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Universidade do Algarve Faculdade de Ciências e Tecnologias

Curso de Bioquímica

Relatório de estágio

Estudo sobre a regulação da mineralização in vitro de

duas linhas celulares derivadas de vértebra de um peixe

teleósteo marinho, Sparus aurata

Autor: Duarte Miguel P. Molha

Orientadores: Prof. Doutora Leonor Cancela

Doutor Vincent Laizé

Faro, 29 de Janeiro de 2003

Research is to see what everyone else has seen, and to think what no one else has thought.”

– Albert Szent Gyoergi – “

TÉá Åxâá ct|á ÑÉÜ àÉwÉ É TÅÉÜ x VtÜ|Ç{É‹

i

Agradecimentos

Existem muitas pessoas a quem gostaria de agradecer…

Gostaria em primeiro lugar, agradecer à professora Leonor Cancela, por me ter permitido

realizar o estágio no seu laboratório, por toda a sua orientação e apoio.

Agradecer também o imenso apoio, amizade e orientação científica do Doutor Vincent

Laizé sem o qual todo este projecto teria sido bastante mais difícil. Merci Vincent!

Agradeço ainda a todos os meus colegas do laboratório, pelo ambiente caloroso que vim

encontrar e pela forma como me acolheram e me ajudaram. São eles António Pombinho,

Assuncion Lago, Brian Schaff, Bruno Pardelha, Carla Viegas, Dina Simes, João Fidalgo, Jorge

Pinto, Juan Bosco, Natércia Conceição, Nuno Henriques, Patrícia Cabrita, Paulo Gavaia, Ricardo

Afonso, Ricardo Leite, Sandra Marques e Vera Fonseca.

Quero também agradecer a todos os meus colegas de curso, pelos anos inesquecíveis que

partilharam comigo e pelos momentos de amizade que relembrarei para o resto da minha vida.

Entre muitos outros gostaria de destacar os meus colegas de casa João Fidalgo (“Joni”) e João

Matos (“Jepe”) por me terem aturado durante todos estes anos, pelo carinho e amizade que

sempre demonstraram.

Gostava ainda de agradecer a todo o corpo de docentes da licenciatura em Bioquímica da

Ualg. pela sua dedicação ao ensino e à motivação dos alunos para esta área tão nobre que é a

química da Vida!

Quero agradecer à Natasha, todo o amor que me deu e por estar ao meu lado tanto nos

momentos mais difíceis como nos momentos de alegria…

Por último quero agradecer à minha família, aos meus pais e à minha irmã a quem dedico

todo este trabalho e sem os quais nunca teria chegado onde cheguei. Obrigado por tudo…

Universidade do Algarve Abstract

ii

Abstract

Studies on regulation of bone formation and mineralization in fish have been

hampered due to a lack of well characterized in vitro model system. The purpose of

this work was to investigate the ability of recently developed bone-derived cell

lines to induce extracellular matrix mineralization and their suitability to study

specific gene expression and regulation.

We found that both cell lines were tetraploid, and that the mineralization of

their extracellular matrix is dependent on several factors. Calcium and

β-glycerophosphate are required for the mineralization and an excess of calcium

leads to a decrease in mineralization rates. We also found that vitamin C may have

a role on the estabilization of the mineralized nodules, decreasing the quantity of

mineralization but increasing the quality of the mineralization nodules.

We have also investigated the effect on mineralizing rates, of levamisole, a

known inhibitor of alkaline phosphatase and warfarin, an inhibitor of the

γ-carboxilation. We have observed that levamisole inhibits and warfarin stimulates

the mineralization of the extracellular matrix, both in a dose dependent manner.

Our results indicate that this new in vitro model system constitutes a

valuable tool for further studies on expression of genes involved in extracellular

matrix mineralization.

Universidade do Algarve Resumo

iii

Resumo

Estudos sobre a regulação da mineralização e formação óssea em peixes têm

sido limitados a estudos in vivo, devido à ausência de um sistema in vitro, bem

caracterizado. O objectivo deste trabalho, foi o de investigar a capacidade de

indução de mineralização da matriz extracelular em linhas celulares recentemente

desenvolvidas, derivadas de osso de Sparus aurata (VSa13 e VSa16), bem como

avaliar a sua utilização para estudos de expressão e regulação de genes

relacionados com o processo de mineralização.

Descobriu-se que ambas as linhas celulares são tetraplóides e que a sua

capacidade de mineralizar a matriz extracelular se encontra dependente de diversos

factores. Verificou-se que estas células necessitam de cálcio e β-glicerofosfato para

a indução da mineralização, tendo-se no entanto observado que um excesso de

cálcio leva a uma diminuição mineralização. A vitamina C poderá ter um papel

importante na estabilização dos nódulos mineralizados.

Neste estudo também se determinou o efeito da adição de levamisole, que é

um conhecido inibidor da fostafase alcalina, e de warfarina, inibidora da

γ-carboxilação, na capacidade de mineralização destas linhas celulares.

Verificamos que o tratamento com concentrações crescentes de levamisole leva a

uma redução no nível de mineralização de ambas as linhas celulares, enquanto que

o tratamento com concentrações crescentes de warfarina induz a mineralização da

matriz extracelular.

Verificou-se que este novo sistema in vitro, pode ser utilizado como modelo

de sistemas osséos de Sparus aurata e constitui uma ferramenta bastante útil para

novos estudos envolvendo expressão e/ou regulação de genes, bem como estudos

sobre a função de diversas proteínas envolvidas na regulação dos processos de

ossificação.

Universidade do Algarve Índices e Abreviaturas

iv

Abreviaturas

Aa aminoácido Abs Absorvância ADN Ácido desoxiribonucleico ADNc Ácido desoxiribonucleico complementar AMPc Adenosina monofosfato cíclica ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensageiro BGP Proteína Gla do osso (derivado do Inglês - bone Gla protein) BSA Albumina de soro bovino (derivado do Inglês - “bovine serum albumin”)Da Dalton D-MEM “Dulbecco’s modified Eagle medium” DMSO Dimetil sulfóxido

EDTA Tetra-acetato de etilenodiamina (derivado do Inglês - “ethylenediaminetetra-acetate”)

FBS Soro fetal bovino (derivado do Inglês - “fetal bovine serum”) Gla Resíduo de ácido glutâmico γ-carboxilado Glu Resíduo de ácido glutâmico IPTG “Isopropilthio-β-D-galactosidase” kb kilobase (1 kb => 1000 pb) kDa kilodalton (1 kDa => 1000 Da)

MCS Região de inserção fragmentos em vectores (derivado do Inglês – “multiple cloning site”

MEC Matriz extracelular MGP Proteína Gla da Matriz (derivado do Inglês - “matrix Gla protein”)

ORF Região codante de um gene (derivado do Inglês – “open reading frame”)

pb Pares de bases PBS Tampão fosfato salino (derivado do Inglês “phosphate-buffered saline”)

PCR Reacção de polimerização em cadeia (derivado do Inglês - “polymerase chain reaction”)

RPM Rotações por minuto SDS “Sodium dodecyl sulphate” T.A. Temperatura ambiente TAE Tris-acetato-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TGFβ “Transforming growth factor β” u.v. Ultra-violeta X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside


v

Índice

AGRADECIMENTOS I

ABSTRACT II

RESUMO III

ABREVIATURAS IV

ÍNDICE V

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. ESTRUTURA E DESENVOLVIMENTO DE OSSO 1 1.1.1. ANATOMIA ÓSSEA 1 1.1.2. DESENVOLVIMENTO ÓSSEO 2 1.1.3. ORGANIZAÇÃO CELULAR DENTRO DA MATRIZ ÓSSEA 3

i. Osteoblastos 3 ii. Osteócitos 4 iii. Osteoclastos e a reabsorção óssea 5

1.1.4. TECIDO ÓSSEO EM PEIXES TELEÓSTEOS 6 1.1.5. COMPOSIÇÃO MOLECULAR DA MATRIZ 7

i. Colagénio 8 ii. Proteínas não-colagénicas 8

• Proteoglicanos 9

• Glicoproteinas 10

• Proteínas com resíduos de ácido glutâmico γ-carboxilados 10 BGP (Bone Gla Protein) 11

• Estrutura 11

• Biossíntese 12

• Função 13

• Regulação 13

• Importância clínica 14 MGP (Matriz Gla Proteico) 15


vi

• Estrutura 15

• Biossíntese 15

• Função 16

• Regulação 16

• Importância clínica 17 1.2. FORMAÇÃO DE MINERAL EM CULTURAS CELULARES 17 1.3. CARACTERIZAÇÃO DA ESPÉCIE EM ESTUDO: SPARUS AURATA 18

1.3.1. POSIÇÃO SISTEMÁTICA 18 1.3.2. BIOLOGIA E ECOLOGIA DA ESPÉCIE 18 1.3.3. INTRODUÇÃO AO PROBLEMA COM A SPARUS AURATA 19

1.4. TRABALHOS PRELIMINARES 19 1.5. OBJECTIVO 20

2. MATERIAIS E MÉTODOS 21

2.1. MATERIAIS 21 2.2. MÉTODOS 21

2.2.1. MANUTENÇÃO BACTÉRIAS E CULTURAS CELULARES 21 i. Escherichia coli 21 ii. Sparus aurata 22

• Meio de cultura 22

• Propagação e contagem de células 22

• Criopreservação 23 2.2.2. DETERMINAÇÃO DE CARIÓTIPO DE CÉLULAS EM CULTURA 23 2.2.3. QUANTIFICAÇÃO PROTEICA TOTAL 24

i. Método de Bradford 24 ii. Método de BCA 25

2.2.4. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA 25 2.2.5. DETECÇÃO DE NÓDULOS MINERALIZADOS POR MÉTODO DE COLORAÇÃO DE VON

KOSSA 26 2.2.6. QUANTIFICAÇÃO DE CÁLCIO 26 2.2.7. CURVA DE RESISTÊNCIA À GENETICINA EM VSA13 E VSA16 27 2.2.8. TRANSFECÇÃO POR CO-PRECIPITAÇÃO DE ADN COM FOSFATO DE CÁLCIO 28 2.2.9. ANÁLISE DE PROTEÍNAS 29

i. Obtenção das proteínas secretadas pelas células 29 ii. Electroforese de SDS-PAGE 30


vii

2.2.10. TRANSFORMAÇÃO EM E. COLI 30 2.2.11. PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ADN 31

i. Mini-preparação de ADN plasmídico 31 ii. Maxi-preparação de ADN plasmídico 31

2.2.12. EXTRACÇÃO E PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADN DE GEL DE AGAROSE 32 2.2.13. ELECTROFORESE DE ADN EM GÉIS DE AGAROSE 33 2.2.14. DIGESTÃO E LIGAÇÃO DE ADN 33 2.2.15. AMPLIFICAÇÃO DE ADN POR PCR 34 2.2.16. SEQUENCIAÇÃO DE ADN 35

3. RESULTADOS 37

3.1. FENÓTIPO DAS LINHAS CELULARES EM VSA13 E VSA16 37 3.2. CARACTERIZAÇÃO DO CARIÓTIPO DAS LINHAS CELULARES 38

3.2.1. CARIÓTIPO DA LINHA VSA13 38 3.2.2. CARIÓTIPO DA LINHA VSA16 39

3.3. ESTUDO DA MINERALIZAÇÃO IN VITRO 40 3.3.1. ANÁLISE DE CONDIÇÕES DE MINERALIZAÇÃO EM VSA13 E VSA16 40

i. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha celular VSa13 41 ii. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha celular VSa16 44

3.3.2. EFEITO DA ADIÇÃO DE LEVAMISOLE NA MINERALIZAÇÃO DA MEC EM LINHAS

CELULARES DE VSA 46 i. Estimativa da de taxa de mineralização 46 ii. Medição da deposição de cálcio 47 iii. Determinação da actividade da fosfatase alcalina 48

3.3.3. EFEITO DA ADIÇÃO DE WARFARINA NA MINERALIZAÇÃO EM LINHAS CELULARES

DE VSA 49 i. Estimativa da de taxa de mineralização 49 ii. Medição da deposição de cálcio 50

3.3.4. CARACTERIZAÇÃO POR SDS-PAGE DAS PROTEÍNAS EXCRETADAS POR VSA13 E

VSA16 51 3.4. CONSTRUÇÃO DE LINHA CELULAR CAPAZ DE SOBREPRODUÇÃO DE BGP 52

3.4.1. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO 52 i. Construção do vector pcDNA3-BGP 52 ii. Construção do vector pRC/CMV-BGP 55 iii. Construção do vector pcDNA3-BGPorf 58


viii

3.4.2. CURVA DE RESISTÊNCIA À GENETICINA DE CÉLULAS VSA13 E VSA16 59 i. Resistência da linha celular VSa13 a geneticina 59 ii. Resistência da linha celular VSa16 a geneticina 60

3.4.3. CONTROLO POSITIVO DE TRANSFECÇÃO POR ENSAIO POR PβGAL 61 3.4.4. TRANSFECÇÃO DAS VSA13 COM OS PLASMÍDEOS PCDNA3-BGP E PRC-BGP 62

4. DISCUSSÃO 63

i. Cariótipos das linhas celulares VSa13 e VSa16 63 ii. Efeito da vitamina C e cálcio na mineralização da MEC 63

• Efeito da vitamina C 64

• Efeito do cálcio 64 iii. Efeito de levamisole e warfarina na mineralização da MEC 65

• Efeito do levamisole 65

• Efeito da warfarina 65 iv. Transfecções com plasmídeos de forma a obter uma linha celular capaz de

sobreexprimir BGP 66 v. Identificação de proteínas expressas em VSa13 e VSa16 67

5. PASSOS FUTUROS 68

6. BIBLIOGRAFIA 69

7. ANEXOS 77

7.1. ANEXO I – SOLUÇÕES UTILIZADAS 78 7.2. ANEXO II – CURVAS DE CALIBRAÇÃO 80

• Método de Bradford 80

• Método de BCA 80

• Curva de calibração de p-nitrofenol 81 7.3. ANEXO III – PLASMÍDEOS 82

• pcDNA3 82

• pcDNA3-BGP 82

• pRC/CMV 83

• pRC-BGP 83

• pGEM-T-easy 84

Universidade do Algarve Introdução

1

1. Introdução

1.1. Estrutura e desenvolvimento de osso

O tecido ósseo e a cartilagem são dois tipos de tecido conjuntivo especializado, que

compõem em conjunto o sistema esquelético dos vertebrados. Estes tecidos têm como principal

função conferir suporte mecânico, pelo alojamento dos músculos responsáveis pela locomoção,

participar na protecção dos órgãos vitais e da medula óssea e por fim funcionar como agente de

armazenamento de iões, especialmente cálcio e fosfato [Murray 1999].

Um dos principais constituintes destes tecidos, tal como nos restantes, é a sua matriz

extracelular. Esta é rica em fibras de colagénio bem como uma grande quantidade de outras

proteínas. No entanto, os tecidos ósseos, os dentes e as cartilagens, ao contrário do restante

tecido conjuntivo, têm a habilidade única de permitir a calcificação da sua matriz [Murray 1999].

1.1.1. Anatomia óssea

Do ponto de vista anatómico é possível subdividir o tecido ósseo em dois grupos. Os

ossos lisos ou planos, nos quais podemos incluir, entre outros, os ossos do crânio e mandíbula e

os ossos longos, tais como a tíbia, o fémur.

Como podemos observar na Figura 1, a parte externa dos ossos é formada por uma

camada de tecido calcificado muito espessa e densa chamada de córtex ou osso compacto, no

qual se encontra enclausurada ao nível da diafase, uma cavidade medular onde a medula óssea

hematopoietica se encontra alojada. Na região da metáfase e da epifase o córtex torna-se

progressivamente mas fino e o espaço interior é preenchido por uma rede calcificada à qual se dá

o nome de osso trabecular ou esponjoso, devido ao seu aspecto poroso. Estes poros não se

encontram vazios, e neles podemos encontrar a medula óssea, que vem em continuidade da

cavidade medular.


2

Continuando na direcção da extremidade do osso, encontramos uma placa de crescimento

de cartilagem não mineralizada. Desta forma podemos verificar que existem duas superfícies

ósseas que se encontram em contacto com outros tecidos; uma superfície externa denominada

periosteal e uma interna chamada de endosteal. É nestas superfícies que podemos encontrar

células osteogénicas (ou osteoprogenitoras) organizadas por camadas [Murray 1999].

1.1.2. Desenvolvimento ósseo

O tecido ósseo forma-se sempre a partir de um tecido conjuntivo pré-existente. A sua

formação pode ocorrer de duas formas distintas. Quer pela mineralização directa a partir da

matriz segregada por osteoblastos, à qual se dá o nome de ossificação intramembranosa, quer por

deposição de matriz óssea sobre uma matriz cartilagínea pré-existente (ossificação endocôndrica)

[Bloom and Fawcett 1975, Junqueira et al. 1995].

Na via intramembranar, as células embrionárias do mesenquima, existentes no tecido

conjuntivo, diferenciam-se em osteoblastos que são as células formadoras de novo osso. O osso

formado contém inicialmente apenas fibras de colagénio dispostas irregularmente. Este osso vai

depois sofrer um processo de maturação, formando-se então um osso maduro, denominado

lamelar devido à sua disposição por camadas. Por outro lado, as partes terminais dos ossos

Figura 1 – Regiões nas quais se podem subdividir os ossos longos longos. As setas indicam a localização das regiões indicadas por baixo de cada imagem.

(adaptado de http://trc.ucdavis.edu/mjguinan/apc100/modules/Musculoskeletal/_topics.html)


3

longos sofrem um processo de formação por via endocondral, em que as células mesenquimais

se diferenciam em condroblastos. Estas células segregam uma matriz cartilagínea que forma o

tecido molde no qual ocorre calcificação.

1.1.3. Organização celular dentro da matriz óssea

Podemos distinguir 4 grupos diferentes de células nos ossos em crescimento: células

osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos e por fim osteoclastos (Figura 2).

À excepção dos osteoclastos, esta divisão pode ser encarada como 3 diferentes estados

funcionais do mesmo tipo de células. Este processo de alterações morfológicas e funcionais é, ao

contrário do processo de diferenciação celular, um processo reversível ao qual é dado por isso o

nome de modelação celular [Bloom and Fawcett 1975].

Figura 2 – Esquema do processo de remodelação óssea e das células envolvidas neste processo.

(adaptado de: www.archive.nsca.uiuc.edu/newanatomy/page3bones.html)

i. Osteoblastos

Os osteoblastos são as células responsáveis pela produção dos principais constituintes da

matriz extracelular. São originárias das células da medula óssea ou do tecido conjuntivo. Estas

células precursoras, mediante o estímulo correcto, iniciam a sua proliferação e diferenciação em


4

Figura 3 – Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteoblastos.


preosteoblastos. Os osteoblastos nunca actuam isolados, podendo ser encontrados em grupos ao

longo da superfície do osso (Figura 3).

Estas células caracterizam-se por um núcleo arredondado, e por um proeminente aparelho

de Golgi. Podem encontrar-se na superfície óssea, sobre a matriz que estão a produzir, ainda

antes desta se encontrar calcificada (a qual é chamada nesta fase de tecido osteóide). A

existência deste tecido é uma consequência do intervalo de tempo entre a formação da matriz e a

sua posterior calcificação (cerca de dez dias).

Uma outra característica marcante dos osteoblastos é a presença de um retículo

endoplasmático rugoso extremamente desenvolvido. Sendo responsáveis pela formação da

matriz óssea, estas células segregam grandes quantidades de colagénio. Este colagénio organiza-

se para formar estruturas semelhantes a cordas. A estas estruturas é dado o nome de fibras em

espiral ou osteóides (o que dá origem ao nome do tecido formado nesta fase – tecido osteóide).

Os osteoblastos causam a precipitação de sais de cálcio e fósforo a partir do sangue, que se ligam

aos osteóides, e iniciam a mineralização do tecido osteóide.

Frequentemente também se verifica a presença de ligações entre as células (“Gap

junctions”). A membrana plasmática dos osteoblastos é rica em fosfatase alcalina e possui

receptores para a hormona da paratiróide. Os osteoblastos também expressam receptores

esteróides para estrogénios e vitamina D no núcleo, bem como diversas moléculas de adesão

(integrinas) e receptores de citoquinas.

ii. Osteócitos

A matriz óssea calcificada, embora muito estável, não é metabolicamente inerte. No

interior desta matriz podemos encontrar osteócitos, em pequenas lacunas chamadas de lacunas

osteocíticas. Estes osteócitos são células derivadas de osteoblastos.


5

A morfologia dos osteócitos varia de acordo com a sua idade e actividade funcional. Um

osteócito jovem é morfologicamente semelhante a um osteoblasto, tendo no entanto um visível

decréscimo do seu volume celular, bem como o retículo endoplasmático e o aparelho de Golgi

menos desenvolvidos. Num osteócito mais maduro, já bastante mais embebido na matriz

calcificada (Figura 4), as características referidas anteriormente são ainda mais evidentes,

verificando-se ainda uma acumulação de glicogénio no citoplasma [Murray 1999].

O destino dos osteócitos é a fagocitação e digestão, conjuntamente com os restantes

componentes do osso quando se dá a reabsorção óssea por parte de osteoclastos. Uma das

funções importantes em que estas células podem estar envolvidas é a regulação e activação local

dos processos de remodelação óssea [Murray 1999].

iii. Osteoclastos e a reabsorção óssea

Os osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea. São células gigantes

que podem conter até 20 núcleos e podem ser encontradas de modo geral em contacto com a

matriz calcificada ou dentro de uma lacuna resultante da sua própria actividade de reabsorção

(Figura 5). Dentro de cada uma destas lacunas é possível encontrar até cinco osteoclastos,

embora geralmente apenas contenham uma ou duas células.

A aparência morfológica dos núcleos varia mesmo dentro de uma mesma célula. Alguns

são redondos e outros apresentam contornos irregulares, o que poderá reflectir a fusão

dessincronizada de percursores mononucleares. O citoplasma apresenta muitos vacúolos e a zona

de contacto com o osso é caracterizada pela presença de uma região muito enrugada com densas

saliências nas partes laterais.

Figura 4 – Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteocitos.

(adaptado de http://trc.ucdavis.edu/mjguinan/apc100/modules/Musculoskeletal/ topics.html)


6

Os osteoclastos apresentam também eles, um complexo de Golgi extremamente

desenvolvido, disposto em torno de cada um dos núcleos. São também abundantes as

mitocôndrias e as vesículas de transporte. No entanto, a característica mais proeminente dos

osteoclastos são as profundas invaginações da membrana plasmática na região em contacto com

a matriz calcificada. A região enrugada na área central encontra-se ladeada por um anel de

proteínas contrácteis, que tem como função a ligação da célula à superfície do osso, permitindo

desta forma selar a área de reabsorção, também chamada de compartimento da reabsorção.

1.1.4. Tecido ósseo em peixes teleósteos

Embora a origem dos tecidos ósseos nos peixes seja complexa, pode ser dividida em dois

grupos principais, derivados dos tipos de ossificação.

A ossificação intramembranar forma-se na ausência de uma matriz cartilagínea

pré-existente, e as ossificações paracondrais, pericondrais e endocondrais formam-se pela

mineralização das cartilagens [Junqueira et al. 1995].

A ossificação intramembranosa dá origem ao dermoesqueleto dos peixes a partir de

diferenciação da superfície externa da sua epiderme [Francillon-Vieillot et al. 1975]. O

endoesqueleto dos peixes teleósteos é bastante robusto e leve. O seu desenvolvimento, ao

contrário do exoesqueleto, é em grande parte originado por mineralização de cartilagem

[Franceschi et al. 1988].

Figura 5 – Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteoclastos.



7

Nos peixes teleósteos existem sobretudo dois tipos de ossos:

Osso celular (osteocítico): Tal como o

nome sugere, este tipo de osso possui células. Neste

caso, as células formadoras de novo tecido ósseo, os

osteoblastos, à medida que vão formando a matriz

óssea ficam encerrados na mesma, diferenciando-se

em osteócitos que permanecem fisiologicamente

activos em cavidades periosteociticas interligadas

através de extensões citoplasmáticas, que passam

através de minúsculos canais ósseos denominados

canaliculi (Figura 6) [Parenti 1986, Weiss and

Watabe 1979].

Osso acelular (anosteocítico): Neste osso, os osteoblastos deslocam-se ao mesmo tempo

que a frente de mineralização, nunca ficando encerrados no seu interior. Em alternativa, este tipo

de osso pode enclausurar os osteoblastos na matriz óssea, no entanto estes acabam por diminuir

de volume e morrer ainda antes da mineralização ocorrer [Moss 1965].

O osso celular é característico dos teleósteos inferiores, e o osso acelular surge nos

teleósteos superiores, como uma evolução, ao contrário do que se poderia supor [Gavaia 1997,

Parenti 1986, Weiss and Watabe 1979].

1.1.5. Composição molecular da matriz

A composição das estruturas ósseas permitem-lhes desempenhar o seu papel mecânico de

protecção e de regulação da homeostase. Embora esta composição esteja dependente de diversos

factores tais como a idade, a localização anatómica e a dieta, de modo geral o osso possui 50 a

70% de mineral, a matriz proteica constitui entre 20 a 40%, apenas existindo 5 a 10% de água e

menos de 3% de constituintes lipídicos.

O mineral que se encontra nos ossos contém muitas impurezas, sendo muito poroso e de

estrutura cristalina muito irregular. Estas características tornam-no mais solúvel, permitindo que

este actue como um reservatório de cálcio, fosfato e iões de magnésio.

Figura 6 – Nesta Figura podemos observar uma parte de uma secção de um osso osteocitico.

(Adaptado de www.medes.fr/Eristo/Osteoporosis/ BoneRemodeling.html)


8

A matriz óssea é formada por fibras de colagénio, sobretudo do tipo I (90%). Os cristais

de hidroxiapatite (Ca10(PO4)6).(OH)2 intercalam-se por entre as fibras de colagénio.

No entanto na matriz óssea encontram-se muitas proteínas não colagénicas, recentemente

purificadas e sequenciadas, contudo a sua função até agora apenas se encontra parcialmente

caracterizada. A grande maioria destas proteínas são sintetizadas pelas células que formam os

ossos, os osteoblastos, no entanto existem proteínas que são preferencialmente absorvidas pela

matriz óssea sendo sintetizadas noutros tecidos tais como o fígado.

i. Colagénio

A unidade de construção básica da rede de fibras da matriz óssea é o colagénio do tipo I

(Figura 7). Trata-se de uma molécula em hélice tripla que contem duas cadeias idênticas α1 e

uma outra cadeia que embora estruturalmente seja semelhante, possui uma sequência distinta

(α2).

As cadeias polipeptidicas de colagénio

caracterizam-se por possuírem uma

subsequência repetitiva Gly-X-Y em que X é

de modo geral uma prolina e em que se

verificam diversas modificações pós-tradução

tais como hidroxilações de certos resíduos de

prolina ou lisinas, glicosilações de lisinas ou

hidroxilisinas com glucose e/ou galactose e

também formação de ligações covalentes intra

e intermoleculares. A análise do nível destas

ligações das proteínas de colagénio presentes

na urina, dá-nos uma boa indicação do nível

de reabsorção óssea que está a ocorrer.

ii. Proteínas não-colagénicas

Constituem 10 a 15% do total de teor proteico da matriz óssea, das quais cerca de um

quarto são provenientes de outros tecidos. Uma grande fracção destas proteínas exógenas são

proteínas do soro tais como albumina e α2-HS-glicoproteina, que por terem um carácter ácido

Figura 7 – Esquema de uma molécula de colagénio –A – cadeia polipeptidica simples B – Modelo no espaço da cadeia C – Conformação em hélice tripla característica do colagénio com os resíduos de glicina no interior da hélice (D – a cor vermelha).

(adaptado de: www.mad-cow.org/collagen.gif)


9

conseguem ligar à matriz devido à sua grande afinidade com os cristais de hidroxiapatite.

Embora não sejam provenientes do próprio tecido ósseo, podem exercer efeitos na mineralização

da matriz extracelular, sendo que à α2-HS-glicoproteina (fetuina nos humanos) é atribuída uma

função de regulação da proliferação das células ósseas. As restantes proteínas exógenas são

sobretudo factores de crescimento e uma grande variedade de proteínas presentes encontram-se

apenas em quantidades vestigiais.

Um dos marcos mais importantes na formação óssea é a síntese de elevados níveis de

fosfatase alcalina. Esta proteína tem como função fornecer fosfato inorgânico (Pi) para a

formação dos cristais de hidroxiapatite Encontra-se primeiramente ligada à superfície celular

através de uma ligação por fosfoinositol. Esta ligação pode mais tarde ser clivada encontrando-se

desta forma fosfatase alcalina na matriz extracelular.

Quanto às proteínas endógenas, podem ser agrupadas em 3 áreas principais:

proteoglicanos; proteínas glicosiladas e por fim as proteínas γ-carboxiladas.

Proteoglicanos

Proteoglicanos são macromoléculas que contém pelo menos uma cadeia lateral acídica de

um polissacarídeo ligada a um centro proteico. Estas proteínas podem ser encontradas tanto

dentro das células, à sua superfície ou mesmo na matriz extracelular. Na matriz óssea podemos

encontrar algumas proteínas pertencentes a esta família, tais como o biglicano e a decorina.

O biglicano pode ser muitas vezes encontrado ligado à superfície de células em

diferenciação e pensa-se que poderá estar envolvido no processo de crescimento e

desenvolvimento do esqueleto, uma vez que julga que o sindroma de Happle, que se caracteriza

por indivíduos de baixa estatura, poderá ser devido a um defeito no gene desta proteína [Traupe

et al. 1992]. O biglicano também possui interacções com o colagénio do tipo I [Boskey et al.

1997b, Schonherr et al. 1995a, Schonherr et al. 1995b, Traupe et al. 1992].

A decorina pode ser encontrada em muitos tecidos conjuntivos, embora tenha sido

inicialmente isolada de cartilagem e osso [Fisher et al. 1983, Rosenberg et al. 1985]. Foi

proposto que esta proteína possa actuar como um ligando bidentado, que liga duas moléculas

vizinhas de colagénio, auxiliando a estabilização das fibras [Scott 1996]. Foi também sugerido,

que possa participar na regulação da espessura das fibras de colagénio [Vogel et al. 1984],

no entanto, um dos papéis mais importantes desta proteína poderá envolver a regulação da

divisão celular e sua diferenciação, uma vez que o seu núcleo proteico liga o TGFβ [Yamaguchi


10

et al. 1990] e é capaz de neutralizar o efeito de estímulo ao crescimento provocado por este

factor [Ruoslahti and Yamaguchi 1991]

Glicoproteinas

Uma das glicoproteinas mais abundante, produzida pelas células ósseas é a osteonectina.

A sua função no osso está relacionada sobretudo com o crescimento e proliferação dos

osteoblastos bem como a mineralização da matriz extracelular.

Existem outras glicoproteinas encontradas na matriz tais como a tetranectina e a

tenascina, no entanto o seu papel ainda é desconhecido.

As células ósseas sintetizam pelo menos nove proteínas que poderão estar envolvidas nos

processos de ligação das células a matriz mineralizada. Estas glicoproteinas têm em comum a

presença de uma sequência, denominada RGD, pois possui os resíduos Arg-Gly-Asn, e que

representa a sequência de ligação à classe de integrinas da superfície celular. Dentro deste grupo,

encontram-se a fibronectina, fibrilina, osteopontina, sialoproteina óssea, entre outras.

Embora se saiba que, por exemplo, a osteopontina é capaz de ancorar os osteoclastos ao

osso, a função da grande maioria destas proteínas é ainda desconhecida uma vez que ainda não

se detectaram quaisquer tipos de defeitos esqueléticos causados pela ausência de qualquer uma

destas proteínas.

Proteínas com resíduos de ácido glutâmico γ-carboxilados

Incluem-se neste grupo diversas proteínas tais como a BGP (bone Gla protein), mais

conhecida por osteocalcina, e a MGP (matrix Gla protein), bem como diversas proteínas, a

grande maioria relacionadas com a via de coagulação sanguínea, tais como a protrombina e os

factores de coagulação VII, IX, X, Z. As duas primeiras são encontradas dos tecidos ósseos e as

restantes são essencialmente produzidas pelo fígado. Caracterizam-se por sofrerem modificações

pós-tradução pela acção de γ-carboxilases dependentes de vitamina K, que modificam resíduos

de ácido glutâmico em resíduos Gla por γ-carboxilação.

Estes resíduos modificados (Figura 8) conferem uma elevada afinidade destas proteínas

aos iões de cálcio, fosfato e cristais de hidroxiapatite.


11

A warfarina é um inibidor da regeneração das formas biologicamente activas do co-factor

vitamina K. Assim, este agente impede a γ-carboxilação dos resíduos Glu em Gla, fazendo com

que as proteínas que possuem estes resíduos deixem de ter afinidade com o cálcio.

BGP (Bone Gla Protein)

Sendo secretada exclusivamente em tecidos calcificados, a osteocalcina é uma das

proteínas não colagénicas mais abundantes nos ossos. No entanto a sua função biológica ainda

não se encontra completamente definida.

Estrutura

Isolada pela primeira vez por Price em 1976 a partir de osso de bovino [Price et al.

1976a], e pouco tempo depois sequenciada [Price et al. 1976b], desde então têm sido descobertas

muitas outras sequencias tanto em outros mamíferos como em aves, anfíbios e peixes [Cancela et

al. 1995, Pinto et al. 2001, Viegas et al. 2002]. É uma proteína muito ácida, de aproximadamente

6 kDa, com 46 a 50 aa, dependendo da espécie, que contém 3 resíduos Gla. São estes resíduos

que conferem à molécula a sua afinidade para o cálcio [Price 1989].

NH2

O

HO

O

O-

O-

O

Figura 8 – Esquematização do resíduo Gla. Na direita a estrutura química e na esquerda a visão 3D “Space

Filling” do resíduo. Como se pode verificar os 2 grupos acídicos conferem uma grande carga negativa a este

resíduo, conferindo-lhe uma grande afinidade para a hidroxiapative que é carregada positivamente graças aos

iões de Ca2+ que possui. (ilustrações criadas em ChemOffice Pro7.0)


12

No estudo realizado por Cancela [Cancela et al. 1995], as sequências conhecidas até

então para a proteína foram comparadas e determinou-se a existência de um grupo de

12 resíduos, que se presumem críticos para a correcta conformação tridimensional da BGP e para

a manutenção da sua funcionalidade. Esta conservação permite ainda retirar algumas indicações

de uma preservação funcional ao longo de um grande período de evolução [Hauschka et al.

1989].

Pelo facto desta proteína ainda não ter sido encontrada em peixes cartilagíneos e apenas

surgir em tecidos ósseos calcificados, especula-se de que poderá ter surgido em simultâneo com

o desenvolvimento de estruturas ósseas, e que será um componente vital à manutenção deste tipo

de tecido especializado [Cancela et al. 1995].

Biossíntese

Sintetizada tanto por odontoblastos como por osteoblastos, verifica-se que se encontra

bastante conservada ao longo de todas as espécies de vertebrados até agora estudados.

A BGP é sintetizada como uma sequência polipeptídica não processada (“preproBGP”)

com cerca do dobro do tamanho da sequência madura. Esta sequência inicial contém um péptido

de sinalização (que dirige a proteína para o retículo endoplasmático) e um propéptido

(responsável pela ligação da γ-carboxilase para processamento dos resíduos Gla). Ambas estas

sequências são removidas antes da proteína ser secretada (Figura 9).

Gla-XXX-Gla-X-Cys

γ-carboxilase

Gla-XXX-Gla-X-Cys

PeptidaseGlu-XXX-Glu-X-Cys

Glu-XXX-Glu-X-Cys

12

3

4

Figura 9 – Esquema do processo de biossíntese da BGP. 1- Síntese de preproBGP; 2 – Remoção do péptido de sinalização; 3 – Ligação da γ-carboxilase e processamento dos resíduos Glu em Gla; 4 – Remoção do propéptido de ligação à γ-carboxilase


13

Função

Sendo uma das 10 proteínas mais abundantes no corpo humano e por se encontrar restrita

a células ósseas, houve um crescente interesse sobre a possível função fisiológica desta proteína,

que no entanto, ainda não se encontra completamente definida.

Alguns estudos atribuíram à BGP a função de recrutar precursores de osteoclastos para os

locais de reabsorção e promover a sua diferenciação em osteoclastos [Glowacki et al. 1991].

No entanto, Price, que em 1981 relatou a existência de mineralização excessiva nas placas de

crescimento de ratos tratados com warfarina [Price and Williamson 1981], sugeriu que uma das

possíveis funções da proteína seria a de regular a quantidade de mineral que é depositado

aquando da calcificação da matriz, actuando desta forma como um inibidor da mineralização.

Uma possível explicação para os resultados obtidos por Glowacki será de que a

osteocalcina possa actuar em combinação com outras proteínas, que também liguem à

hidroxiapatite, como sinal de remodelação óssea. Diversos estudos in vitro apontam para que a

BGP possa formar um complexo com osteopontina à qual se atribui a função de ligação dos

osteoclastos à superfície da matriz óssea [Reinholt et al. 1990].

Estudos mais recentes, utilizando desta vez ratinhos “knockout” que não possuem o gene

da BGP, vieram comprovar que esta proteína é de facto um regulador negativo da formação

óssea, uma vez que a ausência de BGP provocou um aumento progressivo da massa óssea, sem

aumento significativo do número de osteoblastos e osteoclastos [Boskey et al. 1997a, Ducy

1996, Novak et al. 1997, Wolf 1996].

Regulação

O controlo da regulação desta proteína é complexo e envolve muitos reguladores, quer

positivos quer negativos [Kearns et al. 1997]. Existem já estudos sobre a influência de diversos

factores na regulação positiva ou negativa da expressão da osteocalcina, mas entre os mais

analisados estão a vitamina D3 (1,25-dihidroxivitamina D3), derivados da vitamina A (ácido

retinóico e retinóides), glucocorticóides, AMPc, o factor de transcrição AP1, TGFβ, entre outros.

A vitamina D3 tem uma função muito importante na regulação da homeostase do cálcio no osso,

regulando também a secreção de hormonas e actuando igualmente como um agente de

modulação da função, diferenciação e replicação celular [Guo et al., Morrison et al. 1989].

A primeira vez que a vitamina D3 foi implicada na regulação da síntese da osteocalcina, foi


14

devido à observação do decréscimo dos níveis de osteocalcina em um osso de galinha deficiente

em vitamina D3 [Lian et al. 1982] e mais tarde em ratos, também eles deficientes nesta vitamina

[Lian and Glowacki 1987, Spiess et al. 1986, Wientroub et al. 1987].

O modo de actuação da vitamina D3 em roedores e seres humanos dá-se pela ligação de

um receptor proteico intracelular localizado no núcleo (VRD) à vitamina [Thompson et al.

1997], formando desta forma um complexo capaz de se ligar a um elemento de resposta

localizado na região do promotor do gene da osteocalcina, estimulando a expressão do mesmo

[Kerner et al. 1989, Morrison et al. 1989, Theofan and Price 1989]. Contudo, a acção desta

vitamina parece ser mais complexo, pois outros trabalhos subsequentes vieram indicar que esta

pode actuar também como um regulador negativo da transcrição em osteoblastos de galinhas

[Broess et al. 1995].

De uma forma bastante semelhante à descrita para a vitamina D3, também o ácido

retinóico e os retinóides, regulam positivamente a expressão da osteocalcina. O AMPc é também

um indutor da expressão da proteína, mas provavelmente por um mecanismo distinto dos

referidos anteriormente.

A regulação negativa é observada com glucocorticóides e TGFβ [Banerjee et al. 1996,

Morrison et al. 1989]. A regulação nestes casos é feita ao nível da transcrição, pela existência de

locais de regulação específicos que se sobrepõem a caixa TATA na região do promotor, o que

resulta numa competição entre elementos de transcrição basais e os receptores para a ligação ao

ADN [Meyer et al. 1997, Schule et al. 1990].

Importância clínica

Constatou-se que os níveis de osteocalcina no soro são elevados em pacientes com

desordens que impliquem elevadas taxas de reabsorção óssea. Uma vez que indivíduos, sem este

tipo de desordens, apresentam concentrações de osteocalcina regulares, esta proteína tornou-se

rapidamente um parâmetro de diagnóstico de desordens de regulação óssea, tais como o hiper ou

hipoparatiroidismo, o hipertiroidismo osteoporose, a acromegalia, a doença de Paget, entre

outras [Hauschka et al. 1989, Viegas 1999].


15

MGP (Matriz Gla Proteico)

MGP foi inicialmente isolada de osso e caracterizada por Price e Williamson [Price and

Williamson 1985]. Embora o modo de acção desta proteína ainda não se encontre

completamente estabelecido ao nível molecular, a calcificação de artérias e cartilagens em

animais deficientes nesta proteína, dão-nos uma indicação de que esta poderá actuar como

inibidora dos processos de calcificação. Existem evidências experimentais em ratinhos de que a

MGP é necessária para uma inibição activa dos processos de calcificação ectópica das artérias

[Schinke and Karsenty 2000].

Estrutura

É uma proteína relativamente pequena, com cerca de 12,5 kDa, constituída por apenas

uma única cadeia polipeptidica, com 4 – 5 resíduos Gla, que é estabilizada por uma ponte

persulfureto. Embora possua muitos resíduos hidrofílicos, é excepcionalmente insolúvel em

água[Cancela et al. 1990, Price and Williamson 1985]

Biossíntese

A MGP pode ser encontrada numa grande diversidade de tecidos tais como os pulmões,

rins e coração [Fraser and Price 1988, Hale et al. 1988]. No entanto, apenas na cartilagem e o

tecido ósseo se verificam uma acumulação significativa desta proteína [Hale et al. 1988, Price

1988].

A MGP no soro sanguíneo encontra-se em concentrações elevadas; no entanto,

verificou-se ser um pouco mais pequena que a extraída de matriz óssea. A MGP do soro não

possui a região N-terminal existente na matriz óssea, se considerando por isso, ser esta a zona

responsável pela ligação da proteína à matriz. Como esta região N-terminal é fosforilada, um dos

mecanismos propostos para a sua libertação na corrente sanguínea seria a clivagem proteolitica

[Price 1988].


16

Função

A partir de experiências que verificaram que descendentes de ratinhos tratados durante o

seu desenvolvimento embrionário com warfarina possuíam uma ossificação prematura da

cartilagem, assumiu-se que a MGP teria um papel de inibição da calcificação [Price et al. 1982].

Em experiências in vivo, de “knockout” do gene da MGP em ratinhos, verificou-se que

estes morriam passados apenas 2 meses após o nascimento, devido à calcificação das artérias. Na

área e nas artérias calcificadas, era possível observar uma matriz cartilagínea muito semelhante à

observada nos ossos [Luo et al. 1997]. Estes resultados apontam para que se não existir uma

inibição activa da mineralização dos tecidos moles, estes tenham a tendência para mineralizarem

de forma espontânea.

Além do seu papel de inibição da mineralização, a MGP também aparenta possuir uma

função de controlo da qualidade do mineral produzido no osso, uma vez que os ratinhos

"knockout" também apresentaram uma calcificação anormal das diversas cartilagens, o que

resultava em uma baixa estatura e fragilidade dos ossos, que facilmente fracturavam.

Recentemente, a MGP foi também implicada na regulação da ossificação e maturação de

condrócitos de galinhas [Yagami et al. 1999].

Regulação

Existem já diversos estudos sobre a regulação da expressão desta proteína. Estudos

in vitro demonstraram que o ácido retinóico aumenta a expressão da MGP em algumas linhas

celulares, tais como fibroblastos, condrócitos e osteoblastos [Cancela and Price 1992]. O efeito

estimulante sobre a expressão parece estar relacionado com a existência de elementos de resposta

ao ácido retinóico no promotor da MGP. Contudo, existem estudos em que se verificou um

controlo negativo do ácido retinóico à expressão da MGP em diferentes células, sendo esta

repressão do gene provavelmente o resultado de uma competição entre o complexo de recepção

de ácido retinóico e o factor de transcrição EBPβ para a ligação numa parte de sequência comum

do promotor [Kirfel et al. 1997, Romberg et al. 1986].

Um outro factor de regulação da MGP é a 1,25-dihidroxivitamina D3. Esta hormona

derivada da vitamina D aumenta a expressão da MGP em diversos tipos celulares tais como

culturas primárias de condrócitos e osteoblastos [Barone et al. 1991, Cancela and Price 1992,

Fraser and Price 1990] mas aparentemente não produz qualquer alteração de expressão em


17

fibroblastos, condrócitos e osteoblastos humanos, apenas se verificando uma atenuação da

estimulação causada pelo ácido retinóico. O mecanismo pelo qual se dá este processo de

atenuação poderá ser a formação de heterodímeros entre os receptores de ácido retinóico e

vitamina D, que diminuem a quantidade de receptores disponíveis para ligação do ácido

retinóico. A existência destes heterodimeros já foi comprovada utilizando o promotor da BGP

[Shule et al. 1990]

Existem ainda outros factores de regulação, tais como o TGFβ, que aumenta a expressão

da MGP em culturas de células derivadas de pulmão [Zhao and Warburton 1997]. Verificou-se

também que a expressão do colagénio tipo I parece também estar directamente relacionada com

a expressão de MGP [Barone et al. 1991, Barone et al. 1994].

Importância clínica

Munroe e colegas puderam, recentemente demonstrar que certas mutações do gene da

MGP estavam relacionadas com o sindroma de Keutel [Munroe et al. 1999]. Comparando os

sintomas desta doença com os sintomas observados para o "knockout" de ratinhos, verificaram-

se algumas semelhanças, tais como a calcificação anormal das cartilagens, sobretudo nos

ouvidos, nariz e vias respiratórias. No entanto, não se verificaram quaisquer problemas com

fracturas, osteoporose ou baixa estatura, o que não exclui a possibilidade de que existam outros

mecanismos e outras proteínas envolvidas no processo de calcificação extracelular da matriz nos

diferentes órgãos de diferentes espécies.

1.2. Formação de mineral em culturas celulares

As culturas de células fornecem um importante meio para o estudo de importantes

processos e eventos que ocorrem à escala molecular, tais como o controlo da actividade dos

genes, replicação celular, formação de organelos, expressão proteica e diferenciação celular.

Os osteoblastos in vitro sintetizam a matriz extracelular que mineraliza na presença de

uma fonte de fosfato exógena. Este tipo de culturas celulares têm sido usadas para determinar os

mecanismos de mineralização, e têm focado o interesse sobretudo no padrão de expressão das

proteínas da matriz extracelular. No entanto apenas alguns destes estudos demonstraram que o

mineral formado possui hidroxiapatite semelhante à encontrada nos ossos [Murray 1999].


18

Figura 10 – Sparus aurata (dourada)

1.3. Caracterização da espécie em estudo: Sparus aurata

1.3.1. Posição sistemática

Segundo Long, a dourada, possui a seguinte posição sistemática:

Super-classe Pisces

Classe Osteichtyes

Subclasse Actinopterygii

Divisão Teleostei

Subdivisão Euteleostei

Série Percomorpha

Ordem Perciformes

Subordem Percoidea

Família Sparidae

Género Sparus

Espécie Sparus aurata (Linnaeus, 1758)

[Long 1995]

1.3.2. Biologia e ecologia da espécie

A dourada é um membro da família Sparidae e pode ser encontrada tanto no mediterrâneo

como no mar negro, estendendo-se no oceano atlântico desde as ilhas britânicas até ao

arquipélago de Cabo Verde e sul do Senegal. A importância comercial da espécie Sparus aurata

(dourada), está bem patente pelo facto de 7% da pesca anual dentro desta família são membros

desta espécie [Stickney 2000].

A dourada é um peixe normalmente associado a águas litorais, especialmente com fundos

arenosos, possuindo uma elevada tolerância a parâmetros ambientais, possuindo limites de

temperatura entre os 5 e 35ºC e de salinidade entre os 5 e 50‰, e um mínimo teor de oxigénio

dissolvido com cerca de 2 a 3 mg/l. Assim sendo, a Ria Formosa é um local adequado à espécie,

tendo-se verificado como um local de permanência de juvenis desta [Muzavor et al. 1993].


19

O facto de possuir um elevado valor comercial aliado a altas taxas de crescimento confere

a esta espécie um lugar de destaque na piscicultura, sendo deste há bastante tempo explorada

extensivamente nas costas mediterrâneas, sendo actualmente uma das principais espécies de

cultura intensiva, sobretudo em Portugal e Espanha.

1.3.3. Introdução ao problema com a Sparus aurata

Nos últimos anos tem se verificado um grande número de anormalidades ósseas nesta

espécie quando crescem em meios fechados, o que tem causado um impacto negativo no

mercado da aquacultura, uma vez que a sua mortalidade tem vindo a aumentar como

consequência destes defeitos esqueléticos [Faustino and Power 1999]. Assim, diversos estudos

têm sido conduzidos, com o intuito de elucidar o metabolismo ósseo desta espécie e desta forma

tentar compreender e minimizar o impacto comercial que os defeitos esqueléticos observados

têm causado.

1.4. Trabalhos preliminares

Numa tentativa de elucidar o metabolismo das cartilagens e dos ossos em Sparus aurata,

diversos estudos foram realizados, entre os quais se incluem a clonagem do ADNc de BGP e

MGP, e o desenvolvimento de anticorpos específicos para os mesmos. No entanto, o estudo dos

promotores dos genes assim como a regulação da sua expressão não têm sido possíveis, devido à

falta de um sistema celular in vitro capaz de exprimir de forma estável proteínas específicas de

osso. Com esse propósito, foram criadas duas linhas celulares, derivadas de vértebra de Sparus

aurata (VSa13 e VSa16), ambas capazes de mineralizar in vitro, e que exprimem as proteínas

BGP e MGP de forma mutuamente exclusiva.

Em mineralização, a linha VSa16 exprime BGP e a linha VSa13, que em condições

controlo exprime MGP e em mineralização essa expressão é reduzida. Estas células possuem um

tempo de duplicação de cerca de 36 horas e são capazes de mineralizar a sua matriz extracelular

em 10 mM β-glicerofosfato, 50 µg/ml de vitamina C e 4 mM cálcio. Por difracção de raio-X, foi

possível determinar que a matriz mineralizada destas células apresenta um padrão consistente

com o padrão exibido pela hidroxiapatite [Pombinho et al. 2003].


20

1.5. Objectivo

O objectivo deste trabalho foi investigar a capacidade destas linhas celulares (VSa13 e

VSa16) na indução da mineralização da matriz, na presença ou ausência de diversos factores tais

como levamisole e warfarina.

Outro dos objectivos foi o da criação de uma linha celular, derivada de VSa13, capaz de

expressão constitutiva da proteína BGP e estudar o efeito da sua sobreexpressão na

mineralização da matriz extracelular.

Universidade do Algarve Materiais e Métodos

21

2. Materiais e Métodos

2.1. Materiais

O meio de cultura celular D-MEM (Dulbecco’s modified Eagle medium), o FBS (soro de

feto de bovino), antibióticos (penicilina e estreptomicina), antimicoticos (fungizona), solução 1x

tripsina-EDTA e L-glutamina, foram adquiridor a Life Technologies. As placas de cultura foram

compradas à empresa Sarstedt e a solução stock de Giemsa bem como a solução de xileno foram

provenientes da Merck Farma e Química. Todos os restantes reagentes foram adquiridos à

Sigma-Aldrich Química. As células de E. coli usadas são da estirpe DH5α [Sambrook et al.

1989] e as linhas celulares derivadas de osso de Sparus aurata foram desenvolvidas por

Pombinho A. e Laizé V. [Pombinho et al. 2003]. A composição de meios, e outras soluções

utilizadas podem ser encontradas no anexo 7.1.

2.2. Métodos

2.2.1. Manutenção bactérias e culturas celulares

i. Escherichia coli

A estirpe usada neste estudo é a DH5α e o meio de cultura usado é Luria-Bertani (LB).

A selecção de clones transformantes com resistência a ampicilina é efectuada no mesmo

tipo de meio mas com adição de 50 mg/ml ampicilina.

As culturas celulares foram incubadas a 37ºC, sendo as culturas em meio líquido agitadas

em agitador rotativo a 200 rpm.


22

ii. Sparus aurata

É essencial a qualquer experiência envolvendo culturas celulares, manusear células em

condições de completa esterilidade, para isso é utilizada uma câmara de fluxo laminar (Braun

Vertical BBV4). Este tipo de aparelho mantém um fluxo constante de ar estéril na zona aberta da

câmara, impedindo a sua contaminação.

Antes de qualquer utilização é necessário assegurar-se que todo o material utilizado se

encontra em condições de esterilidade, que a câmara se encontra limpa e devendo-se sempre

limpar com álcool (70%) tanto a superfície de trabalho como as próprias mãos. Deve-se também

garantir a esterilidade do meio mantendo uma chama acesa. Todos os meios preparados com

recurso a soluções não estéreis devem ser filtrados com filtro de 0,2 µm antes de serem

utilizados.

Meio de cultura

As culturas celulares, requerem um meio de crescimento complexo, que tem de possuir

todos os aminoácidos essenciais, antibióticos e antimicoticos para prevenir contaminações, sais,

glucose e diversos factores de crescimento. O meio de cultura utilizado para estas células foi o

D-MEM, suplementado com 10% de FBS. Foi-lhe adicionado L-glutamina, (aminoácido

essencial mas que por ser muito instável, não vem na constituição base do meio D-MEM), uma

mistura de penicilina e estreptomicina (antibióticos), e fungisona (antimicótico), todos à

concentração de 1%. Este meio foi substituído a cada 3 dias nas placas de cultura.

Propagação e contagem de células

Sobre condições normais de crescimento, as células em condições de cultura de 33ºC em

atmosfera humidificada e controlada com 10% CO2, dividem-se até não existir mais espaço para

a sua multiplicação, formando uma monocamada contínua de células (condição de confluência

celular). Nestas condições o crescimento cessa, excepto se as amostras forem destacadas da placa

(por acção de tripsina), diluídas e transferidas para novas placas com meio fresco. As células

quando em condições de confluência celular, foram tripsinizadas e replaqueadas na razão de 1:2,

tendo sido utilizadas células entre as passagens 28 e 74.

O processo de passagem é feito pela remoção do meio de cultura por aspiração. De

seguida lavam-se as células com 10 ml de um tampão fosfato (PBS) e adiciona-se 1 ml de


23

solução de tripsina-EDTA de modo a cobrir completamente a superfície. Retira-se o excesso de

solução de tripsina-EDTA e deixa-se actuar durante cerca de 3 min. de forma a destacar as

células, que de seguida se ressuspendem em 10 ml de meio, de forma a parar a acção da tripsina.

Diluem-se então na razão 1:2 e transferem-se para 2 placas perfazendo o volume de 10 ml em

cada uma. Os volumes indicados foram utilizados em placas de 100 mm, sendo necessário

reajustar os volumes para placas mais pequenas.

Sempre que foi necessário a contagem de células para a deposição de quantidades exactas

foi usado um hemacitómetro (Neubaeur, Brand) segundo procedimento descrito por Spector

[Spector et al. 1998].

Criopreservação

Para criopreservação, as células são removidas da placa por tripsinização e suspendidas

em novo meio de cultura frio (4ªC) contendo 10% de DMSO. Este químico impede o

rebentamento da membrana celular a baixas temperaturas. De seguida, transferem-se para

criotubos de 1,8 ml (Nunc, Lisboa, Portugal) que são congelados a -80ºC durante a noite num

contentor de congelamento Cryo C1 (Nalgene, Rotherwas Hereford, Reino Unido) com

decréscimo de temperatura de -1ºC/min. Por fim os criotubos são transferidos para azoto líquido,

para um armazenamento a longo prazo.

Para recuperar as células criopreservadas, deve-se coloca-las directamente num banho a

temperatura ambiente e transferi-las em seguida para placas contendo meio de cultura, após o seu

descongelamento. Quando as células se encontram aderentes ao prato, o meio de cultura é

substituído de forma a eliminar todos os vestígios de DMSO provenientes do meio de

criopreservação, uma vez que este é tóxico e pode matar as células à temperatura ambiente.

2.2.2. Determinação de cariótipo de células em cultura

Para a determinação do cariótipo das células em cultura, utilizou-se um método

desenvolvido para a caracterização de linhas celulares de peixe.

As células VSa13 e VSa16 nas passagens 30 e 28, respectivamente, são incubadas com

0,0025% de colchicina durante 2 h a 33ºC. A colchicina pára a mitose celular, ao impedir a

formação das redes de microtubulos que formam o fuso acromático.

De seguida, retira-se o meio celular e lavam-se as células com 10 ml de PBS.

Tripsinizam-se, depositam-se por centrifugação a 2000 g durante cerca de 5 min. e retira-se o


24

sobrenadante. Dá-se um choque osmótico, ressuspendo-as em 2 ml de solução de 0,4% de

cloreto de potássio (KCl), que coloca as células em turgescência e que facilita o seu posterior

rebentamento. De seguida, incuba-se a suspensão durante 30 min. à temperatura ambiente, findos

os quais se torna a depositar as células por centrifugação durante 5 min. à 2000 g. Remove-se

então o sobrenadante e ressuspende-se as células depositadas em solução Carnoy (solução

fixativa das células – metanol 100% e acido acético glacial na razão de 1:3) deixando-se incubar

durante 15 min. Repete-se este passo 4 vezes e por fim ressuspende-se na solução fixante (750 µl

por cada prato de 100 mm tripsinizado).

A suspensão celular é então deixada cair de 60 cm de altura sobre lâminas geladas

(-20ºC). Este processo origina o rompimento da membrana celular separando os cromossomas.

Deixa-se secar estas preparações durante a noite a temperatura ambiente. No dia seguinte,

coram-se as preparações mergulhando-as numa diluição de 1:20 de uma solução stock de Giemsa

durante 30 min. e em seguida lavam-se bem com água destilada. Deixa-se secar a lâmina e em

seguida, mergulha-se em xileno durante 10 min. Por fim, aplica-se algumas gotas de DPX

(BDH) e coloca-se a lamela no topo, tendo o cuidado de remover o máximo de bolhas de ar da

preparação.

Por fim, os cromossomas em metafase podem ser observados e contados ao microscópio

óptico Olympus BX41, com objectiva 100X. As imagens obtidas foram capturadas com uma

câmara digital CCD Olympus C-3030.

2.2.3. Quantificação proteica total

i. Método de Bradford

Este método de quantificação proteica, desenvolvido por Bradford em 1976 [Bradford

1976], baseia-se na proporcionalidade entre a cor azul do corante “Coomassie Brilliant Blue G-

250” e a sua ligação às proteínas existentes, verificando-se um máximo de absorção a 595 nm.

Por outras palavras, a ligação do corante à proteína em solução ácida faz com que este o pico de

absorção passe de 450 nm para 595 nm. As principais vantagens deste método são a rapidez,

simplicidade e o pequeno número de substâncias interferentes, permitindo uma detecção num

grande intervalo de concentrações (de 10 a 5000 µg/ml de proteína).


25

O corante utilizado foi o reagente comercial disponibilizado pela Pierce (Pierce

Coomassie Plus Protein Assay) e a absorvância foi lida a 595 nm no espectrofotómetro Unicam-

Helios3.

A curva de calibração com BSA, obtida para este reagente, encontra-se em anexo (anexo

7.2).

ii. Método de BCA

Este método de quantificação proteica opcional foi utilizado nos casos de amostras

contendo Triton X-100, uma vez que esta substância interfere com o processo de quantificação

proteica de Bradford.

Este método combina a conhecida reacção do biureto com uma reacção calorimétrica

altamente sensitiva e selectiva de detecção de Cu+1 (formado da reacção de redução do biureto)

utilizando o reagente BCA. O produto de reacção, de cor púrpura, forma-se pela ligação de duas

moléculas de BCA a um ião de Cu+1. Este complexo solúvel em água possui um pico de

absorvância a 562 nm, linear numa gama concentrações de 20 µg/ml a 2000 µg/ml. A curva de

calibração, com BSA encontra-se em anexo na secção 7.2. O kit utilizado baseado neste método

foi o “BCA Kit” (Pierce chemicals) e o procedimento utilizado foi o recomendado pela marca.

2.2.4. Determinação da actividade da fosfatase alcalina

Para a análise da actividade desta enzima, existem já kits comerciais que tornam todo o

processo mais simples. Estes kits baseiam-se na degradação de p-nitrofenol que ao ser clivado

pela fosfatase alcalina, forma um produto com pico de absorção a 410 nm. Desta forma, medindo

a concentração do produto formado num intervalo de tempo regular e normalizando os valores

com a concentração de proteína de cada amostra, é possível determinar a actividade da fosfatase

alcalina. A tabela com a curva de calibração para a degradação de p-nitrofenol encontra-se em

anexo, na secção 7.2.

Para a obtenção das amostras proteicas em placas de 6 poços, retiram-se todo o meio dos

poços e lavam-se as células duas vezes com PBS. Todos os vestígios de PBS são retirados e

adiciona-se 350 µl de solução de 1% de Triton X-100. Raspam-se cuidadosamente as células e

por fim transfere-se o homogenato para tubos eppendorf.


26

As amostras são então analisadas segundo procedimento descrito pelo kit Sigma

(procedimento nº 104) e os valores são normalizados pela quantificação da proteína existente,

utilizando o kit BCA da Pierce (ver secção 2.2.3.ii.)

2.2.5. Detecção de nódulos mineralizados por método de coloração de

von Kossa

Esta técnica foi desenvolvida inicialmente por von Kossa em 1901 e baseia-se na

detecção de nódulos mineralizados pela coloração dos mesmos com nitrato de prata, que desta

forma ficam escuros e facilmente detectáveis no microscópio [von Kossa 1901].

Para esta coloração, retira-se todo o meio das placas de células, lava-se três vezes com

2 ml de PBS e retira-se todos os vestígios do mesmo. Adiciona-se 2 ml de uma solução de

formaldeído 10% em PBS para fixar as células e incuba-se a placa a temperatura ambiente por

uma hora com agitação continua. Retira-se novamente todo o meio e lava-se três vezes, mas

desta vez com água purificada (MilliQ). De seguida, retira-se a água e adiciona-se 1 ml de

solução de nitrato de prata (5% AgNO3 em água). Incuba-se durante 30 min. sobre luz u.v. e por

fim observa-se a coloração e fotografam-se os nódulos.

Os níveis de mineralização relativa de culturas tratadas com levamisole e warfarina foram

determinados por coloração de von Kossa, seguida de análise densiométrica por software

Quantity One 4.2.1 (BioRad). A obtenção da imagem foi feita pelo aparelho Geldoc (BioRad).

2.2.6. Quantificação de cálcio

Também foi analisada a quantidade de cálcio acumulada na matriz extracelular nas

diferentes experiências de mineralização efectuadas, sendo o procedimento base o seguinte:

Em primeiro lugar rasparam-se os poços com 0,75 ml de HCl 0,1 M com o auxílio de um

raspador e transferiu-se para eppendorfs, que se colocaram em agitação durante 4 horas à 4ºC.

De seguida, liofilizaram-se as amostras durante a noite e ressuspenderam-se em 0,1 M HCl,

seguido de vortex durante 15 – 20 min. Por fim, analisou-se a concentração de cálcio por kit

Sigma, através de absorção a 575 nm, segundo o protocolo recomendado (protocolo nº 587).


27

2.2.7. Curva de resistência à geneticina em VSa13 e VSa16

A geneticina é um aminoglicosideo tóxico, quer para células procariótas quer eucariótas,

e é usado por isso como agente de selecção em experiências de genética molecular. No entanto,

para permitir seleccionar células transfectadas resistentes à geneticina, devido à incorporação do

gene de resistência à geneticina presente nos plasmídeos, há que determinar a concentração

mínima de geneticina para a qual se obtém 100% de morte de células não transfectadas. Desta

forma, podemos assegurar-nos de que a pressão selectiva exercida por este agente é eficaz.

Para a determinação da quantidade de geneticina a aplicar para se obter uma elevada

selectividade com o mínimo de perda de células transformadas, há que primeiramente realizar

um ensaio, submetendo as duas linhas celulares a um intervalo de concentrações de geneticina

(G418) para deste modo apurar qual a concentração mínima em que todas as células morrem.

Assim, colocaram-se em placas de 6 poços, células de cada uma das linhas celulares,

expostas a diferentes concentrações de G418 (0,05; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60; 0,75 e 0,90 mg/ml)

durante 2 semanas, obtendo uma amostragem para cada semana.

Os meios contendo diferentes concentrações de geneticina foram preparados a partir de

uma solução stock de 180 mg/ml de G418 e esterilizadas com filtro de 0,2 µm. Os meios foram

sendo substituídos de dois em dois dias e no final de cada semana lavou-se um dos conjuntos de

placas com PBS, retirou-se o excesso, adicionou-se 0,5 ml de água e congelou-se a -80ºC para

ser analisado o seu teor proteico.

A quantidade de proteína nos poços é directamente proporcional à percentagem de

células vivas. Assim sendo, determinando a quantidade proteica nos diversos poços é possível

determinar a viabilidade celular em cada concentração de G418.

Para determinarmos a quantidade de proteína presente em cada poço, descongela-se as

placas previamente colocadas a -80ºC à temperatura ambiente e raspa-se o poço e transfere-se a

solução para tubos eppendorf. Lava-se o poço com 500 µl de água, que também se transfere para

o tubo de eppendorf. Liofilizam-se então as amostras e ressuspende-se o extracto seco em 75 µl

de água ultrapurificada.

Por fim analisa-se a concentração proteína pelo método de Bradford (ver secção 2.2.3.i)


28

2.2.8. Transfecção por co-precipitação de ADN com fosfato de cálcio

O método de transfecção com fosfato de cálcio foi utilizado pela primeira vez em 1973

para introduzir o ADN de adenovirus em células de mamíferos [Graham and Eb 1973].

O princípio desta técnica envolve a mistura de ADN com uma solução tampão de fósforo

com cloreto de cálcio. O complexo resultante de ADN-cálcio-fosfato adere à membrana celular e

é introduzido no citoplasma por endocitose.

As principais vantagens deste método de transfecção são o seu baixo custo, relativa

simplicidade e fácil manuseamento. Além disso, é uma das técnicas mais adequadas para

transfecções estáveis (como incorporação do ADN nos cromossomas do hospedeiro). A sua

principal desvantagem é a sua fraca reprodutibilidade, devido sobretudo às variações verificadas

no tamanho e estrutura do complexo de ADN formado. Uma outra desvantagem deste método é

a resistência encontrada em certos tipos de células (sobretudo células primárias) à entrada deste

tipo de complexos.

Este procedimento de transfecção encontra-se descrito em diversas fontes e envolve a

mistura de uma solução tampão salina/fosfato (BES 2X) e cálcio (CaCl2) ao ADN e incubação a

T.A. O complexo formado é então disperso sobre as células em cultura num estado de

confluência entre 60 e 80% [Sambrook et al. 1989].

Para controlo positivo da transfecção nestas células foi efectuado o ensaio da

β-galactosidase utilizando o vector pβGAL (Invitrogen) que expressa o vector Lac-Z. Assim, as

células transfectadas com este vector podem ser detectadas devido à expressão do produto de

degradação do X-gal por parte da β-galactosidase, que apresenta uma cor azul (Figura 11).

Neste ensaio, 48 horas após a transfecção, as células foram fixadas em 0,5%

gluteraldeido e incubadas durante cerca de 20 h numa solução contendo X-gal (1 mg/ml), e

ferricianida de potássio.

O produto da degradação do X-gal, quando liberto pela acção da β-galactosidase, oxida e

emparelha-se dando origem a um derivado de cor índigo insolúvel. A ferricianida catalisa essa

reacção de oxidação e previne que esse composto sofra um novo passo de oxidação para um

composto incolor [Adams et al. 1981].


29

Figura 11 – Esquema do ensaio da β-Galactosidase. O ADN transfectado exprime o ARN que codifica para a β-galactosidase. Esta proteína degrada X-gal originando um composto insolúvel de cor índigo (azul) que pode ser detectado no microscópio. Em baixo pode-se observar células a expressar X-gal (adaptado de Transfection guide – Promega)

2.2.9. Análise de proteínas

i. Obtenção das proteínas secretadas pelas células

Para a determinação das proteínas secretadas pelas células, deixaram-se crescer em meio

D-MEM com 10% de FBS até atingirem estado de confluência. Neste ponto, as células foram

lavadas com PBS e o meio foi substituído por um meio sem FBS (soro), de forma a eliminar a

contaminação da nossa amostra com proteínas presentes no soro bovino. Após 12 horas,

tornou-se a lavar as células e substituir o meio por um meio sem soro. Após 3 dias, recolheu-se o

meio, que foi de seguida limpo de células por centrifugação a 2000 g durante 5 min. a T.A..

O meio obtido foi então dialisado com uma membrana de diálise Spectrapor 3 (Spectrum

Medical Industries) a 4ºC durante 3 dias em água MilliQ, substituindo o banho duas vezes por

dia.

Em seguida quantificou-se a proteína presente pelo método de Bradford (ver secção

2.2.3.i). Liofilizou-se e resolubilizou-se a amostra em água.


30

ii. Electroforese de SDS-PAGE

A electroforese em géis de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) é um

método muito utilizado para análise de misturas proteicas. Este método baseia-se na separação

das proteínas segundo o seu tamanho, sendo por isso também utilizado para determinar a massa

molecular das proteínas.

As misturas proteicas submetidas a uma electroforese de SDS-PAGE, são desnaturadas

por calor na presença de um tampão que contém um detergente aniónico (SDS) e um agente

reductor como por exemplo β-mercaptoetanol. Este agente reduz as pontes persulfureto e o SDS

liga-se fortemente aos resíduos, criando uma carga homogénea em redor da proteína. Assim, as

cargas negativas do SDS impedem o “re-folding” da proteína à sua conformação original, uma

vez que as cargas negativas se repelem quando uma região da proteína se aproxima de outra.

10 µl de mistura proteica numa concentração final de 1,56 µg/µl foi solubilizada em

tampão amostra de SDS-PAGE [Laemli 1970] e separada em gel de poliacrilamida 4-12%

(Invitrogen).

2.2.10. Transformação em E. coli

Células que adquirem qualquer informação genética exógena dizem-se transformadas. O

processo de transformação consiste na inserção de ADN exógeno no interior das células,

geralmente sobre a forma de plasmídeos, que se irão depois replicar conjuntamente com o ADN

endógeno, segundo os ciclos de multiplicação normais das bactérias originando desta forma

colónias de bactérias contendo muitos biliões de cópias do ADN exógeno. As bactérias contendo

o ADN de interesse, podem ser identificadas por meio de crescimento selectivo, devido a

obtenção de resistência a agentes letais criadas pelas características do plasmídeo incorporado na

célula.

Existem diversos processos de transformação, mas um dos mais usuais e eficientes,

utilizados geralmente em E. coli, é o processo de transformação por choque térmico, que tal

como o nome indica consiste em submeter as bactérias a um choque térmico durante um curto

período de tempo, que faz com que o ADN plasmídico seja incorporado pela formação

momentânea de poros nas membranas de bactérias de E. coli competentes.

Para a realização desta transformação, descongela-se rapidamente o tubo com 200 µl de

células de E. coli, estirpe DH5α competentes (células competentes segundo método descrito em


31

Sambrook et al, 1989) e adiciona-se o ADN a transformar incubando o tubo durante 30 min. em

gelo, com ocasional mistura por agitação suave. O choque térmico é obtido ao transferir-se as

bactérias para um banho a 42ºC durante 45 s. De seguida, transferem-se as bactérias novamente

para o gelo e deixa-se incubar durante 5 min. Adiciona-se 0,8 ml de meio SOC e incuba-se a

37ºC durante uma hora com agitação contínua e vigorosa. Por fim, plaqueam-se em placas de LB

contendo 50 µg/ml ampicilina, de forma a eliminar o crescimento das células não transformadas.

2.2.11. Preparação e purificação de ADN

i. Mini-preparação de ADN plasmídico

Para a obtenção de ADN plasmídico purificado apenas para análise rotineira dos clones

obtidos, é possível a utilização de métodos relativamente simples e económicos, normalmente

designados de “miniprep”. O processo utilizado baseia-se na lise alcalina das células e encontra-

se descrito nos manuais de protocolos para biologia molecular [Sambrook et al. 1989].

O precipitado de ADN resultante foi ressuspendido em 50 µl de água estéril bi-destilada

ii. Maxi-preparação de ADN plasmídico

Para experiências de clonagem ou de transfecção, os métodos simples de purificação de

ADN já não são adequados, por se necessitar de amostras purificadas em grandes quantidades,

sendo por isso necessário recorrer a métodos mais elaborados. Para isso, foram desenvolvidas

técnicas às quais se denominou “maxipreps”, que baseiam-se também na lise alcalina. O

procedimento utilizado foi o seguinte:

Inoculou-se 50 ml de meio LB contendo 50 µg/ml de ampicilina com uma cultura de 2 ml

iniciada a partir de uma colónia de E. coli contendo o plasmídeo de interesse, e deixou-se crescer

durante a noite a 37ºC com agitação. Sedimentou-se as células submetendo-as a centrifugação a

5500 g a 4ºC durante 10 min.

Removeu-se o sobrenadante e adicionou-se 5 ml de GTE. Agitou-se no vortex e

incubou-se durante 5 min a 4ºC. Adicionou-se 10 ml de NaOH/SDS, misturou-se por inversão e

voltou a incubar-se durante 5 min a 4ºC. Adicionou-se 8 ml de solução de acetato de potássio,

misturou-se novamente por inversão e incubou-se durante 5 min a 4ºC. Tornou-se a centrifugar

desta vez durante 15 min a 15000 g e 4ºC.


32

Transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo ao qual se adicionou 14 ml isopropanol

de forma a precipitar o ADN. Misturou-se novamente por inversão e incubou-se durante 5 min a

temperatura ambiente. Tornou-se a repetir o passo anterior de centrifugação, removeu-se o

sobrenadante, ressuspendeu-se o precipitado em 1 ml de TE e adicionou-se 5 µl de RNase A

(10 mg/ml) para degradar o ARN presente na amostra. Deixou-se em incubação a 37ºC até o

pellet dissolver e transferiu-se a solução para um novo tubo ao qual se adicionou 5 µl de

proteinase K, para degradar as proteínas existentes na amostra. Voltou-se a incubar a 37ºC

durante 15 min, extraiu-se o ADN plasmídico com PCI e CIAA (ver em anexo, secção 7.1) e

centrifugou-se a 6000 g durante 5 min. De seguida transferiu-se a fase superior para um novo

tubo (a proteína degradada fica na interface entre as duas fases) e ajustou-se o volume com 1 ml

TE.

Para remover da amostra os pequenos fragmentos de ADN e ARN contaminantes,

procedeu-se a um passe de lavagem com 570 µl de PEG/NaCl e incubou-se durante 15 min a

4ºC. Por fim, centrifugou-se a 20000 g durante 15 min a 4ºC, descartou-se o sobrenadante e

lavou-se o pellet com 750 µl de etanol 70%. Deixou-se secar e ressuspendeu-se o ADN

plasmídico purificado em 400 µl de TE.

2.2.12. Extracção e purificação e quantificação de ADN de gel de agarose

Para a extracção e/ou purificação de fragmentos de ADN contidos em géis de agarose

utilizou-se o kit “ConcertTM Hight Purity Plasmid Gel Extraction System” (Life Technologies)

que se baseia na fusão da agarose, fixação do ADN a uma resina, lavagem e finalmente a sua

eluição em água ou TE.

É uma técnica importante, por exemplo, para assegurar a pureza necessária de um

fragmento de ADN para posterior ligação a um plasmídeo.

A purificação em coluna de soluções de ADN foi obtida por Wizard™ PCR preps – DNA

purification system” da Promega.

No final das purificação do ADN, a sua concentração foi estimada pela absorvância a

260 nm em que 1unidade de densidade óptica corresponde a uma concentração de 50 µg/ml de

ADN


33

2.2.13. Electroforese de ADN em géis de agarose

A electroforese é uma técnica de separação que se

baseia na diferença de velocidade de migração dos

componentes quando submetidos a um campo eléctrico. O

ADN, que a pH neutro se encontra carregado

negativamente, quando submetido a esse campo eléctrico

migra em direcção ao ânodo.

A agarose é um polímero linear, extraído de algas.

Os géis formados por este polímero são obtidos pela sua

dissolução em água por aquecimento e posterior

solidificação. A densidade destes géis varia consoante a

concentração de agarose (Figura 12). O ADN ao passar por estes géis em direcção ao ânodo

sofre resistência, pelo que a migração dos fragmentos de menor dimensão é mais rápida, sendo

essa velocidade determinada pela densidade da matriz do gel, pela voltagem aplicada, pela

composição química dos fragmentos (percentagem de cada base azotada) e pela composição do

tampão.[Sambrook et al. 1989].

Para a análise do ADN separado adiciona-se brometo de etidio, que se intercala entre as

duas cadeias tornando-se visível quando submetido a luz u.v..

Neste trabalho, foram usadas diferentes concentrações de agarose (entre 1 e 4%),

conforme o tamanho do fragmento de interesse. O tampão utilizado foi TAE 1X e a concentração

de brometo de etidio utilizada foi de 5 µg/ml. Adicionou-se corante a solução de ADN de forma

a tornar visível a frente de migração e facilitar a carregamento dos poços no gel. Os marcadores

usados foram os adquiridos à GibcoBRL e utilizaram-se em cada caso, os marcadores mais

adequados à análise do tamanho dos fragmentos esperados.

2.2.14. Digestão e ligação de ADN

Para as diferentes manipulações de plasmídeos, é necessário cortá-lo em determinados

locais específicos. Para isso utilizam-se enzimas de restrição que reconhecem e cortam

sequências específicas de ADN.

As digestões de ADN realizadas utilizaram diversas enzimas de restrição na concentração

de 2 u/µl a 37ºC durante cerca de 1 h.

Figura 12 – Estrutura molecular da agarose. Quando solidificada, a agarose possui uma conformação helicoidal, formando uma densa matriz porosa.

(adaptado de: http://www.cermav.cnrs.fr/posters_virtuels/milou/agarose_poster/agarose.gif)


34

As ligações de ADN foram efectuadas a T.A. com a enzima “T4 DNA ligase” da Gibco

segundo protocolo da marca. O rácio de plasmidio-insert utilizado foi de 1:3.

2.2.15. Amplificação de ADN por PCR

A técnica de PCR permite a amplificação de fragmentos específicos de ADN, utilizando

um ADN polimerase. Para essa amplificação, a enzima tem que se ligar a um fragmento de ADN

de cadeia, pelo que se torna necessário flanquear o fragmento a amplificar com 2

oligonucleotidos designados de “primers”, em que cada um deles é complementar a uma das

extremidades de cada uma das cadeias do ADN a amplificar (ver Figura 13).

Figura 13 – Esquema representativo dos diversos ciclos de PCR. (1) Desnaturação da cadeia dupla a 96°C. (2) Ligação dos “primers” (“Annealing”). (3) Propagação da cadeia a 72°C (P=Polimerase). (4) Finalização do 1º ciclo. As duas cadeias de ADN obtidas servem como molde para o novo ciclo, desta forma, duplicando a quantidade de ADN em cada novo ciclo

(Adaptado de: www.wikipedia.org/wiki/ Polymerase_chain_reaction)

A realização deste tipo de ciclos com temperaturas elevadas tornou-se mais eficiente com

a introdução de polimerases termoestáveis, que por não se degradarem à temperatura de

desnaturação do ADN, tornaram dispensável a introdução de nova enzima a cada ciclo e tornou a

técnica de PCR um dos métodos mais importantes na biologia molecular devido sobretudo à sua

capacidade de automatização.


35

O ADN polimerase usado foi a Taq ADN polimerase (GibcoBRL) segundo o protocolo

sugerido pela marca e os primers usados encontram-se descritos na seguinte tabela:

Tabela 1 –“Primers” usados nas reacções de PCR

Nome Orientação Sequência Descrição

SaBGP-KpnI-F “Directo” 5’ – GGGGTACC*GATGA

AGACTCTTGGCCTTCC –3’

SaBGP-EcoRI-R “Inverso” 5’ – CGAATTC*TCTAGTA

GGGGATCGGTCCG –3’

Estes primers flaqueiam a ORF da BGP

e inserem uma região de restrição para

uma mais fácil inserção do fragmento

num vector.

* A cor vermelha e azul encontram-se os locais de restrição adicionados GGTACC – KpnI GAATTC – EcoRI. As bases adicionais permitem um corte mais eficiente por parte das enzimas de restrição

As condições padrão usadas nos PCR encontram-se descritas na tabela seguinte:

Tabela 2 – Esquema de ciclos de temperatura utilizados das reacções de PCR.

Nº Ciclos Temperatura Tempo

1 95ºC 120 s

95ºC 45 s

50ºC (Tm) 45 s 30

72ºC 45 s

1 72ºC 600 s

O aparelho de PCR usado foi o “Gene Amp PCR system 2400” da Perkin Elmer e os

resultados foram analisados em géis de agarose, e visualizados num transiluminador de u.v.

2.2.16. Sequenciação de ADN

Embora os ADN polimerase utilizadas nas reacções de PCR sejam “ProofReading”, ou

seja, possuem correcção de possíveis erros no processo de polimerização, para ter-se a certeza de

que os fragmentos clonados não contêm erros, e mesmo para identificar claramente clones com

os fragmentos inseridos na orientação correcta, deve-se muitas vezes de recorrer a reacções de

sequenciação para confirmar a identidade das sequências de ADN.

Independentemente do método utilizado, as reacções de sequenciação, baseiam-se na

separação em gel desnaturante de poliacrilamida de fragmentos de ADN com diferenças de


36

tamanho de apenas uma base azotada. O método mais comum para a obtenção destes fragmentos

é baseado no método de Sanger (também conhecido como método dideoxi) pelo qual se formam

cadeias de todos os tamanhos utilizando di-deoxinucleotidos trifosfato, que quando incorporados

no processo de polimerização dos ADN polimerases impede a continuação do processo de

polimerização. Isto ocorre porque estas bases azotadas modificadas não possuem o grupo 3’-OH

e por isso tornam impossível o estabelecimento das ligações fosfodiester com os nucleótidos

seguintes.

As reacções de sequenciação utilizadas neste trabalho prático utilizaram o Kit “T7

Sequencing Kit” da USB Corp, segundo o protocolo por ele sugerido, que utiliza o método

Sanger (anteriormente explicado).

Os primers utilizados nas sequenciações encontram-se descritos na seguinte tabela.

Tabela 3 – “Primers” utilizados nas reacções de sequenciação.

Nome Orientação Sequência Localização

T7 “Directo” 5’-TAATACGACTCACTATA-3’

SP6 “Inverso” 5´-TTCTATAGTGTCACCTAAAT -3´

Estes 2 primers franqueiam a

região MCS dos plasmideos

pGEM-T-easy, pcDNA3 e

pRC (ver secção 7.3)

Universidade do Algarve Resultados

37

3. Resultados

3.1. Fenótipo das linhas celulares em VSa13 e VSa16

Figura 14 – Imagens microscópicas de contraste de fase de células em confluência celular. A – células VSa13; B – Células VSa16. (A barra representa 300 µm)

Como se pode observar na Figura 14A, as células VSa13 morfologicamente são células

poligonais, apresentando taxas de crescimento elevadas. Atingem condições de confluência em

cerca de 3 dias e formam uma monocamada celular homogénea.

As células VSa16 (Figura 14B) apresentam uma morfologia um pouco diferente das

VSa13, sendo um pouco mais alongadas possuindo uma disposição menos organizada, existindo

em algumas regiões a sobreposição de células em camadas. Possuem ainda um crescimento mais

acelerado que as VSa13 atingindo um estado de confluência celular em cerca de 2 dias.

BA


38

3.2. Caracterização do cariótipo das linhas celulares

Como se pode observar na Figura 15,

podemos verificar que o método usado permitiu a

separação dos cromossomas em metáfase, de

forma a poderem ser contados. No entanto, em

algumas imagens obtidas, existiu regiões de

alguma sobreposição dos cromossomas pelo que

se tornou por vezes difícil distinguir exactamente

o número de cromossomas numa dada região.

3.2.1. Cariótipo da linha VSa13

0

2

4

6

8

10

12

14

16

37 42 47 52 57 62 67 72 77 82 87 92 97 102

107

112

117

122

127

132

137

Nº Cromossomas

Nº C

onta

gens

18%

VSa13N = 82

Figura 16 – Gráfico do número de amostras contadas em função do nº de cromossomas para as células da linha celular VSa13 com 30 passagens. A branca representa o número tetraplóide para a espécie Sparus aurata (96). N= número de metáfases contadas. A percentagem representa [(nº de amostras com o nº tetraplóide)/N]

Figura 15 - Imagem de cromossomas em metáfase de células VSa13, corados com Giemsa (Ampliação 200X)


39

Como se pode observar na Figura 16, existe um máximo de contagens de 18% para

96 cromossomas, que corresponde ao número tetraplóide de Sparus aurata, sendo que o número

diplóide desta espécie é de 48, segundo o indicado em outros trabalhos [Bejar et al. 1997].

3.2.2. Cariótipo da linha VSa16

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 97 101

105

109

113

Nº Cromossomas

Nº C

onta

gens

17%

VSa16N=53

Figura 17 – Gráfico do número de amostras contadas em função do nº de cromossomas para as células da linha

celular VSa16 com 28 passagens. A barra branca representa o número tetraplóide para a espécie Sparus aurata.

N = número de metáfases contadas. A percentagem representa [(nº de amostras com o nº tetraplóide)/N]

Segundo a Figura 17, existe um máximo de ocorrências para 96 cromossomas, 9 vezes

contados num total de 53 contagens (17%). Este valor corresponde, à semelhança do que

previamente se verificou para a linha VSa13, ao número tetraplóide de cromossomas para Sparus

aurata.


40

3.3. Estudo da mineralização in vitro

3.3.1. Análise de condições de mineralização em VSa13 e VSa16

Estudos anteriores [Pombinho et al. 2003] haviam obtido mineralização da matriz

extracelular destas linhas celulares pela adição de 3 componentes: β-glicerofosfato, como fonte

de fosfato inorgânico (após degradação pela fosfatase alcalina), vitamina C, para a maturação das

fibras de colagénio, e cloreto de cálcio, como fonte de cálcio, todos eles necessários para a

formação dos cristais de hidroxiapatite. Assim sendo, foi encarada como a condição de

mineralização padrão a seguinte: β−glicerofosfato (10 mM); vitamina C (50 µg/ml) e cálcio

(4 mM).

Neste estudo fez-se variar estas condições, de forma a analisar as variações ocorridas na

mineralização. A experiência decorreu ao longo de 4 semanas, em placas de 12 poços, nas quais

se fez variar a presença ou ausência de vitamina C e variou-se a concentração de cálcio, nas

condições observáveis na tabela seguinte. O meio utilizado foi D-MEM suplementado com 10%

FBS sendo renovado a cada 3 ou 4 dias.

Tabela 4 – Descrição dos aditivos de cada condição de mineralização testada (+, presente e -, ausente)

Aditivos

Condição β-glicerofosfato

(10 mM)

Vitamina C

(50 µg/ml)

CaCl2

1 - - -

2 + - 4 mM

3 + + -

4 + + 1 mM

5 + + 4 mM

6 + + 8 mM


41

i. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha

celular VSa13

Condições 1ª semana 2ª semana 3ª semana 4ª semana

1 Controlo

2 β-glicerofosfato (10 mM)

Cálcio (4 mM)


Ácido Ascórbico (50 µg/ml)



Cálcio (1 mM)



Cálcio (4 mM)



Cálcio (8 mM)

Figura 18 – Efeito de β-glicerofosfato, vitamina C e cálcio na mineralização da matriz extracelular da linha celular VSa13 (imagens macroscópicas).


42


1 Controlo


Cálcio (4 mM)





Cálcio (1 mM)



Cálcio (4 mM)



Cálcio (8 mM)

Figura 19 – Imagens obtidas dos nódulos mineralizados após coloração de von Kossa para determinação do efeito de β-glicerofosfato, vitamina C e cálcio na mineralização da matriz extracelular da linha celular VSa13 (imagens microscópicas).


43

Como se pode verificar pelas 2 tabelas de imagens (Figura 18 e Figura 19) em condições

controlo, sem adição de qualquer um dos componentes além do meio de cultura, não se obteve

qualquer formação de nódulos mineralizados.

A condição em que se obteve um maior grau de mineralização foi a condição 2 (na

ausência de vitamina C). Esta condição apresentou, no entanto, nódulos de aparência menos

consistente.

Na ausência de cálcio (condição 3) não se obteve também qualquer formação de nódulos

mineralizados, o mesmo sucedendo com baixa concentração de cálcio (condição 4 – 1 mM)

Das condições com os três constituintes, a que obteve maior grau de mineralização da

matriz foi a concentração de cálcio a 4 mM (condição 5). Em concentrações elevadas de cálcio

(8 mM – condição 6) existe uma diminuição da formação de nódulos quando comparada com a

condição 5.


44

ii. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha

celular VSa16


1 Controlo


Cálcio (4 mM)





Cálcio (1 mM)



Cálcio (4 mM)



Cálcio (8 mM)

Figura 20 – Efeito de β-glicerofosfato, vitamina C e cálcio na mineralização da matriz extracelular da linha celular VSa16 (imagens macroscópicas).


45


1 Controlo


Cálcio (4 mM)





Cálcio (1 mM)



Cálcio (4 mM)



Cálcio (8 mM)

Figura 21 – Imagens obtidas dos nódulos mineralizados de von Kossa para determinação do efeito de β-glicerofosfato, vitamina C e cálcio na mineralização da matriz extracelular da linha celular VSa16 (imagens microscópicas).

Os resultados para a linha celular VSa16 estão em concordância com os obtidos para a

linha VSa13. Analisando ambas as tabelas das Figura 20 e Figura 21, verificamos que os

controlos não apresentam nódulos mineralizados, o mesmo se verificando para as condições em

ausência e em baixas concentrações de cálcio (condições 3 e 4). Também para esta linha celular

a condição 2 (ausência de vitamina C) é a que produz uma maior quantidade de nódulos

mineralizados de uma menor consistência, muito embora neste caso seja menos evidente.


46

Nesta linha celular, à semelhança do observado para a linha VSa13, também existe uma

diminuição da quantidade de nódulos mineralizados para a condição 6 (elevada concentração de

cálcio) quando comparada com a condição padrão de mineralização (condição 5).

3.3.2. Efeito da adição de levamisole na mineralização da MEC em

linhas celulares de VSa

Para a determinação do efeito do levamisole das duas linhas celulares, planeou-se uma

experiência em que as células são incubadas a condições controlo e condições mineralizantes, na

ausência e na presença de duas concentrações de levamisole diferentes (10 µM e 1 mM).

A experiência decorreu ao longo de 3 semanas, no final das quais se analisou o nível de

mineralização pelo método de coloração de nódulos mineralizados de von Kossa, se quantificou

os níveis de cálcio presentes na matriz extracelular e por fim se determinou a actividade da

fosfatase alcalina.

i. Estimativa da de taxa de mineralização

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Controlo Levamisole 10 Levamisole 1 mM

Gra

u de

min

eral

izaç

ão d

a m

atriz

VSa13VSa16

-13% -36%

-93%

-57%

Figura 22 – Efeito do levamisole na mineralização da matriz extracelular nas células VSa13 e VSa16. Os valores

obtidos estão expressos como efeito total, os seja, correspondem ao valor de mineralização obtido para as condições

de mineralização subtraindo os valores controlo (condições não mineralizantes). As percentagens indicam o valor de

inibição do efeito, em comparação com o controlo.

µl


47

Como se pode observar pela Figura 22, a mineralização diminui com o aumento da

concentração de levamisole, verificando-se um efeito inibitório mais drástico a concentrações

elevadas de levamisole.

Verifica-se também que a concentração de 1 mM de levamisole tem um efeito inibitório

mais acentuado na mineralização da linha VSa13 (93% de redução) do que na VSa16

(57% redução).

ii. Medição da deposição de cálcio

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Controlo Levamisole 10 Levamisole 1 mM

Cal

cio

(mg/

poço

)

VSa13

VSa16

-83%

-46%

µM

Figura 23 – Cálcio depositado na MEC das duas linhas celulares (VSa13 e VSa16), sobre condição controlo e

diferentes concentrações de levamisole. Os valores apresentados são representativos da variação total de cálcio

correspondente à subtracção dos valores obtidos para os controlos (em condições não mineralizantes) aos valores

obtidos para as condições de mineralização. Os valores indicados para cada barra são representativos das

percentagens de inibição de deposição de cálcio na matriz extracelular em comparação com o controlo.

Como podemos verificar na Figura 23, o aumento de concentração de levamisole leva a

um decréscimo da deposição de cálcio na matriz extracelular em ambas as linhas celulares.

Verifica-se que não existe efeito para a concentração mais baixa de levamisole, no entanto, para

a concentração mais elevada de levamisole os valores apresentam resultados semelhantes aos

apresentados para os nódulos mineralizados (Figura 22), existindo uma redução maior na

acumulação de cálcio para a linha VSa13 (-83%) do que a registada para as VSa16 (-46%).


48

iii. Determinação da actividade da fosfatase alcalina

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Controlo Levamisole Levamisole (1 mM)

Act

ivid

ade

fosf

atas

e al

calin

anm

ol(p

-nitr

ofen

ol)/(

mg(

prot

eina

).45

min

)

VSa13VSa16

30%

-57%

309%

141%

(µM)

Figura 24 – Actividade da fosfatase alcalina para as duas linhas celulares (VSa13 e VSa16), sobre condição controlo e diferentes concentrações de levamisole. Os valores apresentados são representativos da variação total de actividade da fosfatase alcalina o que correspondente à subtracção dos valores obtidos para os controlos (em condições não mineralizantes) aos valores obtidos para as condições de mineralização. Os valores indicados para cada barra são representativos das percentagens de indução ou inibição da actividade em relação ao controlo.

Pela análise da Figura 24 observou-se um aumento da actividade com o aumento da

concentração de levamisole. Existe no entanto uma redução na actividade para a linha VSa16

para a concentração de 10 µM de levamisole. A concentração mais elevada de levamisole

(1 mM) levou a aumentos drásticos de actividade tanto para a linha VSa13 como para as VSa16.

Estes resultados são inesperados, uma vez que o levamisole é um inibidor específico da

actividade da fosfatase alcalina, pelo que presume-se que poderá ter existido algum problema

técnico.


49

3.3.3. Efeito da adição de warfarina na mineralização em linhas

celulares de VSa

Para a determinação do efeito da warfarina nas duas linhas celulares, submeteu-se as duas

linhas celulares a condições controlo e condições mineralizantes, na ausência e na presença de

duas concentrações de warfarina (5 µM e 0,5 mM)

A experiência decorreu ao longo de 3 semanas no final das quais se analisou o nível de

mineralização pelo método de coloração de nódulos mineralizados de von Kossa e se quantificou

os níveis de cálcio presentes na matriz extracelular.

i. Estimativa da de taxa de mineralização

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Controlo Warfarina Warfarina (0,5 mM)

Gra

u de

min

eral

izaç

ão d

a m

atriz

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

VSa13VSa16

26%

42%

150% 80%

(5 µM)

Figura 25 – Efeito da warfarina na mineralização da matriz extracelular nas células VSa13 e VSa16. Os valores obtidos, estão expressos como efeito total, os seja, correspondem ao valor de mineralização obtido para as condições de mineralização subtraindo os valores controlo (condições não mineralizantes). As percentagens indicam o valor de indução do efeito, em comparação com o controlo.

Nesta experiência observou-se um aumento do grau de mineralização com o aumento da

concentração de warfarina. O comportamento é idêntico para ambas as linhas celulares, sendo no

entanto mais evidente para elevadas concentrações na linha VSa13, que sofre uma indução de


50

mineralização de 150% quando comparada com a VSa16, cuja indução a essa concentração é de

80%.

ii. Medição da deposição de cálcio

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Controlo Warfarina Warfarina (0,5 mM )

Cál

cio

(mg/

poço

)

VSa13VSa16

-72%

21% 92%33%

(5 µM)

Figura 26 – Gráfico das concentrações de cálcio obtidas para as duas linhas celulares (VSa13 e VSa16), sobre condição controlo e diferentes concentrações de warfarina. Os valores apresentados são representativos da variação total de cálcio correspondente à subtracção dos valores obtidos para os controlos (em condições não mineralizantes) aos valores obtidos para as condições de mineralização. Os valores indicados para cada barra são representativos das percentagens de indução de deposição de cálcio na matriz extracelular em comparação com o controlo.

Como se pode observar pelo gráfico, podemos verificar que existe uma acumulação de

cálcio na matriz com o aumento da concentração de warfarina, sendo essa acumulação bastante

mais evidente para a linha VSa13 para a concentração de 0,5 mM warfarina (92%).

Para a concentração de 5 µM existe uma diminuição drástica da acumulação de cálcio

para as VSa13 (-72%), não consistente com o observado para as VSa16, que a essa concentração

sofrem um aumento de acumulação de 21%; esta diferença poderá ser fruto de algum problema

técnico.


51

3.3.4. Caracterização por SDS-PAGE das proteínas excretadas por

VSa13 e VSa16

Figura 27 – Separação por SDS-PAGE de proteínas secretadas pelas células VSa13 e VSa16 sobre condições normais

Pela análise da Figura 27 pode-se verificar que apresentam padrão de bandas muito

semelhante composto por cerca de 30 bandas. Destas, cerca de 15 estão presentes em grandes

quantidades e poderão ser isoladas e sequenciadas.


52

3.4. Construção de linha celular capaz de sobreprodução de BGP

Para a alteração de uma das linhas já existentes para que produzisse BGP de forma

estável, pensou-se em transformar células da linha celular VSa13, que em trabalhos preliminares

se verificou não exprimir BGP quer em condições mineralizantes quer em condições controlo

[Pombinho et al. 2003], com um plasmídeo possuindo a zona codante da BGP adjacente de um

promotor, capaz de conferir uma expressão constituitiva da proteína. Assim, foi idealizado um

plasmídeo com um promotor de expressão constitutiva e genes de resistência para bactérias e

células eucariótas.

Os plasmídeos pcDNA3 e PRC/CMV da Invitrogen eram por isso indicados para a

função, uma vez que ambos possuem o promotor CMV (citomegalovirus) que permite a

expressão constituitiva do gene a juzante do mesmo, bem como regiões de resistência a

ampicilina e geneticina (ver anexo, secção 7.3).

3.4.1. Construção de vectores de expressão

i. Construção do vector pcDNA3-BGP

Para a construção deste plasmídeo, digeriu-se o pcDNA3 e o vector pGEM-BGP1 que

contêm o ORF da BGP com a enzima de restrição EcoRI (Gibco). Os fragmentos foram então

separados por electroforese em gel de 1% agarose, extraídos e purificados. A ligação foi

transformada por choque térmico em E. coli DH5α competentes e plaqueada em meio LB

contendo ampicilina. Deixou-se crescer durante a noite e seleccionaram-se 24 colónias

individualizadas as quais se deixaram crescer durante a noite em 1,5 ml de LB com ampicilina,

utilizada como agente selectivo de colónias resistentes.

Fez-se uma extracção de ADN plasmídico (miniprep) e consequente análise de restrição

com EcoRI (Gibco) para a determinação dos clones positivos, cujos fragmentos deveram

apresentar 5446 pb e 590 pb. O resultado da digestão está presente na Figura 28.

1 Gene da BGP clonado no vector pGEM-T-Easy, foi-me amavelmente cedido por Jorge Pinto


53

1 2 3 4 5 6 M1kb 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 M1kb 19 20 21 22 23 24

Figura 28 – Digestão com EcoRI de mini-preparações de ADN extraído de colónias E. coli resistentes a ampicilina transformadas com a ligação pcDNA3 ao fragmento de BGP (gel 1% agarose).

A partir desta análise por digestão com EcoRI, pode-se observar a existência de três

clones (4, 16 e 21) com o fragmento de BGP inserido no pcDNA3.

Uma vez as duas extremidades dos de ligação entre o pcDNA3 e o fragmento de BGP

foram obtidas por corte com EcoRI, a reacção de ligação entre ambos não possui uma orientação

preferencial pelo que o fragmento pode ser inserido tanto na posição correcta, como na posição

inversa.

Para a determinação dos clones positivos com a correcta orientação do gene da BGP,

fez-se uma análise de restrição com a enzima StuI (Gibco). Esta enzima corta o plasmídeo em

duas partes desiguais com um corte dentro do fragmento de BGP e outro no plasmídeo, o que

- Frag. pcDNA3

- Frag. BGP

506 pb -

1018 pb -

- 1018 pb

- 506 pb

- Frag

BGP

- Frag.

pcDNA3


54

resulta na formação de fragmentos de diferentes tamanhos conforme a BGP estiver colocada na

posição correcta ou na posição invertida. Os fragmentos originados para o insert na orientação

correcta são 4550 pb e 1561 pb. Na posição invertida os fragmentos têm 4751 pb e 1360 pb

A digestão resultante foi a seguinte:

M1kb 4 16 21

Figura 29 – Gel de agarose 1,5% , resultante da digestão dos clones positivos 4, 16 e 21 de pcDNA3-BGP digeridos com StuI.

A partir dos resultados presentes na Figura 29, determinou-se que o clone 4 possui o

fragmento inserido na posição inversa e os clones 16 e 21 possuem o fragmento de BGP na

orientação correcta.

Os clones 4 e 16 foram então sequenciados para confirmação da direcção da inserção e

confirmação da sua correcta sequencia. As sequências obtidas encontram-se descritas nas Figura

30 e Figura 31.

PCDNA3 BGP CLONE 4 5’ – tggatccactagtaacgcccgccagtgtgctggaattcactagtgatt gtt agg gga aat gat cga atc aca gtg ggt gga aaa taa att cac atg aag ata tta ttc ctc ctg ctc cac atc aca cac ttt tta gct tgc tta cgt gct ttg ggc ttg act ata aa - 3’ Figura 30 – Leitura da sequência obtida para o clone 4 de pcDNA3-BGP. A cinzento, encontra-se indicada a sequência do plasmídeo a montante do promotor T7, usado como “primer” na sequenciação. A sequencia sublinhada indica a zona de restrição da enzima EcoRI utilizada na clonagem.

1018 pb -

1636 pb -

- 4550/4751 pb

- 1561 pb - 1360 pb


55

PCDNA3-BGP CLONE 16 5’ – agtgtgctggaattcgattgagctggaagtctccggtccgacttgtt gcttggtataatacagacggtgaagacagaagctgaaag atg aag act ctg gcc ttc ctg gtt ctc tgc ctc cct ggc agc cat ctg tct gac ttc… - 3’ Figura 31 – Leitura da sequência obtida para o clone 16 de pcDNA3-BGP. A cinzento claro encontra-se indicada a sequência do plasmídeo a jusante do promotor T7, usado como “primer” na sequenciação, a preto encontra-se assinalado o codão de iniciação da BGP e a cinzento-escuro está indicada a restante sequencia codante que foi possível sequencias. A sequencia sublinhada a negrito indica a zona de corte da enzima EcoRI utilizada na clonagem do “insert”.

Pela leitura da sequência e comparação com a sequencia do ADNc da BGP, é possível

comprovar que o clone 4 contêm o fragmento invertido e que o clone 16 possui o fragmento

inserido com a orientação correcta mas com uma sequencia não codante entre o plasmídeo e

codão de iniciação de 23 pb.

ii. Construção do vector pRC/CMV-BGP

Digeriu-se o vector pRC/CMV e o vector pGEM-BGP com a enzima de restrição NotI

(Boehringer). O plasmídeo e o insert digeridos foram então separados por electroforese em gel

de agarose 1% e extraídos e purificados. Fez-se a ligação entre os vectores e o insert e

transformou-se em E. coli competente, plaqueada em meio LB contendo ampicilina. Deixou-se

crescer durante a noite e seleccionaram-se 24 colónias individualizadas, as quais se deixaram a

crescer durante a noite em 1,5 ml de LB também com ampicilina como agente selectivo de

colónias resistentes. Seguidamente, fez-se uma extracção do ADN plasmídico (miniprep) e

consequente análise de restrição com NotI para determinação de clones positivos.

Os fragmentos esperados têm 5520 pb e 606 pb, correspondentes ao plasmídeo

linearizado e o insert, respectivamente.


56

13 14 15 16 17 18 M1kb 19 20 21 22 23 24

Figura 32 – Digestão com NotI de mini-preparações de ADN extraído de colónias E. coli resistentes a ampicilina transformadas com a ligação pRC ao fragmento de BGP (gel 1% agarose). (1) – Plasmídeo não digerido; (2) – Plasmídeo parcialmente digerido.

A partir da digestão com a enzima NotI, verificou-se a existência de clones positivos em

15, 18 e 20. Os primeiros 12 clones não foram aqui colocados por não possuírem nenhum clone

positivo.

À semelhança do que foi feito para o plasmídeo anterior, os clones positivos foram

digeridos com a enzima StuI para determinar a orientação do fragmento de BGP uma vez que

dependendo da sua orientação, os fragmentos resultantes da digestão com esta enzima têm

tamanhos diferentes. Assim os fragmentos esperados para o clone com insert na posição correcta

são de 4555 pb e 1571 pb. Para a orientação inversa são esperados fragmentos com 4735 pb e

1391 pb.

(1)- - pRC linearizado

- BGP- 506 pb

- 1018 pb

- 2036 pb- 3054 pb

- 4072 pb

(1)-

(2)-


57

M1kb 20 18 15

Figura 33 – Gel de 1% agarose, resultante da digestão dos clones positivos de pRC-BGP digeridos com StuI.

A partir do gel presente na Figura 33 podemos observar que o clone 15 possui o

fragmento com orientação correcta, pelo que foi sequenciado para confirmação da sua correcta

sequência. A sequência obtida foi após comparação com a sequência completa da BGP foi:

PRC-BGP CLONE 15

5’ – atccactagtaacggccgccagtgtgctggaattctgcagatatccatcacactg gcggccgcgggaattcgattgagctggaagtctccggtccgacttgttgcttggtataatacagacggtgaagacagaagctgaaagatg aag act ctg gcc ttc ctg gtt ctc tgc t… - 3’ Figura 34 – Leitura da sequência obtida para o clone 15 de pRC-BGP. A cinzento encontra-se indicada a sequência do plasmídeo a montante do promotor T7, usado como “primer” na sequenciação a vermelho encontra-se assinalado o codão de iniciação da BGP e a azul está indicada a restante sequencia codante que foi possível ler. A sequencia sublinhada indica a região de corte por NotI.

Deste modo obteve-se 2 plasmídeos pcDNA3-BGP e pRC-BGP que possuem a região

codante da BGP a montante do promotor CMV. Estes plasmídeos quando transfectados deverão

permitir a expressão constitutiva da BGP, pelo que fez-se uma maxipreparação destes

plasmídeos para os utilizar no processo de transfecção, que requer quantidades elevadas e muito

puras de ADN.

1018 pb -

1636 pb -

- 4555/4735 pb

- 1571 pb - 1391 pb


58

iii. Construção do vector pcDNA3-BGPorf

Ambos as plasmideos pcDNA3-BGP e pRC-BGP possuem uma sequencia de intervalo

entre o promotor CMV a sequencia codante da BGP relativamente grande (151 pb e 187 pb,

respectivamente). Desta forma decidiu-se construir um novo plasmideo em que a distância entre

o promotor e a região codante da BGP fosse menor, o que poderia conduzir a maiores níveis de

expressão quando integrado no genoma da linha celular

Para a construção deste plasmídeo, amplificou-se a região codante da BGP por PCR, a

partir do plasmideo de pGEM-BGP, utilizando os “primers” e condições já referidos nos

métodos (secção 2.2.15). De seguida digeriu-se o vector pcDNA3 e o produto da amplificação

por PCR com as enzimas EcoRI e KpnI (locais de restrição adicionados pelos “primers”

utilizados na reacção de PCR).

Fizeram-se diversas tentativas de ligação entre o vector e o fragmento de PCR digeridos

com ambas as enzimas mas devido a problemas com a eficiência das bactérias transformantes

não foi possível a obtenção do plasmideo no decurso deste trabalho. Em trabalho subsequente,

realizado no laboratório, por Sandra Marques e utilizando os mesmos “primers” foi possível

obter este novo plasmideo o qual foi nomeado pcDNA3-BGPorf.


59

3.4.2. Curva de resistência à geneticina de células VSa13 e Vsa16

i. Resistência da linha celular VSa13 a geneticina

Como se pode verificar pela Figura 35, tanto com 1 ou 2 semanas de tratamento, a linha

celular VSa13 apresenta uma mortalidade (aqui representada pelo teor proteico) perto de 100%

para uma concentração de 0,45 mg/ml. Por isso esta foi a concentração utilizada para seleccionar

células transfectadas.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Concentração de G418 (mg/ml)

Qua

ntid

ade

de P

rote

ina

VSa13 - 1 semana tratamento

VSa13 - 2 semanas tratamento(µg)


60

ii. Resistência da linha celular VSa16 a geneticina

0

20

40

60

80

100

120

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Concentração de G418 (mg/ml)

Qua

ntid

ade

de P

rote

ina

VSa16 - 1 semana tratamento

VSa16 - 2 semanas tratamento

Figura 36 – Gráfico da concentração de proteína encontrada em cada poço para as diferentes concentrações de

geneticina aplicada. A concentração proteica é proporcional à quantidade de células sobreviventes.

Pela análise da Figura 36 para a linha celular VSa16, verifica-se que uma concentração de

0.3 mg/ml é suficiente, mesmo no decurso de apenas 1 semana de exposição para obter-se uma

mortalidade de 100%. Quando comparados com os valores obtidos para as VSa13 (Figura 34)

verifica-se que as VSa13 possuem maior tolerância a geneticina apenas se verificando o mesmo

nível de mortalidade para a concentração de 0,45 mg/ml.

(µg)


61

3.4.3. Controlo positivo de transfecção por ensaio por pβGAL

Figura 37 – Células VSa13, transfectadas com o plasmídeo pβGal, utilizando o método de co-precipitação de fosfato de cálcio, a expressar β-galactosidase. Ampliação 200x, em que a barra representa 50 µm.

O ensaio da β-galactosidase, foi positivo tendo-se observado algumas células azuis. No

entanto a taxa de sucesso foi muito baixa tendo-se encontrado um total de cerca de 6 células

azuis por cada placa de 100 mm (que contêm em condições de confluência aproximadamente de

3*106 células)


62

3.4.4. Transfecção das VSa13 com os plasmídeos pcDNA3-BGP e pRC-

BGP

Fizeram-se 2 transfecções de VSa13 utilizando o método de precipitação de fosfato de

cálcio. As células transfectadas foram colocadas sobre um meio selectivo, na presença de

0,45 mg/ml de geneticina durante 2 semanas com substituição do meio a cada 3 dias.

Na primeira transfecção tentou-se incorporar os plasmídeos na sua forma circular, não se

obtendo qualquer clone resistente. Na segunda transfecção, tentou-se a incorporação do

plasmídeo linearizado com a enzima BglII. A transfecção do plasmideo linear, ao contrário do

plasmideo circular, permite a sua incorporação no genoma da linha celular, obtendo-se desta

forma uma linha celular que não necessita de uma contínua exposição a genéticina para manter

as características de resistência conferidas pelo plasmideo uma vez que este ADN exógeno passa

a ser replicado dentro do sistema de replicação do ADN da própria célula. No entanto também

não se obteve qualquer clone resistente utilizando este plasmideo linearizado.

Universidade do Algarve Discussão

63

4. Discussão

O objectivo principal deste trabalho foi a caracterização de duas linhas celulares

derivadas de osso de Sparus aurata (VSa13 e VSa16), nomeadamente no que diz respeito:

1) Cariótipo,

2) Condições de mineralização da MEC,

3) Efeito do levamisole e warfarina sobre a mineralização da MEC,

4) Contribuir para a obtenção de uma linha celular capaz de sobreexprimir BGP,

5) Identificação de proteínas expressas.

i. Cariótipos das linhas celulares VSa13 e VSa16

Com respeito ao número de cromossomas verificou-se que ambas as linhas celulares são

tetraplóides possuindo 96 cromossomas. No caso da Sparus aurata, o número diplóide foi

determinado por Bejar et al. em 1997 como sendo 48 [Bejar et al. 1997]. Assim sendo deverá ter

existido no processo de imortalização destas duas linhas celulares, uma duplicação do seu

número de cromossomas.

A grande amplitude de valores observada na curva de distribuição do número de

cromossomas em metafase (Figura 16 e Figura 17) pode ser consequência de diversos factores,

tais como a má qualidade da imagem, a sobreposição ou a dupla contagem de cromossomas, ou

até mesmo a dispersão dos cromossomas para longe dos restantes aquando do rebentamento das

células.

ii. Efeito da vitamina C e cálcio na mineralização da MEC

Pôde-se verificar que ambas as linhas celulares são capazes de mineralizar a MEC in

vitro, num processo activo de deposição de nódulos, dependente de vários factores.


64

Efeito da vitamina C

Foi possível determinar que a vitamina C, ou ácido ascórbico neste sistema in vitro não é

necessário para a ocorrência de mineralização. No entanto, a aparência mais frágil dos nódulos

mineralizados na ausência da vitamina C leva a crer que este possa ser importante para a correcta

maturação dos cristais de hidroxiapatite. A implicação da vitamina C nos processos de

diferenciação de diversos tipos de células e a sua importância na síntese da matriz de colagénio

foram já previamente estudadas em mamíferos. [Franceschi et al. 1994, Heino et al. 1989]. Desta

forma a ausência de vitamina C pode originar uma MEC mais desorganizada, composta

sobretudo por fibras de tropocolagénio, que aceite a deposição de cristais de hidroxiapatite mas

que forme uma estrutura cristalina mais frágil. Para comprovar esta hipótese, terá de se analisar a

natureza dos cristais formados na ausência de vitamina C, por exemplo por difracção de raio-x e

também analisar a natureza do colagénio presente nestas condições.

Efeito do cálcio

Em relação a presença de cálcio, verificou-se que quando ausente ou em baixas

concentrações (1 mM) a formação de nódulos é quase nula, que na presença de 4 mM existe uma

mineralização forte e que para 8 mM observa-se uma diminuição da mineralização.

Os resultados obtidos são diferentes dos observados em culturas de células derivadas de

mamíferos, que não requerem a adição de cálcio para indução da mineralização, sobretudo

quando cultivados em meio D-MEM [Mori et al. 1998, Robey and Termine 1985]. Assim,

poderemos supor que a quantidade de cálcio já presente no meio de cultura D-MEM é suficiente

para indução da mineralização em sistemas de mamíferos, mas insuficiente para sistemas

celulares derivados de peixe. Esta hipótese vem da observação de que os peixes marinhos

possuem um meio extracelular rico em cálcio (na água do mar, a concentração de cálcio situa-se

entre 400 e 420 mg/l).

É por isso possível supor que as células de peixe necessitem de um maior estímulo de

cálcio para induzir a mineralização da sua matriz extracelular do que o observado para

mamíferos, para os quais uma baixa concentração de cálcio é suficiente para estimular a

mineralização da MEC, uma vez que os níveis basais de cálcio no seu sangue são também muito

baixos. Esta regulação em peixes é muito menos controlada do que em mamíferos. A dourada,

por exemplo, tolera grandes flutuações na concentração de cálcio no plasma sanguíneo, sem que

se observe grande stress fisiológico [Guerreiro et al. 2002]. Desta forma, os resultados obtidos


65

estão de acordo com esta tolerância à flutuação na concentração de cálcio existente na dourada,

em que apenas se observa uma diminuição da formação de nódulos com 8 mM de cálcio.

A concentração de 8 mM de cálcio é muito elevada pelo que a diminuição da

mineralização observada poderá ser causada pela toxicidade do cálcio nestas concentrações. De

qualquer modo, para determinar se a diminuição da mineralização se deve à diminuição da

viabilidade celular, há que realizar-se estudos de toxicidade do cálcio.

iii. Efeito de levamisole e warfarina na mineralização da MEC

Efeito do levamisole

Em relação ao efeito do levamisole da mineralização, verificou-se tanto uma diminuição

da formação de nódulos mineralizados como a diminuição da deposição de cálcio na matriz. Este

resultado estava previsto, uma vez que o levamisole inactiva a fosfatase alcalina o que provoca

uma redução da quantidade de fosfato inorgânico disponível, que é resultante da degradação de

β-glicerofosfato por parte desta enzima. Esta diminuição de fosfato disponível pode levar a um

decréscimo na formação de cristais de hidroxiapatite.

Em relação à actividade da fosfatase alcalina com concentrações crescentes de

levamisole, verificou-se um aumento da actividade. Este resultado não foi de todo o que seria de

esperar, uma vez que segundo van Belle, o levamisole é um inibidor estereoespecífico não

competitivo da fosfatase alcalina, sendo o mecanismo de inibição a formação de um complexo

inactivo com a enzima [Van Belle 1976]. Assim, uma maior concentração de levamisole deveria

conduzir a uma diminuição da actividade da enzima, o que foi observado em outros

trabalhos.[Garba and Marie 1986, McDougall et al. 2002].

Desta forma, os resultados obtidos terão de ser comprovados com novas experiências

para eliminar a possibilidade dos valores obtidos serem resultantes de algum problema técnico.

Efeito da warfarina

A warfarina é um inibidor da γ-carboxilação, actuando como um antagonista da vitamina

K, necessária ao funcionamento da γ-carboxilase [Berkner 2000, Nishimoto and Price 1985, Pan

et al. 1985, Price 1987a, b]. Desta forma, a presença de warfarina, leva à formação de proteínas

Gla não completamente funcionais, uma vez que a γ-carboxilase se encontra inibida e por isso,


66

nem todos os resíduos de ácido glutâmico das proteínas Gla que sofrem o processo de

γ-carboxilação [Cairns and Price 1994, Price and Williamson 1981]. Assim, é possível averiguar

qual o efeito da menor funcionalidade destas proteínas pela análise do efeito na mineralização da

matriz extracelular.

Como pudemos verificar nos resultados, a formação de nódulos mineralizados e a

deposição de cálcio aumenta consideravelmente com o aumento da concentração de warfarina.

Este resultado seria de esperar, pois observou-se o mesmo tipo de fenómeno em células de

mamíferos [Price and Williamson 1981]. Como trabalhos anteriores verificaram que as linhas

celulares expressam BGP e MGP de uma forma mutuamente exclusiva [Pombinho et al. 2003],

podemos assumir que ambas as proteínas estão envolvidas na regulação da mineralização, uma

vez que ambas as linhas celulares verificaram um acréscimo da mineralização com o aumento da

concentração de warfarina. Estes resultados estão de acordo com o observado em trabalhos

anteriores em que se verificou que o tratamento com warfarina conduz a desordens de

mineralização causadas pela inibição das proteínas Gla [Hale et al. 1988, Price et al. 1982, Price

1989, Yagami et al. 1999]. Desta forma podemos assumir que o papel destas proteínas poderá

ser o mesmo quer em sistemas de mamíferos quer para os peixes teleósteos.

iv. Transfecções com plasmídeos de forma a obter uma linha celular

capaz de sobreexprimir BGP

As transfecções realizadas com os plasmídeos pcDNA3-BGP e pRC-BGP, quer sobre a

sua forma circular quer linearizados, não conseguiram produzir um clone transfectado resistente

de células VSa13. Verificou-se pelo controle positivo transfectado com o plasmídeo pβGal que a

eficiência das transfecções nestas células é muito baixa, desta forma, torna-se difícil encontrar

clones transfectados. Trabalhos subsequentes a este depararam também com a dificuldade de

transfectabilidade desta linha celular, tendo-se utilizando métodos de transfecção por lipossomas

(kit Superfect da Qiagen) sem sucesso. Recentemente a colega Sandra Marques, do nosso

laboratório, conseguiu uma eficiência de transfecção cerca de 25 vezes superior utilizando o kit

de transfecção FuGENE 6 (Roche™), pelo que um clone capaz de sobreexprimir a BGP pode vir

a ser obtido num futuro próximo.


67

v. Identificação de proteínas expressas em VSa13 e VSa16

Verificou-se a existência de um grande número de proteínas secretadas para o meio

extracelular para ambas as linhas celulares. Embora cerca de 15 bandas se encontrem bem

definidas e seja possível vir a sequencia-las por sequenciação N-terminal, a presença de outras

proteínas sobrepostas pode reduzir a eficiência desta técnica de sequenciação.

A separação das proteínas por electroforese bi-dimensional poderá vir a permitir uma

melhor separação das bandas, uma vez que se baseia na separação das proteínas, não só pelo seu

peso molecular como pelo seu ponto isoeléctrico. Assim, proteínas que se encontrem sobrepostas

no gel de SDS-PAGE poderão vir a ser também sequenciadas e identificadas.

Universidade do Algarve Passos Futuros

68

5. Passos Futuros

Como passo imediato, esperamos vir a analisar por electroforese bidimensional as

proteínas secretadas pelas duas linhas celulares quer em condições padrão, quer em condições de

mineralização e sobre a influência de outros factores, tais como a presença de warfarina,

levamisole e outros agentes. Esperamos também poder analisar a diferença do padrão de

proteínas obtido para ambas as linhas.

O passo seguinte, será a identificação das bandas proteicas que se encontrem expressas de

forma diferente em ambas as linhas celulares, de modo a tentar analisar a influência que estas

possam ter sobre as diferenças morfológicas de crescimento e de expressão de genes

apresentadas pelas mesmas.

Esperamos também vir a obter uma linha celular derivada de VSa13 e VSa16, capazes de

exprimir de forma constitutiva BGP e MGP, respectivamente. Com estas linhas, iremos analisar

o efeito que a sobreprodução destas proteínas poderá ter sobre a expressão de outros genes e

sobre a mineralização da matriz extracelular.

Universidade do Algarve Bibliografia

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Universidade do Algarve Anexos

77

7. Anexos

7.1 – Anexo I Soluções utilizadas 78

7.2 – Anexo II – Curvas de Calibração 80

7.3 – Anexo III – Plasmídeos 82


78

7.1. Anexo I – Soluções utilizadas

Ampicillin (Stock = 50 mg/ml) ampicillin sodium 1 g Água bidestilada 10 ml Esterilização por filtração em filtros 0,2 µm Aliquotas armazenadas a -20ºC LB (1 l) Hidrolisado de caseina 10 g Extracto de levedura 5 g NaCl 5 g Acertar o volume a 1 l com água destilada. Autoclave (120ºC, 20 min.). Placas de LB-amp: (1 l) Meio LB 1 l Agar 15 g Autoclave (120ºC, 20 min.). 50 mg/L ampicilina quando a agarose arrefece para 45ºC. PBS (1 l) NaCl 137 mM 8 g KCl 2,7 mM 0,2 g Na2HPO4 8,1 mM 1,44 g KH2PO4 1,47 mM 0,24 g Água destilada 950 ml Acertar o pH a 7,4. Acertar o volume a 1 l (água destilada). Transferir para aliquotas de 500 ml. Autoclave (120ºC, 20 min.). Tripsina-EDTA 1X (0,5 l) NaCl 137 mM 4 g KCl 2,7 mM 0,1 g Na2HPO4 15,8 mM 1,4 g KH2PO4 1,23 mM 0,1 g EDTA 1,1 mM 0,2 g Tripsina 0,2% 1g Água destilada 450 ml Acertar o pH a 7,4. Acertar o volume a 500 ml. Esterilizar por filtração com filtro 0,2 µm. Fazer aliquotas 40 ml. Armazenar a -20ºC.


79

TE (100 ml) Tris 1 M 1 ml EDTA 500 mM 0,2 ml Água destilada 90 ml Acertar o pH a 7,5 Acertar volume a 100 ml GTE Glucose 50 mM (0,9%) Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM EDTA (pH 8.0) 10 mM RNase A Dissolve-se RNase A a 10 mg/ml em 10 mM Tris, HC1 (pH 7,5), 15 mM NaCl. Aquece-se a 100ºC por 15 min. Deixa-se arrefecer até TA. Armazena-se aliquotas a -20ºC. PCI Fenol (pH 8,0) 25 ml Clorofórmio 24 ml Álcool isoamilico 1 ml CIAA Clorofórmio 24 ml Álcool isoamilico 1 ml PEG/NaCl PEG8000 20% NaCl 2,5M TAE (Tris Acetate EDTA). (1X = 0,04 M Tris Acetate, 0,001 M EDTA) 50X stock de 2 l Tris 242 g Ácido acético glacial 57.1 ml EDTA (pH 8,0) 0.5 M 100 ml Ajusta-se volume a 2 l Tampão amostra SDS-PAGE (4X) Tris-HCl (pH 6,8) 320 mM SDS 8% (m/v) Glicerol 15% (v/v) Roxo de m-cresol 0,024% (m/v), β-mercaptoetanol 0,4 M


80

7.2. Anexo II – Curvas de calibração

Método de Bradford

Calibração Tubos Conc. BSA

(mg/ml)

Abs 595

nm

1 0,5 0,548

2 0,25 0,321

3 0,125 0,156

4 0,0625 0,075

Tabela 5 – Concentrações e absorvâncias obtidas para a BSA com método de quantificação proteica de Bradford a 595 nm e respectiva curva de calibração.

Método de BCA

Calibração Tubos Conc. BSA

(mg/ml)

Abs 562

nm

1 0,5 0,692

2 0,25 0,330

3 0,125 0,182

4 0,0625 0,086

Tabela 6 – Concentrações e absorvâncias obtidas para BSA com o método de quantificação proteica BCA a 562 nm e respectiva curva de calibração

y = 1,1398xR2 = 0,9849

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6Concentração BSA (mg/ml)

Abso

rvân

cia

a 59

5 nm

y = 1,3752xR2 = 0,9985

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 0,2 0,4 0,6 0,8Concentração de BSA (mg/ml)

Abso

rvân

cia

a 56

2 nm


81

Curva de calibração de p-nitrofenol

Tubos p-nitrofenol

(mg)

Abs 410

nm

+HCl Abs Final

1 4,55 0,692 -0,008 0,064

2 9,09 0,330 -0,009 0,142

3 18,18 0,182 -0,008 0,303

4 36,36 0,086 -0,005 0,624

Tabela 7 – Concentrações e absorvâncias obtidas para a degradação de p-nitro-fenol 562 nm e respectiva curva de calibração.

y = 0,017xR2 = 0,9978

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20 25 30 35 40

mg pnitrofenol

Abs

410

nm


82

7.3. Anexo III – Plasmídeos

pcDNA3

pcDNA3-BGP

pcDNA3-BGP6036 bp

Neomicina(R)

Ampicilina(R)

BGP Gene

BGH PolyA

SV40 Poly A

CMV Promoter

SP6 Promoter

T7 Promoter

SV40 promoter

SV40 Replication Origi

Col E1 Origin of Replicat ion

Bgl II (5111)

EcoRI (1)

EcoRI (591)


83

pRC/CMV

pRC-BGP

pRC-BGP6126 bp

Neomicina(R)

Ampicilina(R)

BGP Gene BGH PolyA

SV40 PolyA

CMV Promoter

T7 Promoter

Sp6 Promoter

SV40 Promote

F1 Origin

SV40 Origin

ColE1Ori

Bgl II (4567)

EcoRI (853)

EcoRI (5494)

EcoRI (5530)

EcoRI (6120)


84

pGEM-T-easy

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