 6.45. Espectros de UV dos filtrados de tratamento de polpa etanol-água (2) com o sistema lacase mediador/AV: 80 UI/g de lacase, 0,5% de AV e 6% de consistência.
Segundo GENG, LI e Xu (2004) os sistemas pressurizados com oxigênio não
melhoraram o branqueamento de polpas tratadas com o sistema lacase-mediador ácido N-(4-
cianofenil) acetoidroxâmico (NCPA), sintetizado de acordo com o procedimento descrito por
BRINK e CRUMBLISS (1982) em comparação com os sistemas de branqueamento de polpas
expostos ao ar. Nos experimentos pressurizados com oxigênio, a alvura e o número kappa
foram constantes por 1 a 3 h de reação, assim o tempo de 1 h foi suficiente para o sistema
lacase comercial (Trametes villosa, doado pela Novozymes Biotech)e mediador NCPA
degradarem a lignina em polpas Kraft de madeira mole. Outras variáveis estudas no
branqueamento destas polpas foram a consistência, quantidade de lacase e de mediador. O
aumento da consistência de 2,5 para 5% modificou levemente a alvura (58,5 % ISO), no
entanto quando a consistência foi alterada de 5% para 10% houve diminuição de 2,5% na
alvura. Não foi totalmente compreendido como a consistência afeta a efecácia do
branqueamento. Presumivelmente, a velocidade de difusão e penetração da lacase e dos
mediadores nas fibras da polpa podem ser menores em polpas com maior consistência.
Quando a carga de lacase foi dobrada de 12,5 unidade por grama de polpa para 25 unidade,
houve significante aumento da alvura (1,5 % ISO) e diminuição do número kappa (um ponto)
das polpas com 5 ou 10 mg de mediador NCPA por grama de polpa. O aumento da carga de
lacase de 25 para 50 ou 100 unidades por grama de polpa não alterou a alvura ou o número
kappa das polpas.
6. 9. Seqüência de branqueamento de polpas etanol-água (2) de palha
A polpa etanol-água (2) foi branqueada com uma seqüência de branqueamento
enzimático e químico totalmente livre de cloro. Foram estudados as ordens de aplicação de
xilanase de B. pumilus (1 unidade de enzima por grama de polpa seca) e 10 UI/g de lacase
comercial, com 1,5% de mediador (relação à massa de polpa) e a condição otimizada para o
sistema lacase mediador/Av foi de 10 % de consistência, porém em erlenmeyer, com
quantidades de polpa maiores (30 g de polpa seca) do que as utilizadas nos experimentos de
otimização (2 g) não foi possível obter um sistema homogênio, assim foi utilizado a
consistência de 5%.
Foram estudadas as sequüências de branqueamento: XLE1PE2 e LE1XPE2 em que X=
xilanase, L= lacase comercial mdiador/AV, E1= extração alcalina com NaOH 1,5 % (m/v), P=
peróxido de hidrogênio 5% (relação a polpa seca), com 2% (relação a polpa seca) e E2=
extração alcalina com NaOH 3% (relação massa de polpa), E3= extração alcalina com 1,5%
de NaOH em relação a massa de polpa. Todos as etapas de branqueamento foram feitas
usando 5% de consistência, exceto a etapa de branqueamento com xilanase foi feita com 10%
de consistência em saco plástico que permitiu agitação manual da polpa os demais ensaios
foram feitos em erlenmeyer de 500 mL. A temperatur do tratamento xilanolítico foi de 50 ºC
por 2 h, o tratamento com lacase mediador foi feito a 45ºC em banho termostatizado por 1 h e
as extrações alcalinas e branqueamentos com peróxido de hidrogênio foram feitas a 60ºc por 1
h de reação.
As condições de branqueamento utilizadas na etapa com peróxido de hidrogênio foram
feitas de acordo com as condições otimizadas para o bagaço de cana pré-tratado por explosão
a vapor, de acordo com FARIA (1994).
Para o estudo da ação enzimática foram feitos os branqueamentos de polpas etanol-
água (2) na seqüência XLE1 e LE1X. As polpas branqueadas com a seqüência iniciadada com
xilanase apresentaram número kappa 20,65 ± 2,52 e a iniciada por lacase apresentou número
kappa 36,82 ± 3,86. A ordem de aplicação da xilanase ou da lacase influenciou no número
kappa das polpas, porém a alvura das polpas foi a mesma 24,7 % ISO.
Polpas etanol-água (2) foram tratadas na seqüência XPE2 e LPE2 e apresentaram
número kappa 26,62 ± 1,55 e 15,99 ± 2,12 e alvura 28 e 26,4 % ISO, respectivamente. Como
controle foi feito o branqueamento PE2 das polpas etanol-água (2) ou seja o branqueamento
sem enzima e a polpa apresentou número kappa 37,42 ± 1,59 e alvura 25,8 % ISO.
Os dados apresentados mostraram que existem diferenças ao se alterar a ordem do uso
das enzimas xilanase e lacase e que a lacase foi mais eficiente em reduzir o número kappa das
polpas etanol-água em uma seqüência de branqueamento e a xilanase foi mais eficiente para
melhorar a propriedade de alvura da polpa.
Estudos de seqüência de branqueamento aplicando lacase por duas vezes foi feito
usando a seqüência LE2LE e LE2LE2PE3 e as polpas apresentaram número kappa 55,4 ± 1,36
e 13,36 ± 2,84 e alvura 22,8 e 33,9 % ISO, respectivamente. Demonstrando que o uso de
apenas lacase mediador não reduz o número kappa das polpas, mas que na seqüência de
branqueamento o uso de lacase foi eficiente na redução do número kappa das polpas e que
contribuiu para o aumento da alvura das polpas. Segundo BALASHIN eta al. (1999) os
resultados de um tratamento com múltiplas etapas resultam em polpas com menor quantidade
de lignina residual. A quantidade de lignina residual removível em uma única etapa é limitada
e ocorre a deposição e acumulação de produtos oxidados na superfície da fibra da polpa
durante o tratamento enzimático que bloquea as demais reações oxidativas degradativas da
lignina residual. Uma vez que os fragmentos de lignina são removidos do meio reacional, a
polpa se torna sujeita a nova deslignificação. Outra razão para a limitação da deslignificação
da polpa pode ser a dificuldade de penetração dos reagentes na fibra da polpa e assim
limitando a degradação oxidativa da lignina residual somente à superfície das fibras. A
extração alcalina remove a lignina degrada permitindo o maior acesso dos reagentes à lignina
residual.
A polpa etanol-água (2) branqueada de acordo com a seqüência E1PE2 apresentou
número kappa 9,03 ± 0,50 e alvura 41,6 % ISO, assim mostrando que a polpa somente com o
branqueamento químico atingiu número kappa menor do que a polpa branqueada
enzimaticamente, porém o uso das enzimas auxiliou no aumento da alvura das polpas.
As polpas branqueadas com a seqüência XLE1PE2 e LE1XPE2 apresentaram número
kappa 15,27 ± 1,26 e 14,32 ± 3,25, respectivamente, ou seja, se levado em consideração o
desvio padrão, as polpas apresentaram o mesmo número kappa no final das seqüências de
branqueamento. Porém, as polpas branqueadas com a seqüência iniciada com a lacase
apresentou alvura 42,6% ISO e a polpa branqueada com a xilanase no início apresentou
alvura 39,8 % ISO.
A figura 6.46 apresenta a alvura das polpas branqueadas com diversas seqüências de
branqueamento e a figura 6.47 apresenta o número kappa dessas polpas.
In ic ia l
X LE
X P E
LE X
LE LE
LP E
LE LE P E
X LE P E
LE X P E
0 10 20 30 40
A lvu ra (% IS O )
Eta
pa d
e B
ranq
ueam
ento
E P E
P E
Figura 6.46. Alvura de polpas etanol-água (2) branqueadas com uma seqüência de branqueamento enzimático e com reagentes de branqueamento livre de cloro.
IBARRA e colaboradores (2006) fizeram estudos para determinar o melhor ponto de
incorporação do tratamento enzimático (lacase-mediador) na seqüência de branqueamento
industrial TCF consistindo de oxigênio, quelação e peróxido de hidrogênio. Foi comparada a
performance do tratamento das polpas com lacase-HBT antes e depois da etapa de
deslignificação com oxigênio. Os resultados finais de viscosidade e número kappa em ambos
os tratamentos foram similares, mas a maior alvura foi obtida quando o tratamento
enzimáticofoi aplicado depois do estágio de branqueamento com peróxido de hidrogênio.
Inicial XLE XPE LEX LELE LPE LELEPE XLEPE0
10
20
30
40
50
Núm
ero
kapp
a
Etapa de Branqueamento
EPE
E
PE
Figura 6.47. Número kappa de polpas etanol-água branqueadas com uma seqüência de branqueamento enzimático e com reagentes de branqueamento livre de cloro.
6. 10. Obtenção de Carboximetilcelulose de polpa etanol-água de palha branqueada com
seqüência livre de cloro
A polpa branqueada com a seqüência LE1XPE2 foi utilizada para a obtenção de
carboximetilcelulose, pois apresentou menor número kappa e maior alvura do qua a polpa
branqueada com a sequeência de branqueamento iniciada com xilanase.
Foram utilizados 5,0 g de polpa etanol-água (2) de palha de cana branqueada de
acordo com uma sequência de branqueamento TCF para a obtenção de carboximetilcelulose.
Obteve-se 6,93 g de carboximetilcelulose, que corresponde a um ganho de massa de 38,6%.
Nos derivados de celulose ocorre a introdução de grupos funcionais ou ramificações
na cadeia da molécula. Na reação de obtenção de CMC, o hidrogênio da hidroxila da celulose
é substituído pelo grupo –CH2COONa. A introdução do grupo funcional na celulose resulta
na obtenção de um produto de massa molar maior do que a celulose de partida, fazendo com
que haja um ganho de massa. A incorporação de –CH2COONa por unidade de resíduo de
glicose corresponde a 23,6% de substituição ou 0,70 grupo CH2COONa. O valor teórico
máximo de substituição é 3,0, no entanto a substituição chega a ser de 1,2 de acordo com
MACHADO (2000).
Foram feitos espectros de infravermelho de duas CMC comerciais, da polpa etanol-
água de palha branqueada e da CMC obtida neste trabalho.
A tabela 6.25 apresenta as bandas de oscilações características na região do
infravermelho para a celulose (SILVERSTEIN e BASSLER, 1974).
Tabela 6.25 Bandas de oscilações características na região do infravermelho para a celulose (SILVERSTEIN e BASSLER, 1974). Grupo funcional Tipo de deformação Região da Banda
(cm-1) -C-H; -CH2 Axial assimétrica, simétrica
Angular simétrica no plano e fora do plano Angular assimétrica no plano e fora do plano
2926 – 2853 1465 e 1350 720 e 1150
-O-H Axiais Angular no plano Angular fora do plano
3550 – 3200 1420 – 1330 769-650
-C-O; C-O-C
axial 1260 -1000
H2O adsorvida Angular simétrica no plano ~ 1600
A reação de carboximetilação ocorre pela substituição de um átomo de hidrogênio do
grupo hidroxila por um grupo carboximetila. A figura 6.42 apresenta os espectros de
infravermelho da CMC de palha e da polpa etanol-água branqueada. Nestes espectros foi
possível observar um decréscimo na absorbência da banda na região relativa ao estiramento
axial de O-H em 3600 cm-1e deslocamento dessa banda na região em torno de 3650-3400 cm -
1. A diminuição da absorbância deve-se a eterificação dos grupos O-H da celulose por grupos
carboximetílicos e o deslocamento da banda é devido à diminuição das ligações de hidrogênio
intramoleculares.1000 cm-1. Uma banda característica das ligações C-O e C-O-C típica de
éteres foi evidenciada na região de 1150-1000 cm-1.
A introdução do grupo –CH2COONa na estrutura da celulose (grupo que possui a
ligação carbonila inserida no grupo carboxilato) absorve na faixa de 1650-1550 cm-1 devido à
deformação axial assimétrica e essa danda diferencia basicamente o espectro da celulose
(polpa branqueada) com o da CMC.
A figura 6.48 apresenta o espectro de infravermelho de duas carboximetilceluloses
comerciais.
0,20,30,30,40,40,50,50,60,60,70,70,8
400900140019002400290034003900
Númro de Onda (cm-1)
Abso
rbân
cia
CMC Comercial "CPKelco"
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
400900140019002400290034003900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
CMC Comercial
Figura 6.48. Espectro de infravermelho de duas carboximetilceluloses comerciais.
A figura 6.49 apresenta os espectros de infravermelho da palha, da polpa branqueada e
da carboximetilcelulose obtida a partir de polpa de palha de cana branqueada.
De acordo com as especificações da CMC comercial da marca “CPKelco”, esta CMC
possui grau de substituição 0,60 a 0,95. Esta CMC comercial é um aditivo versátil que pode
ser aplicado em muitos campos industriais devido a habilidade de reter água e a capacidade de
engrossar líquidos, possui a propriedade de regular fluxos, estabiliza dispersões e atua como
um agente formador de filme.
A CMC obtida neste trabalho possui grau de substituição 0,78 e que estaria dentro da
faixa do grau de substituição da CMC comercial da marca CPkelco, assim provavelmente a
CMC de palha de cana poderia ser utilizada para as aplicações descritas acima.
O grau de substituição da CMC obtida foi avaliado através da análise da banda de
absorção na região de 1600 cm-1 em relação à banda na região de 901 cm-1 (Abs1600/Abs901),
devido a banda a 901 cm-1 corresponder à vibração do grupo O-C-O envolvendo o carbono-1
(anomérico) dos polissacarídeos e não sofrer influência dos outro grupos (MOROHOSHI,
1991). Através da relação de banda Abs1600/Abs901 foi possível obter um grau de substituição
de 0,78 para a CMCNa de palha de cana.
RUZENE (2005) obteve CMCNa de polpa etanol-água de bagaço de cana branqueada
com uma única etapa com clorito de sódio com grau de substituição de 0,63 (valor obtido pela
relção através da relação de banda Abs1600/Abs901.
Foi feito um teste de corpo de prova (MACHADO, 2000) com a CMC de palha obtida
neste trabalho. Neste teste verifica-se a afinidade da CMC com a água. Em um becker
colocou-se água e uma ponta de espátula de CMC na água. A amostra de CMC dissolveu-se
completamente na água e ficou com um aspecto gelatinoso. A dissolução da amostra de CMC
obtida a partir de polpa de palha em água confirma o sucesso na obtenção desse derivado de
celulose, pois a celulose (polpa de palha) mesmo sendo um material polar não dissolve em
água e a CMC por ser uma molécula polar tem grande afinidade com a água.
Polpa Branqueada
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
11,11,21,31,41,5
400750110014501800215025002850320035503900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
CMC Palha
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,50,6
0,7
0,8
0,9
1
400750110014501800215025002850320035503900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
400750110014501800215025002850320035503900
Número de Onda (cm-1)
Abs
orbâ
ncia
Polpa Branqueada CMC Palha
Figura 6.49. Espectros de infravermelho de carboximetilcelulose de palha de cana branqueada, da polpa de palha branqueada.
7. CONCLUSÕES
A palha de cana, apesar de ser um material lignocelulósico tal como o bagaço de cana
apresentou comportamento diferenciado do bagaço nos processos de polpação organosolv,
principalmete na polpação etanol-água, em que a polpa obtida necessitou ser classificada para
a remoção de estruturas da palha que não formaram polpa.
As xilanases de diferentes origens microbiológicas apresentaram diferentes ações nas
propriedades físicas das polpas. Em termos de viscosidade a xilanase de B. pumilus se
mostrou mais eficiente na melhora desta propriedade da polpa acetosolv. Em termos de
redução do número kappa das polpas acetosolv o uso da xilanase de T. aurantiacus se
mostrou mais eficiente.
A análise dos cromóforos e da quantidade de açúcares redutores liberados nos filtrados
dos tratamentos de polpas acetosolv com as diversas xilanases mostrou que elas atuam de
diferentes modos e que de modo geral ao se utilizar altas doses de xilanase houve a maior
liberação de açúcares redutores.
A xilanase de Humicola grisea pode ser usada com baixas cargas enzimáticas em
polpas acetosolv que não provocam a degradação da celulose em grande extensão.
O processo de polpação etanol-água influenciou grandemente as propriedades das
polpas. Na polpa etanol-água com cerca de 3% de pentosanas não foi observada melhoras nas
propriedades da polpa e não foi observada a ação xilanolítica. Em polpa etanol-água com
cerca de 10% de pentosanas o uso de 1 unidade de xilanase mostrou melhorar a propriedade
de viscosidade da polpa.
O sistema lacase mediador aplicado em polpa etanol-água (com 10% pentosana)
apresentou diferentes comportamentos na redução de número kappa. O mediador ácido
violúrico se mostrou mais eficiente na desliginificação das polpas etanol-água.
O uso de xilanase em seqüência de branqueamento da polpa etanol-água de palha
melhorou a propriedade de alvura da polpa e o uso de lacase foi mais eficiente na redução da
quantidade de lignina residual da polpa.
O uso combinado da xilanase com a lacase possibilitou obter polpa etanol-água
branqueada de acordo com uma seqüência de branqueamento totalmente livre de cloro que foi
utilizada para a obtenção da carboximetilcelulose.
RECOMENDAÇÕES FUTURAS
Estudar o sistema lacase mediador nas polpas acetosolv de palha de cana.
Fazer um estudo mais aprofundade da ação do sistema lacase mediador com o uso de
HBT em polpa etanol-água de palha.
Fazer o estudo das seqüências de branqueamento enzimático e químico de polpas
acetosolv e etanol-água para a obtenção de outros derivados de celulose que não a
carboximetilcelulose.
Fazer a caracterização da lignina de palha de cana e estudar a lignina presente nas
polpas tratadas enzimaticamente.
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