Sínodos Vale do Itajaí, Norte Catarinense e Paranapanema ...
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE BIANCA BATISTON CORRÊA DA COSTA SÍNTESE DE NOVOS DERIVADOS DA TETRAHIDROFTALIMIDA DE INTERESSE BIOLÓGICO E ESTUDOS PRELIMINARES DE CORRELAÇÃO ESTRUTURA - ATIVIDADE Itajaí – 2006
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
BIANCA BATISTON CORRÊA DA COSTA
SÍNTESE DE NOVOS DERIVADOS DA TETRAHIDROFTALIMIDA DE INTERESSE BIOLÓGICO E ESTUDOS PRELIMINARES DE
CORRELAÇÃO ESTRUTURA - ATIVIDADE
Itajaí – 2006
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
BIANCA BATISTON CORRÊA DA COSTA
SÍNTESE DE NOVOS DERIVADOS DA TETRAHIDROFTALIMIDA DE INTERESSE BIOLÓGICO E ESTUDOS PRELIMINARES DE
CORRELAÇÃO ESTRUTURA - ATIVIDADE
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Itajaí, julho de 2006.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos aqueles que sempre acreditaram em mim, e que sempre
estiveram torcendo para que meus anseios pudessem se concretizar. Em especial ao
meu esposo Rodrigo, pelo amor e compreensão, aos meus pais e irmão, por todo o
carinho e apoio, e, enfim, a todos os amigos e demais familiares, pela amizade e afeto.
III
AGRADECIMENTOS
Aos mestres e amigos Cechinel e “tio” Rogério, por tudo o que aprendi ao longo
de todos esses anos, desde a iniciação científica até hoje, e por acreditarem em meu
potencial.
Aos colegas de mestrado, em especial às colegas Juliana Bernardon Pretto e
Juliana Vargas Ardenghi, pela colaboração nos ensaios microbiológicos e
farmacológicos, juntamente com a equipe dos professores Alexandre Bella Cruz e
Márcia Maria de Souza.
À professora Fátima de Campos Buzzi e a toda a sua equipe, por toda a força,
colaboração e disposição nos ensaios farmacológicos, e por todas as dúvidas sanadas
no laboratório de síntese.
À Patrícia Rosa, do Laboratório de Instrumentação Analítica, pela realização dos
Espectros de IV.
À comissão interna de avaliação, composta pelos professores Clóvis Antônio
Rodrigues e Ângela Malheiros, pelas importantes sugestões que contribuíram para o
melhoramento do trabalho.
Ao professor Clóvis, por ter acompanhado de perto o meu trabalho, pela ajuda na
parte de espectroscopia, e pelas dúvidas sanadas em laboratório.
À banca examinadora, composta pelos professores Clóvis Antônio Rodrigues
(UNIVALI) e Edésio Luiz Simionatto (FURB), por terem aceitado o nosso convite para
avaliar o trabalho e pelas valiosas contribuições para a melhoria da qualidade do
trabalho.
Ao Felipe, do Laboratório de Química, por toda a colaboração na parte de
caracterização.
À Geórgia e à Diva, que por muito tempo colaboraram comigo prestando auxílio
no Laboratório de Pesquisa.
A todos os demais funcionários do Curso de Farmácia, por todo o auxílio na
parte experimental do meu trabalho.
À Rosélia, secretária do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, pelo
carinho, e por estar sempre pronta a me ajudar em tudo o que é preciso.
IV
À professora Tânia Mari Bellé Bresolin, coordenadora do Programa de Mestrado
em Ciências Farmacêuticas, e aos demais professores, por todos os conhecimentos
adquiridos ao longo destes três anos.
Ao Prof. Emídio Cunha, do LTF da UFPB e ao Prof. Dr. Franco Delle Monache
(CNR/Roma/Itália), por toda a colaboração na parte de espectroscopia de RMN1H.
Ao Programa de bolsas PIPG/UNIVALI.
Enfim, a todos aqueles que colaboraram para que este trabalho pudesse ser
realizado com êxito.
V
Só há duas maneiras de viver a vida: a primeira é vive-la como se os milagres não existissem; a segunda é vive-la como se tudo fosse um milagre”.
Albert Einstein
VI
SÍNTESE DE NOVOS DERIVADOS DA TETRAHIDROFTALIMIDA DE INTERESSE BIOLÓGICO E
ESTUDOS PRELIMINARES DE CORRELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE
Bianca Batiston Corrêa da Costa
Julho,2006.
Orientador: Valdir Cechinel Filho, Dr. Área de concentração: Química Medicinal Número de Páginas: 84 O interesse no estudo de novas imidas cíclicas vem crescendo muito nos últimos anos devido, principalmente, às variadas e importantes atividades que estes compostos apresentam. O presente estudo foi desenvolvido com base em trabalhos anteriores que demonstraram que novas substâncias análogas à Filantimida, alcalóide isolado de Phyllanthus sellowianus, particularmente as ftalimidas, possuem potencial analgésico e antimicrobiano. Dando continuidade a estes estudos, o presente trabalho visa obter novos derivados da tetrahidroftalimida com atividade biológica, avaliando-se o potencial antinociceptivo e antimicrobiano dos mesmos, levando-se em consideração alguns parâmetros de correlação estrutura-atividade. Os compostos imídicos foram obtidos através da reação entre o anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico com diferentes aminas substituídas em éter etílico, para a obtenção dos ácidos tetrahidroftalâmicos (1). Posteriormente, estes compostos foram ciclizados através de reação de desidratação com ácido acético sob refluxo, para a obtenção das respectivas tetrahidroftalimidas (2). Foram realizados ensaios farmacológicos empregando-se o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,6%, por via intraperitoneal e oral, os modelos de dor induzida pela formalina, capsaicina e glutamato, e o modelo da placa quente. O método de diluição foi usado para se obter as concentrações inibitórias mínimas do crescimento dos microorganismos (CIM) contra os seguintes microorganismos patogênicos aos seres humanos: Candida albicans, Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os resultados demonstraram que o composto C2, obtido através de modificação na estrutura do composto B7, foi o mais promissor, inibindo dose-dependentemente as contorções abdominais induzidas por ácido acético, com DI50 de 27,9 (26,2 – 30,0) μmol/kg, via i.p., sendo cerca de 5 vezes mais ativo que a aspirina e o paracetamol, atuando ainda na segunda fase do teste da formalina, e no teste da capsaicina. Este composto também foi ativo por via oral suerindo que pode ser absorvido pelo trato gastrointestinal. Nenhum composto apresentou CIM significativa contra os microorganismos testados, sendo todos os valores > 100μg/mL. Palavras-chave: Tetrahidroftalimidas; atividade antinociceptiva; atividade antimicrobiana
VII
SYNTHESIS OF NEW TETRAHYDROPTHALIMIDE DERIVATIVES OF BIOLOGICAL INTEREST, AND
PRELIMINARY STUDIES OF THE STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIP
Bianca Batiston Corrêa da Costa
July, 2006.
Advisor: Valdir Cechinel Filho, Dr. Area of Concentration: Medicinal Chemistry Number of pages: 84 Interest in cyclic imides has increased over the last few years, particularly due important activities these compounds present. This investigation was based on previous studies which demonstrated that new substances analogous to Phyllanthimide, an alkaloid isolated from Phyllanthus sellowianus, particularly phthalimides, exhibit antinociceptive and antimicrobial properties. Continuing these studies, the aim of this work was to obtain new tetrahydropthalimide derivatives with biological activity, particularly antinociceptive and antimicrobial effects, taking into consideration some parameters in structure-activity correlations. The imidic compounds were obtained by the reaction of 1,2,3,6-tetrahydropthalic anhydride with different substituted amines in ether, in order to obtain tetrahydropthalamic acids (1). Next, these acids were dehydrated with acetic acid under reflux, to obtain the corresponding tetrahydropthalimides (2). The compounds were characterized using spectroscopic methods (IR, H1NMR and 13C NMR). Pharmacological assays were carried out using different experimental models in mice, such as the writhing test (acetic acid-induced abdominal constrictions in mice), the formalin-induced pain test, the capsaicin-induced pain test, the glutamate-induced pain test and the hot-plate test. The minimal inhibition concentration (MIC) was evaluated by the dilution method, against the following pathogenic microorganisms: Candida albicans, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The results demonstrate that compound C2, obtained by structural modification of compound B7, was the most active compound tested, with calculated DI50 values of 27.9 (26.2 – 30.0) μmol/kg, ip, being about 5 fold-more potent than aspirin and acetaminophen. It also was active in the second phase of the formalin test, and against the capsaicin test. This compound was also active when orally administered, suggesting that it is absorbed by the gastrointestinal tract. All the compounds presented MIC values > 100 μg/mL. Keywords: tetrahydropthalimides; antinociceptive activity; antimicrobial activity
VIII
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 5
2.1. Objetivo Geral .......................................................................................................... 5
2.2. Objetivos Específicos ............................................................................................... 5
3. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 6
3.1. Imidas Cíclicas ......................................................................................................... 6
3.1.1. Ftalimidas .............................................................................................................. 8
3.1.1.1. Aspectos Químicos............................................................................................. 8
3.1.1.2. Aspectos Biológicos ......................................................................................... 12
3.1.1.3. Mecanismo de formação de imidas cíclicas ..................................................... 16
3.2. Imidas cíclicas X analgesia .................................................................................... 17
3.2.1. Perspectivas para o desenvolvimento de novos agentes analgésicos................ 19
3.3. Imidas cíclicas X ação antimicrobiana.................................................................... 19
3.4. Aspectos gerais sobre modificação estrutural e correlação entre estrutura química e
atividade biológica......................................................................................................... 23
4. METODOLOGIA........................................................................................................ 25
4.1. Síntese de 1,2,3,6-tetrahidroftalimidas................................................................... 25
4.2. Formação de derivados de imidas através da reação do anidrido 1,2,3,6-
tyetrahidroftálico com aminoácidos ............................................................................... 26
4.3. Reações de adição de radicais à dupla ligação imídica ......................................... 27
4.4. Purificação.............................................................................................................. 28
4.5. Caracterização ....................................................................................................... 29
4.6. Ensaios biológicos.................................................................................................. 29
4.6.1. Atividade antinociceptiva ..................................................................................... 30
4.6.2. Atividade antimicrobiana ..................................................................................... 33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ .35
5.1. Caracterização dos compostos .............................................................................. 35
5.2. Atividade antinociceptiva ........................................................................................ 48
IX
5.3. Atividade antimicrobiana ........................................................................................ 57
6. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 58
7. REFERÊNCIAS IBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 60
8. ANEXOS......................................................................................................................68
Índice de Figuras
Figura 1 ......................................................................................................................... 16
Figura 2 ......................................................................................................................... 17
Figura 3 ......................................................................................................................... 18
Figura 4 ......................................................................................................................... 25
Figura 5 ......................................................................................................................... 26
Figura 6 ......................................................................................................................... 31
Figura 7 ......................................................................................................................... 31
Figura 8 ......................................................................................................................... 34
Figura 9 ......................................................................................................................... 41
Figura 10 ....................................................................................................................... 42
Índice de Tabelas
Tabela 1 ........................................................................................................................ 39
Tabela 2 ........................................................................................................................ 46
Tabela 3 ........................................................................................................................ 49
Tabela 4 ........................................................................................................................ 57
Índice de Gráficos
Gráfico 1........................................................................................................................ 50
Gráfico 2........................................................................................................................ 51
Gráfico 3........................................................................................................................ 52
Gráfico 4........................................................................................................................ 53
X
Gráfico 5........................................................................................................................ 54
Gráfico 6........................................................................................................................ 55
Gráfico 7........................................................................................................................ 55
Gráfico 8........................................................................................................................ 56
Gráfico 9........................................................................................................................ 56
XI
1
1 INTRODUÇÃO
A síntese orgânica representa a vertente da Química Orgânica capaz de construir
moléculas, independente do seu grau de complexidade estrutural, explorando conceitos
fundamentais que regem o comportamento químico dos diferentes grupamentos funcionais, sendo
capaz inclusive de ordenar hierarquicamente esta reatividade de maneira a introduzir níveis de
seletividade comparáveis aos efetuados na natureza pelas enzimas (BARREIRO, 1991;
BARREIRO & FRAGA,2001).
Neste contexto, cabe mencionar que a síntese orgânica é a principal fonte de
medicamentos, correspondendo a cerca de 75% do total de fármacos disponíveis no mercado
farmacêutico (MENEGATTI et al., 2001). Porém, pode-se dizer que muitos destes fármacos são
oriundos de protótipos advindos de produtos naturais, especialmente de plantas, que têm, ao
longo dos anos, possibilitado a descoberta de inúmeras moléculas bioativas (LOZOYA, 1994;
CECHINEL FILHO & YUNES, 1998; PANDEY, 1998; CECHINEL FILHO, 2000; BUZZI et al,
2003; NEWMAN et al., 2003).
A Química Medicinal se dedica a estudar as razões moleculares da ação dos fármacos, a
relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica, incluindo o planejamento e o
desenho estrutural de novas substâncias que possuam propriedades farmacoterapêuticas úteis,
capazes de representar novos fármacos (WERMUTH et al., 1996). Esta tarefa complexa envolve
uma multiplicidade de fatores responsáveis pela resposta terapêutica de uma substância exógena,
i.e. fármaco, que precisa apresentar elevada eficácia, reflexo das propriedades farmacodinâmicas
(aquelas que regem as interações responsáveis pelo reconhecimento molecular do fármaco, pelo
biorreceptor, e resultam na resposta terapêutica desejada) e farmacocinéticas (aquelas que
governam os fatores de absorção, distribuição, metabolismo e eliminação do fármaco na biofase*,
resultando no perfil de biodisponibilidade), além de possuir reduzida toxidez. Face ao amplo
espectro de fatores envolvidos, resultado da complexidade dos sistemas biológicos, para conduzir
a termo esta tarefa, a Química Medicinal se caracteriza pela interdisciplinaridade (BARREIRO,
2001).•
• Os fatores que governam a biodisponibilidade dos fármacos na biofase são abreviados ADME (A = absorção; D = distribuição; M = metabolismo, e E = eliminação)
2
De fato, entre os principais alvos escolhidos pelos químicos orgânicos sintéticos ao longo
dos anos, encontram-se produtos cuja complexidade estrutural, potentes e diversificadas
atividades biológicas / farmacológicas, despertaram enorme interesse científico e medicinal,
como, por exemplo, os esteróides, as prostaglandinas, os antibióticos β-lactâmicos, substâncias
macrocíclicas com ação antibiótica e anti-câncer, entre outros exemplos (CORREIA et al., 2002).
A modificação molecular é o método mais usado e o mais compensador na obtenção de
medicamentos (FRANKE, 1984; MONTANARI, 1995; BARREIRO, 2001). Tal método
constitui um desenvolvimento natural da química orgânica, e consiste, basicamente, em tomar
uma molécula bem caracterizada, de ação biológica já conhecida, como modelo ou protótipo, e a
partir dela sintetizar e ensaiar novos compostos que sejam congêneres, homólogos, ou análogos
estruturais do medicamento matriz.
Por este motivo, muitas indústrias farmacêuticas desenvolvem estudos envolvendo a
análise da correlação existente entre a estrutura química e a atividade farmacológica destes
compostos sintéticos (MONTANARI, 1995; CECHINEL FILHO & YUNES, 1998; 2001).
Assim, muitas classes de compostos orgânicos em estudo têm demonstrado promissores
efeitos biológicos, sendo que a literatura científica relata um crescimento significativo de novas
moléculas com potência similar ou superior àquela requerida para um fármaco. Muitos deles
encontram-se em estudos pré-clínicos e clínicos avançados e pormenorizados. Entre estas
substâncias, pode-se inserir as imidas cíclicas e seus derivados (CECHINEL FILHO et al., 2003),
que são o alvo deste trabalho.
Face a necessidade de novos fármacos para o tratamento das mais variadas patologias, as
imidas cíclicas aparecem como prováveis moléculas líderes para o desenvolvimento de novos e
eficientes fármacos. No entanto, muito há de se progredir, principalmente em relação à eficácia
destes compostos em estudos clínicos e a determinação inequívoca do perfil toxicológico, bem
como a necessidade de elucidação dos mecanismos moleculares de ação envolvidos nas ações
biológicas dos mesmos (BUZZI et al., 2003).
Nos últimos anos, os estudos envolvendo a obtenção de novas imidas cíclicas com
potencial biológico/farmacológico, através de reações orgânicas, têm sido um constante objetivo
do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas / CCS / UNIVALI, em parceria com
distintas instituições de pesquisa, incluindo os Departamentos de Química e de Farmacologia da
UFSC. Desde 1988, quando se obteve um novo alcalóide de Phyllanthus sellowianus,
3
denominado Filantimida (1) (TEMPESTA et al., 1988), isolado da fração alcaloídica desta planta
(CALIXTO et al., 1984), muitos compostos análogos foram sintetizados e estudados sob os
aspectos biológicos (CECHINEL FILHO et al., 2003). Distintas maleimidas, succinimidas,
citraconimidas e compostos de estruturas relacionadas foram sintetizados, sendo que
demonstraram relevantes ações antiespasmódicas (CECHINEL FILHO et al.,1995), analgésicas
(CECHINEL FILHO et al., 1996b; CORRÊA et al., 1997; ANDRICOPULO, 1996; CORRÊA,
1997; CECHINEL FILHO et al., 1998; STIZ et al., 2000; CAMPOS et al.,2002), e
antimicrobianas (SAVI et al., 1998; CECHINEL FILHO et al., 1994 a,b; BELLA CRUZ et al.,
1996; CORRÊA et al., 1996; LOPEZ et al, 2000).
A Talidomida (2), que foi reconhecida pelo farmacologista Herbert Keller, da Ghemie
Grünenthal, como um análogo estrutural da glutetimida, é um grande exemplo desta classe de
compostos que vêm atraindo a atenção da comunidade científica nos últimos tempos, apesar dos
significativos efeitos adversos já evidenciados no passado, ocasionando cerca de 100% de
teratogenicidade, mesmo em doses clínicas modestas. Ela é uma ftalimido-glutarimida, que teve
inicialmente o seu perfil sedativo-hipnótico bem caracterizado (RANDALL, 1990). Sabe-se que
os recentes estudos evidenciam um possível uso desta substância para o tratamento de várias
patologias, incluindo o câncer . Segundo RIBEIRO et al. (2000), a talidomida age interferindo no
processo de angiogênese patológica, inibindo o crescimento e a proliferação celular em tumores,
e também, no retardamento da replicação do HIV, e no auxílio da perda de peso desordenada de
seus portadores, bem como de portadores do bacilo da tuberculose.
Considerando-se a importância químico-medicinal das imidas cíclicas e de seus
derivados, bem como os excelentes resultados encontrados e publicados até o presente momento,
pretendeu-se sintetizar compostos inéditos derivados da tetrahidroftalimida (3) através da
introdução de novos substituintes no anel imídico, no intuito de se obter compostos mais
potentes, e que possam ser visados como moléculas-protótipo para a síntese de novos e eficientes
fármacos. Além disso, procura-se analisar os compostos do ponto de vista farmacológico e
microbiológico, fazendo-se, quando possível, o emprego de métodos clássicos de correlação entre
estrutura química e atividade biológica.
4
A tetrahidroftalimida (3) foi selecionada devido alguns derivados cíclicos N-substituídos
da ftalimida (2.3-dihidrohalazina-1,4-diona, difenimida e N-fenilftalimida) apresentarem efeito
biológico de interesse medicinal (CECHINEL FILHO et al., 2003; BUZZI et al., 2003), e por ser
uma molécula modelo que permite a obtenção de vários derivados, conforme indicado no
esquema 1.
N
ON
(1) (2)
CH3 CH3
OO
O
N
O
O
HN
CH2CH2
N
O
O
R
R = Fenil, benzil, etc.
(3)
5
2 OBJETIVOS
2.1.Objetivo Geral
• Sintetizar diferentes tetrahidroftalimidas e analisar o efeito biológico destas substâncias
em diferentes modelos de nocicepção e em testes de ação antimicrobiana.
2.2.Objetivos Específicos
• Obter ácidos âmicos através de reações entre aminas e o anidrido cis-1,2,3,6-
tetrahidroftálico;
• Obter tetrahidroftalimidas a partir dos respectivos compostos intermediários (ácidos
âmicos), bem como a partir da síntese direta em refluxo;
• Obter derivados de adição de aminas à dupla ligação do anel tetrahidroftalimídico;
• Avaliar os compostos sintetizados em diferentes modelos farmacológicos de dor.
• Avaliar o potencial antimicrobiano dos compostos obtidos contra microorganismos
patogênicos aos seres humanos (Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus
aureus);
• Comparar a atividade dos compostos em estudo com a atividade de analgésicos e
antimicrobianos disponíveis no mercado farmacêutico.
6
3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1.Imidas Cíclicas
As imidas cíclicas são compostos orgânicos que contém o grupo –CO-N(R)-CO-, sendo R
um hidrogênio, grupo alquil ou grupo aril. Elas compreendem várias sub-classes, como as
maleimidas, succinimidas, glutarimidas, naftalimidas, ftalimidas, entre outras (BUZZI et al.,
2003). São bastante conhecidas por suas propriedades medicinais, incluindo ações sedativas,
hipnóticas, anticonvulsivantes, hipotensivas, diuréticas, analgésicas, bactericidas, fungicidas,
inseticidas, etc (CECHINEL FILHO et al., 2003). Algumas destas substâncias já se encontram
em uso na terapêutica, e outras emergem como possíveis candidatas a novos fármacos. Uma das
fortes razões para o progresso e continuidade dos estudos químicos e biológicos das imidas
cíclicas consiste na facilidade de obtenção, com bons rendimentos e rotas sintéticas exeqüíveis
(BUZZI et al., 2003).
Alguns derivados análogos do alcalóide natural filantimida (1) (TEMPESTA et al., 1988),
têm demonstrado potencial biológico, cujos efeitos são altamente promissores (CECHINEL
FILHO et al., 2003).
Algumas succinimidas (4), como as N-alquilfenilsuccinimidas e derivados, e maleimidas
(5), como as N-alquilarilmaleimidas, foram efetivas contra diferentes bactérias patogênicas aos
seres humanos, freqüentemente encontradas em infecções do trato urinário ou intestinal, como
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, etc (CECHINEL FILHO, 1994
a,b).
N(CH2)n
O
O
X
R
N(CH2)n
O
O
X
(4) (5)
n = 0-4
X = H, 4-Cl3, 4-Cl, etc.
7
Os resultados encontrados demonstram que, em geral, as maleimidas são cerca de 30
vezes mais ativas que as succinimidas, indicando que a dupla ligação no anel imídico é um fator
muito importante para a atividade biológica destes compostos (CECHINEL FILHO et al., 1994a;
1995a; 1996). Outras substâncias estruturalmente relacionadas com tal molécula, denominadas
citraconimidas (7), também foram capazes de inibir o crescimento destas bactérias (CORRÊA et
al., 1996; CORRÊA et al., 1997).
As maleimidas, como as N-alquilfenilmaleimidas e N-alquilarilmaleimidas, e
succinimidas, também foram eficazes contra vários fungos leveduriformes e miceliais,
causadores de distintas micoses em humanos, como Microsporum canis, Cândida albicans,
Penicillium, etc (CECHINEL FILHO, 1995a ; CECHINEL FILHO et al., 1996).
Substâncias estruturalmente relacionadas às maleimidas e succinimidas, mas contendo o
grupo sulfonil em posição 4- do anel aromático, foram descritas como potentes analgésicas no
modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (CORRÊA et al., 1997). Em um
estudo recente desenvolvido no NIQFAR, determinou-se que algumas N-aril-glutarimidas foram
efetivas contra processos dolorosos, verificados pelo modelo do ácido acético e da formalina,
ambos em camundongos (STIZ et al., 2000).
As dicloromaleimidas (6) apresentam consideráveis efeitos antibacterianos (BELLA
CRUZ et al., 1996) e analgésicos (ANDRICOPULO et al., 1998; CECHINEL FILHO et al.,
1998), servindo como protótipos para a introdução de novos compostos aromáticos na dupla
ligação imídica, particularmente fenóis substituídos ou distintas aminas (ANDRICOPULO,
1996). Tais compostos também apresentaram ação antibacteriana (CECHINEL FILHO et al.,
1994 a,b; BELLA CRUZ et al., 1996; CORRÊA et al., 1996), antifúngica (CECHINEL FILHO et
al., 1996 c; LOPEZ et al., 2000) e antiespasmódica (CECHINEL FILHO et al., 1995b), sendo que
se mostraram muito mais potentes que alguns analgésicos e antimicrobianos disponíveis no
mercado farmacêutico.
8
CH3
N(CH2)n
O
O
X
N(CH2)n
O
O
XCl
Cl
(6) (7)
n = 0-4
X = H, 4-Cl3, 4-Cl, etc.
3.1.1. Ftalimidas
3.1.1.1. Aspectos Químicos
A ftalimida pode ser preparada a partir do ácido âmico, o qual é formado pela agitação em
meio etéreo do anidrido ftálico com a amina apropriada, na proporção molar 1:1, cujo ácido
âmico formado é adicionado ao ácido acético e deixado em refluxo suave por 2 horas (Esquema
1) (ANDRICOPULO et al., 1998; BUZZI et al., 2003).
O
O
O
+
Anidrido ftálico
H2N R
Amina
éteragitação
OHNH R
O
OÁcido Âmico
CH3COOH
Refluxo
N
O
O
R
Imida
Esquema 1: Síntese de ftalimidas
9
Objetivando obter novos fungicidas e pesticidas, sintetizou-se uma variedade de derivados
benzenossulfonilados da N-fenilftalimida (8). Foi observado experimentalmente que dependendo
do grupamento X e das condições (solvente, temperatura), poderia ocorrer a abertura do anel
imídico, formando o composto (9).
Em estudos de investigações de reações de substituição nucleofílica ativadas pelo grupo
imídico, descobriu-se que compostos do tipo 4,5-dicloro-ftalimidas podem ser convertidos em
compostos do tipo 4-hidróxi-5-nitro-ftalimidas pela ação do nitrito de potássio, conforme
ilustrado no Esquema 2 (BUZZI et al., 2003).
Esquema 2: Conversão de 4,5-dicloro-ftalimidas em 4-hidróxi-5-nitro-ftalimidas
N
O
O
Y
SO2X
O
O
Y
SO2XXN
X = N3; NHN = C(CH3 2
Y = H; Cl
d1d2
)
(9)(8)
NCl
Cl O
O
R
4,5-dicloro-ftalimida
1) KNO2/DMF
Refluxo, 24hN R
O
OK +O-
O2N
4-hidróxi-5-nitro-ftalimida
2) H+/ H2O
40 - 94%
N
O
O
RHO
O2N
10
Visando obter compostos estruturalmente relacionados à talidomida (2) para posterior
avaliação da atividade anticonvulsivante dos análogos obtidos, foram sintetizados inúmeros
compostos. Para tanto, foi usado o anidrido ftálico como substrato na presença de amina
apropriada, em ácido acético sob refluxo, ocorrendo a ciclização direta do anel imídico em uma
única etapa (Esquema 3) (VOGEL, 1987; BUZZI et al., 2003).
O
O
OX
+
Anidrido ftálicoX = NO2 ; Cl; HY e Z = Grupos alquilas
Z
Y
NH2
Amina
CH3COOHrefluxo
N
O
OX
Z
YDerivado
Esquema 3: Síntese de imidas a partir do anidrido ftálico substituído e de aminas substituídas
Um novo método para sintetizar N-alquilftalimidas via alquilação da ftalmida na ausência
de solvente sob irradiação por microondas foi elaborado, a fim de se obter produtos com bons
rendimentos (49 – 95%) em tempo reduzido (4-10 minutos) (Esquema 4) . As reações foram
realizadas misturando a ftalimida com haleto de alquila adsorvido em carbonato de potássio.
(VOGEL, 1987; BUZZI et al., 2003).
NH
O
O
+
N-alquilftalimida
N
O
O
RX RK2CO3
microondas4-10 min49 - 95%ftalimida haleto de alquila
Esquema 4: Síntese de N-alquilftalimidas via alquilação da ftalimida em microondas
11
Antunes et al. (1998) também relataram o uso de um forno microondas para obter um
derivado da ftalimida (10), o qual foi diretamente preparado em bom rendimento (60%),
conforme ilustra o Esquema 5.
Esquema 5: Síntese direta de derivados da ftalimida por meio de microondas
Kamal et al. (1998) estudaram novas posibilidades para a síntese de ftalimidas N-
substituídas e tiveram grande êxito reagindo anidrido ftálico e azidas apropriadas em presença de
iodotrimetilsilano, formado “in situ”, obtendo-se as N-fenilftalimidas substituídas em excelentes
rendimentos após poucos minutos de reação (Esquema 6).
Esquema 6: Síntese de ftalimidas N-substituídas por meio de reação direta do anidrido ftálico
com azidas em iodometilsilano.
O
O
O
+ NH2CH2COOHmicroondas
30 min60%
anidrido ftálico amina d3
N
O
O
CH2COOH
(10)
R+ N3 RO
O
O
anidrido ftálico azida
TMSCl, NaI
CH3CNN
O
O
a. R = Cl, 15 min., rend. = 95%b. R = OCH3, 15 min., rend. = 95%
ftalimida
12
3.1.1.2. Aspectos Biológicos
Algumas ftalimidas cíclicas provenientes de alquil éteres, tioéteres, sulfóxidos e sulfonas
exerceram atividade hipolipidêmica em ratos. Já os derivados cíclicos N-substituídos da
ftalimidas, particularmente os compostos 2,3-dihidrohalazina-1,4-diona (11) e difenimida (12)
reduziram os níveis séricos de ácido úrico em camundongos hiperúricos, através da inibição da
atividade enzimática da xantina dehidrogenase e xantina oxidase (CECHINEL FILHO et al.,
2003; BUZZI et al., 2003).
N
N R
O
OHR = -CH2CH2OCH3; etc.
NH
O
O
(11) (12)
Derivados da N-fenil-ftalimida (13) apresentaram atividades anticonvulsivantes similares
à da fenitoína e da carbamazepina. Tal composto e alguns derivados apresentaram também
atividade antibacteriana contra bactérias patogênicas, porém o efeito foi menos pronunciado
quando comparado com os derivados da maleimida e 3,4-dicloromaleimida (CECHINEL FILHO
et al., 2003). O
N
O
(13)
Komoda et al. (2001) demonstraram que alguns derivados ftalimídicos apresentam perfil
inibidor de aminopeptidases, alguns deles, como o (14), com potencial anticâncer, inibindo o
processo de metástase tumoral.
13
N
O
O
(14)
Alguns estudos confirmaram os efeitos analgésicos de derivados da ftalimida,
especialmente o composto (15), que foi cerca de 50 vezes mais potente do que a aspirina no
modelo de nocicepção induzida por ácido acético, em camundongos, atuando ainda na segunda
fase (dor de origem inflamatória) do teste da formalina (ANTUNES et al., 1998; BUZZI et al.,
2003).
O
O
CH2 N
N
ON
(15)
Uma série de ácidos derivados de ftalimidas foi sntetizada, cujos compostos foram
avaliados como antagonistas do receptor leucotrieno D4. A tetrazolftalimida LASSBio 552 (16),
foi capaz de inibir a atividade contrátil induzida por 100nM de LTD4 em tiras de traquéia de
cobaia com IC50 igual a 31.2 mM (LIMA et al., 2002; BUZZI et al., 2003).
O
O
N
OX OH
O
NN
NN
tetrazolftalim
X = (CH2)3
ida LASSBio 552(16)
14
Segundo RANDALL, 1990, a talidomida (2) é uma ftalimido-glutarimida que teve,
inicialmente, o seu perfil sedativo-hipnótico bem caracterizado. Em 1957, a talidomida foi
comercializada como fármaco sedativo-hipnótico, amplamente vendido em países europeus,
asiáticos e americanos, tornando-se o medicamento mais vendido na Alemanha Ocidental para o
tratamento da insônia. Entretanto, a importância da configuração absoluta na atividade biológica
desta substância permaneceu obscura até a década de 60, quando ocorreu a tragédia decorrente do
uso de sua forma racêmica, indicada para redução do desconforto matinal em gestantes,
resultando no nascimento de cerca de 12000 crianças com deformações congênitas.
Posteriormente, o estudo do metabolismo da talidomida permitiu evidenciar que o enantiômero
(S) era seletivamente oxidado, levando à formação de espécies eletrofílicas reativas do tipo
areno-óxido, que reagem com nucleófilos bio-orgânicos, induzindo teratogenicidade, enquanto o
antípoda (R)era responsável pelas propriedades sedativas e analgésicas (BARREIRO & FRAGA,
2001).
Quatro anos mais tarde, em 1965, o médico israelita Jacob Sheskin prescreveu a
talidomida como sedativo em pacientes leprosos, observando fortuitamente acentuada redução da
dor e do processo inflamatório associado ao leproma, identificando as propriedades
antiinflamatórias, até então desconhecidas. Em meados de 1991, a Drª Gilla Kaplan e
colaboradores, da Universidade de Rockefeller, em Nova York, constataram a participação da
talidomida na inibição seletiva do Fator de Necrose Tumoral α (FNTα), quando expressa em
quantidade superior àquela necessária à manutenção do sistema imunológico normal, denotando,
portanto, o potencial imunorregulador da mesma (RIBEIRO et al., 2000).
Em estudos mais recentes, demonstrou-se que a talidomida age interferindo no processo
de angiogênese patológica, inibindo, desta forma, o crescimento e a proliferação celular tumoral,
demonstrando, portanto, o seu potencial anti-cancerígeno (BUZZI et al., 2003). Recentes testes
também demonstraram que a talidomida interfere no retardamento da replicação do HIV, e no
auxílio da perda de peso desordenada de seus portadores, bem como de portadores do bacilo da
tuberculose (BARREIRO et al., 2001).
Em um estudo piloto, envolvendo pacientes com falha congestiva do coração, tratados
com talidomida, o resultado foi um decréscimo nos níveis de FNTα e aumento da performance
cardíaca. Embora poucos pacientes tenham sido incluídos, os resultados sugerem que a
15
talidomida deve ser melhor estudada como um agente imunomodulador em falha congestiva do
coração (GULLESTAD et al., 2002).
Recentemente, Hashimoto (2002) observou que a efetividade e o potencial da talidomida
para o tratamento de várias doenças não pode ser atribuído unicamente à sua atividade de
produção e regulação do FNTα. A talidomida deve ser reconhecida como um fármaco multi-alvo,
agindo sobre o receptor nuclear androgênio (AR), a timidina fosforilase/plaquetas derivadas do
fator de crescimento celular endotelial (TP/PD – ECGF), a dipeptidil peptidase (DPP – IV), a
aminopeptidase sensível a puromicina, e α-glucosidase.
Mais recentemente, também observou-se que a talidomida possui atividade inibitória
sobre a COX-2, embora sua atividade seja mais fraca quando comparada ao ácido acetil
salicílico. Algumas modificações estruturais na talidomida deram origem a análogos que exercem
uma inibição altamente seletiva sobre a COX-2 (NOGUCHI et al., 2002; BUZZI et al., 2003).
Isoardo e colaboradores (2004) sugeriram, através de um estudo em pacientes com
mieloma múltiplo, nos quais foi administrada talidomida (a qual desenvolve uma neuropatia
sensorial como efeito adverso), que este fármaco pode induzir tanto uma neuropatia axonal dose-
dependente, como, menos freqüentemente, reverter 50% dos casos a uma gangliopatia sensorial.
Administrando-se baixas doses de talidomida em pacientes com mielofibrose com
metaplasia mielóide (MMM), demonstrou-se que o fármaco apresentou um perfil toxicológico
aceitável, promovendo uma diminuição das citopenias e esplenomegalias decorrentes do quadro
clínico (MARCHETTI et al., 2004).
Estudos recentes demonstraram que a talidomida, quando administrada em pacientes com
mieloma múltiplo, diminui significativamente a angiogênese, o que sugere que esta é um alvo
terapêutico relevante na Leucemia mielóide (KUMAR et al., 2004).
Demonstrou-se, também, que a administração de talidomida causou uma redução
significativa das lesões em pacientes com sarcoma cutâneo, sendo bem tolerada em baixas doses,
com os sintomas nasofaríngeos, neurológicos, pulmonares e hepáticos atenuados (NGUYEN, et
al., 2004).
Além das propriedades citadas, muitos outros efeitos benéficos relevantes e promissores
têm sido relatados para a talidomida, tornando-a uma molécula-líder para o futuro
desenvolvimento de novos fármacos (LIMA ert al., 2001; MIYACHI et al., 1997; BOUSVAROS
e MUELLER, 2001; HASHIMOTO, 2002; BUZZI et al., 2003).
16
Considerando-se os promissores efeitos biológicos descritos anteriormente para várias
classes de imidas cíclicas, é de interesse a busca por novas moléculas, com maior seletividade e
efetividade. Assim, os compostos mais relevantes obtidos no presente estudo poderão ser
selecionados para uma análise mais detalhada quanto aos seus efeitos biológicos. Além disso, os
mesmos poderão também ser utilizados futuramente como modelos a serem aproveitados por
indústrias de fármacos, ou ainda para a elaboração de novos e importantes projetos de pesquisa.
O
OH
R NH
O
N
O
O
R'
N R
O
O
R
Ácido Âmico Tetrahidroftalimida Derivados
R = R´= -CH3, -CH2CH3,
Y Y
2 , CH
Y = H, 4-Cl, 4-CH3, etc.
Figura 1: Compostos que foram sintetizados no presente estudo.
3.1.1.3. Mecanismo de formação de imidas cíclicas
Conforme observado na figura 2, o mecanismo de formação ocorre de maneira
concertada, ou seja, simultânea. Inicialmente ocorre o ataque nucleofílico do grupo amino à
carbonila do anel imídico, devido ao fato do carbono da dupla ligação ser muito polarizado, tendo
carga parcial positiva. Desta forma, permite-se a entrada do nucleófilo, e, conseqüentemente, a
ruptura do anel através da saída de uma molécula de H2O, formando, assim, a imida cíclica.
17
H2N R+ C
CO
O
O
A
C
CO
O
O
AN R
H
H
C
O
OR
O
AC N R
H
C
CN
O
R
O
A + H2O
Figura 02. Mecanismo de formação de imidas cíclicas. 3.2.Imidas Cíclicas X Analgesia
O controle da dor é uma das indicações mais importantes a que se destinam os
medicamentos (RANG et al., 1997).
Testadas “in vivo”, as N-arilalquil-maleimidas e succinimidas, análogas da filantimida
apresentaram importante atividade analgésica, além de antiespasmódica (CECHINEL
FILHO,1995 a; CECHINEL FILHO et al., 1995b;1996b). Alguns análogos da filantimida
(TEMPESTA et al., 1988) também apresentaram atividade analgésica, sendo demonstrada através
de estudo de correlação estrutura-atividade, utilizando-se o modelo de Topliss (CECHINEL
FILHO, et al., 1996b).
Derivados da glutarimida, dicloromaleimida, além de compostos obtidos pela associação
de maleimidas e antipirina (Figura 3) apresentaram bons resultados analgésicos, no teste de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, intraperitonialmente, em camundongos
(CECHINEL FILHO et al., 1998).
18
Igualmente para os derivados da Naftalimida e da Bis-Naftalimida e para as 3,4-
dicloromaleimidas (ANDRICOPULO et al., 1998).
N
O
O
CH3
CH3
CH2CH2
X
N(CH2)n
O
O
XCl Cl (b)
(a)
N
O
O
N
N
CH3
O
CH3
Figura 3: Derivados da glutarimida (a);
dicloromaleimida (b); maleimida/antipirina (c). (c)
Ribeiro e colaboradores (2000) demonstraram que a talidomida apresenta potente efeito
analgésico em vários modelos de dor, cujo mecanismo parece estar associado à inibição da
produção do Fator de Necrose Tumoral α (FNT-α), não atuando sobre o Sistema Nervoso
Central.
Tem-se, também, registros que confirmam os efeitos analgésicos de derivados da
ftalimida, que foram cerca de 50 vezes mais potentes do que a aspirina no modelo de dor
induzida por ácido acético, em camundongos, atuando ainda na segunda fase (dor de origem
inflamatória) do teste da formalina (ANTUNES et al., 1998).
Estudos recentes demonstraram que imidas cíclicas obtidas a partir da aminofenazona
(CAS 58-15-1,4-aminoantipirina) e diferentes anidridos, exerceram atividade analgésica em
camundongos, sendo que a N-antipirina-3,4-dicloromaleimida se destacou, por apresentar o
maior percentual de inibição das contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongos (99,0±0,3%), quando administrado por via intraperitoneal, sendo cerca de 12 a 15
vezes mais ativo que fármacos usualmente comercializados (AAS, Paracetamol e Dipirona).
Quando administrado por via oral no modelo do ácido acético, o composto apresentou um efeito
analgésico bastante pronunciado, reduzindo em 80% o número de contorções abdominais
(CAMPOS et al., 2002).
19
3.2.1. Perspectivas para o desenvolvimento de novos fármacos com efeito analgésico
Nas últimas décadas houve uma mudança radical na forma com que os químicos e
farmacólogos buscam substâncias mais eficazes para o combate à dor (CALIXTO et al., 2000).
Graças à descoberta e elucidação das estruturas dos nocireceptores, hoje se conhece bem o alvo.
Sabe-se também os diversos caminhos fisiológicos associados à propagação da dor. Por isso, a
meta atual da indústria farmacêutica é o desenvolvimento de inibidores ou antagonistas que
podem se ligar diretamente aos nociceptores. E, paralelamente, o desenvolvimento de inibidores
de enzimas associadas a processos fisiológicos da propagação da dor mais seletivos e eficazes.
Outra inovação é a preocupação sobre a estereoquímica dos novos analgésicos. Como a estrutura
dos sítios ativos dos nociceptores já é conhecida, sabe-se quais são os enantiômeros que possuem
atividade. Além disso, ainda há o advento de sistemas de drug delivery, mais especificamente
CNS drug delivery, isto é, sistemas de liberação controlada de fármacos no SNC **.
Com o objetivo de se ter fármacos de maior potência, oferecendo menor toxicidade e
menos efeitos colaterais, é que a química medicinal atua de forma a promover a síntese racional
de fármacos, de forma a modificar as estruturas moleculares de protótipos, para, então, aplicar
métodos de correlação estrutura química - atividade farmacológica desejada, tendo-se, desta
forma, a otimização do potencial fármaco (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
3.3. Imidas Cíclicas X Ação Antimicrobiana
Segundo ANDRICOPULO et al., 1998, algumas 3,4-dicloromaleimidas, apresentaram
efeitos contra bactérias (E. coli e S. aureus), produzindo halos de inibição ligeiramente menor
que os antibióticos tetraciclina e ampicilina, usados como padrões para comparação. Este efeito
antibacteriano sugere que à distância entre o anel imídico e o anel aromático estabelecida por um
grupo metileno parece ser um fator estrutural importante, fato que precisa ser confirmado pela
determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima). O decréscimo dos halos de inibição com
a variação dos grupos substituintes do anel aromático, sugere a influência de fatores eletrônicos
** Maiores detalhes podem ser encontrados no site (www.qmcweb.matrix.com.br).
20
pela introdução de grupos polares, particularmente conjugados ao sistema imídico, assim como,
pela influência de fatores estéricos na interação destas moléculas com o receptor biológico.
Estudos realizados com N-alquilfenil-3,4-diclomaleiminidas (17) demonstraram que a
introdução de dois átomos de cloro na dupla ligação do anel imídico não aumentou
significativamente a atividade contra fungos testados. Recentemente, estes compostos foram
testados contra diferentes fungos patogênicos, comprovando que a atividade dos compostos
realmente cresce com o aumento da distância entre o anel imídico e o anel aromático (LÓPEZ et
al., 2000; WILLIAMS & LEMKE, 2002).
NCl
Cl
O
O
(CH2)n
n = 0-4
(17)
Algumas N-arilmaleimidas (18) foram testadas contra diferentes microorganismos, a fim
de avaliar suas atividades antifúngicas, observando que alguns compostos apresentaram um efeito
inibitório maior que o cetoconazol, um antifúngico de amplo espectro utilizado na terapêutica
(WILLIAMS & LEMKE, 2002; BUZZI et al., 2003).
X = 4-Cl; 4-OCH3; 4-CH3;4-NO2; 4-Br; 4-CH2CH3; 3,4-(CH3)2;4-Cl
N
O
O
X
(18)
As 3,4-dicloroalquilarilmaleimidas (19) e 3-cloro-4-y-alquilarilmaleimidas (20)
apresentaram atividade contra S. aureus e E. coli, demonstrando efeitos biológicos promissores,
uma vez que todos os compostos foram efetivos contra ambos os microorganismos, alguns deles
com resultados ligeiramente menores que os antibióticos tetraciclina e ampicilina (WILLIAMS &
21
LEMKE, 2002; BUZZI et al., 2003). A substituição do átomo de cloro por grupamentos não
planares, como os anéis piperidínico ou morfolínico, levou a compostos totalmente inativos.
Entretanto, a introdução de sistemas rígidos, porém mais planares, como fenóxidos, forneceram
compostos que apresentaram ação antibacteriana comparável à apresentada pelas
dicloromaleimidas (BELLA CRUZ et al., 1996; ANDRICOPULO et al., 1998).
NCl
Cl
O
O
(CH2)n
3,4-dicloroalquilarilmaleimidas
n = 1 - 2X = H; 4-OCH3; 4-Cl; 3,4-Cl2; 4-CH3; 4-NO2
X
N
O
O
(CH2)nX
Cl
Y
X = n = 1 - 2
H; 4-Cl; 4-OCH3 ; 4-CH3; 4-NO2; 3,4-(Cl)2; etc.
N O N OZ
Y = ; ;
Z = 4-CH2CH3; 4-Br; 4-NO2
(19)
(20)
AQUINO et al. (2003), ao testar diferentes 3,4-dicloromaleimidas contra alguns
dermatófitos, constataram que a 3,4-dicloro-N-fenilpropilmaleimida (21) mostrou-se mais
eficiente, apresentando uma CIM de 12,5μg/mL, inibindo o crescimento de 17 cepas (85%) dos
gêneros Microsporum e Trichophyton, sendo a média dos halos de inibição 17mm de diâmetro.
Já a 3,4-dicloro-N-fenil-maleimida (22), até a concentração de 25μg/mL, produziu atividade
antifúngica sobre o crescimento de 16 cepas (80%) do gênero Trichophyton, sendo que a média
dos halos de inibição foi de 15mm de diâmetro.
N
O
O
Cl
Cl
CH2CH2CH2 N
O
O
Cl
Cl
(21) (22)
22
A N-fenil-ftalimida (13) e compostos relacionados apresentaram atividade antibacteriana
contra bactérias patogênicas, porém o efeito foi menos pronunciado quando comparado com os
derivados da maleimida e 3,-dicloromaleimida (CECHINEL FILHO et al., 1995; BELLA CRUZ
et al., 1996; ANDRICOPULO et al., 1998).
Algumas citraconimidas (23) foram capazes de inibir o crescimento de bactérias
patogênicas como E. coli, S. aureus e Salmonella typhimurium. Em geral, a clorosulfonação do
anel aromático não afetou significativamente a atividade antibacteriana (CORRÊA et al., 1996).
Contudo, foi possível observar que os compostos não substituídos e contendo o anel aromático
conjugado ao anel imídico ou separado por apenas um grupo metileno, produziram uma boa
atividade, enquanto que os compostos que possuem dois grupos metileno separando o nitrogênio
imídico do anel aromático não apresentaram atividade antibacteriana em ensaios de difusão
(CORRÊA et al., 1996).
citraconimidas
N
O
OCH3
(CH2)n
X = H; 4-SO2Cl; 4-SO2C6H5;4-SO2NHC6H5-(4)Br; 4-SO2NHC6H5-(4)CH3n = 0-2
X
(23)
As succinimidas (24) apresentaram, em geral, atividade antimicrobiana inferior àquela
observada para as maleimidas. Tais estudos permitiram evidenciar a importância da dupla ligação
do anel imídico na atividade antifúngica (CECHINEL FILHO et al., 2003).
N
O
O
(CH2)n
R = (CH3)2N-; (CH3CH2)2N-; C6H5NH-n = 0-4
H
R
(24)
23
LOPEZ et al (2003) demonstraram que novas succinimidas N-aril-alfa,beta-substituídas
apresentaram atividade contra uma série de dermatófitos de relevância clínica. Entre estes
compostos, destacou-se a 7-tia-2-azabiciclo[2,2,1]hept-2-em-3-amino[5,6-c]succinimida, que foi
o melhor inibidor do fungo Trichophyton rubrum, o maior agente etiológico de todas as infecções
produzidas por dermatófitos. Em contraste, as succinimidas contendo um substituinte N-(p-
sulfonilfenil), somente inibiram o Epidermophyton floccosum, sendo todos compostos ativos
possuindo um grupo oxabiciclo em posições alfa, beta da imida. A presença de substituintes no
grupamento oxabiciclo foram importantes para a atividade. Considerando-se o mecanismo de
ação, a N-(p-N´-4-metóxifenilsulfamoilfenil)-8-oxabiciclo[2,2,1]hept-4-em-3-metil[5,6-
c]succinimida produziu um halo de inibição manchado no ensaio com Neurospora crassa,
sugerindo que ela age através da inibição da síntese ou da construção da parede celular fúngica.
3.4. Aspectos gerais sobre modificação estrutural e correlação entre estrutura química e
atividade biológica
A fim de se otimizar a atividade de compostos biologicamente ativos, pode-se utilizar
procedimentos químicos que envolvem modificações moleculares, e dependendo dos grupos
reativos, muitas mudanças podem ser feitas. Na primeira etapa da modificação molecular,
procura-se introduzir grupos que alterem a hidrofobicidade do composto em estudo, ou grupos
doadores e/ou aceptores de elétrons, permitindo posteriormente a aplicação de algum método
qualitativo ou quantitativo, de correlação entre a estrutura química e a atividade biológica
(BARREIRO, 1991; CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
As modificações produzidas pela introdução de um substituinte podem atingir várias
propriedades físico-químicas da molécula, tais como: hidrofobicidade, densidade eletrônica,
conformação estrutural e propriedades farmacocinéticas, entre outros, cuja análise poderá orientar
as sínteses a serem seguidas (CECHINEL FILHO & YUNES, 2001).
Sabe-se que a substituição de um átomo de H por um determinado substituinte (grupo
alquila, grupo nitro, grupo ciano, grupo carboxilato, halogênio, etc) pode modificar
profundamente a potência, duração e ainda natureza do efeito farmacológico de uma molécula.
Os estudos de correlação estrutura-atividade, fundamentados no efeito do substituinte em um
24
determinado anel aromático, são muito comuns na química medicinal, uma vez que mais de 50%
dos fármacos ou compostos bioativos possuem este tipo de anel (CECHINEL FILHO, 1995;
CECHINEL FILHO & YUNES, 2001).
Na química medicinal, a otimização das estratégias de sínteses são importantes para obter
os melhores resultados e para diminuir os custos. Por isto, uma boa estratégia permitirá conseguir
um grupo de teste importante para realizar um tratamento quantitativo da relação estrutura-
atividade (CECHINEL FILHO et al., 2001).
Objetivando promover um planejamento racional de novas moléculas ativas, foram
desenvolvidos vários métodos de correlação estrutura-atividade. A aplicação destes métodos
auxilia na predição de qual novo grupo ou átomo pode ser introduzido em determinada molécula
para torná-la mais ativa. As indústrias farmacêuticas utilizam, com maior freqüência , o método
desenvolvido por Hansch e colaboradores. Este método procura relacionar a atividade biológica
com as propriedades físico-químicas das moléculas em estudo: a hidrofobicidade (π), fatores
eletrônicos (δ) e estéricos (Es), valores estes tabelados (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
Várias estratégias foram desenvolvidas para compreender os mais diversos parâmetros físico-
químicos numa pequena série de compostos ou grupo de teste. Entre estas, podemos indicar os
métodos de Topliss, Hansch e Leo, Craig, PPC (principais propriedades de substituintes), etc.
(CECHINEL FILHO & YUNES, 2001).
25
4 METODOLOGIA
4.1. Síntese de 1,2,3,6-tetrahidroftalimidas
Seguindo-se a rota sintética 1 (Figura 4), o anidrido cis-1,2,3,6-tetrahidroftálico foi
dissolvido em éter etílico sob agitação, a amina foi adicionada aos poucos, em quantidades
equimolares, para a obtenção dos respectivos ácidos 1,2,3,6-tetrahidroftalâmicos. Em seguida,
estes foram filtrados e lavados, durante a filtração, com éter gelado. Após, ocorreu a secagem em
dessecador contendo sílica, por 24 horas.
Este ácido foi então colocado em refluxo, com ácido acético glacial (agente desidratante),
durante um período de 1,5 a 2 horas, e vertido sobre banho água-gelo, precipitando a 1,2,3,6-
tetrahidroftalimida correspondente.
+ RNH2
Amina
Éter
Agitaçăo
Anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico Ácido 1,2,3,6-tetrahidroftalâmico
RS1 RefluxoÁcido Acético Glacial
1,2,3,6-tetrahidroftalimida
O
O
O
OHNHR
O
O
N
O
O
R
Figura 4: Rota Sintética n° 1 (RS1).
Os ácidos 1,2,3,6-tetrahidroftalâmicos que não se formaram imediatamente sob agitação,
e as 1,2,3,6-tetrahidroftalimidas que não precipitaram com o choque térmico, foram
acondicionadas em geladeira.
Após esta operação, filtraram-se os compostos que precipitaram. As 1,2,3,6-
tetrahidroftalimidas que não precipitaram, foram submetidas a uma extração com clorofórmio.
26
No caso de algumas imidas, ocorreu à formação de massa pastosa ou oleosa, a qual foi
solubilizada em solvente orgânico volátil, seca com sulfato de sódio anidro, e filtrada, e posterior
evaporação do solvente, obtendo-se assim, um sólido amorfo, posteriormente realizando-se
processo de purificação (COSTA & PASZCUK, 2000).
Seguindo-se a rota sintética 2 (Figura 5), o anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico e
quantidades equimolares da amina reagente foram submetidas a refluxo direto com ácido acético
glacial, durante um período de 1,5 a 2 horas. Após o término deste, o produto foi vertido sobre
banho água-gelo, precipitando a 1,2,3,6-tetrahidroftalimida correspondente.
Quando não ocorreu precipitação das imidas, as mesmas foram submetidas a um
procedimento idêntico ao descrito para a rota sintética 1 (COSTA & PASZCUK, 2000).
RS2Refluxo (2h)
Ácido Acético Glacial+ RNH2
Anidridocis-1,2,3,6-tetrahidroftálico
Amina
1,2,3,6-tetrahidroftalimida
O
O
O
N
O
O
R
Figura 5: Rota sintética n° 2 (RS2). 4.2. Formação de derivados de imidas através da reação do anidrido 1,2,3,6-
tetrahidroftálico com aminoácidos
O composto C1 foi sintetizado reagindo-se o anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico com o
aminoácido glicina em refluxo com 5ml de tolueno, 0,2 ml de trietilamina e 2g de sulfato de
sódio anidro por duas horas. Após o refluxo, verteu-se a mistura em 50ml de água e 1ml de HCl,
num banho água – gelo. Como não houve precipitação do produto após o choque térmico, a
mistura foi deixada sob agitação por 30 minutos. Não tendo havido precipitação, deixou-se a
mistura em geladeira por 24 horas. Após este período, o produto precipitou, e foi filtrado, sendo
seco em seguida em dessecador.
27
O
O
O
+ NH2CH2COOHglicina
Anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico
Tolueno (5mL)
+ Trietilamina (0,2 mL)
Refluxo (2h)
Sulfato de Sódio anidro (2g)
Banho água / gelo50mL H2O + 1mL HCl
Agitação - 30 minou Geladeira 24h
PPTOU ?
SIMFiltrar
NÃO
N
O
O
CH2COOH
N-glicino-tetrahidroftalimida - C1
4.3. Reações de adição de radicais à dupla ligação imídica
Reagiu-se 1 mol do composto B7 com 1 mol de Morfolina em 20mL de benzeno sob
agitação a 60°C, até a precipitação do produto. Desta forma, formou-se um derivado (C2), através
da quebra da dupla ligação do anel imídico, e da adição do grupamento morfolino a um dos
carbonos da mesma. Após a precipitação do produto, este foi filtrado, e logo após, seco em
dessecador.
Morfolina
+ O NHBenzeno
Derivado C2
N
O
O
CH2
B7
N
O
O
CH2
O
N
Agitação
28
Reagindo-se 1 mol do composto B7 com 1 mol de Piperidina em 20 mL de Benzeno sob
agitação, a 60°C, formou-se, da mesma maneira, um derivado de adição à dupla ligação do anel
tetrahidroftalimídico (C3), o qual, após a precipitação, foi submetido aos mesmos procedimentos
descritos acima para o composto C2.
+ NHBenzeno
Piperidina Derivado C3
N
O
O
CH2
B7
N
O
O
CH2
N
Agitação
4.4. Purificação
Todas as reações de síntese foram monitoradas através de Cromatografia de Camada
Delgada, utilizando-se placas de silicagel Merck 60 F 254 pré-revestidas, com espessura de 200
μm, em base de alumínio, as quais foram visualizadas através de luz UV (ondas curtas).
Os produtos obtidos que apresentaram impurezas ou produtos laterais indesejáveis, foram
submetidos à purificação por Cromatografia de Coluna, utilizando empacotamento em sílica
Merck 60 (70-230 mesh-ATMS), sendo as amostras sólidas solubilizadas em solventes voláteis e
misturados a porções da silicagel. Após a evaporação do solvente, as amostras foram depositadas
no topo da coluna cromatográfica, à qual, em seguida, recebeu a mistura eluente (método do
empastilhamento) (COSTA & PASZCUK, 2000).
Em todos os procedimentos cromatográficos utilizou-se diferentes gradientes do sistema
de solventes hexano : acetato de etila, atingindo diversas polaridades, e em alguns casos,
diferentes gradientes do sistema CHCl3 : MeOH. Os solventes utilizados foram adquiridos
comercialmente.
Algumas aminas reagentes necessitaram de purificação através de recristalização com
solventes usuais.
Os produtos obtidos na forma oleosa foram purificados através de extração com
clorofórmio.
29
4.5. Caracterização
A caracterização dos compostos sintetizados neste estudo foi feita através da medida do
ponto de fusão, por espectroscopia no infravermelho (IV) e por ressonância magnética nuclear de
Hidrogênio (RMN1H).
A medida dos pontos de fusão foi feita em aparelho Microquímica APF-301, no
Laboratório de Química da UNIVALI.
Os Espectros de IV dos compostos foram obtidos em espectrofotômetro por Transformada
de Fourier (FT-IR), Bomem MB-100, no Laboratório de Instrumentação Analítica da UNIVALI,
sendo obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1).
Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H foram obtidos em espectrômetro de
RMN1H, no Departamento de Química da UFSC, e no Departamento de Química da UFPB.
4.6. Ensaios biológicos
Foram realizadas análises quanto à atividade analgésica e atividade antimicrobiana.
As análises da atividade analgésica foram realizadas no Laboratório de Pesquisa em
Farmacologia da UNIVALI, sob a supervisão das professoras Márcia Maria de Souza e Fátima de
Campos Buzzi, com a participação das mestrandas Juliana Vargas Ardenghi e Juliana Bernardon
Pretto, do Mestrado em Ciências Farmacêuticas, vinculadas ao Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticos (NIQFAR), da UNIVALI, e de acadêmicos do curso de Farmácia vinculados ao
Programa PI/PG, da UNIVALI. A avaliação do efeito antimicrobiano foi realizada nas
dependências do Laboratório de Microbiologia do Curso de Habilitação em Análises Clínicas da
UNIVALI, pela equipe do Prof. Alexandre Bella Cruz, com a participação da mestranda Juliana
Pretto, do Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI.
30
4.6.1. Atividade antinociceptiva
a) Teste das Contorções Abdominais induzidas por Ácido acético 0,6% em camundongos
(writhing test)
A atividade dos compostos foi analisada através do modelo de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético, em camundongos, administrado intraperitonealmente.
Foram utilizados camundongos “swiss” machos (25-30g), previamente mantidos sob
temperatura controlada (23 ± 2 oC) e iluminação em ciclo de 12 horas com ração e água “ad
libitum”.
A resposta nociceptiva foi induzida utilizando-se o chamado “writhing test”
administrando-se ácido acético (0,6%) intraperitonealmente (i.p.). Basicamente, as contorções
consistem na contração da musculatura abdominal, juntamente com a extenção de uma das patas
posteriores de acordo com os métodos já descritos na literatura (COLLIER et al., 1968;
BENTLEY et al., 1981; SANTOS et al., 1995 a,b; MULÉ et al., 1983), como pode ser observado
nas Figuras 6 e 7.
Os animais foram pré-tratados inicialmente com os compostos em análise, por via
intraperitoneal, na dose desejada (10 mg/kg, etc.) antes da injeção de ácido acético. O grupo
controle recebeu volume semelhante de uma solução de salina (NaCl 0,9%). Os animais foram,
então, colocados individualmente em funis invertidos, e as contorções indicativas de dor foram
quantificadas, cumulativamente, durante um período de 20 minutos. O efeito analgésico foi
avaliado em função da inibição das contorções comparando-se ao grupo controle.
A partir desses resultados, foi calculado a DI50 para os compostos mais ativos (B7 e C2), a
qual significa a dose que inibe 50% das contorções abdominais.
31
Fig. 6
Fig. 7
Figuras 6 e 7: Ilustração da resposta nociceptiva em camundongo pelo modelo de dor induzida
pelo ácido acético 0,6%.
b) Modelo de dor induzida por Formalina
Neste teste, foram empregados camundongos machos adultos (25-30g), que receberam,
por via oral, os tratamentos com o veículo, o composto em estudo, e droga padrão (aspirina 100
mg/kg em carboximetilcelulose a 2,5%). 30 ou 60 minutos após, os animais foram ligeiramente
anestesiados com éter, e 20 μL de formalina 2,5% (0,92% de formaldeído), preparada em
solução salina tamponada (PBS), foi injetada na região subplantar, na pata direita. O mesmo
volume de PBS foi injetado na pata esquerda do animal.
Os animais foram colocados em um cilindro de vidro (20 cm de diâmetro), circundado
por espelhos, para facilitar a observação do comportamento nociceptivo. Logo após a injeção da
formalina, o número de vezes que os animais lambem (licking) ou mordem a pata injetada com
formalina foi quantificado (em segundos), durante 30 minutos após a injeção, sendo esse tempo
considerado como indicativo de dor (HUNSKAAR e HOLE, 1987; MURRAY et al., 1988; DE
SOUZA et al., 2003).
32
Ao final do tempo de observação, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e as patas posteriores foram cortadas na junção tíbio-tarsal, e pesadas em balança
analítica para quantificação do edema induzido pela formalina. A diferença de peso (em mg)
entre a pata direita (injetada com formalina) e esquerda (injetada com salina) foi considerada
como índice de edema (DE SOUZA et al., 2003).
c) Modelo de dor induzida pela Capsaicina
Cada animal foi colocado individualmente sob um funil de vidro transparente, por um
período de adaptação de, no mínimo, 20 minutos. Após este período, observou-se a reação à dor
induzida pela capsaicina, cronometrando-se durante 5 minutos o tempo que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata. Cada animal recebeu 20μl de solução de capsaicina (1.6
mg/pata), injetada na região intraplantar da pata posterior direita. O tempo que o animal levou
para lamber ou morder a pata injetada com capsaicina foi considerado como indicativo de dor
(SAKURADA et al., 1992; 1993; DE SOUZA et al., 2003).
d) Modelo de dor induzida pelo Glutamato
Os animais foram colocados individualmente sob um funil de vidro transparente, por um
período de adaptação de, no mínimo, 20 minutos, o qual, posteriormente, foi utilizado para
observar a reação à dor induzida pelo glutamato, cronometrando-se durante 15 minutos o tempo
que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata. Cada animal recebeu 20 ml de solução
de glutamato (30 mmol/pata), injetada na região intraplantar da pata posterior direita. O tempo
que o animal levou para lamber ou morder a pata injetada com glutamato foi considerado como
indicativo de dor (BEIRITH et al., 1998).
33
e) Teste da Placa Quente
Os animais foram colocados sob um funil de vidro sobre a superfície de uma placa de
metal previamente aquecida a uma temperatura de ± 56°C utilizando-se um banho-maria. O
tempo, em segundos, que o animal levou para lamber, levantar ou morder as patas dianteiras ou
traseiras sobre a placa previamente aquecida foi cronometrado, e considerado como indicativo de
dor. Os animais foram selecionados 24 horas antes do teste, quando foram submetidos ao teste
sem qualquer tratamento. Foram selecionados aqueles animais que apresentaram o indicativo de
nocicepção nos primeiros segundos em contato com a placa aquecida. Os animais cujo limiar de
nocicepção foi alto (>25 segundos) foram descartados. No dia seguinte, os animais selecionados
foram tratados com os compostos e/ou controles, e 30 minutos após, foi realizado o teste. Não foi
permitida a permanência dos animais sobre a placa por tempo superior a 30 segundos evitando-
se, assim, danos teciduais decorrentes de possíveis queimaduras (DE SOUZA et al., 2003).
4.6.2. Atividade Antimicrobiana
a) Atividade Antifúngica
Utilizou-se para esta análise o fungo da espécie Candida albicans.
Os compostos foram testados contra tal fungo, pelo método de diluição, a fim de se
determinar a menor concentração de fármaco inibitória do crescimento destes patógenos, ou seja,
a CIM (concentração inibitória mínima), conforme a ilustração na Figura 8.
34
Figura 8. Ilustração do método de diluição para determinação da CIM (concentração inibitória
mínima).
Neste método, a quantidade fixa de amostra testada foi dissolvida homogeneamente num
meio sólido conveniente. Utilizou-se diluições da amostra original, a cada uma das quais se
inoculou o microorganismo que se desejou testar. Através deste método, foi possível se
determinar a concentração inibitória mínima (CIM), que é a menor concentração capaz de inibir o
crescimento do microorganismo. A leitura dos resultados foi feita após 18-24 horas de incubação,
que tomou em consideração o primeiro tubo em que não havia mais turvação observada a olho
nu, comparando-se com o controle (branco), que continha apenas o microorganismo inoculado,
sem o composto (BARON e FINEGOLD, 1990; WOODS et al., 1995; ZACCHINO, 2001; DE
SOUZA et al., 2003).
b) Atividade Antibacteriana:
Os compostos foram testados contra as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
O método utilizado também foi o de diluição, com o objetivo de se obter a concentração inibitória
mínima do crescimento dos patógenos (CIM), conforme descrito acima.
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O interesse nos compostos imídicos cíclicos, sob o ponto de vista químico, se dá,
principalmente, pela versatilidade reacional que esta classe de compostos apresenta.
Neste trabalho, foram sintetizados 23 compostos estruturalmente relacionados, todos
inéditos, visando obter subsídios que permitissem a obtenção de dados concretos para a busca de
substâncias mais ativas, os quais estão indicados abaixo.
Ácidos âmicos sintetizados neste estudo
Cl
O
O
OHNH
O
O
OHNH
A1 Ácido N-fenil-tetrahidroftalâmico
A2 Ácido N-p-Clorofenil-tetrahidroftalâmico
A3
Cl
Cl
O
O
OHNH
CH3
O
O
NHOH
Ácido N-p-metilfenil-tetrahidroftalâmico
A6 Ácido N-butil-tetrahidroftalâmico
A4 Ácido N-3,4-Clorofenil-tetrahidroftalâmico
A5
CH2CH2CH2CH3
O
O
OHNH
O
O
OHNH CH3
Ácido N-metil-tetrahidroftalâmico
36
O
CH2CH2
O
NHCH2
O
O
NHOH
OH
A7 Ácido N-benzil-tetrahidroftalâmico
A8 Ácido N-fenil-etil-tetrahidroftalâmico
CH2 Cl
O
O
NHOH
CH2 OCH3
O
O
NHOH
A9 Ácido N-metóxibenzil-tetrahidroftalâmico
A10 Ácido N-Clorobenzil-tetrahidroftalâmico
Imidas sintetizadas neste estudo
N
O
O
N
O
O
Cl
B1 = AB1 B2 = AB2 N-fenil-tetrahidroftalimida N-p-Clorofenil-tetrahidroftalimida
N
O
O
CH3
B3 = AB3 N-p-metilfenil-tetrahidroftalimida
37
N
O Cl
B4 = AB4 ,4-Dicloro droftalimida
B5 = AB5 N-metil limida
B6 = AB6 N-butil- limida N-benzil alimida
B8 = AB8 N-fenil-et ftalimida
B9 = AB9 N-p-metóxib roftalimida
N-p-Clorob mida
O
O
Cl
O
N CH3
N-3 fenil-tetrahi -tetrahidrofta
tetrahidroftaB7 = AB7 -tetrahidroft
il-tetrahidro enzil-tetrahid
B10 = AB10 enzil-tetrahidroftali
O
O
N CH2CH2CH2CH3
O
O
N CH2
O
O
N CH2CH2
O
O
N CH2 OCH3
O
O
N CH2 Cl
38
Derivados de imidas sintetizados neste estudo:
a) Reação do anidrido 1,2,3,6-tetrahidroftálico com aminoácidos:
b) Adição de radicais à dupla ligação do anel 1,2-ciclohexeno ligado ao anel imídico:
N-glicino-tet roftalimida
C3 N-benzil-1-piperidi etrahidroftalimida
C2 N-benzil-1-morfol etrahidroftalimida
O
O
N
CH2COOH C1 rahid
CH2
O
NO
O
N
ino-t
no-t
CH2
NO
O
N
39
Tabela 1: Rendimento dos compostos sintetizados neste estudo
COMPOSTOS RENDIMENTO (%) P.F.(°C) PURIFICAÇÃO A1 22,48 105,6 -
AB1 / B1 66,60 / 55,77 77,0 - / - A2 90,27 111,4 EXTRAÇÃO COM CHCl3
AB2 / B2 70,15 / 67,52 113,1 - / - A3 55,00 Óleo -
AB3 / B3 64,80 / 61,50 106,0 - / - A4 79,00 131,5 -
AB4 / B4 47,62 / 52,50 129,2 - / - A5 15,27 169,0 CC
AB5 / B5 50,01 / 45,00 63,15 - / - A6* 87,68 Óleo EXTRAÇÃO COM CHCl3
AB6 / B6 29,40 / 51,02 Óleo - / EXTRAÇÃO COM CHCl3A7 38,00 139,1 -
AB7 / B7 56,60 / 48,35 86,55 - / - A8 24,49 173,4 EXTRAÇÃO COM CHCl3
AB8 / B8 65,00 / 51,85 90,4 - / - A9 54.26 93,5 -
AB9 / B9 60.70 / 30.80 76,95 - / CC A10 100,00 140,0 -
AB10 / B10 54.26 / 49.65 62,85 - / - C1 31,19 58,05 - C2 62,22 86,05 - C3 68,61 85,50 -
A = ácido âmico
ABx = Imida obtida a partir do fechamento do anel do ácido âmico em refluxo com CH3COOH
Bx = Imida obtida através do fechamento direto do anel em refluxo
C1 = Imida formada pela reação do anidrido cis-1,2,3,6-tetrahidroftálico com glicina
C2 e C3 = Derivados da Imida B7 com adição de radicais à dupla ligação do anel imídico.
- Compostos considerados puros, sem necessidade de purificação.
Como se pode observar na tabela, os ácidos âmicos apresentaram maiores pontos de fusão
do que as imidas cíclicas, devido ao fato de possuírem o grupamento carboxílico em suas
estruturas, o que dificulta a fusão dos mesmos. O composto que obteve o maior rendimento foi o
A10, com 100%. Com relação às imidas, a que obteve o maior rendimento foi a AB2, obtida
40
através da Rota Sintética 1, ou seja, do fechamento do anel do ácido A2, com 70,1%, e a
respectiva B2, obtida pelo fechamento direto do anel imídico em refluxo, com 67,5%.
Quanto aos derivados de imidas, pode-se dizer que o que obteve o maior rendimento foi o
C3 (com grupamento substituinte piperidino adicionado à dupla ligação do anel ftalimídico).
Pode-se mencionar que a grande maioria dos compostos obtidos através do fechamento do
anel do ácido âmico (RS1) obteve maior rendimento que aquelas obtidas pelo fechamento direto
do anel em refluxo, o que sugere que a Rota Sintética 1 é mais viável quando se deseja obter os
compostos com um maior rendimento. Porém, a Rota Sintética 2 é mais vantajosa quando se
deseja obter a imida em um espaço de tempo menor, pois não há a formação do composto
intermediário (ácido âmico).
5.1. Caracterização dos compostos
Os compostos obtidos foram caracterizados através da determinação do ponto de fusão,
espectroscopia de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear de próton (RMN 1H).
Foram analisadas principalmente as absorções apresentadas pelos grupos funcionais no espectro
de infravermelho (IV),uma vez que esta técnica é eficiente para confirmar a estrutura de ácidos
âmicos e respectivos derivados ciclizados (CORRÊA,1997; STIZ, 2000).
Em relação aos dados de Infravermelho descritos na Tabela 02, pode-se evidenciar
claramente nos ácidos âmicos a presença de absorção de NH na região de 3300-3500cm-1 e de
absorção de OH do grupo carboxila na região de 2500-3200cm-1. Pode-se evidenciar também a
presença de duas absorções na região de 1600-1700cm-1 correspondente às carboxilas C=O, de
ácido carboxílico e amida, conforme ilustrado na Figura 9 para o composto A10.
Quando analisados os espectros das 1,2,3,6-tetrahidroftalimidas, ou seja, imidas
ciclizadas, pode-se observar o desaparecimento das bandas de absorção mencionadas, e
evidencia-se uma banda característica das duas carboxilas simétricas na região de 1700cm-1,
como ilustra a Figura 10 para o composto B10.
As figuras 12 e 13 ilustram os espectros de RMN1H e 13C para o composto C1, cujos
sinais correspondem à estrutura proposta, e estão indicados no próprio espectro.
41O
O
NHOH
CH2 Cl
σ 1639.85 cm-1 CO (amida); σ 1712.86 cm-1 CO (ác); σ 2922.99 cm-1 OH; σ 3295.80 cm-1 NH
Fig. 9: Espectro de IV do ácido 4-clorobenzil-tetrahidroftalâmico (A10)
42 σ 1717.09 cm-1 CO simétrica
O
O
N CH2 Cl
Fig. 10: Espectro de IV da imida N-p-Clorobenzil-tetrahidroftalimida (B10)
43
Figura 11: Espectro de Infravermelho do composto C1
44
Figura 12: Espectro de RMN1H do composto C1
45
Figura 13: Espectro de RMN13C do composto C1
4746
Tabela 2: Caracterização dos compostos obtidos neste estudo, indicando as principais diferenças observadas.
COMPOSTO IV (cm-1) A1 1665,5 CO(amida.); 1709,84 CO(ác); 3031,18 OH; 3351,73 NH B1 1700,0 CO simétrica A2 1647,87 CO (amida); 1710,86 CO (ác); 2900 OH; 3295,4 NH B2 1705,43 CO simétrica A3 1676,01 CO (amida); 1734,51 CO (ác); 2935,02 OH; 3307 NH B3 1700 CO simétrica A4 1691,43 CO (ac); 1717,09 CO (ác); 3025,89 OH; 3381,68 NH B4 1712,06 CO simétrica A5 1660.05 CO (amida); 1720.54 CO (ác.); 2933.02 OH; 3325.07 NH B5 1705,43 CO simétrica A6* 1657.06 CO (amida); 1720,00 CO (ac.); 3093,01 OH; 3295,00 NH B6 1730.00 CO simétrica A7 1619,22 CO (amida); 1673,92 CO (ác); 3031,18 OH; 3345,42 NH B7 1691,43 CO simétrica A8 1621,7 CO (amida); 1715,64 CO (ác); 2907,39 OH; 3031,18 NH B8 1691,43 CO simétrica A9 1639.85 CO (amida); 1712,03 CO (ác); 2900.00 OH;3283.33 NH B9 1691.43 CO simétrica
A10 1639.85 CO (amida); 1712.86 CO (ác); 2922.99 OH; 3295.80 NH B10 1717.09 CO simétrica C1 1722,38 CO simétrica; 3041,49 OH (grupamento aminoácido) C2 1726.34 CO simétrica C3 1721.00 CO simétrica
4847
5.2. Atividade antinociceptiva Considerando-se que o modelo de dor induzida pelo ácido acético 0,6% é um modelo
experimental muito usado para triagem de substâncias com perfil analgésico, além da
simplicidade e baixo custo envolvidos, optou-se inicialmente por avaliar os compostos
sintetizados neste modelo, visando selecionar os mais ativos para testes em outros modelos de
dor.
Modelo de contorções induzidas por Ácido Acético 0,6% i.p. (Dose = 10mg/Kg) R = Grupamento alquila
OHR
O
O
NH N R
O
OR = Grupamento alquila
O
O
(CH2)n
X
NHOH
(A) (A) (B)
N
O
O
N
O
O
(CH2)n
X
N
O
O
(CH2)n
XYAA
AA = Aminoácido (B) (C2, C3) (C1)
n = Número de carbonos na cadeia entre o anel imídico e o anel aromático
R = Radical alquila
X = Substituinte ligado ao anel aromático
A = Ácido Âmico
B = Imida Cíclica
C = Derivado de Imida
O NY = ; N
4948
Tabela 3: Atividade antinociceptiva de ácidos tetrahidroftalâmicos e de derivados das
tetrahidroftalimidas, e drogas de referência no modelo de contorções abdominais induzidas por
ácido acético (writhing test) em camundongos, na dose de 10mg/kg, administrados por via
intraperitoneal.
COMPOSTO n X INIBIÇÃO (%) A1 0 H 10,8 ± 6,2 A2 0 4-Cl 23,7 ± 7,2 A4 0 3,4-Cl2 26,7 ± 1,4 A5 0 - 37,3 ± 4,5* A7 1 H 28,3 ± 10,5 B1 0 H 15,8 ± 6,0 B2 0 4-Cl Inativo B3 0 4-CH3 36,4 ± 3,4* B4 0 3,4-Cl2 50,9 ± 5,4** B5 0 - 17,7 ± 8,6 B6 0 - 34,3 ± 8,8* B7 1 H 51,0 ± 5,4** B8 2 H 10,0 ± 4,8 B9 1 4-OCH3 40,4±3,5*
B10 1 4-Cl 33.3±2,9* C1 0 - 32,9 ± 3,1* C2 1 H 65,4 ± 3,0** C3 1 H 30,0 ± 3,0
AAS♣ - - 35,0 ± 2,0 * Paracetamol♣ - - 38,0 ± 1,0 ** Cada grupo representa o valor ± S.E.M. de 5 ou 6 experimentos. * P < 0,05 ** P < 0,01 comparado com o respectivo valor do controle. - Sem anel aromático substituído. ♣ Fármacos comumente utilizados na clínica como analgésicos.
5049
Como pode-se observar na tabela acima, os compostos mais ativos foram o B7 e o C2,
cujas inibições foram de 51,0 ± 5,4% e de 65,4 ± 3,0%. Conforme os valores acima, pode-se
observar que os maiores percentuais de inibição foram atribuídos aos compostos que possuem um
grupamento metileno separando o anel imídico do anel aromático presente na estrutura, o que
sugere que a presença deste grupamento é um fator importante para a atividade dos compostos.
Quanto ao composto C2, de maior atividade, o mesmo foi obtido após a evidência de que, dentre
os compostos sintetizados, o B7 era o mais ativo. Deste modo, introduziu-se o grupamento
morfolino na dupla ligação imídica, conferindo maior efeito analgésico a este composto no
modelo avaliado. Sugere-se que a potência do mesmo esteja relacionada à presença do grupo
metileno separando os dois anéis, e também à presença do grupamento morfolino ligado ao anel
ftalimídico, o que confere uma maior disponibilidade de elétrons ressonantes à estrutura.
O composto mais ativo sintetizado até então, antes da adição de substituintes à dupla
ligação do anel imídico, B7, foi avaliado no modelo do ácido acético por via oral e em outros
modelos de dor, como o teste da formalina e da capsaicina. Conforme pode ser observado no
gráfico 1, o composto B7 não apresentou atividade por via oral, sugerindo que o mesmo não é
absorvido pelo trato gastro-intestinal.
Modelo do Ácido Acético
I = 35,33±4,85 mmol/Kg (dose =
100mg/Kg – Controle: I = 37,25 ± 2,8
mmol/Kg)
Gráfico 1: B7 -Teste das Contorções induzidas por Ácido Acético 0,6% sendo o composto
administrado por via oral:
5150
O modelo de dor induzida pela formalina é mais específico do que o teste de contorções
abdominais, e permite avaliar dois tipos distintos de dor: a dor de origem neurogênica
(estimulação direta dos neurônios nociceptivos) e a de origem inflamatória, representando a
resposta tônica à dor, acompanhada de uma resposta inflamatória relacionada com a liberação de
mediadores químicos da inflamação (DE SOUZA, et al., 2003).
Primeira Fase da Formalina Segunda Fase da Formalina
B7 (Dose = 10mg/Kg i.p.)
• F1: X = 116 ± 8,40 %• F2: X = 186 ±14,90 % Gráfico 2: Modelo de Dor induzida pela Formalina em Camundongos
O composto B7 também não apresentou efeito analgésico significativo na primeira (dor de
origem neurogênica) e na segunda (dor de origem inflamatória) fase do teste da formalina,
conforme indica o gráfico 2. No teste da capsaicina, apresentou apenas moderada ação, com
inibição de cerca de 30% (Gráfico 3).
5251
Modelo da Capsaicina
B7 (Dose = 10mg/Kg i.p.) X = 84 ± 6,99 IM = 38,02%
Controle = 136,5 ± 15,3
Gráfico 3: Modelo de dor induzida pela capsaicina em camundongos
O teste da capsaicina é empregado com o objetivo de evidenciar a possível interação dos
compostos em estudo sobre os neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, em especial
no sistema taquicinérgico (a injeção de capsaicina induz estimulação direta de receptores
específicos localizados nos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários
neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, incluindo principalmente as taquicininas
(substância P, neurocinina A e neurocinina B)) (SAKURADA et al., 1992; 1993; DE SOUZA et
al., 2003).
Assim, diante dos resultados não muito promissores com este composto, procurou-se
modificar sua estrutura para a obtenção de compostos mais ativos. Introduziu-se diferentes
grupos no anel aromático (4-OCH3 e 4-Cl), de diferente natureza, porém não houve acentuação
da atividade. Ambos os compostos (B9 e B10) foram menos ativos do que o protótipo B7, sem
grupo substituinte no anel aromático. Topliss (1977) sugere que, nestes casos, esteja ocorrendo a
influência de fatores estéricos (posição 4) na interação fármaco – receptor, indicando, para novos
estudos, compostos substituídos nas posições 2,3 ou 5. No entanto, a introdução de um
grupamento morfolino no anel imídico (composto C2) levou a um significativo efeito, o mesmo
não sendo evidenciado para o composto C3, com a introdução do grupo piperidino, indicando
que o aumento da hidrofobicidade aumenta a atividade analgésica, contrastando com os estudos
de Corrêa et al. (1997), que sugerem que o átomo de oxigênio no anel morfolínico pode causar
5352
um decréscimo da atividade, provavelmente devido às pontes de hidrogênio com diferentes
receptores.
Considerando-se o pronunciado efeito do composto C2 no modelo do ácido acético, na
dose de 10mg/kg, o mesmo foi analisado em outras doses para a determinação da DI50 a fim de
verificar sua potência e comparar com alguns fármacos de referência. O gráfico 4 indica que o
composto inibiu dose-dependentemente as contorções abdominais, com uma DI50 de 8.1 (7.6 –
8.7) mg/kg ou 27.9 (26.2 – 30.0) μmol/kg. A aspirina e o paracetamol apresentaram DI50 em
torno de 125 a 135μmol/kg. Portanto, o C2 foi cerca de 5 vezes mais potente do que os
analgésicos mencionados, usados na terapêutica atual.
Contorções abdominais induzidas pelo
o acético - via i
ácid .p.
0
20
40
60
80
cont 6 mg 8 mg 10 mg
f
n. d
e co
ntor
ções
Gráfico 4: Atividade antinociceptiva do composto C2 no modelo de dor induzida pelo ácido
acético (via intraperitoneal) em camundongos.
Quando analisado por via oral, o composto C2 inibiu cerca de 64% as contorções
abdominais na dose d 100mg/kg (Gráfico 5), sugerindo uma DI50 menor que 100mg/kg, e que
pode ser absorvido pelo trato gastro-intestinal. Já os fármacos Aspirina e Paracetamol
apresentaram DI50 entre 100 e 200mg/kg por esta via de administração (VAZ et al., 1996).
IM8 + Mor
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (via i. p.)
**
****
DI50= 8,10 (7,59 – 8,65)
Composto C2
5453
Contorções abdominais induzidas pelo o acético - via o ácid ral
020406080
cont 100 mg
n. d
e co
ntor
ções
Gráfico 5: Atividade antinociceptiva do composto C2 no modelo de dor induzida pelo ácido
acético (via oral) em camundongos.
O modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos é considerado inespecífico
devido ser suceptível a outros agentes medicinais, como anti-histamínicos, anticolinérgicos, etc.
(CHOI et al., 2003). No entanto, é amplamente utilizado para o screening de substâncias
analgésicas naturais ou sintéticas (CALIXTO et al., 2000; CHOI et al., 2003; DE SOUZA et al.,
2003).
Quando analisado no modelo da Formalina, o composto C2 foi totalmente inativo na
primeira fase da dor (origem neurogênica), porém causou significativa inibição na segunda fase, a
10mg/kg por via intraperitoneal (Gráfico 6), sugerindo que pode estar inibindo mediadores
inflamatórios envolvidos no processo.
IM8 + Morf
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (via i. p.)
**
%I = 64,0%
Composto C2
5554
Formalina
Gráfico 6: Atividade antinociceptiva do composto C2 no modelo de dor induzida pela Formalina
em camundongos (10mg/kg, i.p.).
Segundo Hunskaar e Hole (1987), a ausência de efeito na primeira fase do teste da
formalina é um importante indicativo de que a substância não atua através de receptores opióides,
a exemplo da morfina e derivados (CALIXTO et al., 2000). A falta de efeito analgésico no
modelo da placa quente (Gráfico 7), um modelo específico para substâncias que atuam
centralmente (DE SOUZA et al., 2003), confirma esta hipótese.
Gráfico 7: Atividade antinociceptiva do composto C2 no modelo da placa quente em
camundongos (10mg/kg, i.p.).
050
100150200250300350
controle -fase I
10 mg controle -fase II
10 mg
tem
po (s
)
IM8 + Morf
Modelo da Formalina
**
%I = 36,34%
Composto C2
Placa quente
2
3
cont 10 mg
tem
po (s
)
IM8 + MorfComposto C2
Placa Quente
5655
No modelo da capsaicina o composto C2 apresentou uma atividade discreta, porém
significativa, causando inibição de cerca de 21.5% (Gráfico 8), sugerindo que haja uma possível
ação do composto em estudo sobre os neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, em
especial no sistema taquicinérgico (Substância P, Neurocinina A e Neurocinina B) (SAKURADA
et al., 1992; 1993; DE SOUZA et al., 2003).
Capsaicina
Gráfico 8: Atividade antinociceptiva do composto C2 no modelo de dor induzida pela capsaicina
em camundongos (10mg/kg, i.p.).
Visando avaliar o possível envolvimento de receptores glutamaérgicos, o composto foi
analisado no modelo de dor induzida pelo glutamato (BEIRITH et al., 1998), porém, foi
praticamente destituído de efeito analgésico neste modelo (15% de inibição a 10mg/kg, por via
intraperitoneal) (Gráfico 9).
0
50
100
cont 10 mg
tem
po (s
)
IM8 + Morf
Modelo da Capsaicina
%I = 21,5%
Composto C2
Glutamato
0100
200300
cont 10 mg
I
tem
po(s
)
M8+Morf
%I = 15,0%
Glutamato
Gráfico 9: Atividade
antinociceptiva do composto C2
no modelo de dor induzida pelo
Glutamato em camundongos Composto C2
57
Assim, os testes utilizados não permitiram evidenciar o mecanismo de ação do referido
composto, sugerindo a continuidade destes estudos utilizando-se outros modelos específicos (DE
SOUZA et al., 2003)
5.3. Atividade antimicrobiana Método de diluição (Determinação da CIM): Alguns compostos foram testados contra alguns microorganismos patogênicos aos seres
humanos, como S. aureus, E. coli e C. albicans pelo método de diluição, a fim de se determinar a
concentração inibitória mínima contra os referidos microorganismos.
Como podemos observar abaixo, na tabela 4, todos os compostos apresentaram CIMs com
valores acima de 100μg/mL, demonstrando que não exerceram atividade antimicrobiana de
interesse, diferindo de estudos anteriores que indicam que outras sub-famílias de imidas cíclicas,
como maleimidas, 3,4-dicloromaleimidas, citraconimidas, etc., são potencialmente
antimicrobianos (BUZZI et al., 2003; CECHINEL FILHO et al., 2003).
Tabela 4: Atividade Antimicrobiana: Determinação da CIM dos compostos no método de
Diluição:
COMPOSTO S. aureus (μg/mL) E. coli (μg/mL) C. albicans (μg/mL) A1 >100 >100 >100 A2 >100 >100 >100 A3 >100 >100 >100 A4 >100 >100 >100 A7 >100 >100 >100 A8 >100 >100 >100 B1 >100 >100 >100 B2 >100 >100 >100 B3 >100 >100 >100 B4 >100 >100 >100 B8 >100 >100 >100
56
58
6 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode-se dizer que os ácidos tetrahidroftalâmicos e as
tetrahidroftalimidas são facilmente obtidos, apresentando bons rendimentos, apesar da
necessidade de condições especiais, ou seja, da formação do composto intermediário (ácido
âmico), e do refluxo na ciclização do anel imídico.
Quanto às rotas sintéticas, pode-se dizer que a Rota n° 01 (realizada em duas etapas)
apresenta os melhores rendimentos. A Rota Sintética n° 02 (realizada em apenas uma etapa) é
mais viável na síntese direta das imidas, pois não há a formação do ácido âmico intermediário,
sendo o tempo reacional menor.
Quanto aos ensaios para avaliação do potencial antinociceptivo, pode-se dizer que, no
modelo do ácido acético, foram evidenciados alguns parâmetros estruturais importantes, como a
presença de um grupamento metileno separando o anel imídico do anel aromático, e o padrão de
substituição do anel imídico, sendo que os compostos com substituintes (C2 e C3) mostraram-se
mais eficazes que a Aspirina e o Paracetamol.
Os ácidos âmicos (abertos) mostraram-se menos potentes que as imidas, não apresentando
inibição significativa.
O composto B7 foi o mais ativo no modelo do ácido acético (via i.p.), logo, resolveu-se
testa-lo por via oral, e em outros modelos de dor, como o da formalina e o da capsaicina, em
camundongos, sendo que este não apresentou resultados tão significativos.
Com o objetivo de melhorar a ação antinociceptiva do composto B7, resolveu-se
adicionar aminas à dupla ligação do anel tetrahidroftalimídico do mesmo, sendo que foram
sintetizados dois compostos (C2 e C3), dos quais o composto C2 (que contém o grupamento
morfolino) foi o mais promissor, sendo cerca de 5 vezes mais ativo que a aspirina e o
paracetamol no modelo do ácido acético. Quando administrado por via oral, o mesmo pôde ser
absorvido pelo trato gastro-intestinal, com uma DI50 menor que a da aspirina e do paracetamol.
Sugere-se que o composto C2 pode estar inibindo alguns mediadores do processo inflamatório, e
também, que esteja interagindo com alguns neurotransmissores do Sistema Taquicinérgico, não
atuando centralmente, interagindo com os receptores opióides, nem com os receptores
glutamaérgicos.
5958
Os resultados promissores obtidos para o composto C2 sugerem que o mesmo pode ser
futuramente utilizado como protótipo para a descoberta de novos agentes analgésicos.
Pode-se dizer ainda que a substituição no anel aromático do composto B7 não foi um fator
importante para a atividade antinociceptiva, uma vez que o composto B7 mostrou-se mais ativo
do que o B9 e do que o B10, sugerindo, desta maneira, que o decréscimo da atividade seja devido
a um impedimento estérico na interação composto – receptor.
Com relação aos ensaios realizados para a determinação da atividade antimicrobiana,
observou-se que nenhum composto analisado apresentou atividade significativa contra os
microorganismos utilizados (S. aureus, E. coli e C. albicans), ao contrário de estudos anteriores
realizados com outras sub-famílias de imidas cíclicas, que foram bastante promissoras, podendo
ser comparadas com alguns antimicrobianos já utilizados na clínica.
60
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68
8 ANEXOS 8.1. Anexo A – Artigo submetido à publicação em periódico Internacional From: Valdir Cechinel Filho To: [email protected] Sent: Monday, January 31, 2005 1:46 PM Subject: Manuscript for JPPS Dear Dr. F. Jamali, I am sending our manuscript " Synthesis of new tethrahydrophtalimides and related compounds with antinociceptive effects in mice" for publication on JPPS as Research Article. Below are indicated the names and address of three expert reviewers: 1- Mohammad Abdollahi: Pharmaceutical Sciences Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran. Email: [email protected] 2- Eliezer J. Barreiro: LASSBIO/UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. E-mail: [email protected] 3- Carla Delporte Departamento de Quimica Farmacologica y Toxicologica, Facultad de Ciencias Quimicas y Farmaceuticas, Universidad de Chile, Santiago. E-mail:[email protected] Thank you very much for your attention. Cordially, Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Pró-Reitor de Pesquisa, Pós-Graduação, Extensão e Cultura ProPPEC - UNIVALI Fone: 00 55 47 341-7525/7557 ; Fax: 00 55 47 341-7601 Rua Uruguai, 458 - Cx. P. 360 CEP - 88302-202, Itajaí, SC Brasil
6968
Synthesis of new tethrahydrophtalimides and related compounds with antinociceptive
effects in mice
Bianca B. C. Costa, Rogério Corrêa, Marcia M. De Souza, Juliana B. Pretto, Juliana V.
Ardenghi, Fátima De Campos-Buzzi, Valdir Cechinel-Filho
Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas e Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas (NIQFAR)/CCS, Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), 88302-202, Itajaí-
SC, Brasil.
Corresponding Author: Valdir Cechinel Filho, Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas (NIQFAR)/CCS, 88302-202 Itajaí-SC-BRASIL. [email protected]
7069
Abstract: PURPOSE. This paper describes de synthesis of new tethrahydrophtalimides and
related compounds, which were evaluated as possible antinociceptive agents in mice.
METHODS. Twenty compounds were obtained by the reaction of cis-1,2,3,6-
tethrahydrophthalic anhydride with appropriate amines, dehydration, and addition in imidic
double bond. They were analysed in writhing test at 10 mg/kg given intraperitoneally. The most
active compound (19) was studied on formalin, capsaicin, glutamate and hot plate models.
RESULTS. The antinociceptive activity demonstrated by some newly studied compound is
promising, and some of them were more active than acetylsalicylic acid and paracetamol used as
reference drugs against writhing test in mice. Compound (19) was about 5-fold more potent than
the reference drugs, being also effective by oral route and against the inflammatory response in
the formalin test. CONCLUSIONS. The results suggest that compound (19) could be used as a
model to obtain new and more potent antinociceptive agents. It exhibits an interesting
antinociceptive profile, and does not interact with opioid systems.
INTRODUCTION
Cyclic imides are an important class of compounds due to their variety of biological
properties and reactional versatility [1]. Our research group has focused the attention to these
compounds since the discovery of phyllanthimide, an alkaloid present in low concentration in the
active aerial parts of Phyllanthus sellowianus [2]. Using this compound as a model, we have then
synthesized a great number of compounds belonging to the different sub-classes of cyclic imides,
including maleimides, 3,4-dichloromaleimides, succinimides, glutarimides, naphthalimides,
7170
among others, and determined their different kind of biological activities, such as antispasmodic,
antibacterial, antifungal, and analgesic or antinociceptive effects [3-6].
Extending our research program related to the biological properties of cyclic imides, we
have now synthesized twenty new tethrahydrophtalimides and related compounds and evaluated
initially their antinociceptive action using the writhing test in mice at 10 mg/kg by
intraperitoneal route. The most active compound was analyzed in other classical and specific
models of pain in order to confirm its antinociceptive effect as well as to investigate the possible
mechanism of action. The results of acetylsalicylic acid and paracetamol were included in this
study with the purpose of comparison.
MATERIAL AND METHODS
Chemistry
General procedures for the synthesis of studied compounds
Compounds 1-6 were obtained by the reaction of cis-1,2,3,6-tethrahydrophthalic anhydride
with appropriate amines in ether, which were dehydrated by treatment with acetic acid/reflux to
give the respective cyclic compounds (7-18), according to methodology previously described
[7]. Compounds 19 and 20 were obtained directly from compound 14 by the reaction with
morpholine and piperidine in benzene, respectively. The purity of the synthesized substances was
monitored by thin-layer chromatography (tlc) using Sigma (St. Louis, USA) silica pre-coated
plastic plates, 200 μm in thickness, with several solvent systems of different polarities. Spots
were visualized by short-wave UV light and iodine vapor.
7271
Spectral data (IR, 1H- and 13C- NMR) and elemental analysis were in good agreement with the
structures shown in Figure 1.
Pharmacology
Animals
Swiss male mice (25-30 g) were obtained from Central Bioterio of the University of Vale
do Itajaí (Itajaí, Brazil). They were kept in a temperature-controlled environment (23 ± 2 o C)
with a 12 h light-dark cycle. Food and water were freely available. The allocation of animals in
the different groups was randomized and the experiments were carried out in blind conditions.
Since some suffering might result from experiments, the IASP´s Committee for Research and
Ethical Issues Guidelines [8] were followed.
Abdominal constriction response caused by injection of acetic acid
The abdominal constriction induced by intraperitoneal injection of acetic acid (0.6%),
which consisted of a contraction of the abdominal muscle together with a stretching of hind
limbs, was carried out according to previously described procedures [9,10]. Animals were
pretreated with the compounds or standard drugs intraperitoneally (10 mg/kg) 30 min before the
acetic acid injection. Compound 19, the most active compound tested, was also analyzed
intraperitoneally at 6, 8, 10 mg/kg or orally at 100 mg/kg. Control animals received a similar
volume of 0.9 % NaCl solution (10 ml/kg). All the experiments were carried out at 20-22 oC.
After the challenge, pairs of mice were placed in separate boxes, and the number of abdominal
constrictions was cumulatively counted over a period of 20 min. Antinociception was expressed
7372
as the reduction of the number of abdominal constrictions between control animals and mice
pretreated with compounds or standard drugs.
Formalin-induced pain
The procedure was similar to that described previously [10,11]. Animals from the same
strain were slightly anaesthetized with ether, except when used to analyze the first phase of
formalin-induced pain, and 20 μl 2.5 % formalin (0.92 % formaldehyede) made up in phosphate-
buffer solution was injected under the paw surface of the right hindpaw. Two mice (control and
treated) were observed simultaneously from 0 to 30 min following formalin injection. The
amount of time spent licking the injected paw was considered as indicative of pain. The initial
nociceptive scores normally peaked 5 min after formalin injection (early phase) and 15-30 min
after formalin injection (late phase), representing the tonic and inflammatory pain responses,
respectively [11]. Animals were treated with compound 19 intraperitoneally at 10 mg/kg, 30 min
before formalin injection. Following intraplantar injection of formalin, animals were immediately
placed into a glass cylinder of 20 cm in diameter, and the time spent licking the injected paw
(second phase of formalin test) was determined.
Capsaicin-induced pain
The procedure used was similar to that described previously [12]. Animals were placed
individually in transparent glass cylinders. Following the adaptation period, 20 μl of capsaicin (1.6
μg/paw) was injected under the skin of the plantar surface of the right hindpaw, using a
microsyringe. Animals were observed individually for 5 minutes following capsaicin injection. The
7473
amount of time spent licking the injected paw was timed with a chronometer and was considered as
indicative of nociception. Animals were intraperitoneally treated with compound 19 at 10 mg/kg or
saline (10 ml/kg, i.p.) 1 hour before administration of capsaicin. Control animals received a similar
volume of 0.9 % NaCl (10 ml/kg, i.p.).
Glutamate-induced nociception
Animals were treated with compound 19 via i.p. (10 mg/kg) 30 min before glutamate
injection. A volume of 20 μl of glutamate solution (30 μmol/ paw), made up in phosphate
buffered saline (PBS), was injected intraplantarly under the surface of the right hindpaw as
described previously [13]. After injection with glutamate, the animals were individually placed
into glass cylinders of 20 cm in diameter and observed from 0 to 15 min. The time spent licking
and biting the injected paw was timed with a chronometer and considered as indicative of pain.
Hot-plate test
The hot-plate was used to estimate the latency of responses according to the method
described by Eddy and Leimback (1953) [14] with minor modifications. The temperature of the
hot-plate was maintained at 56 ± 3 °C. Animals (n=8) were placed on glass funnels in the heated
surface and the time between placing the animals and the beginning of licking paws or jumping
were recorded as latency of response in non-treated (saline 10 ml/kg, i.p.) or compound 19 ( 10
mg/kg, i.p.) animals.
7574
Statistical analysis
Results are presented as mean ± s.e. mean, except the mean ID50 values (i.e. the dose of
drugs or compounds reducing the algesic responses by 50 % relative to control value) which are
reported as geometric means accompanied by their respective 95 % confidence limits. The
statistical significance between groups was analyzed by variance followed by Dunnett’s multiple
comparison test. P-values of less than 0.05 were considered as indicative of significance. ID50
values were determined by graphical interpolation from individual experiments.
Drugs
The following drugs were used: ASA (acetylsalicylic acid), acetaminophen, indomethacin,
and PBS (phosphate buffered saline) (all from Sigma Chemical, St. Louis, U.S.A), formalin and
acetic acid (Merck, Darmstadt, Germany). The compounds studied as well as the reference drugs
were dissolved in Tween 80 (Merck, AG, Darmstad, Germany), plus 0.9 % of NaCl solution and
Carboxymethylcellulose 0.5 % plus 0.9 % of NaCl solution, respectively. The final concentration
of tween and ethanol did not exceed 5 % and did not cause any effect “per se”.
RESULTS AND DISCUSSION
We initially synthesized the cis-1,2,3,6-tethrahydrophtalamic acids from the reaction of
cis-1,2,3,6-tethrahydrophtalic anhydride and appropriate amines in ether, and further the
purification procedures, the amic acids were dehydrated to give the respective cyclic compounds,
according to shown in scheme 1 below. The addition of piperidine and morpholine to double
7675
bond (imidic ring) was carried out using different solvents, however benzene furnished the most
suitable profile. All the compounds were generally obtained in good yields (40-70 %).
+ RNH2 ether
O
O
O
cis-1,2,3,6-tethrahydrophthalic acid cis-1,2,3,6-tethrahydrophthalic anhydride
O
O
OHNHR
(Amine)
reflux
-1,2,3,6-tethrahydropthalimide
acetic acid
benzene
cis
NH
O
O
N R
O
O
NN
R
-1,2,3,6-tethrahydropthalimidecis derivatives
R = H, alkyl, aryl groups; N= morpholine or piperidine
Scheme 1: Synthesis of compounds studied.
Thus, tethrahydrophtalamic acids and tethrahydrophtalimides derivatives shown in figure
1 were tested against writhing test at 10 mg/kg by intraperitoneal route, whose results are
indicated in Table 1. As can be seen, some of them caused interesting antinociceptive effects,
being more effective than two reference drugs, acetylsalicylic acid and paracetamol. All the
synthetic process was conducted in order to obtain active compounds, according to shown in
Figure 1. In some cases (compounds 1-4 and 7-11) the substitution pattern suggested by Topliss
[15] was used for rational selection of phenyl substituents. However, significant difference
between the parameters involved was not observed. Compound 19, which exhibited the most
efficacy and reduced about 65 % of the abdominal constrictions, was studied in more details.
7776
Figure 2 indicates that it dose-dependently inhibited the abdominal constrictions on writhing test,
with ID50 value calculated of 8.1 (7.6-8.6) mg/kg (27.9 (26.2-30.0) μmol/kg), being about 5-fold
more potent than mentioned reference drugs.
Given orally, compound 19 also was effective in this model (writhing test), reducing in 64
% the number of abdominal constrictions induced by acetic acid (Figure 3), whereas
acetylsalicylic acid and paracetamol were less active by this administration route [16]. Such
result is important from a medical point of view, because strongly suggests that compound 19 is
absorbed from the gastrointestinal tract. Compound 20, which presents the piperidino group
instead of morpholino group attached to the imidic ring, was less active against writhing test at 10
mg/kg, ip, with a reduction of 30 % of the abdominal constrictions. This indicates that the
increase of hydrophilicity improves the antinociceptive effects. The oxygen atom present in the
morpholino moiety would be contributing with the increased in activity through to hydrogen
bonding with different receptors.
When evaluated in the formalin-induced pain, compound 19 at 10 mg/kg, ip, was inactive
against the first phase (neurogenic pain), but significantly inhibited (36.3 %) the inflammatory
response (second phase) (Figure 4), with very similar profile to those of acetylsalicylic and
indometacine reported in previous studies [17].
In the capsaicin test, it caused only a weak antinociceptive effect, with inhibition of 21.5
% (results not shown). This result is in agreement with that observed in the formalin test, since it
provides more direct evidence of the antinociceptive action on neurogenic pain [12]. Another
important finding which confirms these results was obtained in the hot plate test, by the lack of
antinociceptive effect of compound 19 at 10 mg/kg, given intraperineally (results not shown). It
is a technique that presents a selectivity for opioid-derived analgesics [18].
7877
The results also demonstrated that compound 19 does not interact with excitatory amino
acids, since it caused a weak inhibition (15 %, 10 mg/kg, results not shown) of the hyperalgesia
induced by intraplantar injection of glutamate.
Although additional studies are required to elucidate the exact mechanism of
antinociceptive properties of compound 19, the results verified in formalin, capsaicin and hot
plate tests strongly suggest that it acts in a non-opioid patway. Finally, the results showed that
compound (19) could be used as a model to obtain new and more potent antinociceptive agents.
7978
(18)
Figure 1: Molecular structures of tethrahydrophtalamic acids and tethrahydrophtalimide
derivatives studied.
8079
Table 1: Antinociceptive activity of tethrahydrophtalamic acids, tethrahydrophtalimide
derivatives and reference drugs against acetic acid-induced abdominal constriction (writhing test)
in mice at 10mg/kg, given intraperitoneally:
COMPOUND INHIBITION (%)
1 10.8 ( 6.2
2 23.7 ( 7.2
3 48.7 ( 2.8**
4 26.7 ( 1.4
5 37.3 ( 4.5*
6 28.3 ( 10.5
7 15.8 ( 6.0
8 Inactive
9 36.4 ( 3.4*
10 40.4 ( 2.5**
11 50.9 ( 5.4**
12 17.7 ( 8.6
13 34.3 ( 8.8*
14 51.0 ( 5.4**
15 40.4* ( 3.5
16 33.3* ( 3.0
17 10.0 ( 4.8
18 32.9 ( 3.1*
19 65.4 ( 3.0**
20 30.0 ( 3.0
ASA 35.0 ( 2.0 *
Paracetamol 38.0 ( 1.0 **
Each group represents the mean ( s.e.m. of 5 to 7 experiments. * P ( 0.05 and ** P ( 0.01
compared with respective control values. ASA= acetylsalicylic acid.
8180
0
1020
30
40
5060
70
control 6 mg 8 mg 10 mg
(Compound 19)
Num
ber o
f con
stric
tions
**
****
(DI50 = 8.1 (7.6-8.6) mg/kg [27.9 (26.2-30.0) μmol/kg])
Figure 2: Effect on acetic acid-induced pain in mice test of compound 19, administrated
intraperitoneally at 6, 8 and 10 mg/kg. Each column represents mean ± s.e.m. of six experimental
values. **p<0.01, compared with corresponding control value.
0
20
40
60
80
cont 100 mg
(Compound 19)
Num
ber o
f con
stric
tions
**
%I = 64.0%
Figure 3: Effect on acetic acid-induced pain in mice test of compound 19, administrated orally at
100 mg/kg. Each column represents mean ± s.e.m. of six experimental values. **p<0.01,
compared with corresponding control value.
8281
0
50
100
150
200
250
300
350
control 10 mg control 10 mg
(Compound 19)
Lick
ing
(s)
**
%I = 36.34%
First phase Second phase
Figure 4: Effect of the compound 19, administrated intraperitoneally against formalin –induced
pain in mice. Each column represents mean ± s.e.m. of six experimental values. **p<0.01,
compared with corresponding control value.
8382
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