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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ALESSANDRA ALVES MARTINS HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO 2 Uberlândia – MG Agosto - 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE AGRONOMIA
ALESSANDRA ALVES MARTINS
HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO 2
Uberlândia – MG
Agosto - 2014
ALESSANDRA ALVES MARTINS
HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Curso de Agronomia,
da Universidade Federal de
Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheiro Agrônomo.
Orientadora: Nilvanira Donizete
Tebaldi
Uberlândia – MG
Agosto – 2014
ALESSANDRA ALVES MARTINS
HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS DE Pantoea ananatis
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Curso de Agronomia,
da Universidade Federal de
Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheiro Agrônomo.
Aprovado pela Banca Examinadora em 01 de agosto de 2014.
Profª. Drª. Maria Amelia dos Santos Eng. Agr. Lara Caroline Borges M. Mota
Membro da Banca Membro da Banca
_____________________________________
Profª. Drª. Nilvanira Donizete Tebaldi
Orientadora
RESUMO
A cultura do milho (Zea mays) tem grande importância econômica e social,
sendo usado em algumas regiões, como fonte energética única para a alimentação
humana. A incidência e severidade de patógenos são os principais fatores limitantes de
produção da cultura. A mancha branca do milho, causada pela bactéria Pantoea
ananatis, é uma doença que afeta a cultura gerando uma perda média de 60% na
produção de grãos. As plantas infestantes podem ser hospedeiras alternativas da
bactéria, atuando como fonte de inóculo e facilitando o crescimento e sobrevivência do
patógeno. O presente trabalho tem como objetivo avaliar possíveis hospedeiros
alternativos da bactéria Pantoea ananatis entre plantas invasoras da cultura do milho.
As plantas infestantes, capim braquiária (Urochloa decumbens), capim colchão
(Digitaria horizontalis), capim colonião (Panicum maximum), capim carrapicho
(Cenchrus echinatus), caruru (Amaranthus deflexus) e guanxuma (Malvastrum
coromandelianum), e as plantas cultivadas, café (Coffea arábica) e milho, foram
inoculadas com isolados de P.ananatis provenientes de café (UFU D3 e UFU D27) e de
milho (UFU B13), na concentração de 108 UFC mL
-1, quando as plantas apresentavam
de duas a três folhas. As plantas foram mantidas em câmara úmida 24 horas antes e após
a inoculação, sendo que esta foi realizada via aspersão, aplicando em ambas as páginas
da folha. As plantas foram avaliadas aos 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias, quanto a
incidência e severidade da doença através de uma escala de nota. As plantas com
sintomas de mancha branca tiveram a bactéria isolada. Conclui-se que as plantas de
capim braquiária, capim colchão, capim colonião, capim carrapicho e caruru foram
hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis, com exceção da guanxuma.
Palavras-chave: diagnose, mancha-branca, etiologia.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 5
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 7
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 10
3.1. Obtenção do inóculo e preparo de suspensão bacteriana ................................ 10
3.2. Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis .......................... 10
3.3. Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos .................. 12
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 14
4.1. Avaliação dos genótipos de Pantoea ananatis em hospedeiros alternativos. .. 14
4.2. Índice de doença da mancha branca.............................................................. 17
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 20
6. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 21
APÊNDICE A............................................................................................................. 26
5
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos maiores produtores de milho (Zea mays L.) do mundo,
ocupando a terceira posição no ranking, sendo superado pelos Estados Unidos e a
China. As maiores regiões produtoras são o Sul do país, com cerca de 37,2% da
produção nacional, e o Centro-Oeste, com 30,6% (CONAB, 2013). O estado do Paraná
é o maior produtor (22,5%), seguido pelos estados do Mato Grosso (13,4%) e o estado
de Minas Gerais (11,5%).
A cultura do milho apresenta extrema importância econômica, pois é
caracterizada pelas diversas formas de sua utilização, abrangendo desde alimentação
animal até as indústrias de alta tecnologia. O uso do milho em grão para alimentação
animal representa a maior parte do consumo deste cereal, sendo destinado de 60 a 80%
da produção no Brasil para esta atividade (EMBRAPA, 2000).
Além da importância econômica, o cultivo do milho está relacionado
diretamente ao aspecto social, pois grande parte de sua produção é destinada à
subsistência. Segundo o IBGE (2012), mais da metade dos produtores de milho
consomem a produção na própria propriedade, sendo que em algumas regiões
brasileiras, como o semiárido nordestino, o milho é usado como fonte energética
exclusiva na alimentação humana.
A necessidade de uma produção intensa da cultura do milho, exige que sejam
feitas semeaduras antecipadas sob irrigação, semeaduras na safra de verão e safrinha
(PEREIRA et al., 2005). Com isso, houve uma modificação na dinâmica populacional
dos patógenos que prejudicam a cultura do milho, tendo um aumento na incidência e na
severidade de doenças nas regiões produtoras da cultura (LANZA, 2009). Segundo
Gonçalves (2012), as principais doenças foliares que afetam a cultura do milho são a
cercosporiose, ferrugem polissora, ferrugem comum, ferrugem tropical ou ferrugem
branca, helmintosporiose, mancha de diplodia e a mancha branca do milho.
A mancha branca, causada pela bactéria Pantoea ananatis (Serrano 1928)
Mergaert et al., 1993 destaca-se como uma das mais importantes doenças que atacam a
cultura do milho.
A doença encontra-se distribuída em praticamente todas as regiões produtoras de
milho do país, sendo que as perdas provocadas por esta podem ultrapassar 60% da
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produção (FERNANDES; OLIVEIRA, 2000). Os sintomas iniciam-se pelo
aparecimento de lesões foliares aquosas com formato circular, do tipo anasarca, de
coloração verde-claro que depois se tornam necróticas de cor palha. Em ataques mais
severos há coalescência de lesões (FERNANDES; OLIVEIRA, 2000).
A bactéria Pantoea ananatis apresenta diversos hospedeiros como o melão,
cebola (WALCOTT et al., 2002), arroz (TABEI et al., 1988), tomate e pode sobreviver
em folhas de plantas daninhas (GONÇALVES et al., 2010), dificultando assim o seu
controle.
Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo verificar hospedeiros
alternativos da bactéria Pantoea ananatis entre plantas invasoras da cultura do milho.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
A cultura do milho (Zea mays L.) é um dos cereais mais produzidos no mundo,
devido à importância na cadeia alimentar (LANZA, 2009). Segundo a CONAB (2013),
no Brasil a produção de milho apresentou um acréscimo de 8,8% em relação ao ano de
2012, tendo assim a produção de 79.077,9 mil toneladas.
Além disso, em 2012 o Brasil exportou, aproximadamente, 20 milhões de
toneladas de milho, alcançando a segunda posição mundial em exportação. Os
principais mercados de destino das exportações foram a China, Estados Unidos e
Argentina (CONAB; ABRAMILHO, 2012).
A produção de milho tem se caracterizado pela divisão de duas épocas de plantio
conhecidas como safra e safrinha, sendo o período de safra feito durante o período
chuvoso e a safrinha entre os meses de janeiro e abril. A safrinha apresenta menor
produção, pois o plantio é realizado em uma época com condições climáticas
desfavoráveis ao crescimento da cultura do milho (EMBRAPA, 2006).
O cultivo intenso da cultura do milho em diversas áreas do Brasil tem
aumentado a incidência de doenças, pois, segundo Lanza (2009), a expansão da
fronteira agrícola, plantio de safra e safrinha, aumento no uso de sistemas de irrigação,
ausência de rotação de cultura e uso de materiais suscetíveis tem causado mudanças na
dinâmica populacional dos patógenos. Com isso, há um aumento expressivo na
incidência e severidade de patógenos que prejudicam a cultura do milho, sendo estes
muitas vezes considerados como o principal fator limitante de produção no milho.
A mancha branca do milho destaca-se como sendo uma das mais importantes
doenças que afetam a cultura, sendo esta encontrada e disseminada em praticamente
todas as regiões onde o milho é cultivado (FERNANDES; OLIVEIRA, 1997; FANTIN,
1994). A doença antes de 1990 não apresentava grande importância, pois geralmente, só
aparecia no final do ciclo da cultura. Mas a mancha branca tem afetado plantas mais
jovens, podendo levá-las à seca prematura e gerar uma perda de cerca de 60% na
produção de grãos (BALMER; PEREIRA, 1987; GODOY et al. 2001).
A bactéria Pantoea ananatis é o agente causal da mancha branca do milho. No
entanto, inicialmente acreditava-se que a doença era causada por um fungo ascomiceto
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Phaeosphaeria maydis (FANTIM, 1994), assim como por outros fungos obtidos em sua
lesão. Através de testes de patogenicidade e reisolamento do patógeno proveniente de
lesões produzidas por inoculação artificial em casa de vegetação, Paccola-Meirelles et
al. (2001) comprovaram que a bactéria é realmente o agente causal da mancha branca
do milho.
Pantoea ananatis é uma bactéria gram negativa, não esporulante, com respiração
do tipo anaeróbica facultativa, ou seja, é uma bactéria fermentativa (GONÇALVES,
2012). Os sintomas da mancha branca caracterizam-se pela presença inicial de anasarcas
circulares, aquosas e verde-claro que com o tempo tornam-se lesões necróticas, sendo
que estas se iniciam na ponta da folha progredindo para a base, e variam de tamanho de
acordo com o nível de resistência do material utilizado (LANZA, 2009; PACCOLA-
MEIRELLES et al., 2002). Em ataques severos, a bactéria pode causar sintomas na
palha da espiga, seca prematura das folhas e redução no tamanho e peso dos grãos
(OLIVEIRA et al. 2004).
Segundo Rocha e Paccola-Meirelles (2008), P. ananatis é uma bactéria epifítica,
com propriedades de nucleação do gelo que é um fenômeno onde há a formação de
cristais de gelo no conteúdo celular, levando ao rompimento e extravasamento deste,
sendo uma propriedade que pode ajudar a esclarecer o progresso do sintoma da doença
desde de lesões anasarcas, com aspecto encharcadas até o tecido vegetal necrótico com
coloração palha. A população da bactéria aumenta á medida que o milho atinge a fase
de pré-florescimento.
Além disso, a bactéria Pantoea ananatis apresenta um mecanismo conhecido
como “quorum – sensing”, que permite uma comunicação intercelular, permitindo a
percepção da densidade populacional entre as bactérias. Este mecanismo influencia na
sobrevivência, patogenicidade, virulência, produção de antibióticos, mobilidade das
bactérias na planta. Estas emitem sinais que permitem reconhecer o tamanho da
população e, caso esta seja diminuta, as bactérias passam a se agrupar, agindo como
único individuo (SAUER, 2010).
As condições favoráveis para o desenvolvimento da doença são de umidade
relativa alta, com cerca de 60%, e temperaturas amenas, em torno de 14ºC,
principalmente em épocas chuvosas (FANTIM, 1994). O cultivo do milho no Brasil é
realizado muitas vezes em épocas chuvosas, propiciando condições ideais para o
desenvolvimento da doença (FERNANDES; OLIVEIRA, 1997).
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A bactéria é disseminada pela ação de agentes bióticos, como homem, animais,
insetos, e por abióticos, como chuva, ventos e enxurradas. Quanto à sobrevivência,
P.ananatis é um micro-organismo que reside epifiticamente nas folhas, podendo causar
injúrias em seu hospedeiro (MENDES et al. 2011). Segundo Fernandes e Oliveira
(2000), o inóculo primário da bactéria pode ter origem nos restos culturais do milho, o
que dificulta o seu controle, pois ao realizar a semeadura direta o potencial do inóculo
poderá aumentar, sujeitando as lavouras de milho à ocorrência da doença com maior
severidade.
A P. ananatis causa doenças em diversas culturas como melão, cebola, aveia e
tomate (WEELLS et al., 1987; WATANABE et al., 1996; GITAITIS et al., 1997;
AZAD et al., 2000; COTHER et al., 2004). Na África do Sul, a bactéria foi identificada
causando seca dos ponteiros e manchas foliares em eucalipto (COUTINHO et al.,
2002).
Além destas culturas, foram encontradas lesões de P. ananatis em folhas de
capim-colchão, uma erva daninha que é muito comum em lavouras de milho. Segundo
Rocha e Paccola- Meirelles (2008), estas lesões apresentam uma variabilidade
morfológica semelhante à variabilidade descrita para diferentes genótipos de milho.
Sendo assim, acredita-se que esta erva daninha é um hospedeiro alternativo com alto
potencial para que a bactéria se desenvolva nas áreas de plantio do milho.
Os hospedeiros alternativos podem favorecer a sobrevivência da bactéria e
atuam como fonte de inóculo, tendo assim um papel fundamental no desenvolvimento
de doenças. O manejo integrado de doenças inclui a eliminação de hospedeiros
alternativos do patógeno em áreas produtivas como um dos métodos de controle
(NECHET et al., 2009).
As plantas daninhas, além de ser um dos fatores que mais afetam a agricultura,
competindo diretamente com a cultura por nutrientes, água e luz, se caracterizam como
um hospedeiro alternativo com grande potencial de crescimento para o patógeno
(LEITÃO FILHO, 1972). Bactérias com ampla gama de hospedeiros são de difícil
controle, como é o caso de P. ananatis e Ralstonia solanacearum (YABUUCHI et al.,
1995; LOPES et al., 1994).
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3. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em Casa de Vegetação e no Laboratório de
Bacteriologia Vegetal do Instituto de Ciências Agrárias (ICIAG) da Universidade
Federal de Uberlândia (UFU) no ano de 2014.
3.1. Obtenção do inóculo e preparo de suspensão bacteriana
Os isolados bacterianos de Pantoea ananatis utilizados no experimento, foram
provenientes de plantas de café (UFU D3 e UFU D27) originários de Romaria e
Indianópolis MG e de plantas de milho (UFU B13), originários de Planaltina de Goiás
GO, pertencentes à coleção de trabalho do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do
ICIAG/ UFU. Estes isolados foram cultivados em meio 523 (KADO & HESKETT,
1970).
A suspensão bacteriana foi preparada em solução de NaCl 0,85%, sendo ajustada
em espectrofotômetro para OD600=0,3, correspondendo a aproximadamente 1x108 UFC
mL-1
(MIRANDA, 2004).
3.2. Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis
O experimento foi conduzido em casa de vegetação onde foi feita a semeadura de
milho, o uso de mudas de café variedade Mundo Novo e seis espécies de plantas
invasoras (Tabela 1) em vasos de 500 mL. As mudas das plantas invasoras foram
coletadas nas entrelinhas de cafezais, na Fazenda Glória, com exceção do capim
colonião e capim carrapicho que foram coletadas as sementes, sendo transplantadas para
vasos em casa de vegetação. Após seis meses do plantio, quando estas plantas estavam
vigorosas e contendo de 2 a 3 folhas foi realizada a inoculação. A temperatura da casa
de vegetação foi mensurando.
Foram utilizados dois isolados de P. ananatis provenientes do café e um isolado
proveniente do milho para inoculação da bactéria nas plantas, descritos anteriormente.
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Tabela 1. Espécies de plantas utilizadas como hospedeiras de Pantoea ananatis.
Nome Comum Nome científico*
Café mundo novo Coffea arabica L
Capim braquiária Urochloa decumbens
Capim colchão Digitaria horizontalis
Capim colonião Panicum maximum
Capim carrapicho Cenchrus echinatus
Caruru Amaranthus deflexus
Guanxuma Malvastrum coromandelianum
Milho Zea mays
*Fonte: Lorenzi, (1990).
As plantas foram mantidas em câmara úmida 24 horas antes e após a inoculação
da bactéria. A inoculação foi feita por aspersão utilizando uma bombinha manual (100
mL) e o inóculo aplicado em ambas as páginas da folha.
O experimento foi realizado em esquema fatorial 8x3x4, onde foram utilizadas
oito espécies de plantas, inoculadas com três isolados de P. ananatis e quatro
repetições.
As plantas foram avaliadas aos 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias após a inoculação
quanto ao aparecimento de sintomas. Foram avaliadas a incidência e severidade da
doença através de uma escala de notas, onde:
- 0= planta sem sintomas;
- 1= até 25% da área da folha apresentando manchas;
- 2= 25% a 50% da área da folha com manchas;
- 3= mais de 50% da área da folha com manchas;
- 4= planta apresentando desfolha e seca.
Para ponderar a severidade da doença, foi aplicado o índice de McKinney
(1923), descrito pela seguinte fórmula:
ID (%) = ∑ ((f.v)/(n.x)) . 100
Em que:
ID = Índice de doença; f = Número de plantas com determinada nota; v = Nota
observada; n = Número total de plantas avaliadas; x = Grau máximo de infecção.
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Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância através do teste de
Tukey, a 0,05 de significância, e os dados transformados em √x+0,5, por meio do
programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).
3.3. Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos
Das plantas doentes com sintomas de mancha branca foi feito isolamento da
bactéria em meio de cultura 523 e os isolados caracterizados cultural e bioquimicamente
pelos testes de Gram em KOH 3%, oxidação ou fermentação da glicose e YDC.
3.3.1. Isolamento em meio 523
O isolamento da bactéria Pantoea ananatis foi feito a partir de lesões jovens
(tipo anasarca), em meio de cultura 523. Folhas coletadas foram lavadas e cortadas em
fragmentos de 0,5x 0,5cm desinfectadas com álcool etílico 70%, hipoclorito de sódio
2%, lavadas em água destilada esterilizada (PACCOLA-MEIRELLES et al.,2001) e
colocadas sobre o meio de cultura 523 e incubadas a 28ºC por cerca de 3 dias.
3.3.2. Teste KOH
O teste da reação ao hidróxido de potássio (KOH) é usado para confirmar se a
bactéria é Gram positiva ou negativa. O teste verifica a capacidade da parede bacteriana
da amostra em resistir à ação de lise provocada pelo contato com KOH (OLIVEIRA,
2000). Colocada uma gota de KOH 3% em uma lâmina para microscopia, coletou-se
parte de uma colônia presente em cultura na placa de meio 523 e colocou esta em
contato com a gota de KOH. Após dissolver a alíquota, levantasse-se a alça de
repicagem seguidas vezes por 30 segundos, observando se houve a lise da célula (Gram
negativa) formando um “fio” viscoso (BRASIL, 2010; OLIVEIRA, 2000).
3.3.3. Oxidação ou fermentação da glicose
O teste da oxidação ou fermentação da glicose (O/F) em meio Ágar Hugh &
Leifson permite determinar o uso da via oxidativa ou fermentativa da glicose. Em meio
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composto de 10g de dextrose e 1 mL de glicerol autoclavado, foi semeada a bactéria
oriunda de uma cultura com 24 a 48 horas de idade, com uma alça de platina aberta,
fazendo uma perfuração do meio pela alça, para que fosse feita a inoculação. Os tudo
são direcionados à incubadora, à temperatura de 28 ºC, mantendo estes de 1 a 3 dias na
mesma.
3.3.4. Teste em meio YDC
Para confirmação de que o isolado coletado dos hospedeiros utilizados trata-se de
Pantoea ananatis, foram realizados isolamentos destas em meio YDC. No caso desta
bactéria, as colônias formadas devem ser de coloração amarela e com aspecto liso. Os
isolados foram repicados, fazendo estrias simples sobre o meio e após 48 horas em
estufa à 28ºC, observou-se o crescimento da colônia.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Avaliação de hospedeiros alternativos de Pantoea ananatis
Após 21 dias da inoculação foram observados os sintomas da mancha branca em
café, capim braquiária, capim carrapicho, capim colchão, capim colonião, caruru e
milho, inoculados com os isolados UFU B13, UFU D3 e UFU D27 de Pantoea ananatis
(Tabela 2). Nas plantas de guanxuma não foram observados sintomas da doença.
Tabela 2 – Sintomas da mancha branca observados em diferentes hospedeiros, com
diferentes isolados de Pantoea ananatis. Uberlândia, MG, 2014.
Hospedeiros Isolados
UFU B13 UFU D3 UFU D27
Café - + -
Capim braquiária - + +
Capim carrapicho + - -
Capim colchão - + -
Capim colonião - + -
Caruru + - -
Guanxuma - - -
Milho + + -
(+) Sintomas observados; (-) Ausência de sintomas.
Das plantas com sintomas, os isolados bacterianos, que apresentaram colônias
amarelas brilhante com aspecto liso, com bordos regulares no meio 523, lise celular no
teste KOH, formando “fio viscoso” (Gram negativas), anaeróbica estrita e colônias
amarelas em YDC, foram considerados Pantoea ananatis (APÊNDICE A).
Segundo Lanza (2009), as colônias de Pantoea ananatis apresentam aspecto liso,
com colônias convexas e coloração amarela brilhante com bordos regulares.
As plantas de milho apresentaram sintomas característicos de mancha branca três
dias após a inoculação, com lesões inicialmente amareladas e circulares, tornando-se
necróticas (Figura 1A). Aos 21 dias após a inoculação, as manchas se mostravam com
aspecto palha, em diferentes tamanhos.
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Nas folhas de plantas de café (Figura 1B), os sintomas foram observados a partir
de 3 dias após a inoculação até o 18º dia, como sintomas iniciais de pequenas
pontuações amarelas, seguidas de elevações na face superior da folha.
O capim braquiária (Figura 1C) e capim colonião (Figura 1D) apresentaram
sintomas três dias após inoculação; capim colchão (Figura 1E) e capim carrapicho
(Figura 1F) apresentaram sintomas da mancha branca aos 6 e 9 dias após a inoculação,
respectivamente. Estes quatro capins apresentaram sintomas similares ao descrito para
as plantas de milho.
O hospedeiro caruru (Figura 1G) apresentou sintomas de mancha branca, porém
estes não se mostraram com os sintomas característicos da doença observados na cultura
do milho. Os sintomas apareceram seis dias após a inoculação, sendo pequenas
pontuações translúcidas, que se tornam brancas, com aspecto leitoso, com o passar do
tempo.
Diferente dos demais hospedeiros, a guanxuma não apresentou sintomas com a
inoculação dos diferentes isolados de Pantoea ananatis.
Figura 1. Sintomas da mancha branca, causada por Pantoea ananatis, em plantas de
milho (A), café (B), capim braquiária (C), capim colonião (D), capim
colchão (E), capim carrapicho (F) e caruru (G).
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Gonçalves et al., (2010) isolaram a bactéria Pantoea ananatis de pequenas lesões
foliares em capim colchão, planta típica nos campos de produção de milho; e realizaram
o teste de patogenicidade reproduzindo sintomas semelhantes aos causados na cultura
do milho quando inoculados em capim colchão, sob condições controladas em casa de
vegetação. Em condições de temperatura ideal, cerca de 15ºC e câmara úmida por 24
horas, houve maior incidência da doença.
Segundo Gonçalves (2012), o capim colchão é uma das plantas mais comuns nas
lavouras de milho quando em sucessão com o próprio milho safrinha ou culturas em
plantio direto, sendo um hospedeiro preocupante da bactéria.
Além disso, Silva et al. (2010) verificaram que os isolados de Pantoea ananatis
obtidos de plantas de capim colchão foram patogênicos à diferentes híbridos de milho,
concluindo que o capim colchão é uma fonte de inóculo para a ocorrência de mancha
branca no milho.
Orozco (2004) inoculou Ralstonia solanacearum in vitro em diversas plantas
infestantes como o mastruz maria pretinha (Solanum americanum), beldroega
(Portulaca oleracea L.), caruru (Amaranthus spp.), amendoim-bravo (Euphorbia
heterophylla L.), picão-preto (Bidens pilosa L.), capim colchão (Digitaria horizontalis).
Com exceção do capim colchão, todas as plantas infestantes mostraram potencial de
hospedeiro da bactéria, sendo que as raízes da maioria destas permitiram a colonização
de R. solanacearum, favorecendo a sobrevivência da bactéria com ou sem manifestação
de sintomas.
Além de plantas infestantes, o sorgo (Sorghum bicolor) também, é hospedeiro de
Pantoea ananatis (Silva et al., 2010). Isolados provenientes de milho e de capim
colchão foram inoculados em plantas de sorgo em casa de vegetação, gerando manchas
avermelhadas no limbo foliar que progrediram para lesões necróticas com bordos
vermelhos. Plantas de sorgo foram coletadas em campo, apresentando sintomas
semelhantes aos obtidos na inoculação artificial e, quando isoladas, tiveram crescimento
de colônias amarelas, confirmadas como P. ananatis.
Outras culturas de maior importância econômica também são consideradas
hospedeiras de P.ananatis. Em cebola (Allium cepa L.), a bactéria é transmitida por
tripes, causando podridão central e infectando naturalmente as sementes de cebolas.
Verificou-se também que a bactéria pode sobreviver e colonizar a superfície de plantas
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infestantes nos campos de produção de cebola, especialmente em áreas onde é utilizada
a rotação de culturas com a cultura do milho (GITAITIS et al., 2002).
No Japão, a bactéria foi encontrada na cultura melão, gerando podridão interna,
caracterizada por odor forte e coloração marrom ao redor da placenta dos frutos
cultivados em estufas comerciais (WEELLS et al., 1987).
Além disso, segundo Gonçalves (2012), outras espécies do gênero Pantoea foram
identificadas causando doenças tanto em milho, como em outras espécies cultivadas. A
bactéria Pantoea citrea foi identificada como agente da doença rosa do abacaxi,
formando compostos que tornam a coloração da polpa, suco e frutos rosa e marrom
avermelhada (CHA et al. 1997). Já a P. agglomerans foi relatada no México como
causadora de murchas vasculares e crestamento foliar no milho e sorgo e, nos Estados
Unidos, como causadora de podridão de bulbos e crestamento foliar em cebola (EDENS
et al., 2006).
4.2. Índice de doença da mancha branca
Para o índice de doença da mancha branca do milho (Tabela 3), o isolado UFU
D3, proveniente de plantas de café, foi o mais patogênico em relação aos hospedeiros
analisados. Os hospedeiros, capim colchão e capim colonião (26,56%) apresentaram os
maiores índices de doença, seguido pelas plantas de milho (23,44%).
O isolado D3 de Pantoea ananatis mostrou mais agressivo que os demais, sendo
patogênico há um maior número de hospedeiros, desenvolvendo-se em café, capim
braquiária, capim colchão, capim colonião e milho.
Apesar do isolado UFU D3 ter apresentado maior índice de doença, este não foi
patogênico a todos os hospedeiros. Capim carrapicho e caruru foram identificados como
hospedeiros, porém foram infectados apenas pelo isolado UFU B13. Diante disto, é
importante a utilização de diferentes isolados, provenientes de culturas distintas para a
inoculação de plantas. Cada isolado atua diferentemente no hospedeiro, devido à sua
diversidade genética. Os diferentes isolados bacterianos utilizados proporcionaram
diferentes resultados aos hospedeiros. A restrição de utilizar apenas um isolado poderia
gerar falsos resultados, desconsiderando a espécie como hospedeiro alternativo da
bactéria Pantoea ananatis.
18
Tabela 3. Índice de doença da mancha branca do milho, causada por Pantoea ananatis
em diferentes hospedeiros com diferentes isolados. Uberlândia, MG, 2014.
Hospedeiro Isolado Índice de doença (%)
Café UFU D3 17,19 a
Capim braquiária UFU D3 21,88 a
UFU D27 9,38 b
Capim carrapicho UFU B13 3,13 b
Capim colchão UFU D3 26,56 a
Capim colonião UFU D3 26,56 a
Caruru UFU B13 6,25 b
Milho UFU B13 12,50 a
UFU D3 23,44 a
Média dos Isolados UFU B13 UFU D3 UFU D27
2,73 B 14,45 A 1,17 B
CV(%) 61,84
Médias seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não diferem
estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 0,05 de significância.
Segundo Gonçalves et al. (2010) os isolados bacterianos utilizados em testes de
agressividade, devem ser selecionados a partir do estudo de variabilidade genética do
patógeno, tendo assim, uma maior representatividade do quanto este é suscetível ao
mesmo em diferentes ambientes de cultivo. Uma das formas de analisar a variabilidade
genética de patógenos é o uso de marcadores moleculares.
Nakatani (2009) analisando a variabilidade genética de Xanthomonas axonopodis
pv. passiflorae observou uma variabilidade na agressividade de diferentes isolados em
relação ao maracujá azedo, recomendando o uso de isolados mais agressivos pelo fato
19
de que assim é proporcionado maior rigor na seleção de genótipos resistentes e
suscetíveis.
Conhecendo os hospedeiros alternativos de mancha branca é possível evitar
rotações de culturas e aumentar o cuidado com a eliminação de plantas infestantes,
impedindo que estas sejam uma fonte de inóculo primário para a próxima estação de
cultivo da cultura hospedeira (NASCIMENTO et al., 2004; SIKIROU; WYDRA, 2004).
20
5. CONCLUSÕES
Plantas de café, capim braquiária, capim colchão, capim colonião, capim
carrapicho e caruru foram hospedeiras alternativas de Pantoea ananatis, enquanto que
guanxuma não comportou-se como hospedeira da bactéria.
21
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26
APÊNDICE A
1. ISOLAMENTO EM MEIO 523
Figura 2: Isolamento das lesões e repicagem de colônias típicas.
2. TESTE KOH
Bactérias Gram-negativas, como Pantoea ananatis formam o fio viscoso e são
consideradas positivas no teste, pois sua parede bacteriana não é resistente a solução de
KOH 3% ocorrendo então lise celular (FIGURA 3). O DNA da bactéria entra em
contato com o reagente, formando o material viscoso evidenciado pela formação do fio.
Bactérias Gram-positivas não formam o fio viscoso e são consideradas negativas no
teste, pois sua parede é resistente à ação do reagente, não ocorrendo assim a lise celular
e seu material genético não é exposto ao KOH 3% (Oliveira, 2000).
Figura 3: Teste KOH positivo.
27
3. OXIDAÇÃO OU FERMENTAÇÃO DA GLICOSE
Pantoea ananatis é uma bactéria fermentativa. Sendo assim, nos tubos onde
houve crescimento bacteriano, houve a produção de ácido a partir da glicose, reduzindo
o pH e fazendo com que o meio adquira coloração amarela, indicando um resultado
positivo para o teste. Os tubos que mantiveram a coloração original do preparo da
mistura foram considerados como amostras com bactérias oxidativas e formam
descartados.
Figura 4: Realização do teste oxidativo/fermentativo, com resultados positivos e
negativos, respectivamente.
4. TESTE EM MEIO YDC
Após 48 horas em estufa observou-se a formação de colônias amarelas de todos os
isolados utilizados (FIGURA 5), indicando que estes são provenientes da bactéria
Pantoea ananatis.
Figura 5: Colônias formadas em meio YDC.
