UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

ANÁLISES MORFOLÓGICAS, GENÉTICAS E

CITOGENÉTICAS EM HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS DE

Passiflora coccinea e P. hatschbachii

VIVIANE DE OLIVEIRA SOUZA

ILHÉUS-BAHIA

FEVEREIRO DE 2018

ii





ILHÉUS-BAHIA

FEVEREIRO DE 2018

Tese apresentada à Universidade Estadual de

Santa Cruz como parte das exigências para a

obtenção do título de doutora em Produção

Vegetal.

Linha de Pesquisa: Melhoramento Genético e Biotecnologia.

Orientadora:

Prof.a Dra. Margarete Magalhães de Souza

Co-orientador: Dr. Cláusio Antônio Ferreira

de Melo

iii





_________________________________________________________

Profa. Dra. Margarete Magalhães de Souza

UESC/DCB

(Orientadora)

_________________________________________________________

Marcio Gilberto Cardoso Costa

UESC/DCB

__________________________________________________________

Gonçalo Santos da Silva

UESC/DCB

_________________________________________________________

Vanessa de Carvalho C. Pamponét

Instituto Federal Baiano-Uruçuca

_________________________________________________________

Jôsie Cloviane de Oliveira Freitas

Universidade Estadual de Goiás-Posse

iv

AGRADECIMENTOS

À Deus por ser luz em minha trajetória sempre, dando-me saúde e sabedoria.

À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós

Graduação em Produção Vegetal pela oportunidade e a secretária do programa, Carol,

que sempre consegue solucionar os problemas e esclarecer nossas dúvidas.

À Coordenação do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de estudos.

À Professora Dra. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação,

ensinamentos transmitidos, aprendizado, dedicação e conselhos durante o

desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Cláusio Antônio Ferreira de Melo, pela coorientação, amizade,

colaboração, auxílio nas análises estatísticas e disponibilidade durante a realização

deste trabalho. Sempre encontrando soluções com suas ideias inovadoras. Muito

obrigada por tudo!

Á professora Ioná, pela acolhida na UFERSA, e a professora Simone (UFRB),

Helison e Ciro na tentativa de realizar as análises com eletroforese em gel de

poliacrilamida. Agradeço à amiga Elaine, pela estadia durante este período em sua

casa. Muito obrigada!

Á Jôsie, pela parceria, amizade, troca de experiência e auxílio nas análises

estatísticas e no cruzamento entre as espécies Passiflora coccinea e P. hatschbachii, foi

muito importante a obtenção da progênie híbrida.

Ao Paulo e Roberto pelo auxílio nas atividades de campo.

Aos amigos do Laboratório de Melhoramento de Plantas (LAMEP): Aline, que

embora tenha pouco tempo de convivência, já conquistou com seu jeito alegre e

prestativo. Obrigada pelo axílio na avaliação morfológica! Analu (Flor), dividimos

momentos de angústias e aprendizado a cada resultado com os geis de poliacrilamida.

Além disto, agradeço pela realização da análise meótica. Jonathan, agradeço pelo

auxílio na montagem do experimento, na tomada de dados morfológicos, com os géis de

poliacrilamida e por toda experiência científica e de amizade. Você é um guatemalteco

que é um pouquinho brasileiro-baiano. Lembrarei de você com muito carinho! Manu,

pelas experiências trocadas no laboratório, momentos difíceis e alegres e pela amizade

que construímos ao longo desses anos. Você é uma grande amiga! Artur, Matu e Ohana

que já fizeram parte do LAMEP, obrigada por dividir os conhecimentos e por

v

proporcionar momentos de descontração! Pedro, por todo auxílio e disponibilidade no

processo de autoclavagem do solo, além da ajuda na condução do experimento em

campo. Rita Sanchês, pela ajuda com a citogenética clássica (escolha de metáfases,

medições, cariogramas) e molecular, e por todas as dúvidas sanadas. Quero agradecer

também pela amizade, conselhos e conversas construtivas! Você é verdadeira seu

“Erro”. Isso é bom! Rita Moreira, pela amizade, ajuda na condução do experimento,

experiências trocadas no laboratório e por todos os momentos de alegria. Ritão você é

incrível! Vanessa, por toda auxílio no laboratório (na extração de DNA, preparo de

lâminas, aplicação da FISH), além da amizade construída e dos momentos alegres e

descontraídos. Agradeço ao amigo e Pós-doc do LAMEP, Gonçalo, que sempre esteve

presente auxiliando na melhor forma para obtenção dos resultados, sempre disposto a

ajudar. Agradeço ainda pela amizade, foram seis anos de muito aprendizado,

angústias, experiências trocadas, momentos de descontração e conselhos. Obrigada

por tudo! Sentirei falta de todos vocês e deste mundo científico que descobrir!!!

Aos colegas do PPGPV, Geovanna e Pedro, pela amizade adiquirida ao longo

desses anos.

À amiga Pati, pela amizade, conselhos e momentos de descontração.

À minha família, por todo apoio e confiança, sempre acreditando no meu

potencial.

Ao meu esposo e colega de doutorado, Joedson, pelo amor, amizade, e

companheirismo durante todo esse período, sempre me tranquilizando com suas

palavras sábias. Agradeço ainda pela ajuda na montagem do experimento e na coleta

de dados morfológicos. Simplesmente, você me completa. Te amo!

À todos que me apoiaram e participaram para a realização desse trabalho, cada

um teve e tem um papel importante em minha vida e contribuiu nesta minha jornada.

Eu agradeço imensamente!!!

Muito Obrigado!

vi

RESUMO




Este estudo teve como objetivo principal a obtenção e caracterização de híbridos

interespecíficos de Passiflora, visando selecionar aqueles que apresentam características

interessantes ao mercado de plantas ornamentais. No capítulo 1 foram realizadas

hibridações interespecíficas em espécies de Passiflora para estudar a compatibilidade

entre elas e indicar os cruzamentos promissores para a produção de híbridos

ornamentais. Foram realizados 530 cruzamentos interespecíficos entre as espécies. Em

528 cruzamentos utilizou-se a espécie P. subrotunda como genitor femenino, e os

outros dois cruzamentos foram entre P. coccinea vs. P. hatschbachii. Dos 528

cruzamentos envolvendo P. subrotunda, 128 resultaram na fecundação da flor, porém,

apenas quatro cruzamentos utilizando esta espécie como receptora de pólen resultaram

em frutificação. Posteriormente foi possível a confirmação da fecundação cruzada

utilizando o marcador molecular SSR e a Hibridação Genômica In Situ (GISH). Dos

dois cruzamentos envolvendo P. coccinea vs. P. hatschbachii, um cruzamento produziu

fruto, resultando em 117 plantas híbridas. O cruzamento P. coccinea vs. P. hatschbachii

foi promissor, gerando uma progênie com potencial para sere utilizada em programas de

melhoramento de Passiflora para fins ornamentais. No capítulo 2 foi realizada a

descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1 obtidos do cruzamento entre

Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii, bem como a confirmação da hibridação

interespecífica com base em marcadores SSR e através da GISH. Foram observadas

diferenças qualitativa e quantitativa entre os híbridos em relação aos descritores

morfológicos florais e vegetativos avaliados. O descritor floral mais relevante para a

distinção dos híbridos foi o bandamento da corona, permitindo a separação das

progênies em drois grupos, originando os híbridos Passiflora ‘Vivis’ e Passiflora

‘Jhovi’, as quais tiveram o seu registro solicitado a Passiflora Society International. Foi

utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para observação do número

cromossômico, onde foi observada estabilidade numérica de 2n = 18 tanto nos genitores

como na progênie pertencentes aos dois grupos. O marcador molecular microssatélite

(SSR) Pa07 e a GISH confirmaram a fecundação cruzada nos grupos identificados. O

comportamento meiótico das amostras analisadas demonstrou que há regularidade

meiotica, indicando compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente

híbridos com alta viabilidade meiótica. Considerando a beleza das flores de Passiflora,

P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ são híbridos com potencial para o mercado ornamental, podendo

compor jardins, sobre pérgulas ou podendo ser cultivados em vasos na decoração de

diferentes ambientes. No capítulo 3 foram caracterizados genitores e híbridos F1 de

Passiflora, com base em descritores morfológicos, bem como foi estimados os

parâmetros genéticos da progênie híbrida visando o melhoramento destes híbridos para

uso ornamental. As avaliações morfológicas foram realizadas em dois períodos, com

intervalo de seis meses. Observou-se variabilidade para o formato e tamanho dos

descritores morfológicos na população híbrida. Através do agrupamento de Scott-Knott

verificou-se que a maioria das características apresentaram valores intermediários aos

dos genitores. Porém, houveram híbridos que obtiveram valores superiores aos genitores

para o tamanho dos primeiros filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da

corona, evidenciando heterobeltiose. Em geral, as características florais apresentaram

vii

maiores valores de herdabilidade que as características vegetativas. Os maiores valores

de herdabilidade para as caraceristicas florais diâmetro da flor, largura de pétala,

comprimento e largura de sépala e tamanho da primeira série da corona possibilita

realizar a seleção de genótipos e se obter ganhos significativos, com base nos dois

períodos de avaliação. A variabilidade genética identificada nas progênies, estimada

com base em características morfológicas e parâmetros genéticos, evidencia o potencial

destes genótipos para serem utilizados em programas de melhoramento de passifloras

voltados a ornamentação. No capítulo 4 estimou-se a divergência genética dos híbridos

F1 HD25 e seus genitores pela análise multivariada Ward-MLM. Foram avaliados 22

descritores morfológicos, em dois períodos de avaliação. No primeiro período de

avaliação, os genótipos foram alocados em quatro grupos e no segundo período foram

distribuídos em seis grupos. Os grupos em que os genitores estavam incluídos foram os

grupos que apresentaram menos similaridade genética, independente do período de

avaliação. A soma das duas primeiras variáveis canônicas explicaram 98,11% e 89,00%

de toda a variação observada no primeiro e segundo período de avaliação,

respectivamente. Desta forma, foi observado que existe diversidade genética entre os

genótipos híbridos e as espécies genitoras, que pode ser explorada em programas de

melhoramento de Passiflora ornamental. No capítulo 5 foi realizada a caracterização

cariotípica e a confirmação da hibridação interespecífica em 16 híbridos F1, mediante

combinação de técnicas de citogenética clássica e molecular. Foi utilizada a coloração

convencional para analises cariotípicas. Realizou-se a técnica de bandamento

CMA3/DAPI para a identificação das regiões ricas em GC e AT. Foi aplicada a GISH

usando as sondas dos genitores, simultaneamente, para detecção dos genomas parentais

nos híbridos e utilizou-se a Hibridação In Situ Florescente (FISH) para localização de

sítios de DNA Sat e 5S como marcadores cromossômicos. A análise com o fluorocromo

CMA3 possibilitou a visualização de heterocromatina rica em GC, cuja região

corresponde aos satélites. A GISH permitiu a diferenciação do genoma de cada genitor

nos 16 híbridos. Os cromossomos marcadores foram identificados como sendo no

quinto e sexto par em P. coccinea, e em P. hatschbachii no terceiro e sétimo, os quais

correspondem os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. Foram observados em

todos os híbridos analisados estes marcadores cromossômicos, indentificando os

genomas dos genitores na progênie F1. A GISH e a FISH além de permitirem a

confirmação das hibridações, sugere estabilidade entre os genomas genitores nos

híbridos pela ausência de translocações entre genomas e a não visualização de

modificações genômicas de âmbito citológico.

Palavras-chave: Hibridação interespecífica, P. ‘Vivis’, P. ‘Jhovi”, parâmetros

genéticos, análise multivariada, GISH e FISH.

viii

ABSTRACT

MORPHOLOGICAL, GENETIC AND CYTOGENETIC ANALYSIS IN

INTERSPECIFIC HYBRIDS Passiflora coccinea and P. hatschbachii

The main objective of this study was to obtain and characterize interspecific hybrids of

Passiflora, in order to select those that present interesting characteristics to the market

of ornamental plants. In Chapter 1, interspecific hybridizations were carried out on

Passiflora species to study the potential for hybridization between them and indicate the

promising crosses for the production of ornamental hybrids. There were 530

interspecific crosses between species. In 528 crosses the species P. subrotunda was

used as maternal parent, and the other two crosses were between P. coccinea vs. P.

hatschbachii. Of the 528 crosses involving P. subrotunda, 128 resulted in the

fertilization of the flower, however, four crosses using this species as pollen recipient

resulted in fruiting. Subsequently it was possible to confirm cross-fertilization using the

molecular marker SSR and Genomic In Situ Hybridization (GISH). Of the two crosses

involving P. coccinea vs. P. hatschbachii, a cross produced fruit, resulting in 117

hybrid plants. The P. coccinea vs. P. hatschbachii was promising, generating a progeny

with potential to be used in programs of improvement of Passiflora for ornamental

purposes. In chapter 2 the morphological and cytogenetic description of the F1 hybrids

obtained from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii, as well as the

confirmation of interspecific hybridization based on SSR markers and through Genomic

In Situ Hybridization. Qualitative and quantitative differences between hybrids were

observed in relation to the floral and vegetative morphological descriptors evaluated.

The most relevant floral descriptor for the hybrids distinction was the corona banding,

which was responsible for the separation of the progenies into the groups, giving rise to

the Passiflora 'Vivis' and Passiflora 'Jhovi' cultivars, which were registered with the

Passiflora Society International. Conventional staining with Giemsa 4% was used to

observe the chromosome number, where a numerical stability of 2n = 18 was observed

in both parents and progeny belonging to both groups. Microsatellite molecular marker

(SSR) Pa07 and GISH confirmed cross-fertilization in the identified groups. The

meiotic analysis was performed by the technique of crushing in acetic carmine for the

investigation of meiotic abnormalities and fertility in a sample of the progeny evaluated.

The meiotic behavior of the analyzed samples showed a meiotic regularity, indicating

high genetic compatibility between the parents and possibly hybrids with high meiotic

and disjunctional viability. Considering the beauty of Passiflora flowers, P. 'Vivis' and

P. 'Jhovi' are hybrids with potential for the ornamental market, being able to compose

gardens, pergolas or can be grown in pots in the decoration of different environments.

In chapter 3 we characterized the F1 parents and hybrids of Passiflora, based on

morphological descriptors, as well as estimating the genetic parameters of the hybrid

progeny aiming at the improvement of these hybrids for ornamental use. Morphological

evaluations were performed in two periods, with a six-month interval. In the first one

the genetic parameters were estimated in the parents and in 117 F1 hybrids. In the

second period the parents and 107 F1 hybrids were evaluated. Variability was observed

for the shape and size of the morphological descriptors in the hybrid population.

Through Scott-Knotts group it was verified that most of the characteristics presented

intermediate values to those of the parents. However, there were hybrids that obtained

values superior to the parents for the size of the first filaments of the crown, bract width

and diameter of the crown, evidencing the heterosis. In general, the floral characteristics

ix

had higher values of heritability than the vegetative characteristics. The highest values

of heritability for the floristic traits flower diameter, petal width, sepal width and width

and size of the first crown series makes it possible to perform genotype selection and

obtain significant gains, based on the two evaluation periods. The genetic variability

identified in the progenies, estimated on the basis of morphological characteristics and

genetic parameters, shows the potential of these genotypes to be used in programs to

improve passifloras for ornamentation. In Chapter 4 the genetic divergence of F1 HD25

hybrids and their parents was estimated by the Ward-MLM multivariate strategy, which

allows the joint analysis of qualitative and quantitative variables. 22 morphological

descriptors were evaluated in two evaluation periods, with a six-month interval between

them. In the first evaluation period, the genotypes were allocated into four groups and in

the second period were distributed into six groups. The groups in which the parents

were included were the groups that presented the least genetic similarity, regardless of

the evaluation period. The sum of the first two canonical variables explained 98.11%

and 89.00% of all variation observed in the first and second evaluation periods,

respectively. There is genetic diversity between the hybrid genotypes and the genitor

species, which can be explored in ornamental Passiflora breeding programs. In Chapter

5, the karyotypic characterization and the confirmation of the interspecific hybridization

in 16 F1 hybrids were performed by combining classical and molecular cytogenetic

techniques. Conventional staining was used for karyotypic analyzes. The CMA3

banding technique was used to identify the GC rich regions. Genomic In Situ

Hybridization was applied using the probes of the parents simultaneously for the

detection of parental genomes in the hybrids and the Fluorescent In Situ Hybridization

(FISH) was used to locate Sat and 5S DNA sites as chromosomal markers. The analysis

with the fluorochrome CMA3 enabled the visualization of heterochromatin rich in GC,

whose region corresponds to the satellites. GISH allowed the differentiation of the

genomes of each parent in the 16 hybrids. The marker chromosomes were identified as

being from the fifth to the sixth pair in P. coccinea, and in P. hatschbachii in the third

and seventh, which correspond to the sites Sat DNA and 5S rDNA, respectively. These

chromosomal markers were identified in all hybrids analyzed, identifying the genomes

of the parents in the F1 progeny. GISH and FISH, besides allowing the confirmation of

the hybridizations, suggests stability between the genomes in the genomes in the

hybrids by the absence of translocations between genomes and the non-visualization of

genomic modifications of cytological scope.

Keywords: Interspecific hybridization, P. 'Vivis' and P. 'Jhovi', genetic parameters,

multivariate analysis, GISH and FISH.

x

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1

2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................5

2.1 O gênero Passiflora L. ................................................................................................5

2.2 Potencial ornamental de Passiflora L. ........................................................................7

2.3 Hibridação artificial em Passiflora L. ........................................................................8

2.4 Confirmação de cruzamentos em Passiflora L.: marcadores moleculares e análises

citogenéticas......................................................................................................................9

2.5 Parâmetros genéticos.................................................................................................12

2.6 Análise de divergência genética: Método Ward-MLM.............................................14

CAPÍTULO I

3. Hybridization potential between Passiflora species for ornamental

use....................................................................................................................................16

Abstract............................................................................................................................16

3.1 Introduction...............................................................................................................17

3.2 Material and methods ...............................................................................................19

3.3 Results.......................................................................................................................25

3.4 Discussion..................................................................................................................27

3.5 Acknowledgment.......................................................................................................33

3.6 References.................................................................................................................33

CAPÍTULO II

4. Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NOVOS HÍBRIDOS

ORNAMENTAIS...........................................................................................................47

Resumo............................................................................................................................47

Abstract............................................................................................................................48

4.1 Introdução..................................................................................................................49

4.2 Material e Métodos....................................................................................................51

4.3 Resultados..................................................................................................................55

4.4 Discussão...................................................................................................................61

4.5 Conclusões.................................................................................................................64

4.6 Agradecimentos.........................................................................................................65

4.7 Referências Bibliográficas.........................................................................................65

xi

CAPÍTULO III

5. ESTIMATIVA DE PARÂMETROS GENÉTICOS EM HÍBRIDOS

INTERESPECÍFICOS F1 de Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) PARA

ORNAMENTAÇÃO......................................................................................................70

Resumo............................................................................................................................70

Abstract............................................................................................................................71

5.1 Introdução..................................................................................................................72

5.2 Material e Métodos....................................................................................................73

5.3 Resultados..................................................................................................................77

5.4 Discussão...................................................................................................................95

5.5 Conclusões.................................................................................................................99

5.6 Agradecimentos.........................................................................................................99

5.7 Referências Bibliográficas.........................................................................................99

CAPÍTULO IV

6. ANÁLISE DE DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM HÍBRIDOS

INTERESPECÍFICOS DE Passiflora L. PELO MÉTODO WARD-MLM...........104

Resumo..........................................................................................................................104

Abstract..........................................................................................................................105

6.1 Introdução................................................................................................................106

6.2 Material e Métodos..................................................................................................107

6.3 Resultados................................................................................................................110

6.4 Discussão.................................................................................................................121

6.5 Conclusões...............................................................................................................123

6.6 Referências Bibliográficas.......................................................................................124

CAPÍTULO V

7. CITOGENÉTICA COMPARATIVA E HIBRIDAÇÃO IN SITU PARA A

DETERMINAÇÃO DO CARÁTER HÍBRIDO DA PROGÊNIE

INTERESPECÍFICA F1 DE Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii)..........127

Resumo..........................................................................................................................127

Abstract..........................................................................................................................128

7.1 Introdução................................................................................................................129

7.2 Material e Métodos..................................................................................................131

7.3 Resultados................................................................................................................137

7.4 Discussão.................................................................................................................148

xii

7.5 Conclusões...............................................................................................................152

7.6 Agradecimentos.......................................................................................................152

7.7 Referências Bibliográficas.......................................................................................153

8. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................156

9. REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES.............................................................157

1

1. INTRODUÇÃO

O gênero Passiflora L. é composto de um grande número de espécies, onde mais

de 525 já foram descritas (CERVI; IMIG, 2013). O Brasil é considerado um dos

principais centros de diversidade do gênero, sendo reportados cerca de 137 espécies

(BERNACCI et al., 2013). No estado da Bahia, o gênero Passiflora consta de 32

espécies endêmicas, com grande distribuição nos biomas baianos, sendo a Floresta

Atlântica do Sul do Estado e a Chapada Diamantina consideradas os principais centros

de diversidade e distribuição (NUNES; QUEIROZ, 2006; BERNACCI; SOUZA 2012).

Estas espécies são apreciadas cada vez mais como plantas ornamentais devido

principalmente à originalidade de suas flores, as quais são bastante diversificadas com

relação à coloração, a presença da corona (estrutura peculiar da família Passifloraceae) e

variedade na forma das folhagens (SOUZA; PEREIRA, 2003).

Diante do crescente uso destas espécies na ornamentação é possível perceber um

aumento no número de estudos com as mesmas, especialmente estudos de

melhoramento genético para obter variantes genéticos que incremente o valor comercial

das passifloras. Sendo assim, a hibridação interespecífica é um método eficiente e

bastante utilizado em programas de melhoramento genético, uma vez que possibilita a

combinação da variabilidade em espécies muitas vezes contrastantes, permitindo a

obtenção de materiais geneticamente superiores e heterogêneos (SANTOS et al., 2012).

Nas espécies de Passiflora, a produção de híbridos normalmente visa à produção

de cultivares comerciais resistentes a doenças (JUNQUEIRA et al., 2005), geralmente

para a produção de frutos. Entretanto, a obtenção de híbridos para fins ornamentais está

sendo impulsionada, uma vez que vários híbridos vêm sendo produzidos para essa

finalidade (ABREU, 2008; BELO et al., 2018; MELO et al., 2015; SANTOS et al.,

2012). A realização dos cruzamentos interespecíficos com espécies de Passiflora tem

por finalidade a obtenção de flores com formato e cores intrínsecos, levando a sua

utilização na linha do agronegócio de plantas ornamentais (SANTOS et al., 2011).

Em programas de melhoramento de plantas ornamentais é importante a

identificação de genótipos promissores para produção de híbridos com heterose e a

partir daí determinar os métodos de melhoramento mais adequados (VIANA, et al.,

2007). Neste sentido, estudos de caracterização morfológica, diversidade genética e

estimativa de parâmetros genéticos em híbridos interespecíficos são importantes, uma

vez que é possível a identificação do componente genotípico em determinada

2

característica de interesse, permitindo traçar estratégias de melhoramento (CRUZ;

CARNEIRO, 2006).

No melhoramento de plantas a abordagem multivariada é um meio de

agrupamento eficaz na analise de divergência genética entre indivíduos, com grande

importância, principalmente, quando há um número grande de descritores (SANTOS,

2013). Essa análise possibilita o conhecimento da variabilidade genética entre o

germoplasma em análise. Existem métodos de análise multivariada que possibilita o uso

concomitante de variáveis quantitativas e qualitativas para a verificação da

variabilidade, como é o caso do método Ward-MLM (Ward-Modified Location Model

(FRANCO et al., 1998). Esta metodologia consiste primeiramente na formação de

grupos, os quais são definidos pelo método de agrupamento Ward (WARD, 1963)

utilizando a matriz de dissimilaridade de Gower (GOWER, 1971). Posteriormente, a

média do vetor da variável quantitativa para cada subpopulação, que independe dos

valores da variável qualitativa, é estimada pelo método MLM (SANTOS 2013).

A confirmação da hibridação em Passiflora pode ser realizada com base em

diversas técnicas, através de marcadores moleculares codominantes, técnicas de

citogenética molecular, como a Hibridação Genômica In Situ (GISH) e Hibridação In

Situ Fluorescente (FISH), as quais são eficientes neste processo. A confirmação

utilizando marcadores moleculares têm sido empregados em vários gêneros como,

Passiflora (BELO et al., 2018; CONCEIÇÃO et al., 2011b; MELO et al 2016;

SANTOS et al., 2012), Carica L. (MAGDALITA et al., 1997) e Theobroma L.

(FALEIRO et al., 2003).

Os marcadores microssatélites (SSR - Simple Sequence Repeats) revelam o

polimorfismo de forma codominante, com alto poder discriminante (AKKAYA et al.,

1992). É um dos marcadores mais utilizados devido a essas propriedades e ao alto

conteúdo informativo que este proporciona (OLIVEIRA et al., 2006). Os marcadores

SSR são constituídos por sequências repetidas em tandem, de um a seis nucleotídeos e

essas regiões são delimitadas por sequências conservadas de DNA, para as quais são

desenvolvidos primers específicos destas regiões flanqueadoras (LITT; LUTY, 1989;

SELKOE; TOONEN, 2006). Estudos com marcadores microssatélites abrangendo

espécies de Passiflora, tendo sido desenvolvidos apenas para P. edulis Sims. f.

flavicarpa O. Deg. (OLIVEIRA et al., 2005), P. alata (PÁDUA et al., 2005), Passiflora

contracta (CAZÉ, 2012), P. cincinnata (CERQUEIRA-SILVA et al., 2012) e P. setacea

D.C. (CERQUEIRA-SILVA et al., 2014).

3

Além do uso de marcadores moleculares outros estudos com a citogenética

clássica e molecular auxiliam no melhoramento genético. Neste sentido, a aplicação de

técnicas de citogenética clássica, como a coloração convencional, no estudo do número

e morfologia cromossômica, bem como a utilização de técnicas de bandamento através

de fluorocromos base-específicos tem auxiliado no estudo cariotípico de espécies e

híbridos de Passiflora (MELO et al., 2001). A análise de satélite (constrição secundária)

nos cariótipos de genitores e híbridos de Passiflora pode ser realizada com base em

fluorocromos CMA3 e DAPI, evidenciando diversidade na localização dos blocos

CMA3 e DAPI, servindo também como marcadores citológicos na confirmação do

status híbrido (MELO et al., 2001; MELO et al., 2014).

A citogenética molecular tem refinado estudos sobre a localização de genes ou de

sequencias de DNA repetitivo, por meio de Hibridação In Situ Fluorescente (FISH).

Além deste método, a GISH tem sido utilizada para a análise do parentesco e

confirmação de cruzamentos para a obtenção de híbridos (MELO et al., 2015a; MELO

et al., 2017). Ambas as técnicas têm contribuído bastante na localização de diferentes

sequencias de DNA e genomas completos em cromossomos meióticos ou mitóticos, em

fibras de cromatina estendidas e em núcleos interfásicos (FALEIRO et al., 2005;

WANG, et al., 2013). Entretanto, a caracterização citogenética molecular em híbridos

de Passiflora tem sido pouco relatada, embora a localização de sítios para DNA

ribossômico possa fornecer excelentes cromossomos marcadores para caracterização e

confirmação do caráter híbrido (HASTEROK et al., 2005; MELO et al., 2017;

MOREIRA, 2017; SILVA et al., 2017 in press).

O uso da técnica de FISH com sondas para DNAr 45S visando o mapeamento e

caracterização foi realizado inicialmente no híbrido somático de P. edulis f. flavicarpa

vs. P. amethystina J.C.Mikan (CUCO et al., 2005). Em híbridos obtidos de P. gardneri

Mast. vs. P. gibertii N.E.Br. foram utilizadas sondas para os sítios DNAr 5S e 45S para

a confirmação do cruzamento, evidenciando que essa técnica é eficiente na identificação

de híbridos em Passiflora (SILVA et al., 2017 in press). O uso de sondas de DNA Sat, o

qual colocaliza com sítios de DNAr 45S, foi realizado para o estudo comparativo entre

espécies de Passiflora visando o conhecimento evolutivo dessas sequências nos

genomas (PAMPONÉT, 2017).

A utilização de GISH na caracterização dos genomas pode ser útil para identificar

cromossomo ou fragmento cromossômico da espécie silvestre inserida na espécie

cultivada, e para a caracterização de novas cultivares. Em híbridos de P. gardneri vs. P.

4

gibertii a GISH permitiu a comprovação do caráter híbrido em todas as plantas F1

analisadas (SILVA et al., 2017 in press), bem como na caracterização cariotípica de

cultivares e híbridos de Citrus (MOREIRA, 2017). Além disso, a GISH pode ser

utilizada em estudos de recombinação entre híbridos retrocruzados (MELO et al., 2017).

Este estudo teve como objetivo a obtenção e caracterização de híbridos

interespecíficos de Passiflora, visando selecionar aqueles que apresentam características

de interesse ao mercado de plantas ornamentais. Como objetivos específicos: a) realizar

hibridações interespecíficas em espécies do gênero Passiflora para estudar a

compatibilidade entre elas e indicar os cruzamentos promissores para a produção de

híbridos ornamentais; b) realizar a descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1

obtidos do cruzamento entre Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii, bem como

confirmar a hibridação interespecífica com base em marcadores SSR e através da GISH;

c) caracterizar genitores e híbridos F1 de Passiflora, com base em descritores

morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida visando

selecionar híbridos para uso ornamental; d) estimar a divergência genética dos híbridos

F1 através de uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis

qualitativas e quantitativas pelo método Ward-MLM; e) utilizar técnicas de citogenética

clássica e molecular para caracterizar e cofirmar a fecundação cruzada de híbridos F1

resultantes do cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii;

5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 O gênero Passiflora L.

A família Passifloracea engloba 17 gêneros e aproximadamente 650 espécies

(BERNACCI et al., 2013a), das quais estão distribuídas nas regiões tropicais e

subtropicais no mundo. No entanto, o número de espécies tem aumentado com novas

descobertas, como P. cristalina Vanderpl. & Zappi (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011)

P. cacao Bernacci & M. M. Souza (BERNACCI; SOUZA, 2012) e P. pottiae Cervi &

Imig (CERVI; IMIG, 2013). Grande parte das espécies têm seu centro de origem na

América do Sul, e o Brasil é considerado um dos principais centros de diversidade, com

relatos de três gêneros Dilkea Mast., Mitostemma Mast. e Passiflora L. (BERNACCI et

al., 2013b).

No início de século XX, Killip (1938) subdividiu o gênero Passiflora em 22

subgêneros. Porém, mais recentemente foi proposta uma nova classificação, com a

subdivisão do gênero em quatro subgêneros, Astrophea, Deidamioides, Decaloba, e

Passiflora (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004), levando em consideração para o estudo

taxonômico, aspectos morfológicos. Posteriormente, a redução do número de

subgêneros proposto por Killip para os quatro subgêneros foi com base em estudos

filogenéticos e taxonômicos por meio de analise molecular e através de dados na

evolução do número cromossômico (HANSEN et al., 2006). Quanto ao ciclo de vida, as

espécies de Passiflora, são plantas semi-perenes ou perenes (PEREIRA et al., 2005),

trepadeiras, de hábito lenhoso ou herbáceo, podendo encontrar espécies arbóreas ou

arbustivas e com presença de gavinhas (NUNES; QUEIROZ, 2006).

O gênero contempla espécies com grande variabilidade morfológica. Suas folhas

são simples e alternas, elípticas ou orbiculares, inteiras ou lobadas, pecíolo com ou sem

glândulas. A margem foliar pode ser inteira, serreada, denteada ou pectinada, base

cordada, truncada, arredondada ou cuneada (MACDOUGAL; FEUILLET, 2004). As

flores normalmente são hermafroditas, de simetria radial com ampla variação na

coloração; flores brancas (Passiflora hatschbachii Cervi), flores vermelhas (Passiflora

coccinea Aubl.), flores roxas (Passiflora subrotunda Mast.). O cálice é composto por

cinco sépalas, sendo carnosas, ovais, lanceoladas, até amplamente oval-deltóides.

Normalmente, a corola é composta por cinco pétalas membranáceas, que se alternam

com as sépalas. A corona, conjunto de filamentos que envolve a base do ovário, é

6

característica mais marcante do gênero, fato que dar suporte para a taxonomia do grupo.

O androginóforo consiste em um longo tubo floral de órgãos sexuais femininos e

masculinos, soldados e elevados, que situam na parte superior, sempre em número de

cinco e unidos por sua base (CERVI, 1997; ULMER; MACDOUGAL, 2004). Possuem

ovário globoso, ovóide ou fusiforme, unilocular, 3-carpelar, muitos óvulos em

placentação parietal (NUNES; QUEIROZ, 2006). Os frutos geralmente são bagas,

indeiscentes ou cápsulas deiscentes, globosos ou ovoides, com ampla variação no

tamanho, forma e coloração, podendo encontrar frutos vermelhos, amarelos ou roxos

(NUNES; QUEIROZ, 2006; ULMER; MACDOUGAL, 2004; VANDERPLANK,

2000). As sementes são abundantes, comprimidas, com formato ovadas a abcordadas e

são cobertas por um arilo mucilaginoso (NUNES; QUEIROZ, 2006).

O gênero Passiflora é o mais representativo dentro da família Passifloracea, por

apresentar um grande número de espécies, mais de 525 já foram descritas (CERVI;

IMIG, 2013). No Brasil foram reportados aproximadamente 137 espécies, sendo um dos

principais centros de diversidade (BERNACCI et al., 2013b). No estado da Bahia, o

gênero Passiflora consta de 32 espécies, com grande distribuição nos biomas baianos,

sendo a Floresta Atlântica do Sul do Estado e a Chapada Diamantina consideradas os

principais centros de diversidade (NUNES; QUEIROZ, 2006; BERNACCI; SOUZA

2012). Foram encontradas três espécies consideradas endêmicas nos biomas do Estado,

P. saxicola Gontsch, encontrada nos municípios de Ilhéus e Mundo Novo, P. bahiensis

Klotzsch, nos municípios de Cruz das Almas e Itaju do Colônia e P. mucugeana T.S.

Nunes e L.P. de Queiroz, com ocorrência em uma pequena área próxima ao município

de Ibicoara e Mucugê (NUNES 2002).

O uso das espécies do gênero Passiflora é bastante diversificado, podendo ser

empregadas para fins medicinais (devido ao composto passiflorina, que é um ansiolítico

natural encontrado nas folhas e flores), produção de cosméticos (cremes, perfumes e

óleos) (PENHA, 2012), ornamentais e alimentares. Na alimentação humana o principal

uso dessas espécies é para o consumo in natura, na forma de sucos, sorvetes e doces. No

entanto, há um grande interesse para o mercado ornamental, em função da exuberância

de suas flores e folhas (ABREU et al., 2009).

7

2.2 Potencial ornamental de Passiflora L.

Embora a percepção de uma planta ornamental seja peculiar para cada indivíduo,

Mello Filho (1986), a definiu como sendo aquela que provoca estímulos a partir de

características como coloração, tamanho, textura, aspectos fenológicos, sombra

projetada. Dessa forma, as espécies de Passiflora são consideradas cada vez mais como

plantas ornamentais devido principalmente à exuberância de suas flores, as quais são

bastante diversificadas com relação à coloração, a presença da corona, estrutura peculiar

da família Passifloraceae, variedade na forma das folhagens (SOUZA e PEREIRA,

2003). Além disso, as flores possuem perfume marcante e florescimento abundante

(VANDERPLANK, 2000; ULMER; MACDOUGAL, 2004), com período longo de

florescimento para algumas espécies, como é o caso de P. subrotunda que permanece

com suas flores abertas por cerca de 12h (SOUZA 2014), P. bahiensis e P. eichleriana,

as quais possuem flores que permanecem abertas por mais de 24h, e P. cinnabarina e P.

herbertiana cujas flores ficam abertas por três dias consecutivos (ULMER;

MACDOUGAL, 2004).

O cultivo das espécies de Passiflora com objetivo de ornamentar ambientes é

antigo, sendo a Europa pioneira nessa atividade. Por volta de 1625 foram utilizadas as

espécies P. incarnata e P. caerulea (CERVI, 1997), ficando limitado por muito tempo

as essa espécies. Porém, esse fato mudou quando o pesquisador Thomas Milne produziu

o primeiro híbrido artificial, P. ‘Violacea’, oriundo do cruzamento entre P. racemosa x

P. caerulea (PEIXOTO, 2005). Após esse cruzamento, já foram produzido uma grande

quantidade de híbridos com finalidade ornamental (http://www.passiflorasociety.org). A

utilização dessas espécies como ornamental foi sendo consolidada na Europa e nos

Estados Unidos, com ampla comercialização na forma de sementes ou mudas

(RUSHING, 2003; ULMER; MACDOUGAL, 2004; VANDERPLANK, 2000).

Considerando a ampla variabilidade genética das passifloras e considerando que o

Brasil é o centro de diversidade do grupo, o cultivo dessas espécies com intuito

ornamental ainda é pouco explorada (SOUZA et al., 2003).

O fato das passifloras serem pouco utilizadas como ornamentais no Brasil está

relacionado a questão cultural (ABREU et al., 2009), uma vez que, as pessoas não têm o

hábito de cultiva-las exclusivamente para a ornamentação. Sendo assim, há a

necessidade de um trabalho de divulgação no país, para solucionar essa questão cultural

(PEIXOTO, 2005). São poucos os relatos referente ao uso de passifloras ornamentais no

http://www.passiflorasociety.org/

8

Brasil. No Sudeste do país, são utilizadas as espécies P. alata Curtis e P. edulis em

pérgulas ou cercas vivas. Na região Norte e Nordeste são utilizadas as espécies P.

coccinea e P. cincinnata Mast., respectivamente (PEIXOTO, 2005). Dentre as espécies

citadas, P. alata vem sendo destacada em revistas de paisagismo e decoração de

ambientes internos e externos (DURANTE, 2013; CARINI, 2014).

Determinadas espécies de Passiflora se aclimatam a ambientes diversificados

favorecendo o uso na ornamentação de interiores e exteriores. Passiflora morifolia e P..

sublanceolata podem ser utilizadas em vasos para a ornamentação em ambientes

sombreados (PIRES et al., 2011). Por outo lado, P. suberosa litoralis, P. subrotunda

Mast. e P. mucronata Lam. condizem com o uso em jardins sob pleno sol, como

componente de cercas vivas ou pérgulas (PIRES et al., 2011; SOUZA, 2014; MELETTI

et al., 2011). No caso de P. racemosa Brot. e P. kermesina Link e Otto. podem ser

cultivadas em locais com meia sombra (PEIXOTO, 2005).

2.3 Hibridação artificial em Passiflora L.

O processo de hibridação é o resultado da combinação de dois ou mais genomas

de espécies distintas em um mesmo indivíduo (SCHUCK, 2012). Ocorre em indivíduos

que se reproduzem de forma sexuada através da polinização cruzada, produzindo uma

progênie resultante da segregação e recombinação (ALLARD, 1971). Sendo assim, o

cruzamento entre dois genitores originará uma população com variabilidade genética

(SCHUCK, 2012).

O fato das passifloras apresentarem flores grandes, florescimento abundante,

receptividade do estigma e viabilidade do grão de pólen no mesmo período, são

características que fazem com que estas espécies sejam utilizadas em cruzamentos

controlados, sendo que a hibridação pode ser considerada como um processo simples

em programas de melhoramento genético (BRUCKNER; OTONI, 1999).

A compatibilidade genética entre as espécies envolvidas nas hibridações

interespecíficas é um dos principais fatores que deve ser observado para que se obtenha

êxito neste processo, ou seja, as espécies envolvidas devem apresentar homologia

cromossômica para assegurar que os híbridos obtidos sejam viáveis (PEREIRA et al.,

2005). Outro importante fator, tem sido observado com estudos envolvendo viabilidade

do pólen, receptividade do estigma, compatibilidade genética, através de hibridações

9

controladas, têm levado a produção de híbridos promissores para serem utilizados em

programas de melhoramento de plantas (FALEIRO et al., 2008).

Geralmente as hibridações interespecíficas em Passiflora têm como finalidade a

produção de híbridos resistentes a doenças ou que apresentem alta produtividade.

(JUNQUEIRA et al., 2005). Porém, a obtenção de híbridos ornamentais está sendo

realizada no sentido de gerar genótipos que sejam atrativos para uso em paisagismo e

que atendam a diferentes interesses. O primeiro híbrido ornamental de Passiflora

chamado BRS Estrela do Serrado foi lançado no Brasil e envolveu as espécies P.

coccinea vs. P. setacea (FALEIRO et al., 2007). A partir de então já foram obtidos e

registrados híbridos ornamentais (BELO et al., 2018; MELO et al., 2016; SANTOS et

al., 2012). A fim de selecionar genótipos com caracteres de interesse ornamental,

cruzamentos entre sete espécies de Passiflora foram realizados para obtenção de

híbridos interespecíficos F1, os quais foram retrocruzados para verificar a

compatibilidade reprodutiva entre os genitores (CONCEIÇÃO et al., 2011a).

Híbridos interespecíficos de Passiflora são utilizados como ornamentais não

somente devido a beleza das flores produzidas, mas também em viturde da forma de

suas folhas (ABREU et al., 2009), como observado nos híbridos P. ‘Sarah Aimee’

Vanderplank (P. urbaniana Killip vs. P. foetida var. hirsutissima) e P. ‘Pink Jewel 1’

Vanderplank (P. palmeri Rose var. sublanceolta Killip vs. P. foetida var. hirsutissima

Killip), os quais apresentam folhas que chamam atenção para o paisagismo

(VANDERPLANK, 2002).

A existência de híbridos naturais em Passiflora também deve ser considerado,

uma vez que já foi contastada a origem de algumas espécies do gênero por meio da

hibridação como rota de especiação. A origem de P. edulis f. fiavicarpa não é

totalmente esclarecida, pois supõe-se que ela foi originada do cruzamento natural ou por

mutação entre entre P. edulis e P. ligularis Juss (POPE, 1935; VANDERPLANK,

2000).

2.4. Confirmação de cruzamentos em Passiflora L.: marcadores moleculares e

análises citogenéticas

A confirmação dos cruzamentos envolvendo espécies de Passiflora pode ser

baseado em métodos para a obtenção de marcadores moleculares, bem como através de

técnicas de citogenética de identificação cromossomica. Os marcadores moleculares

10

podem ser divididos em duas categorias: codominantes, os quais distinguem

heterozigotos, como o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e o SSR

(Simple Sequence Repeats); e os dominantes, os quais não distinguem heterozigotos,

como o ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) e o RAPD (Random Amplified

Polimorphic DNA) (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; ZÁRATE et al., 2005).

Os marcadores microssatélites ou SSR (Single Sequence Repeats) são sequências

repetidas em tandem compostas de um a seis nucleotídeos (LITT; LUTY, 1989), cujas

sequencias flaqueantes são conservadas em muitas espécies. Utiliza-se destas

sequências para o desenvolvimento de primers e amplificação dos loci microssatélites,

visto que a verificação do polimorfismo ocorre pelo número de repetições monoméricas

no fragmento SSR (OLIVEIRA, 2006). Uma vez que as regiões flanqueadoras são

conservadas, os primers desenhados para uma determinada espécie podem ser utilizados

em espécies relacionadas, o qual é denominado de amplificação cruzada ou

transferibilidade de primers (VARSHNEY, 2005; BRAVO, 2006). A análise dos loci

SSR permite a confirmação de cruzamentos pela simples observação da segregação

mendeliana de herança na família.

O fato deste marcadores terem natureza codominante, faz com que sejam

empregados para diversos estudos. Porém, deve ser produzidos primers específicos para

loco SSR, com base em sequências previamente conhecidas (MELO 2014). Desta

forma, estudos envolvendo espécies de Passiflora ainda são escassos, devido a carência

destes marcadores específicos para estas espécies. Esses primers foi desenvolvidos

apenas para P. alata, P. edulis, P. contracta, P. cincinnata e P. setacea (CAZÉ et al.,

2012; CERQUEIRA-SILVA, 2012; CERQUEIRA-SILVA et al., 2014; OLIVEIRA,

2005; PÁDUA et al., 2005).

A utilização de marcadores microssatélites têm sido empregados de maneira

eficiente em estudos de confirmação de hibridações interespecíficas (BELO et al., 2018;

JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2012). O primeiro relato

utilizando marcadores moleculares ocorreu para confirmação de 15hibridacões

interespecíficas de Passiflora (JUNQUEIRA et al., 2008). A obtenção dos híbridos P.

‘aninha’, P. ‘alva’ e P. ‘priscilla’, com finalidade ornamental, a partir do cruzamento

entre P. sublanceolata (ex P. palmeri var. sublanceolata) e P. foetida foram

confirmados com marcadores moleculares SSR e RAPD (SANTOS et al., 2012). A

partir do cruzamento P. gardneri vs. P. gibertti, também foi confirmado a paternidade

11

dos híbridos P. ‘Bella’ e P. ‘Gabriela’ com os marcadores citados anteriormente, sendo

que um par de primers conseguiu obter resultados eficientes (BELO et al., 2018).

Análises citogenéticas têm contribuído para diversas finalidades no estudo

biológico do gênero, como os estudos evolutivos e taxonômicos, bem como na

confirmação do sucesso de hibridações interespecíficas. (MELO et al., 2017, SILVA et

al., 2017 in press). A análise do cariotípico é importante no sentido que cada

cromossomo tem uma função no desenvolvimento de uma espécie (COELHO, 2015), o

número de cromossomos e cada variante que cada um demosntra contribui nestes

estudos (GUERRA, 1988).

As técnicas citogenéticas classicas têm grande importância para o entendimento

das diferenças entre os táxons e suas relações filogenéticas, porém, no estudo de

confirmação de cruzamentos, análises com base em coloração convencional, utilizando

Giemsa, não fornece respostas tão eficientes quanto análises moleculares, uma vez que,

por meio da coloração convencional é possível apenas a realização da contagem do

número cromossômico. Porém, a utilização de fluoroscromos base-específicos pode ser

utilizado no processo de confirmação, pois possibilita uma análise mais detalhada com

fluorocromos CMA3 (cromomicina A3) e DAPI (4‟-6‟diamidino-2-10-fenilindol) que

evidenciam regiões heterocromáticas ricas em bases GC e AT, respectivamente. As

regiões onde são observadas os satélites servem como marcadores cromossômicos na

confirmação dos cruzamentos nos híbridos interespecíficos (MELO et al., 2001). Em

híbridos de P. edulis vs. P. cincinnata foi possível a visualização de blocos CMA3, os

quais colocalizam com os sítios de DNAr 45S (COELHO et al., 2016).

Com o estabelecimento das técnicas de hibridação molecular in situ, pode

identificar sítios espécificos de DNA, como sequências centroméricas, teloméricas

genes ribossomais, sendo que a localização de sequências ribossomais são excelentes

marcadores para a confirmação de paternidade em híbridos, uma vez que estas

sequencias já foram utilizados para esta finalidade (HASTEROK et al., 2005). A FISH

basea-se na desnaturação e renaturação dos ácidos nucleicos, os quais são encarregados

pela construção de moléculas hibridas (MELO, 2014). Além disso, esta técnica utiliza

sondas para que ocorra a hibridação com o DNA alvo e possa haver a detecção por meio

de anticorpos conjugados com fluorocromoso, uma vez que estas têm compatibilidade

por moléculas pertencentes as sondas (SCHWARZACHER; HASLOP-HARRISON,

2002). A FISH, através de sondas 45S e 5S na confirmação de híbridos foi reportada

para o híbrido somático de P. edulis f. flavicarpa x P. amethistina (CUCO et al.,2005),

12

para os híbridos sexuais P. edulis Sims vs. P. cincinnata Mast. (COELHO et al., 2016),

P. gardneri MAST. vs. P. gibertii N.E. BROW (SILVA et al., 2017 in press) e em

híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2017).

A GISH é uma técnica proveniente de uma modificação da FISH, sendo bastante

eficiente na confirmação de paternidade em híbridos interespecíficos, permitindo a

distinção dos genomas dos genitores nos híbridos (SILVA; SOUZA 2013). No

procedimento da GISH é utilizado o DNA genômico total do genitor paterno como

sonda e o DNA total do genitor materno não marcado, em maior concentração, que atua

como DNA de bloqueio, porém, a concentração do DNA de bloqueio deve ser ajustada

para cada espécie, com base no grau de proximidade genética dos genitores envolvidos

nos cruzamentos (SILVA; SOUZA, 2013). Na identificação dos híbridos

interespecíficos obtidos do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, foi utilizado o

DNA genômico paterno como sonda e o DNA genômico materno com DNA de

bloqueio, sendo que o DNA de bloqueio foi 100x mais concentrado que a sonda

(SILVA et al., 2017 in press). Em híbridos de P. edulis vs. P. cincinnata foi possível à

confirmação através da GISH (COELHO et al., 2016).

Na GISH também pode-se utilizar o DNA genômico total dos genitores como

sonda simultaneamente no mix de hibridação. O uso simultâneo de sondas de ambos os

genitores de híbridos F1 e retrocruzados de Passiflora permitiu a visualização de ambos

os genomas entre os híbridos analisados (MELO et al., 2015a). Em orquídeas, no

cruzamento entre Paphiopedilum delenatii vs. Paphiopedilum micranthum foi possível

através do uso da sonda concomitante dos genitores a visualização de cada lote

cromossômico dos genomas dos genitores nos híbridos (LEE et al., 2011).

2.5 Parâmetros genéticos

A estimativa de parâmetros genéticos permite decidir qual o melhor método a ser

empregado no melhoramento e seleção, pois permite a escolha dos carcateres nas

primeiras etapas e em situações mais avançadas em programas de melhoramente e, além

disso, possibilita inferir o valor conferido a cada caráter, sendo importantes para as

estratégias de melhoramento (ROSSMANN, 2001).

Em plantas perenes a estimativa dos parâmetros genéticos requer mais atenção,

pois estas plantas por apresentarem ciclo longo, os melhoristas devem tomar as decisões

mais certas possíveis. Aliado a isto, é importante o cuidado com os experimentos em

13

campo para que estes sejam delineados de forma correta para a obtenção de estimativas

confiáveis (BISON, 2004).

O coeficiente de variação experimental (CVe) é indicado para inferir sobre a

precisão do experimento. Sendo assim, caracteres que apresentam coeficiente de

variação experimental baixo confirma que os dados obtidos foram precisos. Porém,

características como área foliar, que é condicionado por muitos genes, sendo mais

influenciados pelo ambiente, apresentam coeficiente de variação experimental alto

(SANTOS et al., 2011).

O coeficiente de variação genotípica (CVg) possibilita estimar a variabilidade

genética, que expressa a magnitude da variação genética em função da média do caráter

(RESENDE, 1991). O coeficiente de variação genotípica é considerado alto quando é

superior a 7% (SEBBENN et al., 1998). O coeficiente de variação genotípica em

espécies nativas avalia a variabilidade genética e pode inferir sobre a forma de

cruzamentos entres as espécies, sendo importantes para estudos da variação genética

entre populações naturais para o conhecimento da estrutura das populações

(KAGEYAMA, 1990; RESENDE, 1999).

A partir dos valores do coeficiente experimental (CVe) e do coeficiente de

variação genotípica (CVg), pode-se estimar o índice de variação (IV), que é obtido

através da relação entre CVg/CVe. O índice de variação possibilita a indicação e seleção

de métodos de melhoramento mais apropriados para determinado caracter (SANTOS et

al., 2012). Neste sentido, o índice de variação quanto mais próximo da unidade (1,00)

maior a probabilidade de ganho com a seleção (VENCOVSKY, 1987).

A herdabilidade, que é representada pelo símbolo h2, possibilita a identificação

das diferenças não genéticas e genéticas entre indivíduos, sendo importante para a

predição de ganhos genéticos e na determinação dos métodos de seleção a serem

empregados (REIS, 2000). A variação fenotípica que pode ser herdada, quantifica o

valor fenotípico com base no valor genético, sendo este o valor que influenciará a

próxima geração (ROSSMANN, 2001). Desta forma, a herdabilidade tem grande

importância, pois é através dela que tem-se o conhecimento de quanto da variação

fenotípica é atribuída à variação genotípica (FALCONER; MACKAY, 1996).

A herdabilidade pode variar de zero a um, sendo que quando as diferenças

fenotípicas entre os indivíduos são causadas apenas por diferenças genéticas entre os

mesmos a herdabilidade é igual a um. Porém, quando a herdabilidade é igual a zero, a

14

variabilidade do caráter não tem origem genética. Sendo assim, não há correlação entre

valor genético e valor fenotípico da unidade de seleção (ALLARD, 1971).

Os programas de melhoramento genético visam que os caracteres desejados sejam

herdáveis (BORÉM; MIRANDA, 2009). Neste caso, os caracteres qualitativos

fundamentam-se nas variações fenotípicas, avaliadas nas descendências de cruzamentos.

Enquanto que, os caracteres quantitativos são mais complexos de serem herdados, uma

vez que são governados por muitos genes com efeitos específicos e são mais

influenciados pelo fator ambiental (ARAGÃO et al., 2002; CRUZ; REGAZZI, 2004).

Em híbridos ornamentais de Passiflora os caracteres florais tiveram herdabilidade

maior que os caracteres vegetativos, podendo realizar a seleção com base nos caracteres

florais de forma eficiente (BELO, 2010, MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2011).

Altos coeficientes de variação genética e herdabilidade foram encontrados para todos os

caracteres estudados em Eucalyptus cloeziana, indicando grande controle genético na

herança destes caracteres com possíveis ganhos através do método seleção (BERTI,

2010).

2.6 Análise de divergência genética através do método Ward-MLM

Baseado em características morfoagronômicas, bioquímicas, fisiológicas e

polimorfismos de DNA, pode-se saber a distância genética entre indivíduos e estimar a

divergência genética (AMARAL JÚNIOR, et al., 2010). Estudos de divergência

genética possibilita a detecção de genitores favoráveis que possam ser utilizados em

cruzamentos para a produção de híbridos heteróticos (CRUZ, 2006). Neste sentido, a

análise multivariada é um ferramenta que possibilita a caracterização de genótipos por

meio de descritores morfológicos qualitativos e quantitativos a fim de diferenciá-los

(FERRÃO et al., 2011). Para isso, existem diversos métodos multivariados para o

estudo da diversidade genética, porém, devem ser utilizados de acordo com o objetivo

de estudo. Dentre estes métodos, têm-se o Ward-MLM (Ward-Modified Location

Model), proposto por Franco et al. (1998).

O método estatístico Ward-MLM é capaz de analisar simultaneamente caracteres

qualitativos e quantitativos, sendo utilizadas todas as informações disponíveis dos

genótipos para a sua caracterização (PAIVA et al., 2014). Para este tipo de análise foi

proposto o Location Model (LM), o qual agrupa n indivíduos, quando p variáveis

contínuas e q variáveis discretas são mensuradas em um ambiente (ORTIZ et al., 2008).

15

Desta forma há uma combinação dos níveis de todos q variáveis discretas em apenas

uma variável multinominal W, com níveis m (w= 1, 2,..., m) (CAMPOS, 2012). Além

disso, para determinar o número de grupos é utilizada a logarítmica da probabilidade

(Log-Likelihood), fundamentado em pseudo-F e pseudo-t², associando a descrição de

verossimilhança com a avaliação da razão da verossimilhança (SAS INSTITUTE,

2000).

O método Ward-MLM é composto por duas etapas. A primeira etapa consiste do

agrupamento Ward (WARD JUNIOR, 1963), através da matriz de dissimilaridade de

Gower (GOWER, 1971). A segunda etapa refere-se a utilização do procedimento MLM

a partir da média das variáveis quantitativas em cada população (AMARAL JÚNIOR, et

al., 2010). Além disso, esta técnica possibilita indicar o número ótimo de grupos com

base no cálculo da subdivisão precisa, sendo realizada a identificação da probabilidade

de cada acesso se alocar em grupos específicos (GONÇALVES et al., 2009).

A aplicação do procedimento Ward-MLM tem sido realizada no melhoramento de

diversas culturas para o estudo da divergência genética, como em tomateiro

(GONÇALVES et al., 2009), feijoeiro (CABRAL et al., 2010), bananeira (PEREIRA et

al., 2012), goiabeira (CAMPOS et al., 2013), mamoeiro (LUZ et al., 2014). Através do

método Ward-MLM foi possível identificar diversidade genética entre acessos de uma

mesma espécie de Capsicum, os quais apresentam potencial para serem utilizados

programas de melhoramento genético (BIANCHI, 2017). Este método tem sido

aplicado também para a seleção de plantas de Passiflora resistentes a virose visando

recuperar a qualidade do fruto após ter sido reduzida com o processo de hibridação

(SANTOS, 2013). Sendo utilizados também para avaliar a variação genética em

híbridos retrocruzados de Passiflora com valor ornamental (MELO et al., 2015b)

16

CAPÍTULO 1 Manuscrito nas normas da revista Brazilian Journal of Botany para publicação

Viviane de Oliveira Souza1*, Margarete Magalhães Souza1, Gonçalo Santos Silva1

Hybridization potential between Passiflora species for ornamental use

1 Department for Biological Sciences (DBS), State University of Santa Cruz, CEP 45662900 Ilhéus,

state of Bahia, Brazil.

*Corresponding author: e-mail: [email protected] (V.O. Souza); Phone/Fax.: +557336805055.

ORCID iD: 0000-0002-8801-0101; 0000-0003-0292-7988.

Abstract

Interspecific hybridization is a plant breeding method use for searching improvements of

specific trait of interest. The objective of this work was to carry out interspecific hybridizations in

species of the genus Passiflora for studying the hybridization potential between them, also to

identity the promising crosses to produce ornamental hybrids. 530 interspecific crosses were created

between the Passiflora species, of which 528 using the species P. subrotunda as donor and receptor

of pollen, and two crosses of P. coccinea vs. P. hatschbachii. Between the 528 crosses involving P.

subrotunda, 128 resulted in the fertilization of the flower. Four crosses produced fruits when using

P. subrotunda as receptor of pollen, this enabled the use of molecular markers for the confirmation

the cross-fertilization. Three crosses produced fruit when using P. subrotunda as a pollen donor.

However, the plants from these crosses did not reach the adult stage, not making it possible to

confirm the hybridization. Out of the two crosses involving P. coccinea vs. P. hatschbachii, only

one produced fruit. From the seeds of that fruit were obtain 117 hybrid plants. Microsatellites and

Genomic In Situ Hybridization (GISH) were used for hybridization confirmation. Crossbreeding

involving P. coccinea vs. P. hatschbachii showed potential to be used in ornamental Passiflora

breeding programs.

Keywords: Ornamental hybrids, interspecific crossing, microsatellite marker, GISH.

http://orcid.org/0000-0002-8801-0101

17

1 Introduction

Passiflora L. genus belongs to the Passifloraceae A.L. de Jussieu ex Kunth family, and is

considered of great importance due to the large number of species, around 525 (Cervi and Imig

2013) and to their intra- and interspecific variability (Bellon et al. 2009). These species present

lovely and well-diversified flowers in terms of shapes, sizes and colors, which potentiates their

ornamental use (Abreu et al. 2009). About 137 species have been recorded in Brazil (Bernacci et al.

2013).

Objective of this work was to obtain flowers with exotic color and shape, which allows

greater acceptance for use in ornamental plants (Santos et al. 2011). Interspecific hybridization is

important because it is a technique that allows the production of genetically superior materials, due

to the recombination of the existing variability (Santos 2008). The first hybrid of Passiflora, called

P. 'Violacea', was produced in England by Thomas Milne in 1819 from the cross between P.

caerulea L. and P. racemosa Brot. (Vanderplank 2000). Since then, several hybrids have already

been obtained and registered at the International Passiflora Society

(http://www.passiflorasociety.org).

In Brazil, the creation of hybrids for ornamental purposes is expanding, leading to the creation

of several hybrids for this purpose (Abreu 2008; Conceição et al. 2011a; Santos et al. 2012; Belo et

al. 2018), among which P. ‘Alva’ #120 (2008), P. ‘Aninha’ #121 (2008), P. ‘Priscilla’ #122 (2008)

(Santos et al. 2012), P. ‘Gabriela’ #170 (2010) and P. ‘Bella’ #171 (2010) (Belo et al. 2018). In

other countries, some hybrids are used in greenhouses and gardens, such as P. 'Lady Margareth' and

P. 'Sunburst', respectively from the crosses between P. coccinea Aubl. vs. P. incarnata L. and P.

gibertiana MacDougal vs. P. jorullensis Kunth (Ulmer and Macdougal 2004).

Obtaining progenies from the cross between two pure species usually presents an intermediate

phenotype sharing the characteristics of the parents (Ulmer and Macdougal 2004). For

accomplishing this, knowing how the genitors are genetically related may be the key for a

http://www.passiflorasociety.org/

18

successful interspecific hybridization. If the species present chromosomal homology, this will

increase the chances for success in interspecific hybridization to obtain a viable hybrid (Pereira et

al. 2005).

Confirmation of interspecific hybridization is an important practice in plant breeding

programs. Several techniques can be used for this purpose, such as the use of molecular markers,

molecular cytogenetic techniques such as Genomic In Situ Hybridization (GISH). The

methodologies including molecular cytogenetics may be useful for the confirmation of interspecific

hybridizations. The use of GISH has already been reported for certain species (Silva and Souza

2013), including those of the genus Passiflora (Melo et al. 2017; Silva et al. 2017 in press). GISH is

based on the use of the genomic DNA of the parents, using the DNA of the female genitor and the

total genomic DNA of the male genitor as probe. This makes possible to distinguish the genome

from the donor species in the hybrid (Silva and Souza 2013).

Molecular markers are used to verify polymorphism and can be applied at any stage of plant

development (Faleiro 2005). SSR (Simple Sequence Repeats) markers are DNA regions composed

of repeated single sequences of one to six base pairs in tandem (Souza 2015). This type of marker

has codominant inheritance, being able to make the identification between homozygotes and

heterozygotes. These markers have been used in some genus such as Carica L. (Magdalita et al.

1997), Theobroma L. (Faleiro et al. 2003) as well as in Passiflora (Junqueira et al. 2008; Conceição

et al. 2011b; Santos et al. 2012). However, in Passiflora, there are still few studies with

microsatellite markers, having been reported for P. alata Curtis (Pádua et al. 2005), P. edulis Sims.

f. flavicarpa O. Deg. (Oliveira et al. 2005), P. setacea D.C. and P. cincinnata (Cerqueira-Silva et al.

2014), P. cacao Bernacci & M. M. Souza, P. gibertii N. E. Brown, P. glandulosa Cav., and P.

mucronata Lam. (Silva et al. 2014). The cross-fertilization in Passiflora is confirmed by using SSR

markers, as well as Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) and Inter-Simple

19

Sequence Repeat (ISSR) (Junqueira et al. 2008; Conceição et al. 2011a; Melo et al. 2016; Santos et

al. 2012; Belo et al. 2018).

Considering the need for prior knowledge of the combinations of species of the genus

Passiflora for hybridizations to verify which can be used in future breeding programs, this work had

as objective to carry out interspecific hybridizations in Passiflora to study the potential of

hybridization between them and indicate the promising crosses for the production of ornamental

hybrids.

2 Material and Methods

2.1 Plant material and interspecific hybridizations

The interspecific hybridizations were carried out between May 2014 and June 2015 between

Passiflora species (Table 1; Fig. 1). maintained at the Germplasm Active Bank of the State

University of Santa Cruz, Ilhéus, state of Bahia, Brazil (longitude 39°10'W, latitude 14°39'S,

altitude 78m). The species were kept under protected cultivation conditions, in the espalier system,

in a semi-arch type greenhouse with a 100μm thick plastic covering, activated against UV rays.

Hybridizations were performed according to the flowering period of each species. The species

P. subrotunda participated as a donor and recipient of pollen grains in most interspecific crosses,

due to the presence of a small flower of intense coloration, which can be used in pots and compose

internal or external decorative environments, and present a long period of flower opening and

flowering all year round (Souza 2014), being these characteristics appreciated in the improvement

of ornamental passifloras. No crosses between P. subrotunda and the species P. hatschbachii and P.

coccinea have been observed, as there was no synchronization during flowering. The number of

pollinations for each crossing ranged from 1 to 130, and was performed according to the availability

of flowers in each species.

20

The flower buds were protected with paper bags one day before the anthesis, to prevent

contaminations of any kind. Before the opening of the flower, the anthers were removed and

manual pollinations were carried out by transferring the pollen into the stigma with the aid of a

forceps. Next, the buttons were again protected with paper bags, and checked after five days for

whether there was fertilization or abortion of the floral bud. The fruit resulting from the

hybridizations were protected with nylon screen until maturation. The number of days for fruit

maturation, number of fruits and number of seeds were all evaluated. The seeds were collected from

the fruits, washed and dried at room temperature and stored at 10ºC for later evaluation of the

germination capacity.

2.2 Seeds germination

Seeds coming from the crosses between P. subrotunda vs. P. racemosa, in both crossing

directions; P. vitifolia vs. P. subrotunda; P. malacophylla vs. P. subrotunda; P. subrotunda vs. P.

mucronata; P. subrotunda vs. P. elegans; P. coccinea vs. P. hatschbachii. The seed arils were

removed and sowing was carried out in plastic trays containing the soil substrate, kept in a

greenhouse. The number of seeds placed to germinate corresponded to the quantity of seeds

originating from the fruit obtained for each crossing. Seedling emergence was monitored and the

number of germinated seeds was verified, including the number of days until appearance of

cotyledons and true leaves. After emergence of the true leaves, the seedlings were transferred to

black polyethylene bags, with a capacity of 0.5L.

Due to the lack of synchrony in the flowering, and consequently too the period of the crosses

between the species, it was necessary to place the collected seeds soon to germinate, and it was not

possible to carry out an experimental design. Therefore, for statistical analysis, the chi square test χ2

(P <0.05) was adopted according to Conceição et al. (2011a).

21

2.3 Transferability of SSR primers and crosses confirmation with SSR

Confirmation of the hybridizations was performed using the molecular marker SSR. The

genomic DNA of the parents and of the assumed F1 hybrid plants was extracted from the leaf tissue

by the Doyle and Doyle method (1990) with modifications (Melo et al. 2015). Young leaves were

collected, macerated in liquid nitrogen and then placed in extraction buffer CTAB 2% (NaCl a 1.4

M; EDTA a 20 mM; Tris-HCl a 100 mM; PVP 2%; B-Mercaptoetanol 0.2%). Isolation of nucleic

acids was performed with chloroform: isoamyl alcohol solution (24:1) and resuspended DNA was

done with TE buffer (1mM EDTA; 10mM Tris). Quantification of genomic DNA was estimated by

comparison with 100ng/μL lambda DNA in 1% agarose gel stained with SYBR safe (Invitrogen®).

In order to obtain SSR markers, it was necessary to first carry out the transferability of SSR

primers into the material, due to the lack of SSR primers designed for the Passiflora species under

study. In order to verify the presence of polymorphic SSR loci between parents and subsequent

confirmation of the hybrids, 11 primers developed for P. edulis (Oliveira et al. 2005, 2008) and

three primers developed for P. alata (Table 2) (Pádua et al. 2005). For a final volume of 20μL, SSR

reactions were performed including 10x buffer; 2.5mM MgCl2; 2.5mM dNTP; 10pmol Primer; Taq-

polymerase at 5U µL-1 and 20ng genomic DNA at the following amplification conditions: initial

denaturation at 95°C for 5 minutes, 35 denaturation cycles at 95°C for 40 seconds, annealing at

56°C for 40 seconds, extension at 72ºC for 50 seconds and with a final extension at 72ºC for 7

minutes. The transferability of SSR primers and the existence of polymorphism were verified by

2% agarose gel electrophoresis stained with SYBR Safe and photo documented in Locus L-PIX

system (Locus biotechnology). The confirmation of the interspecific crosses is due to the presence

of different alleles in the genitor species, which segregate in the supposedly hybrid plants. Software

GelAnalyzer-version 2010a (Lazer software 2010) was employed to calculate the size of the

informative bands.

22

2.4 Slides preparation for GISH

GISH was carried out in plants from the crosses between P. coccinea vs. P. hatschbachii and

P. subrotunda vs. P. racemosa for the confirmation of interspecific hybridization. The radicles were

collected from cuttings obtained from matrix plants, pretreated with 8-hydroxyquinoline (8-HQ) at

0.002M for 1 hour at room temperature (RT) and 21 hours at ± 8 -10ºC. After washing twice in

distilled water and fixed in Carnoy (ethanol: glacial acetic acid [3:1], v/v; Johansen, 1940) for 3

hours at RT, the rootlets were maintained at -20°C until use. In order to prepare the slides, the root

apices were washed twice in distilled water and incubated with 20μl of the enzymatic solution 2%

cellulase and 20% (w/v) pectinase for 1 hour and 20 minutes at 37°C. Next, the radicles washed and

the meristematic ends were macerated in 6μl of 45% acetic acid, with a coverall laid over the plant

material. With the aid of needles and under a stereoscopic microscope, the roots were macerated

and covered with a cover slip. They were tapped with the tip of the forceps for disruption of the

cells. The coverslips were then pressed lightly between filter paper to spread the chromosomes,

frozen in liquid nitrogen for at least 5 minutes for later removal of the coverslip, and air dried. The

slides were selected under light microscopy with phase contrast and stored at -20°C until the

application of the GISH technique.

2.5 DNA extraction and probe preparation

For the GISH procedures, the genomic DNA of the parents was extracted using the protocol

proposed by Doyle and Doyle (1990), with modifications (Melo et al. 2015). At the intersection

between P. subrotuda vs. P. racemosa, the total genomic DNA of the paternal parent (P. racemosa)

was used as a probe and the total genomic DNA of the maternal parent (P. subrotunda) was used as

100x concentrated blocking DNA. At the intersection between P. coccinea vs. P. hatschbachii was

used the total genomic DNA for the preparation of the probes, with no blocking DNA being used.

In order to break the probe and the blocking DNA, about 20μg of genomic DNA in a final volume

23

of 200μL was cleaved using sonicator (Qsonica, Q125) with programming for amplitude 40%, 2

seconds on and 2 seconds off, with the total time scale of 5 minutes (Jauhar and Peterson 2006).

Verification of the size of the cleaved fragments was performed by 2% agarose gel electrophoresis

(Pronadisa) using the 100bp ladder marker (NEB) as a parameter. After cleavage of the genomic

DNA, purification of the DNA cleaved by precipitation was performed with 2% final volume of 3M

sodium acetate plus 200% of the final ethanol volume. The mixture was stored at -20°C overnight

and after this period, centrifuged for 10 minutes at 14,000rpm at 20°C for the elimination of the

supernatant and subsequent drying in RT for at least 1 hour. The pellet was resuspended with

ultrapure water. Probe labeling for the maternal genitor (P. subrotunda) and the paternal genitor (P.

hatschbachii) was performed by Nick translation with Biotin-16-dUTP (Roche Diagnostics®) and

the maternal parent (P. coccinea) a labeling of the probe was with Digoxigenin-11-dUTP (Roche

Diagnostics®), in the final concentration of 1μg of cleaved DNA, following the protocol proposed

by the manufacturer.

2.6 Genomic In Situ Hybridization (GISH)

The treatment of the slides followed the protocol for hybridization in situ fluorescence

proposed by Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000) and Souza et al. (2010), with modifications

made by Melo et al (2015). Slides containing the mitotic metaphases were oven-dried at 37°C for

the minimum time of 1 hour. After application of 50μl of 1μg/ml RNase (Sigma) in 2xSSC buffer

(0.3M sodium chloride, Sigma, 0.03M sodium citrate, Sigma), the slides were incubated for 1 hour

at 37°C and then immersed in 2x SSC at RT twice for 5 minutes each time; the solution containing

50μl of 10mM HCl was added over the metaphases for 5 minutes, and after removal of the HCl,

50μl of pepsin (Sigma) [10mg/ml pepsin; 10mM HCl (1:100 v/v)] and the slides were incubated in

the wet chamber for 20 minutes at 37°C. The washing steps mentioned below were performed on a

shaker platform at 120rpm (Biomixer, Mos-1). The slides were washed in 2xSSC at RT twice for 5

24

minutes each time, immersed in 4% formaldehyde at RT for 10 minutes, and again washed in

2xSSC twice for 5 minutes each time. The cytological preparations were dehydrated in 70% ethanol

and 96% ethanol for 5 minutes.

After drying the slides at RT for 30 min, the hybridization mixture was added to the final

volume of 15 μl, being 50% formamide (Sigma), 10% dextran sulfate (Sigma), 2xSSC, 0.13% SDS

(Sodium dodecyl sulfate) (Bioagency). For the identification of the hybrids, 33ng of probe and

3.3μg of the blocking DNA in the hybridization mix, 100x more concentrated than the probe, were

used for the crossing between P. subrotunda vs. P. racemosa. For the identification of the hybrids

from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii, 33ng of each probe was used in the

hybridization mix. The hybridization mixture was heated at 75°C for 10 minutes in thermal cycler

(Eppendorf, Mastercycler) and transferred to ice for at least 5 minutes. Slides containing the

hybridization mixture were denatured in a thermocycler containing a slide adapter (Techne, TC-

412) at 75°C for 10 minutes, and incubated overnight at 37°C in a humid chamber. After

hybridization, the slides were immersed in 2xSSC at RT for 5 minutes for removal of the coverslips.

Post-hybridization baths were performed in a Dubnoff bath (Quimis, 9226ML) at 42°C, consisting

of two immersions in 2xSSC for 5 minutes each time, two in 0.1xSSC for 5 minutes each time, and

two immersions in 2xSSC for 5 minutes each. The slides were immersed in 4xSSC/0.2% Tween 20

(Sigma) at RT for 5 minutes and treated with 50μl of 5% BSA (Bovine Serum Albumin ) (Sigma).

The biotin-labeled probe was detected with 0.7 μl avidin-FITC (Vector) plus 19.3 μl 5% BSA per

slide and the digoxigenin-labeled probe was detected with 0.7 μl anti-digoxigenin-rhodamine. The

slides containing the antibody for detection were incubated in the humid chamber for 1 hour at

37°C. Three baths were performed for 5 minutes each time for removal of the excess antibody with

4xSSC/0.2% Tween 20 at RT. The slides were rapidly immersed in 2xSSC and then mounted and

counter-coated with DAPI/Vectashield® (H-1200), stored at ± 8 - 10°C until analysis.

25

The metaphases were photo documented using the Olympus BX41 epifluorescence

microscope equipped with a 5M Olympus DP25 digital camera by the DP2-BSW software.

Hybridizations detected with avidin-FITC were visualized using the U-MWB filter (excitation 450-

480nm/dichroic cutoff 500nm/emission> 515nm) and the hybridizations detected with anti-

digoxigenin-rhodamine were visualized with the U-MWG filter excitation 510-550 nm/dichroic

cutoff 570nm/emission> 590nm). The FITC/rhodamine overlays and the boards were made using

the SC5 photoshop software.

3 Results

3.1 Interspecific crosses

There were 530 interspecific crosses between Passiflora species, of which 99.62% used the P.

subrotunda species as donor or receptor of pollen. On the other hand, 0.38% corresponded to the

two crosses involving P. coccinea vs. P. hatschbachii. Among the 528 crosses involving P.

subrotunda, 128 resulted in flower fertilization (Table 3). However, only four crosses using P.

subrotunda as a pollen recipient produced fruits, of which three crosses were obtained plants and it

was possible to perform cross fertilization confirmation (Table 3). When we used P. subrotunda as

a pollen donor, four crosses produced fruit. However, the plants from these crosses did not complete

the development stages, and were still in the germination stage (Fig. 2a) and died (Table 3), making

it impossible to confirm the hybridization. Of the two crosses involving P. coccinea vs. P.

hatschibachii, only in one there was fertilization and fruit production, and the native seedlings

presented green coloration and vigorous appearance (Fig. 2b).

Regardless of the confirmation of cross-fertilization, the characteristics mentioned in table 3

were evaluated for all crosses, since the confirmation of the hybrid was only carried out after the

development of the seedlings. Crosses involving P. subrotunda as paternal genitor resulted in a

26

higher number of fertilized flowers, number of fruits and number of seeds (Table 3). However, not

all reciprocal crosses led to fructification, as observed in P. subrotunda vs. P. cincinnata and in P.

subrotunda vs. P. malacophyla. Fruit formation was only verified for crosses involving P.

subrotunda vs. P. elegans and P. subrotunda vs. P. racemosa (Table 3).

After the fertilization of the flower, the greatest time (days) between the formation of the fruit

and its maturation occurred in the crosses in which P. subrotunda was the male parent. While in the

P. coccinea vs. P. hatschbachii cross the smaller time was observed (Table 3).

The highest percentage of fructification occurred in the crossings between P. malacophylla vs.

P. subrotunda, this value was higher than the expected used in the Qui Square test (Table 3). The

fructification values of the other interspecific crossings were lower than the expected (≤ 63.2%).

The crosses between P. racemosa vs. P. subrotunda and P. vitifolia vs. P. subrotunda, showed the

highest number of seeds per fruit. The P. coccinea vs. P. hatschbachii cross produced only one fruit

with 248 seeds (Table 3).

The seeds of the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii presented the highest

germination speed (days). In addition, this cross had the highest germination percentage reaching

the closest value to the expected one. This cross also showed the largest number of live plants

(Table 3). Not all the cotyledons nor the true leafs appear at the same time (days). The time for the

appearance of the true leaf presented greatest variation (Table 3).

3.2 Crosses confirmation with SSR

The SSR markers were used for the confirmation of the following crosses: P. subrotunda vs.

P. racemosa, P. subrotunda vs. P. elegans, P. subrotunda vs. P. mucronata and P. coccinea vs. P.

hatschbachii. The confirmation was made just for the crosses that reached the adult stage.

Only one SSR marker (Pa07) of 14, amplified a polymorphic heterozygous locus relevant for

the confirmation of the interspecific hybridization between P. coccinea (250bp fragment) and P.

27

hatschbachii (260bp fragment). Were assumed hybrids all the crosses that presented the two bands

in a range of 250bp (female) and 260bp (male) (Fig. 3a). The other crosses, P. subrotunda vs. P.

elegans, P. subrotunda vs. P. mucronata (data not shown), P. subrotunda vs. P. racemosa (Fig. 3b),

presented a monomorphic pattern using the SSR maker Pe90 confirming that there was no cross-

fertilization.

3.3 Crosses confirmation with GISH

The GISH technique was performed to ratify the results obtained through the SSR markers.

All genitors and F1 plants (P. subrotunda vs. P. racemosa and P. coccinea vs. P. hatschbachii) were

diploid, with 2n = 18 chromosomes. The chromosomal set from the genitors P. coccinea vs. P.

hatschbachii were distinguished using GISH (Fig. 3c), proving the hybrid state of the F1 plants. The

nine chromosomes of the paternal genitor (P. hatschbachii) detected with avidin-FITC were

strongly hybridized, marking green the entire chromosome. The other nine chromosomes of the

maternal parent (P. coccinea) detected with anti-digoxigenin-rhodamine were marked red (Fig. 3c).

For the crossing between P. subrotunda vs. P. racemosa, although the blocking DNA of the

maternal parent (P. subrotunda) was 100x concentrated, it was not possible to distinguish the

genomes of the parents in the plants, since every chromosome set was hybridized (Fig. 3d),

evidencing that these individuals did not present a hybrid state.

4 Discussion

The interspecific hybridization in Passiflora in this study reveals compatibility among some

species, which may be due to the phylogenetic relationships between them, and many crosses did

not produce fruit. The most promising combination was the cross between P. coccinea and P.

hatschbachii, since there was fertilization, higher seed yield per fruit, higher percentage of

28

germination and vigor. In light of this, the species involved in this cross show the potential to be

used in programs of improvement of Passiflora for ornamental use.

The combinations using P. subrotunda as pollen receptor were not successful, since the

individuals from these crosses did not present a hybrid character. On the other hand, some

combinations using P. subrotunda as a pollen donor produced fruits, from which were generated

seedlings that did not reach the adult stage, possibly due to post-fertilization barriers. Thus,

although it was not possible to confirm cross-fertilization, the plants could be hybrid. The fact that

P. subrotunda presents a small rate of self-compatibility (Souza 2014) may be a factor to be

considered in crosses involving this species, and it is mandatory to remove the stamen in the pre-

crossing procedures to produce interspecific hybrids. It is worth mentioning that this is a pioneer

study with P. subrotunda involving interspecific crosses and that this data of combination of species

of the genus in the production of hybrids are important to find strategies in the improvement of

ornamental passifloras.

In the present study, reciprocal crosses were not successful for all species. At the cross

between P. cincinnata vs. P. subrotunda and P. subrotunda vs. P. malacophylla have been verified

fruiting when P. cincinnata and P. subrotunda were used as the female parent. This is probably due

to unilateral incompatibility, i.e. a self-incompatible species when crossing a self-compatible

species does not produce fruit. The unilateral incompatibility has been reported for the genus

Passiflora (Bugallo et al. 2011; Conceição et al. 2011a) and can be explained by the formation and

growth of the pollen tube in only one of the crossing directions (Conceição et al. 2011a). Another

phenomenon that may influence the failure of a reciprocal crossing is the sporophytic incongruity,

in which the occurrence of fruiting in only one of the crossing paths is due to the sporophytic

incompatibility system (Bugallo et al. 2011; Ocampo et al. 2016).

Hybridizations that resulted in low fruiting may have occurred due to the pollen tube having

interrupted its growth still in the stylet, without fertilization (Bugallo et al. 2011) resulting in the

29

absence of fruits. Only the cross between P. malacophylla vs. P. subrotunda presented fruiting

higher than the expected value, used as reference value in the Qui Square test. In other interspecific

crosses involving the genus Passiflora, fruiting similar or greater than expected has been obtained

for most crosses (Conceição et al. 2011a).

Although the cross between P. malacophylla vs. P. subrotunda showed a percentage of

germination that was higher than expected, used as reference value in the Qui Square test, it did not

produce seedlings. In other crosses involving P. sublanceolata and hybrids (P. sublanceolata vs.

HD13-133 and HD13-133 vs. HD13-141), the percentage of seed germination was below the

expected value, although the crosses produced offspring (Conceição et al. 2011a). Higher

percentage of germination does not imply obtaining more seedlings or producing offspring. These

facts may be related to incongruence due to post-fertilization barriers such as embryo death from

endosperm degeneration (Freitas et al. 2015).

Other factors may also influence seed germination, such as embryo development error, seed

dormancy, embryo-endosperm compatibility (Lester and Kang 1998; Kinoshita 2007), and the

presence of aryl in the seed (Ferreira et al. 2005). The elimination of aryl implies the removal of

inhibitory substances from the germination, and this process positively influenced germination, as

occurred with P. alata seeds, once seed dormancy was broken (Ferreira et al. 2005). Failure to

develop endosperm and low seed germination were observed in different interspecific

hybridizations in Passiflora (Ocampo et al. 2016).

Synchrony was not observed in the germination of the seeds for all crosses, with variation

between 8 and 21 days. As previously reported, the lack of synchrony in seed germination in

Passiflora is frequent (Ulmer and Macdougal 2004), as well as in backcrosses using these species,

varying from 15 days to 60 days (Melo et al. 2016).

In breeding programs, interspecific hybridization has been a very important tool, since it has

sought to introduce genes that are of interest both for resistance to diseases and for improving

30

characters of ornamental interest (Santos 2008). Passiflora species involved in interspecific

hybridizations present characteristics of interest for ornamental purposes, and can be used as

breeders in breeding programs. These species present attractive flowers of intense color and of

varied size, continuous flowering and diversity in the foliage (Abreu et al. 2009). Therefore, several

hybrids have been produced and recorded for these purposes (Junqueira et al. 2008; Conceição et al.

2011a; Santos et al, 2011; Freitas et al. 2015; Ocampo et al. 2016). Nevertheless, there are factors

that can influence the attainment of F1 hybrids, such as genetic distance and chromosome number

(Yotoko et al. 2011). More distant species usually have different chromosome numbers and thus,

the cross between them can be difficult. This fact is reported in the present study for the cross

between P. subrotunda vs. P. sublanceolata, since there is a difference in the chromosome number

and in the taxonomic sections. The same was verified for other hybridizations involving P.

sublanceolata and P. cincinnata (Conceição et al. 2011a).

Confirmation of interspecific hybridization is necessary in plant breeding programs, since

even though the care for the procedure of the technique, such as the removal of the anther before the

open flower can not be ruled out, the possibility of self-pollination before this procedure can not be

ruled out. This may be justified by the fact that a self-compatible species, or even of

autoincompatibles species, but that present a small rate of self-compatibility, as is the case of P.

subrotunda (Souza 2014), when used as a female parent in a cross- fruits. However, not necessarily

the seeds are hybrid, because all seeds or part of them can come from self-pollination (Ocampo et

al. 2016).

Interspecific hybridizations in Passiflora have been confirmed using molecular markers

(Conceição et al. 2011b; Santos et al. 2012; Melo et al. 2016; Belo et al 2018;). We confirmed the

elimination of the self-fertilization hypothesis only for the cross between P. coccinea vs. P.

hatschbachii, and the heterozygous character of the hybrids for the SSR locus was shown by the

first SSR Pa07. For the other crosses (P. subrotunda vs. P. racemosa, P. subrotunda vs. P. elegans,

31

P. subrotunda vs. P. mucronata) we did not observe paternal alleles, confirming that the plants

from these crosses are not hybrids.

At the cross between P. gardneri vs. P. gibertii, the RAPD marker revealed informative

bands, and the first SSR Pe75 confirmed the occurrence of ten interspecific hybrids (Belo et al.

2018). Interspecific hybridization between P. sublanceolata and P. foetida var. foetide was

successful using both the RAPD and SSR marker (Santos et al. 2011). Using molecular markers, it

was possible to confirm among several crosses with Passiflora species, including P. setacea. P.

coccinea (Junqueira et al. 2008). These species were used in hybrids mainly due to their ornamental

value, besides presenting resistance to anthracnose in the fruits and branches and to the virus in the

leaves (Junqueira et al. 2005). In addition, SSR molecular markers enabled the confirmation of RC1

progeny (backcrossing) in plants within Passiflora progenies (Melo et al., 2016).

In this study, GISH proved to be an efficient technique in distinguishing the genomes of the

parents, confirming the hybrid status. This tool has been used for several species such as Brassica

(Yao at al. 2010), Cucumis (Chen et al. 2003), Citrus (Fu et al. 2004) and Passiflora in the

confirmation of interspecific hybrids (Melo et al. 2015, Silva et al. 2017 in press), such as in the

recombination study in backcrossed hybrids (Melo et al. 2017).

The proportion of the blocking DNA and the probe, and the post-hybridization stringency are

factors to be considered in the distinction between the genomic genomes using GISH (Schwarzcher

and Heslop-Harrison 2000), since they may hamper good results. The paternal genomic DNA was

used as probe to identify the hybrid character of the plants coming from the cross between P.

subrotunda vs. P. racemosa, and maternal genomic DNA used as blocking DNA 100x more

concentrated than the probe. The blocking DNA was used in this specific concentration because it

was already observed in other crosses involving Passiflora that the use of 100x blocking DNA was

more efficient in the distinction between the genomes of the parents (Melo et al. 2015; Silva et al.

2017 in press). It is worth mentioning that the function of the blocking DNA is to block the

32

repetitive DNA of the maternal genitor, causing the probe to mark the target genome (paternal

genitor DNA) and to differentiate the genomes.

The greater the distance between species the less the amount of replicate DNA shared. Thus,

genomes can be differentiated with low concentrations of blocking DNA (Tang et al. 2010). When

the species are very phylogenetically close, it is possible to use genomic probes of the parents

simultaneously, and it is necessary to adjust the technique for better results (Melo et al. 2015). The

concomitant use of the genomic probes of the parents P. coccinea and P. hatschbachii enabled the

distinction between the genomes of the genitors and the genome of the interspecific hybrids F1,

identifying the hybrid status of these plants. It was not possible to use the blocking DNA in the

identification of the cross-fertilization between P. coccinea and P. hatschbachii because they must

share many repetitive sequences as these species are phylogenetically closer, belonging to the same

subgenus and taxonomic section. In a cross involving two species of orchids, using probe and

blocking, there was no differentiation of the genomes of the parents in the artificial hybrid, because

the species are very phylogenetically close. Thus, it was necessary to use the probes of the parents

(Lee et al. 2011).

The ability to distinguish the genomes of the parent species in hybrids through GISH also

depends on the size of the chromosomes. In Brassica, the chromosomes are small with only the

pericentromeric regions showing predisposition for marking (Yao et al. 2010). In Citrus, the

chromosomes are small and morphologically indistinguishable and can limit the application of the

technique (Fu et al. 2004). On the other hand, the application of GISH in Passiflora species has not

been difficult, since the chromosomes present ideal size for application and efficiency of the

technique (Melo et al. 2015, 2017; Silva et al. 2017 in press), a fact also observed in this study.

The application of molecular markers and GISH confirmed interspecific hybridizations, and

self-fertilization, consisting of reliable tools to be used in plant breeding programs. The species P.

subrotunda used as maternal and paternal parent made possible the knowledge about the

33

reproduction mode of this species, being able to present self-incompatibility depending on the

species/hybridized genotype. In this way, a more detailed study on this phenomenon will be

important for a better strategy in Passiflora breeding programs when using this species in

interspecific hybridizations. Cross involving P. coccinea vs. P. hatschbachii are more promising to

be used in plant breeding programs for ornamental purposes, since from this crossing there were

fruit production with viable seeds, of which about 75% germinated and generated hybrid plants.

5 Authors' contributions

VOS performed the interspecific hybrids, taking and analyzes the data, analyze with

molecular markers, cytogenetic studies and writing the article. The MMS supervised the cytogenetic

studies, participated in the writing and revision of the final text. GSS contributed with cytogenetic

analyzes and molecular markers, besides participating in the final revision of the text.

6 Acknowledgement

The authors would like to thank UESC, CNPq (National Council for Scientific and

Technological Development) and FAPESB (Foundation for Support to Research of the State of

Bahia) for the financial support for research; CAPES (Coordination for Higher Level Personal

Improvement) for the scholarship granted to the first authors; CNPq for the scholarship awarded to

the second author; to Mauro Peixoto for providing certain images of the Passiflora species for

elaboration of Figure 1.

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41

Tables

Table 1 Passiflora species used in interspecific crosses. Classification according to Ulmer and MacDougal (2004) Subgenus Section Species Access Location Chromosome number (2n)

Passiflora

Granadillastrum P. cincinnata Mast. 504 - 2n = 18 (Heitz 1926, Bowden 1945, Beckett 1960)

Granadillastrum P. coccinea Aubl. 505 Pontes de Lacerda-MT 2n = 18 (Beal 1971, Mayeda 1997, Melo et al. 2001)

Granadillastrum P. elegans Mast. 491 EMBRAPA 2n = 18 (Melo et al. 2001)

Granadillastrum P. galbana Mast. 500 BAG/UESC 2n = 18 (Melo et al. 2001, Souza et al. 2003)

Granadillastrum P. hatschbachii Cervi 446

Leopoldina-MG/Instituto

Plantarum 2n = 18 (Melo et al. 2014)

Granadillastrum P. malacophyla Mast. 405 EMBRAPA Cerrado 2n = 18 (Souza et al. 2003)

Granadillastrum P. mucronata Lam. 509 Canavieiras-BA

2n = 18 (Guerra 1986, Melo et al. 2001, Souza et al.

2003)

Granadillastrum P. nitida Kunth 403

Serra Madureira/Instituto

Plantarum 2n = 18 (Passos 1999, Melo et al. 2001)

Calopathanthus P. racemosa Brot. 475 RJ 2n = 18 (Heitz 1926, Bowden 1945, Beckett 1960)

Calopathanthus P. serratodigitata L. 487 EMBRAPA Cerrado 2n = 18 (Soares-Scott et al. 1999)

Calopathanthus P. setacea DC. 506 - 2n = 18 (Soares-Scott et al. 1999)

Dysosmia P. sublanceolata

(Killip) J.M.

MacDougal

496 EMBRAPA Cerrado 2n = 22 (Santos, 2012)

Granadillastrum P. subrotunda Mast. 452 Fortaleza-CE/Instituto Plantarum 2n = 18 (Melo et al. 2014)

Granadillastrum P. trintae Sacco - Bahia 2n = 18 (Sousa 2014)

Granadillastrum P. vitifolia Kunth 481 Miranda-MG/Instituto Plantarum 2n = 18 (Storey 1950, Snow; McDougal 1993)

- Absence of location and access number.

42

Table 2 Sequence of 14 SSR primers used for the confirmation of the interspecific

hybridizations in Passiflora

Primers Oligonucleotide Sequence

Primer forward Primer reverse

Pe02 GGACGACAATCAAGTGAGG CCCAAACTATGCAACACCAA

Pe19 TTAACAGGACTTAGCACTTGA CTCATCCTTCTTCCATCTTTG

Pe27 TTGCTCATTGCACTCATCCT GCAGACATTTCCTGGAGCA

Pe28 GCCACTAACGTTAACTGTGCT CAAGCTCTTATTAGGCATCCA

Pe37 CAAAAGGATAGGCCTGATGTC TGCTTGGTCATCCACTGAAG

Pe42 GTCACTTCATTCTTCCTTTCC TTAGCCCACTCAAACACAA

Pe54 TGGTGTGTGTGGGTGATTAG CATTCTCCTGCCACCTGAGT

Pe59 GAACACTTCGCATGGCTAGA TTCCGAATCAAACCGTAACT

Pe64 ATCAATTACGCACCCCAAAC GGAACGTCAATCAAGTGAGGA

Pe75 CACAATCGGTGGGAAAGATA GTAGTTTTGGGCAGTTTGC

Pe90 TCAGGAAGATTGCATGTTAGT CTGGGTTTTGTTTATGTTGC

Pa02 AGAGTCGTCTAACCCTCTTGC TCTTGCTTACGCGTGGACTA

Pa04 GGGCGGAAGAAAAGAGAAG GAAACACACGATGCGAAAA

Pa07 CACATTTGCCGTCACTGG CGGCATACGATAAATCTCCTG

Pe: Passiflora edulis; Pa: Passiflora alata.

43

Table 3 Interspecific crosses in Passiflora species and characteristics evaluated in response to crosses

Crosses NC FF DRF NF F (%) χ2 F NS NSG GS G

(%) χ2 G DG DC DTL LP

CC

P. subrotunda vs. P. cincinnata 16 7 39 4 25 61.94 * 87 - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. elegans 2 2 36 1 50 7.25 * 18 16 7 43.75 15.89 * 12 2 7 6 no

P. subrotunda vs. P. galbana 3 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. malacophylla 22 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. mucronata 33 7 37 5 15.15 97.23 * 112 20 9 45.00 13.89 * 15 1 4 6 no

P. subrotunda vs. P. nitida 4 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. racemosa 64 19 28 16 25 61.94 * 234 85 27 31.74 41.92 * 20 1 4-5 23 no

P. subrotunda vs. P. serratodigitata 1 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. setacea 4 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. sublanceolata 3 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. trintae 7 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. subrotunda vs. P. vitifolia 107 2 - - - - - - - - - - - - - -

P. cincinnata vs. P. subrotunda 10 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. elegans vs. P. subrotunda 10 4 88 4 40 22.69 * 92 - - - - - - - - -

P. malacophylla vs. P. subrotunda 39 35 113 35 89.73 30.73 * 143 143 92 64.33 0.07 ns 13-21 1-2 3-10 0 -

P. mucronata vs. P. subrotunda 10 2 - - - - - - - - - - - - - -

P. nitida vs. P. subrotunda 2 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. racemosa vs. P. subrotunda 53 28 89 26 49.05 7.74 * 1954 756 126 16.66 92.12 * 19 1 4-6 0 -

P. serratodigitata vs. P. subrotunda 1 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. setacea vs. P. subrotunda 1 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. trintae vs. P. subrotunda 6 0 - - - - - - - - - - - - - -

P. vitifolia vs. P. subrotunda 130 22 58 18 13.84 105.62 * 1697 924 483 52.27 4.93 * 11 3 7-8 0 -

P. coccinea vs. P. hatschbachii 2 1 35 1 50 7.25 * 248 245 186 75.91 7.15 * 8 3 5 117 yes

*: Significance level P < 0.05; ns: not significant P > 0.05; set ≥ 63.2% (Aular et al. 2004); germination ≥ 83.2% (Ferreira et al. 2005). Number of crosses performed (NC), fertilized flowers (FF), days for fruit ripening

(DRF), number of fruits (NF), % fruiting (%F), number of seeds (NS) obtained from each cross, number of seeds to be germinated (NSG), number of germinated seeds (GS), germination (%G), number of days for

germination (DG), number of days for emergence of cotyledon (DC), number of days for emergence of true leaves (DTL), number of live plants (LP), confirmed crossing (CC).

44

Figures list

Fig. 1 Flowers of Passiflora species used in interspecific hybridizations: a) P. cincinnata; b) P.

coccinea; c) P. elegans; d) P. vitifolia; e) P. galbana; f) P. hatschbachii; g) P. malacophyla; h) P.

mucronata; i) P. nitida; j) P. racemosa; k) P. serratodigitata; l) P. setacea; m) P. sublanceolata; n)

P. subrotunda; o) P. trintae. Photos by Viviane de Oliveira Souza (a, b, d, f, g, h, j, k, l, m, n).

Powered by Mauro Peixoto, www.brazilplants.com (c, e, i and o).

45

Fig. 2 Interspecific crosses between Passiflora species: a) Germination of seedlings from the cross

between P. subrotunda vs. P. racemosa evidencing chlorosis; b) Germination of seedlings obtained

from the crossing of P. coccinea vs. P. hatschbachii, showing non-chlorotic leaves.

46

Fig. 3 Confirmation of interspecific hybridization in Passiflora by molecular markers and

molecular cytogenetics: a) Confirmation of the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii using

primer SSR Pa07 in six hybrids (samples representative of the confirmation). M: molecular weight

marker DNA Ladder (50pb); m: P. hatschbachii (male parent); f: P. coccinea (female parent).

DH25 135, DH25 136, DH25 25 138, DH25 139, DH25 140, HD25 141: interspecific hybrids; b)

Confirmation of uncrossed fertilization between P. subrotunda vs. P. racemosa using primer SSR

Pe90 in five plants. M: molecular weight marker DNA Ladder (100pb); f: P. subrotunda (female

parent); m: P. racemosa (male parent). c) Genomic in situ hybridization (GISH) in interspecific

hybrid mitotic metaphase HD25 244 obtained from the cross between P. coccinea vs. P.

hatschbachii using both probes from the parents. P. coccinea, probe marked with digoxigenin and

detected with anti-digoxigenin-rhodamine (red chromosomes) and P. hatschbachii, biotin-marked

probe detected with avidin-FITC (green chromosomes). d) Genomic in situ hybridization (GISH) in

mitotic metaphase evidencing that there was no cross-fertilization between P. subrotunda vs. P.

racemosa, using blocking DNA 100x more concentrated than the probe. Bar = 10 µm.

47

CAPÍTULO 2

Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NOVOS HÍBRIDOS

ORNAMENTAIS

RESUMO

Dois novos híbridos interespecíficos foram desenvolvidos para a ornamentação. Foi

realizada a descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1 obtidos do cruzamento

entre Passiflora coccinea Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, bem como a confirmação da

hibridação interespecífica com base em marcadores moleculares microssatélites (SSR) e

através da Hibridação Genômica In Situ (GISH). Com base nos descritores

morfológicos florais e vegetativos, foi observada diferenças entre os híbridos em relação

à forma, tamanho e coloração. O bandamento da corona foi o descritor floral mais

relevante para a distinção dos híbridos em dois grupos que deram origem às cultivares

Passiflora ‘Vivis’ e Passiflora ‘Jhovi’, as quais serão registradas na Passiflora Society

International. Passiflora ‘Vivis’possui flores vermelhas, assim como suas pétalas e

sépalas, corona com a primeira série de filamentos (externo) de cor vermelho e branco,

de forma alternada (com bandamento na corona). Passiflora ‘Jhovi’ possui flores

vermelhas, bem como suas pétalas e sépalas, corona com os primeiros filamentos

(externo) de cor vermelho e branco (sem bandamento da corona). O primer SSR Pa07

possibilitou a visualização de dois alelos A (250pb) e B (260pb) na progênie híbrida F1,

as quais apresentaram-se heterozigotas, levando a confirmação da fecundação cruzada.

Foi utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para detecção do número

cromossômico, sendo verificado o número cromossômico diploide 2n = 18 nos

genitores e nos híbridos pertencentes aos grupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’. A partir da

GISH, foi possível a diferenciação genômica com a utilização simultânea das sondas

dos genitores na progênie híbrida F1. Tanto o marcador molecular SSR quanto a GISH

permitiram a confirmação do caracter híbrido das plantas, sendo duas ferramentas

moleculares confiáveis e seguras neste processo. Realizou-se a análise meiótica pela

técnica do esmagamento em carmim acético para estudo do comportamento meiótico

das plantas híbridas. O comportamento meiótico da progênie F1 foi regular, o que

sugere grande compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente híbridos com

fertilidade. Considerando a beleza das flores de Passiflora, P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ são

híbridos com potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre

pérgulas ou ser cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes.

Palavras-chave: Híbridos interespecíficos, P.‘Vivis’, P. ‘Jhovi’, SSR, GISH.

48

Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NEW ORNAMENTAL HYBRIDS

ABSTRACT

Two new interspecific hybrids were developed for ornamentation. The morphological

and cytogenetic description of hybrids F1 obtained from the cross between Passiflora

coccinea Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, as well as the confirmation of interspecific

hybridization based on microsatellite molecular markers (SSR) and through In Situ

Genomic Hybridization (GISH). Based on floral and vegetative morphological

descriptors, differences were observed among hybrids in relation to shape, size and

coloration. The corona banding was the most relevant floral descriptor for the

distinction of the hybrids in two groups that gave origin to the cultivars Passiflora

'Vivis' and Passiflora 'Jhovi', which will be registered in the Passiflora Society

International. Passiflora 'Vivis' has red flowers, as well as its petals and sepals, crown

with the first series of filaments (external) of color red and white, alternately (with

banding in the crown). Passiflora 'Jhovi' has red flowers, as well as its petals and sepals,

corona with the first filaments (external) of red and white color (without crown

banding). The primer SSR Pa07 allowed the visualization of two alleles A (250pb) and

B (260pb) in the hybrid F1 progeny, which were heterozygous, leading to confirmation

of cross-fertilization. The conventional staining with Giemsa 4% was used to detect the

chromosome number, and the diploid chromosome number 2n = 18 was verified in the

parents and in the hybrids belonging to the P. 'Vivis' and P. 'Jhovi' groups. From GISH,

genomic differentiation was possible with the simultaneous use of the probes of the

parents in the hybrid F1 progeny. Both the molecular marker SSR and GISH allowed the

confirmation of the hybrid character of the plants, being two molecular tools reliable

and reliable in this process. The meiotic analysis was performed by the crushing

technique in acetic carmine to study the meiotic behavior of the hybrid plants. The

meiotic behavior of the F1 progeny was regular, suggesting great genetic compatibility

between the parents and possibly hybrids with fertility. Considering the beauty of

Passiflora flowers, P. 'Vivis' and P. 'Jhovi' are hybrids with potential for the ornamental

market, being able to compose gardens, pergolas or can be grown in pots in the

decoration of different environments.

Keywords: Interspecific hybrids, P.'Vivis', P. 'Jhovi', SSR, GISH.

49

1 INTRODUÇÃO

O gênero Passiflora compreende espécies geralmente trepadeiras, com flores

hermafroditas e de coloração diversificada. Apresenta androginóforo e uma corona

composta de dois a três filamentos, com diferentes formas e cores, bem como variação

nas suas folhagens. A capacidade de produzir flores o ano inteiro e longo período de

abertura da flor, como são observados em algumas espécies (ULMER; MACDOUGAL

2004), fazem com que as passifloras sejam inseridas no mercado de plantas ornamentais

(VANDERPLANK, 2000).

Muitas espécies de Passiflora são utilizadas como plantas ornamentais, como P.

alata Dryand., P. cininnata Mast. e P. coccinea Aubl. No entanto, a produção de

híbridos tem se destacado e compondo uma parcela considerável no mercado de plantas

ornamentais na Europa e na América do Norte (ABREU et al., 2009). A produção de

híbridos por cruzamentos artificiais é um método considerado simples, principalmente

pelo fato de muitas espécies florescerem durante o ano todo e produzir flores

abundantes, além da compatibilidade entre as espécies. Nesse sentido o gênero

Passiflora tem sido foco de estudos para obtenção de híbridos com características

intermediarias a dos genitores, visando o melhoramento genético (ABREU et al., 2009).

Passiflora 'Violacea' T. Milne foi o primeiro híbrido obtido no século XIX. A

partir de então já foram produzidos e registrados vários híbridos (KING 2011). A

obtenção de híbridos artificiais no Brasil para ornamentação está crescendo, uma vez

que já foram registrados na Passiflora Society International diversos híbridos, como P.

‘Alva’ P. ‘Aninha’, P. ‘Priscilla’ (SANTOS, et al., 2012), P. ‘Gabriela’ e P. ‘Bella’

(BELO et al., 2018). Além dos híbridos obtidos do cruzamento entre P. gardneri vs. P.

alata, P. watsoniana vs. P. alata, P. watsoniana vs. P. gardneri e P. gardneri vs P.

gibertii (CONCEIÇÃO et al., 2011a) e híbridos retrocruzados produzidos a partir de

Passiflora sublanceolata vs. P. foetida (MELO et al., 2016).

A identificação de híbridos a partir de cruzamentos interespecíficos é um passo

essencial em programas de melhoramento genético, podendo ser realizada pela obtenção

de marcadores moleculares, bem como identificação genômica por meio de técnicas

citogenéticas. Os marcadores microssatélites (SSR - Simple Sequence Repeats)

demonstram potencial para detecar polimorfismo genético em progênies híbridas F1

(BELO et al., 2018; MCGREGOR et al., 2000; SANTOS et al., 2012). Embora esta

técnica necessite do conhecimento de sequências para a construção de primers

50

específicos, ela tem sido empregada de forma eficiente na confirmação da natureza

híbrida em progênies F1 e em híbridos retrocruzados de Passiflora, a partir da

transferibilidade de primers (BELO et al., 2018; MELO et al., 2016; SANTOS et al.,

2012). Além disso, os marcadores moleculares possibilitam a identificação da

paternidade de genótipos híbridos mesmo quando não se tem o conhecimento de um dos

genitores de um determinado cruzamento (BELO et al., 2018).

A citogenética molecular também é uma ferramenta bastante útil para a

confirmação da fecundação cruzada. A Hibridização Genômica In Situ (GISH), tem sido

amplamente utilizada para esta finalidade em diversos híbridos (SILVA; SOUZA,

2013). A GISH envolve o uso do DNA genômico total de uma espécie genitora como

sonda e o DNA genômico total da outra espécie genitora como DNA de bloqueio.

Alternativamente pode-se utilizar o DNA genômico total de ambos os genitores como

sondas (STACE; BAILEY, 1999), sendo ambas as formas eficientes na diferenciação

dos genomas dos genitores no germoplasma híbrido (SILVA; SOUZA, 2013).

A citogenética convencional, com base em análises cariotípicas e no

comportamento meiótico possibilita informações a cerca da confirmação do sucesso da

hibridação, através do número cromossômico e da fertilidade da planta,

respectivamente. No caso de espécies diplóides com diferenças no número de

cromossomos tendem a serem mais divergentes e com isso as chances de obter híbridos

interespecíficos são mais dificultados (LEVIN, 2002). Cruzamentos interespecíficos

envolvendo a espécie P. sublanceolata (2n = 22) e P. cincinnata (2n = 18) não foi bem

sucedido, possivelmente devido à diferença do número cromossômico (CONCEIÇÃO

et al., 2011b). Em híbridos só haverá fertilidade quando o mesmo apresentar meiose

regular e como resultado a formação de gametas viáveis (LAVINSCKY, et al., 2017).

Sendo assim, as analises meióticas fornecem informações a cerca de eventos

importantes que podem indicar homologia entre as espécies, como o pareamento correto

entre os cromossomos, a recombinação meiótica, as irregularidades e a viabilidade dos

gametas (SOUZA et al., 2003).

O objetivo deste trabalho foi realizar a descrição morfológica e citogenética dos

híbridos F1, P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, obtidos do cruzamento entre Passiflora coccinea

Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, bem como confirmar a hibridação interespecífica com

base em marcadores SSR e através da GISH.

51

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal e cruzamentos interespecíficos

As espécies Passiflora coccinea (Figura 1A e 1B) e P. hatschbachii (Figura 1C e

1D) foram utilizadas como genitores feminino e masculino, respectivamente, as quais

foram mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG-Passifloras) da Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt

78m). Foram selecionadas estas espécies para produção de híbridos ornamentais, pois

possuem características que são apreciadas para a ornamentação. Passiflora

hatschbachii apresenta flores de coloração branca e antese noturna (aberturada flor por

volta das 2h00 da manhã). Passiflora coccinea produz flores ao longo do ano, flores de

coloração marcante e atrativa (vermelha) ao mercado ornamental e antese diurna. Em

adição, esta espécie apresenta resistência à virose nas folhas e antracnose nos frutos e

ramos (JUNQUEIRA et al., 2005). Sendo assim, deseja-se obter um híbrido com

potencial ornamental, cujo florescimento ocorra o ano inteiro, com flores que

permaneçam abertas por longo período de tempo e que apresente coloração intensa.

Os cruzamentos interespecíficos foram realizados nas primeiras horas da manhã.

No dia anterior os botões florais em pré-antese foram protegidos com sacos de papel

para não haver contaminação com polén exógeno. Posteriormente, com auxilio de uma

pinça, os grãos de pólen de P. hatschbachii foram depositados com cuidado sobre a

papila estigmática de P. coccinea, a qual já havia sido emasculada. As flores polinizadas

foram identificadas com etiquetas e logo protegidas com sacos de papel por cinco dias.

Após esse período, foi verificado se houve ou não abortamento do botão floral. Foi

realizada a proteção dos frutos produzidos dos cruzamentos contra queda até o seu

amadurecimento (BRUCKNER; OTONI 1999). Após o amadurecimento dos frutos, as

sementes foram retiradas, secas à temperatura ambiente, armazenadas em sacos de papel

e conservadas a 10°C.

2.2 Germinação das sementes e condições de cultivo

Os arilos das sementes foram retirados e a semeadura foi realizada em bandejas de

isopor contendo o substrato terra vegetal e mantidas em casa de vegetação. O número de

sementes colocadas para germinar correspondeu à quantidade de sementes oriundas do

52

fruto. Após o surgimento das folhas verdadeiras, as plântulas foram transferidas para

sacos de polietileno preto, com capacidade de 0.5 L. Depois de aproximadamente 3

meses, as plantas matrizes foram transferidas para vasos de 45 L contendo solo.

Os genitores e os genótipos híbridos foram propagados por estaquia através das

plantas matrizes, as quais foram retiradas da parte intermediária dos ramos, preparadas e

padronizadas com dois nós e duas folhas reduzidas à metade de sua área, secionadas em

bisel e imersas em auxina sintética (ácido indol-3 butírico – AIB). As estacas foram

colocadas em sacos preto de polietileno, com capacidade de 1,5 L, contendo areia

lavada para enraizamento, as quais foram irrigadas diariamente durante esse período.

Quando as plantas atingiram aproximadamente 1m de altura, foi realizado o

transplantio para vasos com capacidade de 25 L contendo solo, e transferidas para a área

experimental, em delineamento em blocos casualizados. As plantas híbridas foram

conduzidas em sistema de espaldeira vertical, com mourões de 2,5 m de altura e fio de

arame 1,8 m do solo. Utilizou-se o espaçamento de um metro entre plantas e dois

metros entre fileiras. Foi realizada poda mensalmente e a adubação a cada 15 dias, de

acordo com a análise do solo: 38,33 mg de fosfato Monoamónico (MAP) purificado,

45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses e após esse

período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de potássio,

99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.

2.3 Descrição morfológica dos híbridos

A descrição morfofógica foi realizada com base em características incluídas nos

descritores oficiais de Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns com base no

manual prático da EMBRAPA (JESUS et al., 2015). As características morfológicas

avaliadas foram as seguintes: diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura

da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), cor da pétala (CorP), largura da sépala

(LSE), comprimento da sépala (CSE), cor da sépala (CorS), largura da bráctea (LBR),

comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), cor

dos TF1 (CorTF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), cor dos TF2

(CorTF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo

(CA), cor da antera (CorA), cor do estame (CorE), cor do grão de pólen (CorGP), cor do

estilete (CorE), cor do estigma (CorEs), comprimento de folha (CF), largura de folha

(LF), área foliar (AF), divisão da lâmina foliar (DLF), consistência do limbo foliar

53

(CLB), forma do caule (FD), diâmetro do caule (DC), comprimento do entrenó do ramo

principal (CEN); profundidade do limbo foliar (PFL): 1) profunda, 2) média, 3) ausente;

antocianina no filete (AF): 1) forte, 2) média, 3) fraca, 4) ausente; antocianina no estilo

(AE): 1) forte, 2) média, 3) fraca; bandamento na corona (BAND): 1) presente, 2)

ausente.

A caracterização morfológica relacionada à coloração das folhas foi baseada na

carta de cores de Munsell para tecidos vegetais (MUNSELL, 1977), sendo a coloração

nomeada de acordo com códigos de letra e números.

2.4 Confirmação da hibridação via marcador molecular

O procedimento para extração de DNA e a transferibilidade de primers, para a

obtenção de marcadores moleculares SSR foi realizado da mesma forma como descrito

no capítulo 1. No entanto, a presença de polimorfismo foi verificada em gel

desnaturante de poliacrilamida a 6% seguindo o protocolo proposto por Crestes (2001).

A identificação de alelos diferentes nas espécies genitoras, que segregaram nas plantas

híbridas evidencia a ocorrência da fecundação cruzada. O software GelAnalyzer 2010

(versão 2010a) foi usado para calcular o tamanho das bandas informativas.

2.5 Análises citogenéticas e viabilidade do pólen

2.5.1 Citogenética convencional

A obtenção dos cromossomos metafásicos foi realizada para identificação do

número cromossômico das espécies genitoras e híbridos. Foram coletadas radículas a

partir de estacas, as quais foram pré-tratadas em 0,002 M 8-hidroxiquinolina (8HQ) por

uma hora a temperatura ambiente (TA) e posteriormente a 8°C por 23 horas. Após este

período, as raízes foram lavadas e fixadas em Carnoy (etanol-ácido acético glacial [3:1,

v/v]) (JOHANSEN, 1940) por 24 horas a temperatura ambiente (TA) e estocadas a -20

ºC até a preparação das lâminas. O protocolo proposto por Guerra (2002) foi usado para

o preparo das lâminas. As raízes foram lavadas, e digeridas na enzima celulase 2% e

pectinase 20% (w/v) a 37 °C por uma hora e 20 minutos. Logo após as radículas foram

lavadas e a região meristemática foi macerada em uma lâmina contendo ácido acético

45% e depositada uma lamínula. As lâminas foram colocadas em nitrogênio líquido

54

para a remoção da lamínula e adesão do material citológico na lâmina. As lâminas

foram observadas em microscópio optico e as que apresentaram boas preparações

citológicas foram armazenas a -20°C para posterior análise citogenética. A coloração

convencional foi realizada de acordo com o protocolo proposto por Guerra (2002) com

modificações, sendo utilizado Giemsa a 4% (Merck®) por cerca de 20 minutos. Após a

coloração as lâminas foram lavadas, secas ao ar e montadas com meio Neomount®

(Merck®).

Para a análise de comportamento meiótico foram realizadas coletas de botões

florais em diferentes estágios de desenvolvimento das plantas híbridas no período da

manhã. Os botões foram fixados em Carnoy, (3:1, v/v, de etanol e ácido acético) em

temperatura ambiente (JOHANSEN, 1940). A troca do fixador foi realizada após meia

hora e após três horas, os quais foram estocados e mantidos a -20 °C até o momento das

análises. Foram preparadas lâminas temporárias pela técnica de esmagamento e

coloração. Primeiramente, uma gota do ácido acético 60% foi depositada sob a antera

por 7 minutos, sendo o excesso retirado com papel de filtro. O material foi corado com

carmim acético 2% (Fluka, 22000), logo realizou-se o esmagamento e em seguida as

lâminas foram cobertas com lamínulas 20x20 mm (SOUZA; PEREIRA, 2011). As fases

meióticas foram observadas em microscópio óptico Olympus CX41.

A fotodocumentação foi feita com a utilização do microscópio de Olympus

BX41 equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25 pelo software DP2-BSW.

2.5.2 Extração do DNA, preparo da sonda para GISH e aplicação da GISH

A extração do DNA genômico dos genitores, o preparo das sondas e a aplicação

da técnica de GISH segui o mesmo procedimento para o capítulo 1. Porém, vale

ressaltar que foi utilizado o DNA de ambos os genomas dos genitores no mix de

hibridação.

2.5.3. Viabilidade do pólen

Foram coletadas flores abertas no período da manhã e retirada uma antera para

aplicação do teste de viabilidade polínica. Os grãos de pólen (GP) foram depositados

cuidadosamente sobre uma gota da solução Alexander (ALEXANDER, 1969), a qual é

baseada em tripla coloração: laranja G (intensificador), fucsina básica (cora o

55

citoplasma de vermelho) e verde malaquita (cora de verde a parede do grão de pólen).

Este corante possibilita a reatividade da parede/citoplasma, sendo considerados viáveis

os GP corados e com citoplasma íntegro.

3. RESULTADOS

3.1 Cruzamentos interespecíficos e descrição morfológica dos híbridos

O cruzamento entre os genitores Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii resultou

em apenas um fruto com 248 sementes, sendo 75.91% viáveis. Com base nos

descritores morfológicos florais e vegetativos, foram observadas diferenças entre os

híbridos em relação à forma, tamanho e coloração. O bandamento da corona foi o

descritor floral mais relevante para a distinção dos híbridos em dois grupos que deram

origem os híbridos Passiflora ‘Vivis’ (Figura 1 E, F) e Passiflora ‘Jhovi’ (Figura 1 G,

H), as quais serão registradas na Passiflora Society International

(www.passiflorasociety.org).

Passiflora ‘Vivis’ - as plantas pertencentes a este grupo apresentam as seguintes

características: caule cilíndrico de 1.10-2.22 cm de diâmetro; entrenó 2.50-5.50 cm de

comprimento; folha partida, trilobadas, membranácea, com 8.42-12.83 cm de

comprimento e 6.43-11.12 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde

escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 5.55-12.90 cm de comprimento;

flores de coloração vermelha, com 8.80-10.40 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de

3.79-4.66 cm de comprimento e 0.90-1.16 cm de largura; sépalas vermelhas de 4.02-

4.60 cm de comprimento e 0.95-1.22 cm de largura; corona com os primeiro filamentos

(externo) de coloração vermelha e branca em faixas alternada (bandamento na corona)

de 2.40-3.20 cm de comprimento; segundo filamentos (interno) de cor branco de 0.43-

0.65 cm de comprimento; anteras de coloração verde-claro; estames verde-claro; pólen

amarelo escuro; estilete verde-claro com pontuações vermelhas, com variações na

intensidade da coloração; estigma verde-claro. Apresenta florescimento contínuo com

maior produção de flores nos meses de outubro a dezembro.

Passiflora ‘Jhovi’ - as plantas pertencentes a este grupo apresentam as seguintes

características: caule cilíndrico de 0.81-1.97 cm de diâmetro; entrenó 2.67-5.50 cm de

comprimento; folha partida, trilobadas, membranácea, com 8.90-12.32 cm de

comprimento e 6.67-11.42 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde

56

escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 5.85-12.58 cm de comprimento;

flores de coloração vermelha, com 8.67-10.90 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de

3.73-4.92 cm de comprimento e 0.90-1.19 cm de largura; sépalas vermelhas de 3.70-

4.73 cm de comprimento e 0.95-1.53 cm de largura; corona com os primeiros

filamentos (externo) de cor vermelho e branco (sem bandamento na corona) de 2.47-

3.00 cm de comprimento; segundo filamentos (interno) de cor branco de 0.45-1.11 cm

de comprimento; anteras de coloração verde-claro; estames verde-claro; pólen amarelo

escuro; estilete verde-claro com pontuações vermelhas, com variações na intensidade da

coloração; estigma verde-claro. Apresenta florescimento contínuo com maior produção

de flores nos meses de outubro a dezembro.

57

Figura 1. Genitores e híbridos F1 obtidos do cruzamento entre Passiflora: (A, B)

Passiflora coccinea; (C, D) P. hatschbachii; (E, F) P. ‘Vivis’; (G, H) P. ‘Jhovi’.


O par de primer SSR Pa 07 desenvolvido para P. alata possibilitou a visualização

de dois alelos A (250pb) e B (260pb), levando a confirmação da fecundação cruzada

(Figura 2). Os genitores P. coccinea e P. hatschbachii, apresentaram-se homozigotos

AA e BB, respectivamente. Enquanto que a progênie híbrida F1 apresentou-se

58

heterozigotos (AB), com a presença de bandas de 250 e 260pb, o que corresponde ao

tamanho das bandas dos geniotes feminino e masculino, respectivamente (Figura 2).

Figura 2. Confirmação da hibridação entre Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii

através do primer SSR Pa07. M: marcador molecular de 50 pb; f: P. coccinea (genitor

feminino); m: P. hatschbachii (genitor masculino); 1: P. ‘Vivis e 2: P. ‘Jhovi’.

3.3 Análise citogenética meiótica e viabilidade do pólen

3.3.1 Citogenética convencional

Foi utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para observação do

número cromossômico, sendo verificado o número cromossômico 2n = 18 nos genitores

(Figura 3 A, B) e nos híbridos pertencentes aos grupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ (Figura 3

C, D).

59

Figura 3. Metáfases mitóticas de genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passilora

(2n = 18). (A) Passiflora coccinea; (B) P. hatschbachii; (C) P. ‘Vivis e (D) P. ‘Jhovi’.

Barra 10µm.

A meiose mostrou-se regular nos híbridos analisados dos grupos P. ‘Vivis’ e P.

‘Jhovi’ (Figura 4). Nas metáfases I e II os cromossomos encontravam-se dispostos na

placa equatorial (Figura 4B e F). Observou-se segregação regular em anáfase I e II

(Figura 4C e G). A constituição de quatro núcleos haploides na telófase II,

respectivamente (Figura 4D e H). Consequentemente, como houve meiose regular, foi

observado na grande maioria das células tétrades, produto pós-meiótico normal (Figura

4 I).

A viabilidade do pólen, utilizando a solução de Alexander, demonstrou grãos de

pólen viáveis na progênie híbrida F1 (Figura 4J), acima de 75%.

60

Figura 4. Comportamento meiótico regular em híbridos interespecíficos F1 obtidos do

cruzamento entre Passilora coccinea vs. P. hatschbachii (2n = 18) corados com carmim

acético 2%. (A-D) Meiose I: (A) Paquíteno; (B) Metáfase I; (C) Final de anáfase I; (D)

Telófase I. (E-H) Meiose II: (E) Prófase II; (F) Metáfase II; (G) Início da anáfase II; (H)

Telófase II. (I) Produto pós-meiótico regular (Tétrade). (J) Grão de pólen viável, corado

com a solução de Alexander. Barra 10µm

3.3.2 Hibridação Genomica In Situ (GISH)

Foi realizada a GISH nos híbridos HD25-101 e HD25-244, pertencentes aos

gupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, respectivamente, para identificação dos genomas dos

genitores na progênie híbrida F1. Foi possível a diferenciação genômica com a

utilização simultânea das sondas de ambos os genitores (Figura 4). Observaram-se nove

cromossomos com sinais de hibridação, de coloração vermelha correspondente ao

genoma de P. coccinea e os nove cromossomos hibridados correspondentes ao genoma

de P. hatschbachii, de coloração verde (Figura 4).

61

Figura 5. Hibridação Genômica In Situ (GISH) em metáfases mitóticas em híbridos

interespecíficos de Passilora (2n = 18). (A) Passiflora ‘Vivis; (B) P. ‘Jhovi’. Barra

10µm.

4 DISCUSSÃO

Através de cruzamentos artificiais foram desenvolvidos novos híbridos

interespecíficos de Passiflora: P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, os quais apresentam

características relevantes para serem utilizados no mercado ornamental. Flor de

coloração vermelha intensa; flores com maior período de abertura, aproximadamente

14h de duração; floração contínua, com maior florescimento entre os meses de outubro

a dezembro e a presença ou não de bandamento na corona, característica

particularmente importante a qual possibilitou a classificação da progênie híbrida em

dois grupos.

As espécies envolvidas no cruzamento interespecífico, P. coccinea e P.

hatschbachii, pertencem ao mesmo subgênero Passiflora e secção taxonômica

Granadillastrum. Portanto, elas são próximas a nível infragenérico, e consequentemente

apresenta o mesmo número cromossômico, fato que contribuiu para o sucesso da

hibridação. Desta forma, as barreiras de incompatibilidade entre espécies de Passiflora

não são consistentes fazendo com que sejam obtidos híbridos interespecíficos

(MELLETI, 2005). No estudo realizado com espécies comerciais e silvestres de

Passiflora foi verificada alta compatibilidade de algumas combinações híbridas sendo

promissoras para programas de melhoramento (OCAMPO et al., 2016).

62

O seguimento normal da meiose possibilita que gametas sejam viáveis resultando

em células pós-meióticas normais e, portanto, na fertilidade da planta (PAGLIARINI,

2000). Desta forma, o estudo detalhado do comportamento meiótico pelo conhecimento

do pareamento cromossômico, irregularidades meióticas e vibilidade dos gametas,

auxilia em programas de melhoramento de plantas quando se deseja realizar hibridações

inter e intraespecíficas (KIIHL et al., 2011; SOUZA et al., 2003).

O pareamento cromossômico é um dos eventos mais importantes da meiose, não

apenas pelo fato da recombinação, mas também para a segregação cromossômica

correta (FACHINETTO; TEDESCO, 2009), onde os cromossomos permanecem unidos

pelos quiasmas (pontos de recombinação) até o momento da anáfase I. Por outro lado,

um erro no pareamento dos cromossomos, pode levar a segregação irregular, com

desequilíbrio no número cromossômico e consequentemente resultará em gametas

desbalanceados com redução no número de gametas viáveis ou com a formação de

plantas aneuploides (SOUZA et al., 2003).

O conhecimento do pareamento cromossômico permite selecionar espécies que

são próximas geneticamente podendo auxiliar em cruzamentos interespecíficos

(TECHIO; DAVIDE, 2007). No caso de híbridos interespecíficos F1, durante a meiose

há a possibilidade de não haver pareamento entre os genomas, já que no núcleo da

célula possui genomas diferentes (genitor feminino e masculino), influenciando na

fertilidade do híbrido (BELO et al., 2018). Embora não tenha sido observado

pareamento dos cromossomos durante a diacinese, com base na anáfase I e II, onde

houve segregação dos cromossomos para os pólos da célula de forma normal e

observação de quatro núcleos haploides na telófase II, pode-se inferir que a meiose nos

híbridos é regular, uma vez que, foi verificado na maioria das células produtos pós-

meiótico regulares (tétrades) e como resultado grãos de pólen viáveis.

Em híbridos interespecíficos F1 obtidos do cruzamento entre Passiflora

sublanceolata (Killip) J. M. MacDougal vs. P. foetida var. foetida L. foi observado

comportamento meiótico regular, sendo que mais de 90% das células foram observados

bivalentes em diplóteno e diacinese e mais de 87% das células em anáfase I e II

apresentaram segregação normal (SANTOS et al., 2012). Os híbridos P. ‘Gabriela’ e P.

‘Bella’, obtidas do cruzamento entre P. gibertii N. E. Brown e P. gardineri Mast.,

também apresentaram meiose regular, com segregação normal em anafase I e II e

formação de quatro núcleos haploides na telófase II (BELO et al., 2018).

63

Por meio de cruzamentos interespecíficos já foram obtidos diversos híbridos

promissores para programas de melhoramento genético. As combinações entre espécies

P. caerulea, P. coccinea, P.galbana, P. glandulosa, P. mucronata, P. setacea com P.

alata e com P. edulis resultaram em híbridos com grande potencial (FALEIRO et al.,

2008). Os híbridos BRS Estrela-do-Cerrado (P. coccinea x P. setacea; FALEIRO et al.,

2007a), BRS Roseflora ([P. coccinea x P. setacea] x P. setacea; JUNQUEIRA et al.,

2007), BRS Rubiflora ([P. coccinea x P. setacea] x P. coccinea; FALEIRO et al.,

2007b), P. 'Alva', P. 'Priscilla' e P. 'Aninha' (SANTOS et al., 2012), P. ‘Gabriel’a e P.

‘Bella’ (BELO et al., 2018) foram produzidos no Brasil com finalidade ornamental. Tais

híbridos apresentam características interessantes e podem ser utilizados no mercado de

plantas ornamentais.

O marcador molecular SSR é uma ferramenta bastante utilizada em programas de

melhoramento de plantas quando se deseja confirmar hibridações. Este tipo de marcador

pode ser feito no estagio inicial da planta (FALEIRO et al., 2008), com base em bandas

informativas, excluído a hipótese da autofecundação (BELO et al., 2018). No presente

estudo, as bandas de 250pb e 260pb verificadas nos genitores P. coccinea e P.

hatschbachii, respectivamente, e sua segregação na progênie híbrida F1 possibilita a

confirmação da fecundação cruzada.

Geralmente, a amplificação de apenas um par de primers que revelem

polimorfismo já é suficiente para confirmar cruzamentos (FALEIRO et al., 2003). Isto

pode ser observado em híbridos interespecíficos de Passiflora com finalidade

ornamental, obtidos do cruzamento entre P. sublanceolata vs. P. foetida (SANTOS et

al., 2012) e P. gardneri vs. P. gibertii (BELO et al., 2018), os quais utilizaram o

marcador SSR e RAPD. Utilizando o marcador RAPD também foi possível a

confirmação de outros cruzamentos interespecíficos de Passiflora ornamental

(CONCEIÇÃO et al., 2011), assim como para a confirmação da paternidade em

híbridos interespecíficos de Passiflora visando resistência a doenças (JUNQUEIRA et

al., 2008). O uso de marcadores ISSR também tem sido utilizado na confirmação de

paternidade tanto em híbridos interespecíficos (COELHO et al., 2016) quanto em

híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2016), sendo este um marcador

eficiente neste processo.

A citogenética molecular baseada na GISH tem sido uma ferramenta bastante

eficiente na confirmação da hibridação cruzada (SILVA e SOUZA 2013). Sendo assim,

utilizou-se a GISH para identificação dos genomas dos genitores na progênie híbrida F1.

64

Verificou-se o status híbrido destes indivíduos com base na visualização de nove

cromossomos de P. coccinea detectados de vermelho (anti-digoxigenina-rodamina) e

nove cromossomos de P. hatschbachii detectados de verde (avidina-FITC) no genoma

das plantas híbridas.

Embora a aplicação da GISH tenha sido recentemente aplicada no estudo e

identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora, os trabalhos envolvendo estas

espécies evidenciam que esta técnica tem sido bastante eficiente e segura (SILVA;

SOUZA 2013; MELO et al., 2016). No cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, a

GISH permitiu a diferenciação do conjunto de cromossomos dos genitores no genoma

das plantas híbridas, confirmando o caráter híbrido em todas as plantas desta progênie

(SILVA et al., 2017 in press). Em espécies de Passiflora com potencial ornamental, a

GISH confirmou a natureza híbrida nas plantas retrocruzadas, além de permitir

visualizar recombinação na maior parte do germoplasma RC1 (MELO et al., 2016). A

GISH também tem sido uma ferramenta útil para identificação de híbridos

interespecíficos de P. edulis vs. P. cincinnata, confirmando a origem genética do

híbrido produzido (COELHO et al., 2016).

5 CONCLUSÕES

Considerando a beleza das flores de Passiflora ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ produzidos a

partir do cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii, esses híbridos possuem

potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre pérgulas ou serem

cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes.

Sendo a meiose um evento que está relacionado à fertilidade da planta, neste

estudo, o comportamento meiótico da progênie F1 é regular, o que aponta

compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente híbridos férteis.

O marcador molecular SSR Pa07 e a GISH confirmaram a natureza híbrida das

plantas, sendo duas ferramentas moleculares confiáveis e seguras no processo de

identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora, caracterizando-se como

ferramentas importante em programas de melhoramento genético.

65

6 AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela concessão da bolsa e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo

apoio financeiro à pesquisa. À professora Dra. Ioná Santos Araújo, professora Dra.

Simone Alves, ao doutorando Helison e pela disponibilidade em nos auxiliar nas

análises de eletroforese com gel de poliacrilamida. Ao doutorando em Produção Vegetal

Joedson Pinto Barroso e aos mestrandos em Produção Vegetal e Genética, Aline Pinto e

Jonathan Morales, respectivamente pelo auxílio nas avaliações morfológicas das

plantas.

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70

CAPÍTULO 3

ESTIMATIVA DE PARÂMETROS GENÉTICOS EM HÍBRIDOS

INTERESPECÍFICOS F1 de Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) PARA

ORNAMENTAÇÃO

RESUMO

A estimativa dos parâmetros genéticos em populações baseando-se em caracteres

fenotípicos são importantes para inferir sobre a variabilidade genética e o valor de

expressão fenotípica e seu potencial de melhoramento de espécies de Passiflora. O

objetivo deste estudo foi caracterizar genitores e híbridos F1 obtidos do cruzamento

entre Passiflora coccinea Aubl. (♀) vs. Passiflora hatschbachii Cervi (♂), com base em

descritores morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida

visando o uso ornamental. Em adição, foi realizado a confirmação da fecundação

cruzada utilizando marcadores microssatélites (SSR). A estimativa dos parâmetros

genéticos foi realizada nos genitores e em 117 híbridos F1 no primeiro período de

avaliação e 107 híbridos F1 no segundo período, com base em características

quantitativas florais e vegetativas. O marcador molecular microssatélite permitiu a

confirmação do status híbrido F1, utilizando apenas um par de primer Pa07. Observou-

se variabilidade para o formato e tamanho dos descritores morfológicos na população

híbrida. O agrupamento de Scott-Knott mostrou que a maioria das características dos

genótipos apresentaram valores médios intermediários aos dos genitores, no entanto,

alguns híbridos apresentaram valores superiores aos genitores para o tamanho dos

primeiros filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da corona, evidenciando

heterobeltiose. De modo geral, as características florais apresentaram maiores valores de

herdabilidade que as características vegetativas. A variabilidade genética identificada

nas progênies, estimada com base em características morfológicas e parâmetros

genéticos, evidencia o potencial destes genótipos para serem utilizados na

ornamentação. Os maiores valores de herdabilidade para as caracerísticas florais

diâmetro da flor, largura de pétala, comprimento e largura de sépala e tamanho da

primeira série da corona possibilita a obtenção de ganhos e a seleção genótipos para uso

ornamental.

Palavras-chave: Caracterização morfológica, cruzamentos interespecíficos,

variabilidade genética, melhoramento de plantas ornamentais.

71

GENETIC PARAMETERS ESTIMATION IN INTERPROTECTED HYBRIDS

F1 by Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) FOR ORNAMENTATION

ABSTRACT

The estimation of genetic parameters in populations based on phenotypic characters is

important to infer about the genetic variability and the value of phenotypic expression

and its potential for improvement of Passiflora species. The objective of this study was

to characterize F1 parents and hybrids obtained from the cross between Passiflora

coccinea Aubl. (♀) vs. Passiflora hatschbachii Cervi (♂), based on morphological

descriptors, as well as to estimate genetic parameters of the hybrid progeny aiming the

improvement for the ornamental use. In addition, cross-fertilization was confirmed

using microsatellite markers (SSR). The genetic parameters were estimated in the

parents and in 117 hybrids F1 in the first evaluation period and 107 hybrids F1 in the

second period, based on quantitative floristic and vegetative characteristics. The

microsatellite molecular marker allowed the confirmation of hybrid F1 status using only

a pair of first Pa07. Variability was observed for the shape and size of the

morphological descriptors in the hybrid population. Scott-Knott's group showed that

most of the characteristics of the genotypes presented average values intermediate to

those of the parents, however, some hybrids presented values superior to the parents for

the size of the first corona filaments, bract width and corona diameter, evidencing

heterobeltiois. In general, the floral characteristics showed higher values of heritability

than the vegetative characteristics. The genetic variability identified in the progenies,

estimated on the basis of morphological characteristics and genetic parameters, shows

the potential of these genotypes to be used in ornamentation. The highest values of

heritability for the floral characteristics flower diameter, petal width, length and width

of sepal and size of the first crown series makes it possible to obtain gains and to select

genotypes for ornamental use.

Keywords: Morphological characterization, interspecific crosses, genetic variability,

ornamental plant breeding.

72

1 INTRODUÇÃO

A família Passifloraceae apresenta ampla distribuição geográfica em regiões

tropicais e subtropicais, encontrada nas Américas, África e Ásia (ULMER;

MACDOUGAL, 2004), sendo o Brasil um importante centro de diversidade com o

registro de quatro gêneros: Ancistrothrysus Harms, Mitostemma Mast., Dilkea Mast. e

Passiflora L. (BERNACCI et al., 2013a). O gênero Passiflora é considerado o mais

representativo em número e diversidade de espécies (BERNACCI et al., 2013b) com

recurso genético aplicável a diversos fins, servindo também como fonte de

germoplasma para o melhoramento genético.

Às espécies de Passiflora é atribuído o valor ornamental devido à beleza peculiar

das suas flores em formas e cores, principalmente a presença da corona, característica

única ao gênero, além da produção de flores ao longo do ano e com variabilidade na

folhagem (ABREU et al., 2009). Desta forma, as espécies de Passiflora apresentam

características que a favorecem a ornamentação, direcionando espécies e híbridos a

programas de melhoramento de passifloras ornamentais. O fato das passifloras serem

alógamas torna-se viáveis métodos de melhoramento que envolvem cruzamentos

interespecíficos para obtenção de híbridos heteróticos (ABREU et al., 2009;

VANDERPLANK, 2000).

Em alguns países europeus que tem a cultura do uso ornamental das passifloras, a

aplicação das hibridações interespecíficas tem contribuído para melhorar caracteres de

interesse, expandindo desta forma o interesse de produtores no uso destes híbridos na

decoração de ambientes, seja em parque, jardins ou na decoração de interiores

(FEUILLET et al., 2000; PEIXOTO, 2005; VANDERPLANK et al., 2003). Entretanto,

no Brasil esta prática é quase inexistente, sendo necessários estudos envolvendo a

melhoria destes caracteres, principalmente relacionados ao porte da planta, coloração,

tamanho e formas foliares, além de períodos mais longos de abertura da flor.

Aliado a necessidade do conhecimento da influencia ambiental na expressão das

caracteristicas genéticas associadas a descritores florais e vegetativos, tem-se à

estimativa de parâmetros genéticos como uma análise importante que pode auxiliar na

indicação de métodos de melhoramento favoráveis para selecionar genótipos superiores

(CRUZ; CARNEIRO, 2006). Apesar dos parâmetros genéticos proporcionarem essa

informação, dando suporte aos melhoristas, estudos envolvendo o melhoramento de

passifloras ornamentais ainda são poucos relatados, requerendo esforços para a

73

ampliação deste tipo de pesquisa em nosso país. Em híbridos interespecíficos F1

ornamentais foram realizadas caracterizações morfológicas para a estimativa de

parâmetros genéticos, onde foi verificada na progênie híbrida o potencial de

variabilidade e expressão das caracteristicas adequadas aos programas de melhoramento

de passifloras ornamentais (SANTOS et al., 2011). A caracterização de progênies da

primeira geração de retrocruzamento foi estimada por parâmetros genéticos visando o

melhoramento de híbridos retrocruzados de passifloras para fins ornamentais (MELO et

al., 2016).

Uma etapa importante após a obtenção da progênie híbrida, é a confirmação da

fecundação cruzada, que pode ser realizada utilizando técnicas mais simples, como

características morfológicas (OLIVEIRA et al., 2005), bem como técnicas moleculares,

baseada em reação em cadeia da polimerase (PCR), que tem se mostrado bastante

eficiente na identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora (BELO et al., 2018;

MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2012), bem como em outras culturas (AHMED et

al., 2013; DIMITRIJEVIC et al., 2010). Os marcadores moleculares microssatélites SSR

(Simple Sequence Repeats) requerem conhecimento de sequências para a construção de

primers específicos. Em híbridos de Passiflora para o procedimento desta técnica é

necessário a transferibilidade de primers SSR, uma vez que não existe primers SSR

desenhados para todas as espécies de Passiflora. Já foram desenvolvidos primers para

algumas espécies de Passiflora, P. edulis Sims (OLIVEIRA et al., 2005; 2008), P.

setacea D.C. (CERQUEIRA-SILVA) e P. alata Curtis (PÁDUA et al. 2005).

Este trabalho objetivou a caracterização de genitores e seus híbridos F1 obtidos

pelo cruzamento entre P. coccinea Aubl. e P. hatschbachii Cervi, com base em

descritores morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida

visando o uso destes híbridos para ornamentação. Em adição objetivou-se a confirmação

da fecundação cruzada utilizando marcadores moleculares SSR.


2.1 Material vegetal e condução do experimento

Utilizou-se neste estudo híbridos interespecificos F1 denominados de HD25,

oriundas do cruzamento entre Passiflora coccinea (♀) vs. Passiflora hatschbachii (♂),

sendo realizados os cruzamentos em casa de vegetação localizada na Universidade

74

Estadual de Santa Cruz - UESC (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m). As espécies

genitoras Passiflora coccinea e P. hatschbachii foram selecionadas neste estudo pelo

fato de apresentarem características de interesse ornamental. P. coccinea apresenta

florescimento abundante ao longo do ano, flores de coloração marcante e atrativa

(vermelha) e possui antese diurna. Além destas características, esta espécie é resistente à

virose nas folhas e antracnose nos frutos e ramos (JUNQUEIRA et al., 2005),

favorecendo a sua utilização em programas de melhoramento de plantas. Enquanto que

P. hatschbachii possui flores de coloração branca e antese noturna. Desta forma,

pretende-se obter um híbrido com potencial ornamental, cujo florescimento ocorra o ano

inteiro, com flores de coloração intensa e atrativa e que permaneçam abertas por maior

período de tempo.

O experimento foi conduzido em blocos casualizados, com três repetições para as

plantas genitoras e cada um dos genótipos híbridos, em unidade experimental no

campus da UESC, sendo realizadas avaliações em dois períodos, com intervalo de seis

meses. Os dados da primeira avaliação foram obtidos durante três meses (novembro de

2016 a janeiro de 2017) e da segunda avaliação durante quatro meses (julho de 2017 a

outubro de 2017).

Propagou-se por estaquia os genitores e os genótipos híbridos a partir das plantas

matrizes, sendo retiradas da parte intermediária dos ramos, preparadas e padronizadas

com dois nós e duas folhas reduzidas à metade de sua área, seccionadas em bisel e

imersas em auxina sintética (ácido indol-3 butírico – AIB) em forma de pó inerte. As

estacas foram adicionadas em sacos preto de polietileno, com capacidade de 1,5 L,

contendo areia lavada para posterior enraizamento, as quais foram irrigadas diariamente

durante esse período. Após dois meses e meio, quando as plantas atingiram

aproximadamente 1m de altura, foram transplantadas para vasos plásticos com

capacidade de 25 L, contendo solo, e transferidas para a área experimental.

Os genótipos foram conduzidos em sistema de espaldeira vertical, com mourões

de 2,5 m de altura e fio de arame 1,8 m do solo. Utilizou-se o espaçamento de um metro

entre plantas e dois metros entre fileiras. A poda foi realizada mensalmente e a

adubação a cada 15 dias, de acordo com a análise do solo: 38,33 mg de MAP

purificado, 45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses e após

esse período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de potássio,

99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.

75

2.2 Análise das características morfológicas quantitativas

Foram avaliadas 18 características quantitativas, as quais estão apresentadas na

tabela 1. Estas características foram incluídas nas análises de acordo com descritores

oficiais de Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns ausentes na lista, com base no

manual prático da EMBRAPA (JESUS et al., 2015). Os dados foram obtidos com

auxílio de paquímetro digital e régua graduada.

Tabela 1. Descritores morfológicos quantitativos avaliados em genitores e híbridos F1

de Passiflora. Características Quantitativas Sigla

Diâmetro da flor (DF)

Diâmetro da corona (DCO)

Largura da pétala (LPE)

Comprimento da pétala (CPE)

Largura da sépala (LSE)

Comprimento da sépala (CSE)

Largura da bráctea (LBR)

Comprimento da bráctea (CBR)

Tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1)

Tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2)

Comprimento do pedúnculo floral (CPED)

Comprimento do androginóforo (CA)

Comprimento de folha (CF)

Largura de folha (LF)

Área foliar (AF)

Diâmetro do caule (DC)

Comprimento do entrenó do ramo principal (CEN)

Número de glândulas no pecíolo (NGP)

2.3 Extração de DNA e confirmação da hibridação via marcador molecular

Para a confirmação da fecundação cruzada, o procedimento realizado para

extração de DNA e obtenção dos marcadores moleculares SSR foi idêntico ao capítulo

2.

2.4 Análise estatística

Após a tomada de dados referente à morfologia das plantas, os dados foram

submetidos à análise de variância com o auxílio do programa Genes (CRUZ, 2006) e as

médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott (P<0,05). Os parâmetros genéticos

foram estimados com base no esquema de análise de variância seguindo o modelo

estatístico (Tabela 3): YiJ= μ + gi + Bj + eij, em que:

76

Үij: onde i é o i-ésimo genótipo da j - ésima repetição;

μ: média geral do ensaio;

gi: efeito do genótipo i (i = 1,2,... g), (NID, 0, σ2g );

bj: efeito do bloco j (j= 1, 2....r), (NID, 0, σ2b);

εij: erro experimental ou resíduo, (NID, 0, σ2) .

Tabela 3. Modelo genético-estatístico com as esperanças dos quadrados médios

utilizados na análise de variância das características morfológicas dos genitores e

híbridos F1. FV GL QM E(QM)

Bloco r - 1 QMB σ2 + gσ2b

Genótipo g - 1 QMG σ2 + bσ2g

Resíduo (g – 1) (b – 1) QMR σ2

Total gb - 1

Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), esperança do quadrado médio

[E(QM)], número de repetições (blocos) (r), número de genótipos (g), componente da variabilidade

genotípica (σ2g), componente de variância residual (σ2)

Foram obtidas as estimativas de esperança do quadrado médio, a partir da análise

de variância de cada característica, sendo estimados os seguintes parâmetros:

1) Variância ambiental ( ):

2) Variância fenotípica ( ):

3) Variância genotípica ( ):

4) Coeficiente de variação genotípica ( ):

77

5) Coeficiente de variação experimental ( ):

6) Índice de variação ( ):

7) Herdabilidade ( ):

3 RESULTADOS

3.1 Obtenção da progênie híbrida

O cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatshibachii foi bem sucedido, havendo

produção de fruto, os quais resultaram em sementes viáveis (248 sementes). Foram

obtidas 117 plantas híbridas com hábito de crescimento herbáceo, sendo trepadeiras de

médio porte. Os genótipos híbridos apresentaram variabilidade em formatos e tamanho

para as características morfológicas (Figura 1). Observou-se nas flores de alguns

híbridos bandamento no primeiro filamento da corona (Figura 1D) e variação no seu

tamanho (Figura 1 E-F). Os genótipos híbridos apresentaram antese diurna, com

abertura da flor às 8h00 e fechamento por volta das 22h00.

No primeiro período foram avaliados 119 genótipos, sendo um genótipo de P.

coccinea (genitor feminino), um genótipo de P. hatshibachii (genitor masculino) e 117

híbridos. No segundo período foram avaliados 109 genótipos, os genitores mais os 107

genótipos híbridos. O número de genótipos híbridos foi reduzido no segundo período,

pois 10 híbridos (HD25 122, HD25 135, HD25 136, HD25 139, HD25 142, HD25 143,

HD25 197, HD25 201, HD25 208, HD25 238) não floresceram, impossibilitando as

avaliações.

78

Figura 1. Flores dos genitores e híbridos HD25: (A) Passiflora coccinea; (B) P.

hatschbachii; (C - F) Flores dos híbridos. Folha dos genitores e híbridos HD25:

(G) P. coccinea; (H - K) Folhas dos híbridos; (L) P. hatschbachii.


O marcador molecular SSR foi eficiente na confirmação da fecundação cruzada,

permitindo a identificação dos 117 híbridos interespecíficos obtidas do cruzamento

entre P. coccinea vs. P. hatschbachii (Figura 2). Foi realizada a transferibilidade de

primers SSR já desenvolvidos para as espécies P. alata (PÁDUA et al., 2005) e P.

edulis f. flavicarpa Deg. (OLIVEIRA et al., 2005; OLIVEIRA, 2008). 14 primers foram

79

usados para verificar a segregação de alelos, dos quais 11 foram desenvolvidos para P.

edulis f. flavicarpa e três para P. alata. Contudo, apenas o primer Pa07 (R:

CGGCATACGATAAATCTCCTG; F: CACATTTGCCGTCACTGG), desenvolvido

para P. alata e transferidos para os genótipos em estudo, evidenciou locus polimórfico

para a confirmação do caráter híbrido, cuja banda informativa do genitor masculino foi

verificada em todos os híbridos (Figura 2). Vale ressaltar que apenas um par de primer

foi suficiente para a identificação do caráter heterozigoto nos híbridos F1.

Figura 2. Confirmação da fecundação cruzada em gel de poliacrilamida 6% corado com

prata referente aos produtos amplificados pelo primer SSR Pa07 nos genitores

Passiflora coccinea e P. hatschbachii; e nos 117 híbridos HD25 F1: (A) 33 híbridos, (B)

41 híbridos e (C) 43 híbridos.

3.3 Análises das características morfológicas quantitativas

Através da análise de variância, realizada para as características quantitativas nos

dois períodos de avaliação, foi observado diferença significativa (P<0,05) entre ambos

os períodos para todas as características morfológicas, exceto para comprimento de

sépala (CSE), a qual não apresentou significância pelo teste F (Tabela 4). Foi verificada

também diferença significativa (P<0,05) entre os genótipos para todas as características,

com exceção para comprimento de folha (CF) (Tabela 4).

A análise de variância foi realizada para as características morfológicas

separadamente para cada período de avaliação após a observação da existência de

diferença significativa entre os períodos de avaliação (Tabelas 7 e 8).

80

No primeiro período de avaliação, através do teste de comparação de médias

Scott-Knott (P<0,05) verificou-se diferença entre os genótipos para todas as

características, exceto para as características vegetativas, largura (LF) e comprimento de

folha (CF), área foliar (AF) e diâmetro do caule (DC), cujos genitores e genótipos

híbridos apresentaram-se todos no mesmo grupo (a) (Tabela 5). Para as demais

características foi observado variação na formação de grupos. As características

vegetativas, comprimento de entrenó (CEN) apresentou dois grupos de distribuição e

número de glândulas no pecíolo (NGP), três grupos. Com relação às características

florais, diâmetro da corona (DCO), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2) e

comprimento do androginóforo (CA) apresentaram três grupos; largura de bráctea

(LBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1) e comprimento do

pedúnculo floral (CPED), quatro grupos; diâmetro da flor (DF), comprimento de pétala

e largura de sépala (CPE e CSE), cinco grupos; comprimento de sépala (CSE) e

comprimento de bráctea (CBR), seis grupos e largura de pétala (LPE), sete grupos

(Tabela 5). Desta forma, a maior formação de grupos foi verificada para as

características CSE, CBR e LSE, enquanto que o menor número de grupos formado foi

observado para DC, TF2 e CA (Tabela 5).

Os genótipos híbridos apresentaram valores intermediários entre as médias dos

genitores para a característica vegetativa NGP. Em relação ao CEN, a maior média foi

obtida para o genitor masculino, enquanto que a média do genitor feminino e dos

genótipos híbridos não apresentaram diferenças, sendo todos dispostos no mesmo grupo

(b) (Tabela 5).

Para as características florais, nove genótipos híbridos apresentaram valores

superiores aos genitores para LBR (HD25 111, HD25 169, HD25 171, HD25 191,

HD25 193, HD25 214, HD25 221, HD25 235 e HD25 246) e TF1 (HD25 112, HD25

143, HD25 193, HD25 197, HD25 203, HD25 212, HD25 218, HD25 235 e HD25 246),

evidenciando heterose (Tabela 5). Observou-se também híbridos que apresentaram

valores intermediários entre as médias dos genitores para as características DF e DCO,

LPE, CPE, LSE, CSE, CA (Tabela 5).

Através do teste de comparação de médias Scott-Knott (P<0,05), no segundo

período de avaliação, foram observadas as diferenças entre os genótipos para todas as

características, exceto para as características vegetativas CF, LF e AF e para a

característica floral LS, com formação de apenas um grupo (a) incluindo os genitores e

os híbridos (Tabela 6). Com relação às características vegetativas o CEN apresentou

81

dois grupos de distribuição, enquanto que DC e NGP apresentaram três grupos (Tabela

6).

As características florais DCO, LBR, TF1 aprsentaram dois grupos. Foi formado

três grupos paras DF, CSE, CBR, TF2, CPED e CA. Quatro e cinco grupos foram

formadas para as características LPE e CPE, respectivamente (Tabela 6). Nesse sentido,

constatou-se que a maior formação de grupos foi para CPE e menor número de grupos

formados para DCO, LBR e TF1.

O agrupamento revelou que as médias das características morfológicas NGP,

LPE, CPE, CBR e CPED possuem valores intermediários entre as médias dos genitores

(Tabela 6). Os híbridos apresentaram valores superiores que a média dos pais para as

características DCO, LBR e TF1, sendo estas duas últimas também observadas nos

híbidos no primeiro período de avaliação. Os maiores valores médios obtidos para as

características DC, CEN, NGP e CPED foram verificados no genitor masculino,

enquanto que as características DF, CSE e TF2 foram observados para o genitor

feminino.

82

Tabela 4. Características morfológicas florias e vegetativas de genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora avaliados em dois períodos.

FV GL

QM

DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP

Período 1 2,93** 1,44* 0,40** 0,30* 0,07** 0,02NS 6,94** 10,59** 3,45** 0,33** 138,18** 3,59** 169,87** 700,97** 24927,28** 58,31** 77,71** 0,57**

Bloco 2 1,48NS 0,25NS 0,00NS 0,11NS 0,00NS 0,16NS 0,09NS 0,31NS 0,05NS 0,00NS 2,47 NS 0,00NS 33,65** 3,49 NS 1544,52** 0,83** 1,32 NS 0,34 NS

Genótipo 108 1,62** 0,85** 0,02** 0,38** 0,03** 0,38** 0,16** 0,52** 0,12** 0,04** 11,10** 0,11** 4,77 NS 5,79** 463,24** 0,35** 2,73** 0,42**

Resíduo 544 0,26 0,28 0,00 0,05 0,00 0,05 0,05 0,11 0,03 0,00 2,74 0,02 4,90 3,37 279,40 0,14 1,07 0,13

Total 656

CV (%) 5,33 12,79 6,14 5,37 8,55 5,40 14,07 11,22 7,40 13,85 19,02 8,89 19,44 18,36 28,21 35,28 28,50 17,25

Média 9,66 4,14 0,99 4,33 1,07 4,36 1,69 3,05 2,67 0,55 8,71 1,90 11,39 10,00 59,25 1,07 3,64 2,14

Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da

sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos

da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule

(DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). ** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo

83

Tabela 5. Análise das características vegetativas e florais com valores médio em cm, exceto AF (cm2), em genitores e híbridos de Passiflora avaliadas

no primeiro período. Genitor/Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA

P. coccinea 1 11,09a 6,94a 78,70a 1,05a 4,30b 2,00c 13,33a 3,83b 1,27a 6,03a 1,47a 6,13a 1,43c 4,53a 2,13d 1,33a 3,80d 2,90a

P. hatschbachii 2 11,92a 13,74a 95,55a 1,53a 8,70a 4,00a 8,77d 4,77a 0,80f 3,73e 0,87e 3,80f 0,87d 1,90f 2,43c 0,33c 15,90a 2,30b

HD25 101 3 12,62a 12,93a 81,93a 0,70a 2,53b 2,00c 9,40c 4,00b 1,00d 4,30d 1,10d 4,30e 1,60b 2,90 2,30d 0,50c 7,10d 2,00c

HD25 102 4 12,18a 11,61a 62,09a 0,78a 2,87b 2,00c 9,70c 3,57c 0,93e 4,73c 1,17c 4,70d 1,73b 3,00d 2,80b 0,53c 7,93d 2,13b

HD25 103 5 12,38a 9,91a 60,34a 0,47a 2,57b 2,00c 9,67c 4,07b 0,83f 4,33d 1,03e 4,13f 1,70b 2,77c 2,77b 0,60b 7,23d 2,20b

HD25 104 6 12,28a 10,80a 76,48a 0,62a 3,13b 2,00c 10,00b 3,60c 1,00d 4,50c 1,10d 4,67d 1,57c 2,47d 2,27d 0,50c 9,30c 2,10b

HD25 105 7 11,87a 11,60a 69,94a 0,71a 2,43b 2,00c 9,60c 3,87b 1,00d 4,37d 1,17c 4,40e 1,30c 2,60e 2,57c 0,67b 7,20d 1,97c

HD25 106 8 12,07a 12,56a 72,52a 0,75a 2,73b 2,00c 9,50c 4,40a 1,00d 4,20d 1,20c 4,20f 1,70b 3,20d 2,70b 0,50c 9,10c 1,90c

HD25 107 9 10,53a 11,29a 54,65a 0,63a 3,20b 2,00c 10,40b 4,60a 1,00d 4,50c 1,10d 4,70d 1,50c 3,10c 2,60b 0,60b 8,50d 2,00c

HD25 109 10 12,39a 11,30a 47,46a 0,81a 3,37b 2,00c 9,30c 4,53a 1,00d 4,23d 1,00e 4,30e 1,80b 3,00c 2,43c 0,50c 8,93c 1,90c

HD25 110 11 11,83a 10,93a 65,60a 0,80a 4,33b 2,00c 9,53c 5,03a 0,87e 4,27d 1,07e 4,33e 1,67b 2,67c 2,73b 0,57b 8,20d 2,07b

HD25 111 12 11,53a 10,85a 53,43a 0,69a 2,60b 2,00c 9,50c 4,60a 1,00d 4,30d 1,10d 4,20f 2,10a 3,00d 2,70b 0,50c 7,60d 2,10b

HD25 112 13 11,26a 11,53a 66,51a 2,61a 3,53b 2,00c 9,67c 4,10b 0,93e 4,53c 1,03e 4,53d 1,73b 2,77c 2,93a 0,57b 7,97d 1,97c

HD25 114 14 10,68a 9,81a 46,49a 0,69a 2,73b 2,00c 9,63c 4,43a 1,00d 4,37d 1,03e 4,33e 1,60b 2,13d 2,70b 0,47c 9,23c 2,03b

HD25 115 15 12,03a 9,37a 78,76a 0,79a 2,27b 2,00c 9,57c 3,67b 0,87e 4,30d 1,00e 4,43e 1,73b 3,40f 2,17d 0,53c 8,57d 1,87d

HD25 116 16 11,20a 9,41a 68,36a 0,58a 3,07b 2,00c 9,87c 3,37c 0,90e 5,00b 1,07e 4,70d 1,60b 2,93c 2,70b 0,63b 9,13c 1,97c

HD25 117 17 11,51a 10,78a 50,79a 0,74a 3,37b 2,00c 9,50c 2,50c 0,70g 4,70c 1,00e 4,80c 1,00d 2,20d 2,60b 0,50c 6,00d 2,00c

HD25 118 18 11,58a 11,00a 67,66a 0,79a 2,70b 2,00c 10,00b 3,50c 0,90e 4,40d 1,10d 4,40e 1,70b 3,20f 2,50c 0,60b 14,20b 1,60d

HD25 119 19 12,38a 11,56a 61,86a 0,87a 2,57b 2,00c 9,73c 4,33a 0,97d 4,33d 1,07e 4,47e 1,63b 2,93c 2,43c 0,50c 7,97d 1,97c

HD25 120 20 10,68a 8,52a 62,37a 0,60a 2,37b 2,00c 9,80c 4,10b 1,00d 4,50c 1,10d 4,20f 1,90a 2,90d 2,60b 0,60b 10,10c 1,90c

HD25 122 21 10,94a 8,91a 65,33a 0,68a 3,80b 2,00c 9,00d 4,27a 1,03d 4,23d 1,17c 4,17f 1,63b 2,90d 2,53c 0,53c 7,13d 2,03b

HD25 124 22 10,58a 10,11a 47,72a 0,82a 3,13b 2,00c 9,33c 3,83b 1,03d 4,23d 1,07e 4,30e 1,70b 2,67d 2,47c 0,53c 7,67d 2,10b

HD25 125 23 11,81a 12,31a 55,83a 0,60a 2,60b 2,00c 10,30b 4,43a 1,03d 4,50c 1,13d 4,43e 1,60b 2,70d 2,40c 0,53c 8,60d 1,90c

HD25 126 24 13,14a 12,23a 69,91a 0,65a 7,20b 2,00c 9,07d 3,50c 1,07c 4,07e 1,00e 4,00f 1,57c 2,77d 2,47c 0,50c 7,27d 1,77d

HD25 127 25 10,13a 10,84a 56,13a 0,58a 3,83b 3,00b 9,00d 4,27a 0,97d 4,10e 1,10d 4,27e 1,00d 2,57d 2,80b 0,37c 10,17c 2,10b

HD25 128 26 11,09a 8,89a 56,26a 0,74a 3,47b 3,00b 9,50c 4,03b 1,00d 4,30d 1,00e 4,40e 1,70b 2,63d 2,70b 0,60b 6,10d 1,97c

HD25 129 27 11,72a 12,41a 66,38a 0,70a 2,90b 2,00c 9,47c 4,07b 1,00d 4,40d 1,00e 4,37e 1,67b 2,87d 2,57c 0,50c 8,37d 1,90c

HD25 130 28 13,19a 12,74a 67,14a 0,84a 2,87b 2,00c 9,00d 3,60c 0,93e 4,10e 1,03e 4,13f 1,40c 3,10c 2,53c 0,50c 6,57d 1,67d

HD25 131 29 12,60a 12,68a 85,84a 0,78a 3,20b 2,00c 10,03d 3,90b 1,00d 4,43d 1,10d 4,53d 1,80b 3,23c 2,57c 0,47c 7,47d 1,70d

HD25 132 30 25,06a 10,49a 63,33a 0,80a 3,67b 2,00c 9,63c 3,80b 0,90e 4,43d 1,10d 4,53d 1,50c 3,00c 2,60b 0,53c 7,30d 1,90c

HD25 133 31 11,84a 11,24a 65,39a 0,68a 3,67b 2,00c 10,70b 4,70a 1,00d 5,00b 1,10d 5,20b 1,50c 3,20c 2,80b 0,50c 10,00c 2,20b

HD25 135 32 12,23a 11,09a 68,59a 0,88a 3,47b 2,00c 9,77c 4,37a 0,93e 4,30d 1,00e 4,37e 1,50c 2,80d 2,63b 0,47c 8,53d 1,83d

84

Tabela 5. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA

HD25 136 33 12,53a 12,34a 77,28a 0,91a 2,30b 2,00c 10,50b 3,77b 0,97d 4,70c 1,00e 4,67d 1,50c 2,40e 2,50c 0,57c 10,00c 2,10b

HD25 138 34 11,77a 10,51a 78,10a 0,72a 2,50b 2,00c 10,60b 4,77a 0,97d 4,60c 1,10d 4,63d 1,43c 2,83d 2,77b 0,53b 10,40c 1,97c

HD25 139 35 12,12a 10,61a 59,43a 0,81a 3,67b 2,00c 9,10d 4,43a 0,90e 4,00e 1,00e 4,13f 1,33c 2,60d 2,63b 0,47c 7,90d 1,80d

HD25 140 36 10,66a 8,11a 60,26a 0,63a 2,67b 2,00c 10,17b 3,30c 0,97d 4,57c 1,00e 4,57d 1,77b 2,77d 2,47c 0,53c 8,83c 2,00c

HD25 141 37 12,76a 11,12a 75,09a 0,84a 3,30b 2,00c 9,77c 4,37a 1,00d 4,50c 1,00e 4,43e 1,50c 2,60d 2,50c 0,57b 8,60d 1,90c

HD25 142 38 11,29a 10,94a 70,31a 0,80a 3,07b 2,00c 10,10b 4,00b 0,90e 4,30d 1,00e 4,50d 1,40c 2,70d 2,70b 0,50c 8,40d 2,00c

HD25 143 39 11,08a 9,63a 59,79a 0,81a 2,27b 2,00b 9,30c 4,27a 0,90e 4,17e 1,07e 4,20f 1,47c 2,37e 2,90a 0,50c 6,67d 2,13b

HD25 144 40 12,48a 10,97a 58,13a 0,72a 3,77b 2,00c 9,23d 3,13c 0,90e 4,17e 1,07e 4,30e 1,30c 2,93d 2,47c 0,47c 8,40d 1,77d

HD25 146 41 12,16a 11,77a 67,18a 0,67a 3,47b 2,00c 10,23b 5,03a 1,03d 4,40d 1,13d 4,53d 1,80b 3,87b 2,60b 0,57b 8,83c 2,03b

HD25 147 42 12,14a 11,39a 90,85a 0,74a 2,07b 2,00c 8,90d 3,60c 1,10c 4,00e 1,10d 4,10f 1,40c 2,80d 2,50c 0,50c 13,50b 1,80d

HD25 148 43 12,58a 11,21a 71,77a 0,76a 3,27b 3,00c 8,67d 3,27c 0,87e 4,10e 0,90e 3,93f 1,20d 2,00f 2,50c 0,53c 6,70d 1,90c

HD25 150 44 11,53a 10,46a 64,40a 0,83a 2,97b 2,00c 9,83c 3,50c 1,00d 4,50c 1,00e 4,40e 1,57c 2,70d 2,53c 0,50c 6,83d 1,80d

HD25 151 45 13,69a 13,03a 74,63a 0,75a 3,17b 2,00c 9,53c 4,33a 1,03d 4,43d 1,23c 4,47e 1,57c 3,03c 2,70b 0,53c 7,60d 2,07b

HD25 152 46 12,16a 9,71a 60,56a 0,69a 3,37b 2,00c 9,73c 3,27c 0,97d 4,40d 1,10d 4,47e 1,70b 2,67d 2,67b 0,57b 8,03d 1,87d

HD25 153 47 12,47a 11,99a 80,87a 0,65a 3,40b 2,00c 9,40c 4,13a 0,93e 4,33d 1,07e 4,27e 1,53c 2,73d 2,60b 0,43c 8,17d 1,83d

HD25 154 48 11,82a 10,71a 70,37a 0,65a 2,07b 2,00c 9,67c 4,80a 1,00d 4,53c 1,07e 4,43e 1,77b 3,10c 2,63b 0,57b 6,70d 2,00c

HD25 156 49 11,11a 9,28a 65,87a 0,65a 3,00b 2,00c 9,77c 3,57c 1,00d 4,27d 1,10d 4,37e 1,47c 3,20c 2,40c 0,57b 7,60d 1,87d

HD25 157 50 12,71a 10,97a 68,29a 0,80a 3,03b 2,00c 9,70c 4,23a 0,97d 4,63c 1,00e 4,60d 1,67b 3,10c 2,63b 0,53c 7,33d 1,97c

HD25 158 51 13,22a 12,77a 74,46a 0,76a 3,73b 2,00c 9,97b 3,73b 0,97d 4,50c 1,07e 4,50d 1,40c 2,77d 2,70b 0,50c 9,70c 1,97c

HD25 159 52 12,09a 11,06a 67,53a 0,70a 3,33b 2,00c 9,60c 4,07b 0,97d 4,40d 1,00e 4,47e 1,57c 3,27c 2,60b 0,53c 7,30d 2,07b

HD25 160 53 12,34a 11,92a 65,37a 0,68a 3,57b 2,00c 9,37c 3,97b 0,97d 4,20d 1,03e 4,20f 1,70b 3,13c 2,47c 0,53c 8,37d 2,13b

HD25 161 54 11,28a 11,88a 68,79a 0,79a 3,17b 2,00c 9,77c 3,83b 1,03d 4,40d 1,10d 4,40e 1,43c 2,77d 2,70b 0,60b 8,33d 1,80d

HD25 162 55 11,39a 11,51a 57,54a 0,80a 3,23b 2,00c 9,57c 4,53a 1,00d 4,17e 1,10d 4,20f 1,57c 3,17c 2,67b 0,53c 7,63d 2,10b

HD25 163 56 12,70a 11,52a 79,39a 0,67a 3,30b 2,00c 10,23b 4,30a 0,97d 4,93b 1,10d 4,60d 1,43c 2,63d 2,53c 0,60b 7,60d 2,10b

HD25 165 57 12,10a 10,23a 56,45a 0,71a 3,87b 2,00c 9,37c 4,00b 0,93e 4,33d 1,00e 4,40e 1,57c 2,70d 2,70b 0,50c 7,00d 1,90c

HD25 166 58 12,27a 12,37a 78,55a 0,76a 3,57b 2,00c 10,50b 4,10b 1,10c 4,90b 1,20c 5,00b 1,50c 2,50e 2,80b 0,60b 8,90c 2,10b

HD25 167 59 11,16a 9,64a 68,23a 0,76a 3,80b 2,00c 9,80c 4,60a 0,90e 4,40d 1,00e 4,40e 1,50c 2,90d 2,60b 0,50c 9,60c 1,90c

HD25 168 60 11,23a 10,60a 64,22a 0,82a 3,40b 2,00c 9,33c 3,33c 1,03d 4,30d 1,03e 4,27e 1,50c 2,93d 2,60b 0,50c 9,00c 1,90c

HD25 169 61 12,36a 11,39a 96,92a 0,78a 3,00b 2,00c 9,67c 4,40a 1,00d 4,33d 1,10d 4,50d 1,90a 3,30c 2,53c 0,50c 9,47c 2,00c

HD25 170 62 10,40a 9,39a 51,79a 0,85a 4,17b 2,00c 9,50c 4,10b 0,87e 4,10e 1,00e 4,20f 1,50c 2,80d 2,40c 0,57b 7,97d 2,17b

HD25 171 63 12,17a 11,91a 77,89a 0,93a 3,23b 2,00c 8,87d 4,57a 0,93e 4,47d 1,13d 4,17f 1,93a 3,33d 2,63b 0,53c 11,70c 2,13b

HD25 172 64 11,83a 10,16a 66,35a 0,86a 3,63b 2,00c 9,03d 4,63a 0,87e 4,20d 1,00e 4,17f 1,67b 3,03c 2,60b 0,50c 8,87c 2,10b

85


HD25 173 65 12,01a 11,34a 67,89a 0,78a 4,33b 2,00c 9,53c 4,53a 0,97d 4,27d 1,03e 4,27e 1,67b 3,13c 2,37c 0,53c 6,77d 1,97c

HD25 176 66 13,02a 11,93a 66,42a 0,77a 3,57b 2,00c 10,30b 4,77a 1,00d 4,60c 1,27b 4,70d 1,70b 3,00c 2,60b 0,57b 8,70d 2,00c

HD25 178 67 10,58a 10,30a 53,15a 0,74a 3,90b 2,00c 9,40c 4,57a 0,93e 4,27d 1,00e 4,07f 1,57c 3,10c 2,63b 0,57b 8,40d 1,90c

HD25 180 68 11,12a 10,43a 56,42a 0,71a 3,57b 2,00c 8,00e 3,20c 1,00d 4,00e 1,20c 4,00f 1,50c 3,10c 2,40c 0,50c 7,20d 2,00c

HD25 182 69 11,04a 11,40a 76,09a 1,38a 4,47b 2,00c 9,70c 3,70b 0,90e 4,20d 1,10d 4,10f 1,60b 2,70d 2,50c 0,40c 7,30d 2,10b

HD25 185 70 12,38a 11,54a 80,29a 0,83a 2,93b 2,00c 9,63c 3,87b 0,97d 4,30d 1,13d 4,43e 1,67b 2,77d 2,47c 0,50c 9,87c 1,90c

HD25 186 71 12,67a 12,74a 72,93a 0,90a 2,80b 2,00c 9,60c 4,17a 1,00d 4,40d 1,17c 4,27e 1,67b 2,90d 2,50c 0,50c 8,30d 2,00c

HD25 187 72 12,21a 10,90a 63,89a 0,84a 3,07b 2,00c 10,27b 4,40a 0,90e 4,60c 1,03e 4,63d 1,47c 2,63d 2,43c 0,50c 7,33d 2,10b

HD25 188 73 11,72a 9,98a 52,28a 0,93a 2,83b 2,00c 9,63c 3,77b 0,87e 4,23d 0,97e 4,40e 1,57c 2,67d 2,50c 0,57b 6,77d 1,83d

HD25 189 74 9,48a 9,57a 36,89a 0,66a 2,97b 2,00c 9,00d 5,00a 1,00d 4,90b 1,00e 4,30e 1,80b 3,70b 2,30d 0,50c 9,20c 2,00c

HD25 191 75 12,42a 10,12a 57,54a 0,80a 3,67b 2,00c 9,80c 4,33a 0,90e 4,40d 1,00e 4,37e 1,83a 3,03c 2,70b 0,60b 7,17d 2,07b

HD25 192 76 10,01a 9,57a 50,53a 0,72a 3,23b 2,00c 10,00b 4,80a 0,80f 4,40d 1,00e 4,40e 1,70b 2,50e 2,80b 0,60b 11,30c 2,00c

HD25 193 77 11,24a 9,49a 64,68a 0,70a 2,70b 2,00c 10,37b 4,37a 1,00d 4,40b 1,37a 4,70d 1,87a 3,47c 3,10a 0,60b 7,80d 2,27b

HD25 195 78 12,74a 11,51a 66,74a 0,82a 4,33b 2,00c 9,83c 4,47a 1,07c 4,40d 1,20c 4,63d 1,63b 3,30c 2,50c 0,60b 8,40d 2,13b

HD25 197 79 12,04a 10,73a 54,96a 0,82a 3,60b 2,00c 8,00e 3,00c 0,90e 4,10e 1,00e 4,10f 1,70b 3,00c 3,00a 0,50c 6,00d 1,80d

HD25 198 80 10,71a 11,32a 63,16a 0,88a 2,73b 2,00c 9,47c 3,77b 0,83f 4,23d 0,97e 4,33e 1,50c 3,13c 2,50c 0,53c 7,73d 2,07b

HD25 199 81 13,06a 11,73a 64,27a 0,76a 3,73b 3,00b 9,60c 3,17c 1,03d 4,20d 1,17c 4,13f 1,77b 3,30c 2,33d 0,57c 6,40d 1,70d

HD25 200 82 11,91a 11,41a 61,30a 0,90a 3,73b 2,00c 9,60c 3,53c 1,03d 4,07e 1,00e 4,27e 1,73b 2,40e 2,60b 0,50c 7,77d 1,83d

HD25 201 83 11,28a 11,21a 53,73a 0,66a 3,43b 2,00c 10,27b 4,43a 0,93e 4,53c 1,17c 4,63d 1,60b 3,17c 2,70b 0,53c 7,13d 2,17b

HD25 202 84 11,73a 11,58a 73,21a 0,83a 3,37b 2,00c 9,17d 3,83b 0,97d 4,27d 1,13d 4,33e 1,60b 2,97c 2,70b 0,57b 7,97d 2,00c

HD25 203 85 11,33a 10,80a 63,25a 0,72a 2,43b 2,00c 9,67c 4,57a 1,07c 4,30d 1,17c 4,37e 1,67b 2,90d 2,87a 0,50c 8,93c 2,07b

HD25 204 86 11,24a 12,47a 64,44a 0,75a 2,77b 2,00c 9,73c 4,70a 1,10c 4,40d 1,03e 4,43e 1,63b 2,90d 2,63b 0,53c 7,80d 1,93c

HD25 208 87 11,62ª 11,51a 65,09a 0,72a 2,90b 2,00c 9,77c 4,03b 1,03d 4,33d 1,00e 4,47e 1,67b 2,97c 2,70b 0,60b 8,70d 1,97c

HD25 209 88 12,83a 13,62a 97,82a 0,68a 2,50b 3,00b 9,27d 4,20a 1,10c 4,40d 1,10d 4,40e 1,60b 3,10c 2,57c 0,50c 8,47d 1,87d

HD25 210 89 13,32a 10,69a 67,89a 0,78a 3,23b 2,00c 9,70c 3,90b 0,97d 4,40d 1,07e 4,40e 1,80b 2,97c 2,60b 0,47c 8,33d 2,00c

HD25 212 90 11,20a 10,76a 57,64a 0,72a 3,57b 2,00c 9,90b 5,00a 0,90e 4,60c 1,00e 4,60d 1,60b 3,10c 3,00a 0,50c 7,30d 2,00c

HD25 213 91 10,26a 11,52a 65,95a 0,76a 3,53b 2,00c 8,87d 3,57c 0,97d 4,23d 1,03e 4,20f 1,50c 3,07c 2,50c 0,60b 7,40d 2,13b

HD25 214 92 10,53a 10,85a 54,08a 0,82a 2,90b 2,00c 9,20d 4,53a 1,17b 4,17e 1,20c 4,10f 2,20a 3,37c 2,67b 0,53c 11,10c 1,97c

HD25 215 93 12,12a 10,49a 65,62a 0,63a 2,73b 2,00c 9,13d 4,00b 1,00d 4,20d 1,10d 4,33e 1,70b 3,13c 2,80b 0,60b 9,00c 2,07b

HD25 217 94 11,93a 10,94a 68,87a 0,63a 3,17b 2,00c 10,30b 4,00b 1,10c 4,67c 1,20c 4,80c 1,63b 3,40c 2,53c 0,53c 9,13c 1,90c

HD25 218 95 12,14a 11,43a 71,55a 0,63a 2,77b 2,00c 9,70c 5,10a 1,00d 4,30d 1,00e 4,40e 1,60b 3,10c 3,20a 0,60b 7,10d 2,00c

HD25 219 96 11,71a 11,94a 71,66a 0,83a 2,23b 3,00b 9,17d 4,03b 0,97d 4,10e 1,07e 4,10f 1,40c 2,87d 2,60b 0,50c 6,73d 1,80d

86


HD25 220 97 11,34a 11,52a 61,34a 0,76a 4,07b 3,00b 9,70c 4,10b 1,00d 4,33d 1,10d 4,33e 1,53c 2,90d 2,57c 0,50c 8,50d 1,90c

HD25 221 98 12,89a 12,61a 73,42a 0,76a 3,37b 2,00c 9,50c 3,80b 1,00d 4,40d 1,10d 4,30e 1,90a 3,30c 2,80b 0,50c 11,00c 2,00c

HD25 222 99 13,04a 12,39a 68,50a 0,75a 3,43b 2,00c 9,67c 4,30a 1,00d 4,33d 1,07e 4,20f 1,57c 2,67d 2,67b 0,60b 6,80d 1,93c

HD25 223 100 12,43a 12,99a 65,98a 0,73a 3,37b 2,00c 9,63c 4,73a 1,03d 4,50c 1,03e 4,43e 1,63b 2,60d 2,73b 0,60b 9,10c 2,10b

HD25 224 101 11,17a 11,43a 61,22a 0,77a 3,03b 2,00c 9,10d 3,73b 0,90e 4,07e 1,00e 4,23e 1,23d 2,67d 2,30d 0,50c 7,03d 1,90c

HD25 225 102 12,10a 11,77a 55,55a 0,81a 4,23b 2,00c 9,23d 4,20a 0,90e 4,07e 0,93e 4,17f 1,33c 2,20f 2,50c 0,57b 8,37d 1,93c

HD25 226 103 11,84a 11,04a 56,47a 0,79a 2,60b 2,00c 9,03d 4,33a 0,93e 4,07e 1,07e 4,10f 1,53c 2,73d 2,47c 0,50c 7,70d 2,00c

HD25 227 104 11,87a 9,78a 60,86a 0,71a 2,83b 2,00c 8,90d 4,20a 0,90e 4,00e 0,90e 3,90f 1,10d 2,40e 2,10d 0,50c 4,70d 2,00c

HD25 229 105 10,22a 8,44a 48,04a 0,74a 4,07b 2,00c 8,63d 3,83b 0,90e 4,07e 0,93e 3,90f 1,77b 2,63d 2,47c 0,53c 6,87d 2,13b

HD25 231 106 12,76a 12,88a 67,56a 0,77a 3,13b 2,00c 10,50b 4,10b 0,90e 4,60c 1,10d 4,70d 1,70b 3,50c 2,70b 0,50c 6,00d 2,00c

HD25 234 107 11,56a 11,78a 58,32a 0,80a 3,10b 2,00c 9,73c 4,87a 0,93e 4,30d 1,00e 4,10f 1,53c 2,67d 2,40c 0,53c 5,23d 2,00c

HD25 235 108 12,01a 11,86a 69,20a 0,89a 3,13b 2,00c 9,63c 4,30a 1,07c 4,27d 1,10d 4,43e 1,97a 3,80b 2,70b 0,60b 7,80d 1,97c

HD25 237 109 12,19a 12,19a 61,00a 0,67a 2,77b 2,00c 9,10d 4,50a 1,03d 4,00e 1,10d 4,10f 1,70 3,20c 2,77b 0,57b 9,40c 1,93c

HD25 238 110 10,94a 10,22a 51,43a 0,61a 2,37b 2,00c 9,50c 4,03b 1,00d 4,30d 1,07e 4,33e 1,67b 2,70d 2,00d 0,57b 7,80d 2,13b

HD25 239 111 13,23a 10,98a 63,84a 0,72a 3,23b 2,00c 10,07b 5,47a 1,10c 4,73c 1,20c 4,60d 1,80b 3,30c 2,60b 0,63b 7,60d 2,17b

HD25 240 112 10,43a 9,78a 52,05a 0,78a 2,83b 2,00c 9,20d 3,83b 0,97d 3,97e 1,00e 4,03f 1,53c 2,40e 2,50c 0,57b 7,57d 1,97c

HD25 241 113 11,03a 10,55a 52,96a 0,83a 2,30b 2,00c 10,87b 3,07c 1,07c 4,87b 1,20c 4,90c 1,40c 3,17c 2,80b 0,57b 9,97c 2,17b

HD25 242 114 12,87a 11,84a 61,53a 0,76a 3,93b 2,00c 8,27e 3,80b 0,97d 3,80e 0,93e 3,77f 1,53c 2,77d 2,23d 0,50c 9,03c 2,00c

HD25 244 115 9,93a 9,07a 36,67a 0,78a 2,43b 2,00c 9,10d 4,50a 1,00d 4,10e 1,10d 4,10f 1,50c 2,90d 2,70b 0,50c 8,00d 1,80d

HD25 245 116 10,82a 10,86a 68,94a 0,66a 4,40b 2,00c 9,90b 4,40a 1,03d 4,27d 1,10d 4,37e 1,63b 3,20c 2,63b 0,53c 7,57d 1,93c

HD25 246 117 9,88a 9,49a 66,41a 0,71a 2,73b 2,00c 9,67c 3,93b 1,03d 4,40d 1,10d 4,40e 2,10a 3,20c 2,47c 0,50c 7,53d 1,83d

HD25 247 118 13,39a 10,86a 67,40a 0,83a 3,83b 2,00c 9,50c 3,60c 0,90e 4,37d 1,03e 4,37e 1,67b 3,23c 2,50c 0,57b 9,50c 2,10b

HD25 248 119 11,31a 10,31a 58,16a 0,71a 3,63b 2,00c 9,10d 3,70b 0,90e 4,10e 1,00e 4,30e 1,50c 2,70d 2,60b 0,50c 8,70d 1,70d

Valores médios seguidos da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Comprimento da folha (CF), largura da

folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura

da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos

primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA).

87

Tabela 6. Análise das características vegetativas e florais com valores médio em cm, exceto AF (cm2), em genitores e híbridos de Passiflora avaliadas

no segundo período. Genitor/Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA

P. coccinea 1 12,12a 7,54a 74,26a 1,03c 4,38a 2,00c 13,62a 3,12b 1,36a 6,23a 1,54a 6,26a 1,25b 3,85a 1,96b 1,32a 5,69c 2,71a

P. hatschbachii 2 12,10a 14,34a 81,71a 3,70a 8,00a 4,00a 8,87c 4,39a 0,81d 3,56e 0,91a 3,79c 1,37b 2,15c 2,15b 0,67c 17,84a 2,07b

HD25 101 3 11,44a 9,77a 65,38a 1,33c 4,76a 2,00c 10,06b 3,92b 1,12b 4,43b 1,16a 4,50b 1,81a 3,50a 2,61b 0,52c 10,05b 1,97b

HD25 102 4 11,03a 8,72a 49,95a 1,51c 4,44a 2,00c 9,52c 4,47a 1,01d 4,37c 1,10a 4,44b 1,65b 3,06b 2,66b 0,55c 8,17c 1,92b

HD25 103 5 11,25a 7,93a 50,68a 2,00b 4,66a 2,00c 10,13b 4,82a 0,94d 4,48b 1,11a 4,61b 1,56b 3,04b 2,83a 0,65c 8,69c 1,81c

HD25 104 6 10,76a 9,486a 60,11a 1,18c 3,33b 2,00c 8,95c 3,65b 0,95d 4,16c 1,03a 4,13c 1,68b 3,73a 2,76a 0,53c 9,41c 1,76c

HD25 105 7 9,55a 8,85a 47,89a 1,21c 3,41b 2,00c 9,35c 4,25a 1,00d 4,22c 1,00a 4,25c 2,12a 3,42a 2,65b 0,55c 9,82b 1,97b

HD25 106 8 10,69a 7,97a 53,29a 1,55c 3,50b 2,00c 9,15c 3,95b 0,97d 4,07d 1,00a 4,10c 2,10a 3,37a 2,85a 0,65c 12,90b 1,90b

HD25 107 9 10,62a 9,26a 53,88a 1,41c 3,94b 2,00c 10,55b 5,25a 1,00d 4,60b 1,12a 4,65b 2,35a 3,42a 2,87a 0,55c 11,97b 2,15b

HD25 109 10 12,20a 9,676a 62,43a 1,89b 4,00b 2,00c 9,42c 5,13a 1,01d 4,25c 1,12a 4,36c 1,78b 3,16a 2,62b 0,57c 9,15c 2,01b

HD25 110 11 12,05a 8,82a 63,90a 1,41c 5,27a 2,00c 9,68c 4,52a 0,98d 4,28c 1,05a 4,45b 1,73b 3,36a 2,81a 0,60c 9,01c 1,96b

HD25 111 12 11,48a 8,90a 58,13a 1,42c 3,50b 2,00c 9,51c 4,20a 0,99d 4,24c 1,14a 4,43b 2,06a 3,41a 2,81a 0,58c 11,07b 1,96b

HD25 112 13 10,93a 8,90a 54,60a 1,52c 3,66b 3,00b 9,75c 4,12b 1,05c 4,41b 1,11a 4,45b 1,75b 3,53a 2,46b 0,55c 12,31b 1,80c

HD25 114 14 9,42a 6,42a 35,57a 1,30c 3,77b 2,00c 9,50c 4,28a 1,05c 4,18c 1,10a 4,26c 1,85a 2,88b 2,70b 0,51c 7,90c 1,96b

HD25 115 15 10,33a 6,66a 49,01a 1,60b 3,72b 2,00c 9,70c 3,50b 0,95d 4,31c 1,10a 4,36b 1,65b 3,02b 2,36b 0,50c 9,76b 1,64c

HD25 116 16 10,57a 8,89a 50,64a 1,26c 4,11b 2,00c 9,33c 4,13b 0,95d 4,10d 1,05a 4,30c 1,95a 3,05b 2,85a 0,55c 11,62b 1,95b

HD25 117 17 11,23a 8,17a 55,50a 1,59b 4,22a 2,00c 10,20b 3,05b 1,05c 4,45b 1,05a 4,55b 1,95a 3,10b 2,85a 0,45c 10,50b 1,65c

HD25 118 18 10,90a 8,02a 55,09a 1,82b 3,25b 2,00c 10,02b 3,73b 0,98d 4,34c 1,02a 4,34c 1,71b 3,10b 2,64b 0,55c 8,49c 1,80c

HD25 119 19 10,94a 8,15a 56,78a 1,81b 3,75b 2,00c 9,45c 3,50b 0,90d 4,08d 1,01a 4,38b 1,51b 3,11b 2,48b 0,53c 7,38c 1,60c

HD25 120 20 10,09a 7,90a 39,16a 1,09c 3,72b 2,00c 9,97b 4,67a 1,00d 4,34c 1,09a 4,47b 1,74b 3,35a 2,71b 0,54c 9,06c 1,81c

HD25 124 21 11,11a 7,09a 55,18a 1,45c 4,72a 2,00c 9,19c 4,62a 1,09c 4,36c 1,17a 4,26c 2,01a 3,19a 2,69b 0,59c 8,42c 1,95b

HD25 125 22 10,48a 9,00a 60,13a 1,10c 3,46b 2,00c 10,11b 4,17b 1,13b 4,35c 1,21a 4,43b 1,88a 3,36a 2,73a 0,59c 11,83b 1,94b

HD25 126 23 12,18a 10,62a 65,25a 1,35c 3,61b 2,00c 9,84b 4,19a 1,16b 4,20c 1,12a 4,26c 1,89a 3,17a 2,82a 0,58c 10,27b 1,89b

HD25 127 24 10,85a 8,54a 53,42a 1,05c 3,66b 2,00c 10,15b 3,63b 1,05c 4,48b 1,18a 4,53b 2,18a 3,28a 2,58b 0,60c 11,65b 1,98b

HD25 128 25 10,47a 8,12a 42,21a 1,15c 3,10b 2,00c 9,65c 3,57b 1,03c 4,38c 1,11a 4,40b 2,06a 3,08b 2,70b 0,55c 9,53c 1,73c

HD25 129 26 10,96a 9,51a 49,09a 1,24c 4,39a 2,00c 9,88b 3,90b 0,95d 4,14c 1,07a 4,40b 1,62b 2,90b 2,67b 0,56c 7,37c 1,76c

HD25 130 27 10,87a 9,10a 50,15a 1,37c 3,83b 2,00c 10,15b 4,75a 1,05c 4,30c 1,10a 4,40b 1,80a 3,30a 3,20a 0,65c 7,35c 1,70c

HD25 131 28 11,24a 8,01a 59,16a 1,26c 5,44a 2,00c 10,70b 4,20a 1,05c 4,80b 1,12a 4,75b 1,67b 3,55a 3,02a 0,65c 10,55b 1,90b

HD25 132 29 10,01a 7,26a 46,23a 1,31c 4,35a 2,00c 8,80c 2,75b 0,95d 4,15c 0,95 4,20c 1,15b 2,45c 3,00a 0,50c 5,55c 1,65c

HD25 133 30 10,35a 7,92a 50,32a 1,50c 5,50a 2,00c 10,04b 3,84b 1,01d 4,52b 1,12a 4,66b 1,65b 3,40a 2,93a 0,53c 7,79c 1,93b

HD25 138 31 11,23a 8,90a 67,27a 1,39c 4,16b 2,00c 10,53b 4,34a 1,00d 4,56b 1,10a 4,59b 1,65b 3,11b 2,80a 0,61c 7,93c 1,97b

HD25 140 32 9,60a 7,93a 40,84a 1,31c 4,00b 2,00c 9,47c 3,83b 0,94d 4,34c 1,04a 4,19c 1,60a 2,84b 2,50b 0,47c 7,33c 1,82b

88


HD25 141 33 10,16a 8,05a 47,00a 1,40c 3,91b 2,00c 10,90b 4,43a 1,03c 4,91b 1,11a 4,83b 1,33b 2,36c 3,10a 0,63c 7,76c 1,30c

HD25 144 34 9,023a 6,77a 34,06a 1,46c 4,00b 2,00c 9,10b 3,80b 0,97d 4,10d 1,02a 4,20c 1,72b 2,97b 2,40b 0,42c 9,92b 1,57c

HD25 146 35 11,85a 8,72a 61,15a 1,18c 3,61b 2,00c 9,66b 4,23a 1,03c 4,20c 1,04a 4,53b 1,86a 3,36a 2,49b 0,54c 7,84c 1,85b

HD25 147 36 10,86a 10,00a 50,68a 1,50c 2,50b 2,00c 10,33b 4,63a 1,06c 4,51b 1,14a 4,52b 1,72b 3,16a 2,86a 0,61c 9,39c 1,71c

HD25 148 37 11,19a 9,39a 51,59a 1,39c 4,05b 2,00c 9,55c 4,25a 1,05c 4,28c 1,08a 4,28c 1,51b 2,80b 2,41b 0,51c 8,10c 1,63c

HD25 150 38 9,823a 8,52a 53,87a 1,39c 4,05b 2,00c 10,03b 4,08b 1,00d 4,63b 1,06a 4,38b 1,64b 3,01b 2,60b 0,61c 9,50c 1,58c

HD25 151 39 10,81a 9,17a 45,56a 1,39c 4,57a 2,00c 10,07b 4,62a 1,00d 4,53b 1,01a 4,48b 1,73b 2,76b 2,98a 0,55c 9,61b 1,75c

HD25 152 40 10,26a 8,65a 51,16a 0,96c 2,93b 2,00c 9,45c 3,80b 1,05c 4,20c 1,20a 4,40b 1,80a 3,65a 3,00a 0,50c 9,35c 1,80c

HD25 153 41 11,46a 8,64a 61,48a 1,17c 3,28b 2,00c 9,67c 4,25a 1,00d 4,31c 1,39a 4,04c 1,44b 2,62c 2,72a 0,57c 10,19b 1,56c

HD25 154 42 11,23a 9,01a 63,09a 1,39c 3,66b 2,00c 9,33c 4,67a 0,96d 4,10d 1,06a 4,10c 1,66b 2,91b 2,48b 0,55c 8,00c 1,70c

HD25 156 43 11,59a 9,77a 62,33a 0,98c 3,69b 2,00c 9,80c 3,36b 1,00d 4,20c 1,06a 4,21c 1,50b 2,60c 2,51b 0,53c 5,85c 1,71c

HD25 157 44 11,45a 9,16a 63,63a 1,18c 3,94b 2,00c 9,55c 3,88b 1,05c 4,42b 1,10a 4,20c 1,82a 3,12b 2,67b 0,52c 10,37b 1,92b

HD25 158 45 10,33a 8,72a 46,18a 1,23c 3,83b 2,00c 9,79c 4,44a 1,05c 4,35c 1,04a 4,32c 1,64b 3,14b 2,67b 0,55c 8,41c 1,45c

HD25 159 46 11,21a 9,15a 51,49a 1,32c 4,27a 2,00c 9,96b 4,03b 1,02c 4,47b 1,04a 4,46b 1,93a 3,31a 2,77a 0,55c 9,15c 1,94b

HD25 160 47 9,15a 8,99a 36,87a 1,70b 3,66b 2,00c 10,03b 4,38a 1,07c 4,22c 1,07a 4,32c 1,77b 3,37a 2,67b 0,57c 9,52c 1,37c

HD25 161 48 11,68a 11,05a 71,29a 1,59b 5,50a 2,00c 10,02b 5,90a 1,03c 4,55b 1,08a 4,51b 1,81a 3,00b 2,91a 0,61c 10,00b 1,56c

HD25 162 49 12,82a 11,12a 81,13a 1,57b 4,05b 2,00c 10,18b 4,42a 1,07c 4,53b 1,12a 4,60b 1,86a 3,15b 2,63b 0,57c 9,33c 2,21b

HD25 163 50 12,33a 11,07a 75,52a 0,94c 4,11b 2,00c 9,70c 4,33a 1,00d 4,30c 1,10a 4,16c 1,56b 3,53a 2,76a 0,56c 9,63b 2,06b

HD25 165 51 11,05a 8,98a 46,39a 0,86c 4,08b 2,00c 10,45b 4,25a 1,10c 4,50b 1,15a 4,60b 1,80a 3,30a 2,80a 0,50c 9,80b 1,75c

HD25 166 52 12,83a 10,47a 80,54a 1,46c 4,94a 2,00c 10,66b 4,13b 1,04c 4,66b 1,17a 4,71b 1,91a 2,39c 2,96a 0,56c 11,14b 1,96b

HD25 167 53 10,49a 8,91a 57,49a 1,11c 3,61b 2,00c 9,55c 4,52a 1,00d 4,25c 1,05a 4,28c 2,12a 3,38a 2,51b 0,59c 10,12b 1,83b

HD25 168 54 9,80a 7,79a 49,13a 1,24c 4,31a 2,00c 9,42c 4,70a 1,00d 4,05d 1,10a 4,10c 1,90a 3,30a 2,67b 0,57c 10,10b 1,80c

HD25 169 55 12,39a 11,1a 77,38a 1,30c 3,02b 2,00c 9,62c 4,17b 0,96d 3,79e 1,03a 4,47b 1,87a 3,36a 2,52b 0,51c 8,24c 1,59c

HD25 170 56 9,97a 8,92a 47,62a 1,60b 4,38a 2,00c 9,75c 4,43a 0,98d 4,45b 1,03a 4,38b 1,70b 3,23a 2,75a 0,56c 10,26b 1,81c

HD25 171 57 12,21a 8,52a 59,74a 1,65b 3,88b 2,00c 10,03b 4,04b 0,98d 4,35c 1,11a 4,56b 1,96a 3,21a 2,71b 0,56c 10,31b 1,83b

HD25 172 58 10,50a 9,01a 50,03a 1,89b 4,77a 2,00c 9,33c 4,02b 0,97d 4,21c 1,10a 4,29c 1,77b 2,91b 2,71b 0,51c 8,79c 1,97b

HD25 173 59 11,41a 8,24a 59,64a 1,97b 5,00a 2,00c 10,20b 3,80b 1,10c 4,80b 1,25a 4,85b 2,27a 3,32a 2,55b 0,52c 10,95b 1,75c

HD25 176 60 11,40a 8,43a 59,02a 1,96b 4,00b 2,00c 10,00b 4,14b 1,02c 4,36c 1,16a 4,40b 1,84a 3,17a 2,51b 0,79c 9,316c 1,77c

HD25 178 61 11,82a 10,52a 66,69a 1,26c 3,77b 2,00c 9,98b 4,78b 1,05c 4,50b 1,07a 4,52b 1,62b 3,45a 2,97a 0,57c 12,57b 1,75c

HD25 180 62 11,41a 9,46a 57,58a 1,48c 2,99b 2,00c 9,91b 4,29a 1,00d 4,51b 1,07a 4,56b 1,77b 3,04b 2,93a 0,54c 9,65b 1,96b

HD25 182 63 10,77a 8,10a 53,56a 2,07b 3,75b 2,00c 9,88b 3,86b 1,03c 4,49b 1,13a 4,45b 2,00a 3,40a 2,57b 0,54c 9,47c 1,84b

HD25 185 64 10,85a 8,74a 60,52a 2,22b 3,28b 2,00c 10,47b 4,54a 1,03c 4,65b 1,16a 4,63b 2,01a 2,92b 2,80a 0,49c 9,12c 1,91b

89


HD25 186 65 12,11a 9,90a 60,11a 1,51c 5,50a 2,00c 10,40b 4,92a 0,96d 4,62b 1,09a 4,52b 1,99a 3,05b 2,57b 0,49c 8,23c 1,95b

HD25 187 66 10,94a 9,66a 59,68a 1,68b 4,44a 2,00c 10,20b 4,50a 0,96d 4,28c 1,06a 4,73b 1,53b 3,58a 2,58b 0,53c 8,36c 2,02b

HD25 188 67 10,00a 6,39a 36,40a 1,46c 4,13b 2,00c 9,22c 3,55b 0,91d 4,10d 0,95a 4,11c 2,06a 3,11b 2,55b 0,55c 7,80c 1,76c

HD25 189 68 10,53a 9,08a 57,51a 1,02c 3,13b 2,00c 10,55b 4,48a 1,01 4,55b 1,25a 4,65b 2,13a 3,61a 2,83a 0,56c 8,85c 2,10b

HD25 191 69 11,33a 7,96a 51,04a 1,25c 5,46a 2,00c 10,10b 4,51a 0,99d 4,43b 1,06a 4,55b 2,03a 3,30a 2,82a 0,59c 9,20c 1,84b

HD25 192 70 10,42a 9,36a 50,12a 1,71b 4,55a 2,00c 9,57c 4,48a 1,03c 4,15c 1,03a 4,16c 1,82a 3,32a 2,59b 0,50c 9,24c 1,97b

HD25 193 71 11,76a 10,63a 60,32a 1,14c 3,55b 2,00c 9,18c 4,30a 1,00d 4,10d 1,12a 4,00c 2,15a 4,00a 2,55b 0,57c 10,67b 1,55c

HD25 195 72 11,04a 8,92a 55,41a 1,93b 3,11b 2,00c 9,98b 4,33a 0,98d 4,46b 1,09a 4,46b 1,85a 3,45a 2,62b 0,60c 8,90c 1,80c

HD25 198 73 10,24a 7,77a 45,78a 1,74b 4,27a 2,00c 9,72c 3,87b 0,93d 4,18c 1,03a 4,36b 1,70b 3,13b 2,81a 0,55c 7,25c 1,76c

HD25 199 74 11,60a 8,78a 50,26a 1,33c 3,88b 3,00b 9,78c 4,38a 1,02c 4,35c 1,15a 4,45b 2,10a 3,65a 2,60b 0,55c 9,65b 1,82b

HD25 200 75 11,41a 8,92a 51,72a 1,66b 4,70a 2,00c 10,10b 5,00a 1,01c 4,43b 1,03a 4,33c 1,97a 3,40a 2,73a 0,58c 8,65c 1,63c

HD25 202 76 10,48a 9,43a 50,39a 1,40c 4,88a 3,00b 9,55c 3,88b 0,97d 4,20c 1,02a 4,22c 1,82a 3,05b 2,67b 0,57c 9,97b 1,75c

HD25 203 77 10,56a 8,63a 48,61a 1,32c 4,38a 2,00c 9,25c 4,10b 0,96d 4,00d 0,96a 4,18c 1,76b 2,98b 2,93a 0,50c 9,21c 1,76c

HD25 204 78 8,42a 8,42a 32,04a 0,99c 4,67a 2,00c 10,25b 4,40a 1,00d 4,50b 1,00a 4,50b 1,45b 3,10b 2,95a 0,50c 6,70c 1,85b

HD25 209 79 12,31a 8,06a 57,90a 1,08c 2,66b 2,00c 9,33c 4,48a 0,96d 4,21c 1,03a 4,22c 1,93a 3,06b 2,81a 0,57c 8,14c 1,90b

HD25 210 80 8,85a 7,82a 38,10a 1,42c 3,36b 2,00c 9,68c 4,49a 1,03c 4,32c 1,05a 4,23c 1,82a 3,07b 2,75a 0,58c 8,74c 1,94b

HD25 212 81 11,60a 11,42a 62,22a 1,17c 3,61b 2,00c 9,20c 4,00b 1,03c 4,13c 1,16a 4,10c 1,86a 3,56a 2,70b 0,60c 9,30c 1,73c

HD25 213 82 11,06a 8,81a 47,38a 1,36c 3,27b 2,00c 9,28c 3,72b 1,11b 4,06d 1,11a 4,08c 1,75b 3,20a 2,55b 0,55c 6,25c 1,50c

HD25 214 83 10,21a 7,86a 41,07a 1,30c 4,77a 2,00c 9,57c 4,27a 1,19b 4,37c 1,19a 4,32c 1,87a 3,47a 2,57b 0,55c 7,92c 1,72c

HD25 215 84 11,83a 9,543a 50,24a 1,07c 4,94a 2,00c 9,42c 4,10b 1,11b 4,20c 1,08a 4,18c 1,96a 3,55a 2,77a 0,66c 9,36c 1,85b

HD25 217 85 9,243a 8,49a 37,73a 1,13c 4,55a 2,00c 9,40c 4,02b 1,10c 4,18c 1,11a 4,21c 1,81a 3,48a 2,7b 0,53c 7,90c 1,91b

HD25 218 86 11,55a 11,29a 60,35a 0,96c 2,94b 2,00c 9,63c 3,90b 1,07c 4,14c 1,09a 4,17c 2,07a 3,70a 2,81a 0,56c 9,36c 1,76c

HD25 219 87 11,71a 9,93a 52,15a 0,92c 3,69b 2,00c 8,84c 4,12b 1,06c 3,97d 1,07a 3,98c 1,83a 3,24a 2,78a 1,11b 7,11c 1,61c

HD25 220 88 11,80a 10,00a 51,97a 1,19c 4,83a 2,00c 9,60c 4,10b 1,05c 4,25c 1,10a 4,05c 1,70b 2,95b 2,50b 0,60c 8,60c 1,85b

HD25 221 89 10,21a 8,87a 46,10a 1,15c 3,64b 2,00c 9,61c 4,25a 0,96d 4,20c 1,04a 4,32c 1,69b 3,03b 2,62b 0,55c 7,88c 1,74c

HD25 222 90 10,68a 9,733a 46,17a 1,02c 3,16b 2,00c 9,53c 4,03b 0,98d 4,00d 1,11a 4,21c 1,51b 3,35a 2,78a 0,66c 8,98c 1,86b

HD25 223 91 10,29a 10,84a 51,79a 1,08c 5,07a 2,00c 9,87b 4,01b 1,04c 4,29c 1,09a 4,4b 1,82a 2,78b 2,88a 0,64c 9,52c 1,91b

HD25 224 92 11,53a 10,65a 55,70a 1,03c 3,66b 2,00c 8,93c 3,78b 0,92d 3,72e 0,97a 3,70c 1,40b 2,82b 2,67b 0,60c 9,15c 1,92b

HD25 225 93 10,75a 10,07a 47,64a 1,37c 4,36a 2,00c 9,20c 4,13b 0,96d 4,30c 1,05a 4,03c 1,53b 2,71b 2,91a 0,51c 6,61c 1,77c

HD25 226 94 11,66a 9,796a 59,20a 1,36c 4,16b 2,00c 9,13c 4,60a 0,93d 3,95d 1,00a 4,02c 1,64b 2,99b 2,56b 0,59c 8,41c 1,70c

HD25 227 95 10,19a 9,12a 43,78a 1,03c 2,77b 2,00c 8,93c 4,38a 0,99d 4,02d 1,00a 4,02c 1,71b 3,04b 2,84a 0,54c 9,04c 1,77c

HD25 229 96 11,10a 9,50a 55,72a 1,08c 2,83b 2,00c 8,83c 4,13b 0,90d 3,90e 1,02a 3,92c 1,60b 2,87b 2,60b 0,63c 7,67c 1,93b

90


HD25 231 97 10,65a 8,19a 48,59a 1,41c 2,75b 2,00c 9,15c 4,20a 0,95d 4,20c 1,00a 4,25c 1,80a 3,30a 2,80a 0,58c 7,83c 1,85b

HD25 234 98 10,20a 9,24a 42,14a 1,07c 3,79b 2,00c 9,53c 4,30a 0,99d 4,35c 1,01a 4,15c 1,55b 2,89b 2,86a 0,61c 6,59c 1,55c

HD25 235 99 10,26a 7,11a 38,51a 1,29c 3,50b 2,00c 9,51c 4,57a 1,01c 4,12c 1,03a 4,21c 2,14a 3,51a 2,88a 0,64c 7,81c 1,79c

HD25 237 100 11,58a 10,98a 56,92a 1,13c 3,66b 2,00c 8,67c 4,37a 1,05c 3,83e 1,06a 3,83c 1,65b 2,98b 3,00a 0,55c 8,68c 2,08b

HD25 239 101 11,98a 9,14a 50,88a 1,36c 3,16b 2,00c 10,30b 4,38a 1,10c 4,51b 1,10a 4,48b 1,88a 3,23a 2,86a 0,65c 8,86c 1,95b

HD25 240 102 9,83a 7,47a 36,79a 0,80c 3,20b 2,00c 9,62c 4,00b 1,04c 4,08d 1,03a 4,25c 1,97a 3,27a 2,76a 0,58c 10,08b 1,83b

HD25 241 103 11,52a 9,72a 54,66a 1,11c 3,53b 2,00c 9,00c 4,00b 1,05c 4,25c 1,15a 4,20c 2,20a 3,30a 2,65b 0,55c 10,7b 1,65c

HD25 242 104 10,21a 8,70a 38,46a 1,30c 3,78b 2,00c 9,57c 3,83b 0,97d 4,29c 1,11a 4,52b 1,86a 3,48a 2,65b 0,51c 10,63b 1,88b

HD25 244 105 8,89a 6,65a 30,37a 1,25c 3,97b 2,00c 10,03b 3,98b 1,00d 4,15c 1,13a 4,35c 2,05a 2,06c 2,80a 0,53c 7,71c 2,03b

HD25 245 106 10,17a 9,43a 54,31a 1,22c 3,57b 2,00c 9,38c 4,05b 0,95d 4,17c 1,05a 4,32c 1,55b 3,42a 2,87a 0,60c 10,10b 1,92b

HD25 246 107 11,15a 9,04a 46,95a 1,25c 3,27b 2,00c 8,87c 3,70b 1,15b 4,11d 1,03a 4,21c 1,88a 3,35a 2,71b 0,60c 11,81b 1,91b

HD25 247 108 8,85a 7,30a 32,04a 1,30c 4,27a 2,00c 10,27b 4,72a 0,95d 4,61b 1,15a 4,60b 1,68b 3,31a 3,23a 0,55c 9,03c 1,80c

HD25 248 109 10,71a 9,01a 48,10a 1,22c 3,89b 2,00c 9,80c 4,25a 1,03c 4,36c 1,13a 4,38b 2,01a 3,18a 2,65b 0,56c 9,06c 1,96b

Valores médios seguidos da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Comprimento da folha (CF), largura da

folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura

da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos

primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA).

91

3.4 Parâmetros genéticos

Foi realizada separadamente para cada período de avaliação a estimativa dos

parâmetros genéticos para os genótipos (Tabelas 7 e 8). Verificou-se pelo teste F

(P<0,05), em ambos os períodos de avaliação, variabilidade genética entre os genótipos

avaliados para todas as características florais e vegetativas, exceto para comprimento de

folha e diâmetro do caule, no primeiro período (Tabela 7), e para comprimento e largura

de folha e área foliar no segundo período (Tabela 8), sendo que essas características

foram influenciadas pelo ambiente, de forma que foi observada valor igual a zero para a

variância genética (Tabelas 7 e 8). O coeficiente de variação ambiental é um indicador

na precisão da obtenção dos dados. Nesse sentido, observou-se valores de baixa a média

magnitude para a maioria das características florais, variando de 4,14 a 14,74 (Tabela

7), no primeiro período e 4,68 a 17,19, no seundo período (Tabela 8). Por outro lado, o

coeficiente de variação ambiental para as características vegetativas foi considerado de

média a alta magnitude, para ambos os períodos de avaliação (Tabelas 7 e 8).

Os valores do coeficiente de variação genética variaram entre 5,81% (CPE) a 17,

93% (CPED) no primeiro período de avaliação e 3,97% (LF) a 19,86% (DC), no

segundo período.

O índice de variação (IV) é um indicador da existência de variabilidade genética

entre indivíduos, no qual essa variabilidade é verificada quando os valores são iguais ou

maiores que a unidade (1,0). Em ambos os períodos de avaliação, os valores de IV

observados para as características florais foram maiores em relação às características

vegetativas. As características florais apresentaram valores superiores à unidade (1,0),

exceto para o diâmetro da corona (Tabela 7). Por outro lado, todas as características

vegetativas apresentaram valores de índice de variação inferiores à unidade nos dois

períodos de avaliação (Tabela 7 e 8).

No primeiro período de avaliação as estimativas das herdabilidade foram

consideradas altas para todas as características florais, acima de 74%. Observou-se

maior e menor valor de herdabilidade para as características TF2 (88,08%) e DCO

(74,30%), respectivamente. (Tabela 7). No segundo período de avaliação, os valores de

herdabilidade foram inferores comparado com o primeiro período, sendo que foi

verificado maior e menor valor de herdabilidade para as características DF (80,81%) e

LSE (52,85%), respectivamente. (Tabela 8). Para as características vegetativas foram

verificados baixos valores da herdabilidade, para ambos os períodos (Tabelas 7 e 8).

92

Tabela 7. Análise de variância e estimativas dos parâmetros genéticos para as características florais e vegetativas de genitores e híbridos

interespecíficos de Passiflora avaliadas no primeiro período.

FV GL

QM


Blocos 2 0,32 0,04 0,00 0,06 0,00 0,03 0,00 0,01 0,01 0,00 8,97 0,03 20,00 11,58 606,03 0,01 3,26 0,05

Genótipos 118 1,11** 0,77** 0,01** 0,23** 0,02** 0,24** 0,12** 0,41** 0,10** 0,024** 8,03** 0,07** 6,67NS 4,14** 337,79* 0,13NS 2,07** 0,26**

Resíduo 236 1,79 0,19 0,00 0,04 0,00 0,03 0,02 0,05 0,02 0,00 1,48 0,01 6,95 2,70 254,72 0,10 1,04 0,10

Total 356

Parâmetros Genéticos

σ2f

σ2e

σ2g

h2

CVg

CVe

IV


0,37 0,25 0,005 0,07 0,007 0,08 0,04 0,13 0,03 0,008 2,67 0,02 2,22 1,38 112,59 0,04 0,69 0,08

0,05 0,06 0,007 0,01 0,001 0,01 0,009 0,01 0,008 0,001 0,49 0,00 2,31 0,90 84,90 0,03 0,34 0,03

0,31 0,19 0,005 0,06 0,005 0,07 0,31 0,11 0,02 0,007 2,18 0,01 0,00 0,48 27,68 0,00 0,34 0,05

84,00 74,30 84,53 82,60 77,99 86,63 77,15 86,22 77,04 88,08 81,53 77,37 - 34,80 24,59 21,18 49,43 61,16

5,82 10,70 7,30 5,81 7,23 6,09 11,12 11,77 6,33 15,62 17,93 6,80 - 6,29 8,07 12,34 17,82 11,05

4,40 10,90 5,41 4,62 6,65 4,14 10,48 8,14 5,99 9,95 14,74 6,36 22,17 14,91 24,49 41,23 31,22 15,25

1,32 0,98 1,34 1,25 1,08 1,46 1,06 1,44 1,05 1,56 1,21 1,06 - 0,42 0,32 0,29 0,57 0,72

Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE),

largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho

dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF),

área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). Variância fenotípica (σ2f), variância experimental (σ2

e), variância

genotípica ((σ2g), herdabilidade (h2), coeficiente de variação genotípica (CVg), coeficiente de variação experimental (CVe), índice de variação (IV).

** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo

93

Tabela 8. Análise de variância e estimativas dos parâmetros genéticos para as características florais e vegetativas de genitores e híbridos

interespecíficos de Passiflora avaliadas no segundo período.

FV GL

QM


Blocos 2 1,93 0,54 0,00 0,08 0,00 0,21 0,13 0,46 0,08 0,00 2,16 0,00 13,33 24,66 1774,10 1,84 1,91 0,29

Genótipos 108 1,08** 0,58** 0,01** 0,25** 0,20** 0,24** 0,14** 0,31** 0,10** 0,03** 8,35** 0,09** 2,39 NS 4,37 NS 325,11 NS 0,38** 1,80** 0,28**

Resíduo 216 0,20 0,23 0,00 0,41 0,00 0,04 0,06 0,12 0,03 0,00 2,48 0,03 2,52 3,99 327,40 0,15 0,99 0,17

Total 326

Parâmetros Genéticos


σ2f 0,36 0,19 0,004 0,08 0,006 0,80 0,04 0,10 0,03 0,01 2,78 0,03 0,79 1,45 108,37 0,12 0,60 0,09

σ2e 0,06 0,07 0,001 0,01 0,003 0,01 0,02 0,04 0,01 0,002 0,82 0,01 0,84 1,33 109,13 0,05 0,33 0,05

σ2g 0,29 0,11 0,003 0,07 0,003 0,06 0,02 0,06 0,02 0,008 1,95 0,02 0 0,12 0 0,07 0,27 0,03

h2 80,81 60,52 77,50 83,49 52,85 80,58 57,80 60,48 64,46 78,34 70,21 69,10 - 8,70 - 58,52 44,83 40,88

CVg 5,50 8,17 5,86 6,14 5,45 5,86 9,26 7,91 5,59 15,68 15,24 8,24 - 3,97 - 19,86 13,03 9,12

CVe 4,68 11,43 5,47 4,73 8,92 4,98 13,71 11,15 7,20 14,28 17,19 9,54 14,59 22,27 34,09 28,97 25,09 18,99

IV 1,18 0,71 1,07 1,29 0,61 1,17 0,67 0,71 0,77 1,09 0,88 0,86 - 0,17 - 0,68 0,52 0,48

Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE),

largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos

segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar

(AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). Variância fenotípica (σ2f), variância experimental (σ2

e), variância genotípica

((σ2g), herdabilidade (h2), coeficiente de variação genotípica (CVg), coeficiente de variação experimental (CVe), índice de variação (IV).

** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo

94

No primeiro período de avaliação, a divergência genética entre os genótipos foi

atribuída à característica tamanho do segundo filamento da corona (TF2) (12,09%),

sendo essa a característica que mais contribuiu, seguida do comprimento de bráctea,

comprimento do pedúnculo floral. Enquanto no segundo período de avaliação a

característica que mais contribuiu também foi TF2 (9,13%), seguida pelo comprimento

e largura de pétala. Por outro lado, as características que menos contribuíram foram

comprimento de folha, área foliar e largura de folha, em ambos os períodos de avaliação

(Tabela 9).

Tabela 9. Contribuição relativa das características para a divergência entre os genótipos

nos dois períodos de avaliação.

Primeiro período Segundo período

Características %Relativa %Acumulada Características % Relativa % Acumulada

TF2 12,0930 12,0930 TF2 9,1353 9,1353

CBR 11,0603 23,1503 CPE 9,0743 18,2096

CPED 9,5831 32,7334 LPE 8,4991 26,7087

CSE 8,4522 41,1856 CPED 8,3333 35,042

LPE 7,4924 48,6780 CA 7,3600 42,402

TF1 6,9486 55,6266 TF1 6,3420 48,7444

CA 6,9215 62,5481 CBR 6,1159 54,8603

DCO 6,0132 68,5613 DF 6,0650 60,9253

DF 5,2190 73,7803 DCO 5,9376 66,8629

LBR 5,1469 78,9272 CSE 5,7326 72,5955

CPE 4,4052 83,3324 DC 5,1465 77,742

LSE 4,0746 87,4070 LBR 4,9643 82,7063

NGP 3,1118 90,5188 NGP 3,6250 86,3313

CEN 2,5359 93,0547 CEN 3,5697 89,901

DC 1,9643 95,0190 LSE 3,1405 93,0415

LF 1,9257 96,9447 LF 2,6164 95,6579

AF 1,7030 98,6477 AF 2,3273 97,9852

CF 1,3493 100,00 CF 2,0151 100,0003 Comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento

entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO),

largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala

(CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da

corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED),

comprimento do androginóforo (CA).

95

4 DISCUSSÃO

Os híbridos F1 resultantes do cruzamento entre Passiflora coccinea vs. P.

hatschbachii apresentam flores com pétalas e sépalas vermelhas, característica do

genitor feminino, P. coccinea. A maioria dos genótipos híbridos apresentaram corona

com filamentos branco e vermelho (sem bandamento), característica de P. coccinea. A

planta na sua grande maioria possui folhas trilobadas, característica de P. hatschbachii e

parte apresenta folhas simples, característica de P. coccinea. Os híbridos apresentam

flores com antese diurna, permanecendo abertas por cerca de 14h00, pois a abertura

floral ocorre às 8h00 da manhã e fecha por volta da 22h00. Em adição, os genótipos

híbridos são vigorosos e não apresentam nenhum sintoma de doenças, como antracnose

ou virose (JUNQUEIRA et al., 2005). São, portanto híbridos promissores para o

mercado de plantas ornamentais, podendo compor jardins sobre pérgulas ou muros,

visto que, são trepadeiras de médio porte.

O fato das espécies P. coccinea e P. hatschbachii pertencerem à mesma secção

taxonômica, Granadillastrum (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004) e ambas

apresentarem 2n = 18 (MELO et al., 2014), são fatores importantes para a obtenção dos

híbridos interespecíficos HD25. Na maioria das vezes, os cruzamentos envolvendo

espécies mais próximas, normalmente espécies com mesmo número cromossômico são

bem sucedidos, fato observado nesse estudo e em outros cruzamentos envolvendo

espécies de Passiflora (JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016; SANTOS et al.,

2012).

Em programas de melhoramento a confirmação das hibridações por meio de

marcadores moleculares consiste em um procedimento importante. Pode-se inferir que

tal procedimento seja mais seguro que procedimentos com base em características

morfológicas, pois estes sofrem influência ambiental, epistasia (processo em que um

gene influencia a ação de outro, inibindo-o) e segregação genética (SANTOS 2008). A

utilização do marcador microssatélite apresenta algumas vantagens, pois permite a

confirmação de hibridações interespecíficas realizadas em estágios iniciais de

desenvolvimento das plantas híbridas e de forma confiável, cuja análise é baseada no

DNA, a qual não deixa dúvidas ao melhorista (FALEIRO et al., 2003).

A confirmação da fecundação cruzada nos híbridos HD25 foi realizada mediante a

análise da segregação de alelos SSR, a partir da análise de bandas informativas, cujas

bandas atuam como uma sequencia marcadora (BORÉM, 1998), sendo um

96

procedimento eficiente na confirmação da fecundação cruzada. A presença de apenas

um loco exclusivo em cada genitor nos híbridos é o suficiente para a exclusão da

hipótese da autofecundação (FALEIRO et al., 2003). Tal procedimento tem sido

relatado com êxito em cruzamentos envolvendo espécies de Passiflora (BELO et al.,

2018; CONCEIÇÃO et al., 2011; JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016;

SANTOS et al, 2012). A utilização do primer Pa07 na revelação do caráter híbrido já

havia sido reportado na confirmação de cruzamentos interespecíficos F1 (SANTOS et

al., 2012) e na confirmação de híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al.,

2016).

As diferenças significativas entre os genitores e híbridos para a maioria das

características em estudo, bem como a estimativa das variâncias genotípicas, fenotípicas

e experimentais revelam a existência de ampla variabilidade genética entre elas, sendo

uma condição importante no melhoramento de plantas, pois permite a obtenção e

seleção de genótipos promissores (ALLARD, 1971). Em estudos visando à seleção de

genótipos superiores, a estimativa dos parâmetros genéticos, é um método relevante,

cujos componentes de variância possibilitam o conhecimento genético, a partir do

fenótipo, da característica e a capacidade para seleção (SANTOS et al., 2011).

Os coeficientes de variação experimental (CVe) indicam a precisão do

experimento e, quando são encontrados CVe inferiores a 10%, são considerados de

baixa magnitude, CVe variando de 10 % a 20 %, são de média a alta magnitude, de 20

% a 30 %, são altos e acima de 30 %, são considerados muito altos (PIMENTEL

GOMES, 2000). Os CVe encontrados neste estudo para as características florais são

considerados de baixa a média magnitude indicando precisão experimental. Porém, a

maioria das características vegetativas apresentaram CVe alto, revelando grande

influência do ambiente na manifestação destas características. De modo geral as

características vegetativas apresentam valores altos de CVe, como foi reportado para

área foliar em estudo anteriores em híbridos de Passiflora (BELO, 2010; MELO et al.,

2016; SANTOS et al., 2011).

O coeficiente de variação genotípica (CVg) pode inferir sobre amplitude de

variação genética de um caráter, sendo um parâmetro importante em programas de

melhoramento genético (VALOIS et al., 1980). De acordo com os critérios de

classificação de Sebbenn et al. (1998), CVg acima de 7% são considerados de alta

magnitude. Seguindo este critério, podemos inferir que há variabilidade genotípica entre

os indivíduos em estudo, visto que a maioria das características avaliadas apresentam

97

valores superiores a 7%. Os menores valores verificados para o CVg foram para as

características DF, LPE, LSE, CSE e TF1. Os híbridos interespecíficos obtidos do

cruzamento entre P. mucronata Lam. e P. edulis apresentam menores valores para

comprimento de pétala e sépala (FREITAS et al., 2015), sendo que estes descritores

apresentam variabilidade genética baixa. O CVg em híbridos retrocruzados de

Passiflora foi reduzido com apenas uma geração de retrocruzamento evidenciando

redução na variabilidade genética, em comparação com a F1, entre as progênies

retrocruzadas para todas a características nos dois períodos avaliados (MELO et al.,

2016).

Os nossos resultados evidenciam que as características florais são as que mais

contribuem para a divergência entre os genótipos. Neste sentido, a alta herdabilidade

para estas características possibilita a seleção de genótipos promissores, pois estas são

herdadas e expressas com menor influência dos fatores ambientais (FREITAS et al.,

2015), mostrando situação favorável para a seleção de genótipos visando a

ornamentação. Ao contrário as características vegetativas que apresentam baixos valores

de herdabilidade, revelando pouca variabilidade genética e influência ambiente na

expressão fenotípica, não sendo recomendados estes caracteres para a seleção (BELO,

2010; MELO, et al., 2016; SANTOS et al., 2011).

Em híbridos interespecíficos de Passiflora, foram encontrados altos valores de

herdabilidade para as características florais, sendo este um parâmetro que reflete

expectativa de ganhos genéticos, permitindo a escolha de métodos de seleção de forma

mais eficaz (BELO, 2010; FREITAS et al., 2015 SANTOS et al., 2011). De modo geral

as características florais apresentaram maiores valores de herdabilidade que as

características vegetativas. Porém, no segundo período de avaliação os valores de

herdabilidade foram de baixa a média magnitude comparada ao primeiro período de

avaliação para algumas características florais, como, DCO, LSE, LBR, CBR e TF1,

indicando que estas caracteristicas sofrem influência do ambiente e que para a seleção

de genótipos com base nestes caracteres precisará de métodos de melhoramento mais

elaborados.

A razão entre CVg/CVe é denominada de índice de variação (IV,), que é um

indicador utilizado para inferir sobre a obtenção de ganhos genéticos quando a situação

é favorável para a seleção, isto quando os valores são maiores que a unidade (1,0)

(VENCOVSKY, 1987). Neste estudo, o IV apresenta valores próximos ou acima da

unidade para a maioria das características florais. Neste sentido, podemos inferir que a

98

situação é favorável ao melhoramento destas características, principalmente para a

característica DF e CPE, que além de apresentar alto IV, apresentam alta herdabilidade

nos dois períodos de avaliação. Desta forma, esta situação mostra-se ser favorável ao

melhoramento de Passiflora ornamental, através de métodos de melhoramento simples,

como seleção massal (VIANA, et al., 2004). Baixos valores de IV foram verificados

paras as características vegetativas, também observados em outros estudos (FREITAS et

al., 2015; MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2011). Neste caso, para os caracteres

vegetativos outros métodos de melhoramento devem ser aplicados, sobretudo por que

estas características apresentaram altos e baixos valores de CV e herdabilidade,

respectivamente.

Levando em consideração os dois períodos de avaliação, as caracteristicas DF,

LPE, CPE, CSE e TF2 permitem maior ganho por seleção, pois apresentam maiores

valores de herdabilidade e IV superior a unidade.

Através do método de agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade

podemos inferir que a grande maioria dos genótipos híbridos apresentam características

morfológicas intermediárias aos genitores. No entanto, alguns híbridos apresentam

valores superiores aos genitores para as características tamanho dos primeiros

filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da corona, evidenciando híbridos

heteróticos, os quais podem ser selecionados para programas de melhoramento de

passifloras ornamentais, já que eles são potencialmente superiores. Alguns híbridos

apresentaram comprimento do androginóforo inferior aos genitores. Neste caso, estes

híbridos podem ser selecionados com base nesta característica, pois busca-se genótipos

com menor androginóforo, uma vez que facilita a polinização do maracujá por insetos

menores, o que influenciará consequentemente na produção (SIQUEIRA et al., 2009).

As características florais são importantes no processo de distinção infragenérica

de espécies de Passiflora, as quais podem ser agrupadas com base na similaridade

apenas do caráter tamanho de flor (TANGARIFE et al., 2009). Neste estudo, as

características florais foram capazes de discriminar os genótipos híbridos, uma vez que,

estas características contribuem com 87,40% da variância total observada no primeiro

período e 82,70% no segundo período de avaliação. Em progênies híbridas de P.

mucronata vs. P. edulis, as características da flor influenciaram na divergência genética

entre os genótipos (FREITAS et al., 2015), evidenciando que a análise destas

características são importantes em programas de melhoramento de passifloras

ornamentais.

99

5 CONCLUSÕES

A variabilidade genética identificada nos híbridos HD25, estimada com base em

características morfológicas e parâmetros genéticos, evidencia o potencial destes

genótipos para serem utilizados na ornamentação. Os maiores valores de herdabilidade

para as caracteristicas florais diâmetro da flor, largura de pétala, comprimento e largura

de sépala e tamanho da primeira série da corona possibilita a obtenção de ganhos e

realizar a seleção de genótipos.

A maioria dos genótipos híbridos apresentam características morfológicas

intermediárias aos genitores. Identificaram-se também híbridos que apresentam valores

superiores aos genitores para as características diâmetro da corona, tamanho dos

primeiros filamentos da corona e largura de bráctea evidenciando heterobeltiose.

6 AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Jôsie Cloviane de Oliveira Freitas da Universidade Estadual de

Goiás pela colaboração com as análises estatísticas. À professora Dra. Ioná Santos

Araújo, professora Dra. Simone Alves, ao doutorando Helison e pela disponibilidade

em nos auxiliar nas análises de eletroforese com gel de poliacrilamida. Ao doutorando

em Produção Vegetal Joedson Pinto Barroso e aos mestrandos em Produção Vegetal e

Genética, Aline Pinto e Jonathan Morales, respectivamente pelo auxílio nas avaliações

morfológicas das plantas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES) pela concessão da bolsa e ao Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa

Cruz (UESC) pelo apoio financeiro à pesquisa.





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104

CAPÍTULO 4

ANÁLISE DE DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM HÍBRIDOS

INTERESPECÍFICOS DE Passiflora L. PELO MÉTODO WARD-MLM

RESUMO

O objetivo deste estudo foi estimar a divergência genética dos híbridos F1 obtidos do

cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii e seus respectivos genitores através de

uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis qualitativas e

quantitativas pelo método Ward-MLM. Para isto, foram avaliados 22 descritores

morfológicos, sendo 18 quantitativos e quatro qualitativos, em dois períodos de

avaliação (verão e inverno). No primeiro período de avaliação, através do procedimento

da função da verossimilhança, os genótipos foram reunidos em quatro grupos e no

segundo período foram formados seis grupos. Em ambos os períodos de avaliação, os

grupos em que os genitores estavam incluídos, foram os grupos que apresentaram maior

dissimilaridade, primeiro período (grupo I e IV) e segundo período (grupo I e VI). As

duas primeiras variáveis canônicas explicaram 98,11% e 89,00% de toda a variação

observada no primeiro e segundo período de avaliação, respectivamente. Esse valor

revela que a utilização do gráfico bidimensional foi eficaz na representação da

divergência entre os grupos. Os resultados podem direcionar futuros cruzamentos entre

indíviduos do grupo I e IV, em ambos os períodos de avaliação, uma vez que estes

grupos apresentam os maiores valores para a grande maioria das características

quantitativas, principalmente as características relacionadas a flor. Com base nas

características florais, pode-se selecionar genótipos promissores, os quais propiciarão

ganhos de forma mais vantajosa. Para isto, os genótipos superiores do grupo I poderão

ser retrocruzados com o genitor feminino, que está incluído no grupo VI, com intuito de

obter plantas com potencial para a criação de novas variedades ornamentais.

Palavras-chave: Diversidade genética, melhoramento de plantas, análise multivariada,

modelo de locação modificado.

105

GENETIC DIVERGENCE ANALYSIS IN INTERESTPECIFIC HYBRIDS OF

Passiflora L. BY WARD-MLM METHOD

ABSTRACT

The objective of this study was to estimate the genetic divergence of the hybrids F1

obtained from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii and their respective

parents through a multivariate approach using simultaneous analysis of qualitative and

quantitative variables by the Ward-MLM method. For this, 22 morphological

descriptors were evaluated, being 18 quantitative and 4 qualitative, in two evaluation

periods (summer and winter). In the first evaluation period, through the procedure of the

likelihood function, the genotypes were grouped into four groups and in the second

period six groups were formed. In both evaluation periods, the groups in which the

parents were included were the groups that presented the greatest dissimilarity, first

period (groups I and IV) and second period (groups I and VI). The first two canonical

variables explained 98.11% and 89.00% of all variation observed in the first and second

evaluation periods, respectively. This value reveals that the use of the two-dimensional

graph was effective in representing the divergence between the groups. The results may

direct future crosses between group I and IV subjects in both evaluation periods, since

these groups present the highest values for the great majority of the quantitative

characteristics, especially the flower-related characteristics. Based on the floral

characteristics, one can select promising genotypes, which will favor gains in a more

advantageous way. For this, the superior genotypes of group I may be backcrossed with

the maternal parent, which is included in group VI, in order to obtain plants with

potential for the creation of new ornamental varieties.

Keywords: Genetic diversity, plant breeding, multivariate analysis, modified lease

model.

106

1 INTRODUÇÃO

Muitas espécies da família Passifloraceae tem origem da Améria Tropical e o

Brasil é considerado um dos mais importantes centros de diversidade genética

(BERNACCI et al., 2013). As espécies de Passiflora são utilizadas principalmente na

alimentação, na indústria farmacêutica e cosmética e como planta ornamental, devido a

flores exuberantes que a grande maioria das espécies produzem.

Pelo fato do Brasil ser um dos maiores centros de diversidade de Passiflora, o

conhecimento da variabilidade genética e de populações segregantes por meio de

constituições alélicas distintas são de grande relevância para identificação de genótipos

promissores para iniciar programas de melhoramento genético (SILVA, 2015).

No melhoramento das espécies de Passiflora voltado para o mercado de plantas

ornamentais, a identificação de genótipos superiores é realizada com base em caracteres

de interesse ornamental (SANTOS et al., 2011), uma vez que grande parte das espécies

produzem flores belíssimas, de coloração e formas atrativas e folhagens bastante

diversificadas (ABREU et al., 2009). Esta variabilidade genética pode ser estimada com

base em descritores morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e moleculares (AMARAL

JUNIOR et al., 2010), através de análises multivariadas que permitem identificar

diferenças entre os genótipos (SILVA, 2015).

Existe diversos métodos de análises multivariadas que têm sido empregados em

estudos de diversidade genética. Dentre estes métodos, tem-se o Ward-MLM (Ward-

Modified Location Model), proposto por Franco et al. (1998). Conhecido como método

da “Mínima Variância” (MINGOTI, 2005), este utiliza variáveis quantitativas e

qualitativas concomitantemente. O método de Ward possibilita a formação do número

ótimo de grupos através da homogeinidade presente nestes grupos (GONÇALVES et

al., 2009), sendo gerado um dendrograma o qual permite melhor visualização da

definição de grupos (ROSEMBURG, 1984).

O Ward-MLM tem sido utilizado em programas de melhoramento de algumas

culturas de interesse econômico, como em feijoeiro (BARBÉ et al., 2010; CABRAL et

al., 2010), tomateiro (GONÇALVES et al., 2008), bananeira (PEREIRA et al., 2012),

mamoeiro (LUZ et al., 2014), maracujazeiro (SANTOS, 2013) e em híbridos

retrocruzados de Passiflora, com o objetivo de verificar a variabilidade e a distância

genética entre os genitores e os híbridos RC1 (MELO et al., 2015).

107

Este trabalho objetivou estimar a divergência genética dos híbridos F1 obtidos do

cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii e seus respectivos genitores através de

uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis qualitativas e

quantitativas pelo método Ward-MLM.


2.1 Material vegetal, condições de cultivo e condução do experimento

Por meio da análise multivariada foram avaliados 119 genótipos no primeiro

período de avaliação, sendo um genótipo de P. coccinea (genitor feminino), um

genótipo de P. hatshibachii (genitor masculino) e 117 híbridos obtidos do cruzamento

entre as espécies mencionadas. No segundo período foram avaliados 109 genótipos, os

genitores mais 107 genótipos híbridos, pois 10 híbridos não floresceram,

impossibilitando as avaliações.

As espécies utilizadas no cruzamento foram obtidas do Banco Ativo de

Germoplasma da UESC (BAG-Passifloras), localizado no campus da Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia. O experimento foi conduzido em

unidade experimental no campus da UESC (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m), no

delineamento em blocos casualizados (três blocos), sendo obtidos os dados da primeira

avaliação durante três meses (novembro de 2016 a janeiro de 2015) e o da segunda

avaliação durante quatro meses (julho de 2017 a outubo de 2017). Os genótipos foram

plantados em vasos de 25 L contendo solo, conduzidos em sistema deespaldeira

vertical, com mourões de 2,5 m de altura e fio de arame 1,8 m do solo. Foi adotado o

espaçamento de um metro entre plantas e dois metros entre fileiras. A poda foi realizada

mensalmente e a adubação a cada 15 dias, de acordo com a análise do solo: 38,33mg de

MAP purificado, 45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses

e após esse período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de

potássio, 99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.

2.2 Descritores morfológicos

A caracterização morfológica dos genótipos foi realizada mediante descritores

morfológicos (Tabela 1), sendo 18 quantitativos e quatro qualitativos, totalizando 22

108

caracteres. Foram incluídos nas análises de acordo com descritores oficiais de

Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns ausentes na lista, com base no manual

prático da EMBRAPA (JESUS et. al., 2015). Os dados quantitativos foram obtidos com

auxílio de paquímetro digital e régua graduada.

Tabela 1. Descritores morfológicos quantitativos e qualitativos avaliados em genótipos híbridos e genitores

de Passiflora. Características Quantitativas Sigla

Diâmetro da flor DF

Diâmetro da corona DCO

Largura da pétala LPE

Comprimento da pétala CPE

Largura da sépala LSE

Comprimento da sépala CSE

Largura da bráctea LBR

Comprimento da bráctea CBR

Tamanho dos primeiros filamentos da corona TF1

Tamanho dos segundos filamentos da corona TF2

Comprimento do pedúnculo floral CPED

Comprimento do androginóforo CA

Comprimento de folha CF

Largura de folha LF

Área foliar AF

Diâmetro do caule DC

Comprimento do entrenó do ramo principal CEN

Número de glândulas no pecíolo NGP

Características Qualitativas

Profundidade do limbo foliar

1) Profunda

2) Média

3) Ausente

PFL

Antocianina no filete

1) Forte

2) Média

3) Fraca

4) Ausente

AF

Antocianina no estilete

1) Forte

2) Média

3) Fraca

AE

Bandamento na corona

1) Presente

2) Ausente

BAND

2.3 Análise estatística

A avaliação das características quantitativas foi com base em três repetições por

genótipo, sendo utilizados posteriormente para análise multivariada os valores médios.

Os valores referentes às características qualitativas utilizadas com base no Manual

109

Prático da EMBRAPA foram substituídos por números, sendo designados como dado

qualitativo no programa SAS.

A análise multivariada pelo método Ward-MLM foi utilizada para verificação da

divergência genética com base nas características quantitativas e qualitativas

concomitante com o auxílio do software SAS (SAS INSTITUTE, 2000). A função

logarítima de Gower (GOWER, 1971) foi utilizada para gerar a matriz de distância. A

melhor determinação de grupos foi obtida a partir dos critérios pseudo-F e pseudo-t2

combinados com o perfil da verossimilhança associado com o teste da razão da

verossimilhança (SAS INSTITUTE, 2000), sendo que o uso de dados quantitativos e

qualitativos pelo índice de Gower (1971) para a obtenção do índice de dissimilaridade

variante de 0 a 1 foi dada por:

Onde i e j correspondemaos indivíduos a serem comparados e k as

características; p = número total de características, e Sij = contribuição da característica

k para a distância total. No caso da característica sendo qualitativa, Sijk assume o valor

1, quando a concordância é positiva ou negativa para a característica k entre os

indivíduos i e j. No caso de característica quantitativa:

Onde Rk = amplitude de variação da variável K, tendo valores 0 e 1. O valor de

Wijk foi utilizado para definir as contribuições dos indivíduos Sijk. Assim, quando o

valor da variável k está ausente em um ou ambos os indivíduos Wijk = 0 ou no caso de

presença o valor é igual a 1.

110

3 RESULTADOS

3.1 Descrição morfológica

Os genitores e os híbridos F1 são classificados como trepadeiras, com hábito de

crescimento herbáceo e caule cilíndrico. Possuem folhas de coloração verde e sem

pilosidade. As variações observadas nas características quantitativas e qualitativas entre

os genitores (P. hatschbachii e P. coccinea) e alguns genótipos híbridos são

evidenciadas nas figuras 1 e 2.

Passiflora coccinea, genitor feminino, apresentou forma do limbo foliar

oblonga, divisão do limbo foliar inteira e ausência de sinus no limbo foliar. Enquanto P.

hatschbachii, genitor masculino, e os genótipos híbridos apresentaram forma do limbo

foliar partida, divisão do limbo foliar partido e sinus no limbo foliar, exceto HD25 190,

cujo híbrido apresentou-se igual ao genitor feminino (Figura 1G). Com relação à

profundidade do limbo foliar, foi verificada variação entre os genitores e genótipos

híbridos (média a profunda), exceto para P. coccinea (Figura 1 e Tabela 9). Os

genótipos híbridos apresentaram antese diurna, com abertura da flor às 8h00 e

fechamento por volta das 22h00, enquanto o genitor feminino, P. coccinea, possue

antese diurna e o genitor masculino, P. hatschbachii, antese noturna.

No estudo das características qualitativas em relação à flor, foi observada

coloração branca nas peças florais (pétalas e sépalas) para P. hatschbachii (Figura 2A) e

coloração vermelha para P. coccinea (Figura 2B) e para os genótipos híbridos (Figura

2B-J). Passiflora hatschbachii apresentou coloração branca para os primeiros

filamentos da corona (Figura 2A), enquanto que todos os híbridos apresentaram

coloração branca e vermelha (Figura 2C-J) característica de P. coccinea (Figura 2B).

Foi obsevada antocianina no androginóforo apenas no genitor feminino. Por outro lado,

verificou-se antocianina no filete e estilete no genitor feminino e nos híbridos, com

variação forte, fraca e média (Figura 2B-J). Não foi observado nos genitores

bandamento na corona, ao passo que, em alguns híbridos essa característica estava

presente (Figura 2I e J).

111

Figura 1. Diferença foliar entre genitores e genótipos híbridos. P. coccinea (A), P.

hatschbachii (B), HD25 138 (C), HD25 101 (D), HD25 244 (E), HD25 130 (F) e HD25

190 (G).

112

Figura 2. Flores dos genitores P. coccinea (A), P. hatschbachii (B) e dos genótipos

híbridos (C-J). Antocianina no estilete (C-E): HD25 118 - forte presença de antocianina

no estilete (seta) (C), HD25 102 - média presença de antocianina no estilete (seta) (D)

HD25 109 - fraca presença de antocianina no estilete (seta) (E). Antocianina no filete

(F-H): HD25 122 - forte presença de antocianina no filete (seta) (F), HD25 130 - média

presença de antocianina no filete (seta) (G), HD25 127 - fraca presença de antocianina

no filete (seta) (H); Bandamento na corona (I e J): HD25 238 - presença de bandamento

na corona (seta) (I) HD25 237 - ausência de bandamento na corona (seta) (J).

113

3.2 Análise multivariada

No primeiro período de avaliação, o método Ward-MLM foi eficaz para distinção

dos genótipos, por meio dos critérios pseudo-F e pseudo-t2, sendo possível a definição

de quatro grupos (Figura 3A) e no segundo período de avaliação foi estabelecido seis

grupos (Figura 3B). A formação dos grupos no primeiro período ocorreu devido ao

maior aumento da função de verossimilhança presente no grupo IV, com incremento de

177,96 (Tabela 2) e com incremento de 118,76 para o grupo VI no segundo período

(Tabela 3).

Figura 3. Função logarítmica da probabilidade (Log-likelihood) mostrando o número de

grupos formado pelo método Ward MLM em genitores e genótipos híbridos de

Passiflora no primeiro (A) e segundo (B) período de avaliação.

Tabela 2. Número de grupos formados com base na função logarítmica da probabilidade

(Log-Likelihood) e seu incremento para variáveis quantitativas em progênies híbridas de

Passiflora caracterizadas no primeiro período de avaliação. Número de grupos Log-Likelihood Incremento

1 -823.71 0.00

2 -764.79 58.91

3 -749.49 74.21

4 -571.53 252.17*

5 -534.25 289.45

6 -427.80 395.90

7 -464.85 358.85

8 0.00 823.71

9 0.00 823.71

* Maior incremento para a formação de quatro grupos pela função logarítmica.

114

Tabela 3. Número de grupos formados com base na função logarítmica da probabilidade

(Log-Likelihood) e seu incremento para variáveis quantitativas em progênies híbridas de

Passiflora caracterizadas no segundo período de avaliação. Número de grupos Log-Likelihood Incremento

1 -717.16 0.00

2 -705.73 11.42

3 -654.22 62.93

4 -664.89 52.27

5 -622.38 94.78

6 -503.61 213.54*

7 -494.06 223.09

8 -428.04 289.11

9 -420.67 296.49

10 -373.57 343.58

11 -353.85 363.30

* Maior incremento para a formação de seis grupos pela função logarítmica.

No primeiro período de avaliação, a análise dos dados morfológicos utilizando o

modelo Ward-MLM possibilitou a formação de quatro grupos homogêneos, o qual

separou os genótipos com base em suas semelhanças. O grupo I foi constituído por 11

genótipos híbridos mais o genitor masculino (P. hatschbachii), o grupo II, por 32

genótipos híbridos, o grupo III, por 44 genótipos híbridos, o grupo IV, por 30 genótipos

híbridos mais o genitor feminino (P. coccinea) (Tabelas 4 e 5). O grupo I conteve

genótipos com maiores valores para as características vegetativas, com exceção para CF

e AF (Tabela 4). O grupo II inclui genótipos com os maiores valores para DCO e TF1

(Tabela 4). Os genótipos pertencentes ao grupo III apresentam maior LBR, CBR, CA e

CF (Tabela 4). Enquanto o grupo IV apresentou os maiores valores para a maioria das

características florais (Tabela 4). Vale ressaltar que os maiores valores encontrados nos

grupos I e IV para as características vegetativas e florais, estão presentes os genitores

masculino e feminino, respectivamente (Tabelas 4 e 5).

115

Tabela 4. Médias das dezoito variáveis quantitativas para cada um dos quatro grupos

formados pelo método Ward-MLM e as duas primeiras variáveis canônicas (CAN) para

o primeiro período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.

Grupos CAN

Variáveis I (12) II (32) III (44) IV (31) CAN1 CAN2

DF (cm) 9.34 9.42 9.54 9.96 -0.153692 -0.388494

DCO (cm) 4.10 4.23 4.20 3.78 0.015065 0.429337

LPE (cm) 0.95 0.94 0.96 0.98 -0.049720 -0.194215

CPE (cm) 4.19 4.29 4.32 4.50 -0.192504 -0.343101

LSE (cm) 1.02 1.04 1.07 1.08 -0.146040 -0.134709

CSE (cm) 4.22 4.31 4.34 4.51 -0.175506 -0.321304

LBR (cm) 1.45 1.58 1.63 1.58 -0.231421 0.084487

CBR (cm) 2.73 2.83 3.01 2.90 -0.159118 0.035077

TF1 (cm) 2.57 2.62 2.56 2.54 -0.000329 0.141507

TF2 (cm) 0.48 0.53 0.53 0.54 -0.188651 -0.081863

CPED (cm) 8.28 7.88 7.93 8.99 0.004366 -0.335544

CA (cm) 1.89 1.98 2.00 1.95 -0.172736 0.143297

CF (cm) 11.95 11.43 12.28 11.77 0.013885 0.035973

LF (cm) 11.54 10.64 11.40 10.67 0.153484 0.154096

AF (cm2) 71.58 58.33 63.71 71.74 0.194853 -0.508486

DC(cm) 0.81 0.80 0.75 0.77 0.056436 0.009133

CEN (cm) 3.68 3.24 3.29 3.12 0.167486 0.084211

NGP 3.00 2.00 2.00 2.00 0.979456 -0.028214

Diâmetro da flor(DF), diâmetro da corona(DCO), largura da pétala(LPE), comprimento da pétala(CPE),

largura da sépala(LSE), comprimento da sépala(CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da

bráctea(CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona(TF1), tamanho dos segundos filamentos da

corona(TF2), comprimento do pedúnculo floral(CPED), comprimento androginóforo (CA), comprimento

da folha(CF), largura da folha(LF), área foliar(AF), diâmetro do caule(DC), comprimento entrenó(CEN) e

número de glândulas no pecíolo (NGP).

116

Tabela 5. Grupos formados pelos métodos Ward-MLM para as dezoito variáveis

caracterizadas no primeiro período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.

No segundo período de avaliação, a análise dos dados morfológicos possibilitou a

formação de seis grupos, o qual separou os genótipos com base em suas semelhanças. O

grupo I foi constituído por oito genótipos híbridos mais o genitor masculino (P.

hatschbachii), o grupo II, por 48 genótipos híbridos, o grupo III, por 16 genótipos

híbridos, o grupo IV, por 11 genótipos híbridos, o grupo V, por 24 genótipos híbridos e

o grupo seis composto apenas pelo genitor feminino (P. coccinea) (Tabelas 6 e 7). O

grupo I, o qual está presente o genitor masculino, apresentou os maiores valores para as

características CPED, LF, DC e CEN (Tabela 6). Em ambos os períodos de avaliação, o

menor CA foi observado nos genótipos contidos no grupo I (Tabelas 4 e 6). Os

genótipos do grupo II e IV não apresentaram nenhuma característica com valores

superiores aos demais grupos. O grupo III contém genótipos com maior LBR e NGP

(Tabela 6). O grupo V inclui genótipos com maior TF1 (Tabela 6). O grupo VI

apresentou os maiores valores médios para grande maioria das características florais,

exceto para DCO, LBR, TF1 e CPED (Tabela 6).

Grupos Genitores e genótipos F1

I HD25 131, HD25 148, HD25 127, HD25 128, HD25 135, HD25 139, HD25 199, HD25

209, HD25 219, HD25 154, HD25 220, P. hatschbachii.

II HD25 117, HD25 165, HD25 159, HD25 170, HD25 224, HD25 225, HD25 248, HD25

107, HD25 109, HD25 110, HD25 112, HD25 122, HD25 129, HD25 143, HD25 176,

HD25 188, HD25 189, HD25 192, HD25 193, HD25 197, HD25 198, HD25 203, HD25

214, HD25 215, HD25 218, HD25 222, HD25 223, HD25 227, HD25 229, HD25239,

HD25 240, HD25 244.

III HD25 146, HD25 125, HD25 157, HD25 242, HD25 162, HD25 186, HD25 151, HD25

101, HD25 103, HD25 105, HD25 114, HD25 119, HD25 124, HD25 126, HD25 130,


160, HD25 171, HD25 172, HD25 173, HD25 178, HD25 180, HD25 187, HD25 191,


102, HD25 106, HD25 213, HD25 226, HD25 235, HD25 238, HD25 247.

IV HD25 144, HD25 147, HD25 150, HD25 118, HD25 120, HD25 168, HD25 169, HD25

241, HD25 136, HD25 156, HD25 166, HD25 217, HD25 221, HD25 158, HD25 167,


246, HD25 152, HD25 138, HD25 153, HD25 140, HD25 115, HD25 116, HD25 142, P.

coccinea.

117

Tabela 6. Médias das dezoito variáveis quantitativas para cada um dos seis grupos

formados pelo método Ward-MLM e as duas primeiras variáveis canônicas (CAN) para

o segundo período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.

Variáveis Grupos CAN

I (9) II (48) III (16) IV (11) V(24) VI(1) CAN1 CAN2

DF (cm) 9.94 9.69 9.59 9.96 9.52 13.62 0.374829 -0.577791

DCO (cm) 4.64 4.22 4.00 4.23 4.11 3.12 -0.422419 -0.035429

LPE (cm) 1.00 1.01 1.02 1.01 1.00 1.37 0.427679 -0.351350

CPE (cm) 4.40 4.30 4.28 4.33 4.22 6.23 0.397685 -0.583247

LSE (cm) 1.04 1.08 1.13 1.10 1.06 1.54 0.589864 -0.248413

CSE (cm) 4.38 4.35 4.35 4.43 4.24 6.27 0.455684 -0.551369

LBR (cm) 1.65 1.76 2.01 1.73 1.82 1.26 0.135577 0.485561

CBR (cm) 3.01 3.20 3.38 2.94 3.13 3.86 0.287562 -0.046711

TF1 (cm) 2.73 2.72 2.72 2.66 2.76 1.97 -0.286178 0.309602

TF2 (cm) 0.60 0.56 0.59 0.53 0.57 1.32 0.534995 -0.524133

CPED (cm) 10.50 8.84 9.99 8.63 9.10 5.69 -0.131187 0.209407

CA (cm) 1.61 1.83 1.81 1.79 1.90 2.71 0.490888 -0.245185

CF (cm) 10.71 10.56 11.02 11.60 11.10 12.12 0.277687 0.088560

LF (cm) 9.78 8.46 9.44 9.64 9.06 7.54 0.019400 0.235720

AF (cm2) 55.88 51.04 53.33 60.24 51.90 74.27 0.175809 -0.112781

DC(cm) 1.72 1.46 1.20 1.27 1.20 1.03 -0.385318 -0.240751

CEN (cm) 4.64 4.00 3.77 4.07 3.77 4.38 -0.150843 -0.208364

NGP 2.00 2.00 3.00 2.00 2.00 2.00 0.102621 0.140464

Diâmetro da flor(DF), diâmetro da corona(DCO), largura da pétala(LPE), comprimento da pétala(CPE),

largura da sépala(LSE), comprimento da sépala(CSE), largura da bráctea(LBR), comprimento da

bráctea(CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona(TF1), tamanho dos segundos filamentos da

corona(TF2), comprimento do pedúnculo floral(CPED), comprimento androginóforo (CA), comprimento da

folha(CF), largura da folha(LF), área foliar(AF), diâmetro do caule(DC), comprimento entrenó(CEN) e

número de glândulas no pecíolo (NGP).

Tabela 7. Grupos formados pelos métodos Ward-MLM para as dezoito variáveis

caracterizadas no segundo período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos Genitores e genótipos F1

I HD25 150, HD25 158, HD25 141, HD25 161, HD25 170, HD25 200, HD25 160, HD25

178, P. hatschbachii.

II HD25 115, HD25 144, HD25 147, HD25 118, HD25 120, HD25 168, HD25 217, HD25

125, HD25 157, HD25 167, HD25 182, HD25 185, HD25 138, HD25 101, HD25 103,


204, HD25 210, HD25 245, HD25 131, HD25 133, HD25 172, HD25 187, HD25 195,


226, HD25 235, HD25 247, HD25 109, HD25 110, HD25 112, HD25 154, HD25 176,

HD25 192, HD25 198, HD25 214.

III HD25 241, HD25 242, HD25 152, HD25 111, HD25 127, HD25 128, HD25 173, HD25

199, HD25 202, HD25 212, HD25 219, HD25 116, HD25 189, HD25 193, HD25 218,

HD25 223.

IV HD25 129, HD25 148, HD25 146, HD25 169, HD25 156, HD25 165, HD25 166, HD25

221, HD 162, HD 186,

HD25 151, HD25 153.

V HD25 104, HD25 159, HD25 163, HD25 224, HD25 225, HD25 246, HD25 248, HD25

171, HD25 180, HD25 191, HD25 209, HD25 237, HD25 107, HD25 117, HD25 188,

HD25 215, HD 220, HD 222, HD 227, HD25 229, HD25 239, HD25 240, HD25 244.

IV P. coccinea

118

No primeiro período de avaliação, com base nas características qualitativas,

observou-se que os grupos I, III, IV apresentaram maior variação em relação à presença

de antocianina do estilete e filete, bem como bandamento na corona (Tabela 8). A

maioria dos genótipos avaliados apresentaram profundidade média do limbo foliar.

Apenas dois genótipos apresentaram profundidade do limbo foliar profunda e apenas

um genótipo apresentou ausência de limbo foliar, o genitor feminino (Tabela 8).

Verificou-se no grupo III maior porcentagem de genótipos com quantidade média de

antocianina no filete (75,00%), enquanto o grupo IV apresentou genótipos com

quantidades altas de antocianina no filete (74,41%) (Tabela 8). A maioria dos grupos

apresentaram quantidades fracas de antocianina no estilete, exceto o grupo IV, que

41,93% e 16,12% dos genótipos apresentaram quantidade média e forte de antocianina

no estilete, respectivamente (Tabela 8). 68,98% dos genótipos contidos nos grupos não

apresentaram bandamento na corona (Tabela 8). Apenas o grupo III apresentou 56,81%

dos genótipos com bandamento na corona (Tabela 8).

Tabela 8. Frequência absoluta das quatro características qualitativas em cada um dos

quatro grupos formados pelo modelo Ward-MLM para o primeiro período de avaliação

em progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos

Características I(12) II(32) III(44) IV(31)

Profundidade do limbo foliar: - - - -

Profunda 1 1 - -

Média 11 31 44 30

Ausente - - - 1

Antocianina no filete:

Forte 1 6 4 24

Média 8 - 33 3

Fraca 2 26 7 4

Ausente 1 - - -

Antocianina no estilete:

Forte 1 - 1 5

Média - 1 3 13

Fraca 11 31 40 13

Bandamento na corona:

Presente 1 - 25 11

Ausente 11 32 19 20

No segundo período de avaliação, verificou-se que os grupos I, II, III, IV e V

apresentaram maior variação em relação à presença de antocianina do estilete e filete e

bandamento na corona (Tabela 9). 100% dos genótipos contidos nos grupos III, V e VI

apresentaram média profundidade do limbo foliar. Os grupos I, IV e VI a maioria dos

genótipos apresentaram forte quantidade de antocianina no filete, enquanto que os

grupos II e V apresentaram genótipos com média quantidade de antocianina no filete

119

(Tabela 9). Observou-se que os genótipos apresentaram quantidade fraca de antocianina

no estilete para os grupos I, II e III (Tabela 9). Por outro lado, o grupo V apresentou

95,83% dos genótipos com quantidade média de antocianina no estilete (Tabela 9). A

maioria dos genótipos apresentaram ausência de bandamento na corona, com exceção

para o grupo II, o qual 58,33% apresentaram bandamento na corona (Tabela 9).

Tabela 9. Frequência absoluta das quatro características qualitativas em cada um dos

seis grupos formados pelo modelo Ward-MLM para o segundo período de avaliação em

progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos

Características I(9) II(48) III(16) IV(11) V(24) VI(1)

Profundidade do limbo foliar:

Profunda

Média

Ausente

-

9

-

1

47

-

-

16

-

1

10

-

-

24

-

-

-

1

Antocianina no filete:

Forte

Média

Fraca

Ausente

6

2

-

1

11

21

16

-

2

9

4

-

7

4

1

-

7

5

12

-

1

-

-

-

Antocianina no estilete:

Forte

Média

Fraca

1

-

8

2

7

39

-

2

13

2

9

1

1

23

-

1

-

-

Bandamento na corona:

Presente

Ausente

1

8

28

20

3

13

3

9

-

24

-

1

Na figura 4 é apresentado o gráfico referente as duas varáveis canônicas obtidas

utilizando a metodologia Ward-MLM, que juntas explicaram 98,11% (Figura 4A) e

89,00% (Figura 4B) de toda a variação observada no primeiro e segundo período de

avaliação, respectivamente. Esse valor revela que a utilização do gráfico bidimensional

foi eficaz na representação da divergência entre os grupos (Figura 4). De acordo com a

visualização gráfica foi possível observar os grupos de genótipos mais divergentes e os

mais similares. Para o primeiro período de avaliação, com base na primeira variável

canônica, verificamos que as características NGP (0,97) e LB (0,25) foram as que mais

contribuíram para a dissimilaridade entre os grupos (Tabela 5). De acordo com a

primeira variável canônica, a LS (0,58) e TF2 (0,53) foram às características que mais

contribuíram para a dissimilaridade entre os grupos no segundo período de avaliação

(Tabela 6).

120

Figura 4. Variáveis canônicas em genótipos de Passiflora: a) As duas primeiras

variáveis canônicas (CAN) para os quatro grupos formados pelo métodoWard-MLM

para variáveis quantitativas caracterizadas no primeiro período de avaliação em

genótipos híbridos de Passiflora; b) As duas primeiras variáveis canônicas para os seis

grupos formados pelo métodoWard-MLM para variáveis quantitativas caracterizadas no

segundo período de avaliação em genótipos híbridos F1 de Passiflora.

Através da análise das variáveis canônicas, no primeiro período de avaliação

observou-se a maior distância entre o grupo I e IV (376,82), os quais encontravam-se os

genitores masculino e feminino, respectivamente (Tabela 10). Dessa forma, os

genótipos híbridos apresentaram maior similaridade em relação aos genitores feminino e

masculino. Por outro lado, a menor distância foi observada entre os grupos II e III

(1,94) (Tabela 10).

Tabela 10. Distância entre os grupos formados pelo método Ward-MLM para variáveis

quantitativas avaliadas no primeiro período em progênies híbridas F1 de Passiflora.

Grupos I II III IV

I 0 357.97 361.31 376.82

II 0 1.94 15.69

III 0 13.83

No segundo período de avaliação, a análise gráfica das variáveis canônicas

revelaram maior dissimilaridade genética entre o grupo I e VI (621,08), os quais estão

incluídos os genitores masculino e feminino, e os demais grupos formados com base nas

características (Tabela 11). Menor distância foi verificada entre os grupos IV e V (8,04)

(Tabela 11).

121

Tabela 11. Distância entre os grupos formados pelo método Ward-MLMpara variáveis

quantitativas avaliadas no segundo período em progênies híbridas F1 de Passiflora.

Grupos I II III IV V VI

I 0 19.05 71.30 37.66 41.08 621.08

II 0 33.38 14.88 9.06 555.16

III 0 18.95 16.78 550.48

IV 0 8.04 549.09

V 0 562.84

4 DISCUSSÃO

Estudos de divergência genética têm grande importância para o melhoramento

genético em espécies de Passiflora, pois revela a diferenciação de genótipos, que está

relacionada com a variabilidade genética (SANTOS et al., 2011). Neste estudo, a

utilização de características morfológicas quantitativas e qualitativas,

concomitantemente através da abordagem Ward-MLM permitiu a definição de quatro e

seis grupos. A dissimilaridade observada no primeiro e segundo período de avaliação,

respectivamente, indica que estas características são eficazes para a diferenciação de

genitores e híbridos.

A formação do número de grupos pode está relacionada ao número de acessos,

espécies, genótipos, as características avaliadas, como tipo e quantidade (GONÇALVES

et al., 2009), ou o período de avaliação, como neste estudo onde a avaliação

morfológica foi realizada em dois períodos diferentes (verão e inverno). O método

Ward-MLM tem sido utilizado em algumas culturas de importância econômica, como

em maracujazeiro, (SANTOS 2013), tomateiro (GONÇALVES et al., 2009) e

mamoneira (OLIVEIRA, 2013).

Nesse estudo, em ambos os períodos de avaliação o grupo o qual o genitor

feminino está presente foi o que obteve os maiores valores para a maioria das

características florais, incluindo o DF, LP, CS, LS e CS, característica estas que são de

interesse ornamental. Desta forma, pode-se selecionar genótipos do grupo IV obtidos no

primeiro período de avaliação, uma vez que a seleção de genótipos pode ser com base

em caracteres quantitativos e qualitativos. Com o objetivo de estudar a diversidade

genética entre 11 espécies de Passiflora, Paiva et al. (2014), observaram que o grupo o

qual a espécie P. coccinea estava incluída, apresentou maiores médias para o diâmetro

122

da flor, comprimento da pétala, sépala, bráctea e androginóforo, fato também verificado

em ambos os períodos de avaliação.

No grupo I está contido genótipos que além de apresentarem maior DF, LP, CS,

LS e CS, também contem genótipos com bandamento na corona. Estas características

que agregam valor ornamental, possibilitando a seleção de genótipos voltados para o

melhoramento de plantas ornamentais (MELO et al., 2015). Em híbridos F1

retrocruzados (RC1) de Passiflora, a seleção de plantas também foi baseada nos

descritores quantitativos e qualitativos de forma conjunta, sendo que muitos genótipos

retrocruzados apresentaram potencial para uso ornamental e que também poderiam ser

utilizados no desenvolvimento de novas variedades (MELO et al., 2015).

Nas espécies de Passiflora, o comprimeno do androginóforo é considerada uma

característica relevante nas avaliações, pois está relacionada à polinização, e

consequentemente à produção (SANTOS, 2013). Neste estudo, em ambos os períodos

de avaliação, o comprimento do androginóforo foi menor nos genótipos incluídos no

grupo I. O androginóforo menor facilita a polinização, principalmente por insetos

menores, uma vez que a distância entre o estigma e a corona é minimizada (SIQUEIRA

et al., 2009).

Em ambos os períodos de avaliação, verificou-se menor similaridade entre os

grupos em que os genitores estão inseridos, indicando que os descritores utilizados na

análise são eficientes para o estudo da divergência genética nos genótipos híbridos e

genitores. Por outro lado, a maioria dos genótipos híbridos encontra-se nos grupos em

que os genitores não estão presentes, indicando que estes genótipos apresentam

características mais distantes dos genitores. No primeiro período de avaliação, há várias

diferenças encontradas entre o grupo I e IV que favoreceu para menor similaridade entre

esses grupos. Dentre elas, o diâmetro da flor, tamanho do segundo filamento da corona

e bandamento na corona, em que os genótipos contidos no grupo I possuem flores

menores, com menor comprimento do segundo filamento da corona e genótipos com

bandamento da corona ausente. Enquanto o grupo IV caracterizou-se por apresentar

flores grandes, com maior comprimento do segundo filamento da corona e genótipos

com bandamento da corona. No segundo período de avaliação, as diferenças

encontradas entre o grupo I e VI que favoreceu para menor similaridade foram

basicamente às mesmas para o primeiro período.

Em programas de melhoramento, o conhecimento das distâncias entre os grupos é

importante, pois auxilia na seleção de genitores adequados à obtenção de híbridos com

123

maior efeito heteróticos, além de poder recuperar segregantes em gerações avançadas

(CRUZ, 2006). A partir de descritores morfológicos, foi realizada análise de diversidade

genética, em híbridos interespecíficos com potencial ornamental, para identificar a

variabilidade genética e a distância entre os genótipos híbridos e seus genitores. Neste

estudo foi observado maior similaridade entre o genitor masculino e a progênie híbrida

(SANTOS et al., 2011). Em híbridos RC1 de Passiflora, a menor similaridade ocorreu

entre o genitore recorrente e os genótipos RC1 em ambos os períodos de avaliação

(MELO et al., 2015).

Com base na elevada porcentagem das duas primeiras variáveis canônicas foi

escolhido o gráfico bidimensional. Estas duas primeiras variáveis canônicas explicam

98,11% e 89,00% da variação, no primeiro e segundo período de avaliação,

respectivamente, evidenciando que este tipo de gráfico é mais indicado para a explicar

as relações entre os grupos e entre os genótipos dentro dos grupos (CABRAL et al.,

2010). Este fato também foi observardo em outras espécies de Passiflora, no qual as

duas primeiras variáveis canônicas explicaram 91,65% da variação total em genótipos

híbridos obtidos do cruazamento entre Passiflora edulis vs. P. setacea obtidas pelo

método Ward-MLM (SANTOS, 2013). As duas primeiras variáveis canônicas por meio

da metodologia Ward-MLM explicaram 95% da variação total em Ricinus communis L.

(OLIVEIRA et al., 2013). Quando as duas primeiras variáveis canônicas encontram-se

acima de 80% da variação total, a interpretação da variabilidade entre os genótipos é

satisfatória (CRUZ; CARNEIRO, 2006), assim como ocorreu neste estudo. Por outro

lado, as variáveis canônicas podem ser representadas em gráfico tridimensional. Isto

ocorre, quando as duas primeiras variáveis canônicas não explicam a variabilidade total,

sendo necessária inserir a terceira variável. Este fato, foi obeservado em Psidium

guajava L., no qual as duas primeiras variáveis foram responsáveis por 61,79%, sendo a

primeira responsável por 39,12% e a segunda por 22,68%. Porém, com a introdução da

terceira variável canônica (19,50%), obteve-se 81,30% da variação total, o que explicam

grande porcentagem da variação (CAMPOS et al., 2013).

5 CONCLUSÕES

De acordo com as características morfológicas existe diversidade genética entre os

genótipos híbridos e as espécies genitoras, que pode ser explorada em programas de

melhoramento de Passiflora ornamental.

124

Estes resultados podem direcionar futuros cruzamentos entre indíviduos do grupo

I e IV, em ambos os períodos de avaliação, uma vez que estes grupos apresentam os

maiores valores para algumas características quantitativas, principalmente as

características relacionadas a flor.

A partir das características florais, pode-se selecionar genótipos promissores, os

quais propiciarão ganhos de forma mais vantajosa com base em sua seleção. Para isto,

os genótipos superiores do grupo I poderão ser retrocruzados com o genitor feminino,

que está incluído no grupo VI, com intuito de obter plantas ainda mais promissoras.

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127

CAPÍTULO 5

CITOGENÉTICA COMPARATIVA E HIBRIDAÇÃO IN SITU PARA A

DETERMINAÇÃO DO CARÁTER HÍBRIDO DE PROGÊNIE

INTERESPECÍFICA F1 DE Passiflora (P. coccinea vs. P. hatschbachii)

RESUMO

Este estudo teve como objetivo caracterizar o cariótipo e confirmar a hibridação

interespecífica em 16 híbridos oriundos do cruzamento entre P. coccinea Aubl. vs. P.

hatschbachii Cervi, mediante combinação de técnicas de citogenética clássica e

molecular. Para isto foi utilizado a coloração convencional para analises cariotípicas; foi

realizado a técnica de bandamento CMA3/DAPI para identificação das regiões ricas em

GC e AT, foi aplicado a Hibridação Genômica In Situ (GISH) usando as sondas de

ambos os genitores, sem adição do DNA de bloqueio, para detecção dos genomas

parentais nos híbridos e foi utilizado a Hibridação In Situ Florescente (FISH) para

localização de sítios de DNA Sat e 5S para confirmação de paternidade. Os híbridos

apresentaram o mesmo número cromossômico que as espécies genitoras, 2n = 18. A

análise com os fluorocromos CMA3/DAPI possibilitou a visualização de

heterocromatina rica em GC, cuja região corresponde aos satélites (constrição

secundária), os quais não foram visualizadas através da coloração convencional

utilizando Giemsa 4%. A GISH permitiu a distinção dos genomas de cada genitor nos

16 híbridos. Em P. coccinea, através da FISH os cromossomos marcadores foram

identificados no quinto e sexto par, e no terceiro e sétimo par em P. hatschbachii, os

quais correspondem os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. Estes marcadores

cromossômicos foram observados em todos os híbridos analisados, indentificando os

genomas do genitores na progênie híbrida F1. A aplicação das sondas de DNA

genômico e ribossômico possibilitou a diferenciação dos cromossomos das espécies

genitoras no genoma dos híbridos interespecíficos F1, demonstrando que o uso

simultâneo é ainda mais efetivo na confirmação da fecundação cruzada e estas técnicas

podem ser adotadas em programas de melhoramento de Passiflora. A GISH e a FISH

além de permitirem a confirmação das hibridações, permite a visualização de

estabilidade entre os genomas genitores nos híbridos pela ausência de translocações

entre genomas e a não visualização de modificações genômicas de âmbito citológico.

Palavras–chave: Hibridação interespecífica, citogenética clássica, citogenética

molecular, GISH, FISH.

128

COMPARATIVE CYTOGENETICS AND IN SITU HYBRIDIZATION FOR

THE DETERMINATION OF THE INTERPRETED PROGENETIC HYBRID

CHARACTER F1 OF Passiflora (P. coccinea vs. P. hatschbachii)

ABSTRACT

This study aimed to characterize the karyotype and to confirm interspecific

hybridization in 16 hybrids from the cross between P. coccinea Aubl. vs. P.

hatschbachii Cervi, by combining classical and molecular cytogenetic techniques. For

this, conventional staining was used for karyotypic analyzes; the CMA3/DAPI banding

technique was used to identify the regions rich in GC and AT, the Genomic In Situ

Hybridization (GISH) was applied using the probes of both parents, without addition of

the blocking DNA, to detect the parental genomes in the hybrids and Flourescent In Situ

Hybridization (FISH) was used to locate DNA Sat and rDNA 5S sites for confirmation

of paternity. The hybrids presented the same chromosomal number as the genitor

species, 2n = 18. The analysis with the fluorochromes CMA3/DAPI allowed the

visualization of heterochromatin rich in GC, whose region corresponds to the satellites

(secondary constriction) which was not possible through coloration using Giemsa 4%.

GISH allowed the genome distinction of each parent in the 16 hybrids. In P. coccinea,

the marker chromosomes were identified in the fifth and sixth pair, and in the third and

seventh pair in P. hatschbachii, which correspond to the DNA Sat and rDNA 5S sites,

respectively. These chromosomal markers were observed in all hybrids analyzed,

identifying the genomes of the parents in hybrid F1. The application of the genomic and

ribosomal DNA probes allows the differentiation of the chromosomes of the genitor

species in the genome of interspecific hybrids F1, demonstrating that the simultaneous

use is even more effective in the confirmation of cross fertilization and these techniques

can be adopted in Passiflora breeding programs. GISH and FISH, besides allowing the

confirmation of the hybridizations, allows the visualization of stability between the

genomes of the genomes in the hybrids by the absence of translocations between

genomes and the non-visualization of genomic modifications of cytological scope.

Keywords: Interspecific hybridization, classical cytogenetics, molecular cytogenetics,

GISH, FISH.

129

1 INTRODUÇÃO

O gênero Passiflora L. é considerado o maior e mais importante dentro da família

Passifloraceae, por apresentar um grande número de espécies (CERVI; IMIG, 2013), as

quais produzem flores de beleza única, com características (formas, tamanhos, cores e

presença da corona) que confere potencial ornamental (ABREU 2009). As espécies

deste gênero para uso ornamental têm sido exploradas de forma mais significativa nos

Estados Unidos, Japão e em alguns países da Europa (BERNACCI et al., 2013). No

Brasil, o interesse destas espécies para ornamentação está sendo aos poucos ampliado,

com o desenvolvimento de híbridos ornamentais com flores peculiares que atendam a

diferentes ambientes (BELO, 2010; CONCEIÇÃO et al. 2011; SANTOS et al., 2012,

ULMER; MACDOUGAL, 2004).

A hibridação interespecífica entre espécies silvestres de Passiflora é uma

estratégia relevante nos programas de melhoramento de plantas não apenas para

transferência de genes de uma espécie resistente para uma suscetível, como também na

produção de híbridos ornamentais, cuja estratégia visa plantas com características

únicas e com vigor híbrido (SANTOS, 2008).

A identificação de híbridos pode ser realizada através de diversas técnicas, desde

as mais simples, com base em características morfológicas (OLIVEIRA et al., 2005) até

as mais sofisticadas, envolvendo marcadores moleculares, análises citogenéticas

clássica e molecular. Do ponto de vista da análise de citogenética molecular, a

Hibridação Genômica In Situ (GISH) é eficiente na distinção de genomas e possibilita a

identificação de híbridos naturais e artificiais (SILVA; SOUZA, 2013). Esta técnica

consiste no uso do DNA genômico total de uma espécie como sonda e na aplicação de

DNA de bloqueio da outra espécie, possibilitando a distinção de ambos os genomas das

espécies genitoras no híbrido (SILVA; SOUZA, 2013). Na aplicação da GISH para

identificação de híbridos, também pode ser utilizado simultâneamente duas sondas,

sendo as sondas de ambos os genitores (MELO et al., 2015), a qual é chamada de GISH

multicolor (LI et al., 2001; XIONG et al., 2006).

Outra técnica citogenética molecular útil para a confirmação de híbridos é a

Hibridação In Situ Fluorescente (FISH), a qual localiza sequências específicas no

genoma, como sítios de DNA ribossômicos 45S e 5S e sítios teloméricos (MELO;

GUERRA, 2003; MELO et al., 2011; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press).

130

Esses sítios servem como marcadores cromossômicos específicos para distinção dos

genomas das espécies genitoras em plantas híbridas (SILVA; SOUZA, 2013).

O uso das técnicas citogenéticas moleculares no estudo de hibridações em

espécies de Passiflora é considerado recente, sendo o primeiro relato em 2015 apenas

da FISH, utilizando a sonda de DNAr 45S e 5S (MELO et al., 2015). Porém, estão

sendo desenvolvidos estudos com o gênero na aplicação da FISH e GISH na

confirmação de paternidade de híbridos (COELHO et al 2016; MELO et al., 2017;

SILVA et al., 2017 in press). Do ponto de vista do melhoramento de plantas, as análises

citogenéticas são muito importantes para caracterização de germoplasma, pois o

melhoristas pode selecionar genótipos estáveis cariotipicamente e sem variações

meióticas, já que estes fatores podem afetar a reprodução e a produção (GUERRA et al.,

2013).

O uso da citogenética clássica, através da coloração com Giemsa, possibilita o

conhecimento do cariótipo, como tamanho, número e morfologia de cromossomos além

de permitir a identificação da localização de satélites, em determinadas situações

(MELO, et al., 2011). Os fluorocromos CMA3 (cromomicina A3) e DAPI (4 ', 6-

diamidino-2-fenilindole) são bastante úteis para a identificação de heterocromatina rica

em GC e AT. Em Passiflora as regiões ricas em GC são restritas a Região Organizadora

de Nucléolo (RON) (MELO et al., 2014). Desta forma, auxilia na identificação dos

satélites que podem ser utilizados na identificação de híbridos (ORTOLONI et al.,

2007; COELHO et al 2016).

Este estudo teve como objetivo caracterizar o cariótipo e confirmar a hibridação

interespecífica em híbridos oriundos do cruzamento entre P. coccinea vs. P.

hatschbachii, mediante citogenética clássica e molecular. Para isto foi aplicado a GISH

usando as sondas dos genitores para detecção dos genomas parentais nos híbridos e foi

utilizado a FISH para localização de sítios de DNA Sat e DNAr 5S como marcadores

cromossômicos.

131

2 MATERIAL E METODOS

2.1 Material vegetal

Foram realizadas análises citogenéticas nos genitores P. coccinea e P.

hatschbachii e em 16 híbridos interespecíficos, cuja progênie foi denominada de HD25

(HD25 101, HD25 106, HD25 109, HD25 125, HD25 133, HD25 140, HD25 143,


244, HD25 245). Foram escolhidos estes híbridos para análise pelo fato deles

apresentarem algumas diferenças na morfologia floral (flores com mancha nas sépalas,

cor da flor mais intensa, bandamento na corona) e diferenças no aspecto da planta

(Figura 1). As espécies genitoras e os híbridos foram mantidos em condições de campo,

localizado no Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), no município

de Ilhéus, Bahia (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m).

132

Figura 1. Amostra representativa de híbridos interespecíficos F1 obtida do cruzamento

entre Passiflora coccinea (A) (genitor materno) vs. P. hatschbachii (B) (genitor

paterno), evidenciando diferenças na morfologia floral: (C) HD25 140 - flor com

aspecto normal, (D) HD25 143 - manchas nas sépalas (seta), (E) HD25 238 -

bandamento nos primeiros filamentos da corona (seta), (F) HD25 245 - flor

apresentando coloração mais intensa. (G) Aspecto da planta do híbrido HD25 143, (H-J)

Diferença na morfologia foliar: (H) Folha de P. coccinea, (I) Folha do híbrido HD25

244, (J) Folha de P. hatschbachii.

133

2.2 Preparo de lâminas

As radículas foram coletadas com aproximadamente um centímetro de

comprimento, proveniente de estacas mantidas em sacos plásticos de polietileno

contendo areia lavada. O material foi pré-tratado com 8-hidroxiquinolina (8-HQ) a

0,002 M por uma hora em temperatura ambiente (TA) e mais 21 h a ± 8-10 ºC, lavadas

duas vezes em água destilada e fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético glacial [3:1],

v/v; JOHANSEN, 1940) por 3 h em TA, depois foram mantidas a -20 °C até sua

utilização. O preparo citológico das lâminas seguiu o protocolo proposto por Guerra e

Souza (2002), no qual foram feitas duas lavagens em água destilada nos ápices de raízes

e em seguida digeridas com o uso da solução enzimática de 2% celulase e 20%

pectinase (w/v) incubadas em estufa a 37º C por uma hora e 20 minutos. Após esse

período as raízes foram lavadas novamente com água destilada para retirada da enzima

e em seguida maceradas em 6 μl de ácido acético 45% com auxílio de agulhas. Foi

depositado sobre o material lamínula 18 x 18 e com a ajuda da pinça e papel de filtro foi

feito o espalhamento do material biológico. Utilizando o papel de filtro foi feito uma

pressão com o dedo de forma delicada sob a lamínula para espalhamento dos

cromossomos. Posteriormente, as lâminas foram mantidas em nitrogênio líquido por no

mínimo 5 minutos e então foi retirada a lamínula com auxílio de um bisturi e logo secas

ao ar. As lâminas analisadas e que apresentaram boas metáfases foram mantidas a -20

°C até a aplicação das técnicas.

2.3 Coloração convencional e análise com fluorocromos CMA3 e DAPI

Foi realizada a coloração convencional seguindo o protocolo proposto por Guerra

e Souza (2002) para o estabelecimento do número cromossômico, com modificações,

em que o material foi corado com Giemsa 4% (Merck®) por 20 minutos, com posterior

lavagem em água destilada e seca ao ar. Após esse período foi realizado a montagem

com lamínula em meio Neomount (Merck®).

Foram usados os fluorocromos CMA3 e DAPI para identificação da

heterocromatina rica em GC e AT, respectivamente. O procedimento da dupla coloração

CMA3/DAPI seguiu o protocolo proposto por Guerra e Souza (2002), com modificação

na concentração do CMA3, que consistiu na aplicação de 15 μl desse fluorocromo

(0,125 mg/ml) sobre as lâminas por uma hora, lavadas com água destilada e secas. Em

134

seguida em cada lâmina foi aplicado 15 μl de DAPI (0,5 mg/ml) por meia hora, lavadas

e secas. Posteriormente as lâminas foram montadas com 15 μl do meio de montagem

glicerol/Macllvaine (1:1 v/v) usando uma lamínula de 20 x 20 mm e envelhecidas por

três dias para posterior análise.

As metáfases foram fotodocumentadas com a utilização do microscópio de

epifluorescência Olympus BX41 equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25

pelo software DP2-BSW. O CMA3 foi detectado com filtro U-MWV (450-480nm de

exitação) e o DAPI foi detectado com filtro U-MWU (330-385nm de excitação).

2.4 Extração do DNA e produção das sondas para GISH e FISH

Para o procedimento da GISH, foi realizada a extração do DNA genômico dos

genitores de acordo com o protocolo proposto por Doyle e Doyle (1990), com algumas

modificações (MELO et al., 2015), sendo coletadas folhas jovens em duplicata,

maceradas em nitrogênio líquido, colocadas em tampão de extração CTAB 2% [NaCl a

1,5 M; EDTA a 20 mM; Tris-HCl a 100 mM; B-Mercaptoetanol a 0,2%]. Os ácidos

nucleicos foram isolados com solução (24:1) clorofórmio: álcool isoamílico e a

ressuspensão do DNA foi realizada em tampão TE [Tris a 10 mM; EDTA a 1 mM]. A

concentração do DNA genômico extraído foi inferido com base na comparação com 100

ng de DNA lambda em eletroforese em gel de agarose 1% (Pronadisa), corado com

SYBR safe (Invitrogen®).

Aproximadamente 20 μg de DNA genômico dos genitores em um volume final

de 200 μL foi fragmentado com o auxílio de um sonicador (Qsonica, Q125), com a

programação para a amplitude 40%, 2 segundos ligado e 2 segundos deligado, com o

tempo total de 5 minutos (JAUHAR; PETERSON, 2006). O tamanho dos fragmentos

foi detectado em gel de agarose 2% (Pronadisa) utilizando como parâmetro o marcador

ladder 100 pb (NEB, new england biolabs). Posteriormente foi realizada a purificação

do DNA fragmentado com 2% do volume final de acetato de sódio a 3 M mais 200% do

volume final de etanol P.A. O material foi colocado a -20 ºC overnight e, no dia

seguinte, centrifugado por 10 min a 14.000 rmp a 20ºC para a eliminação do

sobrenadante e posterior secagem em TA por no mínimo 1 hora. A ressuspensão do

pellet foi realizado com água ultrapura com o volume necessário para concentração final

de 1,1 μg/μL de DNA clivado. A marcação da sonda do genitor materno (P. coccinea)

foi realizada por Nick translation com Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics®) e

135

do genitor paterno (P. hatschbachii) com Biotina-16-dUTP, na concentração final de 1

μg de DNA clivado, seguindo o protocolo proposto pelo fabricante.

Para a FISH a sonda construída para o DNA satélite (CL69 PeSat_2) que

colocalizam com os sítios de DNAr 45S, foi obtida por amplificação via PCR com o par

de primers (L-TGAGCAGTTCCACCGTGTATAG; R-

ATGCACTCTGCGTACTAAACCA) (PAMPONÉT, 2017). A sonda 5S foi obtida com

os pares de primers 5'-GTGCGATCATACCAG C(AG)(CT)TAATGCACCGG-3' e 5'-

GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGA GG-3' para DNAr 5S. A sequência de

DNAr 5S foi desenvolvida para Glicine max L. (GOTTLOB-MCHUGH et al., 1990) e

utilizado em Passiflora (MELO; GUERRA, 2003). A sonda CL69 PeSat_2 foi marcada

com Biotina-16-dUTP (Roche Diagnostics®) e a sonda 5S foi maracada com a

Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics). As sondas foram marcadas por Nick

tranlation, com concentração final de 1 μg de DNA clivado, seguindo o protocolo

proposto pelo fabricante.

2.5 Aplicação de FISH e GISH

O tratamento das lâminas seguiu o protocolo para FISH proposto por

Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) e Souza et al. (2010), com modificações

realizadas por Melo et al (2015). As lâminas contendo as metáfases mitóticas foram

colocadas em estufa a 37 °C por 1 h e após esse período foi aplicado de 50 μl de RNase

(Sigma) a 1 μg/mL em tampão 2xSSC (cloreto de sódio a 0,3 M, Sigma; citrato de sódio

a 0,03 M, Sigma), as quais foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37°C. As

lâminas foram imersas em 2xSSC em temperatura ambiente (TA) duas vezes por 5 min

cada; 50 μL de HCl a 10 mM foi adicionado sobre as metáfases por 5 min e após

retirada do HCl, foi adicionado 50 μL de pepsina (Sigma) [pepsina a 10 mg/mL; HCl a

10 mM (1:100 v/v)] e incubadas em câmara úmida por 20 min a 37°C. As lâminas

foram lavadas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada em plataforma agitadora a

120 rpm (Biomixer, Mos-1), imersas em paraformaldeido a 4% em TA por 10 min, e

novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min cada. O material citológico foi

desidratado em etanol 70% e etanol 96% por 5 min cada, para aplicação da mistura de

hibridação.

Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de

hibridação com o volume final de 15μl, sendo formamida 50% (Sigma), dextran sulfato

136

10% (Sigma), 2xSSC, SDS 0,13% (Dodecil sulfato de sódio) (Bioagency). No

procedimeno da GISH, para a identificação dos híbridos, foram utilizados 33 ng de cada

sonda no mix de hibridação. Para a FISH, foram utilizados 50 ng das sondas. A mistura

de hibridação foi aquecida a 75 °C por 10 min em termociclador (Eppendorf,

Mastercycler) e transferida para gelo por no mínimo de 5 min. As lâminas contendo a

mistura de hibridação foram desnaturadas em termociclador contendo um adaptador

para lâminas (Techne, TC-412) a 75 °C por 10 min e incubadas overnight a 37 °C em

câmara úmida. Após a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5

min para a remoção das lamínulas. Os banhos pós-hibridação foram realizados em

banho Dubnoff (Quimis, 9226ML), a 42 ºC, consistindo em duas imersões em 2xSSC

por 5 min cada, duas em 0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por

5 min cada. As lâminas foram imersas em 4xSSC/Tween 20 a 0,2% (Sigma) em TA por

5 min e tratadas com 50μl de BSA (Sigma) a 5%. As sondas marcadas com biotina

foram detectadas com 0,7 μl de avidina-FITC (Vector) e as sondas marcadas com

digoxinenina foram detectadas com 0,7 μl anti-digoxigenina-rodamina (Roche®) mais

18,6 μL BSA 5% por lâmina. As lâminas contendo o anticorpo para a detecção foram

incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 °C. Foram realizados três banhos por 5 min

cada para a retirada do excesso de anticorpo com 4xSSC/Tween 20 a 0,2% em TA. As

lâminas foram rapidamente imersas em 2xSSC e logo foram montadas e contracoradas

com Vectashield ® Antifade Mounting Medium DAPI (H-1200), estocadas a ± 8 - 10 °C

até análise.

Com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus BX41 equipado

com câmera digital de 5M Olympus DP25 pelo software DP2-BSW as metáfases foram

fotodocumentadas. As hibridações detectadas com avidina-FITC foram visualizadas

com o uso do filtro U-MWB (excitação 450-480nm/dichroic cutoff 500nm/emissão >

515nm). As hibridações detectadas com anti-digoxigenina-rodamina foram visualizadas

com o filtro U-MWG (excitação 510-550 nm /dichroic cutoff 570nm/emissão >

590nm). O DAPI foi detectado através do filtro U-MWU (excitação 330-

385nm/dichroic cutoff 400nm/emissão > 420nm). A confecção das pranchas e

sobreposições FITC/rodamina foi realizada com o uso do software photoshop SC5. Os

ideogramas foram elaborados utilizando o software Corel Draw® X7 (Corel

Corporation, Canada).

137

3 RESULTADOS

3.1 Coloração convencional

O número cromossômico diploide 2n = 18 foi verificado nas espécies genitoras, P.

coccinea e P. hatschbachii e nos 16 híbridos interespecíficos HD25 (Figura 2). Através

da coloração convencional não possível realizar a identificação dos pares

cromossômicos homeólogos, pois a identificação precisa de satélites ou distinção na

posição de centrômeros entre pares foi impossibilitada, sendo possível a verificação em

poucas metáfases. Desta forma as medições foram realizadas em todo o cromossomo,

incluindo braço curto, braço longo e satélite (comprimento total) e a partir destas

medições foram produzidos os ideogramas (Figuras 8 e 9), com base na média do

comprimento total dos cromossomos das cinco metáfases dos 18 cromossomos para os

híbridos e com base nas medidas do comprimento total dos pares cromossômicos para

os genitores.

138

Figura 2. Metáfases mitóticas em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora

(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)

HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156,

(K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P)

HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.

139

3.2 Bandamento CMA3 e DAPI

A análise com os fluorocromos CMA3/DAPI possibilitou a visualização de

heterocromatina rica em GC, cuja região corresponde aos satélites (constrição

secundária). Os genitores, P. coccinea e P. hatschbachii, apresentaram dois pares de

cromossomos com blocos CMA3+/DAPI-

(Figuras 3 A e B). Em todos os híbridos F1 foi

possível a observação de blocos CMA3+, confirmando o número de satélites igual aos

dos genitores (Figura 3, 4, 8 e 9; Tabela 1).

Os cariogramas dos genitores foram elaborados levando em consideração o

tamanho cromossômico, seguindo a ordem decrescente. A elaboração dos cariogramas

dos híbridos foi com base nos cromossomos homeólogos e não no tamanho

cromossômico, sendo que a disposição dos cromossomos não seguiu a ordem

decrescente. Foi realizada a identificação dos cromossomos no cariótipo dos genitores a

partir de letras e números. Para o genitor materno, P. coccinea, foi designado para os

pares cromossômicos de 1 a 9, os cromossomos de 1A a 9I (Figura 4A). Para o genitor

paterno, P. hatschbachii, foi denominado de 1a a 9i para os pares cromossômicos de 1 a

9 (Figura 4B). Para os genótipos híbridos a denominação no cariótipo foi com base nos

cromossomos marcadores dos genitores, com a presença dos blocos CMA3+ com

segregação nos híbridos. Os pares cromossômicos 5E e 8H do genitor P. coccinea

apresentaram os blocos CMA3+

(Figura 4A) e os pares cromossômicos 3c e 8h do

genitor P. hatschbachii apresentaram os blocos CMA3+

(Figura 4B).

Os 16 híbridos analisados foram numerados e nomeados apresentando os blocos

CMA3+ como marcadores para a identificação. Foi escolhido como marcador o

cromossomo 5E e 3c dos genitores P. coccinea e P. hatschbachii, respectivamente,

ambos nos braços longos, uma vez que esses cromossomos apresentaram marcas

exclusivas para cada genitor na confirmação do status híbrido dos genótipos. Neste

sentido, em todas as plantas híbridas foram identificados os cromossomos com blocos

CMA3+ em regiões específicas para cada genitor doador (Figura 4C - R).

140

Figura 3. Coloração com fluorocromos utilizando CMA3 e DAPI para localização de

heterocromatina em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A)

P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F)

HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187,

(L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q)

HD25 244, (R) HD25 245. As setas indicam blocos CMA3+. Barra 10 μm.

141

Figura 4. Cariogramas das metáfases mitóticas com bandamento CMA3/DAPI em

genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P.

hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25

133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M)

HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25

245. As letras e números nos genitores indicam os pares cromossômicos. As letras e

números nos híbridos indicam os cromossomos com os blocos CMA3+. Barra 10 μm.

3.3 GISH

A GISH utilizando as sondas dos genitores concomitantemente e sem o uso de

DNA de bloqueio na mistura de hibridação permitiu a distinção dos genomas de cada

genitor nos 16 híbridos (Figura 5), comprovando o caráter híbrido das plantas F1 em

estudo. Em cada híbrido foi visualizado nove cromossomos hibridados uniformemente

com a sonda do genitor paterno, detectados com avidina-FITC (verde) e os nove

cromossomos hibridados com a sonda do genitor materno, detectados com

antidigoxigenina-rodamina (vermelho).

142

Figura 5. Hibridização Genômica In Situ (GISH) em metáfases mitóticas dos híbridos

interespecíficos obtidos do cruzamento entre P. coccinea (cromossomos vermelhos) e P.

hatschbachii (cromossomos verdes). (A) HD25 101, (B) HD25 106, (C) HD25 109, (D)

HD25 125, (E) HD25 133, (F) HD25 140, (G) HD25 143, (H) HD25 156, (I) HD25

187, (J) HD25 190, (K) HD25 218, (L) HD25 224, (M) HD25 237, (N) HD25 238, (O)

HD25 244, (P) HD25 245. Barra 10 μm.

3.4 FISH

Foram mapeados os cromossomos dos genitores e os híbridos refrentes aos sítios

de DNA Sat (colocalizado com sítios de DNAr 45S) e DNAr 5S (Figuras 6 - 9). Através

da FISH utilizando a sonda de DNA Sat foi possível identificar os satélites (constrição

secundária) não visualizados na coloração convencional. Foram observados quatro sítios

de DNA Sat e dois sítios de DNAr 5S em ambos os genitores que segregaram nos

genótipos híbridos (Tabela 1 e Figuras 6 - 9).

143

Os cariogramas dos genitores e híbridos com os sítios de hibridação de DNA Sat e

DNAr 5S foram elaborados seguindo o procedimento para a elaboração dos cariogramas

refente aos blocos CMA3+, sendo identificado os cromossomos no cariótipo dos

genitores a partir de letras e números. A identificação nos genótipos híbridos foi

realizada com base nos cromossomos marcadores dos genitores, com sítos de hibridação

de DNA Sat e DNAr 5S, os quais ocorrem nos híbridos. Portanto, os sítos de DNA Sat

em P. coccinea, foram observados nos pares cromossômicos 5E e 8H e os sítios de

DNAr 5S localizados no par 6F (Figura 7A). Em P. hatschbachii os pares

cromossômicos 3c e 8h apresetaram sítios de DNA Sat e o par 7g apresentou sítios de

DNAr 5S (Figura 7B).

Os híbridos interespecíficos F1 apresentaram dois pares cromossômicos com sítios

de hibridação de DNA Sat e um par com sítios de DNAr 5S, característica de cada

genitor (Figuras 6 - 9; Tabela 1) confirmando que todos os genótipos analisados são

híbridos.

Como objetivo de facilitar a identificação dos cromossomos marcadores, os

cariogramas dos híbridos foram numerados e nomeados unicamente com os

cromossomos marcadores, os quais revelaram os sítios de DNA Sat e DNAr 5S, (Figura

7C-R). Na espécie P. coccinea, o cromossomo 5E e 6F foram escolhidos como

marcadores, uma vez que foram exclusivos para a espécie (Figura 7A). O par 3c, em P.

hatschbachii, também confere como bom marcador cromossômico, na confirmação da

paternidade dos híbridos analisados, já que este marcador é exclusivo para a espécie,

assim como o par cromossômico 7g (Figura 8B).

Quanto aos outros cromossomos com sítios de DNA Sat não foram utilizados

como marcadores, pelo fato desses sítios estarem presentes no braço longo em ambos os

genitores. Além disso esses cromossomos são morfologicamente semelhantes, o que

impede a sua utilização de maneira confiável para a confirmação.

144

Figura 6. Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) com as sondas para sítios de DNAr 5S

(vermelho, indicado pelas setas) e DNA Satélite (sonda CL69 PeSat_2) (verde, indicado

pelas setas) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P.

coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25

125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L)

HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25

244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.

145

Figura 7. Cariogramas com sondas para sítios de DNAr 5S (vermelho) e DNA Satélite

(sonda CL69 PeSat_2) (verde) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora

(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)

HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156,

(K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P)

HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. As letras e números nos genitores indicam os

pares cromossômicos. As letras e números nos híbridos indicam os cromossomos com

os sítios de DNAr 5S e DNA Satélite. Barra 10 μm.

146

Figura 8. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA

Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de

Passiflora (2n = 18): (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25

106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J)

HD25 156.

147

Figura 9. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA

Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de

Passiflora (2n = 18): (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O)

HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245.

148

Tabela 1. Dados de bandamento CMA3, DNA Sat, DNAr 5S dos genitores Passiflora

coccinea e P. hatschbachii e híbridos interespecíficos F1 (2n = 18).

Genótipos CMA3+

DNA Sat (colocalizado

com DNAr 45S) DNAr 5S

P. coccinea 4 4 2

P. hatschbachii 4 4 2

HD25 101 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 106 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 109 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 125 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 133 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 140 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 143 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 156 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 187 4 4 (2M; 2P) 2(1M; 1P)

HD25 190 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 218 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 224 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 237 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 238 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 244 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

HD25 245 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)

Número de blocos CMA3 (CMA3+); número de sítios de DNA Sat (DNA Sat); número

de sítios 5S (DNAr 5S); sítio originado do genitor materno (M); sítio originado do

genitor paterno (P).

4 DISCUSSÃO

Muitas espécies de Passiflora tendem a apresentar cariótipo semelhante, com a

maioria dos cromossomos metacêntricos e com tamanhos similares (SOUZA et al.,

2008). Sendo assim, híbridos F1 apresentam semelhanças cariotípicas, levando a

dificuldades no pareamento de cromossomos homeólogos. Nesse sentido, a

caracterização cariotípica das plantas híbridas se torna uma tarefa difícil quando se

deseja comparar com o cariótipo dos genitores, ficando limitada apenas na contagem do

número cromossômico (SOARES-SCOTT et al., 2005). Em híbridos interespecíficos de

Passiflora, obtidos do cruzamento entre P. gardneri Mast. vs. P. gibertii N.E. BROW,

foi observado cariótipo similar tanto para as espécies genitoras quanto para os híbridos,

dificultando a distinção baseado no tamanho cromossômico (SILVA, 2014).

Neste estudo, através da coloração convencional não foi possivel identificar a

localização e o número de satélites (constrição secundária) nos genitores e híbridos,

uma vez que era visualizados em poucas metáfases mitóticas e de maneira imprecisa.

No entanto, através do bandamento CMA3, foi possível a identificação dos satélites de

149

forma segura. Em trabalhos anteriores através da coloração convencional, foi observado

a presença de dois pares com constrição secundária em P. coccinea e P. hatschbachii

(MELO et al., 2014; OLIVEIRA, 2017).

A identificação de blocos CMA3+

nos genitores constitui-se em uma ferramenta

que proporciona resultados informativos e precisos, permitindo a confirmação de

híbridos (SILVA et al., 2017, in press). Em Passiflora, blocos heterocromáticos ricos

em GC visualizados pelo fluorocromo CMA3 colocalizam em regiões de DNAr 45S

(MELO et al., 2014; BELO et al., 2015; SILVA et al., 2017 in press). Mais uma vez a

utilização do fluorocromo CMA3 mostra-se confiável quanto à localização de satélites

sendo importantes marcadores citológicos para identificação de híbridos

interespecíficos.

A GISH é bastante eficiente na discriminação de genomas das espécies genitoras

nos híbridos, tendo como base sondas genômicas (SILVA; SOUZA 2013; SILVA et al.,

2017 in press). Além disso, possibilita a identificação de recombinações cromossômicas

de híbridos retrocruzados (MELO et al., 2015), na investigação das relações genômicas

entre espécies (SILVA 2014) e no estudo da origem de genomas parentais de

poliploides (LIU; GU et al., 2011). Neste estudo foi usada a sonda de ambos os

genitores para confirmação da fecundação cruzada sendo observado a presença dos

genomas de P. coccinea e P. hatschbachii na composição genômica das plantas

híbridas.

Pelo fato das espécies genitoras pertencerem ao mesmo subgênero e secção, sendo

próximas filogeneticamente e compartilhando muitas sequencias repetitivas, foi

utilizada as sondas de ambos os genitores, visto que já foram observados resultados

positivos em híbridos F1 e retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2015). No

cruzamento artificial entre duas espécies de orquídeas (Paphiopedilum delenatii vs.

Paphiopedilum micranthum) também só foi possível à distinção dos genomas dos

genitores nos híbridos com a utilização das sondas de ambos os genitores, uma vez o

genomas desses indivíduos apresentam relações filogenéticas próximas (LEE et al.,

2011).

Para obtenção de resultados satisfatórios e confiáveis, muitas vezes é preciso o

ajuste da técnica de GISH, como, a utilização de sondas genômicas dos genitores,

modificações na concentração de DNA de bloqueio e sondas, bem como na melhor

definição do tamanho dos fragmentos de DNA usados no preparo de DNA de bloqueio

e sonda (SCHWARZACHER; HESLOP-HARRISON, 2000; MELO et al., 2015). O uso

150

de DNA de bloqueio 100x ou até 1000x mais concentrado que a sonda tem sido

empregada na distinção do genoma dos genitores devido ao grau de homologia que elas

podem apresentar (TANG et al., 2010; FRIENSEN; KLAAS, 1998), em função das

muitas sequências repetitivas compartilhadas (SILVA et al., 2017 in press). Em híbridos

interespecíficos resultantes do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii foi testado o

DNA de bloqueio do genitor materno 20x, 40x, 60x e 100x mais concentrado que o

DNA do genitor paterno. Nesse estudo foi verificado que o DNA de bloqueio 100x mais

concentrado que a sonda foi eficiente na distinção dos genomas dos genitores nos

híbridos, evitando a hibridação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).

A fluorescência amarela opaca visualizada nos cromossomos hibridados

utilizando a sonda detectada pela anti-digoxigenina-rodamina (Figura 5) observada com

o uso do mesmo filtro Olympus U-MWB (específico para a detecção FITC), foi devido

a mistura de sinais FITC (verde) - TRITC (vermelho), pois os locais de hibridação

fortes do TRITC são visualizados em uma mistura com os locais de hibridação FITC e a

fluorescência TRITC transforma -se em amarela (MELO et al., 2015).

Outro fator a ser considerado na eficiência da aplicação da GISH, está relacionado

com o tamanho cromossômico. Em algumas espécies como Brassica rapa L., B. napus

L. (YAO et al., 2010) e em espécies do gênero Citrus (FU et al., 2004), já foi reportado

que cromossomos pequenos podem limitar a aplicação da técnica, sendo que em

Brassica apenas as regiões pericentroméricas podem ser hibridadas (YAO et al., 2010).

Contudo, em híbridos retrocruzados de Passiflora, a aplicação da GISH evidencia

resultados eficientes em cromossomos pequenos, não sendo impecilho na aplicação

desta técnica (MELO et al., 2015).

O DNA Satélite (DNA Sat) colocalizam com o DNAr 45S, pois ele está

localizado nas regiões espaçadoras do DNAr 45S que é repetido em tandem. Neste

sentido, o número e a sua localização funcionam como marcadores cromossômicos que

auxiliam no processo de identificação cromossômica (SILVA, 2014) sendo importantes

na confirmação de hibridações interespecíficas.

A localização e o número de sítios observados na progênie híbrida foram

correspondentes aos sítios das espécies genitoras. Os cromossomos marcadores foram

identificados nos pares 5 e 6 para P. coccinea, e nos pares 3 e 7 para P. hatschbachii, o

qual corresponde os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. A variação do

número de sítios não observada nos híbridos HD25 sugere que os cromossomos

homeólogos são semelhantes, fato que pode ter contribuído para a estabilidade dos

151

cromossomos na progênie híbrida F1. Em híbridos interespecíficos de Passiflora obtidos

do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, a quantidade de sítios DNAr 45S

variou, onde foi observado híbridos com 5 e 6 sítios, umas vez que P. gibertii (genitor

paterno) apresentou 5 sítios e P. gardneri (genitor materno) 6 sítios. Ainda neste estudo,

os autores observaram que apenas o uso da sonda de rDNA 5S já seria capaz na

confirmação da fecundação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).

Neste trabalho foi utilizada a sonda CL69 Sat_2, a qual apresenta sítios de

hibridação que colocalizam com a região DNAr 45S (PAMPONÉT, 2017), com padrão

de marcação confiáveis na identificação da paternidade dos híbridos HD25,

confirmados também pela presença dos blocos CMA3+, o qual colocalizou com DNA

Sat. Assim como a sonda para DNA Sat foi eficiente, a sonda DNAr 5S também

utilizada como marcador permitiu a confirmação de paternidade. Na célula, estes tipos

de marcadores revelam informações que são observadas de forma clara, sendo eficiente

na confirmação de cruzamentos interespecíficos. Este procedimento pode ser realizado

em qualquer fase de desenvolvimento da planta, conferindo uma boa alternativa para

programas de melhoramento que compreende o método de hibridações interespecíficas

(SILVA, 2014).

A localização, assim como o polimorfismo de sítios ribossomais são importantes

para o estudo de relações evolutivas (PAMPONÉT, 2017). Em três espéceis de

Passiflora (P. edulis, P. serratodigitata e P. alata), por exemplo, foi possível observar

marcações cromossômicas para DNA Sat possibilitando diferenças na quantidade e

localização dos sítios de hibridação, sendo marcadores relevantes para caracterização de

espécies (PAMPONÉT, 2017). Neste estudo não foi observado a existência de

polimorfismo para os sítios de DNAr 5s e DNA Sat nas espécies genitoras e nos

genótipos híbridos. Por outro lado, em híbridos retrocruzados (RC1) de Passiflora foi

verificado polimorfismo no tamanho do sinal de hibridação para os sítios ribossomais

45S e 5S, devido a alterações/variações decorrentes dos cruzamentos entre espécies

diferentes (MELO et al., 2017).

Não foi observado diferenças na quantidade e número de sítios de hibridação dos

genótipos híbridos. Existem alguns fatores que podem justificar este fato. Os híbridos F1

não terem passado por recombinação meiótica, pois não tem recombinação com os

cromossomos das espécies genitoras no genoma do híbrido F1, sendo possível isto em

uma segunda geração de cruzamentos (F2). Alem disso, muitas das variações

encontradas citogenômicamente em plantas pode ocorrer devido a irregularidades na

152

segregação cromossômica (KIIHL et al., 2011), bem como por meio de alterações

cromossômicas estruturais, como translocação (MELO et al., 2017).

As sondas DNAr 5S e 45S também foram utilizadas no híbrido obtido do

cruzamento entre P. edulis Sims vs. P. cincinnata Mast. para a confirmação do caráter

híbrido, sendo identificados na progênie híbrida os sítios de cada genoma doador

(COELHO et al., 2016). O uso destas sondas possibilitou a identificação de variação no

número e localização de sítios de DNAr em híbridos retrocruzados de Passiflora,

revelando recombinação meiótica nestes híbridos (MELO et al., 2017). Em outros

gêneros como, Beta L. (DESEL et al., 2002), Brassica (HASTEROK et al., 2005),

Lilium L. (MARASEK et al., 2004) e Oryza L. (XIONG et al., 2006) a aplicação da

FISH também foi utilizados na determinação do status híbrido, utilizando estes tipos de

marcadores.

5 CONCLUSÕES

A aplicação das sondas de DNA genômico e ribossômico possibilita a

diferenciação dos cromossomos das espécies genitoras no genoma dos híbridos

interespecíficos F1, demonstrando que o uso simultâneo é ainda mais efetivo na

confirmação da fecundação cruzada e que estas técnicas podem ser adotadas em

programas de melhoramento de Passiflora.

A GISH e a FISH além de permitirem a confirmação das hibridações, permite a

visualização de estabilidade entre os genomas genitores nos híbridos pela ausência de

translocações entre genomas e a não visualização de modificações genômicas de âmbito

citológico.

6 AGRADECIMENTOS

Ao pós-doc Gonçalo Santos da Silva e ao coorientador Cláusio Antônio Ferreira

de Melo da Universidade Estadual de Santa Cruz no auxílio com as análises

citogenéticas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela concessão da bolsa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo

apoio financeiro à pesquisa.

153





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156

8 CONCLUSÕES GERAIS

A realizações das hibridações interespecíficas permitiu o conhecimento da

compatibilidade entre as espécies de Passiflora, sendo importante para encontrar

estratégias em programas de melhoramento de passifloras.

A hibridação interespecífica é um método de melhoramento eficiente para

obtenção de novos materiais, sendo identificados dois híbridos Passiflora ‘Vivis’ e P.

‘Jhovi’ com potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre

pérgulas ou serem cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes. Estes

híbridos apresentaram comportamento meiótico regular, podendo ser considerados

híbridos férteis.

A seleção de genótipos híbridos pode ser realizada com base em características

florais, pois estas apresentaram pouca influência ambiental (alta herdabilidade) e altos

valores de índice de variação.

A GISH e a FISH confirmaram a natureza híbrida das plantas, através da distinção

dos cromossomos das espécies genitoras no genoma dos híbridos F1, evidenciando que a

utilização de ambas as sondas dos genitores proporcionaram resultados ainda mais

efetivos na exclusão da hipótese de autofecundação.

157

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