UNIVERSIDADE DE SOROCABA PRO- REITORIA...
86
0 UNIVERSIDADE DE SOROCABA PRO- REITORIA ACADÊMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Ítalo Frizo EFEITOS DO COGUMELO Lentinulaedodes (SHIITAKE) NA EXPOSIÇÃO MATERNO-FETAL AO METOTREXATO SOROCABA/SP 2014
Transcript of UNIVERSIDADE DE SOROCABA PRO- REITORIA...
0
UNIVERSIDADE DE SOROCABA
PRO- REITORIA ACADMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS
talo Frizo
EFEITOS DO COGUMELO Lentinulaedodes (SHIITAKE) NA EXPOSIO
MATERNO-FETAL AO METOTREXATO
SOROCABA/SP
2014
1
ItaloFrizo
EFEITOSDO COGUMELO Lentinulaedodes(SHIITAKE) NA EXPOSIO
MATERNO-FETAL AO METOTREXATO
SOROCABA, SP
2014
Dissertao apresentada Banca Examinadora do Programa de Ps-graduao no Mestrado Cincias Farmacuticasda Universidade de Sorocaba, como exigncia parcial para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas. Orientadora ProfDr Marli Gerenutti
2
ItaloFrizo
EFEITOS DO COGUMELO Lentinulaedodes (SHIITAKE) NA EXPOSIO
MATERNO-FETAL AO METOTREXATO
BANCA EXAMINADORA _____________________________________________
ProfaDraMarli Gerenutti Presidente da Banca
Universidade de Sorocaba
___________________________________ ProfaDra Yoko Oshima-Franco
Universidade de Sorocaba
____________________________________
ProfaDraRaquel de Mendona Rosa-Castro Universidade de Sorocaba
Dissertao aprovada como requisito parcial para obteno do grau de Mestre no Programa de Ps-graduao em Mestrado de Cincias Farmacutica da Universidade de Sorocaba.
Aprovado em ___/___/____
3
AGRADECIMENTOS
Gostaria primeiramente de agradecer a Deus por me permitir conseguir
tornar- se um homem de honra, honesto, vitorioso e vencedor de mais um obstculo.
Tambm gostaria de agradecer a minha famlia e a todos que me apoiaram
nos momentos difceis e de afastamento para realizao das atividades para
concluso desta etapa da minha vida.
Gostaria de agradecer e dedicar meu trabalho realizado neste projeto a minha
esposa rica e minha filha gata pelas muitas vezes que as deixei s ou me afastei
por tempos para executar as tarefas para concretizao desta fase.
A minha gratido eterna ficam as pessoas que foram fundamentais para que o
projeto se conclusse: a minha orientadora ProfaDraMarli
Gerenutti,ProfaMsMagaliGlauzer Silva, as mestrandas Mrcia Rebelo,Sthefany
Rodrigues Fernandes Viana e ThaisaBorimPickler; aos Tcnicos do laboratrio
Valria, Neia, Mrcia e a aluna de iniciao cientfica GiovanaSabadim, por toda
ateno e ajuda a mim concedida, a vocs deixo meus sinceros agradecimentos.
A empresa Yuri Cogumelos meu agradecimento pela doao das amostras de
cogumelos doadas para desenvolvimento da pesquisa.
Enfim agradeo a todos e todas que de alguma forma estiveram presentes e
puderam me ajudar, fica aqui meu muito obrigado.
4
``Bom mesmo ir luta com determinao, abraar a vida com paixo, perder com
classe e vencer com ousadia, por que o mundo pertence a quem se atreve. E a vida
muito bela para ser insignificante.
Charles Chaplin
5
RESUMO
Oemprego de cogumelos medicinais, como recurso de prtica generalizada
na medicina popular e tem aumentado acentuadamente nas ltimas dcadas. A
utilizao do Lentinulaedodesvem crescendo significativamente e, em alguns pases
utilizado tradicionalmente por suas propriedades teraputicas. Neste trabalho
pretendeu-se a avaliar o efeito protetor do Lentinulaedodes sobre uma droga
imussupressora (metotrexato) em modelo gestao em ratas. Foram utilizadosos
seguintes tratamentos: Lentinulaedodes 0.4g/kg/dia (SI), Lentinulaedodes 0.8
g/kg/dia (SII), metotrexato 0.20 mg/kg/dia (MTX), Lentinulaedodes 0.4g/kg/dia +
metotrexato 0.20 mg/kg/dia (SIMTX), Lentinulaedodes 0.8 g/kg/dia + metotrexato
0.20 mg/kg/dia (SIIMTX). Foram avaliados os parmetros bioqumicos sanguneos
maternos (ATL, AST, creatinina, ureia e estresse oxidativo) e morfolgicos fetais. Os
resultados obtidos indicam que a amostra de Lentinulaedodes utilizadaencontrou-se
dentro dos parmetros descritos na literatura para as concentraes de glucanas e
de compostos fenlicos.Tanto o Lentinulaedodes (SI e SII) quanto o MTX,como as
associaes (SIMTX SIIMTX) no promoveram efeitos de toxicidade materna,
entretanto em todos os tratamentos observou-se efeito fetotxico. O
Lentinulaedodes apresenta um efeito importante sobre a capacidade reprodutiva das
ratas durante o perodo de pr--implantao, sendo que este reverte os efeitos
deletrios promovidos pelo MTX nesta fase. Pode-se concluir que a utilizao
doLentinulaedodes como protetor na exposio ao metotrexato deve ser
considerada para se evitar abortos espontneos, entretanto, por apresentar efeitos
fetotxicos, suas doses devem ser bem definidas.
Palavras-chave:Anlise Bioqumica.Cogumelo
Shiitake.Lentinulaedodes.Toxicidade.
6
ABSTRACT
The use of medicinal mushrooms as a source of general practice in folk
medicine has increased in recent decades. The use of Lentinulaedodes has grown
significantly and in some countries is traditionally used for its therapeutic properties.
This work intended to evaluate the protective effect of Lentinulaedodes on the
imussupressor drug (methotrexate) in pregnancy model in rats. The following
treatments were used: Lentinulaedodes 0.4 g/kg/dia (SI), Lentinulaedodes 0.8
g/kg/day (SII) , methotrexate 0.20 mg/kg/day (MTX), Lentinulaedodes 0.4g/kg/dia +
methotrexate 0.20 mg/kg/day (SIMTX), Lentinulaedodes 0.8 g/kg/day + methotrexate
0:20 mg/kg/day (SIIMTX). Fetal maternal blood biochemical parameters (ATL, AST,
creatinine, urea and oxidative stress) were evaluated and morphological? The results
indicate that the sample Lentinulaedodes used was within the parameters described
in the literature for the concentration of glucans and phenolic compounds. Both
Lentinulaedodes (SI and SII) and MTX, as associations (SIMTX e SIIMTX) did not
cause maternal toxicity effects, however in all treatments were observed fetotoxic
effect. The Lentinulaedodes has an important effect on the reproductive capacity of
female rats during the pre - deployment, and this reverses the deleterious effects
promoted by MTX at this stage. It can be concluded that the use of Lentinulaedodes
as a protective exposure to methotrexate should be considered to prevent
miscarriages; however, by presenting fetotoxiceffects, their dose should be well
defined
Keywords: Biochemistry Analysis.Shiitake Mushrooms. Shiitake.Toxicity.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Lentinulaedodes etapas da produo em bloco de substrato. 18
Figura 2 - Linhagens de Lentinulaedodesidentificadas por cdigo. 31
Figura 3 - Comprovao da presena de compostos fenlicos amostra de Lentinulaedodes (Mtodo: Folin-Ciocauteau).
34
Figura 4 - tero retirado de ratas para avaliao da capacidade reprodutiva. 40
Figura 5 - Avaliao morfolgica externa de fetos fixados em Bodian: medidas realizadas com paqumetro.
41
Figura 6 - Sequncia de cortes de Wilson realizada nos fetos aps fixao em Bodian.
42
Figura 7 - Etapas do processo de diafanizao e colorao de fetos para a anlise ssea.
43
Figura 8 - Feto diafanizado para avaliao morfolgica ssea. 44
Figura 9 - Curva analtica do cido glico usado para quantificao de compostos fenlicos no Lentinulaedodes.
45
Figura 10 - Curva da glutationa reduzida (GSH) utilizada para avaliao de estresse oxidativo em sangue de ratas prenhes.
48
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sinonmias do Lentinulaedodes (1877- 1975). 15
Tabela 2 - Composio (%) de cidos graxos do Lentinulaedodes. 19
Tabela 3 - Ganho de peso (gramas) de ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes, durante o perodo de gestao.
47
Tabela 4 - A anlise dos parmetros antioxidantes CAT (catalase) e GSH (glutationa reduzida) em sangue das ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes durante o perodo de gestao.
49
Tabela 5 - Anlise bioqumica dos parmetros: transaminase alanina aminotrasnferase (ALT),transaminase aspartatoaminotransferase (AST), creatinina (CREJ2) e ureia (UREL) realizada em sangue de ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes durante o perodo de gestao.
51
Tabela 6 - Desempenho reprodutivo de ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes, durante o perodo de gestao.
54
Tabela 7 - Avaliao do desenvolvimento do concepto de ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes, durante o perodo de gestao.
56
Tabela 8 - Medidas morfolgicas (cm) externas dos fetos de ratas expostas ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s associaes, durante o perodo de gestao.
58
9
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotransferase
AMG Amiloglicosidase
AST Aspartatoaminotransferase
CAT Catalase
CREJ2 Creatinina
DHFR Dihidrofolatoredutase
DTNB 5-5-ditio-bis-2-cido nitrobenzico
EAG Equivalente de cido glico
FDA FoodandDrugAdministration
GLDH Glutamato desidrogenase
GPH-Px
GPH-R
Glutationaperoxidase
Glutationaredutase
GSH Glutationa
GS-SG Glutationadissulfeto
GSH-T Glutationatransferase
Hb Hemoglobina
LDH Lactato desidrogenase
NADH Nicotinamida adenina dinucleotdeo
MDH Malatodesidrogenase
MTX Metotrexato
NK Natural Killer
ROS Espcie reativa de oxignio
10
SUMARIO
1INTRODUO 13
1.1 Composio qumica do Lentinulaedodes 19
1.2 Utilizao teraputica do Lentinulaedodes 20
1.3 Agentes promotores do estresse oxidativo
1.4 Exposio materna ao metotrexato e avaliao toxicolgica na gestao
23
25
1.5 JUSTIFICATIVA 28
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
2.2 Objetivos especficos
30
30
30
3MATERIALE MTODOS 31
3.1Lentinulaedodes 31
3.2Obteno da amostra seca de Lentinulaedodes 31
3.3 Dosagens de glucanas e de compostos fenlicos 32
3.3.1 Determinao de glucanas 32
3.3.2 Determinao de compostos fenlicos 33
3.4 Animais 34
3.4.1Acasalamento e prenhez 35
3.5 Administraodas drogas 35
3.6 Avaliao da toxicidade materna 36
3.6.1 Avaliao bioqumica 36
3.6.1.1 Determinao da glutationa reduzida (GSH) 37
3.6.1.2 Determinao da atividade da catalase (CAT) 37
3.6.1.3Determinao da transaminase aspartatoaminotransferase (AST),
transaminase alanina aminotransferase (ALT), creatinina e da ureia.
38
3.7 Avaliao da capacidade reprodutiva 39
3.8Avaliao do desenvolvimento do concepto 40
11
3.8.1 Avaliao morfolgica externae visceral de fetos 41
3.8.2 Avaliao morfolgica ssea de fetos 42
3.9Anlise Estatstica 44
4 RESULTADOS 45
4.1 Teores de glucanas e de compostos fenlicos no Lentinulaedodes 45
4.2 Efeitos da exposio ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s
associaessobre da toxicidade materna
46
4.2.1 Avaliao do ganho de peso de ratas prenhes 46
4.2.2 Avaliao bioqumica materna 48
4.2.3 Avaliao da capacidade reprodutiva 52
4.3 Efeitos da exposio ao Lentinulaedodes, ao metotrexato e s.
associaes sobre o desenvolvimento do concepto
55
4.3.1 Avaliao morfolgica externa, visceral e ssea de fetos 57
5DISCUSSO 59
6CONSIDERAES FINAIS
7CONCLUSO
63
64
REFERNCIAS 65
ANEXO A - Certificado de aprovao em CEUA /Uniso 76
ANEXO B - Descarte dos animais 77
ANEXO C - Atestado de sade animal
ANEXO D - Atividades acadmico-cientficas desenvolvidas pelo aluno
ANEXO E - Atividades em estgio docente
78
79
82
12
1 INTRODUO
O cultivo decogumelos realizado h mais de 10 sculos na China e os
registros histricos indicam que a primeira espcie cultivada foi Auriculria auricula,
aproximadamente no ano de 600 d.C, e em seguida Flamulina velutipes, cerca de
800 d.C, e a terceira Lentinula edodes, por volta de 900 d.C (HERRERA, 2001).
Hipcrates foi o primeiro a mencionar o valor medicinal dos cogumelos, em 400 a.C.
Na primeira meno sobre os cogumelos, estes foram descritos como alimentos de
paladar agradvel para se consumir em forma de ch,mas para consumo na forma
solida no apresenta saboraprazvel(BEYER, 2003).
No Brasil, nas ltimas dcadas, o consumo de cogumelosvem crescendo
significativamente quando comparado a pases Europeus e Asiticos. Este fato est
atribudo presena de colnias de imigrantes asiticos espalhadas por todo o pas,
indicando que estes so os responsveis pelo cultivo e incorporao do consumo de
cogumelos no hbito alimentar dos brasileiros (FIDALGO; GUIMARES, 1985).
Os supostos benefcios medicinais e alimentcios dos cogumelos so os
responsveis pelo aumento nacional da procura e da produo, sendo que a
produo nacional de cogumelos comestveiscresce, em mdia, 15% ao ano
(SHIBATA; DEMIATE 2003). A produo mundial tambm vem aumentando em
nmero exponenciale,na ultima dcada, estimou-se uma produo de 18 milhes de
toneladas, levando a um crescimento econmico na rea (FAOSTAT, 2009).
Embora no Brasilexista a insuficincia de dadosque demonstrem o real perfil
das variedades de cogumelos cultivadas e consumidas, sabe-se que dentre
asvariabilidades de cogumelos produzidas se destaca o Shiitake(MATTILA et al.,
2000; SALES-CAMPOS et al., 2009). Shiitake (shii, tipo de rvore; take, cogumelo
em japons) um fungo aerbio decompositor de madeira, e que decompe
resduos vegetais intactos que ainda no sofreram prvia decomposio por outros
microrganismos (NAPPI; MORETTO, 1998), e cientificamente denominado
Lentinula edodes (CHANG; MILES, 1989).
O cogumelo Lentinula edodesocorre naturalmente em florestas da zona
temperada e subtropical da sia, em pases como o Japo, China, Brneo, Coria,
13
Tailndia, Burma, Nova Guin, alm de algumas regies do Himalaia e Filipinas. Por
apresentar caractersticas sensoriais excelentes foi denominado alimento dos
deuses pelos romanos e por suas propriedades teraputicas e nutricionais, ficou
conhecido como elixir da vida pelos chineses (NAPPI;MORETTO, 1998).
O cultivodoLentinulaedodes se originou na China e logo aps, comeou a ser
produzida no Japo e posteriormente, nos EUA, Europa e Amrica Latina (ROYSE
et al., 1985; SABOTA, 1996).
O interesse pela produo, cultivo e consumo do cogumelo Lentinula edodes
vem aumento progressivamente tornando-se oterceiro cogumelo mais consumido no
mundo(HANDAYANIet al., 2011).
Embora, no Brasil, j existam grandes produtores e importadores de
cogumelos, o cultivo normalmente se d em pequenas propriedades que, na maioria
das vezes, utilizam instalaes j existentes as quais so adaptadas, apresentando
manejo e cultivo rudimentares(BONONI et al., 1995).A regio do Alto Tiet (SP) a
maior produtora de cogumeloLentinula edodes, fato atribudo existncia da maior
colnia de imigrantes japoneses do Brasil (FRANCO, 2006; VILELA, 2012).
A micologia reconhece cinco filos nos fungos e, os fungos comestveis so
encontrados nos filos Ascomycota e Basidiomycota. No filo Basidiomycota esto
classificados os cogumelos comestveis (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007),
sendo que na ordem Agaricales encontra-se o maior nmero desses cogumelos e os
mais conhecidos (URBEN, 2004).
A classificao taxonmica empregada para o cogumelo Lentinula
edodessegundo Nappi e Moretto (1998) assim descrita: Reino: Fungi; Diviso:
Mycota; Classe: Basiodiomycetes; Subclasse: Holobasiodiomycetidae; Ordem:
Agaricales; Famlia: Tricholomataceae; Gnero: Lentinula; Espcie: Lentinula
edodes.No ltimo sculo, o cogumelo Lentinula edodes recebeu varias
denominaes (Tabela 1), e,em 1975 recebeu a denominao utilizada at a data de
hoje; entretanto, alguns autores e produtores ainda citam suas sinonmias.
14
Tabela 1- Sinonmias do Lentinula edodes (1877- 1975)
Nomes Ano
Agaricus edodes 1877
Collybia shiitake 1886
Armilaria edodes 1887
Agaricus russaticeps 1888
Lepiota shiitake 1889
Lentinus tonkinensis 1890
Mastaleucomyces edodes 1891
Pleurotus russaticeps 1891
Cortinellus shiitake 1899
Tricholoma shiitake 1918
Cortinellus 1925
Lentinus shiitake 1936
Cortinellus edodes 1938
Lentinus edodes 1941
Lentinula edodes 1975
FONTE: PRZYBYLOWICZ; DONOGHUE, 1988.
Segundo Urben (2004) os cogumelos so essencialmente terrestres. Porm
existem algumas espcies quecrescem em substrato de ligninaou emexcremento de
herbvoros.
O Lentinula edodes um cogumelo que cresce em substrato de lignina, e
pode ser produzido em toras, mtodo tradicional ou pode ser produzido em cultivo
intensivo. Embora, tradicionalmente o Lentinula edodesseja produzido em cepasde
eucalipto, o cultivo axnico em substratos base de diversos resduos agrcolas
vemganhando espao na produo comercial deste cogumelo(EIRA; MINHONI,
1996; SAN ANTONIO, 1981).
No cultivo axnico a colheita acontece mais rapidamentee a eficincia
biolgica do fungo bastante elevada(HIROMOTO, 1991; LEVANON
et al., 1993;PRZYBYLOWICZ; DONOGHUE, 1988). Neste cultivo intensivo so
utilizados blocos de serragem suplementada com nutrientes e substratos agrcola,
como por exemplo, farelos de cereais. Estes substratos atuam como fontes
15
denitrognioorgnico necessrio ao aumento da massa miceliana, interferindo com a
produtividade e eficincia biolgica do fungo.
A produtividade do fungo depende da sua capacidade de secretarenzimas
como as celulases, hemicelulases e ligninases, induzindo a liberao de nutrientes
para seu crescimento (BUSWELL; CAI; CHANG 1996; MONTINI,2001; ZHANXI;
ZHANHUA, 2001). As trocas gasosas dos substratos, durante o
crescimentovegetativo, para a produo destas enzimas so importantes, pois
trocas gasosas deficientes durante ocrescimento do fungo podem diminuir a
velocidade de miceliao em virtude da inibio da atividadeenzimtica
(DONOGHUE;DENISON, 1995 1996).
As selees adequadas do substrato, da suplementao e da linhagem,
garantem melhor resultado na produo. Entretanto, o controle das condies
climticas, o nmero de orifcios inoculados e os mtodos de manejo tambm so
fatores fundamentais que podem interferir no rendimento da produo (ANDRADE,
2003; MINHONI et al., 2005).
Antigamente, o bagao de cana prensado, devido suas caractersticas de
compactao fibrosa e areada, era um resduo muito utilizado na produo e no
cultivo de Lentinula edodes. No entanto, por ter sido considerado um resduo final
rico em paredecelular, de baixo contedo de clulas inteiras, baixadensidade e
pobre em protenas e minerais sempre houve a necessidade de suplementao com
nutrientes, de preferncia solveis para estarem prontamentedisponveis para o
fungo (BUSWELL; CAI; CHANG 1996; SANTOS, 1990). Sendo assim, a serragem
de eucalipto suplementada, vem ganhando espao na produo axnica do
Lentinula edodes.
A Figura 1 ilustra o processo de produo axnica do Lentinula edodes
utilizando na blocagem, a serragem de eucalipto suplementada. Este processo de
produo consiste inicialmente na lavagem da serragem para a extrao de
contaminantes fsicos e qumicos; mistura de substrato ao material a ser emblocado;
esterilizao dos blocos acondicionados em invlucros apropriados, para posterior
inoculao das cepas; inoculao das cepas; armazenamento dos blocos em salas
16
refrigeradas e com controle de unidade para o desenvolvimento de hifas; retirada
dos invlucros de acondicionamento; estoque dos blocos em sala de cultivo e coleta,
com temperatura e unidade controladas. A fase aps o desenvolvimento das hifas
o momento onde ocorre a comercializao dos blocos inoculados, para o cultivo em
pequena e mdia escala. Em todo este processo, o controle de qualidade
microbiolgico dos blocos e a manuteno das cepas, so fundamentais para a
produo sustentvel do Lentinula edodes.
17
Figura 1- Lentinula edodes etapas da produo em bloco de substrato.
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H) Legenda: A) Lavagem e secagem da serragem; (B) inoculao das cepas; (C) blocos inoculados sendo preparado para armazenamento; (D) armazenamento para a produo de hifas; (E) blocos sendo encaixotados para a comercializao; (F) blocos prontos para distribuio; (G)- blocos em processo de inicio de produo; (H) blocos produzindo para a coleta. Fonte: Elaboraoprpria
18
1.1Composioqumica do Lentinula edodes
Os cogumelos apresentam em sua constituio estruturas responsveis
pelas execues de funes importantes para proteo do organismo,
especialmente por serconsideradouma importante fonte de protenas (DIAS et al.,
2004; SUGUI et al., 2003). O cogumelo Lentinula edodesapresenta em sua
composio qumica, 90% de gua, 3-5% de carboidratos, 10-40% de protena, 2-
8% de lipdeos, 44% de fibras, 8-10% de minerais (BREENE 1990; BORCHERS et
al.,1999;CHEUNG et al., 2003).
Os teores de lipdeos presentes em cogumelos so extremamente baixos,
segundo dados analisados por Chang e Miles (1989) ficam entre os valores 1.1 e
8.3%. No cogumelo Lentinula edodes foi encontrado 2.1% de gordura em base seca,
foi concludo que 77.7% dos lipdeos eram formados de cidos graxos insaturados
com prevalncia para linolico (LONGVAH;DEOSTHALE 1998). A Tabela 2 indica a
composio lipdica do Lentinula edodes.
Tabela 2-Composio (%) de cidos graxos do Lentinula edodes.
cido mirstico 0.71
cido esterico 1.66
cido palmotilico 1.93
cido oleico 6.23
cido palmtico 21.94
cido linolico 67.53
Fonte: NAPPI;MORETTI, 1998.
Os minerais presentes no Lentinula edodesso o clcio, potssio, magnsio,
fsforo, sdio, cobre, ferro, mangans e zinco representando de 56 a 70% do total
de cinzas. Do contedo de minerais mais significativos est o clcio com 0.05 g/kg, o
potssio, 26.7g/kg, o magnsio, 1.55 g/kg e o fsforo com 8.7 g/kg(MATTILA et al.,
2001).
Os cogumelos podem ser uma boa fonte de vitamina B1, B2, B12, niacina,
biotina e vitamina C e folatos totais. Na Finlndia, em estudos realizados com
diversas espcies de cogumelos, Mattila et al (2000) observaram que o
19
Lentinulaedodesfoi a espcie que apresentou os mais elevados teores de vitamina
C (2.1mg/100g), B12 (0.07g/100g) e D (0.1 g/100g).
Entretanto, atualmente, o grande destaque dos valores nutricionais e
medicinais dos cogumelos est relacionado ao teor de glucanas, em especialao teor
das -glucanas. As -glucanas so aucares que esto ligados quitina e protenas,
presentes na parede celular e frutos dos fungos, so polissacardeos e exo
polissacardeos com funo estrutural (MOL et al.,1990).Em glucanosparticulares,
como o homo-e hetero-glucanos com(1 3), (14)eo (16)ligaes
glucosdicas, suposto serem osresponsveis poralgumas das
propriedadessaudveis decogumelos (LEE et al., 2009; MANZI; PIZZOFERRATO
2000).
A -glucana presente no Lentinula edodes conhecida como lentinan ou
lentinana(NEHA et. al.,2012). So estruturas moleculares que seguem uma ordem
formando um anel, que diferem da celulose das plantas, pois apresentam um tipo
especial de ligao entres as unidades e possuem ramificaes de alto peso
molecular (CLEARY; GRAHAN; HUSBAND, 1999; SHU; WEM; LIN,2003).A
lentinana uma -D-Glucana de alta massa molecular e configurao helicodal
isolada a partir de extrato aquoso do fungo (CHIARA et al., 1969). A frmula
molecular (C6 H10O5)n.
Os cogumelos tambm apresentam compostos fenlicos que so molculas
constitudas de pelo menos um anel aromtico, onde um hidrognio substitudo por
um radical de grupo hidroxila.A maioria observada na forma de steres ou
heterosideos, e no em uma forma isolada na natureza (SIMES et al., 2000).
1.2Utilizao teraputica do Lentinula edodes
Cerca de 25% dos frmacos empregados atualmente advem direta ou
indiretamente de produtos naturais, especialmente de plantas e fungos. Entretanto,
nas ltimas dcadas, os frmacos de origem natural que apareceram no mercado
so, em maior proporo, provenientes de pesquisas cientficas realizadas na China,
na Coria e no Japo, sendo que a contribuio dos pases ocidentais neste perodo
foi bem menor. (YUNES; CECHINEL-FILHO, 2001).
20
Segundo Chandra (2011a) os cogumelos exticos tm sido muito utilizados
na medicina chinesa antiga, devido suas propriedades imunomoduladoras no
tratamento e/ou na preveno de doenas crnicas. Nos ltimos anos, no Ocidente,
em especial, a busca por produtos e alimentos saudveis, como os cogumelos, vem
aumento e despertando o interesse na medicina preventiva.
Mundialmente os cogumelos tm sido reconhecidos como alimento funcional,
e o acmulo de conhecimentos prticos sobre os cogumelos adequados para
consumo e aqueles que so venenosos ou psicotrpicos, garantem em parte, a
segurana de seu uso. Em muitas partes do mundo, especialmente na Europa,
cogumelos selvagens so regularmente coletados e usados diretamente como
alimento principal ou adicionado a sopas, guisados e chs(BRAUER et al., 2002;
MINATO; MIZUNO; TERAI, 1999;SUGUI et al., 2003).
Em pases como a Coria, China e Japo, nos quais os cogumelos so
utilizados em grande escala e apresentamsignificativa importncia na economia, os
estudos sobre suas propriedades medicinais esto mais sedimentados. As principais
aes farmacolgicas avaliadas at o presente momento referem-se: a
hepatoproteo relacionada proteo de hepatcitos pela LM-lignina (ITOH et
al.,2010; SASIDHARAN et al., 2010;YOSHIOKA et al.,2012); tratamento ou
preveno de doenas crnicas e hipercolesterolemia (CHANDRA et al., 2011b;
LAWRANCE et al., 2011); efeito de eliminao de radicais atravs de compostos
fenlicos como cido sirngio e cido vanlico (ISHIKAWA et al., 2001; ITOH et
al.,2010); efeito imunomodulador pela presena de polissacardeos e glucanas
(ITOH et al.,2009); efeito antitumoral(TANAKA et al., 2011).
Uma das mais notveis caractersticas dos extratos derivados de cogumelos
medicinais sua habilidade de funcionar como imunoestimulador, ou seja, a
constituio fisiolgica do mecanismo de defesa do hospedeiro melhorada pela
exposio a componentes que restauram a homeostase e melhoram a resistncia
para doenas. Entretanto, somente nas ltimas trs dcadas, a tecnologia qumica
tem sido hbil para isolar componentes relevantes e utiliz-losem experimentos
controlados para aplicao anticncer (CHIHARA et al.,1970; HATVANI, 2001;LIU;
OOI; CHANG, 1997; SUGUI et al., 2003).
21
Alguns autores sugerem que o efeito antitumoral atribuido s -
glucanasoriundas de cogumelos, estligado frao d-glucano;seu efeito
farmacologico difere dos demais tratamentos quimioterpicos, pois as -
glucanasatuam aumentando a atividade das funes imunolgicas
(ADEREM;ULEVITCH, 2000).
As -glucanasso reconhecidas pelo sistema inato, ativando clulas Natural
Killer (NK), macrfagos, clulas T, promovendo a liberao de citocinas e
interleucinas, assim como tambm produzindo anticorpos (DONG et al.,2002;
MIZUNO et al.,1990a).
Certas espcies de cogumelos tm conhecido efeito na diminuio do
colesterol quando adicionado na dieta de animais em experimentos. A eritadenine
isolada de Lentinula edodes mostrou que a sua ao pode ser hipocolesterolmica
devido depresso da secreo do colesterol do fgado para a corrente sangunea,
entretanto, um mecanismo mais detalhado no foi definido (MANZI;
PIZZOFERATTO, 2000; SUGUIYAMA; AKACHI; YAMAKAWA, 1995).
O Lentinula edodes usado tradicionalmente para doenas de funo imune,
alergias, infeco fngica, gripes, resfriados, doenas cardacas, hiperlipidemia,
sendo o primeiro macro fungo a entrar no domnio da biotecnologia moderna, por
apresentarestas possveis aplicaes teraputicas (BISEN et al., 2010).
Os extratos brutos de Lentinula edodeseas-glucanas, extradas dos
polissacardeos de Lentinula edodes so utilizados no Japo, como medicamentos,
desde os anos 80, sendo estas ltimas, comercializados pelo nome de Lentinan
(MIZUNO et al., 1990; WATANABE et al., 2006).No Brasil, a atual legislao no
permite a comercializao de extratos de cogumelos (Resoluo da Diretoria
Colegiada, RDC n. 14 de 31 de maro de 2010 (BRASIL, 2010) e apenas o
cogumelo Agaricus blazei possui registro como alimento.
O uso milenar de cogumelos medicinais mostrou, ao longo dos anos, que
determinadas espciespodem apresentar substncias potencialmente perigosas e
por essa razo devem ser utilizadas com cuidado, respeitando seus riscos
22
toxicolgicos (VEIGA JNIOR et al., 2005). Os efeitos mais preocupantes do uso
indiscriminado de cogumelos medicinais sobre a gestao, os quais podem
promover efeitos teratognicos, embriotxicos e abortivos, uma vez que, os
constituintes destes cogumelos podem atravessar a placenta, gerando danos ao
concepto (GERENUTTI; GROTTO, 2013).
1.3 Agentes promotores do estresse oxidativo
Nos organismos aerbios so produzidas espcies reativas de oxignio
(ROS), durante o perodo de atividade biolgica das clulas. Para que exista a
manuteno do equilbrio do funcionamento do organismo, aps esta produo,
estas espcies so removidas pelo sistema de defesa. Este sistema de defesa
envolve enzimas e molculas no enzimticas (FRIDOVICH, 1999; VALKO et al.,
2007).
O estresse oxidativo uma situao onde a produo de espcies reativas de
oxignio excessiva, levando a um desequilbrio fisiolgico que pode resultar na
destruio das defesas antioxidantes, promovendo a inutilizao ou a inibio da
funo normal no organismo (LACHANCE; NAKAT; JEONG, 2001; MACHLIN;
BENDICH, 1987). Normalmente, o processo de estresse oxidativo danifica lipdios,
protenas e DNA celulares (FU et al., 1998; RIDNOUR et al., 2005;VALKO et al.,
2007).
Os radicais livres presentes no organismo humano so tomos ou molculas
que contenham eltrons desemparelhados em seu orbital, estes apresentam
atividade aumentada, pois so quimicamente mais ativos, os radicais derivados de
oxignio so a espcie reativa de oxignio (ROS) e so, portanto a classe mais
importante produzida pelo organismo humano em grandes quantidades (GILBERT,
2000; GUTTERIDGE; HALLIWELL, 2000; MILLER; BUETTNER; AUST, 1990).Alm
de o ROS ser produzido porfatores fisiolgicos normais, existem outros co-fatores
ambientais como radiao, poluio e tabagismo, que levam tambm a formao de
radicais livres resultando em estresse oxidativo, levando ao aparecimentos de vrias
doenas (SIZER; WHITNEY, 2003).
23
O estresse oxidativo deve ser prevenido assegurando que os nveis de
antioxidantes e quelantes de radicais livres estejam em nveis adequados (FRIES et
al.,1993).
Segundo Clarke (2009) a ao dos antioxidantes no organismo proteger as
clulas do estresse oxidativo. As molculas e substncias que apresentam efeitos
antioxidantes podem desacelerar processos de oxidao levando o organismo,
agora protegido, a uma maior longevidade. Portanto, de extrema importncia
manter o equilbrio entre o sistema de defesa e os radicais livres.
Para que o sistema fique em homeostase existem duas formas de captao e
uso de radicais, uma advinda de uma dieta rica em alimentos contendo os
antioxidantes e outra do prprio organismo, atravs de um sistema de enzimas
celulares, onde suas concentraes so equilibradas por herana gentica. Estes
sistemas enzimticos so representados pela superxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidase (GPH-Px), glutationa (GSH), e estes so as principais
barreiras enzimticas para a eliminao dos radicais livres (CADENAS,1997; FANG;
YANG; WU, 2002; FERREIRA; MATSUBARA, 1997;VALKO et al.,2007).
A GSH um tripeptdeo, contendo cistena e o tiol no protico mais
abundante nas clulas dos mamferos. Concentraes baixas de GSH tm sido
reportadas em algumas doenas, como a AIDS, e estassociado ao maior risco de
estresse oxidativo e da ocorrncia de infeces oportunistas. Este decrscimo do
GSH pode refletir o aumento na produo de antioxidantes, num grau que excederia
a capacidade de detoxificao do GSH. O oxignio um gs indispensvel para
ciclo vital, mas pode causar danos ao nosso organismo uma vez que promove
formao de radicais livres devido ao metabolismo das clulas (BARROS et.
al.,2008; KITZBERGER, 2005).
A GSH apresenta as funes de quelante de radicais livres (HO, H2O2, LOO
e ONOO-), quer reagindo diretamente com estes, quer indiretamente como co-factor
de enzimas antioxidantes como a GSHPx e a GSH-T, entre outras. No processo de
neutralizao dos radicais livres, a GSH oxidada com a formao do radical GS,
este rapidamente reativo com um segundo radical GS, formando a molcula
24
glutationa dissulfeto (GS-SG), que no antioxidante. A GS-SG novamente
reduzida a duas GSH pela enzima GPH-R. A GSH utilizada para regenerar ao seu
estado ativo, outras molculas antioxidantes como a vitamina C e a vitamina E. A
capacidade da GSH para regenerar as molculas antioxidantes mais importantes
est ligada ao estado redox do par Glutationa dissulfeto/Glutationa (GS GSSG/GSH)
(PASTORE et al., 2003).
A presena de antioxidantes vinda de alimentos em nossa dieta diria assume
um importante papel protetor, aliviando os efeitos deletrios dos oxidantes. Os
fitoqumicos presentes em diversos produtos naturaisso compostos bioativos, que
so capazes de reduzir a ao dos oxidantes no organismo, e englobam
carotenides (-caroteno, -caroteno, -criptoxantina, lutena,zeaxantina,
astaxantina e licopeno); compostos fenlicos: cidos fenlicos (cidos
hidroxibenzicos e cidos hidroxicinmicos), flavonides (flavonis, flavonas,
flavanis, flavanonas, antocianidinas e isoflavonides), estibenos, cumarinas e
taninos; alcalides; compostos azotados (derivados da clorofila,aminocidos e
aminas) e compostos organossulforados:(isotiocianatos e compostos de enxofre
allicos) (HALL; CUPPETT, 2007).
Vrias drogas sintticas, utilizadas para doenas crnicas, tem demonstrado
serem indutoras de estresse oxidativo. Dentre estas drogas, destaca-se o
metotrexato, para o qual esto sendo direcionados muitos estudos que possam
protegem o organismo de seus efeitos deletrios (ATASHFARAZ;FAROKHI;
NAJAFI, 2013;BOZKURT et al.; 2014; IBRAHIM et al., 2013).
1.4 Exposio materna ao metotrexato e avaliao toxicolgica na gestao
O metotrexato (MTX) amplamente utilizado em altas doses para o
tratamento de doenas malignas, incluindo leucemia aguda na infncia, leucemia
linfoctica, osteosarcoma, linfoma,doena de Hodgkin, cncer de cabea e pescoo,
cncer de pulmo, cncer de mama, psorase, coriocarcinoma e os tumores
trofoblsticos relacionados. Apresenta alguma atividade imunossupressora em
baixas doses. O metotrexato um frmaco que possui as mesmas caractersticas do
25
cido flico apresentando efeito de antagonista competitivo, inibindo a sntese de
DNA e a reproduo celular (PEREIRA et al., 2014; SEO et al., 2009).
A enzima dihidrofolato redutase (DHFR) inibida pelo metotrexato, causando
acmulo intracelular de dihidrofolato. Este acmulo provoca a inibio na sntese de
purinas e timidilato. especfico para a fase S da diviso celular, capaz de inibir de
forma irreversvel a enzima didrofolatoredutase. Esta inibio impede formao de
tetraidrofolato, a partir de diidrofolato. O tetridrofolato cofator necessrio
transferncia de tomos de carbono, essenciais para a sntese do DNA e do RNA. O
metotrexato tambm age inibindo, de forma parcialmente reversvel, a enzima
timidilatosintetase, envolvida na proliferao celular (MARQUES, 2008).
O metotrexato (MTX) um teratognico potente quando utilizado em doses
elevadas para o cncer ou para a interrupo da gravidez ectpica. Um agente
teratognico definido como qualquer substncia, organismo, agente fsico ou
estado de deficincia que, estando presente durante a vida embrionria ou fetal,
produz uma alterao na estrutura ou funo da descendncia (DICKE, 1989;
SMILTHELLS, 1980). O termo teratogenicidade provm do grego teratos, que
significa monstro. O sentido original da palavra refere-se a malformaes
anatmicas macroscpicas, embora atualmente tenha se expandido sua definio
para englobar anomalias mais sutis como atraso intra-uterino e distrbios
bioqumicos e psicomotores (LIMA et al., 2001).
A ao de um agente teratognico sobre o embrio ou feto em
desenvolvimento depende de diversos fatores, destacando-se: (1) estgio de
desenvolvimento do concepto, (2) relao entre dose e efeito, (3) gentipo materno-
fetal, e (4) mecanismo patognico especfico de cada agente (BERNARDI 1991;
GERENUTTI; DE SOUZA-SPINOZA;SCHLER-FACCINI, 2002).
A exposio a altas doses ao MTX durante a gravidez est associada com a
embriopatia do metotrexato, porm, h incerteza sobre o potencial teratognico em
doses reumatolgicas, em especial, quando utilizado uma vez por semana, em
baixas doses (WEBER-SCHOENDORFER et al., 2014). Com base em relatos de
casos humanos de exposio, a embriopatia promovida pelo metotrexatotem sido
26
descrita com caractersticas que incluemdficit de crescimento, microcefalia,
hipoplasia dos ossos do crnio, fontanelas amplas, craniossinostose coronal ou
lambdoidal, ponte nasal larga, arcadas superciliares rasas,olhos proeminentes,
orelhas de implantao baixa, hipoplasia maxilar, epicanto, membros curtos, p torto
congnito, hipodactilia e sindactilia. Esta sndrome pode ser associada com
exposies entre 6 e 8 semanas aps a concepo e nveis de dosagem de 10
mg/semana (FELDKAMP; CAREY, 1993; HYOUN; OBICAN; SCIALLI, 2012). Weber-
Schoendorfer et al (2014), aps estudo multicntrico, sugeriram que o uso ps-
concepo de doses reumatolgicas de metotrexato (MTX) est associado com um
risco aumentado de defeitos congnitos graves e aborto espontneo e tal evidncia
no foi encontrada para o uso de pr-concepo.
Embora seu uso possua implicaes importantes para o tratamento de
doenas reumatolgicas, mesmos em baixas doses, a segurana em mulheres em
idade reprodutiva ainda escassa (MARTIN et al., 2014).
Em modelos animais, nas doses correlacionadas exposio materna em
humanos (19.2 mg/kg/dia), o metotrexatopromoveu anormalidades que incluem
hidrocefalia, microftalmia, palatosquese, micrognatia, displasia vertebral e caudal,
focomelia, hemimelia, sindactilia e ectrodactilia (HYOUN; OBICAN; SCIALLI, 2012).
27
1.5 JUSTIFICATIVA
A exposio aprodutos naturaisdurante o processo de gestao responsvel
por cerca de 1% dos problemas que envolvem o feto com relao a malformaes.O
risco teratolgico existe durante todo perodo gestacional, no entanto maior na
fase de embriognese, quando ocorrem a diferenciao tecidual e organognese.
(ARAUJO, 1998)
Para que um produto seja recomendvel como alimento e/ou medicamento,
suas propriedades biolgicas devem ser bem conhecidas.Dependendo do material
gentico que o agente mutagnico atinge, as manifestaes das mutaes sero
diferentes, podendo at ter efeitos deletrios. Quando a mutao ocorre nas clulas
somticas, h vrias consequncias, sendo as mais comuns formao de tumores
benignos ou malignos; a morte celular, que pode causar envelhecimento precoce;
mal formaes e abortos, durante o desenvolvimento embrionrio. Entre os testes
recomendados pelo US Food and Drug Administration (FDA), destacam-se os
relacionados s atividades mutagnicas e antimutagnicas (FDA, 2013).
Os dados relacionados mutagenicidade do cogumelo Lentinula edodes,
Shiitake, assim como o da maioria dos cogumelos comestveis so escassos e
alguns resultados de experimentos realizados apresentam atividade mutagnica
varivel, isto pode ser atribudo a vrios fatores, entre eles, a composio qumica
dos cogumelos, que dependente das variaes geogrficas, sazonais e
intraespecficas(GRUTER; FRIEDERICH; WURGLER, 1991; STERNER et al.,
1982a, 1982b).
Sendo assim, estudos baseados em segurana de suplementos produzidos
com cogumelos, em especial ao Lentinula edodes, tornam se cada vez mais
importantes (YOSHIOKA; TAMESADA; TOMI, 2010). Estes estudospodem auxiliar
tanto o produtor quanto ao registro de um novo alimento, como podem garantir o
consumo seguro pela populao.
Por outro lado, ao se garantir a segurana da utilizao do Lentinula
edodesdurante a gestao, o mesmo poder ser utilizado com adjuvante na
28
exposio a agentes supostamente deletrios durante o perodo crtico do
desenvolvimento do concepto, como o caso do metotrexato (MTX).
29
2OBJETIVOS
2.1 Objetivogeral Avaliar a segurana da exposio materna ao Lentinula edodes para uma
possvel preveno aos efeitos deletrios do metotrexato durante o perodo de
gestao.
2.2 Objetivos especficos
Determinar a concentrao de glucanase de compostos fenlicos no
Lentinula edodes.
Comparar a capacidade reprodutiva de ratas expostas ao Lentinula
edodes(0.4g/k/dia e 0.8g/kg/dia)ao metotrexato (0.20mg/kg/dia) e s
associaes entre estas drogas(0.4g/k/dia + 0.20 mg/kg/dia; 0.8g/kg/dia +
0.20 mg/kg/dia).
Avaliar a toxicidade materna durante o perodo da gestao por meio de
anlises bioqumicas: transaminase alanina aminotrasnferase (ALT) e
transaminase aspartato aminotransferase (AST), creatinina,ureia, glutationa
reduzida (GSH) e catalase (CAT).
Avaliar o desenvolvimento morfolgico externo, visceral e sseo de fetos
provenientes de ratas expostas ao Lentinula edodes (0.4g/k/dia e
0.8g/kg/dia)ao metotrexato (0.20 mg/kg/dia) e s associaes entre estas
drogas (0.4g/k/dia + 0.20 mg/kg/dia; 0.8g/kg/dia + 0.20 mg/kg/dia) durante o
perodo de gestao.
30
3Material e Mtodos
3.1Lentinula edodes
As amostras de cogumelos Lentinula edodes (Shiitake) foram fornecidas pela
Empresa Yuri Cogumelos, localizada na cidade de Sorocaba, So Paulo, sendo as
mesmas produzidas pela prpria empresa. A linhagem utilizada foi de origem
japonesa adaptada no Brasil, pela empresa. A Figura 2 mostra a identificao das
sries de linhagens considerando suas origens no Japo.
Figura 2- Linhagens de lentinula edodes identificadas por cdigo
Fonte: Elaboraoprpria
3.2Obteno da amostra seca de Lentinula edodes
As amostras de cogumelo in natura foram picadas com faca de inox, em
tamanhos homogneos no mesmo dia da coleta e transporte para a universidade.
Foram pesados 5 kg da amostra e colocadas em estufa com circulao de ar(marca
Orion 515) a temperatura de 50C, por um perodo de aproximadamente 24h, onde
a mesma permaneceu at alcanar concentrao de 5 a 15% de massa seca. Aps
o perodo foram pesadas as amostras (secas) vrias vezes at que a mesma
apresentase o mesmo peso mdio por trs vezes. O rendimento foi de 445.14g de
amostra seca. A amostra seca foi moda (moinho de facas e martelo marca
31
Marconi), em seguida tamisada em tamises (malha 50 e malha 60), com a
finalidade de obteno de partculas homogneas para serem suspendidas em
gua. O rendimento final foi de 105.30g de amostra seca tamisada (2.106%). O p
tamisado foi acondicionado em embalagens plsticas hermticas mantidas em
dessecador.
3.3 Dosagens de glucanas e de compostos fenlicos
Para as dosagens de glucana e compostos fenlicos, foram utilizados 15 g de
Lentinula edodesseco e tamisado.
3.3.1 Determinao de glucanas
A determinao de glucanas foi realizada em duplicata, pelo mtodo da
Foundation of Japonese Food Analysis Center (1980) modificado por Prosky et al.
(1988). O mtodo analtico oficial japons e consiste em hidrlises enzimticas e
qumicas.
Duas alquotas de 1g cada foram depositadas em frasco de Erlenmeyer (500
mL), com 50 mL de tampo fosfato 80 mM (pH 6.0). Logo em sequncia, a soluo
foi tratada com 0.1mL da enzima -amilase termostvel Termamyl (Novo Nordisk)
e incubada por 30 min em banho-maria (60oC); aps, inseriu-se 0.1 mL protease
neutra bacteriana (Novo Nordisk),o pH de 7.5 foi ajustado com hidrxido de sdio
(NaOH 25 mM), e a soluo foi incubada por 30min em banho-maria (60C); em
continuidade, adicionou-se 0.3 mL de amiloglicosidase AMG (Novo Nordisk), pH
de 4.5 foi ajustado com acido clordrico( HCl75mM), e a soluo foi incubada em
banho-maria por 30min (60C).
Terminado o tratamento enzimtico, 200 mL de soluo de lcool etlico a
95% foramadicionadoss amostras, os bales volumtricos foram mantidos em
banho-maria por 60 min.(60C), aps resfriamento, o excesso de lcool do
sobrenadante foi retirado por suco, at que sobrassem as fibras insolveis
precipitadas no balo; estas fibrasprecipitadas foram separadas por centrifugao
em centrigufa da marca Eppendorf 5804R (20000g /10minutos). Os precipitados
32
desta centrifugao foram lavados com soluo de lcool etlico e acetona a 80%,
este procedimento foi realizado por 3 vezes. Aps evaporao em capela, do lcool
etlico e da acetona, ao precipitado foramadicionados 10 mL de soluo de acido
sulfrico (H2SO472%) e os bales volumtricos foram incubados a temperatura
ambiente por 4h, para hidrlise das fibras compostas de glucanas.
Em seguida a este processo de digesto foram acrescentados aos bales 140
mL de gua destilada, estes foram incubados em banho-maria em ebulio por 2h.
Terminado o perodo de encubao, o pH foi ajustado para 7.0 com hidrxido de
sdio (NaOH5M), o volume foi completado para 300mL. As duplicatas foram
filtradas em papel de filtro Whatman n 5B, e a quantidade de glicose foi
determinada pelo mtodo enzimtico com leitura em espectrofotmetro em
comprimento de onda 505 nm, utilizando-se 1.0 mL do composto 4-aminofenazona
(0.025mol/L)/fenol (0.055mol/L), na presena de glicose oxidase (1 U/mL) e
peroxidase (0.15 U/mL) (LaborlabLtda).
A concentrao de glucanas presente nos cogumelos em base seca
foicalculada atravs da equao matemtica:
Glucana (g/100g)= Glicose (g/100g)x 0.9
Onde: 0.9 = fator de correo
3.3.2 Determinao de compostos fenlicos
A extrao de compostos fenlicos foi realizada em triplicatasegundo o
mtodo descrito por Scalbert et al. (1989) de acordo com as modificaes realizadas
por Ramirez-Anguiano et al. (2007). Trs alquotas de 1g foram acondicionadas em
cubetas de vidro, as quais se adicionou 10 mL metanol 80%, agitando-se em
agitador de tubos Vrtex (2 min.),e deixando-se o solvente em contato com a
amostra por 12h. Em seguida, centrifugou-se em centrifuga Empendorrf 5804R
(10000 rpm/ 8 minutos), coletou-se0.5 mL do sobrenadante, e acrescentou-se 2.5
mL de folin-Ciocauteau (10%) com 2 mL de Na2CO3(7.5%) deixando em contato por
33
30min a T ambiente . O mtodo baseia-se na reao com o reagente de Folin-
Ciocauteau, reagente proveniente da mistura de dois cidos fosfomolibdico e
fosfotungstico, onde, na presena de compostos fenlicos observa-se alterao de
colorao do amarelo ao azul (Figura 3); durante a reao na presena de fenis
ocorre formao de complexo de colorao azul (reao redutor) e a intensidade
dada em relao concentrao de grupos hidroxilas extradas das amostras
analisadas(ANGELO; JORGE, 2007; OLIVEIRA et al., 2009).Aleitura da absorbncia
da soluo foi realizada em espectrofotmetro (760 nm). O cido glico foi utilizado
como padro de referncia para dosagens de compostos fenlicos noLentinula
edodes, pois apresenta alta qualidade de materializao da medida e melhor
incerteza (FIDELIS, 2006).
Figura 3-Comprovao da presena de compostos fenlicos (Mtodo: Folin-Ciocauteau)
Fonte: Elaboraoprpria
3.4 Animais
Foram utilizados ratos Wistar, machos e fmeas, com aproximadamente 60
dias de idade, pesando entre 160-180 gramas. Todos os animais foram adquiridos
no biotrio da Anilab-Animais de Laboratrio Criao e Comrcio Ltda, possuem
laudo de sade (ANEXO C). Os experimentos foram realizados deacordo com o
The Guide for the Care and Use of Laboratory Animal (National Research Council,
1996) and European Community guidelines (EEC Directive of 1986; 86/609/EEC).
Todos os procedimentos foram aprovados pela CEUA- UNISO sob protocolo n
007/2012(ANEXO A). Os animais foram mantidos no Biotrio de Experimentao da
34
Uniso, alojados em gaiolas plsticas medindo 40X60X20, com tampas metlicas.
gua e rao foram fornecidas ad libitum. O peso dos animais foi registrado
diariamente.
3.4.1Acasalamento eprenhez
Para o acasalamento, os animais foram alojados no mximo 02 machos com
05 fmeas, por um perodo noturno de 12 horas. Por meio de observaes
microscpicas, a indicativa do primeiro dia da prenhez foi presena de
espermatozoides no esfregao proveniente do lavado vaginal (DAMASCENO et al.,
2008).
3.5 Administraodas drogas
As concentraes de Lentinula edodes utilizadas para este estudo foram
eleitas considerando-se o consumo de cogumelos na China (10 kg/70 kg/ano).
Assim, a dose administrada aos ratos foi selecionado com base nas doses de
referncia (RFD) normalmente calculadas a partir de valores (NOAEL) Nvel de
efeito adverso no observado, dividindo pela incerteza (10) e os fatores de
modificao (10) (RFD = NOAEL/100), o que significa exposio de 400 mg/kg/dia.
Finalmente, foram propostos doses de 400 e 800 mg / kg de peso corporal do rato.
(MENDONA, 2005).
Os animais, aps a confirmao da prenhez foram alojados em nmero de
dois animais por gaiola e divididos em 06 grupos de seis animais: grupo 1 (grupo
controle), grupo SI (0.4 g/kg/dia de Lentinula edodes), grupo SII (0.8 g/kg/dia de
Lentinula edodes), grupo MTX (0.20 mg/kg/dia de metotrexato), grupo SIMTX (0.4
g/kg/dia de Lentinula edodes + 0.20 mg/kg/dia de metotrexato), grupo SIIMTX (0.8
g/kg/dia de Lentinula edodes + 0.20 mg/kg/dia de metotrexato).
As concentraes de 0.4 g/kg/dia e 0.8 g/kg/diade Lentinula edodes
foram preparadas diariamente, por diluio em gua purificada
(aparelho MilliQ, pH 7.0); aadministrao foi por via oral, com auxlio
de agulha de gavagem. A administrao diria do Lentinula edodes(os
35
grupos SI, SII, SIMTX e SIIMTX)foi realizada do primeiro ao vigsimo
dia de prenhez,sempre s 8:00 horas, por via oral.
A concentraes de 0.20 mg/kg/dia de metotrexato (lote 12123921C,
Pharnostra)foimanipulada em farmcia magistral, em soluo com
gua bidestilada (processo de osmose reversa), acondicionadas em
frasco mbar revestido com alumnio, mantidas em refrigerao, por
um perodo mximo de 15 dias (estabilidade garantida pelo fornecedor
aps ressuspenso). A administrao diria do metotrexato (os grupos
MTX, SIMTX, SIIMTX) foi realizada do quarto ao nono dia de prenhez
devidos ser o perodo de desenvolvimento celular,sempre s 8:00
horas,por via oral.
3.6 Avaliao da toxicidade materna
No vigsimo primeiro dia de prenhez as ratas foram anestesiadas com
quetamina (anestsico geral na dose de 30 mg/kg - intramuscular) e o cloridrato de
xilazina (relaxante muscular na dose de 6mg/kg). Para a avaliao da toxicidade
materna foram avaliados os parmetros bioqumicos e parmetros de capacidade
reprodutiva.
3.6.1 Avaliao bioqumica
Para a avaliao bioqumica das ratas prenhes foram analisados os seguintes
parmetros sanguneos: estresse oxidativo, funo renal e funo heptica. O
volume de sangue coletado por puno venosa (heptica) em seringa previamente
heparinizada, foi de 3 a 5 mL. Este sangue foi imediatamente transferido para tubo
com anticoagulante EDTA. Deste tubo, uma alquota de 500 L foi transferida para
tubo tipo Eppendorf, e armazenada em freezer a -80C. O restante do sangue foi
centrifugado em centrifuga de bancada refrigerada, SORVALL, Modelo ST 16R(10
min, 4000 rpm), o plasma foi utilizado para anlises bioqumicas.
Para os parmetros de estresse oxidativo foram analisadas as concentraes
de glutationa reduzida (GSH), e atividade da enzima catalase no sangue das ratas
prenhes; para os parmetros de funo renal foram dosadas a creatinina e a ureia;
36
para os parmetros de funo heptica foram dosadas as transaminases aspartato
aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT). As avaliaes renais e
hepticas foram realizadas por kits no Equipamento Cobas C111 (Roche).
3.6.1.1 Determinao da glutationa reduzida (GSH)
A determinao da GSH se deu por quantificao dos tiis totais, em leitora
de placas, com deteco visvel, baseada no mtodo de Ellman (1959). Para isso,
150 L do sangue ratas prenhez coletos na cesaria, sempre mantido em banho de
gelo, foram hemolisados com 100 L de Triton X-100 a 10% e precipitados com 100
L de cido tricloro actico (TCA) a 30%. As amostras foram centrifugadas a 4C em
centrifuga de bancada refrigerada, SORVALL, Modelo ST 16R (10 min, 4000 rpm),
e os sobrenadantes separados. Aps, 50 L de cada sobrenadante foi diludo em
900 Lde tampo fosfatos e reagiram com 50 L de 5-5-ditio-bis-2-cido
nitrobenzico (DTNB), formando um complexo amarelo. A leitura foi realizada em
seguida em Leitora Automtica de MicroplacasTECAN, modelo INFINITE M200
PRO (412 nm). Os resultados esto expressos em mol/mL sangue.
3.6.1.2 Determinao da atividade da catalase(CAT)
A atividade da enzima catalase foi avaliada por espectrofotometria UV/VIS
utilizando mtodo de Aebi (Aebi, 1984). O mtodo baseia-se na decomposio do
H2O2 pela catalase, ao longo do tempo, monitorado a 240 nm. Para tanto,
primeiramente o sangue foi diludo em tampo fosfato de potssio (10 L de sangue
+ 590 Lde tampo). Aps, uma alquota de 20 Ldeste sangue diludo foi misturado
a 1.910 Lde tampo fosfato de potssio 50 mM (pH 7.0) e 70 L de H2O2 foi
adicionado, dando incio reao. As mudanas na absorbncia foram monitoradas
por cinco minutos (Espectrofotmetro da marca FEMTO, modelo 800XI). Uma
constante de variao (), relacionada com a hemoglobina (Hb), auxilia na
expresso dos valores da atividade no sangue (/gHb).
A dosagem Hb foi feita pelo Kit Comercial de Hemoglobina Bioclin, baseado
na metodologia da cianometahemoglobina. Em tubo de ensaio foram colocados 1L
sangue e 2mL de reagente de cor do kit Bioclin, a leitura foi realizada em
espectrofotmetro (FEMTO, modelo 800XI)em comprimento de onde 540 nm; para
37
cada anlise foram preparados, diariamente, em triplicata, os padres do kit
Bioclin. Os resultados Hb para posterior anlise de GSHforam calculados pela
formula:
Hb= absorbncia do teste/absorbncia do padro x 10
Onde:10 = fator de correo
3.6.1.3 Determinao da transaminase aspartato aminotransferase (AST),transaminase alanina aminotransferase (ALT), creatinina e da ureia.
Para as dosagens de transaminases alanina aminotrasnferase (ALT) e
aspartato aminotransferase (AST), creatinina e ureia utilizaram-se o plasma. Todas
as dosagens foram realizadas em equipamento automatizado COBAS C111
(Roche), por meio de kits especficos para este equipamento: ALTL, ASTL, CREJ2
e UREAL (Roche).
O teste de ALTL (Roche) tem como princpio a catalisao da reao entre
L-alanina e 2-oxoglutarato. O piruvato formado reduzido por NADH numa reao
catalisada por lactato desidrogenase (LDH), formando L-lactato e NAD+. O ASTL na
amostra catalisa a transferncia de um grupo amino entre L-aspartato e 2-
oxoglutarato, formando oxoloacetato e L-glutamato. O oxoloacetato com NADH na
presena de malato desidrogenase (MDH), formando NAD+. A taxa de oxidao de
NADH diretamente proporcional s atividades catalticas de ALT e AST,
determinada medindo a diminuio da absorbncia. Ambos os testes possuem um
intervalo de medio de 200-700 U/L e o comprimento de onda utilizado de
340/378 nm
O teste de creatinina CREJ2 (Roche) baseia-se no mtodo de Jaff,
atravs de um ensaio colorimtrico cintico. Numa soluo alcalina a creatinina
forma um complexo amarelo-avermelhado com picrato. A taxa de formao do
corante proporcional concentrao de creatinina na amostra O intervalo de
medio do teste de 0,2-12.4 mg/dL e o comprimento de onda de 512/583 nm.
38
O princpio do teste da ureia UREL (Roche) cintico e baseia-se em duas
reaes. Primeiramente a ureia hidrolisada pela urease, dando origem a amnia e
carbonato. Na segunda reao, o 2-oxoglutarato reage com amnia na presena de
glutamato desidrogenase (GLDH) e da coenzima NADH, dando origem a L-
glutamato. O NADH oxidado a NAD, a taxa de diminuio da concentrao de
NADH diretamente proporcional concentrao de ureia na amostra. O teste
possui um intervalo de medio de 3,0-240 mg/dL e utiliza como comprimento de
onda 340/409 nm.
O COBAS C111 foi desenvolvido para laboratrios de pequeno porte, possui
um rendimento de 60 a 85 testes/hora, apresenta como princpio de medio a
fotometria de absorbncia, utiliza doze comprimentos de onda e realiza medio
monocromtica e bicromtica.
OCfas (Calibrator for automated systems, Roche) foi utilizado para realizar a
calibrao dos reagentes; o controle de qualidade para a monitorizao da exatido
e preciso dos mtodos quantitativos foi realizado empregando-se, antes do inicio
das anlises, o reagente Precinorm U plus. Os reagentes dos kits foram inseridos no
disco refrigerado prprio para reagentes; o segmento de cubetas foi inserido no anel
interno; as amostras foram cadastradas no equipamento e o pedido foi definido.
Foram colocados 300 uL de plasma no cup de amostra e o mesmo foi inserido na
rea de amostras, que tem capacidade de oito amostras por vez. O equipamento
verifica a qualidade da cubeta, pipeta os reagentes e as amostras, incuba e inicia as
medies. Os resultados foram calculados pelo equipamento com base nos
resultados de medio fotomtrica que determinaram a quantidade de absorbncia
no fludo.
3.7Avaliao da capacidade reprodutiva
Para a avaliao da capacidade reprodutiva, as ratas foram cesariadas, com
uma inciso longitudinal na linha alba para exposio do tero e dos ovrios. O tero
e os ovrios foram retirados. O tero foi inspecionado quanto ao nmero de fetos, de
implantaes e reabsores visveis (Figura4). Os ovrios, os fetos e as placentas
39
foram pesados. Foi verificada a vitalidade fetal, por meio de um leve estmulo
mecnico com a ponta do dedo indicador.Os corpos lteos foram contados
(DAMASCENO et al., 2008).
Figura 4-tero retirado de ratas para avaliao da capacidade reprodutiva.
Fonte: Elaborao prpria
Os fetos foram sacrificados com halotano (1%) em cmara fechada. A
capacidade reprodutiva das fmeas foi calculada por meio das frmulas:
Porcentagem de Perdas Pr-implantao = no corpos lteos no
implantaes / no corpos lteos X100
Porcentagem de Perdas Ps-implantao = no de implantaes no de
fetos vivos / no de implantaes X100
3.8 Avaliao do desenvolvimento do concepto
Para as anlises desenvolvimento do concepto, todos dos fetos foram
analisados segundo os parmetros: avaliao morfolgica externa, avaliao
visceral, avaliao morfolgica ssea. (GERENUTTI et al.; 2006)
40
3.8.1 Avaliao morfolgica externae visceral de fetos
Aps a pesagem, 50% dos fetos de cada fmea foramfixados em lquido de
Bodian. A soluo fixadora de Bodian consiste em 148 mL de gua destilada, 50 mL
de formaldedo, 50 mL de cido actico glacial e 752 mL de lcool etlico a 95%. Os
fetos foram colocados em vidro com tampa de rosca contendo a soluo, e as
anlises foram realizadas no prazo mximo de 15 dias aps a fixao.
(DAMASCENO et al., 2008).
As seguintes medidas externas foram determinadas com o auxlio de um
paqumetro: anteroposterior do crnio, lterolateral do crnio, anteroposterior do
trax, lterolateral do trax, crniocaudal, cauda (Figura 5).
Figura 5- Avaliao morfolgica externa de fetos fixados em Bodian: medidas realizadas com paqumetro.
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Legenda: (A) Antero-posterior do crnio; (B) latero-lateral do crnio; (C) latero-lateral do trax; (D) antero-posterior do trax;( E) crnio-caudal;(F) cauda.Fonte: Elaborao prpria
41
Os fetos destinados s avaliaes viscerais foram separados em dois grupos:
um grupo foi analisado segundo os cortes de Wilson (Figura 6) e o segundo grupo
foi analisado seguindo as tcnicas de toracotomia e microseco. As avaliaes
visceraisforam realizadas com o auxlio de estereomicroscpio com iluminao direta
(Olimpus), seguindo-se uma sequncia padronizada. As informaes obtidas foram
descritas e armazenadas em protocolo para posterior anlise (DAMASCENO et al.,
2008).
Figura 6-Sequncia de cortes de Wilson realizada nos fetos aps fixao em Bodian.
Fonte: Elaborao prpria
3.8.2 Avaliao morfolgica ssea de fetos.
A avaliao morfolgica ssea foi realizadapelo processo de eviscerao e
diafanizao, com observao em estereomicroscpio (Olympus, 66X)e fonte
auxiliar de luz.
Os fetos destinados anlise esqueltica permaneceramem soluo de
acetona pura (Merck), em vidro com tampa de rosca, por perodo de 24 horas. Em
cada feto foi realizado, um corte transversal abaixo das costelas e cortes oblquos
dos lados direito e esquerdo at a regio anal, formando um tringulo. O intestino,
as vsceras abdominais, o diafragma e as vsceras torcicas foram retirados com o
auxlio de pina de ponta fina. Aps a eviscerao, os fetos foram submetidos ao
processo sequencial diafanizao e colorao com alizarina red-S (Figura 7).
42
Figura 7-Etapas do processo de diafanizao e colorao de fetos para a anlise ssea.
Fonte: Elaborao prpria
A diafanizao alcanada com a macerao dos tecidos moles (pele e
musculatura) pelo hidrxido de potssio (KOH) a 1% em gua destilada; o
clareamento foi realizado com a soluo clareadora, constituda por uma parte de
lcool benzlico, duas partes de glicerina e duas partes de etanol absoluto. A
alizarina red-S foi empregada para visualizar o esqueleto (Figura 8), pois se fixa nos
locais em que houve deposio de clcio, corando os ossos de vermelho
(DAMASCENO et al., 2008). O esqueleto foi examinado sistematicamente, da
cabea cauda.
43
Figura 8- Feto diafanizado para avaliao morfolgica ssea.
Vista Dorsal Vista Frontal
Fonte: Elaborao prpria
3.9Anlise Estatstica
Para a anlise dos resultados foi utilizado o nvel de significncia entre 1 e
5%. O teste de Bartlet foi usado para avaliar a homocedasticidade (erros devem ter
varincia constante, representado por valores de F) dos dados; a anlise de
varincia Anova para dados paramtricos, seguida do teste Tukey-Kramer para
comparaes mltiplas em todos os experimentos realizados. O teste do Qui-
quadrado foi utilizado para comparaes no paramtricas, em porcentagens. Para
as anlises foi utilizado o programa GraphPad InStat.
44
4 RESULTADOS
4.1 Teores de glucanas e de compostos fenlicos no Lentinula edodes
O Lentinula edodes analisado apresentou nas amostras estudas 0.53 g
glucanas/ 100g de glicose de cogumelo seco.
A curvaanaltica (Figura9) foi construda nas concentraes entre 0.5 a5 mg
de cido glico por g de amostra seca, seguindo a metodologia adaptada da
Farmacopeia Portuguesa(2002). Osresultados foram expressos em mg de
equivalente de cido glico (EAG)/grama de amostraem base seca.
Figura 9- Curva analtica do cido glico usado para quantificao de compostos fenlicos no
Lentinula edodes.
A concentrao de compostos fenlicos na amostra de Lentinula edodes foi
de 2.4mg/g.
45
4.2 Efeitosda exposio ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaes sobretoxicidade materna.
4.2.1 Avaliao do ganho de peso de ratas prenhes
O ganho de pesodos animais foi considerado em dias intercalados (1-3 dias
de gestao: F= 1.656, p 0.05; 4-6 dias de gestao: F= 2.984, p0.05; 7-9 dias de
gestao: F= 9.144, p 0.0001; 10-12 dias de gestao: F= 37.555, p 0.0001; 13-
15 dias de gestao: F= 5.721, p 0.05; 16-18 dias de gestao: F= 33.393, p
0.0001; 19-21 dias de gestao: F= 55.683, p 0.0001). Os resultados (Tabela 3)
obtidos indicam que o Lentinula edodes nas doses de 0.4 e 0.8 g/kg/diapossui uma
tendncia em promover um aumento no ganho de peso quando comparado ao grupo
controle (Tabela 3). O metotrexato, conforme o esperado promoveu uma reduo do
ganho de peso, tanto quando comparado ao grupo controle quanto aos grupos que
receberam o Lentinula edodes(0.4 e 0.8 g/kg/dia). Por outro lado pode-se observar
que no grupo onde houve a associao entre metotrexato e Lentinula edodes0.4
g/kg/dia, esta reduo do ganho de peso persistiu. Entretanto, quando da
associao entre metotrexato e Lentinula edodes0.8 g/kg/dia, inicialmente observa-
se que ocorre uma reverso da reduo do ganho de peso comparada ao grupo
exposto ao metotrexato, e esta reverso estende-se at o 12 dia de gestao; aps
este perodo, esta associao entre metotrexatoLentinula edodes0.8 g/kg/dia torna-
se altamente prejudicial ao ganho de peso das gestantes reduzindo este parmetro.
47
Tabela 3- Ganho de peso (gramas) de ratasexpostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaes, durante o perodo de gestao.
Dias de
gestao
Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
1-3 7.662.65 7.832.60 10.003.84 9.003.63 11.803.40 10.83 1.47
4-6 9.00 1.54 8.33 2.87 7.66 2.73 9.001.63 3.20 2.77*c 7.33 1.26
7-9 9.331.82 9.33 1.96 10.83 2.35 5.501.39*ab 5.801.16*ab 7.33 1.44
10-12 8.16 1.15 10.83 1.48* 10.83 1.06* 5.331.43*ab 2.00 1.77*abc 9.33 1.34cd
13-15 9.33 1.33 10.331.88 7.501.81 10.00 2.50 8.60 1.88 5.50 1.46*ac
16-18 10.502.46 19.33 2.09* 18.002.94* 9.500 2.43ab 9.202.90ab 4.16 1.62*abcd
19-21 21.664.45 24.663.15 19.50 2.29a 10.83 2.17*ab 10.80 2.96*ab 1.33 0.80*abcd
Nota: Grupos controle (soluo salina), (SI)Lentinula edodes 0,4 g/kg/dia, (SII) Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes 0.4
g/kg/dia + metotrexatoe (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato. *Comparao do grupo controle (p 0.05, ANOVA, Teste de Tuckey-Kramer mltiplas
comparaes); (a) comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX
48
4.2.2 Avaliao bioqumica materna
Para a avaliao da concentrao de GSH foi construda a curva analtica nas
concentraes entre 0.005 mM e 0.1 mM de glutationa reduzida, seguindo tambm a
metodologia de Ellman (1959). Esta curva de calibrao da GSH est representada
na Figura10.
Figura 10-Curva da glutationa reduzida (GSH) utilizada para avaliao de estresse oxidativo em
sangue de ratas prenhes.
As determinaes da GSH e da CATno sangue das ratas prenhes esto
indicadas na Tabela4. Com relao atividade da CAT, no foi observada diferena
entre todos os grupos analisados (F= 0.8904, p 0.05). Por outro lado, com relao
concentrao de GSH, uma diminuio no seu nvel foi observada somente no grupo
que recebeu a maior concentrao de Lentinula edodes (0.8 g/kg/dia). Nos
gruposque receberam metotrexatoe no grupo que recebeu a associao
entremetotrexatoe Lentinula edodes (0.8 g/kg/dia) a concentrao de GSH se elevou
quando comparada ao grupo controle; todos os grupos expostos ao metotrexato,
associado ao Lentinula edodes ouno associado, tiveram um aumento de GSH
quando comparados aos grupos que receberam apenas o Lentinula edodes (F=
36.449, p 0.0001).
49
Tabela 4-A anlise dos parmetros antioxidantes CAT (catalase) e GSH (glutationa reduzida) em sangue das ratas expostas ao Lentinula edodes,
ao metotrexato e s associaes duranteo perodo de gestao.
Grupos
Anlise Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
CAT (k/gHb) 86.9724.36 92.6923.40 81.54 26.22 71.4816.39 82.6037.05 63.7631.90
GSH (mol/mL) 0.37 0.06 0.21 0.04cd 0.17 0.06*cd 0.720.10*abd 0.44 0.13abc 0.57 0.09*ab
Nota: Grupos controle (soluo salina), (SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes 0.4
g/kg/dia + metotrexato e (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato. *Comparao do grupo controle (p 0.05, ANOVA, Teste de Tuckey-Kramer
mltiplas comparaes); (a) comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX
50
A Tabela 5 apresenta as dosagens bioqumicas da AST, daALT, da creatinina,
e da ureia de ratas do 21 dia de gestao. Os resultados obtidos indicam que
houve uma reduo dos nveis de ASTL para todos os animais dos grupos
experimentais quando comparados ao grupo controle (F= 6.894, p 0.001).
Entretanto, as dosagens de ALTL apresentaram reduo apenas nos grupos
expostos ao metotrexato e nos grupos onde houve a associao entre o metotrexato
com Lentinula edodes (doses de 0.4 e 0.8 g/kg/dia), quando comparados ao grupo
controle e aos grupos expostos somente ao Lentnula edodes(F= 14.765, p
0.0001).
As dosagens de creatinina mostraram- se reduzidas apenas nos grupos
expostos ao Lentinula edodes na dose de 0.8 g/kg/dia e associao entre
metotrexato eLentinula edodesna dose de 0.4 g/kg/dia quando ao grupo controle (F=
2.860, p 0.05). Por outro lado, as dosagens de ureia encontram-se reduzidas para
todos os grupos experimentais quando comparados ao grupo controle (F= 4.319,
p0.001).
51
Tabela 5-Anlise bioqumica dos parmetros:transaminase alanina aminotrasnferase (ALT),transaminase aspartato aminotransferase (AST), creatinina
(CREJ2) e ureia(UREL) realizadaem sangue de ratas expostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaesdurante o perodo de gestao.
Testes Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
ASTL(U/L) 105.93 19.46 78.31 13.56* 64.30 12.25* 68.70 14.42* 68.06 14.94* 74.23 7.93*
ALTL (U/L) 69.87 2.84 68.93 2,05 68.53 3.88 58.98 3.53*ab 59.06 3.74*ab 63.13 2.83*a
CREJ2 (mg/dL) 0.32 0.04 0.27 0.09 0.22 0.07* 0.26 0.03 0.22 0.03* 0.24 0.04
UREL (mg/dL) 57.70 2.25 45.18 6.65* 47.75 6.0* 45.21 4.9* 47.73 5.53* 46.46 6.84*
Nota: Grupos controle (soluo salina), (SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes
0.4 g/kg/dia + metotrexato e (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg /dia + metotrexato. *Comparao do grupo controle (p 0.05, ANOVA, Teste de Tuckey-
Kramer mltiplas comparaes); (a) comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX
52
4.2.3 Avaliao da capacidade reprodutiva
O desempenho reprodutivo de ratas foi avaliado pela porcentagem de perdas
pr e ps-implantao; o quadro 1mostra os parmetros utilizados para o clculo
das perdas.
Quadro 1- Parmetros utilizados para o clculo de perdas pr-implantao e perdas ps-
implantao de ratas expostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaesdurante o
perodo de gestao,
Parmetros Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
Corpos lteos 65 68 72 86 58 80
Implantaes 60 66 69 69 51 75
Fetos 60 65 55 25 23 3
Nota: Grupos controle (soluo salina),(SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes
0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia + metotrexato e
(SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato.
ATabela 6 mostra os efeitos da exposio ao Lentinula edodes e ao
metotrexato, isoladamente ou em associao sobre a porcentagem de perdas pr e
ps-implantao.
Os resultados encontrados mostram que Letinula edodes nas doses de 0.4 e
0.8 g/kg/dia reduziu as perdas pr-implantao quando comparadas ao grupo
controle. O metotrexato aumentou as perdas pr-implantao quando comparado
aos grupos controle e Lentinula edodes nas doses de 0.4 e 0.8 g/kg/dia; entretanto,
na associao do metotrexato ao Lentinula edodes (0.4 g/kg/dia) observa-se uma
reduo desta perda, porm esta ainda permanecemaior quando comparada ao
grupo controle e aos grupos expostos apenas ao Lentinula edodes nas doses de 0.4
e 0.8 g/kg/dia. Por outro lado, na associao do metotrexato ao Lentinula edodes(0.8
g/kg/dia) observa-se uma reduo desta perda promovidas pelo metotrexato ou na
associao com Lentinula edodes (0.4 g/kg/dia). Porm as perdas causadas neste
53
grupo, embora no difiram das do grupo controle, so maiores do que as perdas de
ratas expostas ao Lentinula edodes nas doses de 0.4 e 0.8 g/kg/dia.
Quanto s perdas ps-implantao, o metotrexato conforme o esperado
promoveu um aumento deste parmetro, porm em associao com o Lentnula
edodes na dose de 0.4 g/kg/dia, apresentou uma reduo neste parmetro. Por
outro lado, na associao metotrexato com Lentnula edodes na dose de 0.8
g/kg/dia, ocorreu um aumento acentuado desta perda. Observa-se ainda, que o
Lentnula edodes na dose de 0.8 g/kg/dia, tambm promoveu aumento de perdas
ps- implantao quando comparado ao grupo controle.
54
Tabela 6- Desempenho reprodutivo de ratas expostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaes,durante o perodo de gestao.
Porcentagem Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
Perdas pr-implantao 7.69 2.94* 4.16* 19.76*ab 12.06*ab 6.25 *abcd
Perdas ps-Implantao 0 1.51 20.28*a 63.76*ab 54.90*ab 96*ab
Nota; Grupos controle (soluo salina), (SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes
0.4 g/kg/dia + metotrexato e (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato.*Comparao do grupo Controle (p 0.05, Teste do Qui-quadrado); (a)
comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX.
55
4.3 Efeitos da exposio ao Lentinula edodes, ao metotrexato s associaes sobre o desenvolvimento do concepto
A Tabela 7mostra que houve uma reduo de peso de fetos epara todos os
grupos quando comparados ao grupo controle (F= 85.231, p 0.0001). Este efeito foi
mais expressivo quando o Lentinula edodes nas doses de 0.4 e 0.8 g/kg/dia est
associado ao metotrexato. O peso da placenta somente encontra-se reduzido
quando da associao do Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia ao metotrexato (F= 3.461,
p0.001). Por outro lado, no foi observado reduo na vitalidade fetal, pois todos os
fetos formados encontravam-se vivos.
56
Tabela 7- Avaliao do desenvolvimento do concepto de ratas expostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaes,durante o perodo de
gestao.
Parmetros Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
Vitalidade fetal (%) 100 100 100 100 100 100
Peso dos fetos (g) 5.750,59 4.570.68* 3.970.42*a 4.180.52*a 3.770.44*a 2.64 0.26*abcd
Peso da placenta (g) 0.82 0.11 0.810.12 0.880.18 0.850.14 0.820.20 0.540.04*abcd
Nota: Grupos controle (soluo salina), (SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes
0.4 g/kg/dia + metotrexato e (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato. *Comparao do grupo controle (p 0.05, ANOVA, Teste de Tuckey-
Kramer mltiplas comparaes); (a) comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX
57
4.3.1 Avaliao morfolgica externa, visceral e ssea de fetos.
Nas avaliaes externas observou-se que em todos os grupos os fetos no
apresentaram sindactilia, hipodactilia, focomelia, alteraes abdominais, alterao
na fixao de olhos, alterao de palato. Tambm no foram observados alteraes
nas estruturas sseas. Entretanto, dos parmetros viscerais avaliados, no grupo
exposto o metotrexato, observou-se que 12% dos fetos (3 em 25 fetos) apresentou
hidrocefalia.
A Tabela 8 mostra as medidas utilizadas para a avaliao morfolgica externa
de fetos. Os resultados obtidos indicam que houve uma reduo de todos os
parmetros avaliados, tanto para os grupos expostos ao Lentinula edodes quando
administrado isoladamente como administrado em associao ao metotrexato (latero
lateral do crnio F= 16.757, p 0.0001; antero posterior do crnio: F= 10.518, p
0.0001; Latero lateral do trax: F= 12.761, p 0.0001; antero posterior do trax: F=
26.032, p 0.0001; crnio caudal; F= 31.090, p 0.0001; cauda: F= 19.055, p
0.0001). A associao da dose de 0.8 g/kg/dia de Lentinula edodes ao metotrexato
promoveu as maiores redues nas medidas.
58
Tabela 8- Medidas morfolgicas (cm) externas dos fetosde ratas expostas ao Lentinula edodes, ao metotrexato e s associaes,durante o perodo de
gestao.
Medidas
Grupos
Controle SI SII MTX SIMTX SIIMTX
Latero lateral do crnio 0.780.10 0.680.06* 0.640.05* 0.610.05* 0.680.06* 0.590*
Antero posterior do crnio 1.360.22 1.200.08* 1.160.04* 1.100.06* 1.380.24* 0.980.02*abc
Latero lateral do trax 1.010.19 0.870.10* 0.780.08* 0.800.08* 0.860.09* 0.580.05*ad
Antero posterior do trax 0.990.70 0.890.08* 0.780.07* 0.820.07* 0.850.09* 0.620.02*abcd
Crnio caudal 5.64 0.70* 4.980.33* 4.460.21*a 4.480.34*a 4.610.26* 3.360.23*abcd
Cauda 1.340.29 1.07 0.10* 0.940.09* 0.940.11* 1.140.09*b 0.750.05*d
Nota: Grupos controle (soluo salina), (SI) Lentinula edodes 0.4 g/kg/dia, (SII)Lentinula edodes 0.8 g/kg/dia, (MTX) metotrexato, (SIMTX) Lentinula edodes 0.4
g/kg/dia + metotrexato e (SIIMTX) Lentinula edodes0.8 g/kg/dia + metotrexato. *Comparao do grupo controle (p 0.05, ANOVA, Teste de Tuckey-Kramer
mltiplas comparaes); (a) comparao ao grupo SI, (b) comparao ao grupo SII, (c) comparao ao grupo MTX, (d) comparao com SIMTX
5 DISCUSSO
Este estudo fundamenta-se na premissa de que o Lentinula edodespode atuar
como um agente antioxidante, reduzindo os efeitos deletrios dos perxidos sobre
os tecidos. Neste sentido, o metotrexato, frmaco imunossupressor, promotor do
aumento das atividades de espcies reativas ao oxignio, foi utilizado para avaliar os
benefcios do potencial protetor e antioxidante do Lentinula edodessobre a
gestao(STAJI et al., 2013).
Os cogumelos apresentam numerosos compostos com atividadeantioxidante:
como vitaminas, polissacardeos, peptdeos, protenas, cidos orgnicos,
carotenides e compostos fenlicos (BORS; SARAN 1987). E embora
existamnumerosos antioxidantes sintticos que podem melhorar a capacidade do
sistema de defesa, a preferncia ainda dada aos antioxidantes naturais, devido
aos efeitos txicos e mutagnicos que estes antioxidantes sintticos podem
promover (STAJI et al. 2013). Neste sentido, ressalta-se a importncia das
dosagem de compostos fenlicos no Lentinula edodes. O valor encontrado (2.4 mg
decido glico/g base seca) est prximos ao dos estudos realizados por Pauli e
Sylos( 2010). Por lado, Reis et al. (2012) ao extrair compostos fenlicos a partir do
miclio do Lentinula edodes, obtiveram uma dosagem de 12.53 mg/g de cido glico
no extrato. Estas diferenas de dosagem de compostos fenlicos podem estar
diretamente relacionadas ao substrato utilizado no cultivo axnico.
Os compostos fenlicos so conhecidos por suas propriedades anti-oxidantes
e dentre estes, os flavonoides se destacam por esta atividade (DORMAN et al.,
2003). Entretanto, h evidncias de que as atividades biolgicas de flavonides
podem desempenhar um papel duplo em mutagnese e carcinognese. Podendo
atuar como antimutagenicos / promutagenicos e antioxidantes / pr-oxidantes, o que
em grande parte dependente dos nveis de consumo e as condies fisiolgicas
doorganismo (SKIBOLA;SMITH, 2000).
A amostra de Lentinula edodes utilizada neste estudo tambm apresentou
valores de gua e glucanas dentro dos valores preconizados na literatura. O
rendimento seco do Lentinula edodes foi de 10%, o que indica que este cogumelo
apresenta em torno de 90% de sua composio, em gua, e conforme Mattila et al
(2000), isto o indicativo de seu importante valor nutricional.
O resultado da dosagem de glucanas realizados na amostra de lentinula
edodesfoi0.53 g/100g de glicose. Os resultados encontrados apresentam-se dentro
faixa de glucanas obtida para as diversas espcies de cogumelos foi de 0.21g a
0.53g/100g de glicose, realizado em metodologia similar a empregada neste estudo
por Manzi e Pizzoferrato (2000).
A reduo do ganho de peso de gestante um fator importante na avaliao
da toxicidade materna, a qual deve estar associada s alteraes bioqumicas
maternas para a inferncia sobre a toxicidade de um agente externo (GERENUTTI;
DEL FIOL; GORPO,2006); os resultados obtidos neste estudo mostraram que o
Lentinula edodes promove um aumento do ganho de peso quando administrado
isoladamente. Entretanto, nos animais expostos ao metotrexato e nas associaes
pode-se observar uma reduo no ganho de peso.
Os ensaios in vivo com o Lentinula edodes, indicam que este cogumelo no
induz toxicidade materna, quando observados os parmetros para toxicidade renal e
heptica. As dosagens de ALT e ASTnos animais dos grupos experimentais foram
inferiores as do grupo controle. O aumento da atividade da ALTL e ASTL uma
indicativa de leses hepticas, induzidas por agentes exgenos,estudos
randomizados realizados com o metotrexato em humanos, portadores de artrite
reumatoide e hepatite C, indicam que a exposio a este frmaco, no promoveu
alterao nos nveis de AST e ALT(IANNONEet al., 2014).
Somado a isto, tambm se observou uma reduo dos nveis sanguneos de
creatinina nos grupos SII (0.8 g/kg/dia) e SIMTX (0.4 g/kg/dia) em relao ao grupo
controle. Com relao ureia apresentou reduo dos nveis em todos os grupos
experimentais em relao ao grupo controle. Teores sanguneos de ureia e
creatinina aumentados podem estar diretamente relacionados ao teor de protenas
da dieta e serem indicativo de estado patolgico renal (RENN et al., 2000).
Osresultados de avaliao heptica e renal indicam que as mes no apresentaram
efeitos de toxicidade exposio ao Lentinula edodes, ao metotrexato e nem
mesmo s associaes empregadas.
As CAT so enzimas que funcionam como canal de limpeza promovendo
detoxificao do metabolismo celular normal decompondo H2O2 (peroxido de
hidrognio) em H2O (gua) e O2 (oxignio) (BREUSEGEM, 2001).As dosagens
sanguneas de CAT em ratas prenhes indicam que nem o Lentinula edodes, nem o
MTX ou as associaes, promoveram alteraes significativas em relao ao grupo
controle.
As anlises de GHS nas gestantes indicam que o Lentinula edodes na
concentrao de 0.4 g/kg/dia no apresentou diferena do controle, e que o
Lentinula edodes na concentrao de 0.8 g/kg/diadiminuiu o GSH, mostrando que
em concentraes elevadas um composto com potencial antioxidante pode se tornar
um pr-oxidante(SKIBOLA;SMITH, 2000).
Dorman et al. (2003) afirmam que um aumento dos nveis de exposio aos
compostos fenlicos, quer atravs da dieta ou por suplementao, pode,
potencialmente, sobrecarregar o sistema que conduz formao de espcies
reativas de oxignio. Alm disso, estes autores, ressaltam que em perodos onde
existe um aumento do desenvolvimento celular, como na gestao, a exposio em
doses excessivas de substncias que contenham compostos fenlicos pode
promover uma maior sensibilidade celular aos efeitos deletrios do agente pr-
oxidante.
Os resultados obtidos, ou seja, o aumento da concentrao de GSH confirma
a ao oxidante do MTX. Por outro lado, esta atividade oxidante do MTX parece ter
sido inibida quando da associao comLentinula edodes(0.4 g/kg/dia), onde
observa-se uma reduo da GSH. Entretanto, na associao MTX eLentinula
edodes(0.8 g/kg/dia) esta ao oxidante permanece.
Segundo Lucchi et al (2005) pacientes expostos aos agentes que promovem
aumento do nvel de estresse, apresentam aumento da atividade GSH, isso parece
indicar a existncia de um mecanismo de adaptao do organismoem virtude do
aumento dessa atividade. Isto parece justificar o aumento ocorrido nos grupos MTX,
SIMTX, SIIMTX, onde apresentaram um aumento significativo de GSH em relao
ao grupo controle.
Segundo Weber-Schoendorfer et al (2014) o uso ps-concepo de doses
reumatolgicas de metotrexato est associado ao risco aumentado de defeitos
congnitos graves e aborto espontneo.Em nossos resultados a exposio
dometotrexato(MTX), corrobora esta informao, uma vez que o metotrexato (MTX)
promoveu uma significativa perda pr-implantao e uma acentuada perda ps-
implantao. Entretanto, a perda pr-implantao apresenta-se reduzida quando da
associao do metotrexato aoLentinula edodes; e este efeito parece ser dose
dependente, reforando a capacidade de proteo do Lentinula edodes sobre os
efeitos txicos do metotrexato, uma vez que as ratas foram expostas ao Lentinula
edodesdesde o primeiro dia gestao. As ratas expostas associao do
metotrexato com Lentinula edodes0.8 g/kg/dia tiveram suas perdas pr-implantao
inferiores a associao do metotrexato com Lentinula edodes0.4 g/kg/dia, e foram
semelhantes aos do grupo
