UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA … · compostos fenólicos x rendimento de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO

MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para

obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na

Agricultura).

BOTUCATU - SP

Fevereirode 2013

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO

MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE

Orientador: prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para

obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na Agricultura).

BOTUCATU - SP

Fevereirode 2013

III

Aos meus pais,

João e Maria Helena ...

...que me deram a vida e que nunca mediram esforço para me dar tudo que estava ao seu alcance. Sempre estiveram ao meu lado me apoiando, me incentivando em tudo e corrigindo meus erros com sabedoria, dignidade e respeito. Sempre com muito amor, amor esse que é meu alicerce. Obrigada Deus por me dar a oportunidade de ser filha de tão pessoas maravilhosas.

Dedico.

IV

Aos meus irmãos, Marcos e André... ... que sempre estão ao meu lado, são meus conselheiros e companheiros.

A minhas cunhadas,

Edivirges e Andreia..... ... pelo carinho e incentivo diário.

Aos meus sobrinhos,

Matheus, Emanuel e Heitor .... ... que são o sol do meu dia, que alegram a minha vida e sempre estão me ensinando alguma coisa.

As minha avós,

Vó Cida (in memória) e Vó Angelina (in memória) .... ... que fizeram toda a diferença na minha vida, me ensinaram muitos valores e principalmente o amor a vida e pra com o próximo. Saudades.

Ofereço.

V

Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o sino que tine. E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse amor, nada seria.”

Paulo de Tarso

VI

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus, pela minha vida e por mais essa

oportunidade, juntamente com as pessoas que mais amo.

Agradeço meu orientador Waldemar GastoniVentiruni Filho, pelo apoio e

compreensão de sempre, entendendo minhas dificuldades e limitações, mas sempre

acreditando em mim. Obrigada pelo carinho, incentivo e paciência dedicados ao nosso

trabalho.

Ao Prof. ToshioNojimotoe aProfaMarthaMariaMischanpelas orientações de

estatística.

A ProfaDra Magali Leonel e ao Prof. Dr. Ricardo Figueira pelas sugestões

apresentadas na qualificação e na defesa que muito acrescentaram no meu trabalho e no

meu crescimento profissional.

A Luciana Brunelli que estava sempre pronta pra me ajudar.

Ao Roberto M. Fulan (in memoria) e ao Marcos A. Risseti que foram os

primeiros a acreditarem em mim como profissional, e a me dar várias oportunidades.

Muito obrigada pelo carinho, paciência e dedicação.

A Usina São Manoel, por me liberar para as aulas e permitir que o trabalho

fosse realizado na empresa.

Ao Cristiano Azeredo, que sempre me motivou em todos os momentos.

Também contribuiu diretamente com o assunto abordado neste trabalho.

Aos colaboradores do laboratório industrial que direta ou indiretamente

colaboraram para que tivéssemos os resultados das análises para a conclusão do

trabalho. Em especial a Roberta Bronzatto, Elisangela Madaleno e ao Elton Rodrigues

que muitas vezes participaram diretamente com muito companheirismo. Valeu pessoal!!

Ao Cleber Aguiar, que sempre esteve pronto para tirar dúvidas e ajudar.

Ao Bruno Innocenti, e aos colegas de trabalho que me estiveram presente no

dia-a-dia auxiliando direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse concluído.

As minhas amigas queridas Márcia Lafão, Jaqueline Travalim, Rosane

Menchiori Francisco, Kátia Castro, Eliana Alves, Andrea Benito que sempre me

apoiaram e vibraram com minhas conquistas. Que bom que Deus colocou vocês em

minha vida.

VII

A Andréia Innocenti, que muitas vezes foi um anjo em minha vida, sempre me

alertando para as matrículas e datas acadêmicas, me socorrendo em muitos momentos.

Aos meus familiares queridos que sempre estão junto comigo, me dando muito

amor e carinho, e tudo isso me dá forças para novos desafios. Principalmente aos meus

pais que sem eles, que são meus exemplos, nada disso estaria acontecendo.

VIII

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS .............................................................................................. XI

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. XII

RESUMO .................................................................................................................. 1

SUMMARY .............................................................................................................. 3

CAPÍTULO I ............................................................................................................. 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................. 6

1.1INTRODUÇÃO .................................................................................................. 6

1.2REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 8

1.2.1Cana-de-açúcar ............................................................................................... 8

1.2.2Mel final ou melaço ........................................................................................ 9

1.2.3Levedura Alcoólica ........................................................................................ 10

1.2.4Fermentação alcoólica .................................................................................... 15

1.2.4.1Processos ..................................................................................................... 16

1.2.4.2Processo batelada ......................................................................................... 17

1.2.4.3Processo batelada alimentada ...................................................................... 17

1.2.4.4Processo contínuo ........................................................................................ 18

1.2.5Fatores que interferem o processo fermentativo ............................................ 19

1.2.5.1 pH ................................................................................................................ 19

1.2.5.2Temperatura ................................................................................................. 20

1.2.6Contaminação microbiana .............................................................................. 21

1.2.7Culturas puras de levedura ............................................................................. 22

1.2.7.1Identificação da levedura no processo fermentativo ................................... 22

1.2.8Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ..................................................... 23

1.2.9Compostos fenólicos e fermentação alcoólica .............................................. 26

1.3REFERÊNCIAS ................................................................................................ 27

CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32

RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO

MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE

BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA

ALCOÓLICA............................................................................................................ 33

SUMMARY .............................................................................................................. 34

IX

2.1INTRODUÇÃO ................................................................................................. 35

2.2MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 36

2.2.1Descrição do processo industrial de fermentação .................................... 36

2.2.2Planejamento experimental e análise estatística ...................................... 38

2.3ANÁLISES QUÍMICAS E MIROBIOLÓGICAS ............................................ 38

2.3.1Compostos fenólicos ....................................................................................... 38

2.3.2Identificação das leveduras ..................................................................... 38

2.3.3Viabilidade, viabilidade de brotamento e brotamento celular ......................... 38

2.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 39

2.5CONCLUSÃO .................................................................................................... 45

2.6REFERÊNCIAS ................................................................................................. 45

CAPÍTULO III ................................................................................................... 47

RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS

DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR

SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO..................................................... 48

SUMMARY .............................................................................................................. 49

3.1INTRODUÇÃO .................................................................................................. 50

3.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 51

3.2.1Descrição do processo industrial de fermentação ..................................... 51

3.2.2Planejamento experimental e análise estatística ......................................... 52

3.3ANÁLISES QUÍMICAS E CALCULO DA EFICIÊCIA FERMENTATIVA

POR SUBPRODUTOS ............................................................................................. 53

3.3.1Compostos fenólicos ....................................................................................... 53

3.3.2Calculo da eficiência da fermentação por subprodutos ................................... 53

3.3.3Análises dos subprodutos para cálculo da eficiência da fermentação ............. 54

3.3.3.1Porcentagem de fermento vinho delevedurado e do creme de levedura ..... 55

3.3.3.2 Teor alcoólico do vinho deleveduradoe do creme de levedura .................... 55

3.3.3.3ARRT do vinho delevedurado............................................................. 55

3.3.3.4Glicerol do vinho delevedurado .................................................................. 55

3.3.3.5Acidez sulfúrica do mosto, do vinho levedurado e do fermento tratado 55

3.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 56

3.5CONCLUSÃO .................................................................................................... 61

3.6REFERÊNCIAS ................................................................................................. 61

X

CAPÍTULO IV ................................................................................................................ 63

CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 64

XI

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I ............................................................................................................ 5


Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus

produtos, identificados por diversos autores.............................................................. 25

CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32




ALCOÓLICA..................................................................................................... 33

Tabela 2.1 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:

compostos fenólicos x viabilidade celular................................................................. 42


compostos fenólicos x viabilidade de brotamento ..................................................... 43


compostos fenólicos x brotamento celular ................................................................ 44

CAPÍTULO III ................................................................................................... 47



SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO..................................................... 48

Tabela 3.1 - Resultados das análises de cariotipagem ............................................... 57

Tabela 3.2 Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t::

compostos fenólicos x rendimento de fermentação por subprodutos ........................ 58


compostos fenólicos x ARRT do vinho ..................................................................... 60

XII

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I ............................................................................................................ 5


Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar ............................................................. 9

Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) ............................................ 12

CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32




ALCOÓLICA..................................................................................................... 33

Figura 2.1 – Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São

Manoel.............................................................................................................. 37

Figura 2.2 – Resultados das análises de cariotipagem............................................... 39

Figura 2.3 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e

aviabilidade celular de levedura

alcoólica.................................................................... 42

Figura 2.4 – Correlação entre aconcentração de compostos fenólicos do mosto e a

viabilidade de brotamento de levedura alcoólica....................................................... 43

Figura 2.5 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos no mosto e o

brotamento de levedura alcoólica .............................................................................. 44

CAPÍTULO III ................................................................................................... 47



SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO .................................................... 48

Figura 3.1 Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São

Manoel ....................................................................................................................... 52

Figura 3.2 – Correlação entre a concentração dos compostos fenólicos do mosto e

a eficiência de fermentação por subprodutos ............................................................. 58

Figura 3.3 - Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e o

ARRT do vinho .......................................................................................................... 59

1

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração

dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento,

brotamento celular da levedura alcoólica e a eficiência da fermentação por subprodutos

durante a safra 2011/2012 na Usina São Manoel, São Manuel (SP). Esta unidade iniciou

a safra com a levedura selecionada CAT-1. Durante a safra, as cepas nativas adentraram

o processo fermentativo e também foram avaliadas quanto à sensibilidade a

concentração dos compostos fenólicos. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de

caso na planta industrial de fermentação contínua. As análises de concentração dos

compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método FolinCiocalteu,

enquanto que as análises de viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamento

da levedura foram feitas através de contagem em câmara de Neubauer utilizando

corante azul de metileno. A eficiência da fermentação foi determinada por subprodutos

gerados durante o processo fermentativo. A análise estatística foi avaliada pelo

coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t. Concluiu-se

que, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação negativa sobre a

viabilidade celularno período com leveduras 100% das nativas e no período geral da

safra; sobre a viabilidade de brotamento somente o período com leveduras 100% nativas

tiveram relação negativa. Os compostos fenólicosnão apresentaram relação com o

2

brotamento celular da levedura e com a eficiência da fermentação em nenhumdos

períodos estudados.

_________________________________________________________________________

Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,

brotamento e eficiência da fermentação.

3

EFFECTS OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS

CONCENTRATIONINTHEALCOHOLIC FERMENTATION, Botucatu, 2013, 64p.

Dissertação (Mestrado em Agronomia / Energia na Agricultura – Faculdade de Ciências

Agronômicas, Universidade Paulista).

Author: MIRIAM ROBERTA HENRIQUE

Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO

SUMMARY

The aim of this project was to evaluate the relationship of the

must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability,

cellular budding of alcoholic yeast and the efficiency of the fermentation for by-

products during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP).

This unit began the harvest with the selected yeast called CAT-1. During the harvest,

the native stumps penetrated the fermentation process and they were also appraised as

for the sensibility to the concentration of the phenolic compounds.The research was

developed as a case study in the industrial plant of continuous fermentation. Analyses of

concentration of the must phenolic compounds were accomplished through the

FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability and

budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a marker ( m-

ethilen blue).The efficiency of the fermentation was determined using by-products

generated during the fermentation process . Statistical analysis was evaluated by

Pearson’s correlation coefficient and its significance through the “t” test .It was

concluded that the must phenolic compounds had negative relationship about the

cellular viability in the periods with 100% of native yeasts along the general period of

the harvest; about the budding viability only the period with 100% native yeasts had

negative relationship. The phenolic compounds didn't present relationship with the

4

budding cellular yeast and with the efficiency of the fermentation in none of the studied

periods.

_________________________________________________________________________

Key-words: phenolic compounds, Saccharomyces cerevisiae, cellular viability, budding

and fermentation efficiency.

5

CAPÍTULO I

6

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1.1 INTRODUÇÃO

A cana-de-açúcar (Saccharumspp.), por apresentar potencial

genético favorável para acúmulo de sacarose, é a principal responsável pela produção de

açúcar e etanol no Brasil, que se destaca como maior produtor mundial de etanol de

cana-de-açúcar (UNICA, 2009).

A fermentação alcoólica é uma das principais etapas do processo

para produção do etanol, na qual as leveduras (Saccharomycescerevisiae) transformam

açúcares presentes no mosto em etanol, gás carbônico e componente secundários. Este

processo pode ser influenciado por vários fatores, entre eles, temperatura, pH, pressão

osmótica, composição do meio, bactérias, leveduras contaminantes, etc.

A qualidade da matéria-prima afeta diretamente a eficiência

fermentativa, levando à queda do rendimento alcoólico, quando o mosto contem ácidos

orgânicos e inorgânicos que inibem o processo fermentativo (PAYNE, 1989).

A matéria-prima não se restringe somente ao caldo da cana-de-

açúcar. Nas unidades de produção de etanol acopladas a unidades de produção de

açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final diluído em

caldo secundário (extraído a partir do segundo terno) ou filtrado após tratamento, ou

somente em água. Nos últimos anos, a utilização de mel com maior nível de

esgotamento como matéria-prima de fermentação vem se tornando uma pratica comum.

Neste mel estão presentes açucares fermentescíveis e não fermentescíveis, cinzas, sais,

compostos coloridos e outros (TOSETTO, 2008).

As variedades da cana-de-açúcar, as condições ambientais de

cultivo, o grau de maturação e a incidência de pragas e doenças, podem influenciar

diretamente na qualidade da matéria-prima. Como mecanismo de defesa contra as

pragas e doenças a cana-de-açúcar pode produzir metabólitos, sendo estes muitas vezes

inibidores do processo fermentativo.Entende-se por inibição da fermentação a atuação

de compostos sobre as leveduras, que são as responsáveis pela transformação do açúcar

em etanol. O nível de inibição deste processo de conversão de açúcar em álcool vai

depender do tipo da linhagem de levedura utilizada, associada aos compostos inibitórios

e as suas concentrações (TOSETTO, 2008).

7

A contribuição dos fatores de inibição provenientes da cana-de-

açúcar pode ser atribuída à própria variedade utilizada, assim como a deterioração dessa

planta, ocorrida devido às operações envolvidas nos processo de colheita, como horas

de queima, tempo de corte e transporte.

O mel final, oriundo do processo de fabricação de açúcar, faz

parte da composição do mosto de fermentação, que por sua vez, agrega, além de todos

esses fatores vindos com a cana-de-açúcar, também os inibidores provenientes das

operações envolvidas na produção do açúcar, tais como os ácidos orgânicos (lático,

fórmico e acético) e hidroximetil-furfural - HMF (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964;

FRIEND, 1979; GODSHALL; LEGENDRE, 1988).

Segundo Amorim et al. (1996), as destilarias brasileiras têm

como prática frequente iniciar os processos fermentativos com uma determinada

levedura, seja pela tradição de seu uso, como a Saccharomycescerevisiae, pela

facilidade de obtenção em grandes quantidades, como as leveduras de panificação, ou

ainda, pelo fato da mesma ter sido obtida através de melhoramento genético para se

melhor adequar às necessidades do processo industrial.

As destilarias brasileiras, por não possuírem unidades de

esterilização de mosto, são consideradas abertas do ponto de vista microbiológico. Elas

trabalham com populações mistas, ou seja, varias linhagens de levedura presentes. Estas

linhagens podem ser classificadas como sendo selecionadas, nativas ou selvagens. As

linhagens selecionadas são aquelas adquiridas de forma pura para serem utilizadas como

inóculo nas partidas das plantas industriais. As nativas são aquelas encontradas no

processo, que apresentam características fermentativas satisfatórias, mas são diferentes

em relação às selecionadas. As linhagens selvagens são aquelas presentes nos processos

que apresentam características fermentativas não adequadas aos processos industriais e

normalmente não são Saccharomyces, sendo consideradas oportunistas, dominando o

processo somente em condições anormais, tais como: operação com baixa concentração

de etanol, paradas prolongadas, paradas curtas ou longas sequenciais, etc.

(ANDRIETTA, 2007).

Estudos da defesa das plantas contra pragas e doenças

(FONTANIELLA et al., 2003) mostraram um aumento no nível de fenóis totais em

cana. Compostos fenólicos possivelmente têm desempenhado algum papel negativo na

fisiologia da levedura durante a fermentação, que resulta no aumento de açúcares

8

redutores residuais totais (ARRT) e menor rendimento fermentativo e

consequentemente perdas na produção do etanol (RAVANELI, 2010).

Inserido nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo

investigar os efeitos da concentração dos compostos fenólicos presentes no mosto sobre

a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento celular, taxa de brotamento celular e a

eficiência fermentativa durante a safra 2011/2012 da Usina São Manoel, São Manuel,

SP.

1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2.1 Cana-de-açúcar

A provável origem da cana-de-açúcar é o norte da Índia. Há

referências sobre a produção de açúcar na Pérsia 500 D.C. Da Pérsia, foi levada para

costa ocidental através do Mar Mediterrâneo e daí para a Espanha, por volta do século

VIII. Nos séculos XI e XII, através das Cruzadas, espalhou-se por toda a Europa, África

e China. Na América, foi introduzida por Colombo em São Domingos, em 1.494. No

Brasil, o plantio iniciou-se em São Vicente, em 1.522, trazida por Martin Afonso de

Souza (MARQUES, 2001).

A cana-de-açúcar pertence ao gênero Saccharum e possui várias

espécies. Sua reprodução pode ser por sementes (sexuada) ou por brotação de gemas

(assexuada). A via sexuada é fortemente influenciada por fatores como localização

geográfica e variáveis climáticas. Em condições de produção industrial, o processo

baseia-se na brotação de gemas de plantas sadias de variedades selecionadas, por

apresentar características de interesse industrial (MARQUES, 2001).

Segundo Marques (2001) as variedades comerciais, de um modo

geral, apresentam características de composição tecnológica que variam dentro de certos

limites (Figura 1.1).

9

Fibra

8 a 18%

Celulose

Lignina

Pentosanas

Caldo

86 a 92%

Água

75 a 82%

Sólidos Solúveis

18 a 25%

Açúcares

15,5 a 27%

Sacarose (12 a 18%)

Glicose (0,2 a 1%)

Frutose (0 a 0,5%)

Não-açúcares

(impurezas)

1 a 2,5%

Orgânicos

0,8 a 1,8%

Inorgânicos

0,2 a 0,7%

Aminoácidos

Ácidos

Ceras

Corantes

Gorduras

SiO2

K2O

P2O5

CaO

MgO

N2O

Fe2O3

SO3

Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar.

1.2.2 Mel final ou melaço

O mel final ou melaço é o subproduto da produção do açúcar

cristal. É utilizado associado ao caldo da cana-de-açúcar ou simplesmente diluído em

água, como substrato do processo fermentativo. Embora seja atribuído o nome de mel

final ou melaço para o produto obtido depois da cristalização da sacarose contida no

caldo de cana-de-açúcar, as particularidades atribuídas a cada processo não permitem

uma generalização em relação à composição dessa matéria-prima. Mas o que se conhece

é que existem inúmeros compostos comuns, os quais são encontrados em maior ou

menor quantidade nos melaços de cana-de-açúcar. O mel final além de carrear, de um

modo concentrado, componentes da matéria-prima (nutrientes, sais, compostos

fenólicos), também pode conter ácidos orgânicos (acido lático, fórmico e acético) e

hidroximetil-furfural (HMF) proveniente do processo, que propicia o acúmulo e ou

formação de produtos, que podem atuar como inibidores da fermentação (TOSETTO,

2008).

10

1.2.3 Levedura alcoólica

As leveduras são seres eucariontes e forma uma das classes mais

importante dos fungos. A Saccharomycescerevisiae, que são as leveduras mais

utilizadas na produção de etanol, apresenta-se na forma unicelular com 2 a 8

micrômetros de diâmetro. São anaeróbicas facultativas (STECKELBERG, 2001).

Encontram-se predominantemente na forma unicelular e facilmente se diferenciam das

bactérias em virtude de suas dimensões maiores e de suas propriedades morfológicas.

Uns dos aspectos que as caracterizam como fungos são a composição da parede celular,

a perda de mobilidade e a ausência de fotossíntese (McKANE; KANDEL, 1996;

MORTIMER, 2000, citados por WIESIOLEK, 2007).

Como resultado de seu modo reprodutivo, condições de cultivo,

idade e cultura, a célula da levedura pode apresentar diferentes formas e tamanhos,

sendo as mais comuns as esféricas, globosas, ovoides e alongadas. As leveduras podem

multiplicar-se por gemulação (brotamento), esporulação ou por fissão. O método mais

comum é o de gemulação (brotamento), sendo que durante sua vida uma célula madura

(célula mãe) pode gerar até 24 brotos (células filhas). As principais microestruturas das

leveduras são a parede celular, a membrana citoplasmática, o núcleo, os vacúolos e as

mitocôndrias (AMORIM et al., 1996).

O crescimento pode ser definido como um aumento dos

constituintes celulares, levando a um aumento no número de células, quando

microrganismos crescem através de processos como brotamento ou fissão binária. Esse

crescimento pode ser descrito como função logarítmica do número de células em

determinado período de incubação, resultando numa curva de quatro fases diferentes

(GLAZER, 1998).

1. Fase lag: quando os microrganismos entram num meio de cultura fresco,

usualmente não aumentam imediatamente o número de células ou massa. A

divisão celular não ocorre imediatamente, pois a célula está sintetizando novos

componentes. Esta fase varia seu comprimento consideravelmente com as

condições do microrganismo e a natureza do meio (GLAZER, 1998).

2. Fase exponencial ou fase log: os microrganismos estão crescendo ou dividindo

ao ritmo máximo possível em função do seu potencial genético, da natureza do

meio e das condições na qual estão crescendo. Seu ritmo de crescimento é

exponencial durante esta fase, visto estarem crescendo e se duplicando a

11

intervalos regulares. A população é mais uniforme em termos químicos e

fisiológicos nesta fase (GLAZER, 1998).

3. Fase estacionária: o crescimento populacional cessa e a curva se torna

horizontal. O tamanho da população final depende da disponibilidade de

nutrientes, dentre outros fatores. Nessa fase, o número total de organismos

viáveis permanece constante. Este pode ser resultado de um balanço entre

divisão e morte celular ou a população pode simplesmente cessar a divisão e

permanecer em atividade metabólica. Sabe-se que os microrganismos entram em

fase estacionária por muitas razões, sendo uma delas a limitação de nutrientes.

Porém o crescimento também pode cessar devido ao acúmulo de produtos

tóxicos, limitando principalmente culturas anaeróbias (GLAZER, 1998;

PRESCOTT, 1999).

4. Fase de morte: restrições ambientais ocorrem com a privação de nutrientes e a

produção de metabólitos tóxicos que levam ao declínio no número de células

viáveis. A morte da população microbiana, como seu crescimento, é

exponencial. Este padrão ocorre mesmo quando o número total de células

permanece constante porque as células simplesmente não se dividem após

morrerem (GLAZER, 1998; PRESCOTT, 1999).

Nas leveduras, encontra-se uma variedade de reações

fisiológicas. O metabolismo de açúcar como a glicose, pode ocorrer anaeróbica

(fermentação) ou aerobica (respiração). O processo mais característico é o metabolismo

anaeróbico, também conhecido comumente como fermentação alcoólica, cujos produtos

finais são etanol e gás carbônico (PELCZAR; REID; CHAN, 1980 citados por

WIESIOLEK, 2007).

O metabolismo da levedura, como o de qualquer ser vivo, pode

ser dividido didaticamente em anabolismo e catabolismo. O processo anabólico diz

respeito a reações de síntese de material celular, tais como proteínas, gorduras,

polissacarídeos, etc., à custa de energia celular armazenada na molécula de ATP. No

catabolismo o processo se inverte, as moléculas são quebradas e oxidadas, sendo que a

energia química produzida nessas reações é acumulada nas moléculas de ATP

(VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001).

A transformação do açúcar (glicose) em etanol e CO2envolve

reações em sequência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica. Tal

aparato enzimático está confinado no citoplasma celular sendo, portanto, nessa região

12

da célula que a fermentação alcoólica se processa. Essas enzimas, referidas como

“glicolíticas”, sofrem ações de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas,

inibidores, substâncias do próprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que

estimulam e outros que reprimem a ação enzimática, afetando o desempenho do

processo fermentativo conduzido pelas leveduras (LIMA et al., 2001).

Segundo Wiesiolen (2007), a glicólise é a soma total de reações

bioquímicas pelas quais a glicose é convertida em piruvato. A via mais frequente é a de

Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) (Figura 1.2).

Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP)

Glicose

(1)↓

Glicose 6-fosfato

(2)↓

Futose 6-fosfato

(3)↓ Frutose 1,3-difosfato

(4)↓

Gliceraldeído-3-fosfato

(5)↓

1,3 difosfato-Glicerato

(6)↓

3-Fosfoglicerato

(7)↓

2-Fosfoglicetato

(8)↓

Fosfoenolpiruvato

(9)↓

Piruvato

(10)↓

Acetaldeído

(11)↓

Etanol

Enzimas envolvidas

1- Hexoquinase (Mg

++ATP convertido em

ADP)

2- Fosfohexoseisomerase

3- Fostofrutoquinase (Mg++

ATP convertido em

ADP)

4- Aldolase

5- Gliceraldeído 3-P-desidrogenase (entra

NAD sai NADH + H++

+ Pi)

6- Fosdoglicerilquinase (entra ADP sai ATP)

7- Fosfoglicerilmutase

8- Enolase

9- Piruvatoquinase (entra ADP sai ATP)

10- Piruvato descarboxilase (Liberação de CO2)

11- Álcool desidrogenase

13

Convém ressaltar que a levedura Saccharomycesé um anaeróbio

facultativo, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições

de aerobiose como de anaerobiose (ausência de oxigênio molecular). Os produtos finais

da metabolização do açúcar irão depender das condições ambientais em que a levedura

se encontra. Assim, enquanto uma porção do açúcar é transformada em biomassa, CO2 e

H2O em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO2 em anaerobiose,

processo denominado fermentação alcoólica (LIMA et al., 2001).

O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas

equações:

Fermentação alcoólica

C6H12O6→ 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 57 Kcal (1)

Respiração

C6H12O6 + 6O2 →6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 Kcal (2)

A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose

(180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g), 2 moles

de ATP e 57 Kcal de energia. Assim, o rendimento teórico para a produção de etanol é

de 0,511 g/g. Na prática, segundo Oura (1974), este valor não é observado devido à

utilização de parte da glicose para produção de glicerol e alcoóis superiores, substâncias

necessárias para síntese de material celular e manutenção da levedura.

A via respiratória – energeticamente mais eficiente – é utilizada

no início do processo de fermentação, com a finalidade de promover o crescimento e o

reviramento do fermento. A via fermentativa tem a função de promover a transformação

do açúcar em etanol e gás carbônico (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). Os

carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos

(constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose,

glicose, frutose e outros provenientes da matéria-prima) (LIMA et al., 2001).

O passo inicial na utilização dos açúcares fermentescíveis pela

levedura pode ser tanto a passagem intacta do açúcar através da membrana celular ou a

sua hidrólise fora da membrana celular, seguida pela entrada na célula de alguns ou

todos seus produtos de hidrólise. A sacarose é hidrolisada pela enzima invertase,

localizada na parede celular, sendo seus produtos (glicose e frutose) metabolizados pela

14

célula (ALMEIDA; SILVA, 2005; WALKER, 2000). As leveduras consomem primeiro

a glicose e depois a frutose (RUSSEL, 1994).

Dos fatores ambientais que regulam a respiração e a

fermentação em células de leveduras, a disponibilidade de glicose e oxigênio é o mais

documentado (WALKER, 2000). No caso de algumas leveduras, entre elas a

Saccharomycescerevisiae, em presença de glicose mesmo em condições estritamente

aeróbias, o metabolismo é do tipo respiro-fermentativo. Esse comportamento

metabólico é provocado por um efeito conhecido como efeito Crabtreeou repressão

catabólica. Esse efeito se pronuncia em condições onde a concentração de glicose

ultrapassa um valor limite. O mecanismo responsável pela repressão catabólica pode ser

bastante complexo, mas estudos mostram que ocorre principalmente através do forte

efeito repressivo da glicose sobre a atividade de enzimas respiratórias e também,

possivelmente, pela inibição da expressão genética de enzimas constituintes da via

respiratória, fazendo com que parte do piruvato que não pode ser oxidado pelo ciclo de

Krebs seja reduzido a etanol pelo processo fermentativo (BAKKER et al., 2001). Em

contrapartida, outro efeito conhecido como efeito Pasteur relaciona o oxigênio com a

cinética do catabolismo de açúcar, estabelecendo que, sob condições anaeróbias, a

glicólise aconteça mais rápido do que sobre condições aeróbias. Este fenômeno é

observado somente quando as concentrações de glicose forem baixas (cerca de 5 mM)

ou sob certas condições de nutrientes limitantes (WALKER, 2000). Segundo Nogueira e

Venturini Filho (2005), a principal diferença entre o efeito Pasteur e o efeito Crabtreeé

que no primeiro, observa-se a tendência da levedura respirar em meios aeróbios,

enquanto no segundo, constata-se que a levedura pode fermentar mesmo na presença de

oxigênio.

O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar

anaerobicamente o açúcar, é gerar uma forma de energia (ATP) que será empregada na

realização de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e

biossínteses, necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para

perpetuar a espécie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem tão somente de produtos

de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o

etanol, bem como outros produtos de excreção (como o glicerol e ácidos orgânicos),

pode ser oxidado metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em

condição de aerobiose (WALKER, 2000; LIMA et al., 2001).

15

Na sequência de reações enzimáticas de produção de ATP, é

intrínseca à formação de etanol, rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a

formação de materiais necessários à constituição da biomassa (polissacarídeos, lipídeos,

proteínas, ácidos nucleicos e outros), bem como para a formação de outros produtos de

interesse metabólico, relacionados direta e indiretamente com a adaptação e

sobrevivência. Assim, juntamente com o etanol e o CO2, o metabolismo anaeróbio

permite a formação e excreção de glicerol, ácidos orgânicos (succínico, acético,

pirúvico e outros), alcoóissuperiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, além de

outros compostos de menor significado quantitativo (LIMA et al., 2001).

Simultaneamente ocorre o crescimento das leveduras (formação de biomassa). A

formação do glicerol, o mais abundante dos compostos orgânicos secundários da

fermentação, está acoplada à manutenção do equilíbrio redox celular, o qual é alterado

quando da formação de ácidos orgânicos, biomassa e da presença de sulfito no mosto. A

formação de glicerol também está relacionada a uma resposta ao estresse osmótico,

quando de concentrações elevadas de açúcares ou de sais no mosto (WALKER, 2000;

LIMA et al., 2001).

Segundo Amorim et al. (1996), a levedura como entidade viva

independente, realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia

química necessária para a sua sobrevivência, sendo o etanol apenas e tão somente um

subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade

metabólica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras,

condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor, isto e, com maior eficiência

na produção de etanol.

1.2.4 Fermentação alcoólica

Segundo Lima (1985), a primeira destilaria de etanol no Brasil

foi montada em Piracicaba-SP, onde o processo de fermentação era batelada. O

fermento utilizado era multiplicado para cada batelada e nessa época havia dois tipos de

fermentação: a utilizada para produção de álcool nas usinas de açúcar e a desenvolvida

para produção de aguardente.

Um grande avanço ocorreu na produção de etanol, quando

surgiu o método de Melle-Boinot (batelada-alimentada), na França, na década de 1930.

Esse processo consiste no reaproveitamento da levedura já utilizada em processo

fermentativo. Ele possui algumas vantagens sobre a fermentação em batelada como,

16

economia de açúcar devido a menos reprodução celular, elevado rendimento de etanol,

eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho fermentado, fermentação

menos contaminada devido ao tratamento do leite de levedura (tratamento ácido), menor

complexidade das operações (FERREIRA, 2005).

O processo mais difundido no Brasil sempre foi o de batelada-

alimentada com recirculação da levedura, esse processo já era bastante conhecido e

utilizado em outros países e também no Brasil, mas precisou de muito estudo e

aprimoramento para atingir os níveis de produtividade e eficiência obtidos hoje

(CORTEZ, 2010).

Até o início dos anos 60, poucos eram os investimentos feitos na

produção de etanol no Brasil. As causas para este atraso estiveram provavelmente

ligadas ao problema de falta de incentivo, dificuldade de obtenção de equipamentos e

até mesmo ao pequeno interesse que a produção de etanol despertava devido ao

mercado interno ser pequeno e o externo possuir forte concorrência (ANDRIETTA,

1994).

Então, na década de 60 iniciou-se a modernização desta

indústria, onde Borzani e Fernandes (1994) citados por Andrietta (1994), estudaram a

cinética da fermentação alcoólica contínua.

No início da década de 70, praticamente todas as destilarias de

etanol já operavam com o processo Melle-Boint, com grandes ganhos no rendimento e

na produtividade. Nesta década, este processo foi otimizado, chegando aos anos 80 no

seu máximo de eficiência. Nesta mesma década também se intensificou estudos sobre o

processo contínuo de fermentação alcoólica (ANDRIETTA, 1994).

Com o advento do PROALCOOL, houve um maior interesse na

produção de etanol, e algumas indústrias partiram para a fermentação contínua, que no

início apresentara alguns problemas, que segundo Finguerutet al. (1992) citados por

Andrietta (1994), foram devidos às primeiras plantas contínuas serem fruto de

adaptações de baixo custo de plantas de batelada-alimentada já existentes.

1.2.4.1 Processos

Os processos de fermentação são classificados de acordo com a

maneira através da qual o substrato é adicionado e o produto retirado, podendo-se citar

o processo em batelada, o batelada-alimentada e o contínuo.

17

1.2.4.2 Processo batelada

O processo batelada é também conhecido como processo

descontínuo. Este processo no passado foi muito utilizado na produção de etanol, mas

segundo Maiorellaet al. (1981), ele é lento, pois se gasta muito tempo para o preparo do

reator.

Prepara-se um meio de cultura adequado à nutrição e ao

desenvolvimento do microrganismo e também ao acúmulo do produto desejado; coloca-

se este meio de cultura em um biorreator; adiciona-se o microrganismo responsável pelo

processo biológico e se aguarda que o processo ocorra. Após um determinado tempo de

fermentação, retira-se o caldo fermentado do reator e executam-se as operações

unitárias necessárias para a recuperação do produto (SCHIMIDELL; FACCIOTTI,

2001, citados por PACHECO, 2010).

É considerado um processo seguro com relação a assepsia, pois

ao final de cada batelada, o reator pode ser esterilizado juntamente com um novo meio

de cultura, recebendo um novo inoculo (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001, citados por

PACHECO, 2010). Além do menor risco de contaminação, este processo apresenta

grande flexibilidade de operação pela possibilidade de utilização dos fermentadores para

fabricação de diferentes produtos e por permitir melhor condição em relação a

estabilidade genética do microrganismo (CARVALHO; SATO, 2001, citados por

PACHECO, 2010).

A fermentação em batelada pode levar a baixos rendimentos e

produtividade quando o substrato é adicionado de uma só vez, no início do processo,

pois exerce efeitos de inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular a produtos

que não interessam (CARVALHO; SATO, 2001, citados por PACHECO, 2010).

A condução da fermentação alcoólica por processo em batelada,

praticamente só ocorre em escala de laboratório e em pequenas destilarias de aguardente

(PACHECO, 2010).

1.2.4.3 Processo batelada alimentada

Este processo é uma variante do processo batelada. É também

conhecido como Melle-Boinot. Neste processo, o substrato é alimentado sob condições

controladas até atingir o volume útil do biorreator. É um processo conveniente e

satisfatório quanto à operação e eficiência de conversão de açúcares a etanol

(PACHECO, 2010)

18

Esse processo possibilita uma vazão de alimentação constante

ou variável com o tempo e a adição de mosto de forma contínua ou intermitente. Devido

à flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento dos reatores, no

processo batelada alimentada é possível controlar a concentração de substrato no

fermentador, de modo que o metabolismo microbiano seja deslocado para uma

determinada via metabólica, levando ao acúmulo de um produto específico

(CARVALHO; SATO, 2001).

Almeida (1960) citado por Ferreira (2005) descreveu as

seguintes vantagens do processo Melle-Boinot:

- Economia de açúcar devido à menor reprodução celular elevando o rendimento em

etanol;

- Eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho (separação de células de

levedura);

- Fermentação mais pura devido ao tratamento de leite de levedura (tratamento ácido);

- Eliminação da necessidade de cultura pura no preparo do pé-de-cuba, prática exigida

no processo clássico, diminuindo, portanto, a complexidade das operações da planta.

1.2.4.4 Processo contínuo

Este processo não sofre interrupções, há a retirada continua do

produto a uma vazão igual a da alimentação, permitindo um fluxo contínuo, diminuindo

assim, o efeito inibitório do etanol e do substrato. Este tipo de processo atinge, quando

bem operado, maior produtividade e rendimento.

Segundo Rodrigues et al. (1992), este processo tem apresentado

uma maior produtividade, com um aumento que pode atingir 100% em relação à

batelada alimentada. Os novos projetos que estão sendo desenvolvidos consideram a

cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e computacionais. Com isto

obtêm-se processos que:

- Reduzem gastos em mão-de-obra;

- Aumentam a produtividade;

- Reduzem o tempo não produtivo (carga, descarga, limpeza);

- Trabalham em condições ótimas de operação no estado estacionário;

- Reduzem a utilização de insumos; entre outros.

19

1.2.5 Fatores que interferem no processo fermentativo

Segundo Luceri et al. (2005), as leveduras são capazes de

sobreviver em flutuações ambientais intensas por adaptarem rapidamente sua máquina

bioquímica interna às novas condiçoes. Um aspecto desta adaptação é a marcada

capacidade de ajuste da expressão gênica às necessidades ambientais requeridas para

seu crescimento.

Organismos unicelulares requerem condições internas

específicas para crescimento. Estratégias múltiplas existem para manter essas condições

internas, face a vários e frequentes ambientes externos instáveis. Considerando que

organismos multicelulares podem usar órgãos e tecidos especialidados para prover um

ambiente interno relativamente estável e homogêneo, organismos unicelulares como a

levedura S. cerevisiae tem desenvolvido mecanismos autônomos para adaptação de

mudanças ambientais drásticas. As leveduras regularmente resistem a flutuações nos

tipos e quantidades de nutrientes disponíveis, temperatura, osmolaridade e acidez de seu

ambiente, a variável presença de agentes nocivos, como radiação e agentes tóxicos. De

fato, quando condições ambientais mudam abruptamente, a célula deve rapidamente

ajustar seu programa de expressão genômica para adaptarem-se as novas condições

(GASH et al., 2000).

1.2.5.1 pH

Segundo Amorim et al. (1996), o pH é fator significativo para as

fermentações industriais devido à sua importância tanto no controle da contaminação

bacteriana quanto ao seu efeito sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e

formação de subprodutos.

Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-

se na faixa de 4,5 a 5,5 com uma boa capacidade tampão, mas as leveduras mantêm uma

homeostase de forma independente dos valores de pH do meio, por isso toleram o

tratamento ácido. O tratamento ácido também provoca lixiviação de nutrientes tais

como N, P e K da levedura que acaba por elevar o pH. Embora o tratamento ácido se

mostre estressante à levedura, ele apresenta efeito benéfico de controlar a contaminação

bacteriana, pois ocorre uma redução significativa no número de bactérias durante esse

tratamento (AMORIM et al., 1996).

O pH ótimo para a produção de etanol por leveduras

Saccharomycescerevisiae situa-se geralmente, na faixa de 4 a 5. Aumentando-se o

20

pHaté 7, observa-se via de regra, uma diminuição do rendimento em etanol, com

aumento da produção de ácido acético (MAIA, 1989).

Segundo Blanchet e Ballerini, citados por Maia (1989), o pH

interno da célula se mantêm na faixa de 5,8 a 6,8, entretanto, baixos valores de pH

tornam o meio mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispêndio

de energia na manutenção do pH interno, além, de afetar as proteínas de transporte da

membrana citoplasmática que ficam expostas ao meio externo. O pH do meio externo

também, afeta a velocidade de crescimento das leveduras, a qual atinge um máximo

quando o pH está compreendido entre 5 e 6. Na fermentação alcoólica, o

estabelecimento e controle do pH do meio em valores inferiores a 5 é também

considerado importante como meio para prevenir contaminação por bactérias láticas e

acéticas.

1.2.5.2 Temperatura

Na indústria, a temperatura do mosto é um fator crítico no

processo fermentativo. Segundo Steckelberg (2001) a temperatura ótima de fermentação

é uma função que depende do teor do etanol no meio, tendendo a diminuir com o

aumento do teor alcoólico. Portanto, teoricamente, a otimização de um processo de

fermentação com relação à temperatura requer uma redução da temperatura do processo,

à medida que o etanol é produzido. A temperatura de fermentação também influencia a

fluidez na membrana citoplasmática e a atividade das enzimas, alterando a

permeabilidade na membrana e o metabolismo das células.

O efeito inibitório do etanol está intimamente relacionado à

temperatura da fermentação. Segundo Sá-Correia e Van Uden (1983), a faixa de melhor

resistência ao etanol para cepas usuais de Saccharomycescerevisiae é de 13 a 27ºC a

11% (v/v) de etanol. A tolerância ao etanol diminui para temperaturas mais baixas que

13ºC ou mais altas que 27ºC, de forma que a inibição do crescimento do microrganismo

ocorre tanto em processos à baixa temperatura (cervejas, espumantes), como em

processos à alta temperatura (etanol combustível, vinhos tintos).

De acordo com Van Uden (1985) existem três temperaturas

chaves de um processo de crescimento de leveduras: Tmaxi(temperatura máxima inicial

de crescimento), Tmaxf(temperatura máxima final de crescimento) e Topt (temperatura

ótima de crescimento). O aumento da concentração de etanol ao longo da fermentação

21

provoca uma diminuição das 3 temperaturas. Quando Tmaxf se iguala a temperatura do

processo, o crescimento celular torna-se nulo.

Segundo Maia (1989), a temperatura ótima de crescimento das

leveduras é geralmente, inferior à temperatura ótima para produção de etanol. A

fermentação alcoólica geralmente é conduzida em torno de 30 a 32ºC, quando se

pretende maximizar a produtividade em etanol.

1.2.6 Contaminação microbiana

A característica microbiológica da cana-de-açúcar que entra no

processo de extração das unidades sucroenergéticas no Brasil normalmente apresenta

altos níveis de microrganismos contaminantes, sejam eles bactérias, leveduras ou

fungos. Isso porque, segundo Dorta (2006), a decomposição da sacarose por

microrganismos inicia-se quando a cana-de-açúcar está ainda no campo. Quanto mais

rápido a cana for levada à usina para ser convertida em sacarose ou etanol, mais

eficiente será o processo de obtenção de tais produtos. Oliva-Neto (1995), citado por

Dorta (2006), durante o processamento da cana até a etapa de fermentação alcoólica nas

dornas das destilarias, a microbiota contaminante passa por uma grande seleção em

função do pH, temperatura, condições atmosféricas e produtos inibidores (presentes no

substrato) a que são submetidas. Assim, durante o processo fermentativo, a microflora

restringe-se a poucos gêneros, uma vez que o pH torna-se mais baixo e existe o aumento

do teor alcoólico, ficando difícil a adaptação para a maior parte dos microrganismos.

Entretanto, o processo de batelada alimentada ou contínuo com o reciclo de célula,

utilizado nas usinas sucroenergéticas favorece a proliferação de alguns gêneros

contaminantes nas dornas fermentativas (OLIVA-NETO E YOKOYA, 1994).

O aumento das contaminações na cana-de-açúcar pode ser

favorecido por geadas como mostram os trabalhos de Irvine eFriloux (1965) e Coll et al.

(1978), e também por doenças e parasitas como as galerias formadas pela

Diatraeasaccharalis, que facilitam a entrada de bactérias, fungos e leveduras nos

colmos da cana, facilitando sua deterioração (TILBURY, 1969). Mayeux e Colmer

(1975); Duncan e Colmer (1964), relatam o aumento das contaminações no caldo de

cana-de-açúcar como consequência da terra que se adere às raízes, colmos e folhas

quando são carregadas até a indústria.

A literatura aponta como principais contaminantes do meio

fermentativo bacilos Gram-positivos compostos pelos gêneros Lactobacillus, Bacilluse

22

Leuconostoc, sendo este último menos comum devido a menor resistência ao teor

alcoólico (OLIVA-NETO, 1995). Oliva-Neto (1990) isolou como principal

contaminante da fermentação alcoólica o gênero Lactobacillus, a partir de amostras de

leite de levedura, em usinas do estado de São Paulo. A análise taxonômica demonstrou

que L. fermentumfoi a bactéria predominante (62%), seguida por L. murinus(9%), L.

vaccinostercus(9%), L. plantarum(2%) e Leuconostocsp (2%). Do total da referida

microflora, 64% resistiu a 10% (v/v) de etanol em cultivo isolado.

Segundo Narendranathet al. (1997), a contaminação por

bactérias láticas é o maior problema da fermentação industrial de etanol. O crescimento

das referidas bactérias reduz o rendimento alcoólico devido o consumo de glicose que

seria destinada à síntese etanólica, além da competição dos nutrientes do meio, e do

efeito tóxico do ácido lático (YOKOYA, 1991, NARENDRANATHet al. 1997). Além

disso, tais bactérias podem induzir a floculação do fermento causando o assentamento

de células de leveduras no fundo das dornas e perda de células nas centrífugas

contribuindo ainda mais para a diminuição do rendimento, produtividade e viabilidade

celular (OLIVA-NETO; YOKOYA, 1994).

1.2.7 Culturas puras de levedura

No final dos anos 1920, começou-se a falar no Brasil da

substituição da fermentação espontânea pela cultura de levedo puro, já empregado nos

países desenvolvidos, desde o final do século anterior.

1.2.7.1 Identificação da levedura no processo fermentativo

As fermentações industriais geralmente iniciam-se com uma

cepa de levedura selecionada. Entretanto, no decorrer dos ciclos fermentativos, as

linhagens que iniciaram o processo podem ser substituídas por outras leveduras. Tais

leveduras, denominadas nativas ou selvagens ou contaminantes, podem predominar no

processo em função de alguns fatores, tais como agressividade na competição por

nutrientes, maior velocidade de multiplicação, pressão de seleção favorável e adaptação

às condições do meio fermentativo. Como consequência, o processo pode ser

negativamente afetado, através de redução no rendimento alcoólico, maior tempo de

fermentação e produção de metabólitos indesejáveis. Entretanto, essas leveduras podem

também apresentar excelente rendimento alcoólico, possibilitando assim ser

23

selecionadas para o processo fermentativo (CABRINI; GALLO, 1999) citados por

Steckelberg, 2001.

Os métodos moleculares têm sido bastante empregados na

identificação de leveduras, uma vez que são mais precisos quando comparados aos

testes tradicionais (morfológicos, bioquímicos e fisiológicos).

Atualmente, vários métodos moleculares são utilizados para

caracterizar linhagens de leveduras no processo fermentativo, tais como o Polimerase

Chain Reaction (PCR), RandomAmplifiedPolymorphic DNA

(RAPD),RestrictionFragmentLengthPolymorfism (RFLP),

AmplifiedFragmentLenghtPolymorphism (AFLP) (RAVANELI, 2010). Entretanto,

quando se pretende verificar a permanência de uma linhagem durante todo o processo

de fermentação, a técnica mais empregada é a PFGE (Pulsed Field Gel Eletrophoresis),

ou eletroforese em campo pulsado. Essa técnica consiste em separar o DNA

cromossômico intacto, de acordo com o tamanho dos cromossomos, e tem-se mostrado

uma importante ferramenta na identificação de gêneros, espécies ou estirpes de

leveduras (BASSO et al.,1993). A técnica de eletroforese em campo pulsado tem sido

amplamente empregada por diversos autores, segundo Ravaneli, 2010. Basso et al.

(1993), citados por Ravaneli (2010), investigando o emprego da técnica de PFGE no

acompanhamento de linhagens industriais de Saccharomycescerevisiae, verificaram que

as leveduras de panificação não permanecem no processo fermentativo industrial após

40 dias, sendo substituídas por leveduras dominantes típicas de cada destilaria. Outro

método também utilizado é Método PCR Microssatélite (ANTONANGELO et al.

2009).

Basso et al. (2008) citados por Ravaneli (2010), relatam que a

principal razão pela qual essas leveduras são incapazes de permanecer no processo pode

ser a condição de estresse imposta pelas fermentações, tais como alta concentração de

etanol, estresse osmótico, elevadas temperaturas, presença de sulfito e bactérias

contaminantes.

1.2.8 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar

Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de

benzeno, ao qual se ligam grupo tipo hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande

variedade de compostos fenólicos, tais como cumarinas, taninos, ligninas e flavonoides

são considerados fenóis vegetais (BOVI, 1997).

24

A concentração destes compostos na planta está relacionada ao

ataque de fungos, bactérias e insetos (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964; FRIEND,

1979). Em adição, injuria mecânica e química e doenças virais e bacterianas induzem a

produção de cor vermelha no tecido possivelmente como resposta ao estresse na cana-

de-açúcar (GODSHALL; LEGENDRE, 1988).

Os componentes fenólicos sofrem reações não enzimáticas,

incluindo oxidação e autopolimerização com pigmentos marrom escuro, reações com

proteínas e aminoácidos, para produzirem melaninas, pigmentos de coloração marrom e

reações com aldeídos para produzir produtos de condensação vermelhos na presença de

ácidos (BOVI, 1997). Os compostos fenólicos também sofrem reações de

escurecimento por via enzimática. A reação de cor catalisada por enzima resulta da ação

de o-difenol-O2oxiredutase sobre os fenólicos, particularmente ácido clorogênico. A o-

diquinona resultante dessa oxidação é quimicamente reduzida a um o-difenol secundário

e a quinina secundária assim formada, polimeriza para formar cor. Compostos

poliméricos coloridos podem também ser formados a partir da quinonaclorogênica após

reação com aminoácidos (GROSS; COOMBS, 1976, citados por TOSETTO, 2008).

Paton (1978) utilizou cromatografia em camada delgada em

placas de celulose para a identificação de ácidos fenólicos presentes em folhas de cana-

de-açúcar, caldo de cana, e outros produtos oriundos da cana-de-açúcar, identificando

treze ácidos fenólicos (Tabela 1.1).

Larrahondoet al. (1996) promoveram identificação dos

compostos fenólicos em açúcar bruto empregando cromatografia gasosa (CG) acoplada

a espectrometria de massa (MS). Esta analise indicou a presença de diversos ácidos

fenólicos no açúcar bruto, os quais estavam presentes na cana-de-açúcar como ácido

fenólico, siríngico e derivados do ácido cinâmico, além de derivados de ácido benzoico.

Leite (2000) estudou a presença dos compostos fenólicos no

colmo, bainha, folha e palmito da cana-de-açúcar. Foram encontrados no caldo e

confirmados através de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), derivados de

ácidos cinâmicos e hidroxibenzóicos, além de derivados de flavonas apigenina,

luteolina, tricina. Observou-se composição mais complexa nas outras partes da cana,

como nove derivados de flavonas na bainha, onze na folha e dezoito no palmito, além

dos ácidos cinâmicos e benzoicos. As folhas, bainhas e palmito contêm compostos

pertencentes às classes já encontradas no colmo, como ácidos 3,5-dihidroxicinamico, o-

cumárico e gentísico.

25

Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus produtos,

identificados por diversos autores.

Compostos fenólicos e flavonóides

Derivados do ácido benzóico

ácidogentístico

ácido p-hidroxibenzóico

ácido m-hidroxibenzóico

ácido 3,4-dihidroxibenzóico

ácidovanílico

ácidosiríngico

ácido salicílico

3,4-dihidroxibenzaldeído

p-hidroxibenzaldeído

ácido 2,3-dihidroxibenzóico

vanilina

Derivados do ácido cinâmico

ácido o-cumárico

ácido p-cumárico

ácidocafeico

ácidoferúlico

ácidosinápico

ácidoclorogênico

éster de ácido ferúlico

Derivados de cumarina

cumarina

umbeliferona

esculina

Flavonas

apigenina

luteolina

tricina

Flavonóis

quercetina

rutina

kaempferol

Outros derivados

ácido quiníco-3'-cafeiol

ácido quiníco-3'p-cumaroil

ácido quínico-4-p-cumaroil

coniferina

sinapoil glicose

p-cumaroil glicose

Fonte: TOSETTO (2008)

26

1.2.9 Compostos fenólicos e fermentação alcoólica

Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma

de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos

desinfetantes. Klarmann e Shternov (1936) citados por O’Connor e Rubino (1991),

realizaram testes para comprovar a ação germicida de compostos fenólicos e concluíram

que a potência germicida contra os microrganismos testados aumenta com o aumento do

peso molecular dos compostos fenólicos.

O’Connor e Rubino, (1991) relatou que o fenol e seus derivados

apresentam diversos tipos de ação bactericida. Em altas concentrações estes compostos

atuam como um violento veneno protoplasmático, penetrando e rompendo a parede

celular e precipitando as proteínas celulares. Entretanto, em baixas concentrações, os

fenóis e seus derivados inativam o sistema de enzimas essenciais.

Segundo Borzani e Falcone (1960), o fenol se dissolve no

protoplasma. Sua ação depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os

lipídeos do protoplasma. Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor

máximo, as proteínas precipitam irreversivelmente e a célula morre.

Martin e Jonsson (2003) compararam a resistência de onze cepas

(industrial e laboratório) de Saccharomyces e Zigosaccharomycesa inibidores da

fermentação de derivados lignocelulósicos. Eles prepararam um coquetel inibidor, em

diferentes concentrações, contendo dois ácidos alifático, dois furaldeídos e dois

compostos fenólicos. Concluíram que dentro de uma mesma espécie existe uma cepa

que é mais resistente ao coquetel inibidor tendo uma redução no rendimento em etanol

de 10% em presença do coquetel inibidor na concentração de 100%, enquanto que a

cepa mais sensível não produziu etanol na presença de 25% do coquetel inibidor.

Conforme Narendranathet al. (2001), os ácidos orgânicos

também são potenciais inibidores das leveduras. Estes compostos estão presentes nas

plantas da cana-de-açúcar e são carreados pelo caldo e acabam se acumulando nos méis

que posteriormente serão fermentados. Este acúmulo acontece quando o caldo passa

pelos evaporadores e cozedores para a retirada da água e cristalização do açúcar, mas a

temperatura que o caldo é submetido não é suficiente para evaporar ou decompor estes

compostos que possuem elevados ponto de ebulição e boa estabilidade térmica.

Polakovic (1992) constatou que os compostos fenólicos atuam

como inibidores do processo de fermentação alcoólica, atuando sobre a enzima

invertase da levedura.

27

1.3 REFERÊNCIAS

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32

CAPÍTULO II

33




ALCOÓLICA.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração

dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento

e a taxa brotamento celular de levedura alcoólica, durante a safra 2011/2012 na Usina

São Manoel, em São Manuel-SP. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de caso

na planta industrial de fermentação contínua. Esta usina iniciou a safra com a levedura

selecionada CAT-1, sendo que durante a safra as cepas nativas adentraram o processo

fermentativo. As análises de concentração de compostos fenólicos do mosto foram

realizadas através do método FolinCiocalteu, enquanto que as análises de viabilidade

celular, viabilidade de brotamento e brotamento da levedura foram feitas através de

contagem em câmara de Neubauer com corante azul de metileno. A análise estatística

foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do

teste t. Concluiu-se que, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação

negativa sobre a viabilidade celularnos períodos com leveduras 100% das nativas e no

período geral da safra; sobre a viabilidade de brotamento somente o período com

leveduras 100% nativas tiveram relação negativa. Os compostos fenólicosnão

apresentaram relação com o brotamento celular da levedura em nenhumdos períodos

estudados.

Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,

brotamento.

34

RELATIONSHIP OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS

CONCENTRATION WITH THE CELLULAR VIABILITY, BUDDING

VIABILITY AND THE CELLULAR BUDDING TAX OF THE ALCOHOLIC

YEAST.

SUMMARY


must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability,

alcoholic yeast cellular budding tax during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar

Mill, São Manuel (SP).The research was developed as a case study in the industrial

plant of continuous fermentation. This unit began the harvest with the selected yeast

called CAT-1. During the harvest, the native stumps penetrated the fermentation process

Analyses of concentration of the must phenolic compounds were accomplished through

the FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability

and budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a

marker(m-ethilen blue).Statistical analysis was evaluated by Pearson’s correlation

coefficient and its significance through the “t” test.It was concluded that the must

phenolic compounds had negative relationship about the cellular viability in the periods

with 100% of native yeasts along the general period of the harvest; about the budding

viability only the period with 100% native yeasts had negative relationship. The

phenolic compounds didn't present relationship with the budding cellular yeast and with

the efficiency of the fermentation in none of the studied periods.

Key-words: phenolic compounds, Saccharomyces cerevisiae, cellular viability, budding.

35

2.1 INTRODUÇÃO

As leveduras são organismos eucarióticos e formam uma das

classes mais importantes de fungos. As células de Saccharomycescerevisiae

apresentam-se normalmente na forma unicelular, com 2 a 8 micrometros de diâmetro.

Estas se reproduzem basicamente por brotamento, onde a célula mãe, após um período

de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula (TOSETTO, 2008).

Segundo Okoloet al. (1987) citado por Ravaneli (2010), a

porcentagem de células e brotos viáveis durante a fermentação é de extrema importância

para a manutenção da população de leveduras, sendo seu monitoramento

imprescindível, uma vez que, além de metabólitos indesejáveis na matéria-prima,

compostos tóxicos às leveduras que são produzidos durante a fermentação podem

acumular-se no fermento promovendo perdas de viabilidade e reduzindo a eficiência

industrial.

Entre os compostos tóxicos que merecem especial destaque,

como inibidores das leveduras alcoólicas, estão os ácidos orgânicos e os compostos

fenólicos. Na literatura há vários trabalhos que descrevem os efeitos danosos de

compostos fenólicos sobre uma população microbiana, estando incluídas no grupo

suscetível as células de levedura (BORZANI; FALCONE, 1960; O’CONNOR;

RUBINO, 1991; MARTIN; JONSSON, 2003). Alguns destes compostos estão

presentes no caldo da cana, dentre eles o ácido gálico, ácido salicílico, ácido cafeico,

ácido ferúlico, ácido sináptico, ácido vanílico, conforme Leite (2000).

Os compostos fenólicos são originados do metabolismo

secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento e reprodução, além de

se formarem em condições de estresse, como infecções, ferimentos, radiações UV,

dentre outros (ANGELO; JORGE, 2007). Basicamente são substâncias formadas pelo

anel benzênico com grupos hidroxilas associados diretamente à estrutura cíclica. Esses

compostos são sintetizados a partir de duas rotas metabólicas principais: a via do ácido

chiquímico e a via do ácido mevalônico (KEGG, 2008).



desinfetantes (Klarmann; Shternov, 1936 citados por O’Connor; Rubino, 1991).

Segundo Borzani e Falcone (1960), o fenol se dissolve no protoplasma e sua ação

depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os lipídeos do protoplasma.

36

Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor máximo, as proteínas

precipitam irreversivelmente e a célula morre.

Os compostos fenólicos que estão presentes nas plantas da cana-

de-açúcar e são carreados pelo caldo, acabam se acumulando nos méis que

posteriormente serão fermentados (TOSETTO, 2008).

Durante o processo de fermentação, a presença de compostos

fenólicos podem inibir a reprodução da levedura, o que resulta em menor viabilidade

das células e brotos, comprometendo o reaproveitamento de células (RAVANELI et al.

2006). Ravaneli (2010) que trabalhou com os efeitos dos compostos fenólicos na

viabilidade celular de leveduras alcoólica, afirmou que a redução da viabilidade celular

no decorrer dos ciclos fermentativos foi menor em relação ao início dos primeiros

ciclos. Nesse trabalho, o autor concluiu que a queda na viabilidade ao longo dos ciclos

possivelmente ocorreu em função do estresse acumulado pela levedura, causado pela

presença das biomoléculas inibidoras do processo fermentativo, tais como compostos

fenólicos, ácidos e a presença de contaminantes.

Tosetto (2008) trabalhou com duas cepas isoladas (Y904 e SA1)

para avaliação dos efeitos dos compostos fenólicos encontrados em melaço (ácido

cafeico 10,75 ppm, vanílico 59,70 ppm, gálico 1,49 ppm e siríngico 72,18 ppm) sobre a

viabilidade celular. Concluiu que a substância que mais afetou a cepa SA1 foi ácido

gálico; o decréscimo por ciclo foi de 6,87% em relação ao valor de viabilidade inicial; já

para a outra cepa, nenhum composto fenólico afetou significativamente a viabilidade

celular.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos compostos

fenólicos do mosto sobre a viabilidade celular, viabilidade brotamento e brotamento da

levedura Saccharomycescerevisiae durante o processo de fermentação contínua, na safra

de 2011 da Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1 Descrição do processo industrial de fermentação

Na Usina São Manoel, o processo de produção de etanol é

contínuo. O volume útil total dos reatores é de 2.800 m³ e a capacidade de produção

diária é de 1.200 m³ de etanol hidratado e 500 m³ etanol anidro. A planta de

fermentação é composta por três linhas de quatro fermentadores (total de 12) e uma

37

única dorna final. Após o término da fermentação, o vinho passa por centrífugas da

marca Alfa Laval, modelo FESX 512-S-34-60 com rotação de eixo de 1.700 a 1800 rpm

para separação do creme de levedura. O vinho delevedurado (sem as leveduras) segue

para a destilação e o creme de levedura para o tratamento do fermento. Na safra

2011/2012, a Usina São Manoel adotou o processo de recentrifugação, em que o creme

de levedura obtido da centrifugação é diluído com água acidulada (o pH do creme é de

aproximadamente 3,0) e novamente centrifugado, para obter um novo creme que será

tratado (água e ácido sulfúrico) mantendo um pH entre 2,1 a 2,3 e recirculado no

processo fermentativo. Durante a centrifugação ocorre a sangria de fermento para a

fábrica de levedura seca (Figura 2.1).

A multiplicação do fermento para o início da safra foi feita com

270 kg levedura selecionada CAT-1, em cubas de fermentação.

Figura 2.1 – Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São

Manoel.

Dornas de

fermentação

Centrifugação

Cuba de fermento Água

Ácido sulfúrico

Centrifugação

Cubas de fermento Água Ácido sulfúrico

Dornas de

fermentação

Volante - vinho

Aparelhos

destilação

Volante - vinho

Sangria

38

2.2.2 Planejamento experimental e análise estatística

O trabalho foi desenvolvido como um estudo de caso, realizado

na Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo, durante a safra

2011/2012. Os resultados das análises da concentração de compostos fenólicos do

mosto foram relacionados com a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento e o

brotamento da levedura, no mesmo período.

Após as paradas prolongadas por chuva, foram excluídos três

dias após o reinicio de moagem, para desconsiderar as oscilações que ocorrem durante o

período da parada até estabilizar o processo novamente.

A relação entre as variáveis estudadas foram avaliadas pelo

coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t ao nível de 5%

de probabilidade (GOMES, 1976).

2.3 ANÁLISES QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS

2.3.1 Compostos fenólicos

Amostras pontuais de mosto foram coletadas a cada 4 horas

(6/dia), misturadas e congeladas à temperatura de -3ºC. Para a análise de compostos

fenólicos, a amostra composta foi descongelada, em banho-maria, e submetida à análise

por meio do método de Folin-Ciocalteu, com leitura de absorbância a 650 nm em célula

de 10 mm. O espectrofotômetro utilizado foi da Marca Hach, modelo DR 5000

(CLARKE, et al., 1985).

2.3.2 Identificação das leveduras

A identificação das cepas de leveduras foi feita por meio de

cariotipagem (técnica que separa por eletroforese os cromossomos de leveduras, na sua

forma intacta), sendo que a amostragem foi realizada mensalmente durante a safra pelo

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícola

(CPQBA/UNICAMP).

2.3.3 Viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamentocelular

Foram realizadas em amostras de vinho da dorna final, por meio

de coletas pontuais (2/dia). O método usado para a determinação da viabilidade celular,

39

viabilidade de brotamento e brotamento foi o da contagem em câmara de Neubauer e

coloração das células com azul de metileno (CTC, 2011).

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante a safra ocorreu a contaminação do fermento original

com leveduras nativas.A Figura 2.2 mostra a sucessão de cepas de leveduras

Saccharomycescerevisiae durante a safra. A levedura CAT-1 foi utilizada como inóculo

para o processo de fermentação. Observa-se que nos dois primeiros meses de safra (abril

e maio), a cepa CAT-1 representou 100% da população, não havendo contaminação por

leveduras nativas. Nos meses de junho e julho, a cepa CAT-1 (60%) foi contaminada

por quatro leveduras nativas (40%), iniciando o processo de sua eliminação. Nos três

últimos meses de safra (agosto, setembro e outubro), a cepa CAT-1 foi eliminada dos

fermentadores, restando apenas às leveduras nativas. Essa contaminação por leveduras

ocorre devido às variações de condições de processo, das condições climáticas,

qualidade da matéria-prima, etc. (BASSO, 211). Antonangelo, 2009, também observou

o surgimento de outras cepas de leveduras nativas na usina São Manuel na safra

2008/2009.

Figura 2.2 – Resultados das análises de cariotipagem.

Neste estudo, os compostos fenólicos do mosto variaram de 623

a 1.749 mg/L (média de 1.109 mg/L). Essa variação ocorreu em função do tipo de

mosto empregado (caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções)

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

14/abr (multiplicação)

09/mai 15/jun 07/jul 09/ago 09/set 24/out

Acompanhamento cariotipagem Safra 2011/2012

Nativa (Biotipo H) não floculante Nativa (Biotipo G) não floculante Nativa (Biotipo F) Floculação forte

Nativa (Biotipo E) Floculação leve Nativa (Biotipo D) Floculação leve Nativa (Biotipo C) Floculação leve

Nativa (Biotipo B) Floculação forte Nativa (Biotipo A) Floculação forte CAT1 - não floculnte

40

e de acordo com concentração de compostos fenólicos contidos no caldo e/ou melaço, a

qual foi influenciada pela qualidade da cana-de-açúcar.

No vinho, a viabilidade celular variou de 70,3 a 98,1% (média

de 89,6%), a viabilidade de brotamento de 55,9 a 100% (média de 84,8%) e o

brotamento celular de 8,5 a 29,4% (média de 15,1%). Essa variação foi decorrente da

instabilidade de processo durante a safra, como paradas prolongadas por chuva ou por

possíveis inibidores presentes no mosto, oriundos da matéria-prima de baixa qualidade.

As Figuras 2.3, 2.4 e 2.5 ilustram a relação da concentração de

compostos fenólicos do mosto sobre a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento e

o brotamento, respectivamente.

Os valores dos coeficientes de correlação, r e do teste t, entre as

variáveis, compostos fenólicos e viabilidade celular estão na tabela 2.1. Para os itens: a)

levedura – 100% CAT-1 e b) levedura – 60% CAT-1 e 40% nativas, as correlações são

não significativa e mostrando que os compostos fenólicos neste caso não estão

relacionados com a viabilidade celular. Já para os itens: c) levedura – 100% nativa e d)

levedura - Geral da Safra, as correlações foram significativas e os compostos fenólicos

no mosto relacionam-se negativamente com a viabilidade celular.

Na tabela 2.2 os valores dos coeficientes de correlação, r e do

teste t, as correlações entre os compostos fenólicos no mosto e a viabilidade do

brotamento apenas o item: c) levedura -100% nativa foi significativo, sendo que neste

caso os compostos fenólicos tiveram relação negativa sobre viabilidade de brotamento.

Para os demais períodos as correlações não são significativas, mostrando que os

compostos fenólicos não tiveram relação com o brotamento celular.

Os compostos fenólicos e o brotamento celular representados na

tabela 2.3, em todos os itens as correlações são não significativas de acordo com os

valores dos coeficientes de correlação, r e do teste t, onde os compostos fenólicos não se

relacionaram com o brotamento celular.

A literatura especializada afirma que a presença de alguns

compostos fenólicos no mosto em fermentação prejudica o metabolismo da levedura

alcoólica, inibindo a reprodução da levedura e a viabilidade celular (RAVANELI, et al.

2006; TOSETTO, 2008; RAVANELI, 2010) Segundo Tosetto (2008) as linhagens de

leveduras tem comportamentos diferentes quando relacionados aos compostos

fenólicos, isso pode explicar a relação entre os compostos fenólicos em determinados

41

momentos da safra, onde observamos a relação hora significativa outra não

significativa.

Os autores que trabalharam nesse tema fizeram uso de

laboratórios, enquanto que o presente trabalho foi realizado em planta industrial; ou

seja, em condições ambientais diferentes. Por exemplo, nos experimentos laboratoriais,

o número de reciclagem é pequeno, 10 ciclos (RAVANELI, 2010; GARCIA et al.,

2010) em relação ao processo industrial, onde o fermento permanece em atividade

durante 6 a 7 meses (aproximadamente 570 ciclos). Mesmo este sendo um estudo em

planta industrial, observamos em determinado período a mesma relação dos compostos

fenólicos sobre a viabilidade celular e a viabilidade de brotamento.

Ravaneliet al. (2006) constaram que houve redução da

viabilidade celular no decorrer dos ciclos fermentativos. Observaram também que a limpeza

de fundo de dorna realizada ao final da maioria dos ciclos (do 3º ao 8º), contribuiu para a

melhoria da viabilidade celular. Neste caso, os autores podem ter feito uma sangria

involuntária, retirando do fermentador células velha, favorecendo a renovação do fermento.

Estima-se que a biomassa de levedura aumente entre 5 a 10%

durante um ciclo de fermentação, sendo suficiente para substituir as células de levedura

perdida durante a centrifugação (BASSO et al., 2011). Considerando esse raciocínio, na

Usina São Manoel, ocorre à sangria (média de 14g de massa seca por litro de etanol

produzido) do fermento para a secagem da levedura, favorecendo a renovação da

população de levedura (AMORIM, 2005), ou seja, as células mais novas estariam

menos suscetíveis ao efeito dos compostos fenólicos em suas concentrações.

Outro fator que deve ser considerado no presente estudo é que

na Usina São Manoel o mosto entra na dorna de fermentação na proporção de 2:1 em

relação ao fermento que foi centrifugado duas vezes, sendo a última com água. Dessa

forma, pode-se considerá-lo com menor concentração de compostos fenólicos. Portanto,

a concentração de compostos fenólicos no mosto em fermentação diminui, passando a

ser em torno de dois terços (67%) da concentração inicial.

Durante o processo de fermentação, o controle operacional

possibilita manobras de condução de processo para garantir a sanidade e vitalidade das

células, como preparo do mosto (caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em

diferentes proporções), composição química do mosto (nutrientes presentes no mosto

como nitrogênio amoniacal), centrifugação e controle de contaminação bacteriana,

controle da temperatura nos reatores, etc. Esses controles operacionais podem ter

42

colaborado para que a concentração dos compostos fenólicos não tivesse relação

significativa sobre a viabilidade (levedura 100% CAT-1 e levedura 60% CAT-1 e 40%

nativa), viabilidade de brotamento em alguns períodos e sobre o brotamento em todos

os períodos. Mesmo assim, em alguns períodos os compostos fenólicos tiveram relação

significativa com a viabilidade e a viabilidade de brotamento.

Figura 2.3 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e

aviabilidade celular de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da cepa

CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1

e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por

100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras

durante todo o período de safra (período 18/04 a 09/10/11).

Tabela 2.1 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t: compostos

fenólicos x viabilidade celular. a) população composta por 100% da cepa CAT-1

(período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40%

de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de

cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o

período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).

Compostos fenólicos no mosto x Viabilidade celular r t(r)

a) Levedura - 100% CAT-1 0,61 1,71

b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa -0,02 0,14

c) Levedura - 100% nativa -0,32 3,42 *

d) Levedura - Geral Safra -0,25 3,17 *

* Significativo ao nível 5% de probabilidade

(a) (c)

(b) (d)

50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)

Compostos fenólicos mosto (mg/L)

Cepa levedura - 100% CAT-1

50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)


Cepa levedura - 100% nativa

50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)


Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa

50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)


Cepa levedura - Geral Safra

43

Figura 2.4 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e a

viabilidade de brotamento de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da

cepa CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa

CAT-1 e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta

por 100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras



fenólicos x viabilidade de brotamento. a) população composta por 100% da cepa CAT-1





Compostos fenólicos no mosto x Viabilidade brotamento r t(r)

a) Levedura - 100% CAT-1 0,35 0,82


c) Levedura - 100% nativa -0,23 2,29 *

d) Levedura - Geral Safra -0,12 1,55

* Significativo ao nível 5% de probabilidade

(a) (c)

(b) (d)

50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

b. b

rota

men

to (

%)



50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

b. b

rota

men

to (

%)



50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

b. b

rota

men

to (

%)



50

60

70

80

90

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Via

b. b

rota

men

to (

%)



44

Figura 2.5 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos no mosto e o

brotamento de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da cepa CAT-1




período de safra (período 18/04 a 09/10/11).


fenólicos x brotamento celular. a) população composta por 100% da cepa CAT-1





Compostos fenólicos no mosto x Brotamento celular r t(r)

a) Levedura - 100% CAT-1 -0,38 0,93

b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa 0,24 1,69

c) Levedura - 100% nativa -0,06 0,20

d) Levedura - Geral Safra 0,11 1,31

Tosetto (2008) identificou os compostos fenólicos do mel e

concluiu que há linhagens de leveduras que são sensíveis a determinados compostos

fenólicos, enquanto outras cepas não o são. Neste trabalho não foram identificados

isoladamente os compostos fenólicos contidos no mosto. Foi observado que asleveduras

(a) (c)

(b) (d)

0

10

20

30

40

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Bro

tam

ento

cel

ula

r (%

)



0

10

20

30

40

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Bro

tam

ento

cel

ula

r (%

)



0

10

20

30

40

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Bro

tam

ento

cel

ula

r (%

)



0

10

20

30

40

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Bro

tam

ento

cel

ula

r (%

)Compostos fenólicos mosto (mg/L)


45

nativas apresentaram maior sensibilidade em relação aos compostos fenólicos do mosto,

quando se refere à viabilidade celular e à viabilidade de brotamento.

2.5 CONCLUSÃO

Dentro das condições de trabalho em que os testes foram

realizados, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação negativa sobre a

viabilidade celularno período com leveduras 100% das nativas e no período geral da

safra. Tiveram relação negativa sobre a viabilidade de brotamento somente no período

com leveduras 100% nativas.

Os compostos fenólicosno mosto não apresentaram relação com

o brotamento celular da levedura em todos os períodos.

2.6 REFERÊNCIAS

ANGELO, P. M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos – Uma breve

revisão. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 232-240, 2007.

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Yeast, 26: S125–S135. doi: 10.1002/yea.1689.Abstracts of the 24th International

Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Manchester, UK, 19-24 July

2009.

BASSO, L. C.; BASSO, T. O.; ROCHA, S. N. Ethanol Production in Brazil: The

Industrial Process and Its Impact on Yeast Fermentation. Biofuel Production-Recent

Developments and Prospects,(Bernardes M. A. S., edited by), p. 85-100.. InTech,

ISBN: 978-953-307-478-8, 2011. Disponível em:

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BORZANI, W.; FALCONE, M. Curso de Bioquímica industrial – Fundamentos. Escola

Politécnica da Universidade de Sao Paulo, v.1, 1960.

CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA.Manual de métodos analíticos

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SIT, 1985. p. 53-87. (Paper, 522).

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Disponível em

http://www.genome.jp/kegg/. Acesso em: 17 de dez. 2009.

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http://www.genome.jp/kegg/

46





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fermentation inhibitors. Enzyme and Microbial Technology, v.32, p. 386-395, 2003.

O’CONNOR, D. O.; RUBINO, J. R. Phenolic compounds. IN: Seymor S. Block,

Disinfection, sterilization, and preservation.Lea &Febiger, Philadelphia/London,

Cap.12, p.204-224, 4o edição, 1991.

RAVANELI, C. G. Qualidade da matéria-prima, microbiota fermentativa e

produção de etanol sob ataque de Mahanarvafimbriolata em cana-de-açúcar.

Jaboticabal, 2010. 103p. Tese (Doutorado),Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias - Universidade Estadual Paulista.

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fermentation. ScientiaAgricola,v. 63, n. 6, p. 543-546, 2006.

TOSSETTO, M. G. Comportamento de linhagens industriais

deSaccharomycesfrente a compostos inibidores no melaço de cana-de-açúcar na

produção de bioetanol.Campinas, 2008. 257p. Tese (Doutorado) - Faculdade de

Engenharia Química - Universidade Estadual de Campinas.

47

CAPÍTULO III

48

RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO

MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR

SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO.

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre a

concentração dos compostos fenólicos do mosto sobre a eficiência da fermentação

alcoólica por subprodutos, em processo contínuo, durante a safra 2011/2012, na Usina

São Manoel, município de São Manuel-SP. Esta unidade iniciou a safra com a levedura

selecionada CAT-1, sendo que durante a safra as cepas nativas contaminaram o

processo fermentativo e a cepa CAT-1 foi eliminada do processo. A pesquisa foi

desenvolvida como um estudo de caso na planta de fermentação. As análises de

concentração de compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método

FolinCiocalteu com corante azul de metileno, enquanto a eficiência da fermentação foi

calculada através de subprodutos gerados durante o processo de fermentação alcoólica.

A análise estatística foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua

significância através do teste t. Concluiu-se que os compostos fenólicos contidos no

mosto não se relacionam com a eficiência da fermentação por subprodutos em processo

fermentativo contínuo industrial em nenhumdos períodos estudados.

Palavra chave: Eficiência da fermentação, compostos fenólicos, levedura alcoólica.

49

RELATIONSHIP OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS

CONCENTRATION WITH THE ALCOHOLIC FERMENTATION

EFFICIENCY USING BY-PRODUCTS METHOD IN A CONTINUOUS

PROCESS.

SUMMARY


must phenolic compounds concentration whit the alcoholic fermentation efficiency

using by-products method in a continuous process, during the harvest 2011/2012 in São

Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP).This unit began the harvest with the selected yeast

called CAT-1 and during the harvest, the native stumps contaminated the fermentation

process eliminating CAT-1 stump from the process. Analyses of concentration of the

must phenolic compounds were accomplished through the FolinCiocalteu method using

a marker (m-ethilen blue),while the fermentation efficiency was calculated using by-

products generated along the alcoholic fermentation process.Statistical analysis was

evaluated by Pearson’s correlation coefficient and its significance through the “t” test.

It was concluded that the must phenolic compounds had negative relationship with by-

products fermentation efficiency in industrial fermentation continuous process in none

of the studied periods.

Key-words: fermentation efficiency, phenolic compounds, alcoholic yeast.

50

3.1 INTRODUÇÃO

O processo de fermentação contínua tornou-se popular no Brasil

principalmente devido ao aperfeiçoamento das tecnologias de resfriamento e agitação

do vinho em dornas de grande volume, com manutenção estável da temperatura. Nesse

processo, as células de levedura recuperadas são recirculadas por fermentações

consecutivas durante toda a safra canavieira (FERNANDES, 2011).

Segundo Fernandes (2011), a eficiência é um indicador

porcentual, ou seja, representa o produto recuperado por cento da quantidade disponível

na matéria-prima. Este parâmetro mede com maior fidelidade o desempenho do setor

industrial. No caso da fermentação alcoólica, a eficiência deve ser expressa como a

porcentagem de etanol produzido em relação ao açúcar consumido.

A eficiência da fermentação por subprodutos é medida de

acordo com os subprodutos gerados no processo fermentativo (CTC, 2007, citado por

FERNANDES, 2011), para aplicação em sistemas de fermentação contínua ou

descontínua. Fornece a estimativa da eficiência de fermentação e depende da precisão

das medidas analíticas necessárias para os cálculos (FERNANDES, 2011).

No processo de fermentação há muitos fatores que podem

interferir em um bom rendimento fermentativo, dentre eles está a matéria-prima que

pode conter muitos inibidores celulares. Entende-se por inibição da fermentação a

atuação de compostos sobre as leveduras, que são as responsáveis pela transformação

do açúcar em etanol (TOSETTO, 2008).

Entre os compostos que merecem especial destaque, como

inibidores das leveduras nos processos de fermentação alcoólica, estão os ácidos

orgânicos e os compostos fenólicos. Na literatura há vários trabalhos que descrevem os

efeitos danosos de compostos fenólicos sobre uma população microbiana, estando

incluídas no grupo suscetível as células de levedura (BORZANI; FALCONE, 1960;

O’CONNO; RUBINO, 1991; MARTIN; JONSSON, 2003). Alguns destes compostos

estão presentes no caldo da cana como descrito por LEITE (2000). Dentre os compostos

citados estão o acido gálico, acido salicílico, acido cafeico, acido ferúlico, acido

sináptico, acido vanílico entre outros.

Garcia et al. (2010) ao avaliar o açúcar redutor residual total

(ARRT) em vinho, observaram que os compostos fenólicos, exerceram um efeito

negativo sobre as leveduras, prejudicando sua capacidade de usar os açúcares

51

disponíveis no ambiente, causando uma menor eficiência da fermentação. Observaram

também, que o caldo da cana-de-açúcar com danos causados por pragas, apresentou

níveis mais elevados de contaminantes e os níveis mais elevados de compostos

fenólicos que interferem e prejudicam o processo de fermentação.

Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de

benzeno, ao qual se ligam grupos hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande variedade

de compostos fenólicos, cumarinas, taninos, ligninas e flavonóides são considerados

fenóis vegetais (BOVI, 1997).



desinfetantes (O’CONNOR; RUBINO, 1991).

Polakovic (1992) em seu trabalho constatou que os compostos

fenólicos (fenol, guaiacol e ácido vanílico) atuam como inibidores do processo de

fermentação alcoólica, atuando sobre a enzima invertase da levedura.

Amorim et al. (1996) também relacionaram que o acúmulo de

estresse nas leveduras durantes os ciclos de fermentação, pode ser causado pela

presença de biomoléculas que inibem o processo fermentativo, como os compostos

fenólicos e ácidos orgânicos produzidos durante a fermentação. A presença destes

inibidores são indesejáveis e podem se acumular nas leveduras durante os ciclos,

causando redução na viabilidade e diminuindo eficiência industrial.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre a

concentração dos compostos fenólicos do mosto e a eficiência da fermentação alcoólica

por sobproduto em processo contínuo.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1 Descrição do processo industrial de fermentação

O processo de produção de etanol na Usina São Manoel é

contínuo, sendo que o volume útil total dos reatores soma 2.800 m³. A capacidade de

produção diária é de 1.200 m³ de etanol hidratado e 500 m³ etanol anidro. A planta de

fermentação é composta por três linhas de quatro fermentadores (total de 12) e uma

única dorna final. Após o término da fermentação, o vinho passa por centrífugas da

marca Alfa Laval, modelo FESX 512-S-34-60 com rotação de eixo de 1.700 a 1800 rpm

para separação do creme de levedura. O vinho delevedurado (sem as leveduras) segue

52

para a destilação e o creme de levedura para tratamento do fermento. Na safra

2011/2012, a Usina São Manoel adotou o processo de recentrifugação, em que o creme

de levedura obtido da centrifugação é diluído com água acidulada (o pH do creme é de

aproximadamente 3,0) e novamente centrifugado, para obter um novo creme que será

tratado (água e ácido sulfúrico) mantendo um pH entre 2,1 a 2,3 e recirculado no

processo fermentativo. Durante a centrifugação ocorre a sangria de fermento, que segue

para a fábrica de levedura seca (Figura 3.1).

A multiplicação do fermento para o início da safra foi feita com

270 kg levedura selecionada CAT-1, em cubas de fermentação.

Figura 3.1 Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São Manoel.

3.2.2 Planejamento experimental e análise estatística

O trabalho foi desenvolvido como um estudo de caso, realizado

na Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo, durante a safra

2011/2012. Os resultados das análises da concentração de compostos fenólicos do

mosto foram relacionados com aeficiência da fermentação no mesmo período.

Após as paradas prolongadas por chuva, foram excluídos três

dias após o reinicio de moagem, para desconsiderar as oscilações que ocorrem durante o

período da parada até estabilizar o processo novamente.

Dornas de Fermentação

Centrifugação Cuba

Tratamento do fermento

Centrifugação

Cuba

Tratamento do fermento

Água + ácido sulfúrico Água + ácido sulfúrico

Sangria do

fermento

Volante

Vinho delevedurado Aparelho destilação

53

A relação entre as variáveis estudadas foram avaliadas pelo

coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t ao nível de 5%

de probabilidade (GOMES, 1976).

3.3 ANÁLISES QUÍMICAS E CÁLCULO DA EFICIÊCIA FERMENTATIVA

POR SUBPRODUTOS.

3.3.1 Compostos fenólicos

Amostras de mosto foram coletadas de forma pontual a cada 4

horas (6/dia), misturadas e congeladas à temperatura de -3ºC. Para a análise de

compostos fenólicos, a amostra composta foi descongelada, em banho-maria, e

submetida à análise por meio do método de Folin-Ciocalteu, com leitura de absorbância

a 650 nm em célula de 10 mm. O espectrofotômetro utilizado foi da Marca Hach,

modelo DR 5000 (CLARKE, et al., 1985).

3.3.2 Cálculo da eficiência da fermentação por subprodutos

𝑬𝒇 = 100

1 + 1,19 . 𝐾1 + 0,5 . 𝐾𝑔 + 0,51 . 𝐾𝑎𝑐 + (0,51 . 𝐾𝑎𝑟𝑟𝑡) (1)

Onde:

Kl = perdas porcentuais devido ao fermento produzido:

𝑲𝟏

= 𝐿𝑒𝑣𝐷𝑉 . 0,33

𝐺𝑟𝑎𝑉𝑉𝐶 . 0,7893 (2)

Karrt Perdas devidas aos açúcares redutores residuais totais

𝑲𝒂𝒓𝒓𝒕 =𝐴𝑅𝑅𝑇

𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶 . 0,7893 (3)

Kg Teor de glicerol no vinho delevedurado

54

𝑲𝒈 = 𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙

𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶. 0,7893(4)

Kac Acidez produzida

𝑲𝒂𝒄 =𝐴𝑐𝑉𝐷𝐹 − 𝐴𝑐𝐹𝑇

𝐿𝑒𝑣𝑉𝑐

𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇 – 𝐴𝑐𝑀 1 −

𝐿𝑒𝑣𝑉𝑐

𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇

1,837 . 789,3 𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶

100 −

𝐿𝑒𝑣𝑉𝐶

𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇

𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝐹𝑇

100

(5)

Legenda:

LevDV - Porcentagem de fermento vinho delevedurado.

GraVVC - Teor alcoólico vinho delevedurado (% v/v).

Glicerol - Teor de Glicerol vinho delevedurado (%).

AcVDF - Acidez sulfúrica vinho dorna final (g/L).

AcFT - Acidez sulfúrica fermento tratado (g/L).

LevVC - Porcentagem de fermento vinho delevedurado (%).

LevFT - Porcentagem de fermento tratado (%).

AcM - Acidez sulfúrica do mosto (g/L).

GrauVFT - Teor alcoólico fermento tratado (% v/v).

ARRT - Açúcares redutores residuais totais (%)

3.3.3 Análises dos subprodutos para cálculo da eficiência da fermentação

55

3.3.3.1 Porcentagem de fermento vinho deleveduradoe do creme de levedura

As amostras de vinho delevedurado foram coletadas de forma

pontual a cada 4 horas e as amostras do creme de levedura foram coletadas de forma

pontual a cada 8 horas

A porcentagem foi medida através da centrifugação de 10 mL da

amostra em um tubo graduado de 10 mL com fundo cônico em uma centrífuga de

bancada marca Metroterm, modelo MTD – Plus com rotação de 3.500 rpm por 3 min.

Ao final do tempo, observou-se o volume do precipitado no tubo graduado e

multiplicou-se por 10. Sendo o resultado expresso em % (CTC, 2011).

3.3.3.2 Teor alcoólico do vinho deleveduradoe do creme de levedura


pontual a cada 4 horas eas amostras de creme de levedura foram coletadas de forma

pontual a cada 8 horas.

As amostras foram destiladas em microdestilador de álcool,

marca Tecnal modelo TE-012 e a leitura do teor alcoólico do destilado feita em

densímetro eletrônico: marca Anton Paar – modelo DMA 4500, sendo o resultado

expresso em % v/v(CTC, 2011).

3.3.3.3 ARRT do vinho delevedurado


pontual a cada 8 horas. O método utilizado foi Lane &Eynon e titulação com solução de

Fehling A e B. O resultado foi expresso em porcentagem (CTC, 2011).

3.3.3.4 Glicerol do vinho delevedurado


pontual a cada 8 horas. O glicerol foi determinado pelo método enzimático, empregando

espectrofotometria, cuja absorbância é medida a 540 nm. Resultado foi expresso em %

m/v (CTC, 2011).

3.3.3.5 Acidez sulfúrica do mosto, do vinho levedurado e dofermento tratado

As amostras do mosto, do vinho levedurado e do fermento tratado foram

coletadas de forma pontual a cada 4 horas. A determinação foi feita através de titulação

56

com solução de hidróxido de sódio 1mol/L, gota a gota e sob agitação até pH 8,7. O

pHmetro usado foi da marca Mettler Toledo modelo AG 8603 (CTC, 2011).

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 3.1 mostra a sucessão de cepas de leveduras

Saccharomycescerevisiae no mosto em fermentação, durante a safra. Observa-se que

nos dois primeiros meses de safra (abril e maio), a cepa CAT-1 representou 100% da

população, não havendo contaminação por leveduras nativas. Nos meses de junho e

julho, a cepa CAT-1 (60%) foi contaminada por leveduras duas nativas (40%), iniciando

o processo de sua eliminação. Nos três últimos meses de safra (agosto, setembro e

outubro), a cepa CAT-1 foi eliminada dos fermentadores, restando apenas às leveduras

nativas. Andriettaet al. (2011) também observaram substituição da população de

leveduras no processo fermentativo ao monitorarem a safra de uma usina

sucroalcooleira através de cariotipagem.

A biodiversidade de leveduras encontradas em ambientes de

destilaria poderia ser uma importante fonte de tensões. Isto porque durante a reciclagem

de células de levedura, a pressão seletiva (evolução adaptativa) é aplicada sobre as

células, conduzindo a cepa com maior tolerância para as condições de estresse de

fermentação industrial a predominar (BASSO, et al., 2008).

57

Tabela 3.1 - Resultados das análises de cariotipagem.

Resultado das Análises de Cariotipagem - Safra 2011/2012

Cepas de

Saccharomyces

Data da amostragem do vinho dorna final

14/04/11

(início) 09/05/11 15/06/11 07/07/11 09/08/11 09/09/11 24/10/11

CAT1 - sem perfil

floculação 100,0% 100,0% 64,9% 61,0% - - -

Nativa (Biotipo A)

fortemente

floculante

- - 13,0% - - - -

Nativa (Biotipo B)

fortemente

floculante

- - 13,0% - - - -

Nativa (Biotipo C)

levemente

floculante

- - 9,1% 2,4% 92,9% 54,5% 8,3%

Nativa (Biotipo D)

levemente

floculante

- - - 36,6% - - -

Nativa (Biotipo E)

levemente

floculante

- - - - 7,1% - -

Nativa (Biotipo F)

floculação pesada - - - - - 45,5% -

Nativa (Biotipo G)

não floculante - - - - - - 75,0%

Nativa (Biotipo H)

não floculante - - - - - - 17,0%

Os compostos fenólicos variaram de 623 a 1.749 mg/L (média

de 1.106 mg/L). Essa variação ocorreu em função da concentração dos compostos

fenólicos contidos na matéria-prima (caldo e/ou melaço) sobre o tipo mosto empregado

(caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções) durante a safra.

A eficiência da fermentação por subprodutos variou de 78,4 a

95,72% (média de 91,5%). Essa variação ocorreu por diversos motivos, dentre eles: a

presença de leveduras nativas durante o processo fermentativo (tabela 3.1), retornos de

paradas prolongadas por chuva com matéria-prima com altas horas de queima, o que

compromete a qualidade do mosto.

A Figura 3.2 ilustram a relação da concentração de compostos

fenólicos do mosto e a eficiência da fermentação alcoólica.Pode-se constatar que os

coeficientes angulares assumiram valores próximos de zero, indicando que as retas estão

praticamente paralelas ao eixo x; portanto, não devendo haver correlação entre os dados

analisados, em todos os períodos de safra.

58

Os valores dos coeficientes de correlação, r e do t, entre as

variáveis, compostos fenólicos no mosto e eficiência da fermentação por subprodutos,

em todos os períodos estudados (Tabela 3.2) as correlações são não significativas,

mostrando que neste caso não estão relacionados os compostos fenólicos com a

eficiência da fermentação.

Figura 3.2 – Correlação entre a concentração dos compostos fenólicos do mosto e a

eficiência de fermentação por subprodutos. a) população composta por 100% da cepa

CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1

e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por

100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras


Tabela 3.2 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:: compostos

fenólicos x rendimento de fermentação por subprodutos. a) população composta por

100% da cepa CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60%

da cepa CAT-1 e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população

composta por 100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de

leveduras durante todo o período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).

Compostos fenólicos no mosto x Eficiência da Fermentação r t(r)

a) Levedura - 100% CAT-1 -0,35 0,93

b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa 0,08 0,56

c) Levedura - 100% nativa 0,11 1,06


(a) (c)

(b) (d)

70

75

80

85

90

95

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic

iên

cia

Ferm

enta

ção

(%

)



70

75

80

85

90

95

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic

iên

cia

Ferm

enta

ção

(%

)



70

75

80

85

90

95

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic

iên

cia

Ferm

enta

ção

(%

)



70

75

80

85

90

95

100

500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic

iên

cia

Ferm

enta

ção

(%

)



59

Polakovic (1992) constatou que os compostos fenólicos como o

fenol, o guaiacol e o ácido vanílico são inibidores do processo de fermentação alcoólica,

atuando sobre a enzima invertase da levedura. Através da Tabela 3.3 os valores dos

coeficientes de correlação, r e do t, entre as variáveis, compostos fenólicos no mosto e

ARRT do vinho, em todos os períodos estudados as correlações são não significativas,

mostrando que neste caso não estão relacionados os compostos fenólicos com o ARRT

do vinho todos os períodos de safra. Neste presente estudo, não foram feitas análises

específicas de identificação de compostos fenólicos.

O comportamento do ARRT do vinho é semelhante ao resultado

sobre a eficiência da fermentação por subproduto. A Figura 3.3 ilustra a correlação entre

as concentrações de compostos fenólicos do mosto e do ARRT do vinho.

Figura 3.3 - Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e o

ARRT do vinho. a) população composta por 100% da cepa CAT-1 (período 18/04/11 a

09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40% de cepas nativas

(período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de cepas nativas

(período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o período de

safra (período 18/04 a 09/10/11).

(a) (b)

(c) (d)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

AR

RT

(%

)



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

AR

RT

(%

)



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

AR

RT

(%

)



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

AR

RT

(%

)



60


fenólicos x ARRT do vinho. a) população composta por 100% da cepa CAT-1 (período

18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40% de cepas

nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de cepas

nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o


Compostos fenólicos no mosto x ARRT vinho r t(r)

a) Levedura - 100% CAT-1 0,34 0,88


c) Levedura - 100% nativa -0,04 0,37


Garcia et al. (2010) constatou que durante os ciclos estudados

(10) os compostos fenólicos exerceram um efeito negativo sobre as leveduras,

prejudicando sua capacidade de usar os açúcares disponíveis, resultando em baixa

eficiência da fermentação.

Ao contrário do que foi observado pelos autores citados

anteriormente, no presente trabalho não foi possível relacionar os danos dos compostos

fenólicos do mosto sobre as leveduras, com consequente redução da eficiência da

fermentação. É provável que as metodologias de análise química empregadas não

permitiram que as equações de regressão fossem estatisticamente significativas. Além

disso, os autores que trabalharam nesse tema fizeram uso de laboratórios, enquanto que

o presente trabalho foi realizado em planta industrial; ou seja, em condições ambientais

diferentes. Por exemplo, nos experimentos laboratoriais, o número de reciclagem é

pequeno (10 ciclos) em relação ao processo industrial, onde o fermento permanece em

atividade durante 6 a 7 meses (aproximadamente 570 ciclos).

Durante o processo de fermentação, o controle operacional

possibilita manobras de condução de processo para garantir a sanidade das células, e

melhor rendimento industrial, tais como o preparo do mosto (caldo/mel ou

caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções), composição química do mosto

(nutrientes presentes no mosto como nitrogênio amoniacal), centrifugação e

recentrifugação do creme, controle de contaminação bacteriana e sangria. Esses

controles operacionais podem ter colaborado para que os compostos fenólicos não

interferissem no rendimento fermentativo por subprodutos.

61

3.5 CONCLUSÃO

Dentro das condições de trabalho em que os testes foram

realizados, concluiu-se que os compostos fenólicos contidos no mosto não se

relacionam com a eficiência da fermentação por subprodutos em processo fermentativo

contínuo industrial.

3.6 REFERÊNCIAS

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controle e monitoramento. FERMENTEC/FEALQ/ESALQ-USP. Piracicaba,1996.

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has Brazil learned about yeasts inhabiting the ethanol production processes from sugar

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edited by), p.67-84. InTech, ISBN: 978-953-307-478-8, 2011. Disponível em:

http://www.intechopen.com/articles/show/title/bioethanol-what-has-brazil-learned-about-yeasts-inhabiting-the-ethanol-production-processes-from-sug.

Acessoem: 24 out. 2012.

BASSO, L. C.; AMORIM, H. V.; OLIVEIRA, A. J. LOPES, M. L. Yeast selection for

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1163, 2008.

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Politécnica da Universidade de São Paulo, v.1, 1960.

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açúcar sobre as características do caldo. Campinas, 1997. 81p. Tese (Doutor)

Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.

CLARKE, M. A. R. S. et al. Color components in sugar refinery processes. In:

ANNUAL MEETING OF SUGAR INDUSTRY TECHNOLOGISTS, 44th, 1985,

California. Proceedings.California: SIT, 1985. p. 53-87. (Paper, 522).

CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA.Manual de métodos analíticos

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FERNANDES, A. C. Cálculos na Agroindústria da Cana-de-açúcar. 3ª edição,

Piracicaba: STAB, p. 416. 2011

GARCIA, B. D..Damages of spittlebug on sugarcane quality and fermentation

process.ScientiaAgricola, Piracicaba, SP, v. 67, n. 5, p. 555-561, September/October

2010.

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62





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Paulista.

TOSSETTO, M. G. Comportamento de linhagens industriais de Saccharomyces

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bioetanol.Campinas, 2008. 257p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Engenharia Química

- Universidade Estadual de Campinas.

63

CAPÍTULO IV

64

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A literatura especializada relata que o aumento da concentração de

compostos fenólicos na cana-de-açúcar pode estar relacionado com infestações de pragas na

lavoura, sendo que este aumento pode prejudicar o processo de fermentação alcoólica.

Por esse motivo, no inicio da Safra 2011/2012, a Usina São Manoel

adotou em sua rotina laboratorial, a análise de compostos fenólicos no caldo de cana-de-

açúcar e mosto de fermentação. O propósito dessas análises foi monitorar a concentração

dos compostos fenólicos durante a safra e sua relação com as leveduras e a eficiência de

fermentativa.

Como foi o primeiro ano que foi realizado esse trabalho com

compostos fenólicos, a Usina São Manoel optou por fazer um acompanhamento com essa

análise durante as próximas safras, a fim de gerar um histórico sobre os resultados e poder

comparar entre as safras.

Como sugestão de novos trabalhos, seria interessante direcionar

estudos de identificação e a quantificação dos compostos fenólicos contidos no caldo de

cana-de-açúcar de acordo com índices de infestações por praga, como por exemplo, a broca,

comparando com o caldo de cana-de-açúcar considerado sadio. Relacionar os dados

encontrados, com o efeito destes como inibidores celulares sobre o processo fermentativo e

também, sobre as cepas de primeira geração e com cepas de reciclos, as quais podem ou não

sofre influencia de saturação.

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