Universidade Federal de Sergipe

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Programa de Pós-Graduação em Química

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÂO DE RESÍ DUOS

DE PESTICIDAS EM PLANTA MEDICINAL Cordia salicifolia UTILIZANDO AS

TÉCNICAS DE MSPD, GC/MS e HPLC-UV

PEDRO HENRIQUE VIANA DE CARVALHO

SÃO CRISTÓVÃO/SE

2009

2

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÂO DE RESÍ DUOS

DE PESTICIDAS EM PLANTA MEDICINAL Cordia salicifolia UTILIZANDO AS

TÉCNICAS DE MSPD, GC/MS e HPLC-UV.

PEDRO HENRIQUE VIANA DE CARVALHO

ORIENTADOR: Prof. Dr. Sandro Navickiene

SÃO CRISTÓVÃO/SE

2009

Dissertação apresentada ao

Núcleo de Pós-Graduação em

Química da Universidade Federal

de Sergipe como requisito para a

obtenção do título de Mestre em

Química.

3

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C331d

Carvalho, Pedro Henrique Viana de Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de pesticidas em planta medicinal Cordia salicifolia utilizando as técnicas de MSPD, GC/MS e HPLC-UV / Pedro Henrique Viana de Carvalho. – São Cristóvão, 2009.

118 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de Sergipe, 2009.

Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene 1. Química analítica – métodos físico-quimicos. 2. Pesticidas. 3.

Plantas medicinais. I. Título.

CDU 543.5:632.95:633.88

4

Este trabalho é dedicado especialmente à minha mãe Lea Maria Viana de

Carvalho e meu pai Hélio Wilson Lemos de Carvalho por todo carinho, atenção,

inspiração profissional e de vida, à minha inesquecível infância, à grande educação

e incentivo que me foi concedido; e a vocês declamo meu enorme carinho aqueles

que considero os melhores pais do mundo sem dúvida alguma.

5

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pelo dom da vida e pela oportunidade de seguir em frente.

Ao apoio de meus pais por todo incentivo, educação e aprendizado, inspiração

profissional e de vida, atenção, dedicação dado durante todos esses anos pois sem

eles eu não teria chegado aonde eu cheguei.

Ao meu avô e minha avó Henrique e Helena (in memorian) e avô e avó Pedro e

Avelina.

Aos meus tios e tias em especial a minha madrinha Iliege Maria Viana.

Aos meus tios Álvaro, Chiquinho e tia Santinha (in memorian).

A minha família, meus irmãos Thiago e Thiana pelo companheirismo e amizade ao

longo destes anos.

A meus primos em especial Paulinho, Marcelinho e Marquinhos, a todos amigos de

Barreiras e Aracaju.

Um agradecimento especial a um grande primo, irmão que tive durante todos esses

anos, a grande e eterna amizade, parceria, momentos compartilhados de dificuldades

e alegrias daquele que considero meu melhor amigo Mateus Viana de Souza (in

memorian).

Um agradecimento especial a meu orientador Prof. Sandro Navickiene pela oportunidade

concebida de ser seu aluno de mestrado, pela atenção, pela competência na busca dos

caminhos para a solução de dúvidas e resolução de problemas.

Ao prof. Haroldo Silveira Dórea por sua grata ajuda ao longo da graduação e do

mestrado.

6

Ao professor Carlos Alexandre por sua amizade e orientação no Programa de

Iniciação Científica no LQA.

Aos meus antigos colegas de graduação e mestrado em Química: Moacir, Kennedy,

Marcelo Zohio, Elias, Luís Oliveira, Taís, Danielle Barros, Ana Clécia, Charlene e

Adilson.

Aos amigos Ismael, dona Eliza e dona Ednalva.

Aos colegas do LCP Ricardo, Adriano Aquino, Elissandro, Débora, Márcia, Tamires

Cruz, Tamires Gleice, Marcell, Michel, Alain Gaujac, Daniela, Maria Geovânia,

Adalberto, Anselmo, Clóvis, Thaíse, Mirella, Vanessa e Iara pelo clima de harmonia e

alegria no laboratório.

Aos professores do Departamento de Química: Nivan, Paulo César, José do

Patrocínio, Péricles, Valéria, Luciane, Maria Eliane, Maria de Lara e Ana Paula.

Agradecimento a CAPES pela bolsa de mestrado concedida.

Ao CNPq pelo financiamento do projeto intitulado por: “Cooperação acadêmica UFS-

UFSCar para o fortalecimento do Programa de Pós-Graduação em Química aplicada

ao estudo de recursos naturais renováveis do Estado de Sergipe”, Processo nº

620212/2006-3, coordenado por Péricles Barreto Alves, o qual foi selecionado no

Edital MCT/CT-INFRA/CT-ENERG/CNPq nº 07/2006.

7

CURRICULLUM VITAE

1. Formação Acadêmica:

• Mestrado em Química pela Universidade Federal de Se rgipe.

Desenvolvimento de Método para Determinação de Resí duos de

Pesticidas em Planta Medicinal Cordia salicifolia utilizando as

Técnicas de MSPD, GC/MS e HPLC-UV, 2009, sob orient ação do

professor Dr. Sandro Navickiene.

• Graduação em Química Licenciatura pela Universidade Federal de

Sergipe, São Cristóvão/SE, 2005.

2. Artigos Aceitos para Publicação:

CARVALHO, P. H. V.; PRATA, V. M.; ALVES, P. B.; NAV ICKIENE, S.

Determination of Six Pesticides in Medicinal Herb ( "Cordia

salicifolia ") by Matrix Solid-Phase Dispersion and Gas Chromat ography-

Mass Spectrometry. Aceito para publicação em The Jo urnal of AOAC

International. 2009.

RODRIGUES, M. O.; BRITO, A. M.; JÚNIOR, S. A. ;SIMO NE, C. A. ;ARAÚJO,

A. A. S. ; CARVALHO, P. H. V. ; SANTOS, S. C. G. ; ARAGÃO, K. A. S. ;

MESQUITA, M. E. ; FREIRE, R. O . Estudos Espectroscópicos e Estruturais

dos Polímeros de Coordenação 2D, ∞[TB(DPA)(HDPA)] E

∞[GD(DPA)(HDPA)]. Aceito para publicação em Química Nova, 2008.

8

3. Artigo Submetido:

CARVALHO, P. H. V.; BARRETO, A. B.; RODRIGUES, M. O .; PRATA, V.

M.; ALVES, P. B.; MESQUITA, M. A.; JÚNIOR, S. A.; N AVICKIENE, S.

Coordination Polymer [(GD)(DPA)(HDPA)], as a New Se lective Material

for The Matrix Solid-Phase Extraction of Pesticides Residues from

Medicinal Plant. Submetido em Journal of Chromatogr aphy A, 2008.

4. Resumos Apresentados em Congressos Internacionai s: 3

5. Resumos Apresentados em Congressos Nacionais: 12

6. Experiência Profissional:

a. Escola Monteiro Lobato, Barreiras – Bahia.

Função: Professor da Sétima e Oitava Série do Ensin o

Fundamental da Disciplina Ciências e dos 1º, 2º e 3 º graus do

Ensino Médio das disciplinas Química e Física. (02/ 2006 a

08/2006).

• Estágio Docência da CAPES realizado pelo Núcleo de Pós-

Graduação em Química da Universidade Federal de Ser gipe

(NPGQ/UFS).

Disciplina: Métodos Cromatográficos e Espectrometri a de

Massas. (04/2008 a 08/2008).

9

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO.....................................................................................................20

2. OBJETIVOS........................................................................................................24

2.1. Objetivo Geral...............................................................................................24

2.2. Objetivos Específicos....................................................................................24

3. JUSTIFICATIVA..................................................................................................25

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..........................................................................27

4.1. Pesticidas......................................................................................................27

4.1.1. Classes químicas dos Pesticidas Estudados............................................32

4.2. Plantas Medicinais........................................................................................36

4.3. Dispersão da Matriz em Fase Sólida............................................................39

4.4. Cromatografia Gasososa e Espectrometria de Massas..............................44

4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência....................................................46

5. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................49

6. EXPERIMENTAL................................................................................................53

6.1. Materiais e métodos......................................................................................53

6.2. Solventes e adsorventes...............................................................................53

6.3. Padrões de pesticidas...................................................................................53

6.4. Equipamentos...............................................................................................54

6.5.Preparação de amostra de planta medicinal................................................54

6.6. Condições Cromatográficas para o GC/MS.................................................54

6.6.1.Condições Cromatográficas para o HPLC-UV...........................................55

6.7.. Preparação das Soluções Padrão de Pesticidas.......................................56

6.8. Otimização das Condições Cromatográficas por GC/MS...........................56

6.8.1. Otimização das Condições Cromatográficas por HPLC-UV....................57

6.9. Procedimento de Limpeza das Vidrarias.....................................................58

6.9.1 Curva analítica...........................................................................................58

7. RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................59

7.1. Método de extração por MSPD.......................................................................59

8. Resultados de Valores de Recuperação em Análises por GC/MS....................61

10

8.1. Ensaios para Seleção do Suporte Sólido.....................................................61

8.2. Ensaios para Seleção de Co-coluna............................................................64

8.3. Ensaios para Seleção de Solventes de Eluição dos Pesticidas.................69

8.4. Ensaios para Seleção do Volume de Solventes...........................................71

8.5. Ensaios para Seleção da Proporção de Solventes .....................................72

8.6. Ensaios para Seleção da Proporção Matriz/Suporte Sólido........................73

8.7. Efeito Matriz .................................................................................................76

8.8. Resultados de Valores de Recuperação em Análises por HPLC-UV..........78

8.9. Validação do Método....................................................................................80

8.9.1. Estudos de Recuperação do Método........................................................86

8.9.2. Linearidade................................................................................................88

8.9.3. Limites de Detecção e Limites de Quantificação para Análises por GC/MS

e HPLC-UV.........................................................................................................90

8.9.4. Limites de Detecção..................................................................................90

8.9.5. Limites de Quantificação ..........................................................................91

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................92

10. REFERÊNCIAS..........................................................................................93

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquematização da dispersão da matriz em fase sólida.

Figura 2. Esquema de coluna MSPD para extração de pesticidas na planta

medicinal Cordia salicifolia.

Figura 3. Ensaios de recuperação para seleção do suporte sólido e concentração

da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 4. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando

ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de

fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 5. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente utilizando

ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de

fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 6. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando

ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de

fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 7. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando

ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de

fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 8. Cromatograma obtido por GC/MS, (no modo SCAN), de extrato de

Cordia salicifolia com solvente ciclohexano.

Figura 9. Cromatograma obtido por GC/MS, (no modo SCAN), de extrato de

Cordia salicifolia com solvente acetato de etila.

12

Figura 10. Ensaios de recuperação para seleção da mistura dos solventes de

eluição, utilizando C18 como co-sorvente e alumina como suporte sólido, com

concentração de solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 11. Ensaios de recuperação para seleção do volume de mistura de

solventes ciclohexano/diclorometano, utilizando C18 como co-sorvente e alumina

como suporte sólido, com concentração de solução padrão de fortificação de

pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 12. Ensaios de recuperação para seleção da proporção da mistura de

solventes ciclohexano/diclorometano no volume de 30 mL, utilizando C18 como

co-sorvente e alumina como suporte sólido, com concentração de solução

padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 13. Ensaios de recuperação para seleção da proporção planta

medicinal/suporte sólido utilizando mistura de solventes

ciclohexano/diclorometano (1:3, v,v) no volume de 30 mL, com concentração de

solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

Figura 14. Ensaios de recuperação por MSPD com sistema alumina/planta

medicinal (1:1 m/m) e co-sorvente C18, com volume de 30 mL de mistura de

solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) e análise por HPLC-UV com

concentrações da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,3; 0,5 e 1,0

µg/g.

Figura 16. Cromatograma obtido por GC/MS, da solução padrão dos pesticidas

acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona na

concentração de 0,5 µg/g em solvente diclorometano.

13

Figura 17. Cromatograma obtido por GC/MS no modo SIM do extrato de Cordia

salicifolia fortificado com solução padrão dos pesticidas acefato, clorprofam,

pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona na concentração de 0,5 µg/g,

utilizando C18 como co-sorvente e alumina como suporte sólido e mistura e

solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) no volume de 30 mL.

Figura 18. Cromatograma obtido por HPLC-UV, da solução padrão dos

pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina na concentração de 0,5

µg/g em solvente acetonitrila.

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde humana

segundo dados da ANVISA.

Tabela 2. Características gerais dos pesticidas selecionados para estudo.

Tabela 3. Propriedades físico-quimicas dos pesticidas selecionados para estudo

Tabela 4. Solubilidade dos Pesticidas em Solventes Orgânicos

Tabela 5. Estruturas químicas dos pesticidas selecionados para estudo.

Tabela 6. Série eluotrópica utilizada na seleção da fase móvel em MSPD.

Tabela 7. Comprimentos de onda mínimo dos solventes mais utilizados em

HPLC.

Tabela 8. Tempos de retenção e fragmentos monitorados na quantificação dos

pesticidas.

Tabela 9. Programação de eluição no modo gradiente para análises em HPLC-

UV.

Tabela 10. Tempos de retenção dos pesticidas analisados por HPLC-UV.

Tabela 11. Valores de recuperação média e coeficientes de variação em extrato

de Cordia salicifolia por MSPD e GC/MS.

Tabela 12. Valores de recuperação média e coeficientes de variação em extrato

de Cordia salicifolia por MSPD e HPLC-UV.

15

Tabela 13. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os

pesticidas preparados em extrato de Cordia salicifolia e analisados por GC/MS.

Tabela 14. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os

pesticidas preparados em extrato de Cordia salicifolia e analisados por HPLC-

UV.

Tabela 15. Valores dos limites de detecção (LOD) em análises por GC/MS e

HPLC-UV.

Tabela 16. Valores dos limites de quantificação (LOQ) dos pesticidas em

análises por GC/MS e HPLC-UV.

16

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASE – Extração Acelerada com Solventes (do inglês Accelerated Solvent

Extraction)

BHC - Hexaclorociclohexano

CV – Coeficiente de Variação

DAD – Detector de Arranjo de Fotodiodos (do inglês Diode Array Detector)

DCM - Diclorometano

DDD - Diclorodifenildicloroetano

DDE - Diclorodifenildicloroetileno

DDT – Diclorodifeniltricloroetano

DL – Dose Letal

DL50 – Dose Letal para 50% da População

EBDC - Etileno-Bis-Ditiocarbamato

ECD – Detector de Captura de Elétrons (do inglês Electron Capture Detection)

EI – Modo de ionização por impacto de elétrons (do inglês Electron Impact)

EU – União Européia (do inglês European Union)

EUA – Estados Unidos da América

FAO – Organização das Nações Unidas de Agricultura e Alimentos (do inglês

Food and Agriculture Organization of the United Nations)

FID – Detector por Ionização em Chama (do inglês Flame Ionization Detection)

GC – Cromatografia Gasosa (do inglês Gas Chromatography)

HCB – Hexaclorobenzeno

HCH – Hexaclorociclohexano

HDL – Lipoproteína de Alta Densidade (do inglês High Density Lipoprotein)

HPA – Hidrocarboneto Policíclico Aromático

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês High Performance

Liquid Chromatography)

HS – do inglês Headspace

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

IC – Intervalo de Confiança

ICH – Protocolo Harmonizado Internacional

17

IDA – Índice Diário Aceitável.

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade

Industrial

IT – Aprisionamento de Íons (do inglês Ion-Trap)

LC – Cromatografia Líquida (do inglês Liquid Chromatography)

LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade (do inglês Low Density Lipoprotein)

LLE – Extração Líquido-Líquido (do inglês Liquid – Liquid Extraction)

LMR – Limite Máximo de Resíduos

LOD – Limite de Detecção

LOQ – Limite de Quantificação

MAE – Extração Assistida por Microondas (do inglês Microwave Extraction)

MS – Espectrometria de Massas (do inglês Mass Spectrometry)

MS-MS – Espectrometria de massas (do inglês Tandem Mass Spectrometry)

MSPD – Dispersão da Matriz em Fase Sólida (do inglês Matrix Solid-Phase

Dispersion)

NCI – Ionização química no modo negativo (do inglês Negative Chemical

Ionization)

NPD – Detector de Nitrogênio e Fósforo (do inglês Nitrogen Phosphorus

Detector)

PA – Poliacrilato

PCI – Ionização química no modo positivo (do inglês Positive Chemical

ionization)

PDMS - Polidimetilsiloxano

PID - Detector de Fotoionização – (do inglês Phothometric Ionization Detector)

PLE – Extração com Líquido Pressurizado (do inglês Pressurized Liquid

Extraction)

r – Coeficiente de Correlação

RP – Fase Reversa (do inglês Reversed Phase)

RSD – Desvio Padrão Relativo

s – Estimativa do Desvio Padrão Absoluto

SBSE – Extração com Barras de Agitação (do inglês Stir Bar Sorptive

Extraction)

SFC – Cromatografia por Fluido Supercrítico (do inglês Supercritical Fluid

Chromatography)

18

SFE – Extração por Fluido Supercrítico (do inglês Supercritical Fluid Extraction)

SIM – Monitoramento de Íons Selecionados (do inglês Selected Íon Monitoring)

SPE – Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction)

SPME – Microextração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Microextraction)

THF – Tetrahidrofurano

TOF – Tempo de Vôo (do inglês Time-Of-Fly)

USA – do inglês United States of America

USEPA – Agência Americana de Proteção Ambiental (do inglês United States

Environmental Agency)

UV – Ultravioleta

19

RESUMO

A fitoterapia constitui em um tipo de método terapêutico. As plantas medicinais são as principais

fontes de suporte para este tipo de atividade e estão sujeitas à ação de pragas como insetos e

doenças que podem comprometer ou inviabilizar seu desenvolvimento ocasionando perdas

econômicas. Pesticidas de diferentes grupos químicos são aplicados para controlar ação destas

pragas. Todavia, este tratamento pode ocasionar a contaminação por resíduos de pesticidas. Em

vista disto, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de método baseado na extração por

dispersão da matriz em fase sólida e pelas técnicas de cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas e cromatografia liquida de alta eficiência com detector UV-Vis com arranjo

de fotodiodos para determinar resíduos dos pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina,

tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia. O método por dispersão da matriz em

fase sólida foi desenvolvido, testando-se diferentes tipos e quantidades de sorventes, alumina,

Florisil, sílica e C18, e solventes orgânicos (20 a 40 mL) como ciclohexano, diclorometano, acetato de

etila, clorofórmio e n-hexano em diferentes proporções (1:1, 1:2 e 1:3, v/v). As melhores

recuperações para os pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em

análises por GC/MS, foram obtidas com o sistema alumina/C18, utilizando um volume de 30mL de

mistura de solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) com valores médios de recuperação

variando de 62 a 129% e coeficientes de variação na faixa de 5,24 a 16,4% para os níveis de

concentração de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g. Foram realizadas também análises pela técnica de HPLC-UV,

utilizando-se a mesma fase sólida para extração por MSPD, alumina/C18, e sistema de solventes

ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com valores de recuperação na faixa de 55 a 112% e

coeficientes de variação entre 0,6 a 15,1% para os pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e

bifentrina para os níveis de concentração de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g. Os limites de detecção e

quantificação para análises no GC/MS ficaram na faixa de 0,02 a 0,07 mg/kg e 0,03 a 0,1 mg/kg

respectivamente e os limites de detecção e quantificação em análises por HPLC-UV ficaram na faixa

de 0,03 a 0,08 mg/kg e 0,03 a 0,4 mg/kg, respectivamente.

Palavras-chave: pesticidas; MSPD; GC/MS; HPLC-UV; Cordia salicifolia, planta medicinal.

20

ABSTRACT

The phytotherapy is usually regarded as a type of alternative medicine. The medicinal herbs

comprises the herbal material used as main source of this approach, which can be susceptible to the

action of pests and diseases.. Pesticides are widely used in agricultural crops because of their

susceptibility to disease attacks. Therefore, it has been a growing interest in the detection and

quantification of pesticide residues in agricultural produce intended of human consumption. A simple

and effective extraction method based on matrix solid-phase dispersion (MSPD) was developed to

determine acephate, chlorpropham, pyrimicarb, bifenthrin, tetradifon, and phosalone in leaves of the

medicinal plant Cordia salicifolia using gas chromatography-mass spectrometry with selected ion

monitoring (GC/MS, SIM) and high performance liquid chromatography with diode array detector

(HPLC-UV). Different parameters of the method were evaluated, such as type of solid phase (C18,

alumina, silica-gel and Florisil), the amount of solid phase and eluent (dichloromethane, ethyl acetate,

chloroform, and cyclohexane). The best results were obtained using 0.5 g of herb sample, 0.5 g of

neutral alumina as dispersant sorbent, 1,0 g of C18 as clean-up sorbent and

cyclohexane:dichloromethane (1:3, v/v) as eluting solvent. The method was validated using herb

samples fortified with pesticides at different concentration levels (0.3, 0.5 and 1.0 mg/kg). Average

recoveries (7 replicates) ranged from 62 to 129%, with relative standard deviations between 5,24 and

16,4%, respectively in analysis of GC/MS and recoveries (5 replicates) ranged 55 to 112%, with

relative standard deviations between 0.6 and 15.1% in analysis of HPLC-UV. Detection and

quantification limits for herb ranged from 0.02 to 0.07 mg/kg and from 0.03 to 0.1 mg/kg, respectively

in analysis with GC/MS and analysis with HPLC-UV detection and quantification limits for herb ranged

from 0.03 to 0.08 mg/kg and from 0.03 to 0.4 mg/kg, respectively.

Keywords: medicinal plant; porangaba; Cordia salicifolia; pesticides; MSPD; GC/MS; HPLC-UV.

21

1. INTRODUÇÃO

Fitoterapia é a utilização de vegetais em preparações farmacêuticas (extratos,

pomadas, tinturas e cápsulas) para auxílio no tratamento de doenças, manutenção e

recuperação da saúde. O termo fitoterapia vem do idioma grego e quer dizer

"tratamento" (therapeia) "vegetal" (phyto). O uso de plantas medicinais na fitoterapia

vai desde as formas mais empíricas e tradicionais até as científicas. Dados literários

sobre a utilização de vegetais para a cura de doenças ou outros males são

encontrados desde 50.000 anos atrás. Intuitivamente o homem procurou descobrir

soluções para as suas necessidades básicas como nutrição, reprodução e proteção

(DEVIENNE, 2004).

Os egípcios (1.500 a.C) relataram a utilização de azeite, figo, cebola, alho,

funcho, açafrão, hortelã e pimenta como culturas utilizadas medicinalmente. O

“Papyrus Erbers”, coleção egípcia contendo 811 prescrições, menciona 700 drogas

vegetais, minerais e animais, incluindo salgueiro, acácia e sedativos extraídos de

Ephedra (TAVARES, 1996; TEIXEIRA, 1994). Em toda história, registra-se que os

medicamentos surgiram da simples observação. O conhecimento alquímico foi

utilizado por diversos povos e nações, especialmente pelos chineses, indianos e

árabes, sendo assimilados a partir do século XX pelo continente europeu (DI STASI,

1996). Num estágio mais avançado do uso das plantas medicinais, foram criadas

teorias e observações que contribuíram para a fitoterapia atual (TAVARES, 1996).

Na primeira metade do século XX, os produtos de origem vegetal foram

esquecidos, temporariamente, em decorrência do grande sucesso de compostos

químicos obtidos de microorganismos, os quais eram capazes de curar infecções

graves (VILLEGAS, 1998).

22

Alguns fatos proporcionaram o renascimento do interesse das plantas medicinais

como menor tempo e menor custo no desenvolvimento de novos medicamentos à

base destes produtos naturais (FERREIRA, 2001). As pesquisas científicas têm

como base a comprovação da identidade botânica, composição química de drogas

vegetais, obtenção, identificação e análise dos princípios ativos, bem como a

determinação da ação farmacológica e propriedade tóxicas. Vários são os princípios

ativos químicos obtidos exclusivamente de matéria-prima vegetal que representam

não apenas um novo grupo de substâncias, mas a descoberta de uma intervenção

terapêutica no mercado (FERREIRA, 2001).

Nas três últimas décadas, as pesquisas com plantas geraram diversos princípios

químicos, com atividades farmacológicas importantes como a vimblastina e

vincristina, ambas isoladas da vinca (Cantharanthus roseus), o lapachol e a beta-

lapachona, obtidos da Tabebuia heptaphylla, os derivados da camptotecina obtidos

de Camptotheca acuminata, entre outros (SANTOS 1999).

Atualmente as descobertas de várias substâncias de origem vegetal, indicadas

pelo uso popular, tiveram suas atividades farmacológicas cientificamente

consolidadas (MIGUEL, 1999), contudo é comprovado que apenas 30% dos

medicamentos comercializados são originados direta ou indiretamente de plantas

medicinais (DEVIENNE, 2004). A Organização Mundial da Saúde estima que

aproximadamente 80% da população mundial utiliza de algum modo plantas

medicinais como medicamentos. Das 365.000 espécies já catalogadas, 25.000 são

utilizadas em preparações da medicina tradicional. Estes valores indicam a

importância quanto ao estudo das plantas medicinais, de modo a revelar sua

eficácia, segurança e qualidade, e assegurar melhor aceitação destas pela classe

médica e, conseqüentemente, pela população em geral.

Os parâmetros de qualidade para fins farmacêuticos são, em princípio,

estabelecidos pelas Farmacopéias e Códigos Oficiais. Muito contrastante é a

biodiversidade da flora brasileira ao lado do atraso de nossa Farmacopéia no que se

refere às monografias de plantas medicinais. A primeira edição da Farmacopéia

Brasileira publicada em 1929 continha 257 monografias de plantas medicinais.

23

No período de 1980 a 1990 houve um grande aumento no consumo de plantas

medicinais, em virtude do modismo naturalista existente na época, e nos anos

seguintes até os dias atuais, formaram-se várias comissões técnicas pelo Ministério

da Saúde, com o objetivo de regulamentar o registro, a produção e a

comercialização de plantas medicinais, em um mercado de características amplas e

de baixa qualidade.

A identificação de novas fontes naturais de compostos químicos visando o

desenvolvimento de fitofármacos pode beneficiar a economia de países em

desenvolvimento, além de possibilitar a autonomia no gerenciamento de suas

políticas de saúde. Neste contexto, produtos naturais obtidos de plantas

demonstram ter um valor incalculável para a sociedade contribuindo

significativamente para a economia e para a melhoria na qualidade de vida da

população (YUNES, 2001).

As plantas medicinais assim como outras plantas nativas estão sujeitas ao

ataques de pragas como insetos, ácaros e fungos, o que inviabiliza a

comercialização destes produtos, ocasionando em perdas econômicas, sendo

necessário efetuar processos mitigadores como a utilização de pesticidas para

controlar a ação das pragas (GRISOLIA, 2005).

Pesticidas de diferentes grupos químicos e classes toxicológicas são utilizados

para controlar o ataque das pragas às culturas, todavia o tratamento com pesticidas,

deixa resíduos no ambiente ou no próprio produto quando utilizado de maneira

excessiva, desrespeitando os limites máximos de resíduos estabelecidos pelas

legislações, comprometendo a saúde dos consumidores. Vários países têm

restringindo a utilização destas substâncias tóxicas e estabelecido diretrizes legais

para calcular suas concentrações através da implementação do limite máximo de

resíduos para cada tipo de cultura. No Brasil estes níveis são estabelecidos pela

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2008).

Além da eventual presença de pesticidas, a literatura relata que produtos

fitoterápicos utilizados como base da medicina airvédica, baseada em um sistema

tradicional da Índia, comercializados pela internet, contém níveis elevados de metais

como chumbo, mercúrio e arsênio, e que segundo dados de pesquisas já feitas nos

Estados Unidos, os níveis destes metais excedem os padrões legais aceitáveis e

podem provocar intoxicações (RAI, 2008).

24

Isto posto faz-se necessário dispor de métodos analíticos para garantir a

qualidade das plantas medicinais e de fitoterápicos comercializados, bem como

estabelecer limites máximos permitidos e intervalos de ingestão diária, visto a

crescente demanda da população não só do Brasil como também mundial por

medicamentos de baixo custo (CRUZ, 1995).

Um método apropriado para análise de resíduos de pesticidas, precisa

apresentar sensibilidade, seletividade, exatidão e precisão e ser de baixo custo,

aplicável para uma variedade de pesticidas em matrizes diversas e capazes de

fornecer informações estruturais necessárias e corretas sobre o princípio ativo

(MICHEL, 2004).

O método de dispersão da matriz em fase sólida (MSPD, do inglês Matrix Solid-

Phase Dispersion) é uma técnica de extração conveniente uma vez que proporciona

efetuar etapas de rompimento da estrutura sólida original da matriz,

homogeneização, extração e purificação da amostra de maneira simultânea,

possibilitando a posterior análise do extrato pré-concentrado utilizando mínima

quantidade de solventes orgânicos e pouca quantidade de amostra (KRISTENSON,

2006). O extrato final pode ser analisado por cromatografia gasosa com detector

espectrofotométrico de massas, cromatografia líquida de alta eficiência e

eletroforese capilar (LIANG, 2004).

O presente trabalho propõe desenvolver um método analítico simples e eficaz

para determinação de resíduos de pesticidas acefato, chlorpropham, pirimicarbe,

bifentrina, tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia, utilizando a

dispersão da matriz em fase sólida e as técnicas de cromatografia gasosa acoplada

à espectrometria de massas e cromatografia líquida de alta eficiência com detector

no UV-Vis com arranjo de fotodiodos.

25

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Desenvolver um método analítico pela utilização de dispersão da matriz em fase

sólida e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e

cromatografia liquida de alta eficiência com detector UV com arranjo de fotodiodos

para determinação de resíduos de pesticidas de diferentes classes químicas em

amostras de planta medicinal Cordia salicifolia.

2.2 – Objetivos Específicos

� Selecionar pesticidas que podem estar presentes direta ou diretamente em

Cordia salicifolia.

� Desenvolver um método analítico rápido, seletivo e sensível para

determinação de resíduos dos pesticidas acefato, bifentrina, chlorpropham, fosalona,

pirimicarbe e tetradifona na planta medicinal Cordia salicifolia utilizando a técnica por

dispersão da matriz em fase sólida.

� Otimizar as condições cromatográficas de análise dos pesticidas selecionados

por GC/MS/SIM e HPLC-UV.

� Validar o método desenvolvido por MSPD, GC/MS e HPLC-UV.

� Analisar amostras de Cordia salicifolia comercializadas no Mercado Municipal

da cidade de Aracaju-Sergipe.

26

3. JUSTIFICATIVA

A crescente demanda da população mundial por plantas medicinais tem

aumentado continuamente e com isso o maior interesse da população por produtos

fitoterápicos obtidos diretamente da natureza (CALIXTO, 2000). As plantas medicinais

que sustentam este tipo de prática popular são produtos agrícolas que assim como os

alimentos estão sujeitos ao ataque de diversos tipos de pragas como fungos, ervas

daninhas, insetos ou ácaros, sendo, portanto necessário o uso de pesticidas como

necessidade de preservação destas culturas. Com esta finalidade, o uso de

praguicidas na agricultura é permitido por órgãos governamentais, após o registro

adequado de suas formulações para as diversas culturas as quais pode ser utilizado

(TANG, 2008).

O monitoramento da quantidade de pesticidas presentes em culturas agrícolas

é de grande importância, pois permite avaliar a qualidade destes produtos,

proporcionando a verificação de tendências no aumento do uso. É necessário,

portanto o desenvolvimento de métodos analíticos que sejam confiáveis, de baixo

custo, com curto tempo de análise e que seja de fácil difusão e aplicação em outros

laboratórios.

A técnica de dispersão da matriz em fase sólida é dentre outros aspectos

bastante simples de ser aplicada, apesentando algumas vantagens frente aos outros

métodos de extração como a LLE e SPE, como a menor utilização de solventes

orgânicos, sendo aplicada para matrizes sólidas ou semi-sólidas (LANÇAS, 2004).

A cromatografia pode ser utilizada como técnica por sua aplicação em diversos

tipos de análises químicas na separação de uma boa parte dos constituintes

presentes na natureza. As técnicas de cromatografia gasosa e cromatografia líquida

quando acopladas com detectores adequados têm sido bastante utilizadas na

separação e na análise de poluentes orgânicos, como pesticidas, em matrizes

ambientais e alimentares, pelo alto poder de identificação e quantificação destas

substâncias químicas (NETO, 2003).

27

A planta medicinal Cordia salicifolia é bastante popular pela sua propriedade

cardiotônica e conhecida também por ser antidiurético e aplicada como medicamento

alternativo para redução de peso corporal, sendo comercializada em farmácias

populares como fitoterápico de baixo custo. Por ser uma cultura agrícola é susceptível

principalmente ao ataque de insetos, ervas daninhas, ácaros ou fungos que podem vir

a inviabilizar sua comercialização ou uso caseiro por parte da população (FAO, 2008).

A porangaba é cultivada próximo a culturas de laranja no município de Boquim/

SE, e pode estar sendo indiretamente contaminada por pesticidas aplicados na

laranja. Por isso se faz necessário dispor de um método analítico simples e eficiente

para determinar resíduos de pesticidas na planta medicinal porangaba a fim de

garantir que o uso desta planta medicinal não resulte em problemas de intoxicação

para os consumidores deste produto.

28

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

4.1 – Pesticidas

As substâncias químicas estão presentes em nossa sociedade, nos mais

diferentes contextos do dia-a-dia, como nos medicamentos, alimentos, plásticos,

detergentes, tintas, cosméticos, roupas, pesticidas, produtos de limpeza e

desinfecção, em ambientes industriais e rurais, além da poluição típica de grandes

centros urbanos.

No que se refere às áreas agricultáveis, um grande desafio para a humanidade é

a produção de alimentos para uma população em plena expansão. Os setores rurais

estão disputando espaço com a expansão das áreas de urbanização e

industrialização. Nesse contexto, a busca de uma maior produtividade agrícola por

hectare, o emprego de pesticidas tem apresentado papel preponderante. Atualmente

a exploração comercial e econômica de qualquer cultura agrícola faz uso de

pesticidas, exceto a agricultura orgânica (GRISOLIA, 2002).

Literalmente o termo praguicida tem o significado de produto com a capacidade

de destruir pragas. A denominação pesticida, muito difundida entre os povos de

língua portuguesa e usual naqueles de língua inglesa, tem o significado de algo,

com poder de destruir pestes. O termo defensivo tem o significado de algo que serve

para defender ou resistir ao ataque de um inimigo qualquer. Um outro termo também

em uso é agrotóxico que tem o sentido geral de incluir todos os compostos químicos

utilizados na agricultura (FAO, 2008).

Com o desenvolvimento das monoculturas e o considerável aumento da

produção agrícola mundial, intensificou-se a preocupação em relação ao controle de

qualidade dos produtos agrícolas. O uso destes produtos aumentou

consideravelmente mesmo na pecuária, tornando-se necessário o monitoramento de

resíduos destas substâncias que eventualmente estariam no meio ambiente e

conseqüentemente nos produtos cultivados (SANCHEZ, 2006).

29

Os sistemas de produção intensivos elevam a necessidade de uso de pesticidas,

os quais aumentam as concentrações residuais destes princípios ativos ou de seus

metabólitos, que por sua vez podem comprometer a qualidade do ecossistema. A

deriva de pesticidas ocorrida durante o processo de aplicação dos produtos diminui

a eficiência da aplicação, além de comprometer a qualidade da flora e fauna nativas

de uma determinada região, assim como a água local, ou de outras regiões, bem

como na saúde do trabalhador rural e de comunidades vizinhas.

O pesticida aplicado no campo para combater as pragas tem um tempo de meia-

vida para se degradar ou pode ser metabolizado por enzimas do próprio produto e

ser transformado em um metabólito com possibilidade de ser ainda mais tóxico que

o composto original (VIANA, 1996).

Quando o produtor não respeita o prazo de carência de cada princípio ativo ou

metabólito e colhe o produto antes desse prazo, este chega ao consumidor

contaminado. Por isso é necessário se conhecer o comportamento físico-químico de

um pesticida e de seus metabólitos ou produtos de degradação formados para se

prever sua atuação no meio ambiente e estabelecer limites máximos aceitáveis

destes resíduos assim como seu intervalo de segurança e o índice diário aceitável

(GRISOLIA, 2005).

Os pesticidas podem ser classificados de acordo com a praga que eles

combatem:

Acaricidas – para controle de ácaros.

Bactericidas – para controle de bactérias.

Fungicidas – para controle de fungos.

Herbicidas – para controle de ervas daninhas.

Inseticidas – para controle de insetos.

Nematicidas – para controle de nematelmintos.

Rodenticidas – para controle de roedores.

Vermífugos – para controle de vermes.

30

E também podem ser classificados quimicamente como:

Organo-sintéticos : Carbamatos (nitrogenados), clorados, fosforados e

clorofosforados

Inorgânicos : À base de arsênio, tálio, bário, selênio, nitrogênio, fósforo, cádmio,

ferro, chumbo, cobre, mercúrio e zinco.

Botânicos : À base de nicotina. piretrina, sabadina e rotenona.

De acordo com parâmetros como mobilidade e persistência, toxicidade aguda e

crônica realizados com organismos não-alvo (peixe, abelhas, algas, etc.), os

pesticidas são classificados quanto à periculosidade ambiental em classes que

variam de I a IV, de produtos impeditivos de obtenção de registro, produtos

altamente perigosos ao meio ambiente (Classe I), e produtos pouco perigosos ao

meio ambiente (Classe IV). Observando-se a exposição humana a estes agentes, a

avaliação dos pesticidas em função dos efeitos à saúde, resulta em diferentes

categorias toxicológicas de acordo com a Tabela 1. Esta classificação obedece aos

resultados de testes realizados em laboratório que tentam estabelecer a dose letal

(DL), do pesticida em 50% dos animais utilizados naquela concentração.

Tabela 1 . Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde

humana segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2008.

Classificação

Toxicológica

Toxicidade DL 50 (mg/kg) Faixa colorida

I Extremamente

tóxico

≤ 5 Vermelha

II Altamente tóxico 5 a 50 Amarela

III Medianamente

tóxico

50 a 500 Azul

IV Pouco tóxico 5.000 Verde

- Muito pouco tóxico ≥ 5.000 -

31

Os pesticidas são classificados também quanto à ação, a forma de atuação e

a origem. Quanto à forma de atuação os agrotóxicos podem ser sistêmicos ou não

sistêmicos. Os não sistêmicos têm ação de contato (via dérmica), penetração,

ingestão (via oral) e fumigante (via respiratória). Os agrotóxicos sistêmicos surgiram

como um aperfeiçoamento na seletividade do combate à praga, com a intenção de

não matar os insetos não nocivos. É transportado pela seiva do vegetal em

quantidade letal para o inseto, sem prejudicar a planta (PINHEIRO, 2004).

A Tabela 2 mostra a classificação dos pesticidas selecionados para o estudo

quanto ao seu modo de ação, forma de atuação e classe toxicológica.

O comportamento de um pesticida pode ser estimado pelas suas

características físico-químicas e pelos seus metábolitos ou produtos de degradação

formados. A Tabela 3 mostra algumas propriedades físico-químicas dos pesticidas

selecionados para o estudo. A Tabela relaciona a solubilidade dos pesticidas

estudados em alguns solventes orgânicos.

Tabela 2 . Características gerais dos pesticidas selecionados para estudo.

FONTE: ANVISA, 2008.

Pesticidas Modo de ação Forma de

atuação

Classe

toxicológica

Fórmula

bruta

acefato inseticida e

acaricida

sistêmico moderadamente

tóxico

C4H10NO3PS

bifentrina inseticida sistêmico altamente tóxico C23H22ClF3O2

clorprofam fungicida sistêmico altamente tóxico C10H12ClNO2

fosalona inseticida e

acaricida

sistêmico altamente tóxico C12H15ClNO4

PS2

pirimicarbe acaricida sistêmico pouco tóxico C11H18N4O2

tetradifona Inseticida

acaricida

sistêmico altamente tóxico C12H6Cl4O2S

32

Tabela 3. Propriedades físico-químicas dos pesticidas selecionados para estudo.

Pesticidas Ponto de Ebulição (ºC)

Pressão de Vapor (Pa),

20-25ºC

*Log K ow Tempo de meia vida (t 1/2), em dias

**Solubilidade de 20-25ºC

(g/L) acefato 153-154 2,3x10-4 -0,89 3 790

bifentrina 150 2,4x10-5 >6 30 <1,0 x 10-7

clorprofam 78,6 1,3x10-3 - 26 0,089

fosalona 117 <6,7x10-5 3,3 108 0,0017

pirimicarbe 164,7-167,7 0,97x10-3 1,7 21 3,0

tetradifona 156-157 0,91x10-3 - 31 3,0 x 10-5

FONTE: BARCELÓ, 1997.

• *Coeficiente de partição octanol:água.

• **Solubilidade em água.

Tabela 4. Solubilidade dos Pesticidas em Solventes Orgânicos

Solubilidade (g/L)

Pesticidas Acetato

de etila

Acetona Acetonitrila Clorofórmio Diclorometano Hexano

acefato 35 151 - - solúvel 0,1

bifentrina - solúvel solúvel solúvel solúvel solúvel

clorprofam - - solúvel solúvel solúvel solúvel

fosalona solúvel solúvel solúvel solúvel solúvel -

pirimicarbe - 4,0 - 3,3 solúvel -

tetradifona - 82 solúvel 225 solúvel -

Fonte: BARCELÓ, 1997.

33

4.1.1. Classes Químicas dos Pesticidas Selecionados .

Os pesticidas em estudo têm seu limite máximo de resíduos relacionado à

aplicação em culturas agrícolas diversas susceptíveis ao ataque de pragas como

insetos, fungos, ácaros e ervas daninhas. Os pesticidas selecionados têm forte

atuação na preservação da produção agrícola como plantas medicinais, com classes

químicas distintas classificadas como piretróides, organofosforados, organoclorados

e carbamatos (BARCELÓ, 1997).

Piretróides: Substâncias que foram sintetizadas a partir do ácido crisantêmico,

com a finalidade de obtenção de inseticidas potentes com menor grau de toxicidade

para mamíferos, que ainda apresente dentre outras vantagens, baixo custo e

fabricação e de venda e maior facilidade e uso. Um piretróide selecionado para

estudo é a bifentrina que atua como acaricida e inseticida muito aplicado em cultura

de rosas e plantas ornamentais, susceptíveis ao ataque destas pragas. A bifentrina

tem sido muito empregada, devido a sua eficácia no controle dos insetos Sitophilus

zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), e Tribolium castaneum

(Coleoptera: Tenebrionidae) em cultura de grãos. (SILVEIRA, 2006).

Organofosforados: Os pesticidas organofosforados são classificados nas

seguintes classes fundamentais: fosfato, fosforotionato, fosforoditionato,

fosforotiolato, fosforoamidato e pirofosfato. Os pesticidas organofosforados

constituem uma classe importante de inseticidas, acaricidas, nematicidas e

fungicidas, sendo atualmente os mais utilizados na agricultura. Embora estes

compostos sejam degradados em água, existe a possibilidade de restarem resíduos

e subprodutos em níveis relativamente nocivos ao consumo humano, além da

possibilidade de contaminação aguda, pontual, com altas concentrações (NETO,

2003).

Os pesticidas organofosforados por serem hidrossolúveis, não se acumulam no

tecido adiposo e consequentemente, são degradados mais rapidamente em tecidos

vivos. Possuem a vantagem de serem eliminados mais rapidamente em mamíferos,

quando comparados com os pesticidas organoclorados (DÓREA, 1999). Os

organofosforados são conhecidos por promover a inibição da enzima

acetilcolinesterase, responsável pela degradação do neurotransmissor acetilcolina

(FILHO, 2005).

34

Dentre os pesticidas organofosforados, os selecionados para estudo no presente

trabalho foram a fosalona e o acefato. A fosalona vem sendo freqüentemente

utilizada em culturas de jardinagem amadora e em culturas caseiras, devido a sua

moderada toxicidade e forte atuação como substância inseticida e acaricida (LIAPIS,

2003). O acefato é comumente utilizado como acaricida principalmente em culturas

de couve-flor, cravo, brócolis, fumo, crisântemo, melão, pimentão (ANVISA, 2008) e

atualmente tem sido descoberta a sua forte atuação contra a bactéria Paramecium

caudatum, um ácaro que causa transtornos na plantação de diversas culturas

agrícolas (VENKATESWARA, 2006).

Carbamatos: são compostos orgânicos derivados do ácido carbâmico. São

menos tóxicos que os fosforados e mais tóxicos que os clorados (contaminação

aguda). Degrada-se relativamente rápido e não se acumulam em tecidos

gordurosos. Possuem ação mais curta que os organofosforados, com relação à

função reguladora da acetilcolinesterase (enzima que torna possível a transmissão

de impulsos nervosos no organismo); todavia, vários produtos deste grupo químico

foram banidos em outros países devido aos seus efeitos cancerígenos.

Dentre os pesticidas da classe química dos carbamatos selecionados para

estudo tem-se o pirimicarbe e o clorprofam. O pirimicarbe é bastante utilizado nas

plantações de alface, tomate, berinjela, batatas ou diretamente em culturas de

plantas medicinais como camomila, hortelã e boldo de acordo com dados recentes

da ANVISA, 2008. Os limites máximos de resíduos para o pirimicarbe se referem à

soma de outros metabólitos, o pirimicarbe dietilico e N-formil (metilamina). O

pirimicarbe é freqüentemente empregado como acaricida no combate ao Coccinella

undecimpunctata que ocorre em culturas de batatas. O clorprofan é geralmente

utilizado em culturas que são frequentemente atacadas por ervas daninhas (NETO,

2005), e sendo um carbamato possui considerável degradação em meio aquoso.

35

Clorodifenilsulfonas: Substâncias que fazem parte desse grupo, basicamente

possuem a mesma característica dos compostos organoclorados, pela presença do

cloro ligado a um ou mais anéis aromáticos na estrutura química da substância.

Organoclorados são classificados como pesticidas com alto grau de persistência

ambiental, pela facilidade de acumulação em meio gorduroso como o tecido

adiposo, ou em sedimentos de mares e rios. Pesticidas organoclorados são vistos

sob o aspecto da toxicidade crônica pelo fato de causarem efeitos patológicos em

longo prazo. Os pesticidas organoclorados atuam no sistema nervoso central e

periférico, interferindo nas transmissões dos impulsos nervosos. O famoso DDT

(diclorodifeniltricloroetano) foi o primeiro inseticida sintetizado logo após a segunda

guerra mundial com o objetivo de combater insetos que transmitiam a malária e o

tifo. A tetradifona, que faz parte do grupo químico das clorodifenilsulfonas, é

comumente utilizada no controle de ácaros em cultura de frutas cítricas, feijão,

berinjela, mamão e pimentão (ANVISA, 2008).

A Tabela 5 relaciona as estruturas químicas dos pesticidas selecionados para

estudo.

36

Tabela 5 . Estrutura química dos pesticidas selecionados para estudo.

Pesticidas Estrutura química

acefato (O,S-dimethyl acetylphosphoramidothioate)

clorprofam (1-methylethyl

(3-chlorocarphenyl)carbamate

pirimicarbe (2-

dimethylamino-5,6-dimethylpyrimidin-4-yl dimethylcarbamate)

bifentrina (2-

methylbiphenyl-3-ylmethyl (Z)-(1RS,3RS)-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropane

carboxylate)

tetradifona (4-chlorophenyl

2,4,5-trichlorophenyl sulfone)

fosalona (S-6-chloro-2,3-dihydro-2-oxobenzoxazol-3-

ylmethyl O,O-diethylphosphorodithioate

FONTE: ANVISA, 2008.

37

4.2 – Plantas Medicinais

As plantas são recursos naturais de fundamental importância tanto para o

homem quanto para outros seres vivos. A vida seria inexistente sem os vegetais,

pois além de sua grande importância nos processos vitais de transformação de gás

carbônico em oxigênio, em conjunto representam a maior fonte da biomassa de

carbono e energia para os seres vivos, desde os organismos unicelulares até o mais

complexo mamífero (GRISOLIA, 2007).

Além dessa importância outra grande potencialidade refere-se à capacidade que

as plantas possuem em produzir imensa variedade de moléculas orgânicas de

grande complexidade estrutural, muitas destas substâncias utilizadas como

mecanismo de defesa das próprias plantas contra agentes patogênicos, herbívoros

ou agressores abióticos como os raios ultravioletas entre outros (CHAN, 2002).

Dentre as várias moléculas que servem como mecanismo de defesa das plantas,

várias espécies foram utilizadas pelo homem em situações adversas (patogenias,

mutações, etc.) de grande interesse não apenas agrícola como também terapêutico,

que levou cientistas realizarem um estudo mais detalhado dessas plantas medicinais

e de suas respectivas substâncias.

Nos tempos atuais são numerosos os trabalhos realizados com diversas plantas

medicinais nativas, destacando-se os trabalhos da química de produtos naturais,

estudos biotecnológicos de culturas de tecidos vegetais, biologia molecular e mais

recentemente os de microorganismos endofíticos (LU, 2003).

A utilização das plantas medicinais e a fitoterapia encontram-se em expansão em

todo o mundo, consistindo em um mercado bastante promissor (CALIXTO, 2000).

No Brasil a utilização das plantas medicinais vem sendo estimulada por diversos

fatores tais como a enorme variedade de espécies vegetais disponíveis, a grande

desinformação relacionada ao tema e o fraco desenvolvimento tecnológico desta

área no país (CARVALHO, 2008).

38

Produtos à base de plantas medicinais são comercializados no Brasil em

farmácias/drogarias, supermercados, ervanárias. Na maior parte das vezes o modo

de preparo de um medicamento à base de planta medicinal é de forma caseira

sendo a folha a parte mais utilizada (53%), seguida de toda a planta (13%), raízes

(11%), flores (7%), sementes (5%), cascas (5%), resinas (3%), frutos (2%) e bulbos

(1%) (SANTOS, 2007).

Na maior parte dos trabalhos com plantas medicinais o principal modo de

preparo dos remédios caseiros é na forma chá, sendo que a facilidade de preparo

de medicamentos caseiros está diretamente relacionada à facilidade de coleta e o

manuseio das plantas. Os quintais de residências são um exemplo típico desta

facilidade de obtenção das plantas medicinais, que se constitui em espaços ao redor

da unidade familiar, onde além de plantas medicinais, são cultivadas plantas

ornamentais ou frutíferas (SANTOS, 2008).

Para uma utilização segura de qualquer planta medicinal como medicamento é

necessário que ela seja padronizada, isto é, deve-se estabelecer a autenticidade da

droga vegetal e seu teor de princípios ativos dentro dos parâmetros que são

utilizados como critérios de qualidade (CARVALHO, 2008).

A planta medicinal em estudo é conhecida popularmente por porangaba de nome

científico Cordia salicifolia, também conhecida por cafezinho, café-de-bugre, café-

do-mato, chá-de-bugre, claraiba, louro-mole ou chá-de-frade. A Cordia salicifolia é

da família das boragináceas de nome botânico aceitável Cordia ecalyculata; é uma

árvore de copa alongada, de 8-12 cm de altura com tronco de 30-40 cm de diâmetro

nativa desde o nordeste ao sul do Brasil. Possui folhas simples de 8-14 cm de

comprimento, e flores pequenas, perfumadas de cor branca. Seus frutos têm a

forma de bagas de cor vermelha semelhantes ao café, por isso as denominações

populares (LORENZI, 2005).

39

A Cordia salicifolia foi primeiramente descoberta pela população indígena do

Brasil, e ainda é consumida em regiões tropicais deste país, da Argentina e Paraguai.

Seu uso no Brasil é considerável nas regiões de Minas Gerais, Goiás, Bahia e Acre,

onde a planta é bastante conhecida por sua propriedade diurética e cardiotônica

(MENGHINI, 2008).

A Cordia salicifolia é indicada terapeuticamente como tônico cardíaco, diurético e

redutor de apetite. Estudos recentes no Japão encontraram novos usos medicinais

para esta planta, no tratamento do vírus tipo I do Herpes, reduzindo em 99% dos

casos a penetração do vírus (HAYASHI, 1990).

Estudos ainda em andamento comprovam que doses maiores de extrato de óleo

de porangaba podem atuar contra células cancerosas e na minimização de gastrites e

úlceras gástricas, um problema que atinge mais de 50% da população mundial,

principalmente em nações em processos de desenvolvimento (MENGHINI, 2008). A

bactéria Helicobacter pylori, responsável por este tipo de gastrite ou úlcera,

específica, é contraída muitas vezes por falta de higiene adequada na manipulação de

alimentos para consumo.

Outro constituinte químico típico de plantas do gênero Cordia é o β-sitosterol. Este

composto sozinho ou em combinação com outros esteróis de plantas tem

demonstrado em estudos clínicos um efeito de reduzir os níveis de colesterol no

sangue. Ele age neste sentido de três formas. Primeiramente quando usado junto com

a comida, onde ele se associa às gorduras e age bloqueando a absorção do

colesterol pelo corpo (somente 5-10% de β-sitosterol agregado é absorvido). Este

efeito pode ajudar também em regimes de redução de peso e especialmente na

prevenção de doenças cardiovasculares (MENGHINI, 2008).

40

4.3 – Dispersão da Matriz em Fase Sólida

O preparo da amostra tem como principal objetivo isolar o(s) componente(s) de

interesse de outros compostos presentes na matriz os quais poderão interferir

posteriormente na determinação analítica. Muitas vezes esta etapa é também

denominada de extração, mas em muitos casos, não é necessária uma etapa de

extração para que o analito possa ser avaliado por uma técnica instrumental. Após o

isolamento dos compostos de interesse da matriz, pode ser necessária uma etapa

de limpeza do extrato, particularmente em se tratando de amostras complexas

(LANÇAS, 2008).

A limpeza da amostra é quase sempre empregada na análise de amostras

ambientais, fluidos biológicos, alimentos e similares, pois, devido a grande

quantidade de compostos presentes nestas matrizes, invariavelmente a técnica de

extração não será suficiente para gerar um extrato insento de contaminantes. Alguns

autores incluem a etapa de clean-up como uma forma de preparo de amostra, outros

não. Após a etapa de preparo da amostra propriamente dita, o extrato está pronto

para a análise instrumental (POOLE, 1995).

A extração é sem dúvida a etapa mais crítica e complexa no preparo da amostra.

Em muitos casos a extração pode ser combinada com a concentração dos analitos,

derivatização e outros procedimentos, em uma única etapa de preparo da amostra.

Existem várias técnicas de extração, dependendo do estado físico, químico e a

complexidade da matriz e dos compostos a serem extraídos sendo os principais a

extração líquido-líquido (LLE), extração em fase sólida (SPE), microextração em

fase sólida (SPME), extração em fluido supercrítico (SFE), extração contínua,

extração Soxhlet, extração com fluidos pressurizados (PLE), extração acelerada

com solventes (ASE), extração por microcroondas (MAE), extração sortiva em

barras de agitação (SBSE) e a dispersão da matriz em fase sólida (MSPD), entre

outras (LANÇAS, 2008).

41

A dispersão da matriz em fase sólida foi primeiramente introduzida pelo norte

americano Steven Barker em 1989 e surgiu a partir de modificações feitas na

extração em fase sólida com o objetivo de se fazer pré-concentração de analitos

diretamente sobre amostras sólidas ou semi-sólidas. A MSPD é usualmente

empregada com o propósito de isolar um ou mais analitos de uma matriz sólida ou

semi-sólida (BARKER, 2007). Um esquema da MSPD pode ser visto na Figura 2.

Figura 1. Esquema da dispersão da matriz em fase sólida.

42

A MSPD faz uso de fases estacionárias ou suportes sólidos como sílica, alumina,

Florisil, ou sílica modificada com modificadores orgânicos como C18, C8 amino,

ciano, entre outras a depender da natureza do analito. A matriz é dispersa e

homogeneizada sobre o suporte até a obtenção de uma massa uniforme, permitindo

uma interação forte entre o suporte sólido e os componentes da matriz (LOPEZ,

2008). O adsorvente serve como um abrasivo rompendo a estrutura original da

amostra, proporcionando um novo grau de interação dos analitos com o suporte

sólido facilitando no isolamento e no processo de extração. O adsorvente exerce um

papel fundamental no processo de extração. No entanto é difícil se obter um

adsorvente que seja eficiente na extração de um conjunto de substâncias

pertencentes a funções químicas diferentes e que apresentem os mesmos tipos de

interação com este sorvente (LANÇAS, 2004).

Na prática, o processo de MSPD pode ser dividido em duas etapas, sendo que a

primeira consiste no preparo do cartucho contendo a amostra e a segunda na

eluição dos analitos de interesse. A fase sólida é pesada numa balança adequada e

transferida para um recipiente adequado para posterior trituração. A amostra então é

adicionada à fase sólida e então ambos são triturados e homogeneizados até a

formação de uma pasta uniforme e homogênea por um tempo de aproximadamente

30 a 60 segundos tipicamente. Este sistema irá conter a amostra distribuída

uniformemente sobre a superfície da fase sólida. A amostra é então colocada em um

cartucho. Em seguida é adicionado o solvente e procede-se a eluição com auxílio de

pequena pressão para diminuição do tempo de extração. O extrato obtido poderá

ser analisado diretamente caso já esteja na forma, pureza e concentração

adequados, ou sofrer outras operações como centrifugação, filtração, derivatização,

concentração, dependendo da técnica analítica empregada (BARKER, 2007).

Várias aplicações da dispersão da matriz em fase sólida podem ser encontradas

na literatura ilustrando o crescimento do interesse pela técnica. Uma das grandes

aplicações no momento é como uma das etapas importantes em um enfoque para

análise de multirresíduos de pesticidas em alimentos denominado QUECHERS

(“Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe”, ou seja, Rápido, Fácil, Barato,

Efetivo. Robusto e Seguro) (GONZÁLEZ, 2008).

43

Dentre os suportes sólidos comumente utilizados em processos de extração

por dispersão da matriz fase sólida pode-se citar:

Sílica (SiO2)n-OH: É um polímero inorgânico usado diretamente como

sorvente e para preparação de uma importante família de sorventes conhecidos

como sílicas ligadas fisicamente. É o sorvente mais utilizado para propósitos gerais.

Possui superfície ligeiramente ácida que facilita a retenção dos compostos básicos.

Facilmente absorve água pela formação de ligação de hidrogênio com grupos

silanóis (LANÇAS, 2004).

Alumina (Al2O3)n: Depois da sílica, é o adsorvente mais utilizado. Possui

caráter anfótero Tem característica alcalina, embora possa também ser preparada

para apresentar características neutra ou ácida. É geralmente empregada na

separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com

características ácida, neutra ou alcalina, é bastante útil na separação de substâncias

que apresentam variações dessas características (COLLINS, 2006).

Florisil [Mg.Al(SiO4)n] : É o sorvente mais polar e deve ser utilizado com

reservas quando se analisa compostos polares, uma vez que poderá provocar

adsorção irreversível em sua superfície e o analito de interesse não ser removido

com os eluentes comumente empregados nesta técnica. É muito utilizado na

extração de pesticidas (LANÇAS, 2004).

Octadecilsilano (C18): Possui caráter apolar. A característica lipofílica do C18

facilita o rompimento, dispersão e retenção de espécies lipofílicas (KRISTENSON,

2006).

Os fatores que afetam na MSPD são: a natureza do suporte sólido como

tamanho do poro com ou sem end-caping, natureza da fase ligada ao suporte (fase

normal, fase reversa, e com ou sem pré-condicionamento da fase), a natureza da

amostra (conteúdo de água, açúcar), modificações na matriz (ajustes no pH), e a

natureza ou a ordem dos solventes de eluição (SILVA, 2007).

Muitas vezes a depender da natureza da amostra, o extrato obtido após o

processo de MSPD encontra-se suficientemente limpo para a análise num

equipamento adequado, entretanto muitas vezes torna-se necessário adicionar uma

etapa adicional no processo de extração atuando na remoção substâncias

interferentes da matriz, pelo uso de co-sorvente ou conectando-se uma segunda

coluna, no próprio processo de MSPD (BARKER, 2007).

44

A seletividade de um procedimento por MSPD depende da combinação

sorvente/solvente usada. A natureza desta combinação é determinada

principalmente pela polaridade dos analitos de interesse e a natureza da matriz

(KRISTENSON, 2006). Na seleção do solvente de eluição, o principal auxílio é a

série eluotrópica (εº). Quanto maior o valor de εº do solvente, maior será sua força

de eluição e, portanto, mais facilmente removerá o analito da fase sólida. O solvente

selecionado deve maximizar a recuperação dos analitos de interesse e minimizar a

eluição dos componentes interferentes da matriz (MITRA, 2003).

A Tabela 6 relaciona alguns solventes comumente utilizados como fase móvel em

processos de MSPD e SPE.

Tabela 6. Série eluotrópica utilizada na seleção da fase móvel em MSPD.

Solvente Valor eluotr ópico ( ε°) em s ílica

acetato de etila 0,45

acetona 0,43

acetronitrila 0,50

ácido acético glacial > 0,73

água > 0,73

álcool isobutílico 0,54

benzeno 0,27

ciclohexano 0,03

clorofórmio 0,31

diclorometano 0,32

éter anidro 0,29

éter tert-butil metílico 0,29

Hexano 0,00

n-hexano 0,00

n-heptano 0,00

metanol 0,73

metil etil cetona 0,39

Pentano 0,00

piridina 0,55

2-propanol 0,63

tetracloreto de carbono 0,14

45

tetrahidrofurano 0,35

tolueno 0,22

1,1,2-tricloro-trifluoroetano 0,02

2,2,4-trimetilpentano 0,01

FONTE: SILVA, 2007.

4.4 – Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Mass as

A cromatografia é um eficiente método de separação empregada em diversos

setores da ciência de grande aplicação em vasta área de conhecimentos na qual a

análise qualitativa e quantitativa das espécies químicas deve ser realizada

permitindo a separação de misturas complexas (LANÇAS, 1993). As várias

modalidades de emprego da cromatografia respondem por mais de 70% da química

analítica (COLLINS, 2005). De uma forma geral a cromatografia é definida como um

processo de separação dos componentes de uma mistura, através da distribuição

destes componentes entre duas fases: uma estacionária e uma fase móvel. Durante

a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os componentes são distribuídos

entre as duas fases de tal forma que cada um destes componentes é seletivamente

retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais dos mesmos.

Esta diferença de interações entre os diversos compostos permite a separação

dos constituintes químicos de uma determinada mistura. Como conseqüência, os

tempos gastos para cada constituinte químico de uma mistura chegar ao detector

são diferentes permitindo a identificação e quantificação adequada dos mesmos

(COLLINS, 2004).

Os analitos a serem separados por cromatografia gasosa devem apresentar uma

razoável pressão de vapor à temperatura de separação. Substâncias orgânicas,

complexos organometálicos e substâncias inorgânicas voláteis ser analisadas e

quantificadas.

46

A cromatografia gasosa está limitada à análise de compostos voláteis (cerca de

15% dos compostos orgânicos); porém a existência de cromatógrafos que operam a

temperaturas de até 450 ºC, às técnicas de pirólise e a possibilidade de converter

muitos compostos em derivados voláteis ampliam consideravelmente o campo de

aplicação desta técnica (BARCELÓ, 1997). A cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massas é utilizada na identificação de centenas de componentes

presentes em sistemas naturais e biológicos, permitindo a caracterização de

substâncias em diversas amostras e na quantificação dos compostos

(SKOOG, 2002).

No espectrômetro de massas as moléculas são bombardeadas com um feixe de

elétrons. As moléculas se ionizam e se quebram em muitos fragmentos. Cada

espécie de íons possui determinado valor da razão da massa para a carga, ou valor

m/z. Um espectro de massas é um gráfico contendo as massas dos fragmentos

positivamente carregados (incluindo o íon principal) nas suas concentrações

relativas. O pico mais intenso do espectro, chamado pico base, tem arbitrariamente

a intensidade 100% (SILVERSTEIN, 2002).

Os espectrômetros de massas empregados na elucidação das estruturas de

substâncias são classificados conforme o método de separação, deflexão ou desvio

da trajetória dos íons. Alguns são de deflexão em campo magnético simples ou de

dupla focalização, outros, de tempo de vôo (Time-of-Flyght) e, ainda, de filtro de

massas com quadrupolo ou triplo quadrupolo e aprisionamento de íons (íon-trap)

(SKOOG, 2002).

As informações qualitativas são obtidas através da interpretação dos espectros

de massas. Esse espectro de massas é característico da substância principal e pode

ser comparado a espectros de massas de padrões analisados simultaneamente, ou

provenientes de bibliotecas armazenadas no computador (COLLINS, 2006). A

elevada sensibilidade possibilita a hifenação com técnicas cromatográficas como a

cromatografia gasosa (GC/MS), cromatografia líquida (LC/MS) e eletroforese capilar

(CE/MS), tornando a espectrometria de massas um dos mais apropriados métodos

físico-químicos para elucidação e determinação estrutural de compostos orgânicos

como produtos naturais, drogas, fármacos, polímeros e identificação de poluentes

orgânicos como pesticidas, HPA’s, bifenilas policloradas, dioxinas em matrizes

diversas.

47

A técnica de GC/MS, com o espectrômetro de massas operando no modo de

impacto de elétrons (EI) é bastante empregada em laboratórios de análises de

resíduos de poluentes orgânicos. Esse tipo de instrumentação permite elucidar

diversas estruturas de poluentes como pesticidas. As bibliotecas atuais compõem

cerca de aproximadamente 120.000 espectros de massa (m/z) de poluentes

ambientais como, por exemplo, os pesticidas (BARCELÓ, 1997).

Em análises ambientais o espectrômetro de massas é usualmente operado no

modo de impacto de elétrons, ionização química no modo positivo (PCI), ionização

química no modo negativo (NCI) ou no modo Tandem (MS-MS), (BARCELÓ, 1997).

4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A técnica de cromatografia líquida é complementar à cromatografia gasosa,

pelo fato de permitir a separação e análise de compostos termicamente instáveis,

não-voláteis ou de elevada polaridade. A análise de substâncias polares pode ser

realizada através do uso de mistura binária de solventes metanol:água ou

acetonitrila:água, e colunas com fases estacionárias do tipo C18, C8 ou ciano

(BARCELÓ, 1997).

Um sistema de HPLC é basicamente constituído de bombas de alta pressão,

injetor, colunas, detector e um sistema de aquisição de dados. A separação de uma

mistura por HPLC se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a fase

estacionária e a fase móvel, as quais podem ser pontes de hidrogênio, interações

eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Walls entre outras. Os modos de

separação podem ser classificados de acordo com a natureza das interações. São

eles: cromatografia em fase normal, cromatografia em fase reversa, por pareamento

de íons, por troca iônica ou por exclusão de tamanho. A escolha do modo adequado

para cada tipo de análise é baseado na natureza, massa molecular, polaridade e

caráter iônico do soluto (SNYDER, et. al1997).

Em cromatografia no modo normal a fase estacionária é mais polar do que a

fase móvel, o oposto ocorre em cromatografia no modo reverso. Os solventes

utilizados são geralmente uma mistura de solventes orgânicos sem a adição de água.

As fases estacionárias são adsorventes orgânicos como sílica e alumina ou fases

48

polares quimicamente ligadas. A força de diferentes misturas de solventes para

eluição no modo normal pode ser medida experimentalmente (CASS, 2001).

A cromatografia em fase reversa é a mais utilizada em HPLC, uma vez que

permite a separação de uma grande variedade de solutos e de fases móveis aquosas.

A fase móvel comumente utilizada é a mistura acetonitrila/água, sendo a acetonitrila

quando necessário substituída por metanol ou tetrahidrofurano. O uso de apenas

estes três solventes deve-se à pequena quantidade de solventes orgânicos miscíveis

em água (SNYDER, 1993).

O princípio da retenção em fase reversa é a hidrofobia, sendo a separação

baseada em interações entre a parte não polar do soluto e a fase estacionária, ou a

repulsão desta parte não polar do soluto com a fase móvel. A retenção em fase

reversa aumenta com o aumento de água na fase móvel (CASS, 2001).

A cromatografia líquida é particularmente adaptável às análises de resíduos de

pesticidas, com faixas amplas de polaridades, incluindo produtos de degradação ou

metabólitos secundários destes pesticidas, sem necessariamente derivatizar a

molécula do princípio ativo a ser quantificado. A cromatografia líquida apresenta

alguns requintes em relação à cromatografia gasosa, como a instalação no próprio

sistema de pré ou pós-colunas, sendo esta uma aplicação bastante usual na

determinação de pesticidas carbamatos e piretróides (BARCELÓ, 1997).

O detector aplicado neste trabalho foi o detector espectrofotômétrico UV-Vis

com arranjo de fotodiodos. Seu princípio é baseado na absorção de luz ultravioleta ou

visível, por parte da amostra. É um detector seletivo para moléculas com grupos

cromóforos (que absorvem num comprimento de onda específico) (CASS, 2001).

Recomenda-se a utilização de comprimentos de onda no máximo do analito, para

evitar interferência do solvente que compõe a fase móvel.

A Tabela 7 mostra os comprimentos de onda mínimos para que não seja

observada interferência da fase móvel.

49

Tabela 7. Comprimentos de onda mínimo dos solventes mais utilizados em HPLC.

Solvente UV (nm) mínimo

Acetona 330

Acetonitrila 200

Benzeno 280

Tetracloreto de carbono 265

Clorofórmio 245

Ciclohexano 210

Éter etílico 220

Dimetilsulfóxido 270

Etanol 210

Acetato de etila 255

Hexano 200

Metanol 210

Pentano 200

1-Propanol 210

Tetrahidrofurano 215

Tolueno 285

Água 190

FONTE: CASS, 2001

50

5. REVISÃO DE LITERATURA

Esta revisão da literatura apresenta trabalhos que abordam métodos de

determinação de resíduos de pesticidas em plantas medicinais por técnicas

cromatográficas de análise.

ABHILASH, 2008, desenvolveram um método por MSPD para determinação de

resíduos de pesticidas lindano e isômeros do hexaclorociclohexano em vegetais,

frutas e planta medicinais por GC-ECD. Foi adicionado a etapa de limpeza na

extração dos pesticidas nas matrizes estudadas. Foi utilizado 500 mg de Florisil como

adsorvente para homogeneização com 5,0 g de amostra. Na tentativa de eliminar a

umidade da matriz foi utilizado ainda 1,0 g de sulfato de magnésio anidro e 500mg de

cloreto de sódio que foram transferidos para uma coluna contendo 2,0 g de alumina

neutra e 500 mg de sulfato de sódio anidro. Para a etapa de eluição foi feito

otimização do sistema de solventes, sendo utilizado 1 mL do gradiente de solvente n-

hexano/acetato de etila (70:30, v/v). As recuperações ficaram na faixa de 93 a 103%.

Os limites de detecção para os α, β, γ e δ-HCH foram de 3 a 5 ng/g respectivamente.

O método foi aplicado para determinação de lindano e outros isômeros do

hexaclorociclohexano em matrizes alimentícias e de plantas medicinais.

DONG, 2007, desenvolveram uma metodologia para determinação de resíduos

de Metalaxyl nas plantas medicinais Panax notoginseng, Panax quinguefolium L,

Paeonia lactiflora Pall e Angelica sinensis. A extração foi realizada por SPE utilizando

cartuchos de 250 mm x 15 mm empacotados com 10 g de Al2O3 (contendo 3% de

água). As análises foram feitas por cromatografia liquida de alta eficiência no modo

reverso (RP-HPLC) com detector UV. A eluição foi realizada no modo isocrático, com

fase móvel composta pela mistura acetonitrila/água (40:60 v/v) e comprimento de

onda de 220nm. Os resultados de recuperação ficaram na faixa de 91,6 a 97,9%

considerados satisfatórios e RSD’s entre 1,2 e 5,0%. O limite de detecção foi de 3,6 x

10-10g. O método foi considerado eficiente, seletivo, e sensível e, portanto adequado

para determinação de Metalaxil nas plantas medicinais analisadas.

51

HAJJO, 2007, desenvolveram uma metodologia multirresíduo para análise de

pesticidas na planta medicinal Origanum syriacum bastante popular na região do Rio

Jordão, Oriente Médio. A extração foi feita utilizando ma mistura de solventes

acetonitrila/éter de petróleo. Foi feito uso de coluna preparada com Florisil, como

etapa na eliminação de impurezas da matriz. Os valores de recuperação dos

pesticidas foram de 74 a 119% com valores de coeficientes de variação entre 1,0 e

23,6%. Os valores de limites de detecção foram de 0,0008-0,5 mg/Kg. O método foi

empregado para análise de pesticidas em amostras da planta medicinal

comercializada em um supermercado da região. Sete das oito amostras

apresentavam quantidades detectáveis dos pesticidas DDT, folpet, dicofol, HCB,

HCH, vinclozolina e quintozeno.

LING, 1999, desenvolveram um método para determinação de 13 pesticidas

organoclorados em plantas medicinais típicas da China por extração SFE análises por

GC-ECD e GC-MS para confirmação dos pesticidas na matriz. Os pesticidas em

estudo foram os isômeros α, β, γ, σ-HCH, heptacloro, aldrin, endrin, dieldrin, α, β-

endosulfan, 4,4’DDT, 4,4’-DDE e 4,4’DDD. O gás utilizado como fluido supercrítico foi

o CO2 sob pressão de 250 atm e temperatura de 50ºC, com 5 minutos de extração

estática e 20 minutos de extração dinâmica. Para a etapa de purificação do extrato foi

utilizado 2,0 g de Florisil como sorvente para cada 0,1g de planta medicinal, e eluição

com 12,0 mL de n-hexano sob vazão de 1 mL/min. Os valores de recuperação ficaram

na faixa de 78 a 121% com reprodutibilidade na faixa de 5-31%, exceto para os

pesticidas endrin e β-endosulfan. Em termos gerais o método foi considerado rápido e

simples para a determinação dos pesticidas organoclorados estudados.

MA, 2007, desenvolveram um método por GC-ECD para determinar pesticidas

organoclorados (DDT, BHC e PCNB) em amostras de plantas medicinais. A extração

por SPE foi feita utilizando-se éter de petróleo como solvente. Os valores de

recuperação ficaram na faixa de numa faixa 89% a 102%, considerados satisfatórios,

e os valores de RSD’s ficaram na faixa de 0,5% a 8,9% para três valores de

concentração das soluções padrão dos pesticidas. O método foi validado

demonstrando ser rápido, simples, pouco gasto de solvente orgânico e com bons

valores de recuperação para os pesticidas estudados.

52

SCHUREK, 2008, desenvolveram um método para determinação de 36

pesticidas em amostras de chás. A determinação foi realizada pelo acoplamento on-

line da técnica de microextração em fase sólida no modo headspace com um

sistema bidimensional de cromatografia acoplado a espectrometria de massa com

analisador de massa por tempo de vôo (HS-SPME-GCxGC-TOF/MS) como uma

nova alternativa em relação à prática convencional de análise por GC-MS utilizando

outro tipo de técnica de extração que possa consumir maior quantidade de solventes

orgânicos. Alguns parâmetros no processo de extração por SPME foram ajustados

como o tipo da fibra utilizada para adsorção adequada dos pesticidas estudados e

temperatura de dessorção dos analitos. A repetibilidade foi medida pelo CV, cujo

valor máximo foi de 24%. Os limites de quantificação variaram no intervalo de 1 a 28

µg/kg.

TANG, 2007, determinaram resíduos de seis pesticidas nas plantas medicinais

Isatis indigotica e Paeonia lactiflora Pall por MSPD. O método consistiu na

homogeneização de 0,5g de planta medicinal com o sorvente sílica-gel e acetona

como solvente de eluição. Os resultados de recuperação para os ensaios fortificados

com soluções padrão nas concentrações de 0,1 a 5 mg/kg foram de 80 a 110% com

valores de RSDs na faixa de 0,43 a 17,6%. Os limites de quantificação para os

pesticidas metalaxyl, triadimefon e paclobutrazole foi de 0,01mg/kg e de 0,05 mg/kg

para os pesticidas vinclozolina, tebuconazole e fenatimol. O método empregado foi

rápido, eficiente e sensível para determinação dos pesticidas.

TANG, 2006, utilizaram dois métodos de extração para determinação de 15

fungicidas (organoclorados, organofosforados e piretróides) na planta medicinal Isatis

indigotica e formulações. Utilizou-se extração por ultra-som e posterior centrifugação

para separação do material particulado da planta medicinal na preparação da infusão.

Em seguida foi feito uso de extração líquido-líquido para extração dos pesticidas com

uso de éter de petróleo. A determinação dos pesticidas foi feita por GC-ECD-FID. As

soluções padrão dos pesticidas foram preparadas nas concentrações de 0,4 e

10µg/Kg. Os valores de recuperação foram considerados satisfatórios situados na

faixa de 72 a 113% para a infusão. Para o extrato obtido somente após a sonicação e

centrifugação sem fazer uso da LLE os resultados de recuperação foram de 73 a

105,1%, e os valores de recuperação obtidos apenas por extração no ultra-som foram

de 70 a 119%.

53

Os valores de coeficientes de variação para todos os pesticidas analisados

foram menores que 20%. Em termos gerais os métodos empregados para

determinação dos pesticidas estudados foram considerados simples, rápidos para

determinação simultânea dos resíduos dos pesticidas analisados com bons valores de

recuperação e repetibilidade com limites de determinação adequados e satisfatórios.

ZUIN, 2002, realizaram um estudo de comparação entre uma metodologia

convencional da Farmacopéia Européia (EP) e uma metodologia por MSPD para

analisar resíduos de pesticidas em plantas medicinais brasileiras. Os pesticidas

estudados foram os organoclorados (clorotalonil, tetradifona, lindano, α-endosulfan, β-

endosulfan, hexaclorobenzeno e dieldrin) e os pesticidas organofosforados

(fenitrotiona, parationa-etílica, parationa-metílica e malationa) que foram analisados

por GC-ECD. Uma massa de 0,5 g de Florisil desativada com 3% de água foi

adicionada a 1,0 g de folhas secas e pulverizadas Passiflora. L foi homogeneizado por

5 minutos. A mistura foi transferida para um cartucho (5 X 15 cm) contendo 2,0g de

alumina neutra desativada com 3% de água e 0,5 g de sulfato de sódio anidro para

retirada da umidade no processo de extração. A eluição foi feita com 5,0mL de uma

mistura dos solventes n-hexano/acetato de etila (70:30, v/v). Foram realizados testes

para a seleção do suporte sólido (C8, C18 e Florisil), do solvente de eluição (acetato de

etila e n-hexano) e adsorvente adequado para a etapa de limpeza do extrato, evitando

eventual interferência de algum constituinte químico característico da planta, evitando

desta forma a influência da matriz nos resultados. O estudo de recuperação do

método foi feito considerando-se três níveis de concentração, com valores médios de

recuperação de 96% (Farmacopéia Européia) e 94% por MSPD. O método

desenvolvido apresentou valores equivalentes ao da Farmacopéia Européia com a

vantagem de ser de baixo custo, simples e rápido.

54

6. EXPERIMENTAL

6.1 – Material

Béquer (50 e 250 mL), bastão de vidro, proveta (10 a 50 mL), balão

volumétrico (1, 5, 10 e 25 mL), balão de fundo redondo, vidro de relógio, frasco de

vidro com tampa rosqueável, vial para auto injetor (Shimadzu, Japão); colher de aço

inoxidável, espátula, garra, pinça, seringa de polietileno (20 mL), lã de vidro, garra,

micropipeta (Boeco Pipette 10-100 e 100-1000 µL), pipeta Pasteur.

6.2 – Solventes e Sorventes

Acetona, acetonitrila, acetato de etila, clorofórmio, ciclohexano,

diclorometano, n-hexano, (p.a., Merck, Darmstadt, Alemanha); Florisil 60-100 mesh

(Sigma, U.S.A); alumina neutra 70-290 mesh (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha);

C18 50 µM-65 A° (Waters - U.S.A); Sílica Gel 60 -20 0 mesh (J. T. Baker, Estados

Unidos); sulfato de sódio anidro (Merck, Darmstadt, Alemanha).

6.3 – Padrões de Pesticidas

- acefato (Dr. Ehrenstorfer GmbH, USA, pureza de 97,0%)

- bifentrina (Riedel-de-Haën, México, pureza de 99,8 %)

- clorprofam (Crescent Chemical CO. Inc, USA, pureza de 99,9%)

- fosalona (Crescent Chemical CO., Inc., USA, pureza 99,0%)

- pirimicarbe (Chem Service,USA, pureza de 98,0%)

- tetradifona (Radian International, Holanda , pureza 99,0 %)

55

6.4. Equipamentos

Evaporador-rotatório (Fisatom 802D), balança analítica (Sartorius BL 2105),

cromatógrafo gasoso modelo 17A acoplado ao espectrômetro de massas QP5050A

da marca Shimadzu com injetor split/splitless, cromatógrafo líquido de alta eficiência

da Shimadzu modelo Prominence, Sistema para SPE vacuum manifold (Varian,

Walnut Creck, CA, EUA).

6.5. Preparação de Amostra de Planta Medicinal

A planta medicinal conhecida popularmente por porangaba de nome científico

Cordia salicifolia é plantada no município de Boquim/SE e adquirida no mercado

municipal Tales Ferraz, BOX 168, da cidade de Aracaju/Sergipe. A porangaba foi

previamente seca para retirar umidade e triturada. Em seguida suas folhas foram

triturados com auxílio de um liquidificador caseiro, peneirados e armazenados num

frasco de vidro previamente limpo, sob refrigeração.

6.6. Condições Cromatográficas para o GC/MS

Cromatógrafo Gasoso da Shimadzu modelo 17A acoplado ao espectrômetro de

massas modelo QP5050A da marca Shimadzu (Kyoto, Japão); Coluna DB5MS - 5%

fenil e 95 % polidimetilsiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) J & W Scientific (USA).

O gás de arraste foi o He (99,999%) à pressão de 100,1 KPa. ; Injetor split/splitless

(250ºC); modo splitless; temperatura de interface de 280ºC, Volume injetado 1 µL;

Programação de temperatura: temperatura inicial: 60 ºC (1 min); taxa de

aquecimento de 10 ºC/min até 300 ºC (3 min); O espectrômetro de massas foi

operado com monitoramento de íons selecionados (SIM), no modo de impacto de

elétrons a 70 eV (250ºC); Vazão de 1,6 mL/min; Tempo de corrida de 30 minutos.

56

6.6.1. Condições Cromatográficas para o HPLC-UV

Cromatógrafo líquido de alta eficiência modelo Prominence da marca Shimadzu

com desgaseificador modelo DGU-20A, detector no UV-Visível com arranjo de

fotodiodos modelo SPD-20MA, sistema de bombas reciprocicantes modelo LC-

6AD/7A e CBM-20A, injetor automático modelo SIL-20A.

Coluna C18 (250 x 4,6 mm) da Microsorb-MV 100-5, da marca Varian. Software

LCSolution. Fase móvel composta por gradiente binário acetonitrila/água e eluição no

modo gradiente como mostra a Tabela 8. Volume de injeção de 20 µL. Varredura de

comprimento de onda na faixa de 200 a 800 nm. Tempo de corrida de 25 minutos.

Vazão da fase móvel de 1ml/min.

Tabela 8. Programação de eluição no modo gradiente em HPLC-UV otimizada

para análise dos pesticidas selecionados no presente trabalho.

Tempo (min) Porcentagem de

acetonitrila

0,01 60

2,00 65

6,00 70

15,00 75

18,00 70

20,00 65

25,00 60

30,00 60

57

6.7 – Preparação das Soluções Padrão dos Pesticidas

As soluções padrão estoque de cada pesticida foram usadas para preparar as

soluções padrão intermediárias e de trabalho e obtenção das curvas analíticas por

diluições apropriadas em diclorometano, por serem solúveis neste solvente orgânico, e

armazenadas a - 4º C. Foram preparadas soluções dos pesticidas acefato, clorprofam,

pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em níveis diferentes de concentração

para a etapa de fortificação das amostras de porangaba. Também foram preparadas

soluções padrões dos pesticidas no extrato da matriz. As soluções de trabalho foram

utilizadas no prazo máximo de quatro semanas e armazenadas no freezer para

minimizar a degradação.

6.8. Otimização das Condições Cromatográficas por G C/MS.

Primeiramente foram realizadas análises das soluções padrão individuais dos

pesticidas selecionados no presente estudo por GC/MS (modo SCAN) para

obtenção dos tempos de retenção dos pesticidas. Posteriormente foram feitas

injeção das soluções padrão dos pesticidas selecionando seus íons característicos

(modo SIM, Selected Ion Monitoring).

Foram feitas programações de temperatura, a fim de obter uma melhor

separação entre os analitos durante a análise por GC/MS. A seleção dos fragmentos

monitorados e os tempos de retenção dos pesticidas estão relacionados na Tabela

9.

58

Tabela 9 – Tempos de retenção e fragmentos monitorados na quantificação dos

pesticidas.

Pesticidas Tempo de retenção (min)

Fragmentos monitorados (m/z)

acefato 5,9 136, 142, 168

clorprofam 14,5 154, 171, 213

pirimicarbe 16,7 166, 238, 152

bifentrina 22,7 165, 181, 322

tetradifona 23,3 227, 356, 362

fosalona 23,6 257, 367, 121

6.8.1. Otimização das Condições Cromatográficas por HPLC-UV.

Foram estabelecidas condições cromatográficas adequadas para identificação e

quantificação dos pesticidas no extrato da planta medicinal. Os padrões dos

pesticidas acefato, chlorpropham, pirimicarbe, bifentrina e tetradifona na

concentração de 5 µg/mL foram injetados individualmente para reconhecimento dos

tempos de retenção e dos espectros no UV-Vis.

A eluição gradiente foi empregada com fase móvel constituída por uma mistura

binária dos solventes acetonitrila/água e coluna do tipo C18. A utilização da eluição

gradiente é aplicada com o intuito de aumentar a força de eluição no modo reverso a

fim de diminuir o tempo de análise. A vazão da fase móvel foi de 1 ml/min e o tempo

total de corrida foi de 20 minutos para todos os pesticidas. A Tabela 10 apresenta os

pesticidas analisados por HPLC-UV e seus respectivos tempos de retenção.

59

Tabela 10 . Tempos de retenção dos pesticidas analisados por HPLC-UV.

Pesticidas Tempo de retenção (min)

pirimicarbe 4,4

clorprofam 5,0

tetradifona 5,4

bifentrina 10,4

6.9. Procedimento de Limpeza da Vidraria

Os materiais utilizados no preparo das soluções e durante as extrações foram

enxaguados em água corrente, por três vezes; lavar com solução de Extran a 2%;

enxaguar em água corrente, por três vezes; lavar com água destilada; enxaguar com

acetona; secar com auxílio de uma estufa à 90ºC; cobrir com papel alumínio as

extremidades abertas dos materiais e guardá-los em armários fechados.

6.9.1 Curva Analítica

Preparou-se uma solução estoque para cada pesticida (acefato, clorprofan,

pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona) com concentração de 400 µg/mL em

diclorometano. A partir disto foram preparadas soluções intermediárias com

concentração de 10 µg/mL para reconhecimento dos tempos de retenção dos

pesticidas por GC/MS e HPLC-UV. Para preparação da curva analítica e fortificação

das amostras de porangaba foram preparadas soluções padrão da mistura dos

pesticidas com concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 3,0 e 5,0 µg/mL para GC/MS e

HPLC-UV. Recomendação INMETRO/ANVISA, 2008, cinco pontos para cada

padrão de pesticida.

60

7.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO

7.1. Método de Extração por MSPD

Os métodos analíticos para determinação de resíduos de pesticidas em

diferentes matrizes de uma forma geral estão divididos em dois grupos: os métodos

individuais e os métodos multirresíduos. Os primeiros são aplicados para análise de

um único pesticida ou de seu metabólito mais importante em uma ou várias matrizes e

os métodos multirresíduos são aplicados para análise de vários pesticidas de um

mesmo grupo químico ou de diferentes classes químicas em uma ou várias matrizes

(KRISTENSON, 2004).

O uso de métodos multirresíduos em programas de monitoramento de

alimentos, amostras ambientais e fluidos biológicos é muito freqüente, pelo fato de

possibilitar a otimização do monitoramento de vários pesticidas de diferentes grupos

químicos em uma única extração em diversos tipos de matrizes. Os métodos

multirresíduos além de serem eficientes, apresentam um menor custo com redução do

tempo de trabalho se comparados a métodos individuais (SOLER, 2007).

Neste trabalho foi desenvolvido um método multirresíduo utilizando a

dispersão da matriz em fase sólida como método de extração dos pesticidas acefato,

chlorpropham, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em extrato de planta

medicinal Cordia salicifolia.

O procedimento de extração desenvolvido consistiu nas seguintes etapas:

• Pesar em vidro de relógio 0,5 g de planta medicinal.

• Pesar em vidro de relógio 0,5 g do adsorvente alumina neutra, 1,0 g do

adsorvente C18 e 1,0g do sulfato de sódio anidro.

• Fortificar 0,5 g de Cordia salicifolia com 500 µL de solução dos

pesticidas selecionados e aguardar 30 min.

• Adicionar 0,5 g de alumina neutra à planta medicinal fortificada e

homogeneizar por 3 minutos, tempo suficiente para obtenção de um

material homogêneo adequado para extração.

• Adicionar o Na2SO4 à coluna de MSPD após colocar a lã de vidro na

mesma.

• Transferir o conteúdo do almofariz para a seringa de polietileno

contendo o Na2SO4, C18 e a lã de vidro.

61

• Eluir os pesticidas com 30mL do sistema de solvente

(ciclohexano/diclorometano, 3:1, v/v) usando o sistema de vácuo,

ajustando o fluxo para 1 mL/min.

• Recolher o eluato no balão do evaporador-rotatório.

• Evaporar o solvente em evaporador-rotatório (41°C, 100 rpm) até cerca

de 3 mL.

• Concentrar com suave corrente de N2 até 1,0 mL.

• Analisar por GC/MS ou HPLC-UV.

A Figura 2 apresenta o esquema da coluna MSPD utilizada para extrair os

pesticidas selecionados da matriz de planta medicinal Cordia salicifolia.

FIGURA 2 - Esquema da coluna MSPD para extração dos pesticidas na planta medicinal Cordia salicifolia.

30 mL de mistura de ciclohexano:DCM (1:3, v/v)

0,5 g de Cordia salicifolia + 0,5 g de alumina neutra homogeneizados

1,0 g de sulfato de sódio anidro

Lã de vidro

1,0g de C18

62

A extração dos pesticidas selecionados para estudo em matriz de planta

medicinal através do uso da dispersão da matriz em fase sólida consistiu em

homogeneizar 0,5 g de Cordia salicifolia com 0,5 g de adsorvente alumina neutra por

3 minutos até se obter uma massa uniforme. É necessário efetuar a transferência do

homogeneizado para a coluna de MSPD preparada previamente com sulfato de

sódio anidro para reter a umidade da amostra e co-coluna C18. A preparação da

coluna, com capacidade de 20 mL, foi feita colocando a lã de vidro que serviu como

suporte para o material homogeneizado, adicionando-se em seguida o

homogeneizado amostra/adsorvente.

A eluição dos pesticidas foi otimizada, utilizando-se uma mistura de 30 mL de

ciclohexano:diclorometano (1:3, v/v), passando através do cartucho. O eluato obtido

é concentrado em um evaporador-rotatório, com rotação de 100 rpm e temperatura

de 41ºC. O ajuste do volume do extrato final foi realizado com suave corrente de gás

nitrogênio.

8.0. Resultados dos Valores de Recuperação em Análi ses por GC/MS/SIM.

8.1. Ensaios para Seleção do Suporte Sólido

Testes preliminares foram realizados para escolha do melhor sistema de

sorvente em duplicata, utilizando ciclohexano como solvente de eluição dos

pesticidas, já que a princípio a utilização deste solvente juntamente com os sistemas

de sorventes utilizados era obtido um cromatograma mais livre de impurezas

características da planta medicinal Cordia salicifolia. Os resultados de recuperação

dos testes com os sorventes alumina, C18, sílica e Florisil na extração dos pesticidas

acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona, na planta

medicinal estão apresentados na Figura 5.

63

153,3

132,7

48,558,6

206,5

171,3

141,6

101,5

280,4

104,9

80,3

138

440,5

241,1

120,3

155

5,31

173,1

13,3

136,1

21,6

130,9

183,1

86,6

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

C18 Florisil sílica alumina

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 3 . Ensaios de recuperação para seleção do suporte sólido extração dos

pesticidas com concentração da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5

µg/g.

Em princípio foi possível notar os elevados valores de recuperação em todos os

ensaios somente quando se faz uso de suporte sólido sem adição de etapa de

limpeza na eliminação de impurezas características da matriz. A alumina neutra por

ser um adsorvente tipicamente anfótero consegue interagir quimicamente de forma

favorável com os pesticidas de classes químicas variadas no processo de dispersão

facilitando no processo de extração.

64

O sorvente Florisil segundo dados da literatura deve ser utilizado com reservas

quando se faz extração de analitos mais polares pelo seu elevado caráter polar,

podendo ocasionar em adsorção irreversível dos pesticidas (LANÇAS, 2004).

Resultados maiores de recuperação foram obtidos quando se fez uso deste

sorvente. Os pesticidas interagiram mais quimicamente com o Florisil, entretanto a

utilização do mesmo facilitou também a extração de outros constituintes oriundos da

porangaba por sua maior capacidade de interação química com grupos polares da

planta como a clorofila (ABHILASH, 2007), resultando em efeito matriz, evidenciado

pelos elevados valores de recuperação nos ensaios como mostra os valores de

recuperação para os pesticidas clorprofam, bifentrina e tetradifona.

O sorvente C18, pelo fato de ser sílica modificada com grupos orgânicos, tem

característica apolar facilitando sua interação química com constituintes apolares

provenientes da matriz facilitando desta forma na co-eluição das impurezas da

planta medicinal resultando em elevados valores de recuperação para os pesticidas

acefato, clorprofam, pirimicarbe e bifentrina como mostra a Figura 3, o que dificulta

nos cálculos de quantificação e na identificação dos pesticidas.

Com a utilização da sílica como sorvente, foram obtidos menores valores de

recuperação em relação à utilização de C18 e Florisil. A sílica possui propriedades

mais polares em relação aos outros sorventes utilizados interagindo com mais

facilidade com pesticidas mais polares. Dado a característica mais polar dos

pesticidas em estudo, o solvente ciclohexano utilizado nesta ocasião, não foi

eficiente na eluição dos pesticidas em ensaios com sílica como suporte sólido. É

preciso se considerar a baixa força eluotrópica do ciclohexano em sílica, o que

justifica os baixos valores de recuperação para o acefato e tetradifona, obtidos

nestes ensaios em relação à utilização dos outros sorventes.

De acordo com os dados mostrados na Figura 3, é possível verificar que os

ensaios realizados apresentaram resultados com valores de recuperação acima de

120%. De acordo com a literatura, valores aceitáveis para matrizes complexas estão

na faixa de 50-120% (LOPEZ, 2008). É conveniente, portanto, a adição no

procedimento de uma etapa de limpeza na tentativa de minimizar a quantidade de

impurezas típicas de matrizes complexas como alimentos, plantas, águas, fluidos

biológicos. (KRINTENSON, 2008) que interferem na identificação e quantificação

dos pesticidas (POOLE, 2007).

65

8.2. Ensaios para Seleção de Co-sorvente

É possível verificar que o uso de sílica como sorvente na etapa de limpeza

permitiu a obtenção de valores de recuperação menores quando comparado com

outros sorventes, como é possível perceber os baixos valores de recuperação para

os pesticidas pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona quando foi utilizado

Florisil como suporte sólido. Como os pesticidas selecionados apresentam

características polares a moderadamente polares estes provavelmente estariam

sendo retidos nos grupos silanóis da sílica, pela afinidade química destes grupos de

substâncias com os grupos silanóis, como mostra os resultados da Figura 4, para os

pesticidas bifentrina, tetradifona e fosalona quando do uso dos suportes sólidos C18

e Florisil. Evidencia-se também que a sílica na função de co-sorvente retém também

impurezas de características polares provenientes da planta medicinal pelos baixos

valores de recuperação obtidos de uma forma geral.

61

27,6

25,1

52,7

18,6

9,85

13,9

7,5

62,9

12,3

9,337,33

1,34 1,61

30,7

1,06 1,31

13,1

0

10

20

30

40

50

60

70

C18/sílica Florisil/sílica alumina/sílica

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 4 . Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,

utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução

padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

66

Com a utilização do sorvente C18 como co-sorvente foi possível se observar

menores valores de recuperação como 25,4; 30,9 e 31,1%, para os pesticidas

pirimicarbe, bifentrina e fosalona respectivamente, quando foi feito uso de sílica

como suporte sólido e os valores de 1,86, 21,1 e 31,3% para os pesticidas fosalona,

tetradifona e bifentrina respectivamente pela utilização de Florisil como suporte

sólido, resultados estes que podem ser justificados pela retenção de impurezas com

propriedade polares provenientes da porangaba, já que o adsorvente C18 possui

grupos silanóis residuais que realizam a adsorção de compostos polares e apolares

pela característica tipicamente polar do C18, como mostra os resultados na Figura 5.

A presença dos grupos silanóis residuais do C18 poderá ter adsorvido alguma

quantidade dos pesticidas como a bifentrina, tetradifona e fosalona quando se

utilizou Florisil como suporte sólido e dos pesticidas pirimicarbe, bifentrina e fosalona

quando foi feito uso de sílica como suporte sólido, pelos menores valores de

recuperação mostrados na Figura 5.

Nos ensaios pelo qual se utilizou alumina como suporte sólido com C18 como co-

sorvente foi possível perceber resultados de recuperação numa faixa mediana entre

42,9 e 71,8%, pela baixa força eluotrópica do solvente ciclohexano. Os resultados

mais satisfatórios quando foi utilizado alumina neutra como suporte sólido pode ser

atribuído a maior versatilidade deste sorvente em interagir de maneira mais

universal com os pesticidas de características químicas variadas e possivelmente à

adição da etapa de limpeza do sorvente C18, na retenção de impurezas provenientes

da porangaba. Os baixos valores de recuperação foram obtidos quando foi utilizado

sílica e Florisil como suportes sólidos. Pode-se observar efeito matriz na extração do

pesticida clorprofan em ensaios que fizeram uso de Florisil como suporte sólido e

C18 como co-sorvente, o que ocorre quando alguma impureza de característica

química semelhante ao analito ser extraído juntamente no processo de extração

(POOLE, 2007). Resultados com valores de recuperação pela utilização de C18

como co-sorvente podem ser verificados na Figura 5.

67

63,1

116,4

47,1

209,9

56,6

42,9

80,2

25,4

57,4

31,3 30,9

58,7

21,1

76,171,8

1,86

31,1

51,6

0

50

100

150

200

250

Florisil/C18 sílica/C18 alumina/C18

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 5. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,

utilizando o ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução

padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

O Florisil não foi discutido ainda na literatura como sorvente para extração de

pesticidas em planta medicinal, no entanto resultados de recuperação satisfatórios

foram obtidos quando este foi utilizado no processo de extração como co-sorvente

para os pesticidas clorprofam, pirimicarbe, bifentrina e tetradifona. O sorvente C18 foi

eficiente no processo de dispersão dos pesticidas e o co-sorvente Florisil teve a

função de reter impurezas polares da porangaba como clorofilas, (ABHILASH,

2007), permitindo a eluição dos pesticidas. Resultados satisfatórios também podem

ser observados em ensaios que foi utilizado Florisil como suporte sólido e ao mesmo

tempo como co-sorvente na retenção de impurezas da planta, pelos bons valores de

recuperação para os pesticidas clorprofam, bifentrina e tetradifona, como mostra os

resultados na Figura 6.

68

Ensaios que fazem uso de sílica como suporte sólido não apresentaram valores

satisfatórios de recuperação, pela natureza polar da sílica na retenção dos

pesticidas, como mostra os menores valores de recuperação na Figura 6.

62,8

45,6

34,1

68,5

116,8

241,7

36,4

97,2

82,390,4

52,6

65,1

94,3

74,9

102,6

61,164,6

104,3

6,6 7,31

56,1

31,6

71,6

3,31

0

50

100

150

200

250

300

C18/Florisil Florisil/Florisil sílica/Florisil alumina/Florisil

Rec

upew

raçã

o M

édia

(%

)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 6. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-coluna,

utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução

padrão de fortificação de 0,5 µg/g.

Foi possível verificar valores de recuperação bastante elevados para os

pesticidas quando se utilizou alumina neutra como co-sorvente como, por exemplo,

os pesticidas acefato, clorprofam, tetradifona e fosalona em quase todos os ensaios

realizados. A partir disto é possível concluir que apesar de apresentar caráter

anfótero, o uso da alumina neutra não foi adequado para a retenção de impurezas

da porangaba como mostram os resultados de recuperação da Figura 7.

69

183,4

339,1

121,1

55,851,2

103,6

69,5

189,8

33,1

57,3

105,1

74,4

50,9

74,4

105,1

162,5

125,1

63,8

186,1 183,1

331,6

51,6

183,1

101,6

0

50

100

150

200

250

300

350

400

C18/alumina Florisil/ alumina sílica/ alumina alumina/ alumina

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 7. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,

utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução

padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

70

8.3. Ensaios para Seleção de Solventes de Eluição d os Pesticidas.

O ensaio de MSPD selecionado para testes de seleção de solvente de eluição foi

o sistema alumina como suporte sólido e C18 como co-sorvente.

Com o objetivo de se obter um extrato de Cordia salicifolia mais limpo com

menor presença de impurezas, foram realizados ensaios com os solventes acetato

de etila, diclorometano, ciclohexano, n-hexano e acetato de etila. Devido à baixa

força eluotrópica do solvente ciclohexano nos sorventes testados nos ensaios de

MSPD, foram obtidos cromatogramas relativamente livres de impurezas

características da Cordia salicifolia em relação aos outros solventes utilizados como

o n-hexano e acetato de etila.

O extrato de Cordia salicifolia com ciclohexano, alumina como suporte sólido e

C18 como co-sorvente está mostrado no cromatograma da Figura 8.

Figura 8. Cromatograma obtido do GC/MS (no modo SCAN) do extrato de Cordia

salicifolia com solvente ciclohexano. Para condições cromatográficas de análise ver

item 6.8.

Os testes com acetato de etila juntamente com os sorventes citados

anteriormente na tentativa de reter impurezas provenientes da porangaba não foram

tão satisfatórios em relação à utilização do ciclohexano como mostra o

cromatograma da Figura 9, com alguns picos relativos aos constituintes químicos

presentes na porangaba.

71

Figura 9. Cromatograma obtido no GC/MS (Modo SCAN) do extrato de Cordia

salicifolia com solvente acetato de etila. Para condições cromatográficas de análise

ver item 6.8.

A utilização do ciclohexano não foi conveniente para eluição dos pesticidas,

pelos baixos valores de recuperação obtidos naqueles ensaios. Isto posto, no

propósito de se obter maiores valores de recuperação dos pesticidas no extrato de

porangaba, foram realizados ensaios com mistura de solventes para aumentar a

força eluotrópica e desta maneira maximizar a extração dos pesticidas no processo

de MSPD. Os ensaios realizados com misturas de solventes estão mostrados na

Figura 10.

75,969,4

105,3

56,1

113,1

57,349,1

53

190,4

221,7

103,6

134,8

262,3

125,8

142,4

56,1

102,3

161,6

0

50

100

150

200

250

300

ciclohexano/clorofórmio ciclohexano/diclorometano ciclohexano/acetato de etila

Rec

uper

ação

Méd

ia (%

)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 10. Ensaios de recuperação para seleção do sistema de solventes (1:1,

v/v) de eluição, utilizando alumina como suporte sólido e C18 como co-sorvente, com

concentração da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

72

Em termos gerais foi possível perceber a mudança dos valores de recuperação

quando da utilização de misturas do ciclohexano com solventes de maior força de

eluição como diclorometano e clorofórmio. Bons valores de recuperação podem ser

observados para todos os pesticidas com o uso da mistura de solventes

ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v). Foi verificado efeito matriz para os pesticidas

acefato, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona com a mistura

ciclohexano/acetato de etila (1:1, v/v).

8.4. Ensaios para Seleção do Volume de Solventes

O sistema ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v), foi selecionado para testes de

volume e proporção da mistura dos mesmos na otimização da extração dos

pesticidas. Foi possível verificar a partir dos resultados de recuperação mostrados na

Figura 16 que quando se utilizou 40 mL de mistura de solventes

ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v), foram obtidos resultados de recuperação

bastantes elevados, exceto para o pesticida acefato. O volume de 30 mL foi suficiente

para obtenção de bons valores de recuperação, principalmente para os pesticidas

chlorpropham, tetradifona e fosalona como mostrado na Figura 11.

73

56,360,5 59,2

100,9

110,9

142,6

77,9

47,8

121,1

94,8

116,3

145,3

63,3

100,7 102,1

81,1

89,5

160,4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Ciclohexano/DCM 20mL Ciclohexano/DCM 30mL Ciclohexano/DCM 40mL

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 11 . Ensaios de recuperação para seleção do volume da mistura e

solventes ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v) utilizando alumina como suporte

sólido e C18 como co-sorvente, com concentração da solução padrão de fortificação

de pesticidas de 0,5 µg/g.

8.5. Ensaios para Seleção da Proporção de Solventes

Testes de proporção do sistema de solventes ciclohexano/diclorometano foram

realizados nas proporções (1:1, 1:2, 1:3, v/v) no volume de 30 mL, com resultados

de recuperação favoráveis com a proporção (1:3, v/v). A mistura com o solvente

diclorometano de fato favoreceu na extração dos pesticidas de características

relativamente polares do que quando se compara estes dados com os valores de

recuperação quando se fazia uso apenas do ciclohexano como solvente de eluição.

Bons valores de recuperação podem ser verificados na Figura 12 para os pesticidas

acefato, clorprofam, bifentrina e fosalona.

74

56,3

44,8

91,9

100,9

142,3

116,4

77,9

70,1

121,4

94,8

153,5

103,3

63,3 63,6

133,1

81,1

89,1

79,5

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Ciclohexano/DCM (1:1, v/v) Ciclohexano/DCM (1:2, v/v) Ciclohexano/DCM (1:3, v/v)

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 12 . Ensaios de recuperação para seleção da proporção da mistura de

solventes ciclohexano/diclorometano no volume de 30 mL, utilizando alumina como

suporte sólido e C18 como co-sorvente, com concentração da solução padrão de

fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

8.6. Ensaios para Seleção da Proporção Matriz/Supor te Sólido

Foram feitos testes de recuperação variando-se a proporção matriz/adsorvente

(1:1, 2:1 e 1:2, m/m), na tentativa de se obter melhores valores de recuperação para

os pesticidas em extrato de porangaba. A melhor proporção matriz/adsorvente foi

(1:1, m/m), com 0,5 g de porangaba e 0,5 g de alumina como mostra os dados da

Figura 13.

75

56,360,5

141,3

100,9

110,9

93,1

77,9

47,8

156,9

94,8

116,3

123,1

63,3

100,798,1

81,1

89,5

113,1

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

planta/alumina 1:1 (m/m) planta/alumina 2:1 (m/m) planta/alumina 1:2 (m/m)

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona

Figura 13. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a proporção

(planta medicinal:alumina, m/m), utilizando o 30 mL da mistura dos solventes

ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com C18 como co-sorvente, com concentração

da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.

Foi verificado efeito matriz em ensaios com proporção matriz/adsorvente (2:1,

m/m) quando se fez uso de maior massa de planta, 1,0 g, e pouca massa de

alumina, 0,5 g, no processo de homogeneização resultando em maiores valores de

recuperação como mostra os resultados da Figura 15, que pode ser resultado da

pouca quantidade de sorvente para romper a estruturas moleculares de uma maior

massa da matriz adicionada no processo de homogeneização, aumentando a

quantidade de impurezas provenientes da porangaba.

Valores de recuperação mais satisfatórios foram obtidos com proporção

matriz/adsorvente (1:1, m/m) com 0,5g de planta medicinal e 0,5 de alumina neutra.

Além do mais é importante se destacar nestes ensaios a menor manipulação de

amostra e reagentes na preparação da amostra para estudos de recuperação.

76

De acordo com os resultados apresentados anteriormente, pode-se concluir que

o sistema alumina/C18, foi selecionado de maneira favorável para obtenção de

resultados de recuperação mais satisfatórios em extrato de Cordia salicifolia,

destacando-se a eficiência da fase C18 como co-coluna na retenção de impurezas

provenientes da planta medicinal.

A utilização de etapa de limpeza na coluna de MSPD tem se mostrado muito útil

em alguns trabalhos na retenção de substâncias endógenas (KRISTENSON, 2006).

A mistura de solventes selecionada ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), foi

satisfatória na eluição dos pesticidas pelo ajuste da força eluotrópica da mistura de

solventes obtendo-se valores de recuperação satisfatórios dos pesticidas.

A adição da etapa de limpeza com co-coluna C18 foi fundamental para retenção

de impurezas provenientes da porangaba, resultando em valores de recuperação

razoáveis levando-se em consideração a complexidade da amostra, minimizando o

efeito matriz. A alumina neutra já havia sido utilizada por ZUIN, 2003, em amostras

de folhas de maracujá, Passiflora. L, com 1 g de amostra e utilização de sulfato de

sódio anidro e Florisil na extração dos pesticidas clorotalonil, hexaclorobenzeno, α-

endosulfan, β-endosulfan, tetradifona e lindano nos níveis de concentração de 0,05;

0,1 e 0,3 µg/g, utilizando GC-ECD para comparar a eficiência do método de extração

por MSPD frente ao da Farmacopoeia Européia.

Os testes de fortificação na porangaba foram realizados em três níveis

diferentes de concentração, sendo que, como não existe limite máximo aceitável

para a planta medicinal Cordia salicifolia propriamente dita, os valores de fortificação

foram selecionados com base no limite de detecção dos equipamentos utilizados

(GC/MS/SIM e HPLC-UV) para determinação dos pesticidas na matriz em estudo.

77

8.7. EFEITO MATRIZ

A validação de método é um processo para demonstrar se o método de ensaio é

capaz de produzir resultados confiáveis para a finalidade a que se destina. Para

alcançar este objetivo é necessária a verificação de alguns parâmetros de

desempenho como, por exemplo, a seletividade. O efeito da resposta cromatográfica

acentuada e induzida pela matriz ou efeito matriz é um fator avaliado de grande

magnitude neste parâmetro já que pode afetar acentuadamente as concentrações da

amostra (HAJSLOVÁ, 1998).

Constituintes da matriz que co-eluem com princípios ativos de interesse para

quantificação, resultam em alargamento da banda cromatográfica e acentuam o

valor da concentração do analito, pela mesma afinidade e competição pelos sítios

ativos da coluna do equipamento interferindo na análise do composto de interesse.

Embora os métodos de análise multirresíduos representem formas efetivas de

quantificar uma variedade de pesticidas em alimentos, águas, solos, vegetais como

plantas medicinais ou mesmo fluidos biológicos os valores percentuais de

recuperação para os analitos nem sempre são satisfatórias, por apresentarem,

muitas vezes, porcentagens de extração acima de 100% e, ainda, elevados desvios

nas análises. Estes resultados estão relacionados com os efeitos matriz que

ocorrem durante a análise cromatográfica (HAJSLOVÁ, 1998. Este efeito matriz foi

descrito primeiramente por ERNEY e colaboradores, 1993, que observaram durante

a análise de amostras naturais, a co-extração de vários componentes oriundos da

própria matriz, além dos compostos de interesse, os quais provocavam modificações

na resposta dos pesticidas estudados.

A interferência dos componentes da matriz ocorre porque a curva analítica

utilizada para quantificar os pesticidas, geralmente, é preparada em solvente puro.

Já nas análises dos extratos obtidos por um método de extração adequado, além de

apresentar os pesticidas, contém uma variedade de constituintes provenientes da

matriz que são co-extraídos. Estes compostos interferem durante uma análise

cromatográfica, pois influenciam na quantidade de pesticidas que é transferido para

a coluna. Esta interferência dos componentes da matriz, na quantificação dos

pesticidas depois da análise cromatográfica, é denominada de efeito matriz

(GONZALEZ, 2002).

78

O efeito matriz pode ocorrer em diversas partes do sistema cromatográfico como:

injetor, coluna ou detector. O liner do injetor, um tubo de vidro, é o principal

responsável pelo efeito de matriz, pois os sítios ativos deste material podem

adsorver ou induzir a degradação térmica de alguns analitos. Quando as soluções

padrão são preparadas no solvente puro e analisadas por cromatografia mais sítios

ativos do liner estarão disponíveis para interagir com os pesticidas. Entretanto

quando a análise é feita no próprio extrato da matriz, os pesticidas estarão na

presença de componente da própria matriz, ocorrendo assim uma competição pelos

sítios ativos. Dependendo das características dos analitos e da amostra, os

componentes da matriz podem ser absorvidos pelo liner e uma maior quantidade de

pesticidas serão introduzidos na coluna cromatográfica, resultando numa maior

resposta para os pesticidas quando comparado com a resposta deste em solvente

puro (HAJSLOVÁ, 2003).

HAJSLOVÁ, 2003, fez análise do pesticida captan em extratos de laranja. Este

pesticida quando preparado em tolueno puro, não havia sido detectado pelo detector

por captura de elétrons, muito provavelmente devido a decomposição ou interação

deste com os sítios ativos do liner. Depois de várias injeções de amostra de extratos

de laranja em que foi se acumulando componentes da matriz no sistema

cromatográfico o pico de captan foi devidamente quantificado, embora a

repetibilidade das análises tenham sido baixas.

Normalmente, para corrigir estes erros nos valores de recuperação, a curva

analítica preparada substituindo o solvente puro por extratos da matriz insenta do

analito, durante a diluição das soluções padrões nas diversas concentrações

(RIBANI, 2004). Muitos pesticidas têm apresentado estabilidade quando preparados

no extrato da matriz.

KOCOUREK, 1998, observaram a degradação de pesticidas organofosforados

apenas quando se elevava a temperatura de armazenamento dos padrões, caso

contrário, quando os padrões eram preparados no extrato da matriz e armazenados

em baixas temperaturas, estes se tornavam mais estáveis que os padrões

preparados em solventes puros.

79

Outra forma de minimizar o efeito matriz é quando se faz uso de injeção on-

columm, para evitar a presença de sítios ativos do sistema de injeção, ou freqüentes

mudanças do liner do injetor. Pode-se também utilizar o método de adição de

padrão na própria matriz, ou ainda etapas de clean-up dos extratos para minimizar a

co-extração de constituintes indesejáveis na análise (POOLE, 2007; MASTOVSKÁ,

2004). Entretanto a adição de etapas de limpeza resulta em aumento no tempo de

análise e baixos valores de recuperação caso o constituinte a ser analise tenha

afinidade pelo adsorvente de limpeza ou co-coluna da etapa clean-up no processo

de extração (POOLE, 2007).

Outra alternativa é a adição de substâncias químicas similares aos componentes

da matriz nos padrões preparados em solventes puros, para ocupar os sítios ativos

do liner, impedindo a adsorção ou degradação dos pesticidas. Tais substâncias ditas

como protetoras como o óleo de oliva (ou produtos de degradação destes) tem

maior facilidade de realizar ligações de hidrogênio do que os pesticidas com os

grupos silanóis do liner. Desta maneira estes compostos mascaram os sítios ativos e

proporcionam maior transferência dos pesticidas para a coluna cromatográfica

(POOLE, 2007). A intensidade do efeito da matriz pode variar de uma amostra para

outra, ou de acordo com a concentração do analito na matriz. HAJLSLOVÁ e

colaboradores, 2003, verificaram que quanto menor a concentração do analito na

amostra, maior será o efeito da matriz.

8.8. Resultados dos Valores de Recuperação em Análises p or HPLC-UV

Para testes de comparação entre as análises por GC/MS/SIM e HPLC-UV foi

selecionado o sistema de MSPD constituído pelos sorventes alumina como suporte

sólido e C18 como co-sorvente com proporção porangaba/alumina (1:1, m/m) e

mistura de 30 mL dos solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v). Os resultados

de recuperação foram considerados satisfatórios pela utilização deste sistema de

MSPD.

80

Não foi obtida resposta cromatográfica por HPLC-UV do pesticida acefato em

coluna C18 com gradiente binário acetonitrila/água com uso de detector no UV-Vis,

pela menor sensibilidade deste nos comprimentos de ondas selecionados na faixa

de 220 a 800 nm. Os cálculos de recuperação foram feitos para os pesticidas

pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina com valores de recuperação variando

de 59,4 a 108,6% como mostra a Figura 14.

78,9

74,3 75

9798,9

59,4

95,9

105,6

77,2

108,6

92,9

65,3

0

20

40

60

80

100

120

1µg/g 0,5µg/g 0,3µg/g

Rec

uper

ação

Méd

ia (

%)

pirimicarbe clorprofam tetradifona bifentrina

Figura 14 . Ensaios de recuperação por MSPD com sistema alumina/planta

medicinal (1:1, m/m) e co-sorvente C18, com volume de 30 mL de mistura de

solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) e análise por HPLC-UV com

concentrações da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,3; 0,5 e

1,0µg/g.

81

A técnica de GC/MS/SIM se mostrou mais adequada para quantificação de todos

os pesticidas em extrato de porangaba pela característica universal do

espectrofotômetro de massas acoplado ao cromatógrafo a gás, destacando-se a

eficiência do método de extração por MSPD; No entanto com a utilização da técnica

de HPLC-UV foi obtido menor tempo de análise pela aplicação de eluição gradiente.

Em termos gerais as duas técnicas cromatográficas foram adequadas para cálculos

de quantificação dos pesticidas destacando de forma satisfatória os valores de

recuperação obtidos.

8.9. Validação do método

O desenvolvimento de um método analítico envolve um processo de avaliação

que estime sua eficiência na rotina do laboratório, demonstrando que o mesmo é

adequado para o propósito para o qual foi desenvolvido (LANÇAS, 2004). Este

processo de avaliação é chamado de validação. Um método será considerado validado se

suas características estiverem em conformidade com os pré-requisitos exigidos por

literaturas de referência na área.

Algumas definições de validação são citadas a seguir.

Segundo a ANVISA, a validação deve garantir, através de estudos

experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados. Validação é o ato ou efeito de validar,

dar validade, tornar válido, tornar legítimo ou legal. Visa a diminuir ou controlar os

fatores que levam à imprecisão ou inexatidão de um dado gerado (LANÇAS, 2004).

A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso

rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma

evidência documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para

fazer” (RIBANI, 2004).

Validar, em análise química, é estar com o objetivo voltado para a

confiabilidade analítica do laboratório e do método escolhido ou desenvolvido para se

obter o resultado (LEITE, 1998). Em análise de resíduos de pesticidas, a validação do

método de ensaio ocorre, usualmente, por meio de ensaios de recuperações

intralaboratorial, ou seja, no próprio laboratório onde se deseja validar o método.

82

Os principais parâmetros a serem estudados durante o processo analítico de

validação do método (LANÇAS, 2004) são:

a) Especificidade: capacidade de medir o analito “livre de interferências”;

b) Seletividade: capacidade de medir com exatidão e sem interferentes,

vários analitos em uma mistura;

c) Linearidade: capacidade de fornecer resultado proporcional à

concentração do padrão, em uma faixa de trabalho apropriada;

d) Sensibilidade: capacidade de registrar pequenas variações ou inclinações

da curva analítica provocadas pelo efeito da matriz;

e) Faixa de trabalho: intervalo de concentração entre o limite inferior e

superior dos padrões analisados;

f) Limite de detecção (LOD): capacidade do método em fornecer resultados

no nível mais baixo detectável qualitativamente, mas não

quantitativamente;

g) Limite de quantificação (LOQ): capacidade do método em fornecer

resultados no nível mais baixo detectável de forma precisa e exata,

qualitativa e quantitativamente;

h) Exatidão: capacidade de dar resultados próximos ao valor real verdadeiro;

i) Precisão: capacidade de dar resultados com a menor variabilidade em

relação à repetitividade (intralaboratorial) e reprodutibilidade

(interlaboratorial), de resultados analisados de uma mesma amostra;

j) Incerteza de medição: capacidade de dar resultados com a dispersão dos

valores que podem ser atribuídos razoavelmente ao mensurando.

83

Os parâmetros contemplados neste trabalho para a validação do método

analítico desenvolvido foram: exatidão (em termos de recuperação), precisão (em

termos do coeficiente de variação), linearidade (em termos de coeficiente de

correlação da curva analítica para uma dada faixa de concentração), sensibilidade

(em termos de limite de detecção e limite de quantificação).

EXATIDÃO

Os parâmetros exatidão e precisão são considerados os mais relevantes

porque permitem estimar os erros e as variações embutidos no resultado analítico.

Através dos termos exatidão e precisão a química desenvolve todo o potencial

analítico para emitir um resultado analítico (LEITE, 1998).

Exatidão expressa a concordância entre o valor encontrado e o valor aceito

como verdadeiro ou aceito como referência (LANÇAS, 2004). O ensaio de

recuperação constitui o método mais utilizado para validação de processos analíticos.

A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de

determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente

na amostra. A exatidão é expressa como erro sistemático percentual, inerente ao

processo (perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas

volumétricas imprecisas ou substâncias interferentes na amostra, entre outros)

(LEITE, 1998).

A recuperação é determinada pela relação:

Recuperação (%) = [valor obtido / valor adicionado] x 100

Estes estudos são efetuados adicionando-se soluções do padrão analítico de

interesse de concentração conhecida à matriz isenta do analito (usualmente

denominada testemunha). Efetuam-se as operações necessárias à recuperação do

analito (por exemplo, extração, purificação, concentração, etc.), e o valor do analito é,

então, determinado. Empregando-se esses valores na equação anterior, encontra-se

a recuperação, ou seja, quando do analito adicionado foi determinado no método

(LANÇAS, 2004).

84

As fortificações (adição de soluções com diferentes concentrações do analito

de interesse) na amostra de planta medicinal Cordia salicifolia, foram efetuadas em

três níveis nas concentrações de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g em uma série de sete replicatas

para cada nível. As recuperações dos pesticidas em amostras fortificadas de Cordia

salicifolia, nas concentrações de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g variaram de 58 a 130%, com

precisão variando de 5,24 a 29,7% para análises no GC/MS/SIM e valores de

recuperação na faixa de 59 a 108% com coeficientes de variação na faixa de 0,65 a

15,1% nos níveis de concentração de 0,3; 0,5 e 1,0µg/g para análises no HPLC-UV.

O método desenvolvido por MSPD e GC/MS/SIM apresentou valores

satisfatórios de recuperação na concentração de 0,5 µg/g. Os valores de

coeficientes de variação mais baixos são estabelecidos na concentração de 0,5

µg/g, dado a boa precisão em ensaios realizados nesta concentração. Resultados

de recuperação na faixa de 50 a 120% são aceitáveis para metodologias de

matrizes complexas (RIBANI, 2004), dentro da faixa de recuperação obtida nos

resultados mostrados nas Tabelas 11 e12.

Tabela 11. Valores de recuperarão média dos pesticidas e coeficientes de

variação no extrato de planta medicinal Cordia salicifolia por MSPD e GC/MS/SIM.

Pesticidas Fortificação (µg/g)

Recuperação média (%)

CV* (%)

acefato 0,5 0,3 1,0

68 ±11,7 86 ±15,9 63 ±11,8

12,1 29,7 15,8

clorprofam 0,5 0,3 1,0

113 ±11,7 116 ±17,3 130 ±17,5

8,67 10,6 11,3

pirimicarbe 0,5 0,3 1,0

98 ±14,3 118 ±20,6 81 ±7,54

12,2 12,4 7,8

bifentrina 0,5 0,3 1,0

99 ±19,4 95 ±24,7 84 ±6,36

16,4 26,0 6,6

tetradifona 0,5 0,3 1,0

104 ±6,47 109 ±26,9 82 ±10,8

5,2 24,1 11,0

fosalona 0,5 0,3 1,0

68 ±11,7 105 ±20,8 59 ±11,0

14,5 19,7 15,9

85

Tabela 12. Valores de recuperação média dos pesticidas e coeficientes de variação no extrato de planta medicinal Cordia salicifolia por MSPD e HPLC-UV.

Pesticidas Fortificação (µg/g)

Recuperação média (%)

CV* (%)

pirimicarbe 0,5 0,3 1,0

74 ±1,61 75 ±12,5 79 ±15,6

1,2 9,1 8,9

clorprofam 0,5 0,3 1,0

99 ±12,9 59 ±9,24 97 ±19,0

7,2 8,6

10,8 tetradifona 0,5

0,3 1,0

105 ±11,9 77±0,90 96±10,6

6,2 0,6

13,0 bifentrina 0,5

0,3 1,0

93 ±10,5 65 ±5,52 108 ±2,08

15,1 4,6 1,0

CV*: Coeficiente de variação.

PRECISÃO

A precisão é a expressão da concordância entre vários resultados analítica

obtidos para uma mesma amostra (LANÇAS, 2004). Pode ser determinada em

condições de repetibilidade ou reprodutibilidade. A repetitividade representa a

concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método,

efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas de repetitividade:

mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas

condições; mesmo local; repetições em um curto intervalo de tempo (RIBANI, 2004).

Reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições

de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de operador,

local, equipamentos, etc) (RIBANI, 2004). Precisão é um termo geral para avaliar a

dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma

amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas (INMETRO,

2003).

86

Segundo LANÇAS, 2004, o parâmetro que avalia a proximidade entre várias

medidas efetuadas na mesma amostra é a precisão do processo analítico.

Usualmente, é expressa como desvio-padrão, variância ou coeficiente de variação de

diversas medidas.

Precisão representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes,

repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições

definidas (RIBANI, 2004). Em validação de métodos, o número de determinações é

geralmente pequeno e o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s).

onde x é a média aritmética de um número de medições (média das determinações),

sendo uma estimativa de µ, a média verdadeira (média da população); xi é o valor

individual de uma medição e n é o número de medições.

A precisão também pode ser expressa através do intervalo de confiança da

média, que é uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade de

se encontrar um certo valor de uma variável (RIBANI, 2004), calculada pela equação:

Intervalo de confiança da média = x ± t n-1 s/

onde x é a média aritmética das medidas, s é o desvio padrão das medidas em

replicata (n = 4), t n-1 é o valor crítico da distribuição de Student com n-1

graus de liberdade ( 95% de confiança).

Outra expressão de precisão é através da estimativa do desvio padrão relativo

(RSD), também conhecido como coeficiente de variação (CV).

87

A repetividade do método foi determinada pelos coeficientes de variação

(CV%) das recuperações dos pesticidas conduzidos em cada nível fortificado (n =5),

usando a seguinte fórmula:

CV% = s.x/100

Onde:

s = desvio padrão das quatro recuperações conduzidas em cada nível.

x = média das recuperações em cada nível.

Os coeficientes de variação para cálculos de recuperação no presente estudo

variaram de 6,2 a 29,7% para análises realizadas em GC/MS e de 0,6 a 10,8% para

análises em HPLC-UV.

8.9.1. Estudo de Recuperação do Método

O método desenvolvido por MSPD e HPLC-UV apresentou valores satisfatórios

de recuperação nas concentrações de 0,5 e 1,0 µg/g. Os valores de coeficientes de

variação foram consideravelmente menores em relação às analises realizadas por

GC/MS/SIM, porém valores mais elevados de CV podem ser verificados para o

pesticida tetradifona no nível de concentração de 1,0 µg/g e bifentrina no nível de

concentração de 0,5 µg/g. Coeficientes de variação maiores do que 20% podem ser

observados para ensaios de recuperação no menor nível de concentração pela

maior interferência de constituintes da matriz na eluição juntamente com os

pesticidas em MSPD, afetando na precisão do método (POOLE, 2007).

Os cromatogramas da solução padrão dos pesticidas na concentração de 1,0

µg/g, em solvente diclorometano e do extrato de Cordia salicifolia fortificado com

solução padrão de pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona

e fosalona no nível de concentração de 0,5 µg/g estão mostrados nas Figuras 17 e

18 respectivamente para análises realizadas no GC/MS/SIM.

88

Figura 17. Cromatograma obtido por GC/MS, da solução padrão de pesticidas em

diclorometano. 1 – acefato, 2 – clorprofam, 3 – pirimicarbe, 4 – cloropirifós, 5 –

bifentrina, 6 – tetradifona, 7 – fosalona na concentração de 1 µg/g. Para condições

cromatográficas de análise ver item 6.8.

Figura 18. Cromatograma obtido por GC/MS, no modo SIM, com extrato obtido de

Cordia salicifolia, utilizando C18 como co-coluna e alumina como suporte sólido na

proporção (1:1, m/m), com eluição em MSPD feita com 30 mL de mistura

ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com concentração de solução padrão dos

pesticidas de 0,5 µg/g. 1 – acefato, 2 – clorprofam, 3 – pirimicarbe, 4 – bifentrina, 5 –

tetradifona, 6 – fosalona. Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.

89

Os cromatogramas da solução padrão dos pesticidas na concentração de 1,0

µg/g em solvente acetonitrila e do extrato de Cordia salicifolia fortificado com

solução padrão de pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina na

concentração de 0,3 µg/g estão mostrados na Figura 19 para análises realizadas no

HPLC-UV.

Figura 19. Cromatograma obtido por HPLC-UV no comprimento de onda de 254 nm

de solução padrão de pesticidas com concentração de 1,0 µg/g em acetonitrila.

pirimicarbe, 4,4 min; clorprofam, 5,1 min; tetradifona, 5,5 min; bifentrina, 10,4 min,

Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.1.

8.9.2. Linearidade

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração da substância em questão, dentro de uma

dada faixa de aplicação (RIBANI, 2004). A faixa linear de cada analito foi

determinada a partir de um conjunto de medições experimentais, usando o método

matemático da regressão linear, obtendo-se o coeficiente de correlação r. A

Agência Nacional de Vigilância Sanitária recomenda um coeficiente de correlação

igual a 0,99 como uma evidência de um ajuste ideal dos resultados para a linha de

regressão (ANVISA, 2008). Os valores das faixas de trabalho para todos os

pesticidas foram de 0,1 a 5 µg/g por GC/MS/SIM e HPLC-UV preparados no extrato

da planta medicinal Cordia salicifolia.

90

As Tabelas 13 e 14 apresentam os respectivos valores dos coeficientes de

correlação e equações de regressão linear de cada pesticida estudado por

GC/MS/SIM e HPLC-UV.

Tabela 13. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os

pesticidas preparados no extrato da matriz e analisados por MSPD e GC/MS/SIM da

Shimadzu modelo 5050A. Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.

Pesticidas Linearidade (µg/g)

Coeficiente de correlação r

Equação da reta

acefato 0,1-5,0 0,9989 y=519026x - 13471 clorprofam 0,1-5,0 0,9993 y=290141x - 34813 pirimicarbe 0,1-5,0 0,9985 y=361613x - 10300

bifentrina 0,1-5,0 0,9984 y=304031x - 20813 tetradifona 0,1-5,0 0,9989 y=394073x - 30410 fosalona 0,1-5,0 0,9993 y=234170x - 45103

Tabela 14. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os

pesticidas preparados no extrato da matriz e analisados por MSPD e HPLC-UV da

Shimadzu modelo Prominence. Para condições cromatográficas de análise ver item

6.8.1.

Pesticidas Linearidade (µg/g)

Coeficiente de correlação r

Equação da reta

pirimicarbe 0,1-5,0 0,9981 y=461613x - 10471 clorprofam 0,1-5,0 0,9971 y=391510x - 1481

tetradifona 0,1-5,0 0,9983 y=393246x - 33513 bifentrina 0,1-5,0 0,9986 y=415213x - 41919

91

8.9.3. Limites de Detecção e Limites de Quantificação para análises por

GC/MS/SIM e HPLC/UV.

8.9.4 Limite de Detecção (LOD)

Limite de detecção é a menor quantidade do analito que pode ser detectada no

cromatograma, mas não quantificada, com certo nível de confiança, utilizando-se um

determinado método analítico (LANÇAS, 2004).

O limite de detecção de cada um dos pesticidas estudados foi calculado através

do desvio padrão (n=7 replicatas para análises no GC/MS/SIM e n=5 replicatas para

análises realizadas no HPLC-UV) no menor nível de concentração da solução de

fortificação de cada analito (INMETRO, 2008). O cálculo do limite de detecção foi feito

através da relação mostrada abaixo.

LOD = t99%.s

A seguir na Tabela 15 os valores dos limites de detecção para os pesticidas

analisados por GC/MS/SIM e HPLC-UV.

Tabela. 15 . Valores dos limites de detecção do método para os pesticidas em

análises realizadas por GC/MS/SIM e HPLC-UV

Pesticidas LOD (mg/kg)

GC/MS/SIM

LOD (mg/kg)

HPLC- UV

acefato 0,07 -

clorprofam 0,03 0,03

pirimicarbe 0,02 0,04

bifentrina 0,02 0,08

tetradifona 0,03 0,07

fosalona 0,02 -

92

8.9.5. Limite de Quantificação (LOQ)

O limite de quantificação de um método representa a menor quantidade do

analito presente numa amostra que pode ser determinado com aceitáveis precisão e

exatidão sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é

uma característica de ensaios quantitativos, onde se espera baixos níveis de

concentração do analito. Os limites de quantificação foram calculados levando em

consideração sete replicatas de fortificação na planta medicinal em análises por

GC/MS/SIM e cinco replicatas de fortificação em análises por HPLC-UV, sendo que o

mesmo é estabelecido como dez vezes a estimativa do desvio padrão (INMETRO,

2008). Os limites de quantificação de cada pesticida foram calculados com base na

equação mostrada abaixo:

LOQ = 10. s. t99%.

A seguir na Tabela 16 os valores dos limites de quantificação para os pesticidas

analisados por GC/MS/SIM e HPLC-UV.

Tabela 16. Valores dos limites de quantificação dos pesticidas em análises

realizadas por GC/MS/SIM e HPLC-UV

Pesticidas LOQ (mg/kg)

GC/MS/SIM

LOQ (mg/kg)

HPLC- UV

acefato 0,3 -

clorprofam 0,1 0,4

pirimicarbe 0,4 0,25

bifentrina 0,4 0,1

tetradifona 0,3 0,3

fosalona 0,2 -

93

9. CONSIDERAÇÔES FINAIS

O método de dispersão da matriz em fase sólida com utilização de alumina

neutra como suporte sólido e C18 como co-sorvente na proporção 1:1, m/m, fazendo-

se uso de 30 mL de mistura de solventes ciclohexano/diclorometano, 1:3, v/v, foi

eficiente para extração dos pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina,

tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia e na retenção de

impurezas provenientes da planta medicinal, dado os valores satisfatórios de

recuperação obtidos pela utilização das técnicas de GC/MS/SIM e HPLC-UV

A técnica de GC/MS/SIM com os parâmetros de análise ajustados foi adequada

na identificação e quantificação dos pesticidas. Os resultados de recuperação foram

melhores na concentração de 0,5 µg/g variando de 68 ±11,7% a 130 ±17,5% dado a

melhor exatidão neste nível de concentração.

Valores de recuperação satisfatórios na faixa de 59 a 108% para os pesticidas

pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina, foram obtidos pela utilização da

técnica de HPLC-UV no comprimento de onda de 254 nm. As condições para

extração por MSPD foram otimizadas para obtenção de uma extração eficiente,

precisa e seletiva para os pesticidas analisados no presente estudo, com pouco

tempo de análise e pouca manipulação de solventes orgânicos. Em análises de

amostras reais de porangaba adquiridas no Mercado Municipal Talles Ferraz

localizado na cidade de Aracaju/SE foi possível concluir que as mesmas não

apresentavam contaminação pelos pesticidas selecionados no presente trabalho.

94

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