UNIVERSIDADE DOS AÇORES Departamento de Ciências...

UNIVERSIDADE DOS AÇORES

Departamento de Ciências Agrárias

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DO

ÁCIDO LÁCTICO PRODUTORAS DE BACTERIOCINAS E

SUA APLICAÇÃO NO FABRICO DE QUEIJO FRESCO

Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar

Márcia Costa Coelho

Orientadora: Professora Doutora Célia Costa Gomes da Silva

ANGRA DO HEROÍSMO

2013

Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco

I

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos aqueles que, de algum modo contribuíram para a realização

desta dissertação, nomeadamente:

À minha orientadora Doutora Célia Silva pela orientação, amizade, paciência,

disponibilidade, ensinamentos e dedicação prestada ao longo deste trabalho.

À Doutora Maria de Lurdes Dapkevicius pela disponibilidade, amizade e ajuda.

Ao Doutor Henrique Rosa pela disponibilidade e ajuda no tratamento estatístico

dos dados.

À Marina Lopes por ter feito a identificação genética das bactérias e pelo

companheirismo.

Ao Senhor Paulo Caetano pela sua disponibilidade de entregar o leite para o

fabrico do queijo fresco.

À empresa Chegalvorada (Granja Universitária) pela cedência do leite usado no

trabalho.

Às minhas colegas de trabalho Susana Ribeiro, Sandra Câmara e Cristina

Riquelme, pelo companheirismo e ajuda.

Às técnicas de laboratório, Berta Borges e Guida Pires, pelo companheirismo,

disponibilidade e ajuda.

Aos meus pais e ao meu irmão, por todo o amor, paciência, apoio e incentivo

demonstrado ao longo do mestrado.

Este trabalho foi financiado por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação

para a Ciência e a Tecnologia, no âmbito do projecto PTDC/AGR-ALI/104385/2008.


II

RESUMO

Actualmente, tem merecido especial atenção a aplicação de compostos

antimicrobianos produzidos pelas bactérias do ácido láctico (BAL) como conservantes

naturais, impedindo o crescimento de patógenos nos alimentos.

O presente trabalho teve como objectivo a selecção de estirpes BAL previamente

isoladas do queijo do Pico (DOP), avaliando a actividade antimicrobiana e a sua eficácia

contra a Listeria monocytogenes no queijo fresco. As propriedades tecnológicas e

segurança das BAL produtoras de bacteriocinas foram igualmente investigadas para

avaliar a capacidade para serem utilizadas como culturas de arranque e/ou adjuntas no

fabrico do queijo. Os isolados foram caracterizados pelas suas propriedades

tecnológicas: produção de diacetilo, actividades enzimáticas, proteólise e lipólise. A sua

segurança foi avaliada através do estudo da actividade -hemolítica, produção de

DNase, gelatinase e histamina, e resistência aos antibióticos. Foi testada a produção de

bacteriocinas pelas BAL, bem como a cinética de crescimento, pH e produção de ácido

láctico no queijo fresco. Nestes queijos inoculados com as BAL produtoras de

bacteriocinas, foi ainda realizada uma avaliação sensorial por um painel de provadores

não treinados.

As propriedades antimicrobianas de 116 isolados BAL do queijo do Pico foram

avaliadas. Oito isolados apresentaram actividade contra a Listeria monocytogenes,

exibindo valores de concentração mínima inibitória que variaram entre 200 e 3200

UA ml-1

. Destes isolados, três apresentaram igualmente actividade contra o Clostridium

perfringens. Os oito isolados produtores de bacteriocinas foram identificados por

sequenciação do gene 16S rRNA como Lactococcus lactis (1 isolado) e Enterococcus

faecalis (7 isolados).

Alguns isolados apresentaram actividades enzimáticas promissoras para a

formação do aroma no queijo. Apenas um isolado foi capaz de degradar a caseína,

testando positivo para a actividade proteolítica e dois isolados demonstraram actividade

lipolítica. No entanto, a maioria dos isolados produziu diacetilo a partir do citrato.

Nenhum dos isolados produziu histamina ou apresentou actividade β-hemolítica e de

DNase, mas alguns isolados testaram positivo para a produção de gelatinase. Não foi

também encontrada resistência a antibióticos clinicamente importantes.

No geral, os isolados produtores de bacteriocinas apresentaram um crescimento

moderado no queijo fresco a temperaturas de refrigeração (4 °C), aumentando uma


III

unidade log em 3 dias. Apresentaram baixa capacidade acidificante, apesar do aumento

da produção de ácido láctico exibido por alguns isolados após 24 h. A actividade das

bacteriocinas foi apenas detectada no soro do queijo fresco inoculado com dois isolados

de Enterococcus (L2B21K3 e L3A21K6). Contudo, todos os queijos inoculados com os

isolados produtores de bacteriocinas inibiram a L. monocytogenes no ensaio de difusão

em agar. Com excepção de um isolado (L3A21M3), não foram encontradas diferenças

significativas (P>0,05) na avaliação global dos queijos frescos inoculados com os

isolados produtores de bacteriocinas, realizada por um painel não treinado de 50-52

provadores. Na apreciação global, os queijos inoculados com os isolados produtores de

bacteriocinas obtiveram uma classificação de intermédio a elevado, semelhante ao

queijo fresco sem BAL. Observou-se ainda uma correlação positiva (P<0,05) entre a

apreciação global e a firmeza dos queijos.

Para testar o efeito in situ da produção de bacteriocinas contra a L.

monocytogenes, foram elaborados queijos frescos com leite de vaca pasteurizado,

inoculados com BAL produtoras de bacteriocinas e contaminados com

aproximadamente 106

ufc ml-1

de L. monocytogenes. As contagens de L. monocytogenes

foram monitorizadas durante o armazenamento do queijo fresco a temperaturas de

refrigeração (4 °C) durante 15 dias. Todos os isolados controlaram o crescimento da L.

monocytogenes, apesar de alguns Enterococcus terem sido mais eficazes na redução das

contagens do patógeno. A redução foi de aproximadamente de 4 unidades log em

comparação com o controlo positivo, após 7 dias de incubação. Pelo contrário, no

queijo sem BAL observou-se um aumento da listéria em 4 log ufc g-1

. Duas

combinações de isolados Enterococcus (L3A21M3 e L3A21M8, ou L3B1K3 e

L3A21M3) apresentaram a maior redução nas contagens de L. monocytogenes no queijo

fresco, reduzindo aproximadamente 5 unidades log em 7 dias. A combinação de dois

isolados em particular (L3B1K3 e L3A21M3) poderá ter aplicação prática devido à

ausência de factores de virulência.

Em conclusão, a aplicação dos isolados produtores de bacteriocinas na produção

de queijo fresco pode contribuir para prevenir o crescimento de bactérias patogénicas

indesejáveis como a L. monocytogenes. Alguns isolados apresentaram um excelente

potencial para serem utilizados como culturas adjuntas/protectoras no fabrico do queijo.

PALAVRAS-CHAVE: Bactérias do ácido láctico, bacteriocinas, caracterização

tecnológica, critérios de segurança, queijo fresco, Listeria monocytogenes.


IV

ABSTRACT

In recent years, there has been a particular focus on the application of

antimicrobial compounds produced by lactic acid bacteria (LAB) as natural

preservatives to control the growth of spoilage and pathogenic bacteria in foods.

The purpose of this study was to select LAB strains with antimicrobial activity,

previously isolated from Pico cheese, and evaluate their efficacy against Listeria

monocytogenes in fresh cheese. In addition, the technological and safety relevant

properties from bacteriocin-producing LAB were investigated in order to determine

their ability for the efficient use as starter/adjunct cultures in cheese making. Isolates

were characterised in terms of their main technological properties: diacetyl production,

enzymatic activities, proteolysis and lipolysis. Their safety was also evaluated by

studying their β-haemolytic activity, production of DNase, gelatinase and histamine,

and antibiotic resistance. Bacteriocin production by LAB was tested in fresh cheese,

including LAB growth kinetics, cheese pH and titratable acidity. Additionally, the

sensorial attributes of fresh cheeses made with these LAB as adjunct cultures were

evaluated by a non-trained panel.

A total of 116 LAB isolates from an artisanal cheese (Pico cheese) were screened

for antimicrobial properties. Eight isolates were found to produce bacteriocins against

Listeria monocytogenes with minimum inhibitory units ranging from 200 to 3200

AU ml-1

. Three of the isolates were also active against Clostridium perfringens. The

bacteriocin-producing isolates were identified by 16S rRNA sequencing analysis as

Lactococcus lactis (1 isolate) and Enterococcus faecalis (7 isolates).

Some of the studied isolates displayed enzymatic activities with potential impact

on cheese flavour. Only one isolate was able to degrade casein, being positive for

proteolytic activity and two isolates showed lipolytic activity. Most of the isolates were

found to produce diacetyl from citrate. None of the isolates tested was found to produce

histamine or to possess -haemolytic and DNase activity, but some of the isolates were

positive for gelatinase production. No resistance to clinically relevant antibiotics was

also encountered.

In general, the bacteriocin-producing isolates presented a moderate growth in

fresh cheese at refrigeration temperatures (4 °C), increasing one log count in 3 days.

They presented slow acidifier capacity, despite the increasing production of lactic acid

displayed by some isolates after 24 h. Bacteriocin activity was only detected in the


V

whey of fresh cheese inoculated with two Enterococcus isolates (L2B21K3 and

L3A21K6), but all cheeses made with bacteriocin-producing isolates inhibited L.

monocytogenes in the agar diffusion bioassay. No significant differences (P>0,05) were

found on sensory overall evaluation made by a non-trained panel of 50-52 tasters using

the isolates as adjunct culture in fresh cheese, with the exception of one isolate

(L3A21M3). Cheeses inoculated with bacteriocin-producing isolates were attributed an

overall appreciation of average to high, similar to the fresh cheese without any LAB. A

positive correlation (P<0,05) was also observed between overall appreciation and

cheese firmness.

To test the effect of in situ bacteriocin production against L. monocytogenes, fresh

cheese was made from pasteurised cow’s milk inoculated with bacteriocin-producing

BAL and artificially contaminated with approximately 106

cfu ml-1

of L.

monocytogenes. Numbers of L. monocytogenes were monitored during storage of fresh

cheese at refrigeration temperature (4 °C) for up to 15 days. All isolates controlled the

growth of L. monocytogenes, although some Enterococcus were more effective in

reducing the pathogen counts. The reduction was of approximately 4 log units compared

to the positive control after 7 days of incubation. In comparison, an increase of 4 log

cfu g-1

in pathogen numbers was detected at the same time point in the absence of

bacteriocin-producing LAB. The combination of bacteriocin producing Enterococcus

sp. L3A21M3 and L3A21M8, or L3B1K3 and L3A21M3, optimized the reduction of L.

monocytogenes counts in fresh cheese, reducing in approximately 5 log units after 7

days. The combination of two isolates in particular (L3B1K3 and L3A21M3) showed

promising results due to the absence of important virulence factors.

In conclusion, the present work demonstrates that using bacteriocin-producing

isolates in the manufacture of fresh cheese might contribute to prevent the growth of

undesirable pathogenic bacteria such as L. monocytogenes. Some isolates presented

excellent potential to be used as adjunct/protective cultures for cheese making.

KEYWORDS: Lactic acid bacteria, bacteriocins, technological characterization, safety

criteria, fresh cheese, Listeria monocytogenes.


VI

ÍNDICE

RESUMO II

ABSTRACT IV

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4

2.1 O queijo 4

2.1.1 Perspectivas históricas 4

2.1.2 Queijo produzido em Portugal 4

2.1.2.1 Queijos Denominação de Origem Protegida (DOP) 5

2.1.3 Queijos DOP Açorianos 6

2.1.3.1 Queijo do Pico artesanal 6

2.1.3.2 Queijo de São Jorge 6

2.1.4 O queijo fresco 7

2.2 Microrganismos do queijo 8

2.2.1 Culturas de arranque 8

2.2.2 Culturas adjuntas 9

2.2.2.1 Culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico 10

2.2.2.2 Bolores e leveduras 11

2.3 Caracterização das bactérias do ácido láctico 11

2.3.1 Classificação das BAL 14

2.3.2 Principais BAL presentes no queijo do Pico 16

2.3.2.1 Género Lactococcus 16

2.3.2.2 Género Lactobacillus 17

2.3.2.3 Género Enterococcus 17

2.3.2.4 Género Streptococcus 18

2.3.2.5 Género Leuconostoc 19

2.4 Bacteriocinas 20

2.4.1 Classificação das bacteriocinas das bactérias Gram-Positivas 20

2.4.1.1 Classe I ou Lantibióticos 21

2.4.1.2 Classe II 23

2.4.1.3 Classe III 24

2.4.1.4 Classe IV 24

2.4.2 Mecanismos de acção das bacteriocinas 25

2.4.3 Auto-imunidade 28

2.4.4 Factores que afectam a eficiência das bacteriocinas 28


VII

2.4.5 Aplicações das bacteriocinas na indústria alimentar 29

2.4.6 Aplicações das bacteriocinas nos lacticínios 31

2.4.6.1 Nisina 31

2.4.6.2 Lacticina 3147 32

2.4.6.3 Pediocina PA-1 32

3. MATERIAIS E MÉTODOS 34

3.1 Isolados em estudo 34

3.2 Screening das BAL produtoras de bacteriocinas 34

3.2.1 Actividade antimicrobiana 34

3.2.2 Concentração mínima inibitória 35

3.3 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas 35

3.3.1 Identificação fenotípica 35

3.3.2 Identificação genética 36

3.4 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas 36

3.4.1 Actividades enzimáticas 36

3.4.2 Produção de diacetilo a partir do citrato 38

3.4.3 Actividade proteolítica 38

3.4.4 Actividade lipolítica 38

3.5 Avaliação da segurança 39

3.5.1 Produção de histamina 39

3.5.2 Actividade hemolítica 39

3.5.3 DNase 40

3.5.4 Gelatinase 40

3.5.5 Resistência a antibióticos 40

3.6 Avaliação da produção de bacteriocinas em queijo fresco 43

3.6.1 Elaboração do queijo fresco com as BAL 43

3.6.2 Determinação do pH do queijo 43

3.6.3 Acidez titulável 43

3.6.4 Determinação da humidade 44

3.6.5 Contagens das BAL no queijo 44

3.6.6 Determinação da actividade antimicrobiana no queijo 44

3.6.7 Provas organolépticas 45

3.7 Avaliação do efeito das BAL no crescimento de L. monocytogenes em queijo fresco 45

3.7.1 Elaboração do queijo fresco com BAL e L. monocytogenes 45

3.7.2 Avaliação do crescimento de L.monocytogenes no queijo fresco 46

3.8 Análise estatística 46


VIII

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 47

4.1 Actividade antimicrobiana 47

4.2 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas 49

4.3 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas 51

4.3.1 Actividades enzimáticas 51

4.3.2 Propriedades tecnológicas 53

4.4 Avaliação da segurança das BAL 55

4.4.1 Histamina, Hemólise, DNase e Gelatinase 55

4.4.2 Resistência a antibióticos 57

4.5 Aplicação das BAL como culturas de arranque/adjuntas no queijo fresco 59

4.5.1 Avaliação de parâmetros químicos, crescimento e actividade antimicrobiana 59

4.5.2 Avaliação organoléptica 66

4.6 Efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em queijo fresco 69

4.6.1 Adição individual dos isolados 69

4.6.2 Efeito de culturas mistas 72

5. CONCLUSÃO 76

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 78

ANEXOS 97


1

1. INTRODUÇÃO

Actualmente, os consumidores estão cada vez mais atentos ao risco que constitui a

presença de microrganismos patogénicos e aditivos químicos nos alimentos, o que

conduz à pesquisa de conservantes naturais e eficazes para controlo microbiológico. A

descoberta que certos péptidos bacterianos possuem actividade inibitória contra outras

bactérias, fez despertar o interesse na descoberta e aplicação destes péptidos como

conservantes naturais. Estes péptidos designados por bacteriocinas, podem exibir um

espectro de actividade contra as espécies homólogas ou apresentar um amplo espectro

de acção contra uma variedade de microrganismos Gram-positivos e em particular,

contra certos patógenos. Alimentos tradicionais, como o queijo do Pico (DOP)

produzido com leite cru, possuem uma microflora própria que poderá ser explorada na

pesquisa de novas estirpes de bactérias do ácido láctico (BAL) produtoras de

bacteriocinas, e que podem apresentar elevada actividade contra bactérias indesejáveis

como a Listeria monocytogenes.

A Listeria monocytogenes apresenta-se como um dos patógenos com maior

impacto na indústria dos lacticínios e o seu controlo é muito importante, em particular,

nos queijos produzidos com leite cru (Wan et al., 1997; Gandhi e Chikindas, 2007).

Este microrganismo psicrotrófico está largamente distribuído no ambiente, é capaz de

crescer a temperaturas que variam desde 1 a 45 °C, em valores de pH relativamente

baixos e é altamente tolerante ao sal, o que torna difícil o seu controlo nos alimentos

(Bizani et al., 2008; Sip et al., 2012). A L. monocytogenes provoca assim uma grave

infecção alimentar que afecta essencialmente as mulheres grávidas, recém-nascidos,

idosos e adultos com o sistema imunitário comprometido (Gandhi e Chikindas, 2007).

Leite e queijos são considerados os alimentos de maior risco, embora possam ocorrer

surtos com outros tipos de alimentos como as saladas e vegetais prontos para o consumo

(Bello et al., 2012). O controlo ou mesmo a eliminação deste patógeno utilizando meios

naturais em substituição dos conservantes químicos, constitui uma tendência actual

imposta pelas preferências dos consumidores. Dessa forma, a aplicação de BAL

produtoras de bacteriocinas na indústria alimentar, nomeadamente no controlo da L.

monocytogenes no queijo, pode constituir uma vantagem a ser explorada pela indústria

de lacticínios.


2

Desta forma, o presente trabalho teve como objectivo pesquisar a presença de

bactérias produtoras de bacteriocinas em BAL isoladas no queijo do Pico e avaliar a

eficácia destas BAL produtoras de bacteriocinas no controlo da L. monocytogenes em

queijo fresco. Foi ainda objectivo do trabalho o estudo das características tecnológicas e

de segurança destas BAL, de modo a avaliar a sua aplicação potencial como culturas de

arranque e/ou adjuntas no fabrico de queijo. Finalmente pretendeu-se avaliar também o

efeito destas BAL na qualidade organoléptica do queijo fresco, realizando-se uma prova

com um painel de avaliadores não treinado.

A estrutura global da tese divide-se em 5 capítulos. No primeiro capítulo -

Introdução, é feito um enquadramento do estudo, apresentação dos objectivos e

explicação da estrutura da tese.

O segundo capítulo é constituído pela Revisão Bibliográfica, onde é feita uma

discussão actual da temática escolhida, com apresentação de bibliografia relacionada

com o estudo. É feita uma abordagem ao queijo produzido em Portugal e aos

microrganismos que funcionam como culturas de arranque e/ou adjuntas. As BAL são

caracterizadas, dando-se especial destaque à produção e actuação das bacteriocinas.

Finalmente é descrita a aplicação das bacteriocinas na indústria alimentar, com especial

destaque nos lacticínios.

O terceiro capítulo é constituído pelos Materiais e Métodos, onde são descritas as

metodologias aplicadas ao longo do trabalho experimental, nomeadamente para o

screening das BAL produtoras de bacteriocinas, sua identificação, caracterização

tecnológica e avaliação da segurança; avaliação da produção de bacteriocinas em queijo

fresco e avaliação do efeito destas BAL no crescimento de L. monocytogenes nos

mesmos queijos. Apresentam-se ainda as ferramentas estatísticas utilizadas no

tratamento de dados.

Os Resultados e Discussão são apresentados no quarto capítulo. Aqui são

apresentados os resultados obtidos na aplicação das metodologias, fazendo-se a sua

análise e discussão para cada um dos parâmetros estudados, face a outros estudos

publicados no âmbito deste tema.


3

No quinto capítulo - Conclusão, são expostas as conclusões gerais do trabalho e

apresentadas sugestões para futuros estudos, envolvendo a aplicação das bacteriocinas

na melhoria da qualidade dos produtos lácteos regionais.


4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O queijo

2.1.1 Perspectivas históricas

O queijo encontra-se em quase todas as culturas e é, provavelmente, um dos

alimentos processados mais antigo. No passado, o leite era um alimento sazonal e a sua

transformação em queijo seria uma forma de conservar e utilizar os seus nutrientes

durante o Inverno (Blom e Weréen, 2002; Oliveira, 2010).

A descoberta de resíduos de leite em recipientes de cerâmica de 7000 A.C.

fornece uma prova da utilização do leite pelos povos primitivos (Oliveira, 2010).

Notavelmente, a descoberta de recipientes de cerâmica com pequenos buracos datados

de 6000 A.C. pode ser associada à produção de queijo, fornecendo evidências diretas

para o fabrico do queijo no período neolítico (Salque et al., 2013).

A introdução da indústria leiteira foi um passo importante na agricultura

primitiva, com a rápida adopção dos produtos derivados do leite como componentes

principais da dieta dos agricultores pré-históricos (Salque et al., 2013).

O processamento do leite, particularmente a produção de queijo, constituíu um

importante passo no desenvolvimento porque, não só permitiu a conservação dos

produtos lácteos durante mais tempo e o seu transporte fácil, mas também tornou o leite

como mercadoria digestível para as novas gerações de agricultores (Salque et al., 2013).

2.1.2 Queijo produzido em Portugal

Antes dos anos 30 do século passado, em Portugal Continental, produziam-se

queijos apenas a partir do leite de ovelha e de cabra, estando o leite de vaca

direccionado para o consumo sem transformação (Oliveira, 2010). O leite desnatado e o

leitelho eram destinados à alimentação de animais e consumidos nos locais de produção.

No entanto nos Açores, especialmente nas ilhas de São Jorge, São Miguel e Terceira, a

produção queijeira de leite de vaca já estava bastante enraizada, tendo vindo a

desenvolver-se e a afirmar-se até aos nossos dias (Oliveira, 2010).


5

2.1.2.1 Queijos com Denominação de Origem Protegida (DOP)

De acordo com o Regulamento (CE) nº 510/2006 de 20 de Março a Denominação

de Origem Protegida representa o nome de uma região, de um local determinado ou, em

casos excepcionais, de um país, que serve para designar um produto agrícola ou um

género alimentício:

originário dessa região, desse local determinado ou desse país;

cuja qualidade ou características se devem essencial ou exclusivamente a um

meio geográfico específico, incluindo os factores naturais e humanos;

cuja produção, transformação e elaboração ocorrem na área geográfica

delimitada.

Os queijos DOP são obtidos seguindo métodos tradicionais bem estabelecidos, em

que os mais famosos são os queijos de ovelha Serra da Estrela, Azeitão, Serpa e Castelo

Branco e São Jorge. Estes queijos são tipicamente designados consoante a região onde

são manufacturados, e todos eles possuem características únicas associadas aos seus

modos de manufactura artesanais e de cura (Reis e Malcata, 2011). A maioria destes

queijos são manufacturados com leite cru de ovelha ou cabra, sem adição deliberada de

microflora starter ou não starter (Freitas e Malcata, 2000). São excepções os queijos de

São Jorge e do Pico, que são manufacturados com leite de vaca cru.

Apesar das muitas características distintas entre os queijos, estes partilham alguns

aspectos tecnológicos que englobam um número de etapas básicas: a coagulação, a

desidratação, a moldagem e a salga. Embora a textura e a qualidade dos queijos finais

sejam fortemente determinados pelas etapas de processamento anteriores, é durante a

cura que a maioria dos aspectos característicos da textura e do flavour se desenvolvem,

originando assim distintas variedades de queijo (Reis e Malcata, 2011)

Actualmente, são 11 os queijos portugueses com estatuto DOP: queijo do Pico,

queijo de São Jorge, queijo de cabra transmontano, queijo de Nisa, queijos da Beira

Baixa (queijo de Castelo Branco, queijo Amarelo da Beira Baixa, queijo Picante da

Beira Baixa), queijo de Azeitão, queijo Terrincho, queijo Rabaçal, queijo de Évora,

queijo Serpa e queijo Serra da Estrela (Comissão Europeia, 2013).


6

2.1.3 Queijos DOP Açorianos

2.1.3.1 Queijo do Pico artesanal

O queijo do Pico artesanal é um queijo curado, resultante do escoamento lento da

coalhada após coagulação do leite de vaca cru, com coalho de origem animal. Os seus

ingredientes são: leite de vaca cru, coalho animal e sal (Associação de Produtores de

Queijo do Pico, 1996).

O queijo do Pico constitui uma Denominação de Origem Protegida de acordo com

as normas da União Europeia desde Outubro de 1996 (Câmara, 2012). A área

geográfica de produção cinge-se à ilha do Pico, sendo a denominação de origem

protegida gerida pela Associação de Produtores de Queijo do Pico.

O queijo do Pico apresenta um formato cilíndrico, com um diâmetro

compreendido entre 16 e 17 cm, altura entre 2 e 3 cm, crosta amarela e um peso médio

entre 650 e 800 g. A pasta apresenta uma cor branca amarelada e tem uma textura

irregular, com olhos, pouco compacta e muito untuosa, sendo a consistência mole e

pastosa. Possui um sabor activo e salgado e tem um aroma característico, intenso e

agradável. O tempo mínimo de cura é de 20 dias (Associação de Produtores de Queijo

do Pico, 1996).

2.1.3.2 Queijo de São Jorge

De acordo com o Decreto Regulamentar Regional nº 24/86/A o queijo de São

Jorge é um queijo português curado de consistência firme, pasta amarelada, dura ou

semidura e que apresenta uma estrutura quebradiça.

Este queijo é manufacturado a partir de leite de vaca cru acidificado por uma

cultura starter obtida do soro do dia anterior. É produzido em fábricas de queijo de

pequena escala na ilha de São Jorge e obteve o estatuto DOP em 1986 (Kongo et al.,

2007) sendo a entidade certificadora do produto a Confraria do Queijo de São Jorge, e o

agrupamento gestor da DOP a UNIQUEIJO - União de Cooperativas Agrícolas da Ilha

de São Jorge.

A acidificação é feita a 30 °C, seguida pela cozedura da coalhada a 37 °C,

escorrimento do soro, moldagem da coalhada, salga e por fim o processo de cura que


7

tem uma duração mínima de 3 - 4 meses. No final da cura (tipicamente 4 - 6 meses) o

queijo de São Jorge apresenta olhos pequenos e irregulares disseminados na massa e o

seu flavour caracteriza-se por ser bouquet forte, limpo e ligeiramente picante,

particularidades que se acentuam com o seu envelhecimento (Kongo et al., 2007;

Kongo et al., 2009).

2.1.4 O queijo fresco

Segundo a Norma Portuguesa (NP - 1921, 1985), o queijo fresco tradicional

português é definido como um produto não maturado, obtido por dessoramento lento,

após a coagulação dos leites inteiro, total ou parcialmente desnatado. Este produto tem

como ingredientes essenciais o leite de vaca, cabra ou ovelha ou suas misturas, culturas

bacterianas lácticas específicas e coalho ou outras enzimas coagulantes, e como

ingredientes facultativos o leite em pó, nata, leitelho, proteínas do soro, sal e cloreto de

cálcio.

O queijo fresco apresenta uma forma cilíndrica, de dimensões variáveis entre os 5

e os 8 cm de diâmetro e os 3 e os 5 cm de altura e pesa cerca de 70 a 150 g (Oliveira,

2010). O seu aspecto é uniforme e sem crosta com uma cor branca ou branca amarelada

uniforme e de consistência mole. Os queijos frescos devem ser conservados em

refrigeração, a uma temperatura compreendida entre 0 e 5 °C, tendo nessas condições

um período de validade de 5 dias (Oliveira, 2010).

O queijo fresco apresenta uma elevada actividade da água, pH quase neutro, baixo

teor de sal e sem a adição de conservantes. Estas características proporcionam um

excelente substrato para o crescimento de microrganismos, resultando na redução da

vida de prateleira do queijo fresco (Pingitore et al., 2012). Em particular, a sua elevada

percentagem de água e a ausência de protecção que a crosta fornece aos queijos, torna o

queijo fresco frágil do ponto de vista da segurança do consumidor (Oliveira, 2010).

O consumo de queijo fresco pode assim envolver riscos para a saúde do

consumidor, podendo ser minimizados pela aplicação da Portaria nº 861/84. Esta

portaria fundamentalmente, proíbe a venda de queijo fresco feito a partir de leite cru,

pelo que o leite tem de ser submetido a pasteurização ou outro tratamento térmico

equivalente (Oliveira, 2010). Para além da utilização de leite pasteurizado no fabrico de

queijo fresco, é de crucial importância a utilização de boas práticas de higiene fabril, o


8

controlo sistemático dos processos envolvidos, o correcto funcionamento dos

equipamentos e a utilização de uma embalagem adequada, tendo em vista o controlo do

risco do consumo do queijo fresco (Oliveira, 2010).

2.2 Microrganismos do queijo

Os microrganismos são um componente essencial em todas as variedades de

queijo maturado e desempenham funções importantes durante a manufactura e

maturação deste. A sua microflora pode ser dividida em dois grupos principais: culturas

de arranque (starters) e flora secundária (Beresford et al., 2001).

As bactérias do ácido láctico (BAL) são utilizadas como culturas de arranque para

o fabrico do queijo, podendo ser adicionadas inicialmente ou fazerem parte da

microflora natural do leite. Na flora secundária estão presentes além das BAL, os

bolores e as leveduras que contribuem para a maturação do queijo, influenciando a

textura, sabor e aroma do produto final (Wouters et al., 2002).

2.2.1 Culturas de arranque

As culturas de arranque ou bactérias starter têm como função acidificar o leite e

como consequência inibir o crescimento de outras bactérias (Wouters et al., 2002;

Carminati et al., 2010). Estas podem ser definidas como bactérias que produzem ácido

suficiente para reduzir o pH do leite para menos de 5,3 em 6 horas a 30 - 37 °C

(Beresford et al., 2001).

O uso de culturas de arranque proporciona produtos seguros a nível

microbiológico com propriedades organolépticas e estruturais reproduzíveis (Wouters et

al., 2002; Carminati et al., 2010; Renault, 2010). Estas bactérias podem ser adicionadas

no início da manufactura ou podem surgir como contaminantes naturais do leite, como é

o caso de muitas variedades de queijo artesanais produzidos com leite cru (Beresford et

al., 2001). As bactérias de arranque mais comuns são membros dos géneros

Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc e Enterococcus (Beresford et

al., 2001). Os starters industriais para a maioria dos queijos têm por base espécies

individuais de Lactococcus lactis (Wouters et al., 2002).


9

A maioria das culturas de arranque mesofílicas inclui espécies como Lactococcus

lactis ssp. lactis e o Lactococcus lactis ssp. cremoris (von Wright, 2012). As culturas

termofílicas são compostas por estirpes individuais ou múltiplas de Streptococcus

thermophilus e de lactobacilos termófilos como o Lactobacillus delbrueckii ssp.

delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. delbrueckii ssp. lactis ou o Lb.

helveticus (Beresford et al., 2001).

As culturas de arranque de lactococos mesófilos são usadas na produção de uma

grande variedade de queijos, manteiga e leites fermentados. A selecção destas culturas

tem por base a sua acção na fermentação e nas propriedades pretendidas do produto.

Também as propriedades de manuseamento e estabilidade durante a produção têm

constituído um critério de selecção das culturas de arranque (Marshall, 1991).

Além da produção de ácido durante o processo de fermentação, as culturas de

arranque também contribuem para a maturação do queijo, estando as suas enzimas

envolvidas na proteólise e na conversão dos aminoácidos em compostos que contribuem

para o aroma do produto final (Beresford et al., 2001). Durante a maturação do queijo, a

proteólise é a primeira etapa bioquímica que contribui para o aroma e textura

pretendida. Os lactococos possuem um sistema proteolítico que juntamente com outras

enzimas como a quimosina, são responsáveis pela conversão das caseínas em péptidos e

aminoácidos (Wouters et al., 2002). Os aminoácidos são os precursores chave para o

aroma principal do queijo. Eles são metabolizados por acção de enzimas que convertem

os aminoácidos em aldeídos, álcoois, cetonas, aminas, ácidos, ésteres e compostos que

contêm enxofre, que contribuem para o aroma do queijo (Urbach, 1995; Yvon et al.,

1998).

2.2.2 Culturas adjuntas

As culturas adjuntas podem ser definidas como as que são adicionadas ao queijo

com outros objectivos para além da produção de acidez, embora frequentemente sejam

compostas por microrganismos provenientes dos ingredientes ou do ambiente de fabrico

do queijo (Beresford et al., 2001) As culturas adjuntas seleccionadas das BAL (non

starter lactic acid bacteria - NSLAB) podem ser adicionadas para a acelerar o processo

de maturação e para produção do aroma pretendido. Também podem eliminar defeitos


10

produzidos por NSLAB acidentais, visto que inibem o seu desenvolvimento (Wouters et

al., 2002).

2.2.2.1 Culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico

Durante a maturação do queijo o número de bactérias da cultura de arranque

diminui e as culturas adjuntas adicionadas na forma de culturas definidas ou que

tiveram origem no leite e ambiente, crescem e atingem números superiores aos do

starter (Wouters et al., 2002). As culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico

(NSLAB) não fazem parte da flora de arranque normal, têm geralmente dificuldade em

crescer no leite e não contribuem para a produção de ácido no queijo (Beresford et al.,

2001). Estas são essencialmente constituídas por lactobacilos e pediococos mesófilos,

correspondendo a uma porção considerável da flora microbiana da maioria dos queijos

durante a maturação.

Muitas espécies de lactobacilos mesófilos têm sido isolados dos queijos, mas os

mais comuns são o Lb. casei/paracasei, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus e o Lb. curvatus.

O Pediococcus acidilactici e o Pe. pentosaceus são os pediococos mais frequentemente

encontrados no queijo (Fitzsimons et al., 1999; Beresford et al., 2001).

A composição de NSLAB varia com o dia de produção e com a idade do queijo

(Williams e Banks, 1997; Fitzsimons et al., 2001; Wouters et al., 2002). As NSLAB

têm a capacidade de crescer sob as elevadas condições selectivas existentes na

maturação do queijo. Nas primeiras horas da produção do queijo a lactose foi já

utilizada para a fermentação das culturas de arranque, o pH situa-se entre 4,9 e 5,3, a

temperatura é inferior a 13 °C, o teor de humidade é inferior a 50%, a concentração de

sal varia entre 4 - 6% e existe pouco oxigénio disponível, o que torna o queijo em

maturação num ambiente adverso para os microrganismos. Como as NSLAB possuem

uma grande variedade de enzimas hidrolíticas e são capazes de efectuar proteólise e

lipólise, conseguem crescer no queijo em maturação (Williams e Banks, 1997; Wouters

et al., 2002).

Como as NSLAB dominam a microflora de muitos queijos curados elas

desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do sabor e aroma durante a

maturação. De facto, elas contribuem para a formação de pequenos péptidos e

aminoácidos, que convertem em álcoois, aldeídos, ácidos, ésteres e compostos


11

sulfurosos proporcionando os sabores aromas específicos dos queijos curados (Wouters

et al., 2002).

2.2.2.2 Bolores e leveduras

Os bolores são muito usados na produção de queijos semi-moles em conjunto com

as BAL acidificantes. O seu principal papel é o de realçar o sabor e aroma e de

modificar o corpo e a estrutura do queijo (Wouters et al., 2002).

O pH baixo, o baixo teor de humidade, a baixa temperatura e o elevado teor de sal

do queijo em maturação favorece também o crescimento das leveduras (Beresford et al.,

2001). Deste modo, as leveduras são encontradas numa grande variedade de queijos;

contudo, na maior parte dos casos, o seu papel na maturação é pouco conhecido

(Beresford et al., 2001; Wouters et al., 2002). Pensa-se que estão envolvidas com a

descida da acidez devido à sua capacidade de metabolizar o lactato, permitindo assim o

desenvolvimento da flora microbiana secundária (Wouters et al., 2002). Em alguns

queijos as leveduras contribuem para o desenvolvimento da textura e do aroma do

queijo durante a maturação (Beresford et al., 2001).

2.3 Caracterização das Bactérias do Ácido Láctico (BAL)

As BAL constituem um grupo heterogéneo de géneros que partilham muitas

características fisiológicas importantes (Quadro 1). As BAL devem a sua designação à

capacidade de fermentar glúcidos em ácido láctico por via de metabolismo homo- ou

heterofermentativo (Settanni e Moschetti, 2010).

As BAL subdividem-se em dois grupos segundo a natureza e a concentração dos

produtos finais produzidos a partir da glucose: as homofermentativas que produzem

quase exclusivamente lactato, pela via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) e as

heterofermentativas que produzem, para além de CO2, lactato e etanol, pela via hexose-

monofosfato ou via 6P-gluconato/fosfocetolase (Inês et al., 2008).

As BAL são caracterizadas por serem Gram-positivas, não formadoras de esporos,

catalase negativas, desprovidas de citocromos, anaeróbias tolerantes, fastidiosas,

tolerantes aos ácidos, com metabolismo estritamente fermentativo sendo o ácido láctico

o principal produto final da fermentação do açúcar (Axelsson, 1998). Possuem baixo


12

teor molar de G + C, são oxidase negativas, não reduzem nitratos a nitritos (Carr, et al.,

2002) e crescem apenas em meios complexos (Schleifer e Ludwig, 1995). Elas

dependem da fermentação do açúcar para obter energia, e como não possuem

citocromos, obtêm energia por fosforilação a nível do substrato em vez da cadeia de

transporte de electrões e fosforilação oxidativa (Willey et al., 2009). As BAL também

são geralmente conhecidas por serem organismos não móveis, com excepção do

Lactobacillus agilis e das espécies descritas recentemente: Lactobacillus ghanensis

(Nielsen et al., 2007) e Lactobacillus capillatus (Chao et al., 2008). A heterogeneidade

deste grupo é bem expressa nos seus traços morfológicos, visto que são bacilos ou

cocos, apresentam-se como células individuais ou agrupadas, tétradas e de cadeia curta

ou longa (Settanni e Moschetti, 2010).

A característica chave deste grupo é a sua incapacidade para sintetizar grupos

porfirínicos (e.g. heme), o que explica o facto de nas condições de cultura utilizadas em

laboratório as BAL serem desprovidas de citocromos e de "verdadeira" catalase.

Contudo, podem ocorrer excepções a esta descrição geral, já que algumas estirpes de

BAL produzem peroxidases ou uma "pseudocatalase". Em meios contendo hematina ou

compostos similares, algumas estirpes podem produzir catalase ou mesmo citocromos, e

em alguns casos constituir uma cadeia de transporte electrónico funcional (Inês et al.,

2008).

Devido às capacidades biossintéticas limitadas e os seus elevados requisitos em

termos de fontes de carbono e azoto, o habitat natural das BAL é constituído por

ambientes nutricionalmente ricos (Salminen e von Wright, 1998). As BAL estão

presentes em ambientes muito diversos, como o leite e seus derivados, carne e seus

derivados, vegetais, bebidas, solo, águas residuais, fazendo também parte da microbiota

dos tractos respiratório, intestinal e genital do homem e de animais (Schleifer e Ludwig,

1995).

As bactérias lácticas são essencialmente mesófilas, com algumas linhagens

termófilas, sendo capazes de crescer num intervalo de temperaturas de 5 a 45 °C. Têm a

capacidade de crescer a pH 3,8 e são proteolíticas fastidiosas em relação a alguns

aminoácidos. Produzem um grande número de enzimas glicolíticas, lipolíticas e

proteolíticas, que transformam os nutrientes fundamentais do leite e do queijo em

compostos com propriedades sensoriais desejáveis (Silva, 2011).


13

Quadro 1. Géneros comuns das BAL e suas características diferenciais (Wright e Axelsson, 2012).

*ND - não determinado

a Algumas estirpes de Weissella têm forma de bacilos.

b Na literatura antiga os lactococos são referidos como estreptococos do Grupo N.

Família

Género

Características

Forma

CO2 a

partir

da

glucose

Crescimento

a 10 °C

Crescimento

a 45 °C

Crescimento

em 6,5% de

NaCl

Crescimento

em 18% de

NaCl

Crescimento

a pH 4,4

Crescimento

a pH 9,6

Tipo de

ácido

láctico

Aerococcaceae Aerococcus Cocos

(tétradas) - + - + - - + L

Carnobacteriaceae Carnobacterium Bacilos - + - ND* - ND - L

Enterococcaceae

Enterococcus Cocos - + + + - + + L

Tetrageonococcus Cocos

(Tétradas) + - + + - Variável +

Vagococcus Cocos + - - - -

Lactobacillaceae

Lactobacillus Bacilos Variável Variável Variável Variável - Variável - D, L, DL

Pediococcus Cocos

(tétradas) - Variável Variável Variável - + - L, DL

Leuconostocaceae

Leuconostoc Cocosa

+ + - Variável - Variável - D

Oenococcus + + - Variável - Variável - D

Weissella + + - Variável - Variável - D, DL

Streptococcaceae Lactococcus

b Cocos - + - - - Variável - L

Streptococcus - - Variável - - - - L


14

Genericamente as BAL são usadas na indústria alimentar com fins tecnológicos,

sendo acidificantes, tolerantes aos sais biliares, com capacidade de adesão ao tecido

epitelial do intestino (Gonçalves, 2009) e produtoras de substâncias antimicrobianas

designadamente ácidos orgânicos, peróxido de hidrogénio, enzimas, metabolitos de

baixo peso molecular e bacteriocinas (Piard e Desmazeaud, 1991; Holzapfel et al.,

1995; Kucerova et al., 2007; Mirhosseini et al., 2008; Ahmadova et al., 2013).

Devido a algumas das suas propriedades metabólicas, as BAL são geralmente

empregues pelo seu elevado contributo no flavour, textura, valor nutritivo, segurança

microbiológica e prolongamento da vida de prateleira dos produtos fermentados

(Caplice e Fitzgerald, 1999; Leroy e De Vuyst, 2004; Topisirovic et al., 2006; Settanni

e Corsetti, 2008; Settanni e Moschetti, 2010). Dada a sua vasta utilização em produtos

fermentados tradicionais, e como resultado desta situação, a maioria das BAL, como os

Lactococcus, Oenococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus e alguns

Streptococcus sp., possuem o estatuto GRAS, ou seja, considerados em geral como

seguros (Generally Regarded As Safe) concedido pela American Food and Drug Agency

(FDA) (Collins et al., 2010; Balciunas et al., 2013). Na Comunidade Europeia o

estatuto QPS, Qualified Presumption of Safety é concedido pela Autoridade Europeia de

Segurança Alimentar (EFSA; Câmara, 2012).

As espécies do género Enterococcus e algumas espécies de Streptococcus são

patogénicas na natureza e por esse motivo não possuem estatuto GRAS (Collins et al.,

2010). Devido a preocupações com a segurança, nenhum membro do género

Enterococcus pode ser proposto para estatuto QPS. As preocupações relacionadas com

estas bactérias devem-se aos factores de virulência que estas possuem e à resistência

que apresentam a uma variedade de antibióticos (EFSA, 2007; Franz et al., 2010).

2.3.1 Classificação das BAL

A primeira classificação das BAL foi efectuada por Orla-Jensen em 1919, que

agrupou as BAL nos géneros Betabacterium, Thermobacterium, Streptobacterium,

Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus e Microbacterium (Axelsson, 2004). As

alterações consideráveis ocorridas na taxonomia das BAL, com a criação de novos

géneros, espécies e sua reclassificação e reorganização, conduziram a que destes


15

géneros apenas persista actualmente o género Streptococcus (Inês et al., 2008;

Axelsson, 2004).

Na taxonomia actual, as BAL fazem parte do Filo Firmicutes, da Classe Bacillus,

da Ordem Lactobacilae e das Famílias Aerococcaceae, Carnobacteriaceae,

Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae e Streptococcaceae (Wright e

Axelsson, 2012).

As BAL incluem os géneros Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella (Axelsson, 2004; Holzapfel et al., 2001;

Wright e Axelsson, 2012). O género Bifidobacterium frequentemente considerado no

mesmo contexto das BAL genuínas, partilha algumas características típicas importantes,

mas não está filogeneticamente relacionado e possui um modo de fermentação do

açúcar único (Axelsson, 1998).

A abordagem tradicional na classificação das BAL em diferentes géneros

baseava-se fundamentalmente em caracteres fenotípicos, nomeadamente: (i)

morfológicos (forma das células, endósporos, flagelos, reacção de Gram) e das colónias

(cor, dimensões, forma); (ii) bioquímicos - modo de fermentação da glucose,

configuração do ácido láctico produzido e (iii) fisiológicos - crescimento a diferentes

temperaturas, capacidade de crescer em elevadas concentrações de sal e tolerância a pH

ácido e alcalino (Axelsson, 1998; Axelsson, 2004; Inês et al., 2008). Ainda que estas

características continuem a ser usadas como diferenciais a nível de alguns géneros de

BAL, outros métodos fenotípicos foram introduzidos na classificação das BAL, tais

como os perfis metabólicos e enzimáticos, a tipagem fágica e bacteriocínica e a

serotipagem. Com o desenvolvimento dos métodos quimiotaxonómicos surgiu também

a análise de perfis de ácidos gordos, de perfis de proteínas celulares totais ou a análise

de constituintes da parede celular (Inês et al., 2008).

A aplicação de técnicas moleculares na classificação e identificação das BAL

permitiu substituir e/ou complementar as metodologias clássicas baseadas nas

características fenotípicas. Dos métodos moleculares destacam-se, entre outros, a

sequenciação do gene 16S rRNA e de outros genes, a determinação do teor molar de

Guanina + Citosina, as hibridações DNA-DNA e DNA-RNA, a análise de

polimorfismos dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Lenght Polymorphism


16

- RFLP), a eletroforese em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE) e

diversas técnicas baseadas na reacção em cadeia da polimerase (PCR) tais como

Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Ribossomal DNA

Restriction Analysis (ARDRA) e Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP)

(Gonçalves, 2009).

As BAL típicas como Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,

Pediococcus e Streptococcus, têm um teor molar de G + C inferior a 50% e pertencem

ao ramo Clostridium. As que apresentam um teor molar de G + C superior a 50% estão

incluídas no ramo Actinomycetes, da qual faz parte o género Bifidobacterium, assim

como outros géneros como por exemplo Brevibacterium, Corynebacterium,

Microbacterium e Propionibacterium que também são importantes na indústria

alimentar (Schleifer e Ludwig, 1995).

2.3.2 Principais BAL presentes no queijo do Pico

2.3.2.1 Género Lactococcus

O género Lactococcus caracteriza-se por serem cocos Gram-positivos que

aparecem individuais, aos pares ou em cadeia, não formadores de esporos, sem

mobilidade, anaeróbios facultativos, não β-hemolíticos, catalase negativos e com

crescimento a 10 °C mas não a 45 °C. Geralmente crescem a 4% (p/v) de NaCl com

excepção do Lc. lactis subsp. cremoris que apenas tolera 2% (p/v) de NaCl. Apresentam

metabolismo fermentativo, sendo o ácido láctico L(+) o produto final predominante da

fermentação da glucose. Quanto ao teor molar de G + C do DNA situa-se no intervalo

de 34 a 43% (Teuber, 1995).

Este género é composto por sete espécies: Lc. lactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum,

Lc. raffinolactis, Lc. piscium, Lc. chungangensis e o Lc. fujiensis (von Wright, 2012).

Os lactococos isolados a partir de produtos lácteos fermentados artesanais sem

aplicação de culturas starter industriais, e a partir de ambientes não lácteos são

geralmente referidos como lactococos "selvagens". Os lactococos selvagens

desempenham um papel importante na produção de aroma no queijo e outros produtos

lácteos (Wouters et al., 2002).


17

2.3.2.2 Género Lactobacillus

O género Lactobacillus caracteriza-se por serem Gram-positivos, não formadores

de esporos, bacilos ou cocobacilos com um teor molar de G + C inferior a 50%. São

estritamente fermentativos, aerotolerantes ou anaeróbios, acidúricos ou acidófilos e têm

necessidades nutricionais complexas (e.g. para os glúcidos, aminoácidos, péptidos,

ésteres de ácidos gordos, sais, derivados dos ácidos nucleicos e vitaminas) (Hammes e

Vogel, 1995).

Com a glucose como fonte de carbono os lactobacilos podem ser

homofermentativos produzindo mais de 85% de ácido láctico, ou heterofermentativos

produzindo ácido láctico, CO2, etanol e/ou ácido acético em quantidades equimolares

(Hammes e Vogel, 1995).

Os lactobacilos dividem-se em três grupos (Hammes e Vogel, 1995; Barrangou et

al., 2012):

Grupo A: lactobacilos homofermentativos obrigatórios. As hexoses são quase

exclusivamente (> 85%) fermentadas em ácido láctico pela via de Embden-Meyerhof-

Parnas (EMP). Os organismos possuem a frutose-1,6-bifosfato-aldolase mas não

possuem a fosfocetolase, e por isso, as pentoses e o gluconato não são fermentados.

Grupo B: lactobacilos heterofermentativos facultativos. As hexoses são quase

exclusivamente fermentadas em ácido láctico pela via de Embden-Meyerhof-Parnas

(EMP). Os organismos possuem a aldolase e a fosfocetolase, e por isso, não só

fermentam a hexose mas também as pentoses. Na presença de glucose, as enzimas da

via do fosfogluconato são inibidas.

Grupo C: lactobacilos heterofermentativos obrigatórios. As hexoses são

fermentadas pela via do fosfogluconato produzindo lactato, etanol (ácido acético) e CO2

em quantidades equimolares. As pentoses entram nesta via e podem ser fermentadas.

2.3.2.3 Género Enterococcus

Os enterococos são cocos Gram-positivos que se apresentam de forma individual,

em pares ou em cadeia curta. Não esporulados, podem ser móveis, anaeróbios

facultativos, com metabolismo homofermentativo, onde o produto final predominante


18

da fermentação da glucose é o ácido láctico L (+), geralmente são catalase negativos,

mas algumas estirpes produzem uma pseudocatalase, e possuem elevados requisitos

nutricionais (Devriese e Pot, 1995).

Os enterococos, aparecem frequentemente em grande número nos lacticínios,

sendo as espécies predominantes o Enterococcus faecalis e o Enterococcus faecium

(Giraffa, 2003). A presença destes tem sido geralmente considerado como uma

consequência das condições sanitárias insuficientes durante o processamento. No

entanto, várias estirpes apresentam propriedades bioquímicas que as tornam

possivelmente úteis para serem usadas como starters para aplicação tecnológica na

fermentação dos alimentos. Desde que as estirpes de enterococos têm sido reconhecidas

como potenciais patógenos, a selecção deve ter em consideração os factores de

virulência (Sarantinopoulos et al., 2001a; Wouters et al., 2002; Giraffa, 2003; Cocolin

et al., 2007)

2.3.2.4 Género Streptococcus

Todas as espécies do género Streptococcus são cocos Gram-positivos, que podem

ter forma esférica ou ovalada e estão tipicamente organizados em cadeias ou pares. São

imóveis e não produzem esporos. A maioria é anaeróbia facultativa, mas algumas

estirpes necessitam de CO2 para o crescimento. São quimoorganotróficos, fermentam os

glúcidos com a produção de ácido láctico e outros ácidos, possuem requisitos

nutricionais complexos e são catalase negativos. O teor molar do DNA de G + C é de 34

- 46% (Hardie e Whiley, 1995, Willey et al., 2009; Tagg et al., 2012).

Uma das principais características dos estreptococos é a sua capacidade de

produzir diferentes tipos de hemólise em meios que contêm sangue. Os diferentes tipos

de hemólise que podem ser observados, são nomeadamente completa (β), parcial (α) ou

nenhuma (γ). Em algumas espécies, o aparecimento de zonas α-hemolíticas em torno

das colónias que cresceram aerobicamente pode ser devido à produção de peróxido de

hidrogénio (Hardie e Whiley, 1995; Willey et al., 2009).

Os estreptococos abrangem um componente significativo da flora comensal do

homem e animais, colonizando as membranas das mucosas da boca, tracto respiratório,

tracto alimentar e o tracto urogenital. Algumas espécies também são encontradas na


19

pele, e outras podem ser isoladas a partir de produtos alimentares como o leite e

lacticínios (Hardie e Whiley, 1995).

2.3.2.5 Género Leuconostoc

O género Leuconostoc é constituído por cocos Gram-positivos que apresentam

morfologia irregular, podendo ser alongada ou elíptica. A morfologia celular varia com

as condições de crescimento: quando as bactérias crescem num meio de glucose são

alongadas, enquanto que a maioria das estirpes formam células ovóides quando são

cultivadas em leite. Estas são agrupadas aos pares ou em cadeias curtas (Dellaglio et al.,

1995; Huys et al., 2012).

As espécies de leuconostoc são anaeróbias facultativas, resistentes à vancomicina

e não hidrolisam a arginina (Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004). Todas as espécies

requerem um meio rico em factores de crescimento complexos e aminoácidos,

apresentam um crescimento lento e baixa propriedade acidificante (Dellaglio et al.,

1995; Liu et al., 1997; Huys et al., 2012). Crescem a 8 °C mas não a 45 °C, não crescem

a pH 4,8 e a 7% de NaCl e não produzem H2S (Hemme e Foucaud-Scheunemann,

2004). Os leuconostoc são imóveis, não formadores de esporos, apresentam um teor

molar de G + C de 38 - 44%. Não possuem catalase e citocromos, são

heterofermentativos produzindo assim CO2 a partir do metabolismo da glucose junto

com D-lactato e etanol ou acetato por meio da via da fosfocetolase (Villani et al., 1997;

Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004; Willey et al., 2009). Algumas estirpes são

produtoras de exopolissacáridos como o dextrano (Maina et al., 2008).

Os leuconostocs têm requisitos nutricionais complexos e são encontrados em

plantas, lacticínios, carne e vários produtos alimentares fermentados (Dellaglio et al.,

1995). O Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides e o Leuconostoc lactis são

os leuconostocs dominantes no leite e produtos de lacticínios fermentados. O

Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris e o Leuconostoc paramesenteroides são

menos representados no leite, provavelmente devido ao seu crescimento lento sob

condições psicrotróficas (Dellaglio et al., 1995).

Os leuconostoc têm um papel importante na alteração da qualidade organoléptica

e textura de produtos alimentares como o leite, manteiga, queijo e carne (Dellaglio et

al., 1995; Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004). Porque são heterofermentativos


20

obrigatórios produzem dióxido de carbono, podem provocar o flato de certos queijos e

modificar a textura de produtos fermentados (Dellaglio et al., 1995). No queijo, os

leuconostoc são frequentemente usados como produtores de flavour em culturas de

arranque mistas. Certas estirpes produzem diacetilo e acetoína a partir do citrato e

contribuem para o aroma e sabor típico de muitos alimentos, especialmente os produtos

lácteos (Dellaglio et al., 1995; Villani et al., 1997; Liu et al., 1997).

2.4 Bacteriocinas

As bacteriocinas são péptidos com acção antimicrobiana, sintetizados nos

ribossomas e geralmente estáveis ao calor, sendo produzidos por uma grande variedade

de bactérias. Estes péptidos podem ter um espectro de inibição pequeno - inibindo

bactérias taxonomicamente próximas, ou um espectro de inibição elevado - inibindo

uma grande variedade de bactérias (Cotter et al., 2005; Mirhosseini et al., 2010; Mills et

al., 2011a).

Algumas bacteriocinas produzidas pelas BAL, inibem não só espécies

taxonomicamente próximas como também são eficazes contra patógenos alimentares

importantes como a Listeria monocytogenes e o Staphylococcus aureus, assim como

outros microrganismos patogénicos Gram-positivos (Piard e Desmazeaud, 1992;

O´Sullivan et al., 2002; Ghrairi et al., 2008; Sobrino-López e Martín-Belloso, 2008).

Nos últimos anos, as bacteriocinas têm atraído um interesse considerável para o

seu uso como conservantes naturais dos alimentos em substituição dos conservantes

químicos, pois estas são rapidamente digeridas no tracto gastrointestinal dos humanos

(O´Sullivan et al., 2002; Settanni e Corsetti, 2008; Mills et al., 2011a; Mills et al.,

2011b).

2.4.1 Classificação das bacteriocinas

As bacteriocinas representam um grupo heterogéneo de péptidos, tendo sido

propostos diferentes sistemas de classificação.

Em 1993, Klaenhammer propôs um sistema de classificação que diferenciava as

bacteriocinas em quatro classes principais (Heng et al., 2007):


21

Classe I - Péptidos de pequena dimensão (< 5 kDa) modificados pós-

transcricionalmente,

Classe II - Péptidos de pequena dimensão (< 10 kDa) não modificados,

Classe III - Proteínas de cadeia longa (> 30 kDa) termo lábeis,

Classe IV - Proteínas complexas conjugadas com lípidos ou glúcidos.

Esta separação em quatro classes tem servido de base para a maioria das propostas

posteriores de classificação das bacteriocinas. Contudo, existe uma falta de consenso na

diferenciação de vários sub-grupos, particularmente na classe II, além de vários autores

proporem a retirada da classe IV por falta de caracterização das moléculas a nível

bioquímico (Cotter et al., 2005). Além disso, a descoberta crescente de uma grande

variedade de bacteriocinas, resultou num panorama confuso fazendo com que diferentes

investigadores propusessem novos esquemas de classificação. Como consequência desta

situação, vários critérios têm sido utilizados, incluindo a família a que pertencem as

bactérias produtoras, o peso molecular, as homologias das sequências de aminoácidos

e/ou a organização em cluster dos genes. Apesar de todos os esforços, a classificação

das bacteriocinas ainda não está bem estabelecida e continua a ser assunto de debate.

Nesta tese, adoptou-se a classificação baseada nas sugestões mais recentes de

Montalbán-López et al. (2011).

2.4.1.1 Classe I ou Lantibióticos

As bacteriocinas pertencentes à classe I são frequentemente designadas como

lantibióticos. Os lantibióticos são péptidos pequenos com 19 - 38 aminoácidos, estáveis

ao calor e com peso molecular inferior a 5 kDa (Deegan et al., 2006; Montalbán-López

et al., 2011; Hassan et al., 2012; Balciunas et al., 2013). São produzidos por um elevado

número de bactérias Gram-positivas que sofrem uma grande modificação após a sua

síntese ribossomal (Montalbán-López et al., 2011; Hassan et al., 2012), resultando na

formação de aminoácidos tioéter característicos como a lantionina (Lan) e

metilantionina (MeLan) (Jack e Sahl, 1995; Ouwehand, 1998; Zacharof e Lovitt, 2012).

Esta modificação surge por via de um processo de duas etapas: primeiro, os

aminoácidos serina e treonina são sujeitos a desidratação enzimática para dar origem a

dehidroalanina (Dha) e dehidrobutirina (Dhb) respectivamente. Posteriormente, os


22

grupos tiol das cisteínas próximas atacam a dupla ligação do Dha ou Dhb, o que origina

Lan ou MeLan, respectivamente. Esta condensação entre dois resíduos próximos resulta

na formação de anéis fechados covalentes com o péptido linear inicial conferindo uma

estrutura e funcionalidade específicos (Deegan et al., 2006; Zacharof e Lovitt, 2012). A

nisina é um exemplo de um lantibiótico cuja estrutura primária é ilustrada na figura 1.

Figura 1. Estrutura primária da nisina. Os resíduos de lantionina característicos (Ala-S-Ala) e β-

metilantionina (Abu-S-Ala) que formam os anéis de lantionina estão coloridos a vermelho; os

aminoácidos desidratados Dhb (dehidrobutirina) e Dha (dehidroalanina) estão coloridos a laranja (Kruijff

et al., 2008).

A classe dos lantibióticos é ainda dividida em três subclasses de acordo com a

estrutura química e actividade antimicrobiana (Chen e Hoover, 2003).

A subclasse Ia contém péptidos lineares flexíveis modificados por duas enzimas

diferentes, a enzima de desidratação LanB e a ciclase LanC (Montalbán-López et al.,

2011). São péptidos catiónicos e hidrofóbicos que actuam formando poros nas

membranas citoplasmáticas das espécies alvo sensíveis (Cleveland et al., 2001; Deegan

et al., 2006).

Os membros da subclasse Ib são caracteristicamente globulares, possuem uma

estrutura mais rígida e são de carga negativa ou sem carga (Cleveland et al., 2001; Chen

e Hoover, 2003; Stoyanova et al., 2012). A principal diferença em relação aos

lantibióticos da subclasse Ia é a maturação ser feita apenas com uma enzima (LanM)

que está envolvida na sua desidratação e ciclização (Montalbán-López et al., 2011).

Estas bacteriocinas exercem a sua função interferindo com as reacções enzimáticas

essenciais das bactérias sensíveis (Chen e Hoover, 2003; Ross et al., 2002; Deegan et

al., 2006).

A última subclasse de péptidos que contêm lantionina é a subclasse Ic, que é

composta por péptidos com baixa actividade inibidora. As enzimas envolvidas na sua

maturação não partilham grande homologia com as descritas anteriormente (Montalbán-

López et al., 2011).


23

2.4.1.2 Classe II

As bacteriocinas da classe II são péptidos pequenos (25 - 60 aminoácidos), com

peso molecular inferior a 10 kDa, catiónicos, hidrofóbicos e estáveis ao calor (Chen e

Hoover, 2003; Guinane et al., 2005; Deegan et al., 2006; Hassan et al., 2012). As

bacteriocinas desta classe não possuem resíduos Lan e têm uma estrutura helicoidal

anfifílica que permite a sua inserção na membrana citoplasmática da célula alvo,

promovendo assim a despolarização da membrana e a morte da célula (Balciunas et al.,

2013). As BAL são frequentemente encontradas como produtoras de bacteriocinas de

classe II (Heng et al., 2007; Hassan et al., 2012). Um grande número de subclasses já

foram sugeridas, mas a sua natureza heterogénea faz com que a subclassificação seja

difícil (Montalbán-López et al., 2011). Duas subclasses são comuns a todos os sistemas

de classificação: a subclasse IIa tipo pediocina (ou activo para Listeria) e a subclasse IIb

que corresponde às bacteriocinas formadas por dois componentes (Deegan et al., 2006).

A subclasse IIa é também designada como bacteriocinas tipo pediocina. Estas

bacteriocinas têm geralmente um espectro limitado de actuação, mas apresentam

elevada actividade contra a Listeria monocytogenes, característica que constituiu um

potencial importante como bioconservante num elevado número de alimentos (Ennahar

et al., 1999; Heng et al., 2007; Montalbán-López et al., 2011; Hassan et al., 2012).

A subclasse IIb refere-se às bacteriocinas de dois componentes, ou seja,

bacteriocinas compostas por dois péptidos diferentes cuja actividade inibitória é

dependente da acção complementar dos dois péptidos (Cleveland et al., 2001; Chen e

Hoover, 2003; Deegan et al., 2006, Heng et al., 2007; Hassan et al., 2012). Estas

bacteriocinas têm pouca ou nenhuma actividade quando cada péptido é utilizado

individualmente (Deegan et al., 2006; Balciunas et al., 2013).

As bacteriocinas da subclasse IIc não possuem um péptido sinal (sequência

leader), não sofrem modificações pós-transcricionais e têm uma estrutura cíclica devido

à ligação covalente entre o C e N terminais (Kawai et al., 2004; Montalbán-López et al.,

2011; Hassan et al., 2012; Balciunas et al., 2013).

A subclasse IId inclui outras bacteriocinas lineares não modificadas (Montalbán-

López et al., 2011; Hassan et al., 2012).


24

2.4.1.3 Classe III

Esta classe é composta por bacteriocinas termolábeis de maiores dimensões (> 30

kDa) (Chen e Hoover, 2003; Balciunas et al., 2013). Esta classe também é dividida em

duas subclasses: IIIa e IIIb.

A subclasse IIIa designada por bacteriolisinas consiste em enzimas bacteriolíticas

que facilitam a morte de estirpes sensíveis a partir da lise celular. Pelo contrário, a

subclasse IIIb inclui as bacteriocinas não líticas (Heng et al., 2007; Montalbán-López et

al., 2011).

2.4.1.4 Classe IV

Esta classe é constituída por péptidos circulares originados pela ligação peptídica

das duas extremidades (N e C) e que formam grandes complexos com outras

macromoléculas (Cleveland et al., 2001 Montalbán-López et al., 2011). Este tipo de

bacteriocinas eram antes incluídas na classe II mas passaram depois para uma nova

classe, devido às modificações mais complexas que sofrem em relação às bacteriocinas

da classe II. Além disso, os membros desta classe não partilham grandes semelhanças

com os membros das outras classes (Montalbán-López et al., 2011).

Uma classificação esquemática das classes das bacteriocinas está descrita no

quadro 2.


25

Quadro 2. Classificação esquemática das bacteriocinas (Adaptado de Montalbán-López et al., 2011).

Classe Subclasse / Características Exemplos

Classe I: Lantibióticos

Ia: Modificados por LanB (desidratação)

e LanC (formação de anel).

Exportada pela LanT e libertada do

péptido sinal pelo LanP.

Nisina

Subtilina

Ib: Modificadas pelo LanM (desidratação

e formação de anel). Transportado e

processado pelo LanT.

Mersacidina

Lacticina 3147

Cinamicina

Ic: Lantibióticos não activos SapB

Classe II: Pequenas

proteínas termoestáveis

IIa: Grupo tipo pediocina Pediocina PA-1

Ubericina A

IIb: Bacteriocinas com dois componentes Lactococina G

IIc: Bacteriocinas sem péptido sinal Enterocina EJ97

IId: Outras bacteriocinas Enterocina B

Classe III: Grandes

proteínas termolábeis

IIIa: Bacteriolíticas Enterolisina A

IIIb: Não bacteriolíticas Enterocina Bc-48

Classe IV:

Bacteriocinas circulares Estrutura circular

Enterocina AS-48

Gassericina A

2.4.2 Mecanismos de acção das bacteriocinas

Os mecanismos mais comuns utilizados pelas bacteriocinas para eliminar outros

microrganismos consistem na destruição de células alvo através da formação de poros

ou na inibição da síntese da parede celular (Hassan et al., 2012).

As bacteriocinas, e em particular os lantibióticos, inibem as células alvo por

formação de poros na membrana, esgotando o potencial transmembranar (∆ψ) e/ou o

gradiente de pH, resultando na perda de matéria celular (Cleveland et al., 2001). A

natureza dos poros, em termos de tamanho, estabilidade e condutividade de compostos

diferentes, podem diferir consideravelmente entre bacteriocinas (Eijsink et al. 2002;

Hassan et al., 2012). As bacteriocinas possuem frequentemente carga positiva com

zonas hidrofóbicas, pelo que as interacções electrostáticas com os grupos fosfato de

carga negativa das membranas contribuem para a ligação inicial com a célula alvo


26

(Cleveland et al., 2001; Chen e Hoover, 2003; Deegan et al., 2006; Hassan et al., 2012).

A porção hidrofóbica insere-se em direcção ao interior da membrana e origina a

formação de poros (Cleveland et al., 2001).

A condutividade e estabilidade dos poros induzidos pelos lantibióticos podem ser

aumentadas por moléculas de ligação, nomeadamente o lípido II (Chen e Hoover,

2003). O lípido II é um precursor peptidoglicano da parede celular e alguns lantibióticos

ligam-se a esta molécula inibindo a síntese da parede celular (Figura 2). Alguns

lantibióticos como a nisina possuem ambos os mecanismos de acção (formação de

poros e ligação ao lípido II), enquanto que a maioria apresenta apenas um mecanismo

de acção, como a lacticina 3147 com formação de poros e a mersacidina que actua

exclusivamente por ligação ao lípido II (Deegan et al., 2006).

Figura 2. Estrutura do complexo nisina-lípido II. (A) Interacção da nisina (verde) com o pirofosfato do

lípido II. (B) Pontes de hidrogénio (ponteado amarelo) entre a nisina e o pirofosfato do lípido II (esferas)

(adaptado de Kruijff et al., 2008).

As bacteriocinas da classe II actuam predominantemente através da formação de

poros, causando a dissipação do potencial de membrana, redução do ATP intracelular e

perda de aminoácidos e iões (Deegan et al., 2006). O sistema manose-fosfotransferase

(Man-PTS) é um tipo de receptor alvo usado por muitas bacteriocinas da classe IIa (e.g.

pediocina PA-1, enterocina P, enterocina A e sacacina P) e por algumas bacteriocinas da

classe IId (e.g. lactococina A e lactococina B). O sistema Man-PTS pertence a um grupo

de sistemas de transporte conhecidos como sistemas de fosfoenolpuruvato/carbohidrato


27

fosfotransferase (PTSs), que são caracterizados pela sua capacidade de fosforilar os

monossacáridos para o seu transporte transmembranar (Hassan et al., 2012).

Os principais constituintes do sistema PTS são: a enzima (EI), a proteína HPr, e

um complexo proteico carbohidrato específico conhecido como enzima II (EII) que é o

alvo das bacteriocinas da classe IIa. O complexo Man-PTS EII consiste em quatro

subunidades IIA, IIB, IIC e IID (Postma et al., 1993; Hassan et al., 2012). As

subunidades IIC e IID juntas formam um complexo localizado a nível trans-membranar,

enquanto que as subunidades IIA e IIB se situam na parte citoplasmática e são

indispensáveis para a função de receptor (Diep et al., 2007; Hassan et al., 2012).

As bacteriocinas da classe IIa ligam-se às proteínas do transportador Man-PTS

localizadas na membrana (IIC e IID). A ligação resultante provoca alterações na

conformação no sistema Man-PTS, que faz com que o transportador fique

irreversivelmente aberto, e desse modo provoca a perda de solutos celulares e

eventualmente a morte celular (Hassan et al., 2012).

A figura 3 ilustra o mecanismo de acção das bacteriocinas da classe I e II (nisina e

sacacina, respectivamente).

Figura 3. Modo de acção das bacteriocinas da classe I e II. A nisina interage com o lípido II, enquanto

que a sacacina liga-se ao sistema Man-PTS (Hill et al., 2011).


28

2.4.3 Auto-imunidade

Para se protegerem a si mesmas das suas próprias bacteriocinas, as estirpes

produtoras possuem genes que conferem auto-imunidade (Hassan et al., 2012). Dois

tipos de imunidade têm sido descritos para os lantibióticos: um tipo consiste na

expressão de uma proteína específica de imunidade, LanI, enquanto que o segundo tipo

depende de um transportador ABC (LanFEG). Alguns lantibióticos têm apenas a

proteína de imunidade única, embora outros possuam ambos mecanismos (Chen e

Hoover, 2003; Deegan et al., 2006).

Estes dois sistemas de imunidade trabalham sinergicamente para proteger as

células produtoras das suas próprias bacteriocinas. A proteína LanI, que está ligada à

parte exterior da membrana citoplasmática, confere imunidade às células produtoras

através do bloqueio da formação de poros pelas bacteriocinas. O LanFEG (transportador

ABC) actua transportando as moléculas das bacteriocinas que foram inseridas na

membrana citoplasmática de volta ao meio circundante e deste modo mantém a

concentração da bacteriocina na membrana abaixo do nível crítico (Chen e Hoover,

2003).

As bacteriocinas de classe II possuem geralmente uma proteína de imunidade

associada à membrana que proporciona uma imunidade completa (Deegan et al., 2006).

A interacção da proteína de imunidade com a membrana citoplasmática protege o

produtor contra a sua própria bacteriocina (Chen e Hoover, 2003).

2.4.4 Factores que afectam a eficiência das bacteriocinas

A actividade das bacteriocinas produzidas por diferentes BAL não é uniforme e

constante, dependendo da composição química e das condições físicas do alimento

(Cleveland et al., 2001; Balciunas et al., 2013). Esta actividade pode ser reduzida pela

ligação das bacteriocinas a componentes dos alimentos, adsorção às células ou

proteínas, actividade das proteases e/ou outras enzimas (Schillinger et al., 1996;

Balciunas et al., 2013).

Para além das interacções com os componentes dos alimentos, as bacteriocinas

podem ser afectadas pelas condições de processamento e de armazenamento do produto

como o pH e a temperatura (Deegan et al., 2006).


29

A eficiência inibitória das bacteriocinas também está relacionada com o nível de

contaminação do alimento com o organismo alvo. Se a contaminação inicial é muito

alta, a actividade da bacteriocina é incapaz de prevenir o desenvolvimento de

microrganismos contaminantes (Balciunas et al., 2013).

2.4.5 Aplicações das bacteriocinas na indústria alimentar

Actualmente os consumidores estão cada vez mais atentos ao risco que constitui a

presença de aditivos químicos e de microrganismos patogénicos nos alimentos,

estimulando-se assim o interesse pela procura de conservantes naturais (Balciunas et al.,

2013). Como resultado, os consumidores preferem alimentos naturais e frescos sem

conservantes químicos adicionados. Esta percepção, em conjunto com a exigência

crescente de alimentos minimamente processados com vida de prateleira prolongada,

tem estimulado a pesquisa para encontrar conservantes naturais e eficazes (Schillinger

et al., 1996; Chen e Hoover, 2003; Reis et al., 2012).

A bioconservação refere-se ao uso de microrganismos antagonistas, ou dos seus

produtos metabólicos, para inibir ou destruir microrganismos indesejáveis nos

alimentos, aumentar a segurança alimentar e prolongar a vida de prateleira (Abee et al.,

1995; Schillinger et al., 1996; Chen e Hoover, 2003). As bacteriocinas produzidas pelas

BAL, podem ser consideradas conservantes naturais que preenchem estes requisitos,

pois têm a capacidade de aumentar a segurança alimentar, reduzindo a prevalência de

doenças associadas à contaminação dos alimentos (Chen e Hoover, 2003; Deegan et al.,

2006).

Presentemente, a nisina e a pediocina PA-1 são as únicas bacteriocinas licenciadas

para utilização como conservantes alimentares (Martín-Belloso e Sobrino-López, 2008;

Balciunas et al., 2013).

É sugerido frequentemente que as bacteriocinas não devem ser usadas como a

primeira etapa de processamento ou barreira para prevenir o crescimento ou a

sobrevivência dos patógenos, mas certamente elas podem fornecer uma barreira

adicional para reduzir a possibilidade de doenças de origem alimentar (Deegan et al.,

2006).


30

Diferentes estratégias têm sido propostas para a aplicação das bacteriocinas nos

alimentos, baseadas na adição de preparações produzidas ex situ ou na produção in situ

pelas estirpes bacteriocinogénicas (Gálvez et al., 2008).

São usadas geralmente 3 formas de aplicação das bacteriocinas para a

bioconservação dos alimentos (Schillinger et al., 1996; Chen e Hoover, 2003):

Inoculação dos alimentos com BAL produtoras de bacteriocinas nos produtos. A

capacidade das BAL para crescer e produzir bacteriocinas nos produtos é crucial

para o seu uso com sucesso.

Adição de bacteriocinas purificadas ou semi-purificadas como conservantes

alimentares.

Uso de um produto previamente fermentado com uma estirpe produtora de

bacteriocinas como ingrediente do alimento.

As bacteriocinas produzidas ex situ podem também ser adicionadas como

preparações imobilizadas e incorporadas em embalagens bioactivas, proporcionando

novas formas de bioconservação (Chen e Hoover, 2003; Gálvez et al., 2007). Muitas

vezes as bacteriocinas são adicionadas com outras barreiras antimicrobianas para

aumentar os seus efeitos bactericidas (Leistner, 2000; Gálvez et al., 2007). Uma

alternativa à adição de bacteriocinas é a inoculação dos alimentos com uma estirpe

bacteriocinogénica apropriada para a produção de bacteriocinas in situ. Deste modo, as

estirpes bacteriocinogénicas podem ser usadas como culturas starter, adjuntas ou

protectoras, dependendo do tipo de alimento e objectivo (Holzapfel et al., 1995;

Rodgers, 2001; Deegan et al., 2006; Gálvez et al., 2008; Beshkova e Frengova, 2012).

Em alguns casos, a eficiência das bacteriocinas nos sistemas alimentares é

aparentemente limitado, actuando apenas com redução parcial nas contagens viáveis ou

na inibição do crescimento da bactéria alvo. Todavia, uma inibição parcial pode ser

suficiente para prolongar o tempo de prateleira dos alimentos sem comprometer as suas

propriedades organolépticas. Contudo, isto pode não ser suficiente para patógenos

alimentares, especialmente quando os limites exigidos por lei são tolerância zero, como

é o caso da L. monocytogenes. Nestes casos, as bacteriocinas podem ser muito úteis se

forem usadas em combinação com barreiras adicionais e se forem implementadas as

boas práticas de modo a manter os níveis de patógenos em valores suficientemente

baixos (Gálvez et al., 2008).


31

A produção de bacteriocinas in situ oferece mais vantagens quando comparada

com as preparações produzidas ex situ (Gálvez et al., 2008; Balciunas et al., 2013). No

entanto, é necessária uma selecção cuidadosa das estirpes de modo a garantir a sua

adaptação ao ecossistema particular do alimento (Reis et al., 2012). Devido ao aumento

da quantidade de alimentos conservados a temperaturas de refrigeração, é necessário o

uso de estirpes psicrotróficas produtoras de bacteriocinas, apresentando estas uma

grande vantagem durante o armazenamento refrigerado do alimento. A produção de

bacteriocinas in situ pode ainda contribuir para o domínio das estirpes produtoras sobre

outras BAL durante a fermentação do alimento, sendo muito importante, em particular

no caso das estirpes probióticas, para aumentar a sua prevalência nos alimentos

funcionais fermentados (Gálvez et al., 2008).

2.4.6 Aplicação das bacteriocinas nos lacticínios

No caso da indústria dos lacticínios, os principais patógenes bacterianos a

controlar são aqueles capazes de sobreviver e multiplicarem-se nos produtos crus e em

certos tipos de queijo, como a Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli e a Salmonella spp. (De Buyser et al., 2001; Gálvez et al., 2008; Pinto

et al., 2009). No quadro 3 estão indicadas as principais aplicações potenciais das

bacteriocinas no leite e produtos lácteos.

Os produtos lácteos constituem uma das principais aplicações de algumas das

bacteriocinas já isoladas e identificadas, como a nisina, lacticina 3147 e pediocina PA-1.

2.4.6.1 Nisina

A nisina é um péptido antimicrobiano natural produzido pelo Lactococcus lactis

subsp. lactis que, além de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas, inibe

também o crescimento de esporos de bacilos e clostrídios (Black et al., 2005; Arauz et

al., 2009). A nisina é uma das duas únicas bacteriocinas aprovadas para aplicação nos

alimentos e tem sido muito usada na indústria alimentar (Arauz et al., 2009).

A nisina está disponível num concentrado seco em pó designado de Nisaplin

(Danisco), tendo sido aprovada para a lista de aditivos alimentares Europeia no início

dos anos 80, tendo sido atribuído o número E234. Desde então recebeu o estatuto

GRAS pela FDA (Food and Drug Administration), e é a única bacteriocina que foi


32

aprovada pela organização mundial de saúde para uso como conservante alimentar

(Sobrino-López e Martín-Belloso 2008; Mills et al., 2011b).

Uma das primeiras aplicações da nisina consistiu no controlo da formação de gás

no queijo causada pelo Clostridium tyrobutyricum. Outras aplicações da nisina incluem

a sua utilização em queijos processados e seus derivados para prevenir a proliferação de

formadores de esporos sobreviventes à pasteurização, assim como o controlo de outras

bactérias contaminantes pós-processamento como a Listeria monocytogenes (Gálvez et

al., 2008).

2.4.6.2 Lacticina 3147

A lacticina 3147 é uma bacteriocina com grande potencial para aplicação na

conservação dos produtos lácteos. A aplicação de starters produtores de lacticina 3147

tem sido proposta para aumentar a qualidade do queijo através da inibição da flora

NSLAB durante a maturação, inibir as bactérias patogénicas em alimentos fermentados

e não fermentados e prolongar a vida de prateleira de alguns produtos alimentares

(Guinane et al., 2005; Gálvez et al., 2008).

2.4.6.3 Pediocina PA-1

A pediocina PA-1 é uma bacteriocina com elevada actividade anti-listéria e é

produzida por algumas estirpes de pediococos. A aplicação de pediococos em

fermentações do leite é limitada devido à sua incapacidade de fermentar rapidamente a

lactose, que resulta em crescimento lento no leite e nos produtos lácteos (Rodríguez et

al., 2005; Renye Jr. et al., 2011). Deste modo, as BAL têm sido consideradas como

potenciais hospedeiras para a produção heteróloga da pediocina (Renye Jr. et al., 2011).


33

Quadro 3. Aplicações potenciais das bacteriocinas no leite e produtos lácteos (Gálvez et al., 2008).

Produtos/matéria crua

redução do crescimento microbiano em leite cru

inactivação das bactérias mesofílicas no leite em combinação com campos

eléctricos pulsados (Pulsed Electric Fields - PEFs) ou com pressão hidroestática

elevada (High Hidrostatic Pressure - HHP)

Produtos fermentados

inibição da formação de gás pelo C. tyrobutyricum em queijos duros e semi-

duros

inibição as bactérias patogénicas e tóxicas (L. monocytogenes, B. cereus, S.

aureus) nos queijos e na superfície do queijo

Inactivação das bactérias mesofílicas e da formação de endosporos em queijo

em combinação com pressão hidroestática elevada (High Hidrostatic Pressure -

HHP)

controlo da acidificação no iogurte e outros produtos fermentados

uso de estirpes produtoras de bacteriocinas como culturas starter ou adjuntas

para inibir as bactérias patogénicas e deteriorantes no queijo e em outros

produtos lácteos fermentados

acelerar a cura dos queijos através da libertação de enzimas intracelulares

bacterianas

uso de culturas starter produtoras de bacteriocinas para inibir a microflora das

BAL não starter adventícias/acidentais no queijo

Produtos processados

inibição dos produtores de endosporos em queijo processado e noutros produtos

lácteos processados

inibir a L. monocytogenes nos produtos lácteos após contaminação pós-

processamento


34

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Isolados em estudo

A amostra global consistiu em 116 isolados de bactérias do ácido láctico do queijo

do Pico. As amostras foram colhidas em 3 locais de produção (A, B e C), em dois

períodos diferentes (lotes), e correspondem ao 1º e 21º dia de maturação.

3.2 Screening das BAL produtoras de bacteriocinas

3.2.1 Actividade antimicrobiana

A actividade antimicrobiana das BAL foi determinada pelo método de difusão em

agar - técnica dos poços, segundo a metodologia de Tagg e McGiven (1971). Este

estudo foi realizado com as seguintes bactérias de referência: Listeria monocytogenes

ATCC 7466, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29523,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Clostridium perfringens ATCC 8357.

As bactérias de referência (culturas alvo) foram inoculadas em Nutrient Broth

(AES, França) e incubadas durante 18 horas a 37 °C.

As BAL foram inoculadas em MRS Broth (AES, França) e incubadas durante 72

horas a 30 °C. Após este período centrifugou-se (Centrifuge 5804R, Eppendorf,

Alemanha) a 4000 × g durante 10 minutos a 4 °C, de modo a obter o sobrenadante. De

seguida foram filtrados com filtros de 0,20 μm (Sartorius Stedim Biotech, Alemanha).

Os sobrenadantes foram neutralizados com NaOH 1N ajustando o pH para 6,5 -

7,0. Destes sobrenadantes retirou-se uma alíquota de 1 ml e adicionou-se de seguida

catalase de origem bovina (EC 1.11.1.6, 5 mg/ml) deixando actuar durante 1 hora a

37 °C.

As culturas dos microrganismos alvo foram diluídas em Nutrient Broth (AES,

França) de modo a atingir o valor de 0,5 na escala de McFarland. De seguida, pipetou-

se 100 μl da cultura diluída para 200 ml de Plate Count Agar (AES, França). Distribui-

se o meio por placas de Petri e deixou-se solidificar. Foram feitos os poços com 6 mm

de diâmetro e selou-se o fundo destes com Pastagar B (AES, França). Para cada BAL

foram testados a cultura pura sem tratamento, o sobrenadante, o sobrenadante


35

neutralizado e o sobrenadante neutralizado com adição de catalase. O meio de MRS

Broth foi usado como controlo negativo. Pipetou-se 60 μl de amostra em cada poço.

As placas foram mantidas em refrigeração (4 °C) durante 4 horas e de seguida

incubadas a 37 °C durante 12 horas. A leitura dos resultados foi feita com o auxílio de

uma craveira digital (Absolute Digimatic, Mitutoyo, Inglaterra) para medir os halos de

inibição. Este teste foi realizado em duplicado.

3.2.2 Concentração mínima inibitória

A concentração mínima inibitória (CMI) das BAL foi determinada segundo o

método "spot-on-lawn" adaptado de Mills et al. (2011a). A determinação da CMI foi

realizada com a Listeria monocytogenes ATCC 7466 plaqueada de acordo com a

descrição anterior (secção 3.2.1). Para a determinação da CMI foram feitas várias

diluições do sobrenadante neutralizado e filtrado em Buffered Peptone Water (AES,

França). De seguida pipetou-se 5 μl de cada diluição directamente nas placas.

A CMI também foi realizada pela técnica dos poços descrita na secção 3.2.1.

Foram feitas várias diluições do sobrenadante neutralizado e livre de células em

Buffered Peptone Water (AES, França) e pipetou-se 60 μl de cada diluição nos poços.

As placas foram mantidas em refrigeração (4 °C) durante 4 horas e de seguida

incubadas a 37 °C durante 12 horas. A actividade das bacteriocinas foi definida como o

recíproco da maior diluição onde se observou uma zona de inibição distinta, e foi

expressa em unidades arbitrárias (UA) por mililitro (Ghalfi et al., 2010). Este teste foi

realizado em duplicado.

3.3 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas

3.3.1 Identificação fenotípica

Para a identificação fenotípica das BAL foi utilizado o kit API 50 CH (bio-

Mérieux SA).

O API 50 CH é um sistema padronizado que associa 50 testes bioquímicos para o

estudo da fermentação de substratos pertencentes à família dos glúcidos e derivados

(heterósidos, polialcoois, ácidos urónicos).


36

Cada isolado foi previamente inoculado em MRS Broth (AES, França) durante 24

horas a 30 °C. Para cada isolado foi feita uma suspensão em API 50 CHL Medium (2

ml) para uma densidade óptica de 5 na escala de McFarland. De seguida, foi feita a

preparação das galerias colocando cerca de 10 ml de água destilada nos álveolos do

fundo e depois colocou-se as tiras no fundo da caixa de incubação. Distribui-se a

suspensão bacteriana pelas 50 cúpulas. As galerias foram incubadas durante 48 horas a

30 °C. Por fim anotou-se o resultado das reacções consoante a cor da cúpula e foi feita a

leitura com recurso ao api web.

3.3.2 Identificação genética

As BAL produtoras de bacteriocinas foram identificadas por biologia molecular -

sequenciação do gene 16S rRNA. O DNA genómico total foi extraído e purificado

usando o UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio, Carlsbad, CA). Os

fragmentos de aproximadamente 1388 pares de bases da região 16S rRNA foram

amplificados por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers universais

46F (5´-GCYTAAYACATGCAAGTCG-3´) e 1409R (5´-

GTGACGGGCRGTGTGTRCAA-3´).

As sequências do gene 16S rRNA foram analisadas e determinadas pelo programa

BLAST no website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

3.4 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas

3.4.1 Actividades enzimáticas

Para a determinação das actividades enzimáticas presentes nas BAL foi utilizado o

kit APIZYM (bio-Mérieux SA) que é um micro-método semi-quantitativo de detecção

de enzimas activos (Quadro 4).

Cada isolado foi previamente inoculado em MRS Broth (AES, França) durante 24

horas a 30 °C. Para cada isolado foi feita uma suspensão em API Suspension Medium (2

ml) de modo a ajustar-se a densidade óptica para valores 5 - 6 na escala de McFarland.

De seguida, foi feita a preparação das galerias colocando cerca de 5 ml de água

destilada nos alvéolos do fundo, colocando-se depois a galeria no fundo da caixa de

incubação. Com o auxílio de uma micropipeta pipetou-se 65µl de suspensão bacteriana


37

pelas 20 cúpulas. As galerias foram incubadas durante 4 horas e 30 minutos a 37 °C.

Passado o período de incubação, adicionou-se a cada uma das cúpulas 1 gota de

reagente ZYM A e 1 gota de reagente ZYM B. Deixou-se as colorações desenvolverem-

se durante 5 minutos e em seguida expôs-se a galeria durante 10 segundos a uma

lâmpada de 1000W. Por fim, realizou-se o registo dos resultados consoante a

intensidade da cor obtida, tendo sido usado um quadro de leitura que tinha uma escala

de 0 a 5 em que 0, 1 e 2 são reacções negativas sendo os números 3, 4 e 5 para as

reacções positivas.

Quadro 4. Enzimas e substratos do kit APIZYM.

Cúpula Enzima detectada Substrato

1 Fosfatase alcalina 2-naftil fosfato

2 Esterase (C4) 2-naftil butirato

3 Esterase Lipase (C8) 2-naftil caprilato

4 Lipase (C14) 2-naftil miristato

5 Leucina arilamidase L-leucil-2-naftilamida

6 Valina arilamidase L-valil-2-naftilamida

7 Cistina arilamidase L-cistil-2-naftilamida

8 Tripsina N-benzoil- DL-arginina-2-naftilamida

9 α-quimotripsina N-glutaril-fenilalanina-2-naftilamida

10 Fosfatase ácida 2-naftil fosfato

11 Naftol-AS-BI-fosfohidrolase Naftol-AS-BI-fosfato

12 α-galactosidase 6-Br-2-naftil-αD-galactopiranosida

13 β-galactosidase 2-naftil-βD-galactopiranosida

14 β-glucuronidase Naftol-AS-BI-βD-glucuronida

15 α-glucosidase 2-naftil-αD-glucopiranosida

16 Β-glucosidase 6-Br-2-naftil-βD-glucopiranosida

17 N-acetil-β-glucosaminidase 1-naftil-N-acetil-βD-glucosaminida

18 α-manosidase 6-BR-2-naftil-αD-manopiranosida

19 α-fucosidase 2-naftil-αL-fucopiranosida


38

3.4.2 Produção de diacetilo a partir do citrato

Foi determinada a produção de diacetilo a partir do citrato segundo a metodologia

de King (1948). As bactérias do ácido láctico foram inoculadas em MRS Broth (AES,

França) e foram colocadas numa estufa a 30 °C durante 24 horas. Foram depois

centrifugadas a 2300 × g durante 5 minutos (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Alemanha).

O precipitado (BAL) foi lavado com Buffered Peptone Water (AES, França),

novamente centrifugado a 2300 × g durante 5 minutos e por fim ressuspendido em

Buffered Peptone Water (AES, França). De seguida as BAL foram inoculadas (1% v/v)

em 5 ml de leite gordo UHT. Após uma incubação de 24 horas a 30 °C, retirou-se 1 ml

da suspensão de BAL, adicionando-se 0,5 ml de uma solução de α-naftol (1% v/v) e 0,5

ml de KOH (16% v/v). Esta mistura foi a incubar a 30 °C durante 10 minutos.

A formação de um anel vermelho/rosa no topo dos tubos de ensaio demonstra que

existe produção de diacetilo a partir do citrato. O teste foi feito em duplicado.

3.4.3 Actividade proteolítica

Para determinação da actividade proteolítica, as BAL foram inoculadas em MRS

Broth (AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de Plate Count Agar

(AES, França) e adicionou-se 10% de Skim Milk (Oxoid, Inglaterra). Com o auxílio de

uma zaragatoa inoculou-se o meio à superfície e de seguida as placas foram a incubar

durante 72 horas a 30 °C. Para a leitura dos resultados inundou-se as placas com HCl a

1% durante 1 minuto e depois escorreu-se o líquido. A presença de um halo transparente

em torno das colónias significa que existe actividade proteolítica (Franciosi et al.,

2009). O teste foi feito em duplicado.

3.4.4 Actividade lipolítica

Para avaliar a actividade lipolítica, as BAL foram inoculadas em MRS Broth

(AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de Tributyrin agar (Merck,

Alemanha) e com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a superfície do meio, levando-

se de seguida as placas a incubar durante 72 horas a 30 °C. Foi usado como controlo

positivo a Pseudomonas aeruginosa. A presença de um halo transparente em torno das

colónias indica que existe actividade lipolítica (Hantsis-Zacharov e Halpern, 2007). O

teste foi feito em duplicado.


39

3.5 Avaliação da segurança

3.5.1 Produção de histamina

A produção de histamina foi determinada segundo a metodologia de Joosten e

Northolt (1989), onde se utilizou um meio diferencial com a seguinte composição: 0,5%

de triptona (AES, França), 0,5% de extracto de levedura (AES, França), 0,5% de NaCl

(Merck, Alemanha), 0,1% de glucose (Merck, Alemanha), 0,05% de tween 80 (VWR,

EUA), 0,02% de MgSO4.7H2O (Merck, Alemanha), 0,01% de CaCO3 (Merck,

Alemanha), 0,006% de púrpura de bromocresol (Merck, Alemanha), 0,005% de

MnSO4.4H2O (Merck, Alemanha), 0,004% de FeSO4.7H2O (Merck, Alemanha) e 2%

de histidina (Merck, Alemanha). A única diferença na composição deste meio em

relação ao original, foi a ausência de agar pois foi feito em meio líquido. Acertou-se o

pH para 5,0 ± 0,1 e de seguida o meio foi esterilizado durante 10 minutos a 121 °C.

Também foi feito do mesmo modo um meio sem histidina. Colocou-se as BAL a crescer

em MRS Agar (Biokar) durante 24 horas a 30 °C. Procedeu-se depois à inoculação das

BAL em tubos contendo 2 ml de meio (para cada BAL 2 tubos com histidina e 2 tubos

sem histidina). De seguida cobriu-se com óleo de parafina e incubou-se as BAL a 30 °C

durante 48 horas. Nos casos em que se obtiveram resultados negativos, prolongou-se o

tempo de incubação até aos 7 dias a 30 °C. Após a incubação registou-se a cor do meio.

O meio de cor amarela significa que as bactérias não são produtoras de histamina e o

meio roxo significa que as bactérias são produtoras de histamina. O teste foi feito em

duplicado.

3.5.2 Actividade hemolítica

Para avaliar a actividade hemolítica, as BAL foram inoculadas em MRS Broth

(AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de agar-sangue a partir de

Tryptose Blood Agar Base (Merck, Alemanha) com adição de 7% de sangue de bovino

e distribui-se por placas de petri. Com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a

superfície do meio e de seguida incubou-se as placas durante 48 horas a 37 °C. A

presença de um halo transparente em torno das colónias corresponde a uma hemólise β,

quando existe um halo esverdeado em torno das colónias significa que é hemólise α e

por fim se não existe halo em torno das colónias trata-se de uma hemólise γ (Asteri et


40

al., 2009). Foi usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus aureus ATCC

29523 que é β-hemolítica. O teste foi realizado em duplicado.

3.5.3 DNase

A produção da enzima DNase foi determinada em meio de DNase Test Agar

(Sigma-Aldrich, EUA). As BAL foram inoculadas em meio de MRS Broth (AES,

França) durante 24 horas a 30 °C. Com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a

superfície do meio e de seguida incubou-se as placas durante 48 horas a 37 °C. Foi

usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus aureus ATCC 29523. A

presença de um halo rosado em torno das colónias significa que existe produção da

enzima (Gupta e Malik, 2007). O teste foi feito em duplicado.

3.5.4 Gelatinase

A pesquisa da produção da enzima gelatinase foi realizada segundo a metodologia

de Terzic-Vidojevic et al. (2009). Preparou-se um meio de cultura com 5 g de peptona

(Fluka, EUA), 3 g de extracto de levedura (AES, França), 30 g de gelatina (Biolife,

Itália), 17 g de agar (AES, França) e 1000 ml de água destilada. Acertou-se o pH para

7,0 e de seguida foi feita a esterilização em autoclave (121 °C, 15 minutos),

distribuindo-se depois o meio em placas de Petri. As BAL foram inoculadas em meio de

MRS Broth (AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Com o auxílio de uma zaragatoa

semeou-se a superfície do meio com cada BAL e de seguida incubou-se as placas

durante 48 horas a 37 °C. Foi usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus

aureus ATCC 29523. Após este tempo, as placas foram inundadas com uma solução

saturada de sulfato de amónio (Merck, Alemanha). A existência de um halo transparente

em torno das colónias foi considerado uma reacção positiva. O teste foi realizado em

duplicado.

3.5.5 Resistência a antibióticos

A resistência aos antibióticos foi feita segundo o método de difusão em agar de

Kirby-Bauer. Inoculou-se 100 µl de BAL em 5 ml de MRS Broth (AES, França) e

incubou-se a 30 °C durante 24 - 48 horas. Ao fim desse tempo, fez-se o acerto da

turvação para 5 na escala de McFarland e retirou-se 200 µl para um novo tubo com 5


41

ml de MRS Broth (AES, França). Desse tubo pipetaram-se 400 μl para três tubos que

continham 5 ml de MRS Broth (AES, França). Em seguida, dividiu-se o conteúdo de

cada um dos tubos por 2 placas contendo Müller-Hinton Agar (AES, França). Esperou-

se cerca de 25 minutos para que o agar absorvesse algum do líquido. Deitou-se fora o

excesso e deixou-se secar bem as placas durante 1 hora na câmara de fluxo laminar. Por

último, com o auxílio de uma pinça estéril, aplicou-se sobre o meio os discos com os

antibióticos.

Foram testados 22 antibióticos (Oxoid, Inglaterra): ácido nalidíxico, ofloxacina,

amoxicilina/ácido clavulânico 2:1, carbenicilina, penicilina, piperacilina, canamicina,

estreptomicina, gentamicina, netilmicina, tobramicina, cefalotina, cefotaxima,

ceftazidima, ceftriaxona, clindamicina, cloranfenicol, eritromicina, rifampicina,

sulfametoxazol/trimetoprim, tetraciclina e vancomicina.

Os discos foram colocados de modo a que não existisse sobreposição das zonas de

inibição. Incubou-se a 30 °C por 24 - 48 horas. Por fim, mediram-se as zonas de

inibição por meio de uma craveira digital, incluindo o diâmetro do disco. Os testes

foram feitos em duplicado.

Para a interpretação dos resultados, consultaram-se os valores de referência

(Quadro 5). As BAL foram classificadas em 3 categorias consoante o diâmetro do halo

de inibição: Resistente (R), Sensibilidade Intermédia (I) e Sensível (S).


42

Quadro 5. Valores de referência para as leituras dos antibiogramas (Adaptado de CLSI, 2010, 2011 e

CSFM, 2010)

Código Nome Família/Grupo

Quantidade

Por disco

Diâmetros críticos

(mm)

R I S

NA30 Àcido Nalidíxico Quinolonas 30 µg <15 15-19 ≥20

OFX5 Ofloxacina Fluoroquinolonas 5 µg <22 22-24 ≥25

AMC30 Amoxicilina/Ácido

Clavulânico 2:1 Penicilinas 20/10 µg <16 16-22 ≥23

CAR100 Carbenicilina Penicilinas 100 µg <18 18-21 ≥22

P10 Penicilina Penicilinas 10 UI ≤14 - ≥15

PRL100 Piperacilina Penicilinas 100 µg ≤14 - ≥15

K30 Canamicina Aminoglicosídeos 30 µg <15 15-16 ≥17

S10 Estreptomicina Aminoglicosídeos 10 µg <13 13-14 ≥15

CN10 Gentamicina Aminoglicosídeos 10 µg <16 16-17 ≥18

NET30 Netilmicina Aminoglicosídeos 30 µg <19 19-20 ≥21

TOB10 Tobramicina Aminoglicosídeos 10 µg <16 16-19 ≥18

KF30 Cefalotina Cefalosporinas 30 µg <12 12-17 ≥18

CTX30 Cefotaxima Cefalosporinas 30 µg <23 23-27 ≥26

CAZ30 Ceftazidima Cefalosporinas 30 µg <19 19-20 ≥21

CRO30 Ceftriaxona Cefalosporinas 30 µg <23 23-25 ≥26

DA2 Clindamicina Lincosamidas 2 µg <15 - ≥15

C30 Cloranfenicol Fenicóis 30 µg ≤12 13-17 ≥18

E15 Eritromicina Macrólidos 15 µg ≤13 14-22 ≥23

RD5 Rifampicina Ansamicinas 5 µg ≤16 17-19 ≥20

SXT25 Sulfametoxazol/

Trimetoprim Sulfamidas

1,25/23,75µ

g <10 10-17 ≥16

TE30 Tetraciclina Tetraciclinas 30 µg ≤14 15-18 ≥19

VA30 Vancomicina Glicopéptideos 30 µg ≤14 15-16 ≥17


43

3.6 Avaliação da produção de bacteriocinas em queijo fresco

3.6.1 Elaboração do queijo fresco com as BAL

Procedeu-se inicialmente ao crescimento das BAL em MRS Broth (AES, França)

durante 24 horas a 30 °C. De seguida pipetou-se 100 μl de BAL para 100 ml de leite

magro UHT e incubou-se a 30 °C durante 48 horas.

Para a elaboração do queijo fresco utilizou-se leite gordo obtido na empresa

Chegalvorada (granja da Universidade). Este leite foi pasteurizado no laboratório da

seguinte forma: aqueceu-se o leite a 73 °C durante 16 s, passando-se imediatamente

para um banho com gelo. Após arrefecimento, adicionou-se 0,02% de CaCl2 e 1% de

NaCl ao leite. Após aquecimento a 32 °C, o leite foi inoculado com as culturas BAL

(1%) e foi adicionado o coalho (LMF 1/15,000; 0,2g/L). Após 40 minutos cortou-se a

coalhada em cubos de 2 cm, e aumentou-se a temperatura para 37 °C durante 25

minutos. Passado este tempo escorreu-se o soro e colocou-se a coalhada em cinchos de

6,5 cm de diâmetro. Os queijos foram armazenados à temperatura de 4 °C.

3.6.2 Determinação do pH do queijo

A determinação do pH foi realizada com o auxílio de um potenciómetro (WTW

Inolab pH Level 1, Alemanha), por penetração do eléctrodo directamente no queijo. As

leituras do pH foram feitas às 0, 6, 24, 48 e 72 horas.

3.6.3 Acidez titulável

Para determinação da acidez titulável retirou-se uma amostra de 4 g de queijo e

adicionou-se água destilada morna (40 °C) até perfazer o volume final de 42 ml,

agitando-se muito bem de modo a ficar bem misturado. De seguida filtrou-se em papel

de filtro, retirou-se 25 ml do filtrado e adicionou-se 500 μl de solução de fenolftaleína.

Por fim, foi feita a titulação com NaOH 0,1M até se observar uma cor rosada. A acidez

titulável foi realizada às 0, 6, 24, 48 e 72 horas. A acidez titulável foi calculada do

seguinte modo: 1 ml de NaOH 0,1M corresponde a 0,0090 g de ácido láctico (Kirk e

Sawyer, 1991).


44

3.6.4 Determinação da humidade

Para a determinação da humidade pesou-se 3 g de queijo em recipientes apropriados e

colocou-se numa estufa a 103 °C durante 24 horas. Passado esse tempo, colocaram-se as

amostras num excicador durante 30 minutos para arrefecerem e pesaram-se novamente.

A análise foi feita em triplicado.

3.6.5 Contagens das BAL no queijo

As contagens das BAL no queijo fresco foram feitas por plaqueamento no meio

KF (Biokar, França) para os isolados (L2B21K3, L3A21K6, L3A21K7 e L3B1K3) e

M17 (Biokar, França) para os isolados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3 e L3A21M8),

às 0, 6, 24, 48 e 72 horas.

Retirou-se uma amostra de 25g de queijo e adicionou-se 225 ml de Buffered

Peptone Water (AES, França), misturando-se no Stomacher (400 Circulator) durante 2

minutos a 230 rpm. Foram feitas diluições decimais e procedeu-se ao plaqueamento por

incorporação no meio KF (Biokar, França) e M17 (Biokar, França) conforme os

isolados. As placas com KF (Biokar, França) foram a incubar a 30 °C durante 48 horas,

enquanto que as placas com M17 (Biokar, França) foram a incubar a 30 °C durante 72

horas. Passado este tempo foram feitas as contagens. As contagens foram realizadas em

duplicado.

3.6.6 Determinação da actividade antimicrobiana no queijo

A cultura da bactéria alvo de referência foi inoculada em Nutrient Broth (AES,

França) e incubada durante 18 horas a 37 °C.

As amostras de queijo foram centrifugadas (Centrifuge 5415D, Eppendorf,

Alemanha) a 4500 × g durante 10 minutos, de modo a obter-se o sobrenadante. De

seguida, os sobrenadantes foram neutralizados com a adição de tampão fosfato 0,5 M a

pH 7,0 e passados por filtros de 0,20 μm (Sartorius Stedim Biotech, Alemanha).

A actividade antimicrobiana (anti-listéria) destes sobrenadantes foi determinada

pelo método de difusão em agar em poços, conforme referido na secção 3.2.1. Este teste

foi realizado em duplicado.


45

A concentração mínima inibitória (CMI) dos sobrenadantes do queijo fresco foi

realizada de acordo com a secção 3.2.2, excepto na preparação da amostra.

A actividade antimicrobiana das BAL no queijo fresco foi ainda determinada

introduzido directamente uma alíquota de queijo fresco nos poços, seguindo-se o

procedimento descrito na secção 3.2.1.

3.6.7 Provas organolépticas

Foram realizadas provas organolépticas dos queijos preparados com as BAL

produtoras de bacteriocinas. Utilizou-se um painel de 50 a 52 provadores não treinados

(duas sessões) que realizaram as provas organolépticas cegas em dois dias distintos,

testando em cada sessão, um total de 5 queijos (4 queijos com BAL e um controlo).

Foram avaliados 5 parâmetros: acidez, teor de sal, firmeza, cheiro e apreciação global

dos queijos, numa escala de 1 a 5, em que 1 indica a pontuação mais baixa para os

diferentes critérios: o queijo menos ácido, menos salgado, mais mole, menos aroma e

menos apreciado; e o 5 indica a pontuação mais elevada para os mesmos parâmetros: o

queijo muito ácido, muito salgado, muito firme, aroma muito intenso e muito apreciado.

No anexo I encontra-se um exemplar da folha preenchida por cada provador. De modo a

facilitar o tratamento de dados, a pontuação atribuída por cada provador foi

posteriormente classificada em três níveis: nível inferior I (pontuações 1 e 2), nível

médio II (pontuação 3) e nível superior III (pontuações 4 e 5).

3.7 Avaliação do efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em

queijo fresco

3.7.1 Elaboração do queijo fresco com BAL e Listeria monocytogenes

Procedeu-se inicialmente ao crescimento das BAL em MRS Broth (AES, França)

durante 24 horas a 30 °C. De seguida, pipetou-se 100 μl de BAL para 100 ml de leite

magro UHT e colocou-se a incubar a 30 °C durante 48 horas.

A Listeria monocytogenes ATCC 7466 foi inoculada em Nutrient Broth (AES,

França) e incubada durante 18 horas a 37 °C.

A L. monocytogenes foi centrifugada (Centrifuge 5415D, Eppendorf, Alemanha)

durante 10 minutos a 5900 × g, lavada duas vezes com água peptonada (Buffered


46

Peptone Water, AES, França) e ressuspensa em água peptonada. De seguida foram

feitas diluições decimais de modo a obter-se 106 ufc ml

-1 (1,0 na escala de McFarland).

Para a elaboração do queijo fresco utilizou-se leite de vaca pasteurizado (leite da

empresa Chegalvorada - granja Universitária pasteurizado a 73 °C/16 s) contendo

0,02% de CaCl2 e 1% de NaCl. Aqueceu-se o leite a 32 ºC e de seguida este foi

inoculado com as culturas BAL (1%) e a Listeria monocytogenes (1% ou 0,1%).

Passados 20 minutos foi adicionado o coalho (LMF 1/15,000; 0,2g/L). Após 40 minutos

cortou-se a coalhada em cubos de 2 cm, e aumentou-se a temperatura para 37 °C

durante 25 minutos. Passado este tempo escorreu-se o soro e colocou-se a coalhada em

cinchos. Os queijos foram armazenados à temperatura de 4 °C.

3.7.2 Avaliação do crescimento de listéria no queijo fresco

As contagens de L. monocytogenes foram feitas por plaqueamento em meio de

Palcam (AES, França), às 0, 6, 24, 48, 72 e 168 horas (no primeiro ensaio),

prolongando-se até às 360 horas nos ensaios posteriores. Retirou-se uma amostra de 25

g de queijo e adicionou-se 225 ml de água peptonada (AES, França), misturado-se no

Stomacher (400 Circulator) durante 2 minutos a 230 rpm. Foram feitas diluições

decimais e procedeu-se ao plaqueamento por incorporação no meio de Palcam (AES,

França). De seguida as placas foram a incubar a 37 °C durante 48 horas. Após este

tempo foram realizadas as contagens em duplicado.

3.8 Análise estatística

A análise estatística das provas organolépticas foi realizada pelo teste do Qui-

quadrado. Nos casos em que mais de 20% das células apresentaram uma frequência

esperada inferior a 5% utilizou-se o Fisher Exact Test. Foi também realizada a

correlação não paramétrica de Spearman entre a firmeza e apreciação global. Todas as

análises estatísticas foram realizadas com o programa IBM SPSS Statistics 20.


47

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Actividade antimicrobiana das BAL

Os sobrenadantes neutralizados de oito isolados produziram zonas de inibição

contra a Listeria monocytogenes e destas, três produziram também zonas de inibição

contra o Clostridium perfringens (Quadro 6). Não foi observada actividade

antimicrobiana contra as outras bactérias testadas.

Quadro 6. Detecção da actividade antimicrobiana contra a L. monocytogenes e C. perfringens.

Isolados Estirpes de referência

L. monocytogenes C. perfringens

L2B21K3 + +

L3A1M6 + +

L3A21M1 + -

L3A21M3 + -

L3A21M8 + -

L3A21K6 + +

L3A21K7 + -

L3B1K3 + -

(+) com zona de inibição, (-) sem zona de inibição

De um modo geral, as bacteriocinas produzidas pelas BAL actuam contra

bactérias Gram-positivas, taxonomicamente próximas, e não apresentam actividade

contra bactérias Gram-negativas (Collins et al., 2010). Neste estudo, este facto foi

confirmado pois ambas as bactérias Gram-negativas testadas, Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa, não foram sensíveis à produção de bacteriocinas.

Analogamente, não se observou actividade antimicrobiana contra o Staphylococcus

aureus apesar de este microrganismo ser Gram-positivo.

A actividade antimicrobiana verificada nos sobrenadantes neutralizados livres de

células e com adição de catalase, significa que a actividade observada é devida às

bacteriocinas e não a outros mecanismos de inibição como a produção de ácido e de

peróxido de hidrogénio. A actividade dos sobrenadantes neutralizados manteve-se a


48

temperaturas elevadas (100 °C durante 60 min.) e foi eliminada na presença de

proteases (testes não apresentados), confirmando a identidade proteica do/s agente/s

antimicrobiano/s.

Cinco isolados apresentaram o valor mais elevado para a concentração mínima

inibitória (CMI) pela técnica spot-on-lawn que corresponde a 3200 UA ml-1

. Um dos

isolados (L3A21M3) apresentou um valor baixo de CMI de 200 UA ml-1

(Quadro 7).

Pela técnica dos poços o valor mais elevado de CMI foi detectado nos mesmos quatro

isolados da técnica anterior, mas correspondendo ao valor de 533 UA ml-1

(Quadro 7).

O valor mais baixo de CMI obtido pela técnica dos poços (33 UA ml-1

) foi igualmente

observado no mesmo isolado (L3A21M3).

Quadro 7. Valores da CMI dos isolados produtores debacteriocinas contra a L. monocytogenes.

Isolados Técnica spot-on-lawn Técnica dos poços

Diluição UA ml-1

Diluição UA ml-1

L2B21K3 1:16 3200 1:32 533

L3A1M6 1:16 3200 1:16 267

L3A21M1 1:4 800 1:8 133

L3A21M3 1 200 1:2 33

L3A21M8 1:8 1600 1:16 267

L3A21K6 1:16 3200 1:32 533

L3A21K7 1:16 3200 1:32 533

L3B1K3 1:16 3200 1:32 533

Apesar de na técnica dos poços a maioria dos isolados apresentarem halos de

inibição em diluições mais altas, os respectivos valores de CMI foram inferiores aos da

técnica spot-on-lawn. Isto deve-se ao volume de amostra pipetado, pois na técnica spot-

on-lawn o volume foi de 5 μl quando na outra técnica foi de 60 μl. Na técnica dos

poços, como o volume foi maior, está presente uma maior quantidade de bacteriocinas a

actuar e deste modo surgem halos de inibição em diluições mais altas. No entanto, como

as unidades arbitrárias (UA) são calculadas com base no volume aplicado, constatou-se

que o volume de amostra foi determinante para os valores de CMI.


49

Os resultados de CMI deste trabalho são comparáveis aos obtidos por outros

estudos (CMI de 3200 UA ml-1

; Sip et al, 2012) e superiores aos obtidos por Mills et al.

(2011a) para a plantaricina 423 (40 UA ml-1

). Salum et al. (2012) apresenta um valor de

CMI de 320 UA ml-1

para a bacteriocina produzida pelo Bacillus subtilis. Comparando

com o presente estudo, apenas um isolado (L3A21M3) apresentou uma CMI inferior a

este valor. Outros autores apresentam igualmente valores relativamente baixos (800

UA ml-1

) para enterocinas produzidas por estirpes de Enterococcus faecalis (Isleroglu et

al., 2012; Huang et al., 2013). No entanto, outros autores apresentam actividades

superiores para bacteriocinas produzidas pelo Lactobacillus plantarum (6400 UA ml-1

;

Martínez et al., 2013) ou Lactococcus garvieae (12800 UA ml-1

; Sip et al, 2012).

Schirru et al. (2012) observaram que bacteriocinas produzidas por diferentes estirpes de

Enterococcus faecium apresentavam actividades anti-listéria que variavam

consideravelmente (de 800 a 51200 UA ml-1

). Estes autores referiram ainda que a

actividade máxima dos sobrenadantes neutralizados era atingida após 21 h de cultura,

diminuindo depois deste período. Vários autores referem que o máximo de produção de

bacteriocinas é atingido no final da fase exponencial e início da fase estacionária

(Tolinački et al., 2010; Benkerroum et al., 2012; Sip et al,, 2012; Schirru et al., 2012;

Han et al., 2013). No presente trabalho, a actividade dos sobrenadantes foi medida após

72 h de cultura, pelo que não podemos excluir a possibilidade de se poder obter

actividades superiores diminuindo-se o tempo de cultura em meio.

4.2 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas

Através dos testes API, das oito BAL testadas foram identificadas quatro espécies,

nomeadamente Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis ssp. lactis 1, Lactobacillus

paracasei ssp. paracasei 1 e Streptococcus uberis (Quadro 8).


50

Quadro 8. Identificação fenotípica dos isolados com o sistema API 50 CH.

Isolados Identificação fenotípica % ID*

L2B21K3 Enterococcus faecalis 99.7

L3A1M6 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 97.0

L3A21M1 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1 99.4



L3A21K6 Enterococcus faecalis 99.7

L3A21K7 Streptococcus uberis 96.3

L3B1K3 Enterococcus faecalis 99.2

* % ID - grau de certeza da identificação em percentagem

Através da sequenciação genética, foram identificadas apenas duas espécies

diferentes nos oito isolados, sete Enterococcus faecalis e apenas um isolado

correspondeu à espécie Lactococcus lactis (Quadro 9).

Deste modo, apenas três isolados (L2B21K3, L3A21K6 e L3B1K3) mantiveram a

mesma identificação pelos dois métodos de identificação (Enterococcus faecalis). Dos

restantes isolados, quatro alteraram a sua identificação após sequenciação do gene 16S

rRNA para Enterococcus faecalis e apenas um isolado foi identificado como

Lactococcus lactis (L3A21M1), identificado pelo teste API como Lactobacillus

paracasei ssp. paracasei 1.

Quadro 9. Identificação dos isolados por sequenciação do gene 16S rRNA.

Isolados Identificação genética

L2B21K3 Enterococcus faecalis

L3A1M6 Enterococcus faecalis

L3A21M1 Lactococcus lactis



L3A21K6 Enterococcus faecalis

L3A21K7 Enterococcus faecalis

L3B1K3 Enterococcus faecalis


51

Neste estudo, sete das oito bactérias produtoras de bacteriocinas foram

identificadas geneticamente como E. faecalis, o que não é surpreendente visto que esta

espécie produz frequentemente enterocinas e é prevalente nos queijos artesanais

(Coppola et al., 2003; Gálvez et al., 2008; Nieto-Arribas et al., 2011). Segundo

Edalatian et al. (2012), o género Enterococcus é dominante em muitos produtos

alimentares, incluindo os queijos feitos a partir de leite cru.

Estes resultados vão também de encontro ao trabalho realizado por Bello et al.

(2010) em produtos artesanais italianos (queijo e produtos cárneos), onde se observou

uma elevada incidência de Lactococcus e Enterococcus em isolados produtores de

bacteriocinas.

4.3 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas

4.3.1 Actividades enzimáticas

O padrão de actividades enzimáticas dos isolados produtores de bacteriocinas é

apresentado no Quadro 10.

A maioria dos isolados apresentou uma elevada actividade para a leucina

arilamidase. Todavia, as actividades para a valina arilamidase e cistina arilamidase

apresentaram-se muito baixas ou inexistentes em alguns isolados. Estas

aminopeptidases são importantes na libertação de aminoácidos que podem favorecer o

desenvolvimento de flavours indesejáveis no queijo (Herreros et al., 2003).

A maioria dos isolados, incluindo o L. lactis, exibiu também actividade das

esterases C4 e C8 (20 - 30 nmol de substrato hidrolisado), enquanto que se observaram

actividades muito baixas para a lipase C14 (Quadro 10). Apenas um isolado (L3A1M6)

não apresentou qualquer actividade nas lipases testadas. Baixas concentrações de ácidos

gordos livres contribuem para o flavour do queijo, quando estão em equilíbrio com os

produtos da proteólise (McSweeney e Sousa, 2000). As BAL apresentam geralmente

uma fraca capacidade lipolítica quando comparadas com outros grupos de

microrganismos (Foulquié Moreno et al., 2006). Contudo, as actividades lipolíticas e

esterolíticas podem variar consideravelmente entre espécies e estirpes. Os enterococos

em geral, exibem actividades esterolíticas mais elevadas do que outras espécies de BAL

e, entre os enterococos, o E. faecalis é a espécie mais lipolítica e esterolítica (Tavaria e


52

Malcata, 1998; Sarantinopoulos et al., 2001a; Foulquié Moreno et al., 2006; Nieto-

Arribas et al., 2011). Neste estudo, confirmou-se a heterogeneidade entre enterococos,

uma vez que as actividades mais elevadas da esterase (C4 e C8) foram observadas em

quatro isolados de E. faecalis, enquanto que num dos isolados (L3A1M6) não se

observou qualquer actividade das esterases e lipase.

A fosfatase alcalina apresentou uma actividade muito fraca ou não detectada em

todos os isolados (Quadro 10). Estes resultados estão de acordo com outros autores que

confirmaram a fraca ou não detectável actividade da fosfatase alcalina entre lactococos

e enterococos (Herreros et al., 2003; Serio et al., 2010). Pelo contrário, todos os

isolados apresentaram actividade da fosfatase ácida, que é uma enzima essencial para a

hidrólise dos fosfopéptidos e que já foi detectada em isolados de enterococos (Nieto-

Arribas et al., 2011) e de lactococos (Herreros et al., 2003). Também se verificou uma

elevada actividade da naftol-AS-BI-fosfohidrolase em todos os isolados, o que está de

acordo com os resultados obtidos por outros autores (Herreros et al., 2003; Serio et al.,

2010; Nieto-Arribas et al., 2011).

A actividade da α-quimotripsina foi também detectada na maioria dos isolados,

enquanto que a actividade da tripsina apresentou-se muito baixa ou inexistente.

Igualmente, não foram detectadas actividades enzimáticas para as enzimas /-

galactosidase, -glucuronidase, -glucosidase, -manosidase e -fucosidase (Quadro

10). Algumas destas enzimas, nomeadamente a -galactosidase e -glucuronidase,

podem estar associadas ao cancro do cólon, pelo que a ausência destas actividades

enzimáticas pode constituir um factor positivo na utilização destes isolados em produtos

alimentares.

No estudo de Arizcun et al. (1997), as estirpes analisadas apresentaram variações

consideráveis nas actividades enzimáticas apesar destas pertencerem à mesma espécie

(Enterococcus faecalis). Os resultados obtidos no presente trabalho também

demonstraram variações consideráveis entre os isolados de Enterococcus faecalis.


53

Quadro 10. Actividade enzimática das BAL detectada com o sistema APIZYM. A actividade enzimática

(valores aproximados) é expressa em nmol de substrato hidrolisado.

BAL*

Enzimas†

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

L2B21K3 5 20 30 5 30 5 5 5 20 30 30 0 0 0 5 0 0 0 0

L3A1M6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 20 0 0 0 0 0 0 0 0

L3A21M1 5 20 10 5 10 5 5 5 5 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0

L3A21M3 10 20 30 10 20 5 10 5 10 20 10 5 5 5 5 5 5 5 0

L3A21M8 5 20 20 5 30 10 10 5 10 10 20 0 0 0 5 0 0 0 0

L3A21K6 5 5 20 5 30 5 10 5 20 20 20 5 5 5 10 5 5 5 5

L3A21K7 5 5 20 5 20 5 10 5 10 10 10 5 5 5 10 5 10 5 5

L3B1K3 0 30 30 0 10 0 0 0 10 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0

* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis

†1- Fosfatase alcalina, 2- Esterase (C4), 3- Esterase lipase (C8), 4- Lipase (C14), 5- Leucina arilamidase,

6- Valina arilamidase, 7- Cistina arilamidase, 8- Tripsina, 9- -quimotripsina, 10- Fosfatase ácida, 11-

Naftol-AS-BI-fosfohidrolase, 12- -galactosidase, 13- -galactosidase, 14- -glucoronidase, 15- -

glucosidase, 16- -glucosidase, 17- N-acetil--glucosaminidase, 18- -manosidase, 19- -fucosidase.

4.3.2 Propriedades tecnológicas

As propriedades tecnológicas das BAL foram estudadas através da avaliação das

actividades proteolítica, lipolítica e produção de diacetilo (Quadro 11).

Os isolados apresentaram fraca actividade proteolítica e lipolítica. Apenas um

isolado (L3A1M6) foi capaz de degradar a caseína e dois (L3B1K3 e L3A21M3)

exibiram actividade lipolítica. A baixa actividade proteolítica observada nestes isolados

está de acordo com os resultados obtidos por Sarantinopoulos et al. (2001a).

Curiosamente, as actividades da tripsina e -quimotripsina estão ausentes no isolado

L3A1M6 (Quadro 10), apesar deste ser o único isolado a apresentar actividade

proteolítica. Esta actividade será pois devida à produção de uma diferente protease ou

proteases.

As BAL são geralmente consideradas por apresentarem também uma fraca

capacidade lipolítica, quando comparadas com outros grupos de microrganismos

(Foulquié Moreno et al., 2006). Vários autores caracterizam os enterococos como tendo

fraca actividade proteolítica e lipolítica, sendo contudo o E. faecalis a espécie mais


54

proteolítica (Dovat et al., 1970; Arizcun et al., 1997; Suzzi et al., 2000; González et al.,

2010).

O único isolado L. lactis (L3A21M1) foi o que apresentou o nível mais elevado de

produção de diacetilo. Quatro isolados E. faecalis (L3A21M3, L3A21M8, L3A21K6,

L3A21K7) produziram níveis médios de diacetilo e apenas um isolado (L3A1M6) não

produziu diacetilo a partir do citrato (Quadro 11).

Quadro 11. Propriedades tecnológicas das BAL produtoras de bacteriocinas.

Isolados* Actividade

proteolítica†

Actividade

lipolítica†

Produção de

diacetilo††

L2B21K3 - - +

L3A1M6 + - -

L3A21M1 - - +++

L3A21M3 - + ++

L3A21M8 - - ++

L3A21K6 - - ++

L3A21K7 - - ++

L3B1K3 - + +

* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis

† Resultados expressos como (+) positivo e (-) negativo

†† Produção de diacetilo alto (+++), médio (++), baixo (+) e negativo (-)

Nem todas as BAL têm a capacidade de metabolizar o citrato. A degradação do

citrato resulta na formação de produtos finais metabólicos como o diacetilo, acetaldeído,

acetoína, 2,3-butanodiol e dióxido de carbono, que influenciam significativamente o

aroma e textura dos alimentos fermentados (Hugenholtz et al., 1993; Foulquié Moreno

et al., 2006). O L. lactis exibiu um nível alto de produção de diacetilo sendo esta uma

característica importante para uma potencial utilização como cultura de arranque.

Os enterococos também produziram diacetilo a partir do citrato mas com níveis de

produção mais baixos, com excepção de um isolado que não produziu diacetilo

(L3A1M6). Estes resultados estão de acordo com outros estudos que revelam que as

estirpes de enterococos têm potencial metabólico para metabolizar o citrato e deste


55

modo contribuir para o desenvolvimento do flavour em produtos lácteos

(Sarantinopoulos et al., 2001b; Franciosi et al., 2009).

4.4 Avaliação da segurança das BAL

4.4.1 Histamina, Hemólise, DNase e Gelatinase

Os testes para os factores de virulência revelaram que nenhum dos isolados

produziu histamina ou DNase (Quadro 12). Pela análise do quadro 12 podemos observar

também a ocorrência de hemólise α em todos os isolados, não se observando a

ocorrência das hemólises β. Metade dos isolados (L3A21M1, L3A21M3, L3A21M8 e

L3A1M6) apresentou resultados positivos na produção de gelatinase (Quadro 12).

Quadro 12. Resultados dos testes para a produção de histamina, actividade hemolítica, produção de

DNase e gelatinase das BAL produtoras de bacteriocinas.

Isolados* Produção de

histamina†

Actividade

hemolítica

Produção de

DNase†

Produção de

Gelatinase†

L2B21K3 - α - -

L3A1M6 - α - +

L3A21M1 - α - +

L3A21M3 - α - +

L3A21M8 - α - +

L3A21K6 - α - -

L3A21K7 - α - -

L3B1K3 - α - -

* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis † (-) Negativo, (+) Positivo

As hemolisinas desempenham um papel importante na virulência dos enterococos,

visto que provocam a lise dos eritrócitos podendo aumentar a severidade da infecção

(Franz et al., 2001). A produção de hemólise β tem sido detectada em isolados de

enterococos (Franz et al., 2001; Gupta e Malik, 2007).

No presente estudo, os resultados da actividade hemolítica dos enterococos estão

de acordo com os trabalhos realizados por Omar et al. (2004) e Barbosa et al (2010),


56

onde nenhum dos isolados apresentou actividade hemolítica ou . Mesmo assim, a

ausência de actividade hemolítica nos enterococos não significa necessariamente que

estas bactérias não possuam os genes de virulência (Barbosa et al., 2010).

A DNase é um factor de virulência visto que é uma enzima extracelular que

possui a capacidade de digerir DNA (Câmara, 2012). No estudo de Moraes et al. (2012)

e de Omar et al. (2004) todos os Enterococcus faecalis testados não produziram a

enzima DNase, resultados que coincidem com os obtidos neste trabalho.

A gelatinase também desempenha um papel importante na patogenicidade visto

que é uma protease que está envolvida na hidrólise do colagénio, caseína, hemoglobina

e pequenas proteínas bioactivas. A produção de gelatinase está geralmente associada aos

enterococos de amostras clínicas, mas também tem sido detectada em enterococos

isolados de produtos lácteos (Moraes et al., 2012; Morandi et al., 2013). No presente

trabalho, três isolados E. faecalis apresentaram produção de gelatinase o que vai de

encontro aos resultados obtidos nos estudos de Moraes et al. (2012) e de Franz et al.

(2001). No entanto, a gelatinase constitui um factor virulência que impede a atribuição

do estatuto QPS para estes isolados. O facto dos outros enterococos não terem produzido

gelatinase constitui um factor positivo, mas que deverá ser confirmado pela pesquisa

dos genes (Lopes et al., 2006).

As aminas biogénicas são produzidas no queijo por descarboxilação enzimática

dos aminoácidos pelos microrganismos (Valsamaki et al., 2000). Na maioria dos

queijos as principais aminas são a tiramina e a histamina produzidas pela

descarboxilação da tirosina e da histidina, respectivamente (Loizzo et al., 2013). O

queijo é um dos alimentos fermentados que tem sido frequentemente associado a

intoxicações por histamina (Ladero et al., 2008). Os resultados da produção de

histamina estão de acordo com os obtidos por Suzzi et al. (2000) e Sarantinopoulos et

al. (2001a), em que nenhum dos isolados de enterococos produziu histamina em meio.

Os resultados negativos para a hemólise, histamina e produção de DNase,

adicionando ao estatuto GRAS do L. lactis, faz deste isolado (L3A21M1) um candidato

seguro para desenvolvimento como cultura adjunta e/ou protectora em alimentos.

Eaton e Gasson (2001) demonstraram que a incidência de factores de virulência

nos enterococos é mais elevada nas amostras clínicas em comparação com as de origem


57

alimentar, sugerindo assim que e as estirpes isoladas de alimentos possuem um baixo

potencial de patogenicidade.

4.4.2 Resistência a antibióticos

Os resultados obtidos para a resistência aos antibióticos dos oito isolados são

apresentados no Quadro 13. Nenhum dos isolados foi classificado como resistente à

amoxicilina/ácido clavulânico, carbenicilina, penicilina, cloranfenicol e vancomicina.

Por outro lado, foi detectada a resistência à piperacilina, estreptomicina,

trimetoprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico em todos os isolados. A canamicina,

gentamicina, netilmicina, tobramicina, ceftazidima, ceftriaxona e clindamicina

exerceram um efeito inibitório numa grande percentagem de isolados de Enterococcus

faecalis. Três isolados de E. faecalis (L3A21M3, L3A21M8, L3A1M6) também foram

resistentes à tetraciclina, enquanto que a resistência intermédia foi detectada para a

eritromicina em todos os enterococos. O L. lactis foi sensível à maioria dos antibióticos

testados (16 de 22), sendo resistente à piperacilina, estreptomicina, rifampicina,

trimetoprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico.


58

Quadro 13. Resultados dos testes de resistência/sensibilidade das BAL produtoras de bacteriocinas a 22 antibióticos.

Antibióticos BAL

L2B21K3 L3A1M6 L3A21M1 L3A21M3 L3A21M8 L3A21K6 L3A21K7 L3B1K3

Amoxicilina/Ácido Clavulânico S S S S S S S S

Cloranfenicol S S S S S S S S

Carbenicilina S S S S S S S S

Ceftazidima R R S R R R R R

Gentamicina R R S R R R R R

Ceftriaxona R R S R R R I R

Cefotaxima R R S R I R R I

Clindamicina R R S R R R R R

Eritromicina I I S I I I I I

Canamicina R R S R R R R R

Cefalotina S S S S S S S I

Ácido Nalidíxico R R R R R R R R

Netilmicina R R S R R R R R

Ofloxacina R R R R R R R R

Penicilina S S S S S S S S

Piperacilina R R R R R R R R

Rifampicina S R R I I S I S

Estreptomicina R R R R R R R R

Sulfametoxazol/Trimetoprim R R R R R R R R

Tetraciclina S R S R R S S S

Tobramicina R R S R R R R R

Vancomicina S S S S S S S S

R - Resistente, I - Intermédio e S - Sensível


59

Neste trabalho, os isolados de enterococos foram resistentes aos aminoglicosídeos

como a gentamicina, estreptomicina, canamicina, netilmicina, tobramicina, e β-

lactâmicos como a ceftazidima e piperacilina. Estas observações estão de acordo com

outros estudos que mostram que os enterococos apresentam resistência intrínseca a uma

variedade de antibióticos, como os aminoglicosídeos e os β-lactâmicos (Mathur e Singh,

2005). A maioria dos enterococos apresentou resistência às cefalosporinas, bem como

aos antibióticos sulfamidas e quinolonas, o que pode ser consequência do uso local de

agentes antimicrobianos para o tratamento e controlo de doenças infecciosas em

animais.

Uma das principais preocupações de segurança para os enterococos é a resistência

adquirida para glicopéptidos como a vancomicina (Courvalin, 2006; Morandi et al.,

2013). Todavia, todas as estirpes produtoras de bacteriocinas testadas no presente

estudo demonstraram ser sensíveis à vancomicina e a outros antibióticos clinicamente

importantes como a carbenicilina, penicilina, cloranfenicol e amoxicilina/ácido

clavulânico (Quadro 13).

4.5 Aplicação das BAL como culturas de arranque/adjuntas no queijo fresco

4.5.1 Avaliação de parâmetros químicos, crescimento e actividade antimicrobiana

Os resultados obtidos para a determinação do pH, acidez titulável, crescimento

das BAL e actividade antimicrobiana no queijo fresco inoculado com os oito isolados

são apresentados nas Figuras 4 e 5.

Os queijos inoculados com as BAL apresentaram valores iniciais de pH entre 6,4

e 6,5 baixando ligeiramente até 6,4 - 6,0 ao fim de 72 horas. Pelo contrário, o queijo

preparado sem qualquer inóculo (controlo) não apresentou qualquer descida de pH. A

maior redução de pH foi observada nos isolados L3A21M3 e L3A21M8. Estes isolados

foram também os que apresentaram valores mais elevados de produção de ácido láctico

(acidez titulável), o que explica a redução de pH observada. No entanto, nem sempre se

observa uma correlação estreita entre os valores de pH e a produção de ácido láctico.

Por exemplo, o isolado L2B21K3 apresentou uma produção de ácido láctico (passando

de 0,04 g/100g para 0,10 g/100g) que não foi observada por uma redução

correspondente no pH.


60

Não se observaram alterações na acidez nos queijos controlo e produzidos com os

isolados L3A21K6 e L3A21K7 (0,05 g/100g). No único isolado identificado como L.

lactis (L3A21M1), foram observados valores muito baixos de produção de ácido

láctico, confirmados pela reduzida descida de pH.

Figura 4. Evolução do pH no queijo conservado a 4 °C durante 72 horas. Cada valor representa a média

de duas réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.

Figura 5. Evolução da acidez titulável no queijo conservado a 4 °C durante 72 horas. Cada valor

representa a média de duas réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.

5,9

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

6,7

6,8

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

pH

Tempo (horas)

Controlo L3A21K6 L3A21K7 L3B1K3 L2B21K3

L3A21M8 L3A1M6 L3A21M1 L3A21M3

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Aci

de

z ti

tulá

vel (

g/1

00

g)

Tempo (horas)

Controlo L3A21K6 L3A21K7 L3B1K3 L2B21K3

L3A21M8 L3A1M6 L3A21M1 L3A21M3


61

Na manufactura do queijo um decréscimo rápido do pH é considerado crucial

visto que é essencial para a coagulação, firmeza da coalhada e controlo dos

microrganismos indesejáveis. De acordo com Beresford et al. (2001), as bactérias

starter poderiam ser definidas como isolados que produzem ácido suficiente para

reduzir o pH do leite para 5,3 em 6 horas a 30 - 37 °C. No presente trabalho, nenhum

dos isolados apresentou uma redução de pH tão acentuada, pelo que não podem ser

qualificados como boas culturas de arranque (starters).

As BAL englobam um grupo heterogéneo de microrganismos cuja principal

característica é a produção de ácido láctico (Mayo et al., 2010). Todos os isolados em

estudo produziram ácido láctico no queijo fresco. No entanto, noutros estudos

realizados com BAL em leite foram obtidos valores de acidez titulável superiores aos

observados neste trabalho (Herreros et al., 2003; Badis et al., 2004; González et al.,

2010). Contudo, a reduzida capacidade de acidificação apresentada pela maioria dos E.

faecalis está de acordo com outros trabalhos, onde se verifica que as estirpes de

Enterococcus são produtores de ácido lentos, uma vez que degradam a lactose no leite

mais lentamente do que o Lactobacillus paracasei, que é considerado um baixo

acidificante (Sarantinopoulos et al. 2001a). O L. lactis também foi um baixo

acidificante, o que está de acordo com a baixa capacidade acidificante dos lactococos

isolados a partir de produtos artesanais referida por outros autores (Ayad et al., 2004).

Mesmo assim, os isolados com propriedades acidificantes baixas podem ser usados

como culturas adjuntas, dependendo das suas características. Em relação ao crescimento

no queijo a 4 °C, observou-se um crescimento razoável a esta temperatura, atingindo-se

a fase estacionária às 48 horas na maioria dos isolados, com excepção do isolado

L3A1M6 que continuou em fase exponencial (Figura 6). Ao fim de 72 horas todos os

isolados apresentaram o aumento de 1 unidade log no crescimento. No que concerne à

actividade antimicrobiana, todas as amostras de queijo, com excepção do controlo,

apresentaram halos de inibição da listéria desde o início. Contudo, a actividade anti-

listéria nos sobrenadantes neutralizados só foi detectada com os isolados L2B21K3 e

L3A21K6. O isolado L2B21K3 apresentou actividade anti-listéria desde a introdução da

coalhada nos cinchos (0 horas), enquanto que o isolado L3A21K6 apresentou actividade

anti-listéria detectável no sobrenadante neutralizado após 48 horas de armazenamento (4

°C). Relativamente à CMI dos sobrenadantes neutralizados, nenhum dos isolados

apresentou actividade anti-listéria pela técnica "spot-on-lawn"


62

Figura 6. Cinética do crescimento das estirpes no queijo a 4 °C (●) e produção de bacteriocinas (diâmetro

dos halos de inibição do crescimento de listéria) do extracto neutralizado (■) e do queijo (▲). Cada valor

representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão. A-

L2B21K3, B- L3A1M6, C- L3A21M1, D- L3A21M3, E- L3A21M8, F- L3A21K6, G- L3A21K7 e H-

L3B1K3 (L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis).

0

4

8

12

16

20

4,0

6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

Diâ

me

tro

(m

m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

12

16

20

4,0

6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

Diâ

me

tro

(m

m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

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16

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8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

Diâ

me

tro

(m

m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

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16

20

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6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

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me

tro

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m)

Log

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g-1

Tempo (horas)

0

4

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8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

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me

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m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

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16

20

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6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72 D

iâm

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mm

)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

12

16

20

4,0

6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

Diâ

me

tro

(m

m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

0

4

8

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16

20

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6,0

8,0

10,0

0 12 24 36 48 60 72

Diâ

me

tro

(m

m)

Log

ufc

g-1

Tempo (horas)

A B

C D

E F

G H


63

A elevada actividade antimicrobiana nos queijos detectada desde o início do

armazenamento a 4 °C não poderá ser atribuída à redução de pH ou produção de ácido

láctico pois, na maioria dos isolados, estes valores são idênticos ao do controlo, onde

não se detectou qualquer inibição da listéria. Acresce ainda que apenas se observa um

ligeiro aumento dos halos de inibição nas primeiras 6 horas, período que corresponde ao

crescimento exponencial das BAL. Para períodos posteriores, onde se regista a

diminuição do pH e aumento da produção de ácido láctico, não se observa um aumento

correspondente dos halos de inibição. Estes resultados sugerem que a produção de

bacteriocinas pelas BAL em estudo é realizada num período inicial de crescimento (fase

exponencial). Tendo em conta que o tempo zero corresponde à altura em que a coalhada

foi colocada nos cinchos, regista-se um tempo de incubação prévio de cerca de 65 min.,

que corresponde à formação da coalhada e dessoramento, durante o qual as BAL

poderão iniciar a produção de bacteriocinas. Embora não tenha sido realizado o estudo

da cinética de produção de bacteriocinas por estes isolados, outros autores referem que a

sua produção aumenta durante a fase exponencial de crescimento bacteriano,

estabilizando durante a fase estacionária (Benkerroum et al., 2012; Han et al., 2013;

Martinez et al., 2013). Observando os resultados obtidos pelos dois isolados que

apresentaram actividade anti-listéria nos sobrenadantes (soro do queijo), confirma-se a

presença de bacteriocinas desde o início (tempo 0) para o isolado L2B21K3. Nos

queijos inoculados com este isolado pode-se ainda detectar um ligeiro aumento dos

halos de inibição ao longo do tempo, enquanto que no caso do isolado L3A21K6,

apenas se começa a detectar actividade no sobrenadante e aumento dos halos de inibição

após 48 h. A determinação dos diâmetros dos halos não reflecte correctamente a

quantidade/actividade de bacteriocina produzida, pelo que a medida da concentração

mínima inibitória (CMI) se torna no método mais adequado e reprodutível para análise

da actividade das bacteriocinas. No entanto, no presente estudo não foi possível detectar

a CMI nos sobrenadantes produzidos por estes dois isolados, talvez devido à menor

quantidade de bacteriocinas presentes nos sobrenadantes que, no volume testado (5 l),

não foram suficientes para inibir a listéria pela técnica spot-on-lawn.

A inexistência de actividade anti-listéria observada na maioria dos sobrenadantes

testados pode indicar a ocorrência de adsorção das bacteriocinas às células produtoras

ou às micelas de caseína. Resultados semelhantes foram obtidos por vários autores que

não conseguem detectar a presença de diversas bacteriocinas nos extractos de queijo,


64

embora essa actividade seja detectada quando as amostras de queijo são colocadas

directamente nos poços de agar contendo a bactéria indicadora (Sarantinopoulos et al.,

2002; Foulquié Moreno et al., 2003; Rodríguez et al., 2005). No presente caso, apenas

dois isolados produzem bacteriocinas detectáveis nos sobrenadantes do queijo. Estas

bacteriocinas possuem propriedades químicas diferentes das restantes bacteriocinas, em

particular uma carga global positiva (resultados não apresentados), ao contrário da

maioria das bacteriocinas que são aniónicas e que dessa forma poderão ligar-se

fortemente aos grupos fosfato da caseína.

Os isolados com produção de bacteriocinas inicial elevada, e que apresentaram

igualmente alguma capacidade de acidificação, poderão ser assim utilizados como

culturas de arranque/adjuntas no fabrico de queijos maturados. Já os isolados com uma

produção não detectada de ácido láctico durante a refrigeração a 4 °C têm um elevado

potencial para ser utilizados na produção de queijo fresco, pois neste caso o aumento de

acidez não é desejável. No entanto, dado que existem reservas em relação à aplicação de

E. faecalis nos alimentos, foi escolhido o único isolado produtor de bacteriocinas com

estatuto GRAS, (L. lactis, L3A21M1) para avaliação de alguns parâmetros no queijo

fresco ao longo de 30 dias. Deste modo, os parâmetros pH, acidez titulável, humidade,

bem como crescimento total são apresentados nas Figuras 7 e 8.

Figura 7. Evolução do pH (■) e da acidez titulável (●) no queijo conservado a 4 °C durante 30 dias. Cada

valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão. A-

Controlo, B- L3A21M1 (L. lactis).

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

6,7

6,8

0 5 10 15 20 25 30

Aci

de

z ti

tulá

vel (

g/1

00

g)

pH

Tempo (dias)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

6,7

6,8

0 5 10 15 20 25 30

Aci

de

z ti

tulá

vel (

g/1

00

g)

pH

Tempo (dias)

A B


65

Figura 8. Evolução do crescimento – contagens totais (■) e da humidade (●) no queijo fresco conservado

a 4 °C durante 30 dias. Cada valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o

respectivo desvio padrão. A- Controlo, B- L3A21M1 (L. lactis).

Tanto o queijo controlo como o inoculado com o L. lactis (isolado L3A21M1) não

apresentaram grandes descidas de pH, embora se tenha registado a maior descida no

queijo com o isolado (atingindo o valor de 6,2). Como seria de esperar, o queijo com a

láctica produziu a maior quantidade de ácido láctico (0,15 g/100g aos 30 dias), embora

se tenha registado alguma produção de ácido láctico ao fim de 30 dias no queijo

controlo. Em ambos os queijos a percentagem de humidade foi muito semelhante,

registando-se uma perda superior a 20% no último dia de análise. No entanto, houve

uma descida mais acentuada na humidade nos primeiros dias (Figura 7). Relativamente

ao crescimento microbiano, o queijo com inóculo apresentou um aumento de 2 unidades

log ao longo dos primeiros 15 dias de refrigeração a 4 °C. No queijo controlo

(produzido com leite pasteurizado) não se detectaram contagens de microrganismos nos

primeiros 10 dias de refrigeração. No entanto, com o decorrer do tempo surgiu flora

adventícia, detectando-se as primeiras colónias após 15 dias de refrigeração (Figura 8).

A principal característica de uma cultura starter é a rapidez de acidificação com a

produção de ácidos orgânicos, principalmente o ácido láctico (Wouters et al., 2002;

Leroy e De Vuyst, 2004). Neste estudo verificou-se que os valores de pH desceram

pouco apesar de existir um aumento da quantidade de ácido láctico produzido. Deste

modo, este isolado poderá ser usado como cultura adjunta ou protectora.

0

20

40

60

80

100

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

Hu

mid

ade

(%

)

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

0

20

40

60

80

100

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

Hu

mid

ade

(%

)

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

A B


66

O queijo fresco é um produto com humidade elevada que favorece o crescimento

dos microrganismos (Cunha et al., 2006; Pingitore et al., 2012). Ao longo do tempo de

refrigeração verificou-se um aumento do crescimento do L. lactis no queijo inoculado

com este isolado, assim como surgiu flora adventícia no queijo controlo. Isto deve-se

principalmente à humidade elevada e baixa acidez dos queijos que permitem o

desenvolvimento dos microrganismos. Estes resultados estão de acordo com os obtidos

no estudo de Oliveira et al. (2012) em queijo fresco de cabra onde foi utilizada uma

cultura mista de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris.

Num outro estudo realizado no queijo fresco Minas, foi utilizada uma cultura mista de

Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris, tendo-se obtido

uma maior acidificação (Buriti et al., 2005). Este queijo apresentou também uma

humidade inicial inferior (67,5%), o que corresponde ao teor nos queijos testados no

presente estudo, após 20 dias de refrigeração.

4.5.2 Avaliação organoléptica

No primeiro lote de queijos testados (L2B21K3, L3B1K3, L3A21K6, L3A21K7 e

controlo) não se observaram diferenças significativas (P>0,05) entre os queijos para os

parâmetros avaliados, com excepção da firmeza (Quadro 14) (Anexo II). O queijo com

o isolado L3B1K3 foi considerado mais firme que o controlo pelo painel de provadores

não treinados (50 provadores). De um modo geral, os provadores atribuíram uma

pontuação baixa (nível I) para a acidez, teor de sal e aroma dos queijos. Este não é um

resultado surpreendente, pois o queijo fresco produzido com leite de vaca possui em

geral um aroma pouco acentuado e reduzida acidez. Em relação ao teor em sal, é usual a

adição deste na altura do seu consumo, pelo que irá ser ajustado à medida de cada

consumidor. Os queijos com as BAL mereceram uma apreciação global média (II) a

elevada (III), comparável com o queijo sem qualquer cultura (controlo).

No segundo lote de queijos testados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3,

L3A21M8) o painel de provadores (52 provadores) atribuiu igualmente uma pontuação

baixa (nível I) para a acidez e aroma dos queijos, comparável com o queijo controlo

(Quadro 15). No entanto, observaram-se diferenças significativas (P<0,05) nos

parâmetros acidez, firmeza e apreciação global (Quadro 15) (Anexo III). Na acidez,

estas diferenças foram observadas entre o controlo (ausência de BAL) e os queijos

inoculados com os isolados L3A1M6 e L3A21M3 (P<0,05), sendo os queijos


67

inoculados com as BAL considerados mais ácidos que o controlo. Estes resultados vêm

confirmar a maior produção de ácido láctico (acidez titulável) detectada nestes queijos

(secção 4.5.1). No entanto, o queijo inoculado com o isolado L3A21M8, tendo

apresentado a maior produção de ácido láctico (secção 4.5.1), não foi considerado ácido

pelo painel de provadores (P=0,776). É assim possível que a acidez percepcionada pelos

provadores seja resultado não só da quantidade de ácido láctico produzido, como

também resulte das actividades proteolíticas e lipolíticas dos isolados (secção 4.3.2).

Desta forma, a ausência de actividade proteolítica e lipolítica apresentada pelo isolado

L3A21M8 terá contribuído decisivamente para a reduzida acidez avaliada pelo painel de

provadores. Pelo contrário, os isolados L3A1M6 e L3A21M3 apresentaram actividade

proteolítica e lipolítica, respectivamente, o que, em conjunto com a produção de ácido

láctico, terá contribuído para a atribuição de uma pontuação mais elevada por uma

percentagem mais elevada de provadores (Quadro 15). Em relação à firmeza, os queijos

inoculados com os isolados L3A21M1 e L3A21M8 foram considerados menos firmes

que o controlo (P<0,05). O queijo produzido com o isolado L3A21M3 foi o menos

apreciado, com 39% dos provadores a atribuírem uma classificação baixa (I),

apresentando uma diferença significativa (P<0,05) em relação ao controlo. Este

resultado na apreciação global poderá estar relacionado com o facto de uma maior

percentagem de provadores (23%) ter classificado este queijo como muito ácido. Notou-

se igualmente uma tendência para uma melhor apreciação global quando se tratava de

um queijo mais firme. A correlação entre a apreciação global e a firmeza foi

significativa (P<0,05) em ambos os lotes de queijos testados.

Num estudo realizado em queijo fresco de cabra, (Oliveira et al., 2012), foram

observadas diferenças significativas em alguns queijos na apreciação global e na

firmeza, o que vai de encontro aos resultados obtidos neste trabalho. No entanto,

tratando-se de um queijo de cabra, também foram obtidas diferenças significativas em

relação ao aroma, enquanto que no presente trabalho não se registaram diferenças ao

nível do aroma. Segundo Pereira et al., (2011) os microrganismos inoculados nos

queijos produzidos com leite de vaca não exercem qualquer influência no aroma do

queijo nos primeiros dias de maturação, o que vai de encontro aos resultados obtidos no

presente estudo.


68

Quadro 14. Avaliação da acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global do primeiro lote de queijos testados (L2B21K3, L3B1K3, L3A21K6 e L3A21K7). São

indicadas as percentagens de provadores que atribuíram a classificação I, II e III e respectivos valores de P.

a Valor de P obtido na comparação entre queijos.

b Valor de P em comparação com o queijo controlo.

Quadro 15. Avaliação da acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global do segundo lote de queijos testados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3 e L3A21M8). São

indicadas as percentagens de provadores que atribuíram a classificação I, II e III respectivos valores de P.

Queijo Acidez

Pa Teor de sal

Pb Firmeza

Pa Aroma

Pb Apreciação global

Pa

I II III I II III I II III I II III I II III

L3A1M6 56 29 15 0,003 48 31 21

0,224

28 36 36 0,761 58 27 15

0,160

31 25 44 0,054

L3A21M1 90 9,6 0 0,555 61 29 10 54 33 13 0,042 73 21 6 14 44 42 0,978

L3A21M3 62 15 23 0,004 39 46 15 37 38 25 0,800 60 25 15 39 25 36 0,011

L3A21M8 81 13 6 0,776 48 44 8 61 29 10 0,004 81 11 8 23 31 46 0,319

Controlo 85 13 2 - 50 35 15 33 36 31 - 75 19 6 14 42 44 -

a Valor de P em comparação com o queijo controlo.

b Valor de P obtido na comparação entre queijos.

Queijo Acidez

Pa Teor de sal

Pa Firmeza

Pb Aroma

Pa Apreciação global

Pa

I II III I II III I II III I II III I II III

L2B21K3 82 14 4

0,880

68 18 14

0,173

52 36 12 0,107 82 14 4

0,533

26 32 42

0,698 L3B1K3 82 14 4 58 28 14 10 48 42 0,012 64 26 10 12 32 56

L3A21K6 76 18 6 58 34 8 42 36 22 0,526 76 22 2 18 38 44

L3A21K7 74 24 2 50 32 18 24 42 34 0,378 70 20 10 24 30 46

Controlo 80 14 6 76 16 8 32 46 22 - 74 20 6 22 38 40


69

4.6 Efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em queijo fresco

4.6.1 Adição individual dos isolados

Para avaliar o efeito das diferentes BAL produtoras de bacteriocinas no controlo

de listeria in situ, procedeu-se à adição de um inóculo com L. monocytogenes a estes

queijos. Num primeiro ensaio, foram realizadas contagens até ao 7º dia (Figuras 9 e 10).

Apesar da conservação a 4 °C, observou-se um aumento das contagens de L.

monocytogenes nos queijos controlo (sem adição de BAL), atingindo-se cerca de 8,5 log

ufc g-1

aos 7 dias (Figuras 9 e 10). No entanto, todas as 8 BAL testadas reduziram a

contagem de L. monocytogenes no início e durante o tempo de armazenamento. A maior

redução da presença de L. monocytogenes foi obtida nos queijos inoculados com o

isolado L3A21K7 (Figura 9) e com os isolados L3A21M3 e L3A21M8 (Figura 10),

obtendo-se uma diminuição de aproximadamente 4 unidades log em comparação com o

queijo controlo, após 7 dias. Em contraste, o isolado que exerceu o menor efeito na

redução do crescimento da listéria foi o L. lactis (L3A21M1), reduzindo em cerca de 2

unidades log após 7 dias (Figura 10).

Figura 9. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com bactérias produtoras de

bacteriocinas (L3A21K6, L3A21K7, L3B1K3 e L2B21K3) durante 7 dias. Cada valor representa a média

de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 1 2 3 4 5 6 7

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

Controlo L2B21K3 L3B1K3 L3A21K7 L3A21K6


70


bacteriocinas (L3A21M8, L3A1M6, L3A21M1 e L3A21M3) durante 7 dias. Cada valor representa a

média de três réplicas e as barras de erro representam o desvio padrão.

No sentido de estudar o efeito de redução da listéria para além do tempo

inicialmente estudado (7 dias), foi realizado um novo ensaio com os isolados que

apresentaram uma maior redução da listéria (L3A21M8, L3A21M3, L3A21K7 e

L3B1K3), prolongando-se as análises até aos 15 dias (Figura 11).

Nos queijos conservados a 4 °C durante 15 dias, a maior redução da L.

monocytogenes foi verificada no queijo inoculado com o isolado L3A21M8, com uma

diminuição de aproximadamente 4 unidades log em comparação com o queijo controlo.

Esta redução da listéria foi observada até ao 6º dia, mantendo-se as contagens sem

alteração até ao 15º dia (Figura 11). Ao contrário do que tinha sido observado no

primeiro ensaio (7 dias), o isolado L3A21K7 não foi capaz de reduzir a contagem de

listéria para valores inferiores a 106 ufc g

-1, o que sugere que terá havido um erro na

contagem no dia 7, no primeiro ensaio. Para os restantes isolados testados, não houve

grandes alterações das contagens de listeria com o prolongamento do tempo de análise.

Em relação ao queijo controle, observou-se um contínuo crescimento de L.

monocytogenes até ao dia 9, atingindo a fase estacionária (até aos 15 dias) com

contagens superiores a 108 ufc g

-1 (8,5 log ufc g

-1). Este crescimento da listéria é

favorecido pelo pH próximo da neutralidade (pH = 6,5, ver secção 4.5.1), o que torna o

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 1 2 3 4 5 6 7

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

Controlo L3A21M3 L3A21M1 L3A1M6 L3A21M8


71

queijo fresco um alimento muito susceptível para contaminação e crescimento da

listéria (Kabuki et al., 2004).


bacteriocinas (L3A21M8, L3A21M3, L3A21K7 e L3B1K3) durante 15 dias. Cada valor representa a

média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.

Os resultados evidenciaram uma produção de bacteriocinas desde o início do

ensaio, pois observou-se uma redução da listéria logo nas primeiras horas após a

produção do queijo. A partir das 72 horas, nos queijos inoculados com BAL as

contagens de listéria mantiveram-se estáveis até aos 7 dias, com excepção do isolado

L3A21K7 no primeiro ensaio (Figura 9). Quando se prolongou o tempo de

armazenamento também se constatou não existirem diferenças entre os 7 e 15 dias

(Figura 11).

Estes resultados estão de acordo com outros estudos realizados em queijo fresco

ou cottage cheese. Pingitore et al. (2012) testaram várias estirpes de Enterococcus spp

produtoras de bacteriocinas em queijo fresco de Minas, tendo detectado uma redução da

L. monocytogenes em 3 unidades log após 12 dias. No entanto, as bacteriocinas

produzidas pelas estirpes testadas tinham um efeito bacteriostático, não se observando

uma redução das contagens iniciais de L. monocytogenes. Em cottage cheese, Bello et

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

Controlo L3B1K3 L3A21K7 L3A21M3 L3A21M8


72

al. (2012) observaram igualmente uma diminuição da L. monocytogenes em 3 unidades

log após 6 horas de incubação com uma estirpe L. lactis produtora de lacticina 481.

Contudo, após esse período inicial, as contagens de L. monocytogenes voltavam a

aumentar para valores próximos do controlo, sendo este aumento justificado pelo facto

do queijo apresentar pouca acidificação (pH = 6,5) e deste modo não inibir o

crescimento do patógeno. Num outro estudo realizado também com cottage cheese,

Ross et al. (2000) observaram, após uma semana de maturação, uma redução nas

contagens de listéria de 1000 vezes, provocada pela adição de um starter produtor de

lacticina 3147. Em leite inoculado com L. lactis produtora de pediocina, Rodríguez et

al. (2005) relatam igualmente uma redução de 2,97 unidades log da L. monocytogenes.

Em queijo fabricado com leite de ovelha cru (queijo Manchego), a adição de um starter

produtor de nisina conduziu a uma redução da L. innocua em 4,08 unidades log, após 60

dias de maturação (Rodríguez et al., 1998).

4.6.2 Efeito de culturas mistas

O possível efeito sinergístico das bacteriocinas produzidas pelos isolados na

redução de listéria no queijo fresco foi testado para cinco isolados que apresentaram os

melhores resultados nos ensaios anteriores: L3B1K3, L3A21K6, L3A21K7, L3A21M3

e L3A21M8 (Figura 12). Todos os queijos inoculados com cultura mista reduziram a

contagem de L. monocytogenes no início e durante o tempo de armazenamento. A maior

redução da presença de L. monocytogenes, após 7 dias foi obtida pela utilização de duas

combinações (L3B1K3/L3A21M3 e L3A21M3/L3A21M8) com uma diminuição de

aproximadamente 5 unidades log em comparação com o controlo positivo.

Curiosamente, estes últimos isolados, L3A21M3 e L3A21M8, apresentaram valores

relativamente baixos de CMI, com 200 e 1600 UA ml-1

, respectivamente (ver secção

4.1). Deste modo, a produção e actuação das bacteriocinas nos alimentos nem sempre

reflecte os resultados obtidos em meio de cultura. A produção de bacteriocinas pelas

BAL depende diferentes factores ambientais (pH, presença de outras bactérias,

nutrientes) e embora os valores de CMI sejam muito utilizados para avaliar a actividade

das bacteriocinas, é de extrema importância a sua avaliação no local de actuação

(alimentos).


73

Figura 12. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com dois isolados produtores

de bacteriocinas (L3A21M3+L3A21M8, L3A21K6+L3A21K7 e L3B1K3+L3A21M3) durante 15 dias.

Cada valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.

O elevado inóculo de L. monocytogenes adicionado ao queijo no presente trabalho

(6,1 log ufc ml-1

) foi responsável pelas contagens elevadas detectadas ao longo do

tempo. Foi assim realizado um segundo ensaio com um inóculo mais baixo de L.

monocytogenes, tendo-se observado uma redução equivalente provocada pelo efeito

sinergístico dos isolados L3B1K3/L3A21M3 (Figura 13).

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

Controlo L3A21M3 + L3A21M8

L3B1K3 + L3A21M3 L3A21K6 + L3A21K7


74

Figura 13. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com dois isolados produtores

de bacteriocinas (L3B1K3+L3A21M3) com inóculo menor de patógene durante 15 dias. Cada valor

representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o desvio padrão.

Apesar do inóculo ser um pouco mais baixo (4,8 log ufc ml-1

) as bacteriocinas não

inibiram na totalidade o crescimento da listéria. Estes resultados estão de acordo com o

trabalho de Liu et al. (2008) onde também foi observada uma redução do crescimento

da L. monocytogenes sem eliminar completamente a presença do patógeno.

Embora sejam escassos os estudos realizados em queijos, e em particular no

queijo fresco, nenhum dos trabalhos publicados até ao presente apresenta uma redução

da L. monocytogenes tão elevada como no estudo actual.

A utilização de BAL produtoras de bacteriocinas em produtos lácteos tem sido

advogada por vários autores, pois permite resolver os problemas associados à adição de

bacteriocinas como ingredientes (Gálvez et al., 2008). Deste modo, algumas das BAL

testadas apresentam um grande potencial para aplicação no fabrico de queijo fresco ao

reduzir possíveis contaminações com a L. monocytogenes. Em particular, a utilização

em conjunto dos isolados L3B1K3 e L3A21M3 poderá constituir uma mais valia no

controlo da L. monocytogenes em queijos. Embora estes dois isolados tenham sido

identificados como Enterococcus faecalis, levantando algumas questões de segurança

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Log

ufc

g-1

Tempo (dias)

Controlo L3B1K3 + L3A21M3


75

em relação à sua aplicação nos alimentos, estes apresentam um número reduzido de

factores de virulência (Ribeiro et al., 2013). Muitas bacteriocinas com elevado potencial

para controlo de patógenos nos alimentos são produzidas por enterococci (Foulquié-

Moreno et al., 2006). Os enterococci são prevalentes nos lacticínios e em especial, nos

queijos tradicionais (Rivas et al., 2012). Muitos dos enterococci bacteriocinogénicos

podem crescer e produzir bacteriocinas no leite e queijos, o que os torna em bons

candidatos para utilização como culturas protectoras contra patógenos. Deste modo,

várias estirpes de enterococcus produtoras de enterocinas foram testadas no leite e

queijos com bons resultados (Giraffa et al.,1995; Nuñez et al., 1997).


76

5. CONCLUSÃO

Com a realização da presente trabalho foi possível detectar oito BAL produtoras

de bacteriocinas isoladas a partir do queijo do Pico. Todos estes isolados mostraram ter

actividade inibitória contra um importante patógeno alimentar como a Listeria

monocytogenes e três apresentaram ainda actividade inibitória contra o Clostridium

perfringens. Embora os testes API tenham identificado quatro espécies, pelos métodos

genéticos foram identificadas apenas duas espécies diferentes, sete Enterococcus

faecalis e um Lactococcus lactis.

O L. lactis apresentou características tecnológicas favoráveis como uma produção

elevada de diacetilo e um perfil enzimático promissor do ponto de vista da formação de

aroma. Do ponto de vista da segurança, este isolado apresentou resultados negativos

para a hemólise, produção de histamina e DNase. Não apresentou resistência aos

antibióticos clinicamente importantes o que, adicionado ao estatuto GRAS desta

espécie, faz deste isolado um candidato seguro para desenvolvimento como cultura

adjunta e/ou protectora para a indústria dos lacticínios, influenciando o

desenvolvimento do flavour e melhorando a segurança do produto final. No entanto, foi

com a utilização dos isolados E. faecalis que se observou a maior redução da L.

monocytogenes no queijo fresco. O maior efeito sinergístico foi obtido com a utilização

de duas combinações de isolados (L3B1K3/L3A21M3 e L3A21M3/L3A21M8)

atingindo-se uma diminuição de aproximadamente 5 unidades log em comparação com

o controlo positivo (queijo inoculado com L monocytogenes na ausência de BAL).

A utilização destes isolados no fabrico de queijo fresco foi ainda testada em

provas organolépticas, realizadas por um painel de provadores não treinados. Em geral,

os queijos com as BAL, com excepção do isolado L3A21M3, mereceram uma

apreciação global média (II) a elevada (III), comparável com o queijo sem qualquer

cultura (controlo). Observou-se ainda uma correlação significativa (P<0,05) entre a

apreciação global e a firmeza dos queijos testados.

A ausência de estatuto GRAS do E. faecalis, devido à resistência a alguns

antibióticos e presença de factores de virulência em algumas estirpes, levanta

preocupações relativamente à sua aplicação nos alimentos. Os isolados estudados não se

revelaram hemolíticos, nem produziram histamina ou DNase, embora três dos isolados


77

tenham testado positivo para a produção de gelatinase. Acresce ainda que estes isolados

não se revelaram resistentes a antibióticos clinicamente importantes, sendo assim

possível a sua utilização em aplicações biotecnológicas.

Deste modo, alguns isolados BAL, em particular a combinação dos isolados

L3B1K3 e L3A21M3, poderão ser utilizados na produção de bacteriocinas in situ para o

controle do crescimento da L. monocytogenes. Em alternativa, as bacteriocinas

produzidas pelas espécies de E. faecalis poderão ser isoladas e purificadas para serem

adicionadas como conservantes aos alimentos. A descoberta de novas bacteriocinas com

elevada actividade contra bactérias indesejáveis pode assim constituir uma vantagem a

ser explorada pela indústria alimentar na criação de produtos seguros e livres de

conservantes artificiais.

Como estudos futuros sugere-se a purificação e identificação das bacteriocinas

produzidas por estes isolados e o isolamento dos respectivos genes para uma aplicação

na produção heteróloga das enterocinas por BAL com estatuto GRAS.


78

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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97

ANEXOS


98

ANEXO I

Exemplar dos parâmetros avaliados na avaliação organoléptica


99


100

ANEXO II

Análise estatística dos dados relativos aos queijos do lote 1


101

Queijos: 1- L2B21K3, 2- L3B1K3, 3- L3A21K6, 4- L3A21K7, 5- Controlo.

Lote 1 - 50 provadores

Teste comparações globais entre os vários queijos relativamente aos parâmetros

acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global (N = 250).

Quadro 1. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a acidez.

Acidez Total

1 2 3

Queijo

1 41 7 2 50

2 41 7 2 50

3 38 9 3 50

4 37 12 1 50

5 40 7 3 50

Total 197 42 11 250

Quadro 2. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 1.

Chi-Square Tests

Value df Asymp. Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability

Pearson Chi-Square 3,893a 8 ,867 ,877

Likelihood Ratio 3,864 8 ,869 ,887

Fisher's Exact Test 3,907 ,880

Linear-by-Linear

Association ,351

b 1 ,554 ,584 ,292 ,028

N of Valid Cases 250

a. 5 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 2,20.

b. The standardized statistic is ,592.


102

Quadro 3. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o teor de sal.

sal Total

1 2 3

Queijo

1 34 9 7 50

2 29 14 7 50

3 29 17 4 50

4 25 16 9 50

5 38 8 4 50

Total 155 64 31 250

Quadro 4. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 3.

Chi-Square Tests

Value df Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 11,541a 8 ,173

Likelihood Ratio 11,795 8 ,161

Linear-by-Linear

Association ,256 1 ,613


a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum

expected count is 6,20.

Quadro 5. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a firmeza.

Firmeza Total

1 2 3

Queijo

1 26 18 6 50

2 5 24 21 50

3 21 18 11 50

4 12 21 17 50

5 16 23 11 50

Total 80 104 66 250


103


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear

Association 1,238 1 ,266




Quadro 7. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o aroma.

Aroma Total

1 2 3

Queijo

1 41 7 2 50

2 32 13 5 50

3 38 11 1 50

4 35 10 5 50

5 37 10 3 50

Total 183 51 16 250


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association ,279

b 1 ,597 ,625 ,312 ,026





104

Quadro 9. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a apreciação

global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo

1 13 16 21 50

2 6 16 28 50

3 9 19 22 50

4 12 15 23 50

5 11 19 20 50

Total 51 85 114 250


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear





Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à firmeza (N =

100)

Quadro 11. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a firmeza.

Firmeza Total

1 2 3

Queijo 1 26 18 6 50

5 16 23 11 50

Total 42 41 17 100


105


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 4,223

b 1 ,040 ,054 ,027 ,013


a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 8,50.

b. The standardized statistic is 2,055.


Firmeza Total

1 2 3

Queijo 2 5 24 21 50

5 16 23 11 50

Total 21 47 32 100


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 8,430

b 1 ,004 ,005 ,003 ,002



b. The standardized statistic is -2,903.


106


Firmeza Total

1 2 3

Queijo 3 21 18 11 50

5 16 23 11 50

Total 37 41 22 100


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association ,436

b 1 ,509 ,598 ,299 ,085





Firmeza Total

1 2 3

Queijo 4 12 21 17 50

5 16 23 11 50

Total 28 44 28 100


107


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 1,768

b 1 ,184 ,231 ,116 ,044




Correlação não paramétrica (Spearman) entre a firmeza e a apreciação global

(N=250)

Quadro 19. Correlação não paramétrica entre firmeza e a apreciação global.

Firmeza Apreciação

Spearman's rho

Firmeza

Correlation Coefficient 1,000 ,152*

Sig. (2-tailed) . ,016

N 250 250

Apreciação

Correlation Coefficient ,152* 1,000

Sig. (2-tailed) ,016 .

N 250 250

*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).


108

ANEXO III

Análise estatística dos dados relativos aos queijos do lote 2


109

Queijos: 1- L3A1M6, 2- L3A21M1, 3- L3A21M3, 4- L3A21M8, 5- Controlo.

Lote 2 - 52 provadores

Teste comparações globais entre os vários queijos relativamente aos parâmetros

acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global (N = 260).

Quadro 1. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a acidez.

Acidez Total

1 2 3

Queijo

1 29 15 8 52

2 47 5 0 52

3 32 8 12 52

4 42 7 3 52

5 44 7 1 52

Total 194 42 24 260


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear



a. 5 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum



110

Quadro 3. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o teor de sal.

Sal Total

1 2 3

Queijo

1 25 16 11 52

2 32 15 5 52

3 20 24 8 52

4 25 23 4 52

5 26 18 8 52

Total 128 96 36 260


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear





Quadro 5. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a firmeza.

Firmeza Total

1 2 3

Queijo

1 14 19 19 52

2 28 17 7 52

3 19 20 13 52

4 32 15 5 52

5 17 19 16 52

Total 110 90 60 260


111


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear





Quadro 7. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o aroma.

Aroma Total

1 2 3

Queijo

1 30 14 8 52

2 38 11 3 52

3 31 13 8 52

4 42 6 4 52

5 39 10 3 52

Total 180 54 26 260


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear






112

Quadro 9. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a apreciação

global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo

1 16 13 23 52

2 7 23 22 52

3 20 13 19 52

4 12 16 24 52

5 7 22 23 52

Total 62 87 111 260


Chi-Square Tests


sided)



Linear-by-Linear





Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à acidez (N =

104)

Quadro 11. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a acidez.

Acidez Total

1 2 3

Queijo 1 29 15 8 52

5 44 7 1 52

Total 73 22 9 104


113


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 11,248

b 1 ,001 ,001 ,000 ,000





Acidez Total

1 2 3

Queijo 2 47 5 0 52

5 44 7 1 52

Total 91 12 1 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 1,123

b 1 ,289 ,432 ,216 ,123


a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,50.



114


Acidez Total

1 2 3

Queijo 3 32 8 12 52

5 44 7 1 52

Total 76 15 13 104



Acidez Total

1 2 3

Queijo 4 42 7 3 52

5 44 7 1 52

Total 86 14 4 104

Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 10,306

b 1 ,001 ,002 ,001 ,001





115


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association ,625

b 1 ,429 ,557 ,279 ,116



b. The standardized statistic is -,791.

Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à firmeza (N =

104)


Firmeza Total

1 2 3

Queijo 1 14 19 19 52

5 17 19 16 52

Total 31 38 35 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability

Pearson Chi-Square ,547a 2 ,761 ,778

Likelihood Ratio ,548 2 ,760 ,778

Fisher's Exact Test ,571 ,778

Linear-by-Linear

Association ,541

b 1 ,462 ,540 ,270 ,075



b. The standardized statistic is -,736.


116


Firmeza Total

1 2 3

Queijo 2 28 17 7 52

5 17 19 16 52

Total 45 36 23 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 6,254

b 1 ,012 ,017 ,008 ,004





Firmeza Total

1 2 3

Queijo 3 19 20 13 52

5 17 19 16 52

Total 36 39 29 104


117



Firmeza Total

1 2 3

Queijo 4 32 15 5 52

5 17 19 16 52

Total 49 34 21 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 10,719

b 1 ,001 ,001 ,001 ,000




Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability

Pearson Chi-Square ,447a 2 ,800 ,828

Likelihood Ratio ,448 2 ,799 ,828

Fisher's Exact Test ,473 ,828

Linear-by-Linear

Association ,384

b 1 ,536 ,621 ,310 ,082





118

Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à apreciação

global (N = 104)

Quadro 27. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a apreciação

global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo 1 16 13 23 52

5 7 22 23 52

Total 23 35 46 104



global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo 2 7 23 22 52

5 7 22 23 52

Total 14 45 45 104

Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 1,255

b 1 ,263 ,319 ,160 ,053





119



global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo 3 20 13 19 52

5 7 22 23 52

Total 27 35 42 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association 4,282

b 1 ,039 ,051 ,025 ,011




Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability

Pearson Chi-Square ,044a 2 ,978 1,000

Likelihood Ratio ,044 2 ,978 1,000

Fisher's Exact Test ,097 1,000

Linear-by-Linear

Association ,020

b 1 ,888 1,000 ,500 ,111





120


global.

Apreciação Total

1 2 3

Queijo 4 12 16 24 52

5 7 22 23 52

Total 19 38 47 104


Chi-Square Tests


(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Point

Probability




Linear-by-Linear

Association ,271

b 1 ,603 ,697 ,348 ,090




Correlação não paramétrica (Spearman) entre a firmeza e a apreciação global

(N=260)

Quadro 35. Correlação não paramétrica entre a firmeza e a apreciação global.

Firmeza2 Apreciação2

Spearman's rho

Firmeza

Correlation Coefficient 1,000 ,179**

Sig. (2-tailed) . ,004

N 260 260

Apreciação

Correlation Coefficient ,179** 1,000

Sig. (2-tailed) ,004 .

N 260 260

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

UNIVERSIDADE DOS AÇORES Departamento de Ciências...

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