UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA ... · sulfamethoxazole (SMX), trimethoprim...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

DEMÉTRIUS FERNANDES DO NASCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM

PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS): APLICAÇÃO EM

ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA COMPARADA

FORTALEZA

2011






Tese submetida à coordenação do Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia, do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial

para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de

Moraes

Coorientadora: Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa

Maia

FORTALEZA

2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

N194q Nascimento, Demétrius Fernandes do.

Quantificação de fármacos com atividade antimicrobiana em plasma humano por

cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS):

aplicação em estudos de farmacocinética comparada / Demétrius Fernandes do Nascimento. –

2011.

212 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de

Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2011.

Área de Concentração: Farmacologia.

Orientação: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes.

Coorientação: Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia.

1. Espectrometria de Massas. 2. Sulfametoxazol. 3. Trimetoprima. 4. Sulfadiazina. 5.

Farmacocinética. 6. Ensaio Clínico. 7. Equivalência Terapêutica. I. Título.

CDD 615.1






Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: 31 de outubro de 2011.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________________

Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes – Orientadora

Universidade Federal do Ceará – UFC

__________________________________________________________________

Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia – Coorientadora

Universidade Federal de Pernambuco – UFPE

__________________________________________________________________

Profa. Dra. Gilmara Silva de Melo Santana

Universidade de Fortaleza – UNIFOR

__________________________________________________________________

Profa. Dra. Aline Kércia Alves Soares

Universidade de Fortaleza – UNIFOR

__________________________________________________________________

Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra Brayner

Universidade Federal do Ceará – Campus Sobral

DEDICATÓRIA

DEDICATÓRIA

Dedico essa Tese a Deus, meus pais,

Ivonilde e José Benes, meus irmãos,

Dayves e Danielle, meus pequenos José

Eduardo, Ana Luísa e Gustavo e a todos

aqueles que de alguma forma

colaboraram para o meu crescimento

intelectual e pessoal.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ter me criado, ter me dado à oportunidade de aprender aquilo

que hoje sei e lembrar-me a cada dia que ainda preciso ser uma pessoa melhor.

À Minha Família, pelo carinho, apoio e dedicação durante a realização

deste trabalho e pelo entusiasmo em cada conquista.

À Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, minha orientadora, por ter me

recebido na Unidade de Farmacologia Clínica, como bolsista de iniciação científica

e posteriormente como aluno de pós-graduação, onde pude compartilhar de sua

amizade e de seus conhecimentos científicos que despertaram em mim o amor pela

Farmacologia Clínica. Tenha certeza que a sua orientação foi além da Tese.

Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, por colaborar sempre com seus

ensinamentos enriquecedores que muito contribuíram para o desenvolvimento deste

trabalho.

Ao Dr. Fernando Antônio Frota Bezerra, por estar sempre disposto a

transmitir seus conhecimentos, contribuindo bastante para o meu engrandecimento

acadêmico, bem como pela amizade e respeito desde a época da iniciação

científica.

À professora Dra. Maria Bernadete Sousa Maia, por colaborar sempre

com seus ensinamentos enriquecedores que muito contribuíram para o

desenvolvimento deste trabalho.

À professora Dra. Gilmara Silva de Melo Santana, a Gil, por compartilhar

de sua amizade, convívio e de tantos outros momentos importantes durante minha

vida acadêmica e crescimento pessoal e profissional tornando mais harmoniosa e

gratificante a conquista de mais uma etapa em minha vida.

À professora Dra. Aline Kércia Alves Soares por ter gentilmente aceitado

a participar da Banca Examinadora contribuindo para o engrandecimento do nosso

Trabalho. Pela amizade durante todos esses anos e grande contribuição no saber

científico.

À professora Mirna Marques Bezerra Brayner pela contribuição e por ter

gentilmente aceitado a participar da banca examinadora.

Professores do Curso de Pós-Graduação, por terem colaborado nessa

caminhada infindável pela busca de conhecimentos.

A minha grande amiga Ana Leite pelos puxões de orelha, valiosos

conselhos, amizade e companheirismo durante essa valiosa convivência além de

sempre estar disponível em todas as etapas deste trabalho.

Aos meus amigos, Ismael, Luciana, Raquel, Suellen, Fabrine, Ana

Paula, Deysi pelo incentivo, apoio e imensurável amizade durante todos esses anos

de convivência.

Em especial à minha eterna amiga e irmã Ismenia pela amizade,

companheirismo, cumplicidade, respeito e pelo apoio constante em todas as horas.

À Maria Tereza (Tê) pelo carinho e incentivo durante todo período de

graduação e pós-graduação.

À Andrea, Jonaina (Jô), Gilmara, Marina pela valiosa amizade e apoio

durante todo esse tempo de convivência e compartilhar comigo os sonhos e

angústias de nossa vida acadêmica.

À Fábia, Malu, Evanir, Raimundinho meu agradecimento a todos vocês

por terem colaborado na minha pesquisa científica, fazendo do trabalho diário um

ambiente mais ameno e alegre.

Aos amigos da Unidade de Farmacologia Clínica que direta ou

indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Aos amigos da Pós-Graduação e a todos que fazem o Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e Instituto Claude Bernard

(InCB), por ter colaborado financeiramente no desenvolvimento da pesquisa.

EPÍGRAFE

EPÍGRAFE

“Da terra, Deus criou os

remédios, e o homem de bom

senso não os despreza”.

Ecl. 38, 4-5

RESUMO

RESUMO

QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS): APLICAÇÃO EM ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA COMPARADA. Demétrius Fernandes do Nascimento. Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, 2011.

Foram desenvolvidos e validados dois métodos robustos, rápidos e sensíveis para a quantificação de sulfametoxazol (SMX), trimetoprima (TMP) e sulfadazina (SDZ) em plasma, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS). Os métodos envolveram extração líquido-líquido, com acetato de etila utilizando metoprolol e sulfametoxazol como padrões internos (PI). As separações cromatográficas foram realizadas utilizando colunas Genesis C18 100 x 2.1 mm, 4µ (sulfadiazina) e Genesis C18 150 x 4,6mm, 4µ (SMX + TMP), com sistemas de eluição constituídos por soluções de Metanol/Água (35/65, v/v) + 0,5 % Ácido Fórmico (sulfadiazina) e Metanol/água (45/55; v/v) + 0,5% Ácido Fórmico (SMX + TMP). As curvas de calibração foram lineares, nas faixas de 0,05 a 25 µg/mL (sulfadiazina), 0,5 a 100 µg/mL (SMX) e 0,02 a 3,5 µg/mL (TMP). As recuperações correspondentes às análises dos controles de qualidade foram de 66,8, 59 e 63,4 % para sulfadiazina; 67,7, 63,3 e 74,4% para SMX; 74,5, 70,5 e 78,1% para TMP. Os valores da recuperação referentes aos padrões internos sulfametoxazol e metoprolol foram de 66,2% e 76,8% respectivamente. As metodologias bioanalíticas validadas incluíram avaliação de precisão e exatidão intra e interlote, assegurando que estas estavam dentro de limites admissíveis. Os métodos foram aplicados com sucesso em estudos de biodisponibilidade comparativa de formulações contendo a associação de sulfametoxazol + trimetoprima (suspensão contendo 40 mg de SMX e 8 mg de TMP por mililitro) e de formulações contendo sulfadiazina (comprimidos de 500 mg) em voluntários sadios de ambos os sexos.

Palavras Chaves: CLAE-EM/EM, Sulfametoxazol, Trimetoprima, Sulfadiazina, Farmacocinética, Ensaios Clínicos, bioequivalência.

ABSTRACT

ABSTRACT

QUANTIFICATION OF DRUGS WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY COUPLED TO MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS): APPLICATION IN STUDIES OF COMPARATIVE PHARMACOKINETICS. Demétrius Fernandes do Nascimento. Adviser: Dr Maria Elisabete Amaral de Moraes. Thesis presented for the title of Doctor in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará. Fortaleza, 2011.

Two robust, fast and sensitive methods for quantification of sulfamethoxazole (SMX), trimethoprim (TMP) and sulfadiazine (SDZ) in plasma using high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed and validated. The methods involved liquid-liquid extraction with ethyl acetate using metoprolol and sulfamethoxazole as internal standards (PI). The chromatographic separations were performed using Genesis C18 column 100 x 2.1 mm, 4 microns (sulfadiazine) and Genesis C18 150 x 4.6 mm, 4 microns (SMX+TMP), with elution systems consisting of solutions of methanol/water (35/65, v/v) + 0.5% Formic Acid (sulfadiazine) and methanol/water (45/55, v/v) + 0.5% Formic Acid (SMX+TMP). Calibration curves were linear in the range from 0.05 to 25 mg/mL (sulfadiazine); 0.5 to 100 mg/mL (SMX) and 0.02 to 3.5 mg/mL (TMP). The recoveries corresponding to the analysis of quality controls were 66.8, 59 and 63.4% for sulfadiazine; 67.7, 63.3 and 74.4% for SMX; 74.5, 70.5 and 78.1% for TMP. The recovery values relating to internal standards sulfamethoxazole and metoprolol were 66.2% and 76.8% respectively. The validated bioanalytical methods included evaluation of precision and accuracy being the results within the required limits. The methods were successfully applied in studies of comparative bioavailability of formulations containing a combination of sulfamethoxazole-trimethoprim (suspension containing 40mg of SMX and TMP 8mg per milliliter) and formulations containing sulfadiazine (tablets 500 mg) in healthy volunteers of both sexes.

Key words: LC-MS/MS, Sulfamethoxazole, Trimethoprim, Sulfadiazine, Pharmacokinetics, Clinical Trials, Bioequivalence.

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema das fases de desenvolvimento de um medicamento .................. 35

Figura 2: Efeito da forma farmacêutica no Tmax da carbamazepina 200mg............... 52

Figura 3: Efeito da forma farmacêutica no Tmax do ibuprofeno 400mg ...................... 53

Figura 4: Efeito da alimentação no Cmax do saquinavir (Cápsulas de 200mg) .......... 55

Figura 5: Efeito da alimentação no Tmax do ritonavir (Cápsulas de 100mg). ............. 56

Figura 6: Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes

entre uma fase estacionária (líquido ou sólido) e uma fase móvel (líquido ou gás). . 60

Figura 7: Componentes essenciais de um sistema de cromatografia líquida de alta

eficiência. A) reservatório de fase móvel; B) bomba de alta pressão; C) injetor de

amostra; D) coluna cromatográfica; E) detector; F) sistema de aquisição de dados. 62

Figura 8: Esquema de extração líquido-líquido com utilização de funil de separação.

.................................................................................................................................. 64

Figura 9: Representação esquemática da fonte de “Electrospray”. ........................... 68

Figura 10: Esquema de funcionamento do filtro de massa quadrupolo. .................... 69

Figura 11: Esquema demonstrativo da fragmentação de compostos utilizando

espectrômetro de massa triplo-quadrupolo no modo de monitoramento de reação

múltipla (MRM). ......................................................................................................... 69

Figura 12: Estrutura química sulfametoxazol ............................................................ 70

Figura 13: Estrutura química trimetoprima ................................................................ 71

Figura 14: Estrutura química sulfadiazina ................................................................. 73

Figura 15: Esquema do procedimento de coleta de sangue e separação de amostras

plasmáticas. .............................................................................................................. 99

Figura 16: Esquema do procedimento de extração líquido-líquido (SMX+TMP). .... 108

Figura 17: Esquema do procedimento de extração líquido-líquido (sulfadiazina). .. 113

Figura 18: Esquema dos ensaios de estabilidade pós-processamento de para SMX

+TMP. ...................................................................................................................... 122

Figura 19: Esquema dos ensaios de estabilidade pós-processamento de para SDZ.

................................................................................................................................ 122

Figura 20: Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento de

descongelamento para SMX +TMP......................................................................... 123

Figura 21: Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento de

descongelamento para sulfadiazina. ....................................................................... 124

Figura 22: Esquema dos ensaios de estabilidade de curta duração para SMX + TMP

e sulfadiazina. ......................................................................................................... 125

Figura 23: Esquema dos ensaios de estabilidade de “master e working solutions”

para SMX + TMP. .................................................................................................... 126

Figura 24: Esquema dos ensaios de estabilidade de “master e working solutions”

para sulfadiazina. .................................................................................................... 126

Figura 25: Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração para SMX +

TMP. ........................................................................................................................ 127

Figura 26: Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração para sulfadiazina.

................................................................................................................................ 127

Figura 27: Representação gráfica da curva de calibração para sulfametoxazol y =

1,04x + 0,188; r2= 0,9976. ....................................................................................... 133

Figura 28: Representação gráfica da curva de calibração para trimetoprima y = 11,4x

+ 0,019; r2= 0,9980. ................................................................................................. 134

Figura 29: Cromatogramas representativos do plasma branco: (A) canal SMX, (B)

canal TMP, (C) canal metoprolol. ............................................................................ 135

Figura 30: Cromatogramas representativos do plasma contaminado com: (A) SMX –

1,5 µg/mL; (B) TMP – 0,06 µg/mL; (C) Metoprolol – 0,5 µg/mL. ............................. 137

Figura 31: Curva de concentração plasmática (µg/mL) versus tempo (h) para o

fármaco sulfametoxazol após a administração das formulações de SMX + TMP em

24 voluntários saudáveis. ........................................................................................ 148


fármaco trimetoprima após a administração das formulações de SMX + TMP em 24

voluntários saudáveis. ............................................................................................. 149

Figura 33: Representação gráfica da curva de calibração para sulfadiazina y =

0,292x + -0,00127; r2= 0,9988. ................................................................................ 154

Figura 34: Cromatogramas representativos do plasma branco: (A) canal

Sulfadiazina, (B) canal sulfametoxazol (PI). ............................................................ 156

Figura 35: Cromatogramas representativos do plasma contaminado com: (A)

sulfadiazina – 0,15 µg/mL; (B) sulfametoxazol – 5 µg/mL. ...................................... 157

Figura 36: Curva de concentração plasmática (µg/mL) versus tempo (h) para

sulfadiazina após a administração das formulações em 24 voluntários saudáveis. 166

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características farmacocinéticas sulfametoxazol e trimetoprima .............. 73

Tabela 2: Características farmacocinéticas da sulfadiazina ...................................... 75

Tabela 3: Materiais utilizados nas etapas clínicas. .................................................... 82

Tabela 4: Equipamentos utilizados nas etapas clínicas. ........................................... 83

Tabela 5: Materiais utilizados para quantificação dos fármacos. .............................. 83

Tabela 6: HPLC utilizado para quantificação dos fármacos. ..................................... 84

Tabela 7: Espectrômetro de Massa utilizado para quantificação dos fármacos. ....... 84

Tabela 8: Padrões Analíticos utilizados para quantificação dos fármacos. ............... 84

Tabela 9: Reagentes utilizados na quantificação de SMX+TMP. .............................. 85

Tabela 10: Reagentes utilizados na quantificação de sulfadiazina. .......................... 85

Tabela 11: Descrição das formulações de Sulfametoxazol+Trimetoprima. ............... 96

Tabela 12: Descrição das formulações de Sulfadiazina. ........................................... 97

Tabela 13: Delineamento cruzado 2x2. ..................................................................... 97

Tabela 14: Cronograma de coleta de amostras dos fármacos estudados. ............... 98

Tabela 15: Parâmetros Farmacocinéticos determinados. ....................................... 103

Tabela 16: Parâmetros individuais de detecção dos íons monitorados por (MRM)

para SMX+TMP. ...................................................................................................... 106

Tabela 17: Preparo da curva de calibração para sulfametoxazol/trimetoprima. ...... 109

Tabela 18: Preparo dos controles de qualidade sulfametoxazol/trimetoprima. ....... 110

Tabela 19: Parâmetros individuais de detecção dos íons monitorados por (MRM)

para sulfadizina. ...................................................................................................... 112

Tabela 20: Preparo da curva de calibração para sulfadiazina. ................................ 115

Tabela 21: Preparo dos controles de qualidade sulfadiazina. ................................. 116

Tabela 22: Dados demográficos de todos os voluntários e por gênero ................... 132

Tabela 23: Análise intralote do limite de quantificação - sulfametoxazol ................. 138

Tabela 24: Análise intralote do limite de quantificação - trimetoprima ..................... 139

Tabela 25: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- sulfametoxazol .... 139

Tabela 26: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- trimetoprima ........ 140

Tabela 27: Estudo de estabilidade pós-processamento – SMX e TMP ................... 142

Tabela 28: Estudo de estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento

– SMX e TMP .......................................................................................................... 143

Tabela 29: Estudo de estabilidade de curta duração – SMX e TMP ....................... 144

Tabela 30: Estabilidade soluções estoque – SMX, TMP e Metoprolol .................... 145

Tabela 31: Estabilidade soluções de trabalho – SMX, TMP após 10 dias sob

refrigeração a 4ºC ................................................................................................... 146

Tabela 32: Estabilidade soluções de trabalho – SMX, TMP após 6horas de

temperatura ambiente ............................................................................................. 146

Tabela 33: Estabilidade de longa duração – SMX e TMP ....................................... 147

Tabela 34: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para SMX ....... 150

Tabela 35: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para TMP ........ 150

Tabela 36: Análise da bioequivalência entre as formulações estudadas ................ 151

Tabela 37: Dados demográficos de todos os voluntários e por gênero ................... 152

Tabela 38: Análise intralote do limite de quantificação - Sulfadiazina ..................... 158

Tabela 39: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- Sulfadiazina ......... 159

Tabela 40: Análise intra e interlote do controle de qualidade CQD- Sulfadiazina ... 160

Tabela 41: Estudo de estabilidade pós-processamento – Sulfadiazina .................. 162

Tabela 42: Estudo de estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento

– Sulfadiazina .......................................................................................................... 162

Tabela 43: Estudo de estabilidade de curta duração – Sulfadiazina ....................... 163

Tabela 44: Estabilidade soluções estoque – Sulfadiazina e sulfametoxazol ........... 164

Tabela 45: Estabilidade soluções de trabalho – Sulfadiazina após 14 dias sob

refrigeração a 4ºC ................................................................................................... 164

Tabela 46: Estabilidade soluções de trabalho – Sulfadiazina após 6horas de

temperatura ambiente ............................................................................................. 165

Tabela 47: Estabilidade de longa duração – Sulfadiazina ....................................... 165

Tabela 48: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para sulfadiazina

................................................................................................................................ 167

Tabela 49: Análise da bioequivalência entre as formulações estudadas ................ 168

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

% Porcentagem

Mais ou Menos

< Menor que

Menor ou igual a

m Micrometro

L Microlitro

oC Grau Celsius

ANOVA Análise de Variância

Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CNS Conselho Nacional de Saúde

COMEPE Comitê de Ética em Pesquisa da UFC

CV Coeficiente de Variação

DP Desvio Padrão

g Grama

g/dL Grama por Decilitro

L Litro

mg Miligrama

Min Minuto

mL Mililitro

mm Milímetro

MS Ministério da Saúde

nm Nanômetro

Nº Número

OMS Organização Mundial da Saúde

UFC Universidade Federal do Ceará

ASC Area Under the Curve

HPLC High Performance/Pressure Liquide Chromatography

Cmax Concentração Máxima

CQ Controle de Qualidade

CQA Controle de Qualidade Alto

CQB Controle de Qualidade Baixo

CQM Controle de Qualidade Médio

FDA Food and Drug Administration

ICH International Conference on Harmonization

IMC Índice de Massa Corporal

ISO Internacional Standard Organization

Ke Constante de eliminação

LQ Limite de Quantificação

MRM Monitoramento de reação múltipla

MS/MS Mass spectrometry

t1/2 Tempo da meia-vida plasmática

UNIFAC Unidade de Farmacologia Clínica

USP United States Pharmacopoeia

SUMÁRIO

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ............................................................................................................ 5

AGRADECIMENTOS .................................................................................................. 7

EPÍGRAFE ................................................................................................................ 10

RESUMO................................................................................................................... 12

ABSTRACT ............................................................................................................... 14

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 16

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. 19

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... 22

SUMÁRIO.................................................................................................................. 25

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 31

1.1 Considerações sobre qualidade Biofarmacêutica ou Biofarmacotécinica ..... 32

1.2 Fases do desenvolvimento de um medicamento .......................................... 34

1.3 Ensaios Clínicos ............................................................................................ 36

1.3.1 Classificação dos ensaios clínicos ............................................................ 37

1.3.1.1 Quanto à investigação ........................................................................ 37

1.3.1.2 Quanto á metodologia ........................................................................ 38

1.3.1.3 Quanto à alocação de tratamento ...................................................... 40

1.3.1.4 Quanto à finalidade ............................................................................ 41

1.4 Bioequivalência ............................................................................................. 44

1.4.1 Histórico .................................................................................................... 44

1.4.2 Relevância dos estudos de biodisponibilidade .......................................... 46

1.4.3 Inferência da Equivalência Terapêutica .................................................... 48

1.4.4 Planejamento de Ensaios de Bioequivalência .......................................... 49

1.4.4.1 Número de voluntários ....................................................................... 50

1.4.4.2 Sexo dos voluntários .......................................................................... 50

1.4.4.3 Tempos de coleta ............................................................................... 51

1.4.4.4 Forma Farmacêutica .......................................................................... 52

1.4.4.5 Efeito da alimentação ......................................................................... 53

1.4.4.6 Intervalo entre as administrações ....................................................... 56

1.4.4.7 Metodologia analítica.......................................................................... 56

1.4.4.8 Fármaco e/ou metabólito ativo na circulação a ser quantificado ........ 58

1.5 Considerações sobre análise físico-química de fármacos ............................. 59

1.5.1 Métodos Cromatográficos ......................................................................... 59

1.5.1.1 Classificação ...................................................................................... 60

1.5.1.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ............................................ 61

1.5.2 Métodos de extração de amostras ............................................................ 62

1.5.2.1 Extração Líquido-Líquido (ELL) .......................................................... 64

1.5.3 Espectrometria de Massa ......................................................................... 65

1.6 Sulfonamidas ................................................................................................. 70

1.6.1 Sulfametoxazol +Trimetoprima (SMX + TMP) ........................................... 70

1.6.1.1 Características químicas sulfametoxazol ........................................... 70

1.6.1.2 Características químicas trimetoprima ............................................... 71

1.6.1.3 Características gerais ......................................................................... 71

1.6.1.4 Características farmacocinéticas sulfametoxazol e trimetoprima ....... 72

1.6.2 Sulfadiazina .............................................................................................. 73

1.6.2.1 Características químicas .................................................................... 73

1.6.2.2 Características gerais ......................................................................... 74

1.6.2.3 Características farmacocinéticas ........................................................ 75

2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 77

3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 80

3.1 Objetivo Geral ............................................................................................... 80

3.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 80

4 METODOLOGIA .................................................................................................. 82

4.1 Materiais Utilizados ....................................................................................... 82

4.1.1 Etapa Clínica ............................................................................................. 82

4.1.2 Etapa Analítica .......................................................................................... 83

4.2 Protocolo Clínico ........................................................................................... 86

4.2.1 Delineamento dos estudos ........................................................................ 86

4.2.2 Seleção dos voluntários ............................................................................ 86

4.2.3 Sinais vitais ............................................................................................... 87

4.2.4 Exame cardiológico ................................................................................... 87

4.2.5 Exames laboratoriais ................................................................................ 87

4.2.6 Valores de referência dos exames laboratoriais ....................................... 88

4.2.7 Critérios de inclusão ................................................................................. 88

4.2.8 Critérios de exclusão ................................................................................ 89

4.2.8.1 Probelmas relacionados com os fármacos ......................................... 89

4.2.8.2 Doenças ou problemas de saúde ....................................................... 89

4.2.8.3 Hábitos ou dependências ................................................................... 90

4.2.8.4 Outras condições encontradas nos dias/meses que antecederam os

estudos ........................................................................................................... 90

4.2.9 Restrições e proibições antes, durante e após os estudos ....................... 91

4.2.9.1 Medicamentos .................................................................................... 91

4.2.9.2 Dieta ................................................................................................... 91

4.2.9.3 Outras restrições e proibições ............................................................ 92

4.2.10 Critérios para retirada do estudo ........................................................... 92

4.2.10.1 Por solicitação do voluntário ........................................................... 92

4.2.10.2 Por determinação do investigador ................................................... 93

4.2.11 Entrada do voluntário no estudo ............................................................ 93

4.2.12 Local e forma de confinamento dos voluntários .................................... 93

4.2.13 Horários de Jejum e Alimentação .......................................................... 94

4.2.14 Formulações estudadas ........................................................................ 96

4.2.15 Procedimento para randomização ......................................................... 97

4.2.16 Posologia ............................................................................................... 98

4.2.17 Coletas de sangue ................................................................................. 98

4.2.18 Avaliação da segurança ........................................................................ 99

4.2.19 Aspectos éticos .................................................................................... 101

4.2.19.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ............................... 102

4.2.20 Parâmetros Farmacocinéticos avaliados ............................................. 102

4.2.21 Análise Estatística ............................................................................... 103

4.3 Protocolo Analítico....................................................................................... 104

4.3.1 Sistema da Garantia da Qualidade e Biossegurança ............................. 104

4.3.2 Validação das metodologias bioanalíticas para quantificação dos analitos ..

................................................................................................................ 105

4.3.3 Validação pré-estudo para quantificação de sulfametoxazol+trimetoprima ..

................................................................................................................ 105

4.3.3.1 Padrão interno .................................................................................. 105

4.3.3.2 Condições de detecção no espectrômetro de massa ....................... 106

4.3.3.3 Condições cromatográficas .............................................................. 107

4.3.3.4 Extração das amostras (extração líquido-líquido) ............................ 107

4.3.3.5 Preparo das soluções padrões dos analitos e reagentes ................. 109

4.3.4 Validação pré-estudo para quantificação de sulfadiazina ....................... 111

4.3.4.1 Padrão interno .................................................................................. 111

4.3.4.2 Condições de detecção no espectrômetro de massa ....................... 111

4.3.4.3 Condições cromatográficas .............................................................. 112

4.3.4.4 Extração das amostras (extração líquido-líquido) ............................ 112

4.3.4.5 Preparo das soluções padrões dos analitos e reagentes ................. 114

4.3.5 Validação das metodologias bioanalíticas .............................................. 117

4.3.5.1 Determinação do limite de quantificação (LQ) .................................. 117

4.3.5.2 Curva de calibração/linearidade ....................................................... 118

4.3.5.3 Precisão e exatidão .......................................................................... 119

4.3.5.4 Precisão e exatidão intralote ............................................................ 119

4.3.5.4.1 Precisão e exatidão interlote ........................................................ 119

4.3.5.4.2 Precisão e exatidão intra e interlote do processo de diluição ....... 119

4.3.5.5 Especificidade .................................................................................. 120

4.3.5.6 Recuperação .................................................................................... 120

4.3.5.7 Estudo de estabilidade dos fármacos no fluido biológico ................. 120

4.3.5.7.1 Estabilidade Pós-processamento ................................................. 121

4.3.5.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento ...... 122

4.3.5.7.3 Estabilidade de curta duração ...................................................... 124

4.3.5.7.4 Estabilidade das soluções padrão ................................................ 125

4.3.5.7.5 Estabilidade de “Master Solution” (solução estoque) e “Working

solution” (solução de trabalho) .................................................................... 125

4.3.5.7.6 Estabilidade de longa duração ..................................................... 127

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 129

5.1 Considerações Gerais ................................................................................. 129

5.2 Sulfametoxazol + Trimetoprima ................................................................... 131

5.2.1 Etapa Clínica ........................................................................................... 131

5.2.2 Desenvolvimento e validação do método bioanalítico para quantificação

simultânea de sulfametoxazol e trimetoprima ................................................... 132

5.2.2.1 Linearidade do método ..................................................................... 132

5.2.2.2 Seletividade do método .................................................................... 135


5.2.2.4 Recuperação do método .................................................................. 140

5.2.2.5 Estabilidade dos analitos no fluido biológico .................................... 141

5.2.3 Aplicação da metodologia bioanalítica em estudo de farmacocinética

comparada ........................................................................................................ 148

5.3 Sulfadiazina ................................................................................................. 152

5.3.1 Etapa Clínica ........................................................................................... 152

5.3.2 Desenvolvimento e validação do método bioanalítico para quantificação de

sulfadiazina ....................................................................................................... 153

5.3.2.1 Linearidade do método ..................................................................... 153

5.3.2.2 Seletividade do método .................................................................... 155


5.3.2.4 Recuperação do método .................................................................. 160

5.3.2.5 Estabilidade do analito no fluido biológico ........................................ 161

5.3.3 Aplicação da metodologia bioanalítica em estudo de farmacocinética

comparada ........................................................................................................ 166

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 170

7 CONCLUSÃO .................................................................................................... 173

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 175

9 GLOSSÁRIO ..................................................................................................... 192

APÊNDICE 01 ......................................................................................................... 197

APÊNDICE 02 ......................................................................................................... 198

APÊNDICE 03 ......................................................................................................... 199

APÊNDICE 04 ......................................................................................................... 200

APÊNDICE 05 ......................................................................................................... 201

APÊNDICE 06 ......................................................................................................... 202

APÊNDICE 07 ......................................................................................................... 203

APÊNDICE 08 ......................................................................................................... 208

INTRODUÇÃO

31

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, o grande avanço da tecnologia modificou o

conceito de considerar um medicamento eficaz clinicamente apenas assegurando

seu controle de qualidade, o que incluía somente o conhecimento das

propriedades físicas e físico-químicas do fármaco. Até então não havia

preocupações em relação ao comportamento da forma farmacêutica no

organismo. Entretanto, várias evidências demonstram que os componentes da

formulação e as técnicas de fabricação podem dar origem a um medicamento

ineficaz ou até mesmo tóxico (ABDOU, 1989).

Com o avanço das pesquisas científicas, a qualidade dos

medicamentos passou a ser associada também aos aspectos farmacotécnicos,

denominando-se de qualidade biofarmacêutica ou biofarmacotécnica. Desta

forma, tornou-se evidente que além de fabricar um medicamento tecnicamente

perfeito, é indispensável que a forma farmacêutica libere o fármaco na quantidade

e na velocidade adequadas ao objetivo terapêutico do produto, o que está

diretamente relacionado à sua biodisponibilidade (SHARGEL & YU, 1993;

STORPIRTIS, 1999).

Além disso, deve-se levar em conta que medicamentos contendo a

mesma quantidade de princípio ativo e excipientes não necessariamente

apresentam o efeito terapêutico na mesma intensidade, uma vez que alterações

na rota de síntese do fármaco podem provocar alterações nas características

físico-químicas do fármaco e das substâncias empregadas na formulação e na

tecnologia de fabricação, podendo ter influência significativa na biodisponibilidade

do princípio ativo, comprometendo a eficácia clínica do produto (ZHANG et al.,

2004).

Nesse sentido, os estudos de farmacocinética comparada realizados de

acordo com as Boas Práticas Clínicas (BPC) e de Laboratório (BPL), são

fundamentais para garantir que as formulações estudadas apresentarão o mesmo

desempenho no organismo em relação à biodisponibilidade, expressa em termos

32

da quantidade absorvida do fármaco, a partir da forma farmacêutica administrada,

e da velocidade do processo de absorção (STORPIRTIS & CONSIGLIERI, 1995;

SHARGEL & YU, 1999; STORPIRTIS, 1999; CONSIGLIERI & STORPIRTIS,

2000).

1.1 Considerações sobre qualidade Biofarmacêutica ou Biofarmacotécnica

Uma das qualidades mais impressionantes dos fármacos é a

diversidade de ações e efeitos sobre o organismo.

A grande série de agentes medicinais eficazes disponíveis hoje

representa um dos maiores feitos do homem. Seria assustador conceber nossa

civilização sem agentes notáveis e benéficos. Com seu uso, muitas doenças que

afligem a humanidade através da história, como a varíola e a poliomielite, estão

quase extintas atualmente. As doenças como diabetes, hipertensão e depressão

são controladas com eficiência, hoje, com os fármacos modernos. Os

procedimentos cirúrgicos seriam virtualmente impossíveis sem o benefício de

anestésicos, analgésicos, antibióticos, transfusões sanguíneas, líquidos e

nutrientes intravenosos (ANSEL et al., 2000).

O conceito de Biofarmácia ou Biofarmacotécnica surgiu na década de

70. Uma das primeiras definições data de 1973: “Estudo dos fatores que

influenciam a biodisponibilidade do fármaco no homem e nos animais e o uso

dessa informação para otimizar a atividade terapêutica e farmacológica dos

medicamentos em seu uso clínico” (AMIDON et al, 1995).

Shargel, Wu-Pong e Yu (2005) definiram Biofarmacotécnica como a

ciência que avalia a inter-relação das propriedades físico-químicas do fármaco e

da forma farmacêutica com a via de administração e velocidade e extensão de

absorção do fármaco na circulação sistêmica. Portanto, o estudo de

Biofarmacotécnica envolve:

33

A estabilidade do fármaco na forma farmacêutica;

A liberação do fármaco da forma farmacêutica;

A razão entre a velocidade de dissolução e a liberação do

fármaco no sítio de ação;

A absorção sistêmica do fármaco.

O estudo de Biofarmacotécnica é baseado em princípios científicos

fundamentais e metodologia experimental utilizando métodos in vitro (dissolução)

e in vivo (biodisponibilidade) (SHARGEL; WU-PONG; YU, 2005).

No desenvolvimento de um medicamento, diversos fatores

biofarmacêuticos devem ser levados em consideração tais como:

Considerações relacionadas à farmacodinâmica (objetivo

terapêutico, efeitos tóxicos, reações adversas);

Propriedades físico-químicas do fármaco;

Características relacionadas ao fármaco (farmacocinética,

biodisponibilidade, via de administração, forma

farmacêutica, dosagem);

Características relacionadas ao paciente (adesão à terapia,

custo do tratamento);

Características relacionadas à formulação (estabilidade,

custo, disponibilidade de matérias primas, processo de

fabricação).

Cada produto farmacêutico é uma formulação única. Além dos

princípios ativos, uma formulação também contém diversos componentes não

terapêuticos; os excipientes. É através de seu uso que uma formulação atinge sua

composição única e a aparência física característica. É composta por materiais

como diluentes, espessantes, veículos, agentes suspensores, revestimentos e

desintegrantes de comprimidos, agentes estabilizantes, conservantes,

flavorizantes, corantes e edulcorantes (HISTORY OF THE PHARMACOPEIA,

1995).

34

A relação entre o fármaco, a forma farmacêutica que o contém e a via

pela qual é administrado determina quanto e com que velocidade esse princípio

ativo entra na circulação sistêmica. Para que um fármaco seja eficaz é necessário

que uma quantidade suficiente dele chegue ao sítio ou sítios de ação e ali

permaneça pelo tempo suficiente para exercer o efeito farmacológico (ASHFORD,

2005).

A biodisponibilidade é um parâmetro relacionado ao processo de

absorção. Tal parâmetro tem grande importância para medicamentos que são

administrados por uma via em que ocorra o processo de absorção (oral,

intramuscular, subcutânea, transdérmica, retal, vaginal, etc.), ou seja, uma via

extravascular (ABDOU, 1989).

Diferenças em relação às características físico-químicas do fármaco e

demais componentes da formulação, bem como processos de fabricação

distintos, podem gerar diferenças de biodisponibilidade que, no caso de

medicamentos genéricos, podem comprometer a bioequivalência e

intercambialidade. Tal fato pode ser evitado realizando-se o desenvolvimento

farmacotécnico do produto de maneira adequada (KU, 2008).

1.2 Fases do desenvolvimento de um medicamento

O processo de desenvolvimento de um fármaco inicia-se com a etapa

química, pois se busca seu planejamento e a melhor maneira de sintetizá-lo, com o

objetivo de produzi-lo de forma econômica para que se torne acessível à população.

Após a etapa química (síntese e determinação de suas características físico-

químicas), segue-se a etapa pré-clínica onde são realizadas diversas pesquisas em

culturas de células (ensaios in vitro), órgãos isolados (ensaios ex vivo) e em animais

experimentais (in vivo), nos quais se estuda o metabolismo, a eficácia e o potencial

de toxicidade do fármaco. Em seguida, realiza-se a fase clínica onde são realizadas

diversas pesquisas para verificar a segurança e a eficácia da utilização da

substância em seres humanos (MORAES & MORAES, 2000) (Figura 1).

35

Figura 1: Esquema das fases de desenvolvimento de um medicamento

Assim, para o desenvolvimento de um novo medicamento, desde sua

síntese até sua liberação para comercialização, tem-se a execução das seguintes

etapas:

Fase de Investigação Físico-Química e Farmacotécnica: envolve a

caracterização físico-química da molécula pesquisada, desenvolvimento de formas

farmacêuticas adequadas e determinação da estabilidade do fármaco (MORAES &

MORAES, 2000).

Farmacologia Experimental: estabelece as propriedades

farmacodinâmicas, farmacocinéticas, toxicológicas e possíveis efeitos teratogênicos,

mutagênicos e carcinogênicos em diversas espécies de animais. Visa conhecer a

farmacologia do fármaco para dar segurança e início aos estudos em humanos

(MORAES & MORAES, 2000).

36

Farmacologia Clínica: é a pesquisa realizada em seres humanos,

ocorrendo apenas após a aprovação nas etapas anteriores, que objetiva caracterizar

os aspectos farmacocinéticos, farmacodinâmicos, eficácia terapêutica, segurança e

reações adversas relacionadas ao fármaco (MORAES & MORAES, 2000).

1.3 Ensaios Clínicos

A impropriedade e ineficiência da terapêutica e o desconhecimento da

fisiopatologia das doenças levaram o escritor inglês Richard Gordon afirmar que a

História da medicina foi, em grande parte, até os fins do século passado, a

substituição da ignorância por mentiras. Somente depois que Claude Bernard, no

século XIX, formalizou os critérios para reunir informações baseadas na

experimentação é que a medicina passou a ser considerada uma ciência. Mesmo

assim, a aplicação destes critérios à terapêutica vinha sendo, até recentemente,

lenta e inconsistente. Embora os aspectos diagnósticos da medicina fossem

abordados com sofisticação científica, o valor terapêutico dos medicamentos era

determinado pela tradição de uso e o testemunho dos médicos. Em função disto, a

avaliação da descoberta e do aperfeiçoamento de novos medicamentos teve como

história um processo de risco e ineficiência (MORAES & MORAES, 2000).

Os ensaios clínicos seguem princípios éticos e científicos de

experimentação, e são os responsáveis pelas bases da avaliação de eficácia e

segurança de fármacos ou medicamentos. Os primeiros estudos de pesquisa clínica

controlada foram iniciados por Harry Gold em 1930, seguido por Amberson,

MacMahon e Pinner (1931), que introduziram os ensaios clínicos “simples cegos”

randomizados e controlados. Posteriormente, Harry Gold (1950) passou a adotar os

ensaios clínicos “duplos cegos”. Apesar disso, o termo Farmacologia Clínica,

referindo-se à investigação de fármacos em seres humanos somente foi introduzido

nos meios científicos em 1952. Na atualidade, a Farmacologia Clínica desenvolve

principalmente duas atividades: Estudos Farmacocinéticos e elaboração, execução e

análise de ensaios clínicos para verificar a segurança, qualidade e eficácia dos

medicamentos em seres humanos (MORAES & MORAES, 2000).

37

Neste sentido, um ensaio clínico pode ser dito como um teste

rigorosamente controlado de um novo fármaco ou um novo produto médico em

seres humanos (COBERT & BIRON, 2002). Sob o ponto de vista epidemiológico, é

um estudo experimental e prospectivo. A Agência Europeia para Avaliação de

Medicamentos define ensaio clínico como qualquer investigação em seres humanos,

objetivando descobrir ou verificar os efeitos farmacodinâmicos, farmacológicos,

clínicos e/ou outros efeitos de produto(s) investigado(s) e/ou identificar reações

adversas ao(s) produto(s) em investigação, com o objetivo de averiguar sua

segurança e/ou eficácia.

O investigador controla o agente terapêutico ou profilático, que é recebido

por cada participante do estudo. Os indivíduos são alocados, aleatoriamente, em

dois grupos designados: experimental e controle. Ao grupo experimental é oferecido

o fármaco sob teste, e ao grupo controle, um fármaco de referência ou placebo. Os

agentes empregados em ensaios clínicos podem ser medicamentos, cirurgias,

vacinas, dietas e outros procedimentos médicos (MORAES & MORAES, 2000).

1.3.1 Classificação dos ensaios clínicos

Dependendo do propósito em que se avalia o ensaio clínico, este pode ser

classificado em quatro aspectos: quanto à investigação, metodologia, alocação de

tratamento e finalidade.

1.3.1.1 Quanto à investigação

a) Estudos Unicêntricos

São estudos realizados em somente um local, como hospitais ou

complexo hospitalar, coordenados por um investigador ou por uma equipe de

investigação. O estudo pode se restringir a uma unidade hospitalar ou se estender a

outras unidades integrantes do complexo. Devido a esse fator, geralmente, há um

número reduzido de pacientes envolvidos no estudo, o que, muitas vezes, não

permitem evidenciar as possíveis diferenças entre os tratamentos (MORAES &

MORAES, 2000; SANTANA, 2003; SOARES, 2002; NASCIMENTO et al., 2010).

38

b) Estudos Multicêntricos

São estudos realizados por vários investigadores ou grupo de

investigadores, em centros independentes, efetuando a investigação em conjunto e

adotando um protocolo comum. Os ensaios multicêntricos são mais vantajosos do

que os unicêntricos porque o recrutamento de indivíduos é facilitado e as conclusões

são mais representativas e válidas, porém são mais difíceis de ser planejados e

coordenados. Esse tipo de estudo, envolvendo pesquisadores brasileiros e

internacionais, é regulamentado pela Resolução 292, de 08/07/99, do Conselho

Nacional de Saúde (SUKEKAVA et al., 2008; MORRIS, 2000; FEDOROV et al.,

2004; WORTHINGTON, 2004).

1.3.1.2 Quanto á metodologia

a) Estudos Não Controlados

A principal característica, que se torna um importante problema nesse

estudo, é a ausência de comparação entre um grupo controle e um grupo

experimental. A falta do grupo controle pode levar a conclusões errôneas sobre o

medicamento em estudo (MORAES & MORAES, 2000; SOARES et al., 2006;

TAVARES et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2009).

Esse tipo de estudo é empregado para estudar efeitos secundários,

alterações bioquímicas, após terapias em longo prazo, tolerância, interações e

eficácia dos fármacos.

b) Estudos Controlados

Os estudos controlados são caracterizados por permitirem uma

comparação estatisticamente aceitável entre resultados obtidos em um grupo tratado

com a substância em experimentação e grupo controle com a substância de

referência ou placebo. A possível influência do médico na seleção de voluntários

sadios ou pacientes é mínima, pois a alocação dos participantes do estudo é ao

acaso (MORAES & MORAES, 2000; NASCIMENTO et al., 2010; CUNHA 2010).

39

Existem quatro tipos principais de estudos controlados. São eles:

Estudos Abertos: tanto o participante do estudo quanto o investigador

conhecem o tipo de tratamento ou intervenção à qual foi selecionado. Utilizam-se

esses estudos para avaliação de técnicas cirúrgicas, dessensibilização de drogados

e fumantes, ensaios com alterações de estilo de vida e outros. Porém, pode haver

tendenciosidade, pois como é de conhecimento do observador em qual grupo o

participante se encontra, se torna difícil separar o efeito placebo (MORAES &

MORAES, 2000; SOARES et al., 2007; MAIA et al., 2007; MAIA et al., 2008).

Estudos Simples Cegos: são estudos nos quais o sujeito da pesquisa

(voluntário) desconhece a alocação dos grupos. O objetivo é neutralizar o efeito

placebo, pois o indivíduo não sabe se está tomando o medicamento novo, placebo

ou medicamento de referência. A organização e a monitorização desses ensaios são

mais fáceis e, algumas vezes, suficientes para reduzir os possíveis desvios quando

tratamentos diferentes são comparados (MORAES & MORAES, 2000; MOEINI et a.,

2011; KHEMIS et al., 2011; SEGATTO et a., 2011; NAMWANJE; KABATEREINE;

OLSEN, 2011).

Estudos Duplos Cegos: nesse caso, tanto o observador quanto o

participante desconhecem o grupo de estudo em que se está trabalhando, ou seja,

ambos não sabem se está se avaliando o efeito do medicamento de referência ou

placebo, ou se está avaliando o produto de estudo. São bem utilizados em estudos

de eficácia. Há redução nos vícios de seleção e garantia de objetividade dos

resultados. Contudo, há maior necessidade de organização e preparação de formas

farmacêuticas idênticas para o fármaco em estudo e a referência ou placebo

(MORAES & MORAES, 2000; BARROSO et al., 2006; SANTANA 2009;

CARVALHO, 2009; VIANA, 2011; CUNHA, 2011).

Estudos Triplos Cegos: são estudos sobre os quais o participante, o

observador e o investigador não conhecem os tratamentos. Somente o setor de

produção da indústria promotora da pesquisa conhece o conteúdo das formas

farmacêuticas. Tem com finalidade neutralizar o efeito placebo, a subjetividade do

observador e do investigador. Na análise dos resultados o investigador utilizará

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Namwanje%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kabatereine%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Olsen%20A%22%5BAuthor%5D

40

letras sem saber a que tratamento se refere (MORAES & MORAES, 2000;

SNIJDERS et a., 2011; PORTO et al., 2011; TAAVONI et al., 2011; KULKARNI et al.,

2011; PANDEY et al., 2010).

1.3.1.3 Quanto à alocação de tratamento

a) Ensaios Randomizados

São estudos nos quais o paciente é alocado ao grupo controle ou

experimental através de métodos estatísticos de randomização. Os métodos de

aleatorização ou randomização mais empregados são as tabelas de números

aleatórios e a randomização estratificada. A aleatorização é importante porque

elimina os vícios de seleção. Quando os indivíduos são alocados aleatoriamente aos

diferentes grupos, não há possibilidade de que preferências pessoais do

investigador, no que se refere a qual é o melhor tratamento para um determinado

paciente, venham a alterar os resultados do estudo (MORAES & MORAES, 2000;

SANTANA, 2009; VIANA, 2009; MAIA et al., 2007; MAIA et al., 2008; NASCIMENTO

et al., 2010).

b) Ensaios Não Randomizados

São ensaios nos quais a alocação do participante é realizada através de

um método sistemático predeterminado ou por decisão do investigador ou do próprio

participante. Entre os métodos de alocação sistemática mais comuns, pode-se citar

o de apresentação e alocação alternada (por exemplo, nos dias ímpares se escolhe

um tipo de tratamento e nos dias pares se escolhe o outro tratamento). Esse método

apresenta a desvantagem de permitir ao investigador conhecer previamente o

tratamento que o indivíduo vai receber podendo decidir pela inclusão ou não no

estudo (MORAES & MORAES, 2000; TAVARES et al., 2006; SOARES et al., 2006;

NASCIMENTO et al., 2009).

41

1.3.1.4 Quanto à finalidade

Segundo o órgão americano FDA (Food and Drug Administration), a

finalidade de um ensaio clínico pode ser dividida em quatro fases.

a) Estudos Fase I

É a primeira etapa da investigação de um novo medicamento em seres

humanos. Esta etapa acontece logo após a fase experimental (pré-clínica) cujos

testes são realizados em animais (GUIDANCE FOR INDUSTRY, 1997a; FROTA

BEZERRA, 1999; LEITE, 2004; TAKAHASHI et al., 2011; MADDAHI et al., 2011;

NAKAYAMA et al., 2011).

Nesta etapa são realizados fundamentalmente estudos de farmacocinética

e farmacodinâmica do medicamento, avaliando a tolerância, evidência de ações

farmacológicas, segurança dos esquemas posológicos, absorção, distribuição,

metabolismo e excreção. São utilizados, aproximadamente, 100 voluntários sadios.

Estes estudos proporcionam informações preliminares sobre o efeito e a

segurança do produto em indivíduos sadios ou em alguns casos em pacientes

(estudos com fármacos antineoplásicos) e orientam as etapas posteriores da

pesquisa (GUIDANCE FOR INDUSTRY, 1997a).

As vias de administração devem ser as mesmas que serão estudadas na

prática clínica, não sendo permitido o experimento de outras vias que não tenham

sido previamente ensaiadas em animais.

b) Estudos Fase II

Nesta fase, com o objetivo de estabelecer segurança e demonstrar a

atividade farmacológica do medicamento em curto prazo, são selecionados cerca de

200 pacientes portadores de uma determinada enfermidade ou condição patológica

de interesse.

42

Pode ser denominado como um estudo piloto para estudar a atividade

biológica específica, controle ou profilaxia da doença. Pode-se ainda, estabelecer as

relações dose-resposta, a fim de se obter sólidos antecedentes para a descrição dos

estudos Fase II (GUIDANCE FOR INDUSTRY, 1997b; CUKER et al., 2011; VIANA,

2011; CARVALHO, 2009; BARROSO, 2006; CLELAND et al., 2011; GELMON et al.,

2011).

Esta fase proporciona informações preliminares sobre eficácia do fármaco

e suplementa os parâmetros de segurança obtidos na Fase I.

c) Estudos Fase III

Têm características em comum com o Estudo Fase II, porém, de maneira

mais ampliada. A amostra de pacientes deve ser maior, representando a população

geral que irá utilizar o medicamento quando estiver no mercado (O'CONNOR &

FIUZAT, 2011; HIGASHIDA et al., 2003; KANTARJIAN et al., 2011; PAN et al.,

2011).

Os dados são obtidos por ensaios de comparação do medicamento teste

com um medicamento de referência ou com um placebo.

Por ser a última fase antes da comercialização do medicamento, procura-

se explorar o tipo e o perfil de reações adversas que possa apresentar, como as

mais frequentes, características próprias do fármaco como: interações clinicamente

relevantes, grupos de pacientes com risco para desenvolver efeitos secundários e

fatores que possam alterar o seu efeito farmacológico (GUIDANCE FOR INDUSTRY,

2003).

d) Estudos Fase IV

Na Fase IV, pesquisas são executadas com base nas características por

meio das quais foi autorizado o medicamento. Geralmente, são estudos de vigilância

pós-comercialização para estabelecer o valor terapêutico, o surgimento de novas

reações adversas e/ou confirmação da frequência de aparecimento das reações já

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O%27Connor%20CM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fiuzat%20M%22%5BAuthor%5D

43

descritas e estratégias de tratamento. A população não é mais selecionada, é pouco

homogênea e inclui doentes raramente recrutados durante as Fases I, II ou III:

pacientes que sofrem de patologias diversas, pacientes que recebem associações

terapêuticas e idosos (SPILKER, 1991; KATHLEEN, 2004; RICH, 2004;

WEGSCHEIDER, 2005; PRABHOO et al., 2011; SORENSEN et al., 2011; RAHMAN

et al., 2011).

Devem-se seguir as mesmas normas éticas e científicas aplicadas às

pesquisas de fases anteriores.

No Brasil, depois que um medicamento já vem sendo comercializado, as

pesquisas clínicas desenvolvidas para explorar novas indicações, novos métodos de

administração ou novas associações são consideradas como pesquisas de um novo

medicamento, sendo necessário realizar, novamente, as fases que sejam

necessárias (MORAES & MORAES, 2000).

Certas limitações de detecção de reações adversas podem ser

observadas nos ensaios clínicos Fase I, II e III como: participam poucos pacientes;

excluem-se crianças, idosos, gestantes, pacientes com mais de uma enfermidade,

pacientes que apresentam poucas contraindicações potenciais para receber o novo

medicamento, e os que utilizam vários medicamentos; existe um controle rígido, com

uma peculiar relação entre o médico e o paciente, diferente do que se estabelece na

prática clínica habitual; e os critérios diagnósticos são, em geral, mais rigorosos do

que os aplicados no dia-a-dia da clínica médica (MORAES & MORAES, 2000).

Essas limitações impedem que os ensaios clínicos anteriores à Fase IV

identifiquem reações adversas raras, por exemplo, as que aparecem em menos de

um entre 1000 pacientes, que aparecem após um tratamento prolongado ou muito

tempo depois de suspendê-lo e as que ocorrem em subgrupos específicos da

população (MORAES & MORAES, 2000).

De acordo com a Resolução Mercosul/GMC (Grupo Mercado Comum) nº,

129, de 13 de dezembro de 1996, os ensaios clínicos de bioequivalência estão

inseridos na fase IV da investigação clínica tendo em vista que estes objetivam

44

estabelecer o valor terapêutico e a eficácia do produto através da avaliação e

comparação das biodisponibilidades das formulações estudadas.

1.4 Bioequivalência

1.4.1 Histórico

O termo biodisponibilidade surgiu na literatura científica no início da

década de 70, com a publicação de trabalho relatando diferenças entre as curvas de

decaimento plasmático obtidas após administração de quatro formulações contendo

digoxina a voluntários, em estudo cruzado (MARZO & BALANT, 1995). Entretanto,

trabalhos relacionados à absorção a partir de formas farmacêuticas já vinham sendo

desenvolvidos desde a década de 30, quando dados de excreção urinária de

salicilato foram utilizados como medida de eficácia de comprimidos de salicilato de

sódio com revestimento entérico. Em 1945 Oser e colaboradores estudaram a

absorção relativa das vitaminas em diferentes formulações. Nos anos 50, alguns

autores demonstraram que a absorção de vitamina B12 e ácido-p-aminossalicílico, a

partir de comprimidos revestidos, dependia da desintegração do revestimento.

Também nessa época, surgiram as primeiras bases teóricas para a avaliação da

absorção de fármacos a partir de dados de excreção urinária, e os primeiros estudos

com determinação de concentrações sanguíneas (ABDOU, 1989).

No início da década de 60, constataram-se diferenças na

biodisponibilidade entre diferentes formulações orais contendo fármacos como

prednisona. Hormônios tireoidianos, varfarina, ácido acetilsalicílico, digoxina e

cloranfenicol (GLEITER et al., 1998). Na década de 70 foram relatados episódios de

intoxicação decorrentes de alteração da biodisponibilidade de comprimidos de

digoxina (NYBERG, 1978), o que ocasionou aumento de interesse por esses

estudos, além de maior divulgação dos conceitos relativos à biodisponibilidade e

bioequivalência (COOK, 1978).

No Brasil, as pesquisas farmacoclínicas foram iniciadas com psicotrópicos,

na década de 80, pelo professor Elisaldo Carlini, no Departamento de Psicologia da

Escola Paulista de Medicina, atual Universidade Federal do São Paulo. Entretanto,

45

somente com os estudos de biodisponibilidade, bioequivalência e interação

medicamentosa realizados pelo professor Gilberto De Nucci, a pesquisa com

medicamentos no nosso país começou a ser amplamente divulgada no meio

científico nacional e internacional (MORAES & MORAES, 2000). Este tipo de

pesquisa era patrocinado por indústrias farmacêuticas com uma visão mais

aprofundada do processo de qualidade e garantia da qualidade no desenvolvimento

de medicamentos similares e/ou por estratégia de marketing/comercialização dos

medicamentos pelas indústrias farmacêuticas.

Idealizada em 1989 pelo professor Gilberto De Nucci, a Unidade de

Farmacologia Clínica Miguel Servet/UNICAMP-SP, possibilitou uma estreita

colaboração com outros centros de pesquisa, que resultou na criação, em 1992, da

Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará (UFC) coordenada pela professora Maria Elisabete

Amaral de Moraes. Essa, à época, a primeira unidade de pesquisa clínica a dispor,

desde 1998, estrutura física dedicada exclusivamente para a realização de ensaios

clínicos e uma unidade de cuidados especiais para a realização de estudos de fase I

(MORAES & MORAES, 2000).

Nesta época, as pesquisas eram conduzidas segundo as normas do FDA

(Agência Regulatória Americana) e EMEA (Agência Europeia de Medicamentos),

devido à ausência de legislação específica no Brasil para condução de estudos

biodisponibilidade/bioequivalência.

Seguindo a tendência mundial, o Ministério da Saúde/ANVISA implanta a

política para medicamentos genéricos no país a partir de 1999, através da

promulgação da Lei dos Genéricos (BRASIL, 1999), que estabelece a

obrigatoriedade de realizar estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência

para medicamentos genéricos.

Posteriormente, a resolução RDC nº 133 de 29/05/2003 estabelece a

obrigatoriedade de realizar estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência

para medicamentos similares no Brasil (BRASIL, 2003a). A regulamentação do setor

acarreta em aumento contínuo dos estudos e, principalmente, um grande aumento

46

na qualidade de fabricação dos medicamentos similares e genéricos. Existem ainda

vantagens econômicas pelo baixo preço e competitividade de preços, no caso dos

medicamentos genéricos (ROSENBAUM, 1998; GEITONA et al., 2006).

Para a indústria farmacêutica, o custo de desenvolvimento de uma

formulação genérica é bem menor, quando comparado ao investimento necessário a

pesquisa e desenvolvimento de um medicamento inovador, visto que para o

medicamento inovador é necessário realizar estudos de fase I, II e III para garantir

eficácia e segurança da formulação. Já o medicamento genérico necessita somente

comprovar a equivalência terapêutica através de estudos in vitro (equivalência

farmacêutica) e in vivo (bioequivalência), após o término do período de patente,

assumindo os resultados de estudos de eficácia e segurança, realizados durante o

desenvolvimento do medicamento inovador (RUMEL; NISHIOKA et al., 2006).

Atualmente, vários estudos clínicos para determinação de

biodisponibilidade relativa/bioequivalência de medicamentos estão em execução no

Brasil. Estes estudos têm por objetivo demonstrar a intercambialidade dos

medicamentos teste e referência, de tal forma a garantir a premissa básica da

bioequivalência: se dois medicamentos são bioequivalentes, eles apresentam

equivalência terapêutica, eficácia e segurança (MIDHA et al., 2004). Adicionalmente,

os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência têm por objetivo

demonstrar evidências in vivo da qualidade farmacêutica dos produtos (MIDHA et

al., 2004).

1.4.2 Relevância dos estudos de biodisponibilidade

Sabe-se, que no passado, a maioria dos medicamentos era de origem

natural. Em geral, plantas e minerais constituíam as principais fontes de

medicamentos que eram manipulados em boticas para o consumo imediato pelo

paciente. Entretanto, com o surgimento das primeiras indústrias farmacêuticas e o

desenvolvimento da síntese orgânica, essa situação foi modificada e a fabricação de

medicamentos passou a ser em grande escala para atender às necessidades de

uma demanda crescente (STORPIRTIS et al., 2009).

47

Essas modificações significaram desafios, uma vez que novos conceitos

foram sendo introduzidos para o desenvolvimento de novas formulações e de formas

farmacêuticas que atendessem aos requisitos de estabilidade física, físico-química e

microbiológica, com a produção de lotes sucessivos em escala industrial,

empregando operações unitárias de várias complexidades (AIACHE et al., 1998).

Especialmente nas décadas de 1960 e 1970, foram constatados vários

casos de ineficácia clínica e intoxicações de pacientes como o uso de

medicamentos, o que deu origem a estudos envolvendo universidades e autoridades

sanitárias para o estabelecimento de novos critérios para o registro de

medicamentos, incluindo-se estudos de biodisponibilidade. Estes estudos são

empregados principalmente para a determinação da biodisponibilidade absoluta de

medicamentos inovadores, avaliação da bioequivalência entre medicamentos,

avaliação das alterações na formulação de medicamentos e desenvolvimento de

medicamentos de liberação modificada (SHARGEL et al., 2005).

Na maioria dos casos, os estudos de biodisponibilidade são realizados

empregando-se a determinação quantitativa do fármaco e/ou metabólito em sangue

total, plasma, soro, ou urina, em função do tempo, modalidade considerada mais

adequada, precisa e exata (SHARGEL et al., 2005). Entretanto a casos em que não

é possível realizar a quantificação do fármaco em líquidos biológicos (quando não de

obtém um método preciso, exato e validado para tal finalidade ou quando as

concentrações plasmáticas e os parâmetros farmacocinéticos derivados não

correspondem à modalidade de estudo mais adequada e aplicável ao objetivo do

estudo), o que conduz à realização de estudos farmacodinâmicos, com a medida de

determinado efeito farmacológico correlacionável com a dose administrada.

Contudo, a seleção desta última possibilidade deve ser devidamente justificada,

considerando-se, também, que é normalmente mais complexa e de maior custo

(SHARGEL et al., 2005; WHO, 2006).

Ressalta-se, ainda, que o emprego de modelos in vitro está sendo

discutido nos últimos anos, destacando-se que tanto as universidades quanto as

empresas que atuam na área farmacêutica têm realizado vários estudos visando ao

desenvolvimento e validação de modelos in vitro correlacionáveis com os resultados

48

obtidos in vivo. Esta possibilidade é muito importante sob o ponto de vista ético, pois

colabora na redução de estudos que envolvem seres humanos em pesquisas com

medicamentos (SKELLY et al., 1990; WHO 2006).

1.4.3 Inferência da Equivalência Terapêutica

Antes, assumia-se que equivalentes farmacêuticos eram necessariamente

equivalentes terapêuticos. É importante lembrar que são considerados equivalentes

farmacêuticos os produtos que possuem entre si a mesma concentração da

substância ativa, na mesma forma farmacêutica, porém, não necessariamente os

mesmos excipientes, processo de fabricação etc., e não possuem estudo de

biodisponibilidade ou qualquer outro estudo clínico comparativo. Em contrapartida,

um produto farmacêutico é terapeuticamente equivalente a outro se este contiver a

mesma substância ativa ou mistura terapêutica e, clinicamente, demonstre que

possui mesma eficácia e segurança com este produto de eficácia e segurança

estabelecida por meio de ensaios clínicos (PÁDUA, 2003).

Porém, foi demonstrado que a hipótese de que equivalentes farmacêuticos

eram terapeuticamente semelhantes estava totalmente equivocada para inúmeros

fármacos. Assim, o interesse em estudos clínicos que garantissem a segurança

clínica e eficácia dos medicamentos era cada vez maior. Entretanto, ensaios clínicos

de eficácia são difíceis e caros. Neste caso, o produto deve mostrar o mesmo efeito

terapêutico na situação clínica. Diante deste obstáculo, o estudo de

biodisponibilidade comparativo foi instituído na prática médica como uma tentativa

de inferir a equivalência terapêutica sem a necessidade de estudos clínicos de

eficácia e segurança. Esta extrapolação fundamenta-se no fato de que, uma vez a

substância ativa encontra-se na corrente sanguínea, os mecanismos

farmacocinéticos posteriores (distribuição, metabolismo e excreção) não serão

influenciados pela formulação e o fármaco absorvido, a partir das respectivas formas

farmacêuticas, comporta-se indistintamente, exercendo o mesmo efeito terapêutico

(METZLER, 1974).

Segundo Shargel & Yu (1999) e Storpirtis (1999), a biodisponibilidade de

uma formulação farmacêutica pode ser influenciada por dois fatores: fatores

49

relacionados ao indivíduo (idade, sexo, peso corporal e fatores fisiológicos

associados) e por fatores relacionados à forma farmacêutica (fármaco, excipientes e

técnica de fabricação): tamanho de partícula, forma polimórfica, presença de

solvatos ou hidratos, natureza química, solubilidade, tipo e quantidade de

excipientes, método de preparação, tipo de granulação, tempo de mistura ou

agitação, condições de secagem, velocidade de compressão e instabilidade.

1.4.4 Planejamento de Ensaios de Bioequivalência

Muitos erros terapêuticos relacionados a diferenças na biodisponibilidade,

ocorridos no passado, justificam a necessidade de testes do desempenho da forma

farmacêutica em liberar a substância ativa na circulação sistêmica e, dessa forma,

no sítio de ação. Além disso, a biodisponibilidade da substância ativa a partir de um

produto farmacêutico deve ser conhecida e reprodutível (STORPIRTIS, 1999).

Os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência são planejados

de tal forma a garantir a segurança dos voluntários participantes dos estudos, de

acordo com os referenciais básicos de bioética (BRASIL, 1996; BRASIL, 1997) e

através da definição de parâmetros, que permitam demonstrar que os medicamentos

testados são bioequivalentes (ou não) aos medicamentos de referência. Os

parâmetros a serem considerados no planejamento de estudos de biodisponibilidade

relativa/bioequivalência são:

Número de voluntários;

Sexo dos voluntários;

Tempos de coleta para caracterização do perfil farmacocinético;

Forma farmacêutica;

Intervalo entre as administrações (“washout”);

Condição de administração: alimentação/jejum;

50

Metodologia analítica a ser utilizada para o doseamento das

amostras;

Fármaco e/ou metabólito ativo na circulação a ser quantificado.

1.4.4.1 Número de voluntários

O número de voluntários a ser empregado em um estudo de

biodisponibilidade/bioequivalência é geralmente estabelecido através de estudos

anteriormente realizados para o mesmo fármaco, dados de revisão de literatura e

estudo piloto quando não há dado disponível na literatura, sendo que, o número

adequado de voluntários deve assegurar poder estatístico (> 0.8) suficiente para

garantir a confiabilidade dos resultados do estudo de

biodisponibilidade/bioequivalência (MENDES, 2007).

Com relação ao coeficiente de variabilidade intrassujeito, quanto menor o

coeficiente, menor o número de voluntários a ser empregado para a avaliação

estatística de bioequivalência. Os fármacos considerados de alta variabilidade têm

um coeficiente de variabilidade intrassujeito acima de 30% (MIDHA et al., 2004;

MIDHA et al., 2005) e os fármacos considerados com baixa variabilidade tem um

coeficiente de variabilidade intrassujeito entre 5-15% (MIDHA et al., 2004).

Adicionalmente, devemos levar em consideração os seguintes critérios

estabelecidos pela legislação (BRASIL, 2006): número mínimo de 12 voluntários

para qualquer estudo de biodisponibilidade/bioequivalência e 24 voluntários na falta

de dados de estudos anteriores e de revisão de literatura para o coeficiente de

variação do fármaco.

1.4.4.2 Sexo dos voluntários

A grande maioria dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalência é

realizada em voluntários de ambos os sexos e balanceados. Em casos específicos,

os estudos podem ser realizados em homens ou em mulheres somente. Por

51

exemplo, estudo de bioequivalência de isotretinoína, retinoide que inibe a função das

glândulas sebáceas e a queratinização (THIBOUTOT et al., 2006; GEORGALA et

al., 2005), é realizado em homens, devido ao potencial risco teratogênico da droga.

A legislação atual (BRASIL, 2006) para estudos de contraceptivos exige que os

estudos sejam realizados com mulheres em idade fértil, e para medicações com

características específicas ao sexo e idade que os estudos sejam realizados em

voluntários com essas características.

1.4.4.3 Tempos de coleta

Tempos de coleta adequados devem garantir a caracterização do perfil

farmacocinético do fármaco, sendo desta forma, necessário assegurar (BRASIL,

2003a; MENDES, 2007):

Determinação mais eficiente possível do Cmax através das coletas

de amostras suficientemente próximas a região do intervalo de tempo

previsto para a ocorrência do Tmax;

Coletas de amostras na fase de eliminação. Geralmente, coletas

entre 3 e 5 meias-vidas do fármaco;

Coleta de amostras que possuam níveis quantificáveis por razões

de ordem ética;

Para fármacos que apresentam meia-vida de eliminação longa (superior a

24 horas) pode ser utilizado cronograma de coleta de amostras de até 72 horas

(ASCtruncada), visto que permite a caracterização farmacocinética de Cmax e ASC

relacionada à fase de absorção do fármaco, objetivos estes da avaliação de

bioequivalência, e permite, adicionalmente, um menor número de coleta de amostras

dos voluntários (BRASIL, 2003b).

52

1.4.4.4 Forma Farmacêutica

Os diferentes tipos (comprimido, cápsula, solução, suspensão, etc.) de

formas farmacêuticas devem ser considerados no planejamento dos tempos de

coleta, pois implicam em variação dos parâmetros farmacocinéticos para uma

mesma dose de determinado fármaco (MENDES, 2007).

Nas Figuras 2 e 3, abaixo, apresentam-se exemplos da influência da forma

farmacêutica quanto ao perfil farmacocinético obtido. Como pode ser observado, os

tempos de coleta a serem planejados para determinação do Cmax são distintos

(MENDES, 2007).

Figura 2: Efeito da forma farmacêutica no Tmax da carbamazepina 200mg

(MENDES, 2007).

53

Figura 3: Efeito da forma farmacêutica no Tmax do ibuprofeno 400mg (MENDES,

2007).

1.4.4.5 Efeito da alimentação

Na área das Ciências Farmacêuticas, o tema biodisponibilidade e

bioequivalência tem gerado crescentes discussões. Essas discussões têm

promovido a elucidação dos problemas clínicos relacionados a falhas na

farmacoterapia, causadas, em especial, pela bioinequivalência dos medicamentos.

Também, com o aperfeiçoamento da regulação sanitária, tem ocorrido a evolução da

qualidade dos estudos de biodisponibilidade e bioequivalência (STORPIRTIS et al.,

2009).

Os sistemas de liberação de fármaco são fontes de variabilidade do

desempenho in vivo entre as formulações. Em geral, muitos dos problemas

comprovados ou potenciais de bioequivalência estão sendo relacionados a

formulações de liberação modificada (WELAGE et al., 2001).

A influência da alimentação na absorção de fármacos tem merecido

atenção e vem sendo estudada mais recentemente. A interação fármaco-alimento é

de difícil previsão e ocorre por uma variedade de razões, tais como alterações

fisiológicas (motilidade intestinal, fluxo sanguíneo, etc.), e/ou físico-químicas

54

(quelação, adsorção, etc.), podendo aumentar, retardar ou diminuir, ou mesmo não

afetar a absorção de fármacos (WELLING et al., 1991)

Os estudos dos efeitos da alimentação na absorção de fármacos são

realizados, geralmente, no período de desenvolvimento de novos medicamentos. No

entanto, sabe-se que o alimento pode alterar a biodisponibilidade por interação com

o fármaco ou com a formulação. Em alguns casos, as interações dos excipientes

com os alimentos induzem alterações fisiológicas no trato gastrintestinal, podendo

influenciar a demonstração da bioequivalência. Para todas as formulações de

liberação modificada cuja dissolução in vivo e absorção do fármaco está sujeita à

presença de alimento, a magnitude dos efeitos da alimentação na biodisponibilidade

e na demonstração da bioequivalência dos medicamentos é difícil, senão impossível,

de prever sem a realização de estudo de bioequivalência com alimentação (BRASIL,

2003b, GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2002).

Em consequência, as interações medicamento-alimento podem ser

importantes no ponto de vista clínico. Deve-se ter especial atenção com fármacos

com estreita margem terapêutica, aqueles que apresentam elevada eliminação pré-

sistêmica e aqueles para os quais é fundamental atingir certo nível de concentração

plasmática, como no caso de antibióticos de uso crônico (STORPIRTIS et al., 2009).

Regulatoriamente (BRASIL, 2006) é exigido estudo de bioequivalência sob

condições alimentares nos seguintes casos:

Formas de liberação prolongada ou controlada (adicionalmente ao

estudo em jejum);

Formas de liberação retardada, que apresentam revestimento

gastro-resistente;

Formas de liberação imediata cujos fármacos tenham a absorção

influenciada pela presença de alimentos, resultando em alterações

clinicamente significativas e indicação de administração do

medicamento com alimentos.

55

Nas figuras 4 e 5, observam-se exemplos da influência da alimentação

sobre o perfil farmacocinético obtido após a administração dos fármacos

antiretrovirais saquinavir e ritonavir, respectivamente. Como pode ser observado, os

tempos de coleta a serem planejados para determinação do Cmax são distintos para

ritonavir uma vez que, para o saquinavir, o Cmax é aproximadamente 2,5 vezes maior

na presença de alimentos do que em jejum (MENDES, 2007).

Figura 4: Efeito da alimentação no Cmax do saquinavir (Cápsulas de 200mg)

(MENDES, 2007).

56

Figura 5: Efeito da alimentação no Tmax do ritonavir (Cápsulas de 100mg)

(MENDES, 2007).

1.4.4.6 Intervalo entre as administrações

O intervalo entre as administrações (“Washout”) deve ser de sete meias

vidas para garantir que não haja efeito residual do primeiro período no segundo

período de administração (BRASIL, 2006).

1.4.4.7 Metodologia analítica

A etapa de desenvolvimento e validação de um método bioanalítico é

importante em um estudo farmacocinético, seja com o objetivo de se avaliar a

bioequivalência de formulações ou com o objetivo clínico de se conhecer o

comportamento farmacocinético de determinado fármaco. O método deverá garantir

a confiabilidade dos resultados obtidos a partir da análise de amostras de

concentrações desconhecidas (STORPIRTIS et al., 2009).

A quantificação de amostras em fluidos biológicos pode ser realizada por

diferentes metodologias analíticas, dentre elas:

57

Radioimunoensaio;

Elisa;

Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria

de massas;

Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por

Fluorescência;

Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por

ultravioleta;

Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas;

Absorção atômica;

A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada á

espectrometria de massas (LC-MS/MS) é, atualmente, a mais utilizada para

quantificação de amostras biológicas em estudos de

biodisponibilidade/bioequivalência (KAUPPILA, 2004; WAL et al., 2010) devido as

seguintes características:

A alta sensibilidade e seletividade proporcionada pela associação

das técnicas;

Diminuição do tempo de análise das amostras pela associação

das técnicas, fator importante a ser considerado em estudos de

biodisponibilidade/bioequivalência visto que envolvem o doseamento

de um grande número de amostras;

Do ponto de vista de um estudo de biodisponibilidade/bioequivalência, a

sensibilidade e seletividade da técnica LC-MS/MS permitem a quantificação de

amostras de baixa concentração da fase de eliminação. Adicionalmente, permitem

também a quantificação de amostras contendo baixas concentrações de fármacos

58

após administração de formulações com baixas doses de princípio ativo como, por

exemplo, os contraceptivos e hormônios (LICEA-PEREZ et al., 2007; THERON et al.,

2004).

1.4.4.8 Fármaco e/ou metabólito ativo na circulação a ser quantificado

A farmacocinética é a ciência que estuda o movimento de fármacos pelo

organismo, traduzido pelos processos de absorção, distribuição, biotransformação e

excreção. Embora a bioequivalência seja estabelecida com base na comparação da

velocidade e extensão de absorção do fármaco, todos os outros processos

farmacocinéticos estão direta ou indiretamente envolvidos (KLASSEN, 2001).

A bioequivalência geralmente é avaliada com base nos dados do fármaco

inalterado, mas a determinação das concentrações plasmáticas dos metabólitos é de

particular interesse quando contribui significativamente para a eficácia e/ou

segurança do produto (STORPIRTIS et al., 2009).

Os metabólitos podem ter relevância na determinação da bioequivalência

quando (MIDHA et al., 2004):

Os metabólitos são, no mínimo, equipotentes ao fármaco

inalterado ou trata-se de um pró-fármaco (o metabólito é o

responsável pelo efeito terapêutico);

Os metabólitos são formados por metabolismo pré-sistêmico;

Os metabólitos atingem concentrações plasmáticas superiores às

concentrações do fármaco inalterado;

O fármaco inalterado não pode ser quantificado (ausência de

método analítico sensível, instabilidade na matriz biológica ou rápido

e extenso metabolismo pré-sistêmico) ou a quantificação ocorre de

maneira insuficiente para que a curva de concentração plasmática

59

versus tempo possa ser adequadamente construída e os parâmetros

farmacocinéticos determinados.

Os parâmetros, citados acima, a serem considerados durante o

planejamento dos estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência devem

seguir critérios científicos e regulatórios. Além disso, é de fundamental importância

que as normas técnicas sejam baseadas em aspectos científicos (MENDES, 2007).

1.5 Considerações sobre análise físico-química de fármacos

1.5.1 Métodos Cromatográficos

Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar

de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e

quantificação das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras

técnicas instrumentais de análise, como, por exemplo, a espectrofotometria ou a

espectrometria de massa (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).

A cromatografia é um método físico-químico de separação dos

componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes compostos

em duas fases, que estão em contato íntimo. Durante a passagem da fase móvel

(FM) sobre a fase estacionária (FE), os componentes da mistura são distribuídos

entre as duas, de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela FE,

resultando em migrações diferenciais desses compostos (Figura 6) possibilitando

assim análises qualitativas e/ou quantitativas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997;

CIOLA, 1998; NETO & NUNES, 2003).

60

Figura 6: Separação de misturas por interação diferencial dos seus

componentes entre uma fase estacionária (líquido ou sólido) e uma fase móvel

(líquido ou gás).

Componente A

Componente B

Fase estacionária

Fase móvel

1.5.1.1 Classificação

A classificação simplifica e auxilia o estudo da cromatografia. Esta pode

ser classificada de diversas formas dependendo do interesse e tendo como base de

classificação diferentes fatores, tais como, fase móvel, fase estacionária, processo

de separação ou tipo de soluto (NETO & NUNES, 2003).

A cromatografia pode ser subdividida em CGL – Cromatografia Gás-

Líquido; CGS - Cromatografia Gás-Sólido; CFS – Cromatografia de Fluido

Supercrítico; CLL – Cromatografia Líquido-Líquido; CCD – Cromatografia em

Camada Delgada; CLS – Cromatografia Líquido-sólido; CTI – Cromatografia de troca

iônica; CET – Cromatografia por exclusão de tamanho; CFL – Cromatografia de fase

quimicamente ligada (CIOLA, 1998).

Introdução de uma mistura

Eluição

Separação dos componentes

61

1.5.1.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica de separação que,

em menos de trinta anos passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados

para fins qualitativos e quantitativos (TONHI et al., 2002) e atualmente se destaca na

química analítica pela capacidade de realizar análises qualitativas e quantitativas em

amostras ambientais, farmacêuticas, biológicas e em alimentos, dentre outras

(RIBANI et al., 2004).

A cromatografia líquida de alta eficiência é o mais importante membro de

uma família inteira de técnicas de separação. Utiliza instrumentos muito sofisticados

que podem ser totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que

emprega pequenas colunas recheadas de materiais especialmente preparados e

uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. As colunas utilizadas são muito

eficazes, porém oferecem grande resistência à vazão da fase móvel. Por esta razão,

é necessário empregar sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem

a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna analítica

(COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). É um sistema de separação automatizado que

funciona com uma fase móvel passando por uma fase estacionária sob alta pressão

o que originalmente levou à denominação de Cromatografia Líquida de Alta Pressão.

Esta terminologia foi trocada por “Cromatografia Líquida de Alta Eficiência”, quando

se constatou que o grande aporte da técnica era a melhor capacidade de separação

cromatográfica e não a maior pressão. Além disso, o desenvolvimento de partículas

de sílica peliculares porosas permitiu operar-se dentro de fluxos e pressões

menores, e com maior grau de eficiência no processo de separação (NETO &

NUNES, 2003).

Um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência como mostra a

Figura 7 é composto por alguns componentes essenciais que são responsáveis pela

separação cromatográfica (NETO & NUNES, 2003).

62

Figura 7: Componentes essenciais de um sistema de cromatografia líquida de

alta eficiência. A) reservatório de fase móvel; B) bomba de alta pressão; C)

injetor de amostra; D) coluna cromatográfica; E) detector; F) sistema de

aquisição de dados.

A técnica de cromatografia líquida tem a capacidade de realizar

separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos

presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos,

com alta resolução, eficiência e sensibilidade. A detecção contínua e com grande

reprodutibilidade fornecida por esta técnica eleva as análises qualitativa e

quantitativa a um alto nível de exatidão e precisão (COLLINS; BRAGA; BONATO,

1997; SILVERSTEIN, 2000).

1.5.2 Métodos de extração de amostras

A quantificação de fármacos em amostras biológicas, sobretudo em

plasma de voluntários e/ou pacientes, coletadas em estudos clínicos de

farmacocinética têm sido procedimento usual na determinação da segurança e

eficácia de medicamentos (QUEIROZ & LANÇAS, 2005). As técnicas mais utilizadas

lançam mão da cromatografia como procedimento de separação, identificação e

quantificação com diversos detectores: ultravioleta, fluorescência, eletroquímico e

espectrômetro de massas.

63

Matrizes biológicas complexas como sangue, plasma, urina, saliva e fluido

cérebro espinhal e tecidos contêm grande quantidade de compostos endógenos que

podem interferir no método analítico. O conhecimento dessas matrizes e da

farmacocinética do princípio ativo ordena o desenvolvimento das técnicas de

extração e detecção utilizadas para assegurar especificidade/seletividade para a

determinação do limite de quantificação e da faixa linear. Em estudos de

farmacocinética comparada a matriz mais comumente utilizada é o plasma. Para a

dosagem de fármacos a partir de uma matriz complexa como o plasma faz-se

necessário um pré-tratamento das amostras. Os componentes endógenos presentes

são potenciais interferentes em análises cromatográficas (QUEIROZ et al., 2001).

O pré-tratamento das amostras tem a finalidade de eliminar os

interferentes, extrair o fármaco com altas recuperações e, em determinadas

ocasiões, pré-concentrar, quando se faz necessário um aumento na sensibilidade do

método (QUEIROZ &LANÇAS, 2005).

O desenvolvimento de métodos de extração é uma etapa de extrema

importância para pureza dos picos cromatográficos (especificidade/seletividade) e

para a sensibilidade. As técnicas mais comumente utilizadas para extração e

concentração de compostos presentes em fluidos biológicos têm sido: precipitação

de proteínas, extração líquido-líquido e extração em fase sólida (BARRIONUEVO,

2001; ALNOUTI et al., 2005).

O elevado número de amostras analisadas em um estudo de

bioequivalência exige um alto grau de extração para eliminação de interferentes,

proteção da coluna cromatográfica e de todo sistema cromatográfico e de detecção.

Amostras bem limpas aumentam a durabilidade do sistema cromatográfico através

de uma maior proteção à coluna e de um menor acúmulo de sujeira nos detectores

por exemplo, no percurso óptico da célula de um detector de ultravioleta ou no cone

de amostragem do espectrômetro de massas, propiciando um maior número de

análises consecutivas com um menor número de paradas para lavagem do sistema.

64

1.5.2.1 Extração Líquido-Líquido (ELL)

A extração líquido-líquido (ELL) é um processo de separação que se

utiliza da propriedade de imiscibilidade de líquidos com a separação de misturas

líquidas heterogêneas como mostrado na Figura 8. Nesta técnica de extração ocorre

a partição do analito entre as duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa) (QUEIROZ

et al., 2001).

Figura 8: Esquema de extração líquido-líquido com utilização de funil de

separação.

As técnicas de extração e/ou pré-concentração permitem que a análise

dos componentes de interesse se torne possível. A meta final é a obtenção de uma

sub-fração da amostra original enriquecida com as substâncias de interesse

analítico, de forma que se obtenha uma separação cromatográfica livre de

interferentes, com detecção adequada e um tempo razoável de análise (LOBO,

2001).

A extração líquido-líquido possui algumas desvantagens: as amostras que

possuem grande afinidade pela água, que são parcialmente extraídas pelo solvente

orgânico, resultam em perda do analito. É necessária a utilização de solventes

ultrapuros, uma vez que impurezas do solvente são concentradas junto com a

amostra. O grande volume de solvente utilizado acaba gerando problemas de

descartes, além de ser um processo susceptível a erros e de difícil automação.

Líquidos imiscíveis

65

Apesar destas desvantagens, a extração líquido-líquido é considerada uma técnica

clássica de pré-tratamento de amostra.

Para o uso da extração líquido-líquido em fluídos biológicos

primeiramente é necessária a escolha adequada do solvente orgânico e ajuste do

pH da amostra para que ocorra uma boa recuperação do analito. Vários tipos de

solventes orgânicos são utilizados para extração de drogas ácidas e básicas

presentes na amostra de fluídos biológicos. Quanto maior a afinidade do analito pelo

solvente orgânico maior a recuperação. Substâncias básicas são normalmente

extraídas em pH maior que 7,0 e extração de substância ácida em pH menor que

5,0. Este tipo de extração é muito utilizado para substâncias presentes em fluídos

biológicos (LOBO, 2001).

As estratégias de extração de fármacos dependem da natureza da matriz

biológica e das propriedades físico-químicas do analito em particular. Na extração

líquido-líquido, o uso de procedimentos de múltiplas etapas envolvendo extração e

re-extração em fase orgânica e aquosa com o controle apropriado do pH e da

concentração iônica, podem extrair um analito seletivamente da matriz biológica,

bem como reduzir a quantidade de interferentes e contaminantes no extrato final

(SNYDER, 1997).

1.5.3 Espectrometria de Massa

A espectrometria de massa é uma técnica analítica usada para identificar

compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as

propriedades químicas e estruturais das moléculas. A detecção de compostos pode

ser conseguida para quantidades tão pequenas como 10-12, 10-15 g para um

composto de massa de 1000 Dalton. Isto significa que os compostos podem ser

identificados em concentrações muito baixas (uma parte em 1012) em misturas

quimicamente complexas (SILVERSTEIN, 2000).

O espectrômetro de massas é um instrumento com a capacidade de

determinação da massa molar de compostos eletricamente carregados. Via de

regra, o espectrômetro pode ser entendido como um instrumento composto por uma

66

fonte de íons, um separador (filtro de massas) que na realidade mede a relação

massa/ carga (m/z) e um detector (MORAES & LAGO, 2003).

Embora existam diferentes mecanismos de filtragem e detecção, a etapa

de ionização dos compostos é a que tem a maior variedade de técnicas, fato

decorrente da natureza diversa das amostras e das espécies de interesse (MORAES

& LAGO, 2003).

A espectrometria de massas é utilizada na análise de amostras sólidas,

líquidas ou gasosas contendo espécies voláteis ou não e com aplicações voltadas

desde a análise elementar até a composição de proteínas que requerem diferentes

processos de ionização (MORAES & LAGO, 2003).

A espectrometria de massas está fortemente inserida na rotina das

indústrias farmacêuticas, desde a pesquisa de novos fármacos e formulações até o

controle de qualidade (PEREIRA & CASS, 2005) e validações de processos de

limpeza (KOLODSICK et al., 2006).

No Brasil, a utilização de LC-MS/MS para análise de amostras em plasma

humano vem ganhando cada vez mais importância econômica e de controle da

segurança e eficácia de medicamentos. Esse aumento deu-se através da

promulgação da Lei 9.787 de 1999 que regulamentou o medicamento genérico no

país.

A espectrometria de massa é uma técnica muito utilizada na identificação

estrutural de biomoléculas tais como carboidratos, ácidos nucleicos e esteroides, no

sequenciamento de biopolímeros tais como proteínas e oligossacarídeos bem como

na determinação de compostos de interesse biomédico e bioquímico em matrizes

biológicas.

O espectrômetro de massa é um instrumento que separa íons, positivos

ou negativos, produzidos a partir de átomos ou moléculas, quer sejam das mais

simples às mais complexas, de acordo com a razão massa/carga (m/z).

67

Os princípios científicos em que a técnica se baseia são simples. A

essência da técnica envolve a geração de íons que são depois detectados. Uma das

técnicas de ionização, em maior expansão, é por electrospray. Há, essencialmente,

três características que a diferencia das outras técnicas de ionização. A primeira

delas é a capacidade para produzir íons multiplamente carregados, com número de

cargas elevado, reduzindo, assim, a razão m/z, de tal modo que seja possível

analisar compostos de elevada massa molecular até centenas de kDa, em

praticamente todo o tipo de analisadores. Uma segunda característica é que as

amostras a serem analisadas devem ser introduzidas em solução, tornando possível

o acoplamento com muitas técnicas de separação. Por último e não menos

importante, há o fato de ser o electrospray uma técnica de ionização suave,

permitindo que as interações não covalentes entre moléculas que existem em

solução sejam preservadas na fase gasosa (SIUZDAK et al., 1999).

As soluções são primeiramente pulverizadas eletrostaticamente com

formação de gotas pequenas e altamente carregadas. A nebulização da solução é,

em alguns casos, facilitada pela ajuda de um gás nebulizador. Posteriormente, as

moléculas do analito são separadas do solvente na forma de íons. Este passo de

formação de íons, como em muitas das técnicas de ionização consideradas suaves,

é provavelmente o menos compreendido no processo global do electrospray. Alguns

mecanismos têm sido propostos para a desadsorção de íons a partir de gotas

carregadas, sendo que o modelo de resíduo de carga de Dole (1968), aplicado a

macromoléculas, foi, talvez, o primeiro a servir de base para a atual técnica de

eletrospray. Nesse modelo é considerado que, à medida que o solvente se evapora,

a densidade de carga à superfície aumentará até que as forças repulsivas de

Coulomb, entre as cargas superficiais, excederão a tensão superficial levando à

divisão da gota inicial. Se esse processo de divisão continuar e se a solução original

for suficientemente diluída, será alcançado um estado no qual cada gota conterá

uma única molécula que reterá parte da carga inicial, ou seja, formará macro íons

(Figura 9).

68

Figura 9: Representação esquemática da fonte de “Electrospray”.

As fontes iônicas dos espectrômetros de massa estão, em geral, situadas

numa região de alto vácuo. A fonte de IES encontra-se à pressão atmosférica e a

evaporação do solvente é muitas vezes completada por intermédio de um fluxo

contra corrente de um gás, em geral, argônio. Os íons gerados são, depois,

transferidos desta zona de alta pressão para a zona de alto vácuo do analisador de

massa (PE Sciex, 2004).

O analisador mais utilizado, e mesmo, o primeiro a ser comercializado em

electrospray através da espectrometria de massa, é o quadrupolo. Isto se deve, em

princípio, ao fato de os quadrupolos serem relativamente baratos, fáceis de usar e

capazes de fornecer bom rigor nos valores de massa medidos (PE Sciex, 2004).

O analisador de massa quadrupolo é constituído por quatro eletrodos

cilíndricos de geralmente 5-11 cm de comprimento. Cada cilindro tem aplicado uma

voltagem de corrente direta e um adicional potencial de frequência de radio. Dois

dos cilindros têm uma corrente direta de carga positiva, enquanto as outras duas

têm carga negativa. A fase de frequência de radio é oposta para os eletrodos

positivos e negativos (Figura 10) (PE Sciex, 2004).

69

Figura 10: Esquema de funcionamento do filtro de massa quadrupolo.

O uso mais comum da configuração MS/MS está associado no caso de

análise de moléculas grandes e, particularmente, na resolução de misturas. A

principal análise realizada no método Quadrupolo Triplo na quantificação de

fármacos em matrizes biológicas na execução de estudos farmacocinéticos é o

monitoramento de múltiplas reações (MRM). O monitoramento de múltiplas reações

consiste em um método de análise usado para quantificação de compostos de

identidade conhecida. Assim, o MRM é baseado na determinação da “quantidade”

dos componentes presentes na amostra. Mas, para isso, o espectro formado deve

ser comparado com uma curva de calibração previamente realizada, utilizando desta

forma padrões internos já conhecidos (Figura 11) (PE Sciex, 2004).

Figura 11: Esquema demonstrativo da fragmentação de compostos utilizando

espectrômetro de massa triplo-quadrupolo no modo de monitoramento de

reação múltipla (MRM).

Íon ressonante

Íon não-ressonante

Detector

Mistura de

compostos

Seleção do

íon de interesse Dissociação

Seleção do íon fragmento de

interesse

FONTE Q1 Q2 Q3 DETECTOR

70

1.6 Sulfonamidas

As sulfonamidas foram os primeiros agentes quimioterápicos a serem

empregados na prevenção e cura de infecções causadas por bactérias em

humanos. Com o advento da penicilina e subsequentemente de outros antibióticos

houve uma diminuição na utilização de sulfonamidas por parte dos profissionais

prescritores. Entretanto, a introdução, na década de 1970, da combinação de

sulfametoxazol e trimetoprima aumentou o uso das sulfonamidas na profilaxia e

tratamento de infecções bacterianas específicas (GOODMAN & GILMAN`S, 2011).

As sulfonamidas têm uma ampla atividade antimicrobiana contra bactérias

gram-positivas e gram-negativas. Entretanto, cepas resistentes têm se tornado cada

vez mais comum. Em geral, as sulfonamidas exercem apenas um efeito

bacteriostático, e mecanismos de defesa celular e humoral do hospedeiro são

essenciais para a erradicação definitiva da infecção (GOODMAN & GILMAN`S,

2011).

1.6.1 Sulfametoxazol +Trimetoprima (SMX + TMP)

1.6.1.1 Características químicas sulfametoxazol

O sulfametoxazol (C10H11N3O3S) é designado quimicamente como 4-

amino-N-(5-metil-3-isoxazolil)benzenosulfonamida (Figura 12). É um pó cristalino

levemente amarelado, inodoro ou quase inodoro com um gosto ligeiramente amargo,

obtido por síntese química.

SO 2 NH

O

N

CH3

NH2

Figura 12: Estrutura química sulfametoxazol

71

1.6.1.2 Características químicas trimetoprima

A trimetoprima (C14H18N4O3) é designada quimicamente como 5-[(3,4,5-

trimetoxifenil]-2,4-pirimidinadiamina (Figura 13). É um pó cristalino levemente

amarelado, inodoro ou quase inodoro com um gosto ligeiramente amargo, obtido por

síntese química.

N

NNH2

NH2

CH2

OCH3

OCH3

OCH3

Figura 13: Estrutura química trimetoprima

1.6.1.3 Características gerais

Um dos agentes mais ativos que exercem um efeito sinérgico quando

usado com uma sulfonamida é a trimetoprima (BUSHBY & HITCHINGS, 1968). A

introdução da trimetoprima em combinação com o sulfametoxazol constituiu um

importante avanço no desenvolvimento de agentes antimicrobianos clinicamente

efetivos e representou uma aplicação prática à teoria de que se dois fármacos agem

de maneira sequencial sobre a mesma via enzimática, o resultado desta combinação

será um efeito sinérgico (HITCHINGS, 1982).

A atividade antimicrobiana da associação de Sulfametoxazol +

Trimetoprima resulta de suas ações sobre duas etapas da via enzimática na síntese

do ácido tetraidrofólico. O sulfametoxazol inibe a incorporação do Ácido

aminoparabenzóico (PABA), no ácido fólico, enquanto a Trimetoprima impede a

redução do diidrofolato em tetraidrofolato, que é a forma do folato essencial para

reações de transferência de compostos de carbono, como por exemplo, na síntese

de timidilato a partir de desoxiuridilato. A toxicidade seletiva para os microrganismos,

72

é obtida de duas maneiras. As células de mamíferos utilizam folatos pré-formados

da dieta e não sintetizam o composto. Além disso, a Trimetroprima é um inibidor

altamente seletivo da diidrofolato-redutase de organismos inferiores (GOODMAN &

GILMAN`S, 2011).

A associação de SMX + TMP está indicada no tratamento de infecções

causadas por Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridians, Streptococcus

pneumoniae, Corynebacterium diphtheria, Neisseria meningitidis, Staphylococcus

aureus, e Escherichia coli. Também são sensíveis cerca de 90% das cepas de

Haemophilus influenzae, Klebsiella spp., Salmonella spp., Shigella spp., e Proteus

spp. Brucella species e Nocardia respondem a altas doses desta combinação

(GOODMAN & GILMAN`S, 2011; DOLLERY 1999). A associação destes fármacos

também está indicada nos seguintes tratamentos: bronquite aguda e crônica,

broncopneumonia, otite média e sinusite, uretrites, cistites, pielonefrites e prostatites,

gonorreia em ambos os sexos, Infecções do trato gastrintestinal, febre tifoide e

paratifoide, infecções de pele e anexos, toxoplasmose, osteomielite aguda e crônica,

septicemia e outras infecções causadas por organismos susceptíveis (DOLLERY,

1999).

O volume de distribuição relativamente pequeno de Sulfametoxazol, 12-

18 L, comparado com a Trimetoprima, 100 L, fornece a razão para a relação fixa da

dosagem de Trimetoprima:Sulfametoxazol 1:5 em combinação (DOLLERY, 1999).

1.6.1.4 Características farmacocinéticas sulfametoxazol e trimetoprima

As características farmacocinéticas de SMX e TMP estão descritas na

tabela abaixo (Tabela 1).

73

Tabela 1: Características farmacocinéticas sulfametoxazol e trimetoprima

SULFAMETOXAZOL

Absorção oral 85%

Metabolismo pré-sistêmico Negligenciável

Meia vida plasmática

Média 9 h

Variação 5,9-19,7 h

Volume de distribuição 12-18 L

Ligação às proteínas plasmáticas 66%

TRIMETOPRIMA

Absorção oral >95%

Metabolismo pré-sistêmico Negligenciável


Média 10 h

Variação 8,6-17 h

Volume de distribuição 70-100 L

Ligação às proteínas plasmáticas 42-46%

1.6.2 Sulfadiazina

1.6.2.1 Características químicas

A sulfadiazina (C10H10N4O2S) é designada quimicamente como 5-[(3,4,5-

trimetoxifenil]-2,4-pirimidinadiamina (Figura 14). É um branco ou branco-amarelado,

inodoro pó, quase insípido que lentamente escurece por exposição à luz. É

preparado por síntese química (DOLLERY, 1999).

NH2 SO2NH

N

N

Figura 14: Estrutura química sulfadiazina

74

1.6.2.2 Características gerais

A sulfadiazina é estruturalmente similar ao ácido p-aminobenzóico (PABA)

e exerce sua ação farmacológica pelo bloqueio competitivo da enzima diidropteroato

sintetase (WOODS, 1962). A diidropteroato sintetase é requerida para converter o

PABA em folato. A sulfadiazina, por sua vez, inibe a produção de folato que é

requerido para a síntese de tetraidrofolato, purinas e DNA (DOLLERY, 1999).

Os organismos usualmente sensíveis à sulfadiazina são: Streptococcus

pyogenes, Strep. Pneumoniae, Strep. Viridans, Staphylococcus aureus, Bacilus

anthracis (algumas cepas), Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,

Haemophilus influenzae, H. ducreyi, Brucella spp., Calymmatobacterium

granulomatis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, nocardia spp., Actinomyces spp., e

Chlamydia trachomatis. Quando associada à pirimetamina, a sulfadiazina é também

ativa contra o parasita da malária, Toxoplasma gondii e Pneumocystis carinii.

Enterobacter aerogenes, Alcaligenes spp., Pseudomonas aeruginosa e

Proteus spp. podem ser inibidos in vitro, mas infecções devidas a estes organismos

raramente respondem à sulfadiazina. Assim como outras sulfonamidas, o espectro

de ação da sulfadiazina tem sido reduzido pela resistência bacteriana adquirida.

Streptococcus faecalis é invariavelmente resistente a sulfadiazina. Muitas cepas de

Shigella spp. são resistentes a este agente. A resistência é também comum em

Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae e N. menngitidis (BRIDGES & LOWBURY,

1977).

A principal rota metabólica é a acetilação no fígado. O grupo acetil

(CH3CO) liga-se ao grupo para-amino (NH2) da molécula de sulfadiazina para

produzir N4-acetilsulfadiazina. A taxa de acetilação é geneticamente determinada e

demonstra características bimodais sendo os indivíduos classificados como

acetiladores lentos ou rápidos (DOLLERY, 1999).

A sulfadiazina está indicada no tratamento da nacardiose; toxoplasmose;

agente antibacteriano tópico para queimaduras, úlceras de pressão (sulfadiazina de

prata); profilaxia da febre reumática; infecções do trato urinário; infecções intestinais;

75

cancro mole; malária; pneumonia causada por Pneumocystis carinii; Infecções do

trato respiratório inferior;

1.6.2.3 Características farmacocinéticas

As características farmacocinéticas da sulfadiazina estão descritas na

tabela abaixo (Tabela 2).

Tabela 2: Características farmacocinéticas da sulfadiazina

SULFADIAZINA

Absorção oral 100%

Metabolismo pré-sistêmico (acetilação) 13-38%


Média 7-12 h

Variação 10 h

Volume de distribuição 0,36 L/kg

Ligação às proteínas plasmáticas 20-55%

76

JUSTIFICATIVA

77

2 JUSTIFICATIVA

Os antimicrobianos são fármacos capazes de destruir microrganismos ou

de suprimir sua multiplicação ou crescimento. Podem ser utilizados com finalidades

profiláticas ou curativas. Além disso, a facilidade de uso destes fármacos, o

diagnóstico impreciso, o deficiente controle sanitário, a medicina popular, as

dificuldades para o estabelecimento do diagnóstico correto de um processo

infeccioso, e a falta de fiscalização da venda de antimicrobianos são fatores que

contribuem para o uso impróprio e, consequentemente, para o aumento na formação

de cepas multirresistentes (LUCIBANCA NETO, 2004).

Assim, a determinação da qualidade destes medicamentos considerando

os conceitos de biofarmacotécnica bem como as bases científicas da

intercambialidade é um fator extremamente importante. Desvios nas características

recomendadas podem significar riscos graves para a saúde dos pacientes, podendo

até mesmo tornar-se um problema de saúde pública (PUGENS; DONADUZZI;

MELO, 2008). A intercambialidade entre um medicamento genérico e seu respectivo

medicamento de referência baseia-se no conceito de equivalência terapêutica entre

os mesmos (SHARGEL & YU, 1999).

A legislação brasileira, tendo como base a regulamentação técnica e a

experiência de diversos países na área de medicamentos genéricos, estabelece que

para um medicamento ser registrado como genérico é necessário que se comprove

sua equivalência farmacêutica e bioequivalência (mesma biodisponibilidade) em

relação ao medicamento de referência indicado pela ANVISA (BRASIL, 2003).

Tal fato, aliado ao cumprimento das Boas Práticas de Fabricação e

Controle de Qualidade (BPFC), fornecem as bases técnicas e científicas para a

intercambialidade entre o genérico e seu medicamento de referência, uma vez que,

nesse caso, ambos podem ser considerados equivalentes terapêuticos, ou seja,

medicamentos que apresentam a mesma eficácia clínica e o mesmo potencial para

gerar efeitos adversos (MARZO & BALANT, 1995; MEREDITH, 1996; WHO, 1996;

BENET, 1999; MARZO, 1999; MEYER, 1999).

78

Neste contexto, o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, mais

eficazes e seguros, contribui para o aumento da utilização dos medicamentos que se

tornaram uma importante ferramenta terapêutica nas mãos dos profissionais da

saúde que são os responsáveis por parte significativa da melhoria da qualidade e

expectativa de vida da população.

A confiabilidade dos medicamentos é assegurada através das definições

de rígidos critérios de qualidade adequados para a análise de concessão de registro

desses medicamentos, previstos na legislação. A garantia desses padrões de

qualidade constitui uma ferramenta para a segurança e a confiabilidade dos

medicamentos (SOARES, 2002).

O desenvolvimento e validação de uma metodologia bioanalítica para

quantificação de fármacos em matrizes biológicas quer seja sangue total, plasma,

soro ou urina, é uma ferramenta de grande importância para o controle de qualidade

dos medicamentos. Além disso, é um fator determinante na geração de dados

reprodutíveis e confiáveis após execução de estudos farmacocinéticos.

79

OBJETIVOS

80

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Desenvolver e validar uma metodologia bioanalítica para a quantificação

simultânea de Sulfametoxazol+Trimetoprima e quantificação de sulfadiazina

em plasma humano por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à

espectrometria de Massa (LC-MS/MS).

3.2 Objetivos específicos

Avaliar os parâmetros farmacocinéticos relacionados à absorção dos

fármacos sulfametoxazol, trimetoprima e sulfadiazina em voluntários sadios

de ambos os sexos.

Aplicar a metodologia bioanalítica em estudo de biodisponibilidade

comparativa de formas farmacêuticas orais contendo a associação dos

fármacos sulfametoxazol+trimetoprima em voluntários sadios de ambos os

sexos.

Aplicar a metodologia bioanalítica em estudo de biodisponibilidade

comparativa de formas farmacêuticas orais contendo sulfadiazina em

voluntários sadios de ambos os sexos.

81

METODOLOGIA

82

4 METODOLOGIA

4.1 Materiais Utilizados

4.1.1 Etapa Clínica

Os materiais descritos nas tabelas 3 e 4 foram utilizados durante o

período dos internamentos dos voluntários participantes dos ensaios clínicos.

Tabela 3: Materiais utilizados nas etapas clínicas.

Material Utilizado para Coleta Fabricante

Agulhas descartáveis 25x8 BD – USA

Agulhas 21G x 1 Vacutainer BD – USA

Álcool 70% HUWC-UFC

Algodão Johnson and Johnson – USA

Heparina sódica Hipolabor

Coletores de urina Fornecido pelo Laboratório Louis Pasteur

Pipetas ajustáveis (100µL, 200µL,

1000µL) Gilson Pipetman, França

Ponteiras plásticas para pipetas

(capacidade 5-200µL) Unilab, Brasil


(capacidade 200-1000µL) Unilab, Brasil

Seringas descartáveis de 10ml BD – USA

Suporte para conexão da agulha BD – USA

Tubos Vacutainer BD – USA

Tubos plásticos para armazenar

plasma (Criotubos) Corning Costar Corporation – Canadá

83

Tabela 4: Equipamentos utilizados nas etapas clínicas.

Aparelhos Fabricante

Termômetro thermo flat Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda –

Brasil

Esfignomanômetro Tycos 7050 - 14 Tycos – USA

Estetoscópio Lytmman – USA

Eletrocardiógrafo Dixtal – Brasil

Balança Balmak - Brasil

Centrífuga Eppendorf

Freezer horizontal – 20ºC Eletrolux - Brasil

4.1.2 Etapa Analítica

Para o desenvolvimento, validação e aplicação das metodologias

bioanalíticas propostas foram utilizados equipamentos, padrões, reagentes e

amostras biológicas, descritos nas tabelas 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

Tabela 5: Materiais utilizados para quantificação dos fármacos.

Descrição Fabricante/País

Pipetas automáticas ajustáveis (P200,

P1000 e P10000) Gilson Pipetman, França


(capacidade 5-200µL e 200-1000µL) Axygen, USA

Tubos de ensaio 120 x 12 mm Unilab, Brasil

Tubos de ensaio 75 x 12 mm Unilab, Brasil

Tubos de plástico (capacidade de 2 mL) Axygen, USA

Mesa agitadora (Finemixer) Fine PCR, Coréia

Misturador (Vortex) Phoenix, USA

Balança analítica Precisa 40SM-200A, Alemanha

Placa de PCR 96 poços Eppendorf

84

Tabela 6: HPLC utilizado para quantificação dos fármacos.

Componente Fabricante/Modelo

Bomba analítica Agilent/Alemanha - G1311A

Controladora Agilent/Alemanha - G1379A

Auto-injetor CTC Analytics, Suíça/HTS Pal

Coluna analítica (SMX+TMP) Genesis C18 150 x 4,6mm, 4 micra

Coluna analítica (Sulfadiazina) Genesis C18 100 x 2.1 mm, 4 micra

Tabela 7: Espectrômetro de Massa utilizado para quantificação dos fármacos.

Componente Fabricante/Modelo

Espectrômetro de Massa Sciex/Applied Biosystems, Canadá/API3000

Fonte Sciex/Applied Biosystems, Canadá/Turbospray

positivo

Programa Sciex/Applied Biosystems, Canadá/Analyst v 1.4.1

A fim de conduzir os testes, a qualidade dos padrões de referência

usados na preparação das soluções foi avaliada. Encontram-se registrados na

tabela que se segue a origem e o número de lote dos padrões analíticos utilizados.

Uma cópia dos certificados de análise para os analitos e os padrões internos estão

anexadas nos apêndices 03, 04, 05 e 06.

Tabela 8: Padrões Analíticos utilizados para quantificação dos fármacos.

Descrição Finalidade Fabricante

Sulfametoxazol Analito Sigma

Trimetoprima Analito Sigma

Sulfadiazina Analito Riedel-de Haen

Metoprolol Padrão interno USP

Sulfametoxazol Padrão interno Sigma

85

Tabela 9: Reagentes utilizados na quantificação de SMX+TMP.

Descrição Finalidade

Acetonitrila (Grau HPLC) Extração líquido-líquido

Metanol (Grau HPLC) Constituinte da fase móvel

Fosfato de sódio dibásico (Grau p.a) Extração líquido-líquido

Água (purificada através de Milli-Q) Constituinte da fase móvel

Acido fórmico (Grau p.a) Constituinte da fase móvel

Acetato de etila (grau HPLC) Extração líquido-líquido

Tabela 10: Reagentes utilizados na quantificação de sulfadiazina.

Descrição Finalidade

Acetonitrila (Grau HPLC) Extração líquido-líquido

Metanol (Grau HPLC) Constituinte da fase móvel

Fosfato de sódio dibásico (Grau p.a) Extração líquido-líquido

Água (purificada através de Milli-Q) Constituinte da fase móvel

Acido fórmico (Grau p.a) Constituinte da fase móvel

Acetato de etila (Grau HPLC) Extração líquido-líquido

Foram utilizadas quantidades apropriadas de plasmas humanos, oriundos de

voluntários distintos, sob as seguintes condições: 4 lotes de plasma humano normal,

1 lote de plasma humano hiperlipêmico e 1 lote de plasma humano hemolisado.

86

4.2 Protocolo Clínico

4.2.1 Delineamento dos estudos

A pesquisa consistiu de dois estudos abertos, randomizados, com 2

tratamentos, 2 períodos (2 sequências), nos quais os voluntários (12 homens e 12

mulheres, não grávidas para sulfametoxazol+Trimetoprima e 12 homens e 12

mulheres, não grávidas para sulfadiazina) receberam, em cada período distinto, a

formulação teste ou a formulação referência, seguida por um copo de água de

200mL de água havendo, por conseguinte, dois braços de tratamento.

As formulações foram administradas em dose única por via oral, seguida

de coletas de sangue de pelo menos 4 meias-vidas. Os períodos de tratamento

obedeceram a um intervalo mínimo de 7 meias-vidas entre eles (washout).

Depois da seleção, foram observados por um período de pelo menos

quatro semanas sem fazer uso de qualquer medicação. Os voluntários qualificados

para participar do estudo foram internados por dois períodos de aproximadamente

36 horas, com pelo menos cinco dias de intervalos entre os internamentos. Em cada

internamento, os voluntários receberam, em jejum, a formulação referência ou a

formulação teste e acordo com tabela de randomização.

4.2.2 Seleção dos voluntários

Após um esclarecimento inicial sobre as condições nas quais são

desenvolvidas as pesquisas clínicas, os voluntários participaram de um processo de

seleção. Nesta etapa, a avaliação clínica inicial (pré-estudo) consistiu em uma

história clínica a fim de pesquisar sintomas relativos a alergias, manifestações

relativas aos olhos, nariz, ouvidos, orofaringe, sistema respiratório, cardiovascular,

gastrintestinal, geniturinário, sistema nervoso central, linfo-hematopoético, endócrino

e metabólico, musculoesquelético e dermatológico. Aspectos relativos à estabilidade

emocional, antecedente de hipersensibilidade a drogas, antecedentes cirúrgicos,

antecedentes patológicos familiares e outros, considerados importantes no

momento, também foram investigados.

87

No exame físico foram registrados: a altura (em centímetros), o peso

corporal (em quilogramas), com posterior cálculo do Índice de Massa Corporal (IMC),

e a temperatura axilar (em graus Celsius). Exame dos segmentos corporal foi

efetuado, avaliando-se o aspecto geral, a pele, cabeça e pescoço, olhos, ouvidos,

nariz, boca, orofaringe, tórax e pulmões, coração, abdômen, coluna vertebral,

genitália, linfonodos, extremidades.

4.2.3 Sinais vitais

No período de realização do pré-estudo, pós-estudo e durante o estudo

clínico a pressão arterial diastólica e sistólica, a frequência de pulso e a temperatura

axilar foram aferidas e registradas no Formulário de Relato de Caso (CRF).

4.2.4 Exame cardiológico

Eletrocardiograma convencional com 12 derivações foi realizado

juntamente com os outros exames laboratoriais antes e após o final da etapa clínica.

Os parâmetros: SÂP (vetor resultante da despolarização atrial), SÂQRS (vetor

resultante da despolarização ventricular), SÂT (vetor resultante da repolarização

ventricular), ritmo e frequência cardíaca, duração do complexo QRS e dos intervalos

P-R e Q-T, foram registrados.

Foram observadas também a presença de distúrbios da condução

intraventricular e atrioventricular, sinais de sobrecargas de câmaras atriais e

ventriculares. O laudo final era referido como normal, anormal não clinicamente

significante ou anormal com significado clínico.

4.2.5 Exames laboratoriais

Os seguintes exames laboratoriais foram realizados nos períodos pré-

estudo (período de avaliação para seleção de voluntários saudáveis) e pós-estudo

(período após o segundo e último internamento).

88

a) Análise Hematológica: Hemoglobina, Hematócrito, Contagem total e diferencial

de leucócitos, Contagem de plaquetas e Velocidade de Hemossedimentação (VHS).

b) Análise bioquímica: Ureia, Creatinina, Bilirrubina Total, Proteína Total, Albumina,

Glicose em jejum, Fosfatase alcalina, Aspartato-amino-transferase (AST), Alanina-

amino-transferase (ALT), Colesterol total, Triglicérides, Ácido úrico e Gama GT.

c) Sumário de urina

d) Análise sorológica: Hepatite B, Hepatite C, HIV (Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida - AIDS) e teste sorológico para gravidez (Beta-HCG) para voluntários do

sexo feminino.

Exames realizados somente no pré-estudo: Análise Sorológica.

4.2.6 Valores de referência dos exames laboratoriais

Os valores utilizados como referência para os exames laboratoriais foram

fornecidos pelo laboratório de patologia clínica responsável por estas análises,

Laboratório Louis Pasteur.

Os parâmetros de normalidade para o parasitológico de fezes, análise

sorológica para hepatite B, C e HIV devem consistir de resultados negativos.

4.2.7 Critérios de inclusão

Os seguintes critérios foram satisfeitos para que o voluntário pudesse

participar do estudo:

Homem ou Mulher com idade entre 18 a 50 anos. As mulheres não poderiam

estar grávidas e nem em regime de amamentação;

Voluntário com índice de massa corpórea maior do que 19 e menor do que

30;

89

Boas condições de saúde ou sem doenças significativas, a juízo médico, de

acordo com as regras definidas no protocolo, e avaliações a que foi

submetido: história clínica, medidas de pressão e pulso, exame físico e

psicológico, ECG e exames laboratoriais complementares;

Capaz de compreender a natureza e objetivo do estudo, inclusive os riscos e

efeitos adversos e com intenção de cooperar com o pesquisador e agir de

acordo com os requerimentos de todo o ensaio, o que vem a ser confirmado

mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

4.2.8 Critérios de exclusão

A resposta positiva a qualquer um dos seguintes critérios excluiria o

voluntário do estudo:

4.2.8.1 Probelmas relacionados com os fármacos

O voluntário tem sabidamente uma hipersensibilidade ao fármaco estudado

(sulfametoxazol, trimetoprima ou sulfadiazina) ou a compostos

quimicamente relacionados; história de reações adversas sérias ou

hipersensibilidade a qualquer droga;

História ou presença de doenças hepáticas ou gastrointestinais ou outra

condição que interfere com a absorção, distribuição , excreção ou

metabolismo da droga;

Uso de terapia de manutenção com qualquer droga, excetuando-se

anticoncepcionais por via oral;

4.2.8.2 Doenças ou problemas de saúde

Tem história de doença hepática, renal, pulmonar, gastrintestinal, epiléptica,

hematológica ou psiquiátrica; tem hipo ou hipertensão de qualquer etiologia

que necessite de tratamento farmacológico; tem história ou teve infarto do

miocárdio, angina e/ou insuficiência cardíaca;

90

Achados eletrocardiográficos não recomendados, a critério do investigador,

para participação no estudo;

Os resultados dos exames laboratoriais complementares estão fora dos

valores considerados normais, de acordo com as normas deste protocolo, a

menos que sejam considerados não clinicamente significativos pelo

investigador;

4.2.8.3 Hábitos ou dependências

Voluntário é fuma mais de 10 cigarros por dia;

O voluntário ingere mais do que 5 xícaras de café ou chá por dia;

Tem história de abuso de álcool ou drogas;

4.2.8.4 Outras condições encontradas nos dias/meses que antecederam

os estudos

Fez uso de medicação regular dentro das 4 semanas que antecedem o início

do tratamento deste estudo, ou fez uso de qualquer medicação dentro de uma

semana antes do início do tratamento deste estudo. Ou os casos em que,

com base na meia-vida do fármaco e/ou metabólitos ativos, possa ser

assumida a completa eliminação;

Foi internado por qualquer motivo durante as oito semanas que antecedem o

início do tratamento deste estudo;

Voluntária grávida ou amamentando;

Tratamento dentro dos três meses prévios ao estudo com qualquer fármaco

conhecido de ter um potencial tóxico bem definido nos grandes órgãos;

O voluntário participou de qualquer estudo experimental ou ingeriu qualquer

fármaco experimental dentro dos três meses que antecedem o início deste

estudo;

O voluntário doou ou perdeu 450 mL ou mais de sangue dentro dos três

meses que antecedem o início do tratamento deste estudo ou que doou mais

91

de 1500 mL dentro dos 12 meses anteriores ao início do tratamento deste

estudo;

O voluntário tem qualquer condição que o impede de participar do estudo pelo

julgamento do investigador.

4.2.9 Restrições e proibições antes, durante e após os estudos

4.2.9.1 Medicamentos

Uso de medicação regular dentro das quatro semanas que antecedem o

início do tratamento dos estudos e/ou fez uso de qualquer medicação dentro de uma

semana antes do início dos tratamentos destes estudos. Ou os casos em que, com

base na meia-vida do fármaco e/ou metabólitos ativos, possa ser assumida a

completa eliminação; com base na sua meia-vida (pelo menos 5 t1/2). Caso o

processo de seleção tenha se iniciado menos de 30 dias antes da data programada

para o primeiro período dos estudos, esta restrição foi cuidadosamente verificada

através de questionamento ao voluntário.

Durante o intervalo entre os internamentos foi evitado uso de qualquer

medicação concomitante, inclusive aquelas vendidas sem prescrição médica. Na

ocorrência de ingestão de medicamentos, o investigador clínico avaliou se, com

base na meia-vida do fármaco e/ou metabólitos ativos, poderia ser assumida a

completa eliminação da medicação e, por conseguinte, a não interferência com a

condução dos estudos. Todavia, em caso de emergência, incluindo eventos

adversos, o investigador clínico poderia decidir administrar medicações, as quais

considerassem absolutamente necessárias para o bem-estar dos voluntários. Neste

caso, o uso da medicação deveria também ser registrado apropriadamente no

Formulário de Relato de caso (CRF).

4.2.9.2 Dieta

Não foi permitido, desde 12 horas antes até da última coleta de sangue de

cada internação (período de tratamento), o consumo dos seguintes produtos:

cafeína; bebidas que contenham xantina (chá, café, cola); e bebidas alcoólicas.

92

Além da proibição nos períodos mencionados, o consumo de bebidas

alcoólicas foi limitado durante toda a etapa clínica.

Durante as internações, foram considerados os períodos de jejum,

incluídas as restrições de líquidos. Também não foi permitida a ingestão de qualquer

outro alimento (incluindo doces, pastilhas, gomas, chicletes, pastilhas para garganta,

salgadinhos ou biscoitos de qualquer tipo), além dos programados.

A não observância destas restrições foi informada ao Investigador Clínico,

o qual decidiu se era permitido que o voluntário permanecesse no estudo. O fato e

suas características foram registrados no Formulário de Relato de Caso (CRF).

4.2.9.3 Outras restrições e proibições

Reiterou-se a proibição quanto ao uso de drogas, critério de

exclusão/desligamento do Estudo. Também não foi permitida doação de sangue

durante o estudo. A perda involuntária de sangue deveria ser comunicada à equipe

médica, que tomaria as providências cabíveis.

4.2.10 Critérios para retirada do estudo

4.2.10.1 Por solicitação do voluntário

Voluntário não deseja continuar no estudo por razões pessoais (ou mesmo

sem relatar a razão);

Voluntário não deseja continuar no estudo devido os eventos adversos da

droga de estudo (efeitos não desejáveis possivelmente relacionados ao

fármaco em estudo);

Voluntário não deseja continuar por razões outras que não efeitos adversos

por exemplo indisponibilidade, intolerância aos procedimentos do estudo;

93

4.2.10.2 Por determinação do investigador

Não aderência às exigências do protocolo;

Eventos adversos ou sintomas ou sinais de possível toxicidade;

Doença intercorrente requerendo medicação;

Resposta positiva à reavaliação de qualquer um dos critérios de exclusão, no

momento da admissão ao primeiro período de tratamento ou em ocasião

subseqüente;

Qualquer outra condição que, a juízo do investigador, seja do interesse para

manutenção da saúde do voluntário.

4.2.11 Entrada do voluntário no estudo

Os voluntários foram aceitos no estudo somente quando considerados

saudáveis como determinado pela história médica, exame físico e exames

laboratoriais que antecederam o início do estudo.

Uma vez avaliada a higidez, os voluntários foram submetidos a uma

entrevista para avaliação das condições emocionais para participar da investigação.

Após todas as dúvidas terem sido esclarecidas aos voluntários, e os mesmos tendo

concordado com o protocolo clínico, foi assinado o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (Apêndices 07 e 08) para participação no estudo.

4.2.12 Local e forma de confinamento dos voluntários

Os voluntários foram orientados a se apresentarem para internação, na

Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Faculdade de Medicina – UFC, às 20:00 horas da noite anterior de

cada período de tratamento, e que permanecessem na UNIFAC pelo menos 36

horas após administração da medicação. Os voluntários tiveram cuidados

especializados durante todos os períodos de tratamento, o que incluía uma

94

averiguação de suas condições quando de seu confinamento e no momento da alta,

de forma a possibilitar avaliar sua aderência aos quesitos do protocolo clínico.

A Unidade Farmacologia Clínica dispõe de uma estrutura assistencial

própria, que consiste de:

Unidade para ensaios clínicos com 25 leitos providos de: mesa auxiliar com

um pequeno armário de tampo móvel para utilização como mesa de estudo;

aparelho de TV;

Enfermaria com: carrinho de emergência com medicações necessárias e

padronizadas pelo serviço de Farmácia; monitor cardíaco; oxímetro de pulso;

desfibrilador; respirador; aspirador de secreções;

Posto de enfermagem com: materiais de consumo médico-hospitalar; material

para pequena cirurgia; balança antropométrica; tensiômetros; estetoscópios;

cronômetros; termômetros;

Roupas específicas para os voluntários, não sendo permitido outro tipo de

vestuário, durante os internamentos;

Sala de convivência provida de: aparelhos de TV; vídeo e jogos (as visitas

geralmente são permitidas entre as 14:00h e 17:00h, dependendo do horário

de coleta das amostras);

Telefone para ligações fixas locais;

Estrutura laboratorial com equipamentos para processamento e

armazenamento de amostras biológicas;

A Unidade de Farmacologia Clínica dispõe ainda, do apoio de uma Unidade

de Terapia Intensiva (UTI) do Hospital de Messejana.

4.2.13 Horários de Jejum e Alimentação

Os voluntários permaneceram em jejum desde 08 horas antes da

administração da medicação e até 3 horas após a ingestão da medicação. A fim de

manter a padronização dos grupos de tratamento, a dieta (alimentos e líquidos)

oferecida, obedeceu ao mesmo padrão para todos os voluntários, e de preferência

95

os alimentos e bebidas servidos foram ingeridos por completo. Foi anotado o horário

do início e fim de cada refeição, bem como o de início das ingestões programadas

de líquidos.

Foram servidas as seguintes refeições padronizadas:

Na noite de cada confinamento (até às 21h) será oferecida aos voluntários

uma refeição leve;

Após 3 horas da administração da medicação foi servido um desjejum leve;

Após 5-6 horas após a administração da medicação, foi servido um almoço;

Após 8-9 horas da administração foi oferecido um lanche da tarde;

Após 10-12 horas da administração foi servido um jantar;

Após 14-15 horas da administração foi servida uma ceia;

No dia seguinte (24 horas após a administração) foi oferecido um café da

manhã padronizado e um almoço.

Foram especificamente programadas as seguintes ingestões de líquido:

A ingestão de líquidos ad libitum será permitida até 3 horas antes da

administração do fármaco. Água e líquidos (sem cafeína) foram permitidos ad

libitum após 3 horas da dose;

A medicação foi administrada com 200 mL de água mineral sem gás.

Não foi permitido fumar durante o período do internamento. Medicações

concomitantes foram evitadas quando possível, mas em caso de necessidade, foram

registradas em formulário apropriado. O consumo de álcool foi limitado durante o

período de estudo e evitado completamente durante as 48 horas que antecederam

cada coleta de sangue.

96

4.2.14 Formulações estudadas

Tabela 11: Descrição das formulações de Sulfametoxazol+Trimetoprima.

Formulação Teste Formulação Referência

Nome do Fármaco Sulfametoxazol +

Trimetoprima

Sulfametoxazol +

Trimetoprima

Nome da Marca Bacsulfaprim® Bactrim®

Forma Farmacêutica Suspensão oral Suspensão oral

Dose/unidade 40mg + 8mg/mL 40mg + 8mg/mL

Nome do Fabricante Laboratório Sobral Produtos Roche Químicos

e Farmacêuticos S.A

Endereço do

Fabricante

Rua Bento Leão, 25

Floriano – Piauí - PI

Estrada dos bandeirantes,

2020 – Rio de Janeiro, RJ

Número do Lote 206068 RJ0443

Data de Fabricação 02/2007 01/2007

Prazo de Validade 02/2009 01/2010

97

Tabela 12: Descrição das formulações de Sulfadiazina.

Formulação Teste Formulação Referência

Nome do Fármaco Sulfadiazina Sulfadiazina

Nome da Marca Sulfazina® Suladrin®

Forma Farmacêutica comprimido comprimido

Dose/unidade 500mg 500mg

Nome do Fabricante Laboratório Sobral Laboratório Catarinense

Endereço do

Fabricante

Rua Bento Leão, 25

Floriano – Piauí - PI

Rua Dr. João Colin, 1053 -

América - Joinville - SC

Número do Lote 114299 14916

Data de Fabricação 07/2007 06/2007

Prazo de Validade 07/2010 06/2012

4.2.15 Procedimento para randomização

Os estudos foram abertos e randomizados, sem procedimentos de

codificação cega. A sequencia de tratamento atribuída a cada voluntário nos

períodos de estudo foi determinada por uma lista de randomização, de acordo com o

desenho de Williams descrito na Resolução - RE nº 898, de 29 de maio de 2003 da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa). Os voluntários foram

randomicamente designados a uma das seguintes sequencias de tratamento

(Tabela 13).

Tabela 13: Delineamento cruzado 2x2.

Sequencia Período I Período II

1 R T

2 T R

98

4.2.16 Posologia

Os voluntários receberam, conforme randomização proposta, as

formulações teste e referência, como dose única, entre 7:00 e 8:00 da manhã do dia

após o confinamento (o tempo será anotado no CRF), acompanhado de 200 mL de

água mineral sem gás.

Para a associação contendo sulfametoxazol + trimetoprima, foram

administrados 20mL da suspensão oral contendo 40mg de sulfametoxazol + 8mg de

trimetoprima por mililitro. Para formulação contendo sulfadiazina foi administrado 1

comprimido de 500mg de cada formulação.

4.2.17 Coletas de sangue

As coletas de sangue para determinação das concentrações plasmáticas

de sulfametoxazol, trimetoprima e sulfadiazina foram obtidas, através de cateter

venoso heparinizado, introduzido em veia superficial do antebraço do voluntário,

imediatamente antes da administração de uma das formulações estudadas e nos

seguintes intervalos a partir da administração (Tabela 14).

Tabela 14: Cronograma de coleta de amostras dos fármacos estudados.

FÁRMACO PRÉ-DOSE PÓS-DOSE

(após a administração da medicação)

Sulfametoxazol

+

Trimetoprima

TEMPO ZERO:

Imediatamente antes

(dentro de 1 hora) da

administração do

medicamento

15 min, 30 min, 45 min; e 1, 1:20, 1:40, 2,

2:30, 3, 3:30, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24, 36, 48

horas

Sulfadiazina 30 min, e 1, 1:30, 2, 2:30, 3, 3:30, 4, 4:30, 5,

6, 7, 8, 10, 12, 24, 36, 48 horas

99

A cada intervalo, foram coletados 8mL de sangue e colocados em tubos

vacuteiner de vidro contendo 30L de heparina. Em seguida, as amostras foram

centrifugadas a 3000rpm, na temperatura de 8°C durante 15 minutos e o plasma

separado e colocado em dois tubos de plástico (criotubos) devidamente

identificados. Em seguida, os criotubos foram devidamente armazenados em

freezer, numa temperatura de –20ºC, até sua análise (Figura 15).

Figura 15: Esquema do procedimento de coleta de sangue e separação de

amostras plasmáticas.

4.2.18 Avaliação da segurança

Para fins de acompanhamento de segurança, os voluntários foram

observados durante os estudos visando à detecção de eventos adversos. Uma

experiência adversa inclui qualquer alteração prejudicial, patológica ou indesejada,

na função anatômica, física ou metabólica, conforme indicada pelos sinais físicos,

sintomas e/ou alterações laboratoriais que ocorram em qualquer fase do estudo

clínico, associada ou não com o medicamento do estudo (GUZZO, 2004).

Qualquer evento adverso ocorrendo durante o período de estudo, foi

registrado em detalhes na página apropriada para relato de evento adverso.

Retirada do plasma Armazenamento

Retirada de 8 mL de sangue

Tubo heparinizado

Centrifugação

Separação

100

independente de estarem ou não relacionadas com a administração do fitoterápico.

As perguntas realizadas para saber se os voluntários tiveram algum evento adverso

foram limitadas a perguntas gerais, tais como: "Como vai você?" Foi solicitado ao

voluntário que relatasse qualquer evento adverso, o dia da manifestação e se foi

necessário usar medicação adicional.

Os eventos adversos foram classificados quanto à intensidade como:

Leve: Quando facilmente tolerado;

Moderado: Desagradável o bastante para interferir nas atividades

cotidianas;

Severo: Se impossibilita à realização das atividades cotidianas

normais.

Para a classificação dos eventos adversos, quanto à relação de

causalidade, foram utilizados os critérios descritos a seguir.

O evento é atribuído quando: (1) existem informações científicas prévias

sobre o evento; (2) provas com evidências objetivas (exames laboratoriais, pressão

arterial e outros) ou subjetivas (clínicas); (3) o evento apareceu com sequencia

temporal plausível após a administração do medicamento; (4) não há fatores

alternativos que podem ter causado o evento observado; (5) houve melhora clínica

plausível após a retirada do medicamento (após eliminação) ou pela administração

de um antagonista; (6) o voluntário já apresentou reação semelhante com o uso do

mesmo medicamento ou com o uso de medicamentos do mesmo grupo

farmacológico ou (7) a reação reapareceu quando se re-administrou o medicamento

(GUZZO, 2004).

O evento é provável quando: (1) existem informações científicas prévias



temporal plausível após a administração do medicamento; (4) não há fatores

101

alternativos que podem ter causado o evento observado, ou (5) houve melhora

clínica plausível após a retirada do medicamento (após eliminação) ou pela

administração de um antagonista, porém (1) o voluntário não apresentou reação

semelhante com o uso do mesmo medicamento ou com o uso de medicamentos do

mesmo grupo farmacológico e (2) a reação não reapareceu quando se re-

administrou o medicamento (GUZZO, 2004).

O evento é possível quando: (1) existem informações científicas prévias



temporal plausível após a administração do medicamento, entretanto (1) há fatores

alternativos que podem ter causado o evento observado; (2) não há melhora clínica

plausível após a retirada do medicamento (após eliminação) ou pela administração

de um antagonista; (3) o voluntário não apresentou reação semelhante com o uso do

mesmo medicamento ou com o uso de medicamentos do mesmo grupo

farmacológico e (4) a reação não reapareceu quando se re-administrou o

medicamento (GUZZO, 2004).

O evento é classificado como não atribuído quando: (1) não existem

informações científicas prévias sobre o evento; (2) não há provas com evidências

objetivas (exames laboratoriais, pressão arterial e outros) ou subjetivas (clínicas); (3)

o evento apareceu com sequência temporal improvável após a administração do

medicamento; (4) há fatores alternativos que podem ter causado o evento

observado; (5) não há melhora clínica plausível após a retirada do medicamento

(após eliminação) ou pela administração de um antagonista; (6) o voluntário não

apresentou reação semelhante com o uso do mesmo medicamento ou com o uso de

medicamentos do mesmo grupo farmacológico e (7) a reação não reapareceu

quando se re-administrou o medicamento (GUZZO, 2004).

4.2.19 Aspectos éticos

Os projetos de pesquisa, com os protocolos clínicos dos estudos

juntamente com os Termos de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndices 07 e

08) foram submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

102

Universidade Federal do Ceará, credenciado pelo Conselho Nacional de Saúde/MS.

Nenhuma das etapas dos ensaios clínicos foi iniciada antes da aprovação do

protocolo experimental pelo Comitê de Ética e todos os consentimentos dos

voluntários foram obtidos por escrito após orientação sobre riscos e benefícios dos

estudos.

Os ensaios clínicos foram conduzidos de acordo com os padrões

estabelecidos pela Resolução n° 894 de 29 de maio de 2003 – Anvisa, pelo ICH

Harmonized Tripartite Guideline for Good Clinical Practice (1996), Declaração de

Helsinque (1964) e suas revisões de Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong Kong

(1989), Somerset West (1996), Edimburgo (2000), Washington (2002), Tóquio

(2004), Seul (2008), assim como Resolução 196/96 do CNS-MS.

4.2.19.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Segundo a Declaração do Congresso Nacional de Bioética (SIBI),

realizado em junho de 2000, o art. 11º, dedicado aos temas da pesquisa e

experimentação, relata que “os sujeitos das experimentações deverão dar seu

consentimento livre e esclarecido e plenamente informado”.

Os voluntários selecionados para esse estudo receberam explanação

sobre a natureza e os objetivos do estudo. Foi enfatizado que o trabalho teria a

finalidade de pesquisa e que o voluntário não poderia esperar qualquer efeito

terapêutico. O voluntário também tinha conhecimento da sua liberdade para se

retirar a qualquer momento do estudo sem que isto lhe cause qualquer prejuízo no

seu atendimento junto à Unidade de Farmacologia Clínica ou ao Hospital

Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará. Foi solicitado a

cada voluntário que, caso concordasse com o protocolo de estudo, assine o Termo

de Consentimento Livre e Esclarecido para a participação do estudo.

4.2.20 Parâmetros Farmacocinéticos avaliados

Os parâmetros farmacocinéticos avaliados na bioequivalência derivam

diretamente da curva de concentração do medicamento ao longo do tempo, que é

103

caracterizada pela quantificação de um determinado número de amostras biológicas,

relativas aos tempos de coleta previamente estabelecidos.

Os parâmetros farmacocinéticos calculados para os fármacos em estudo

estão descritos na tabela 15.

Tabela 15: Parâmetros Farmacocinéticos determinados.

Parâmetro Definição

ASCúltimo

Área sob a curva de concentração da droga versus

tempo do tempo 0 (zero) ao tempo da última

concentração acima do Limite de Quantificação

(LOQ), calculada pelo método linear trapezoidal;

ASCinfinito ASC0-túltimo + ASCextrapol

Cmax Concentração máxima no plasma

Tmax Tempo da concentração máxima

t1/2 Tempo de meia vida, t1/2 = ln(2) / λ

4.2.21 Análise Estatística

Os seguintes programas foram utilizados para o cálculo dos parâmetros

farmacocinéticos, estatística descritiva e apresentação dos dados:

WinNonLin Professional Network Edition, Versão 5.2.1;

Microsoft Excel 2003;

Graph Pad Prism. Version 3.02.

Análise estatística foi realizada com base em modelo multiplicativo para

valores de ASC0-túltimo e Cmax. O desenho foi avaliado usando modelo apropriado

(Mixed Models Procedure), tendo tratamento com efeito fixo e voluntário como efeito

aleatório.

104

A avaliação de Biodisponibilidade/Bioequivalência média foi realizada pela

média do intervalo de confiança, usando dois testes unicaudais. O critério

estabelecido para todos os parâmetros foi intervalo de confiança de 90% dentro do

intervalo de 80-125%.

4.3 Protocolo Analítico

4.3.1 Sistema da Garantia da Qualidade e Biossegurança

Os principais benefícios de sistemas de gestão da qualidade em

laboratórios de pesquisa são: maior credibilidade nos resultados e pesquisadores,

comparabilidade e reprodutibilidade de resultados publicados, aumento da confiança

entre as partes envolvidas e facilidade na aquisição de financiamentos.

Para garantir que os estudos realizados atendam às expectativas e

exigências das autoridades regulamentadoras e das organizações que fornecem

reconhecimento, a Unidade de Farmacologia Clínica tem seu escopo de trabalho e

Sistema de Qualidade baseados nas Normas e Resoluções: NBR ISO/IEC

17025:2001; Resolução ANVISA nº 41, de 28 de abril de 2000; Resolução ANVISA

nº 133, de 29 de maio de 2003; Resolução ANVISA nº 135, de 29 de maio de 2003;

Procedimento GGLAS nº 02/17025 e Procedimento GGLAS nº 02/BPL; Boas

Práticas Clínicas.

O objetivo da biossegurança adotada é reconhecer fontes de perigo,

avaliar as situações de risco que essa fonte oferece e controlá-la, tomando decisões

técnicas e/ou administrativas para promover mudanças. Ao adotarmos

procedimentos específicos para evitar ou minimizar os riscos de atividades

potencialmente perigosas, estamos aplicando a biossegurança.

Jaleco, óculos de segurança e luvas de procedimentos; são de uso

obrigatório durante os procedimentos e quando for necessária a manipulação de

soluções biológicas. Procedimentos de segurança utilizados em laboratórios bem

105

como procedimentos adequados para descarte de lixo químico e biológico são

seguidos no desenvolvimento dos ensaios.

4.3.2 Validação das metodologias bioanalíticas para quantificação

dos analitos

A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o

método bioanalítico atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a

confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar precisão, exatidão

linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, especificidade,

reprodutibilidade, estabilidade e recuperação adequadas à análise. Desse modo, é

importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devem apresentar-se

devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente

treinados (BRASIL, 2003c).

4.3.3 Validação pré-estudo para quantificação de

sulfametoxazol+trimetoprima

4.3.3.1 Padrão interno

A escolha do padrão interno utilizado no processo de validação e

desenvolvimento do método bioanalítico proposto deu-se através da análise de sua

estrutura química, bem como do fármaco em estudo. Os critérios utilizados para a

escolha do padrão interno foram: presença de grupos funcionais similares em ambas

às estruturas; semelhança quanto às características químicas de cada molécula; e

composição química elementar. Através desta análise preliminar foi escolhido, como

padrão, interno para a quantificação simultânea de sulfametoxazol + trimetoprima o

metoprolol.

106

4.3.3.2 Condições de detecção no espectrômetro de massa

Escolhido o padrão interno, iniciou-se a avaliação das condições

cromatográficas e do espectrômetro de massa ideais para o desenvolvimento do

método.

O espectrômetro de massa foi calibrado antes do início das análises,

utilizando soluções dos analitos sulfametoxazol, trimetoprima e do padrão interno

metoprolol para avaliar a integridade dos cromatogramas, os íons moleculares e a

performance do espectrômetro.

O espectrômetro de massa equipado com interface turbospray operou no

modo positivo e os íons gerados foram monitorados através do monitoramento de

múltiplas reações (MRM). Os íons moleculares dos analitos e do padrão interno

apresentaram as seguintes características de detecção: Relação massa/carga (m/z)

de 254,2 > 156,0 para sulfametoxazol, 291,2 > 230,2 para trimetoprima e 268,3 >

116,2 para metoprolol (PI).

A tabela 16 contém os parâmetros individuais da detecção de cada íon

monitorado.

Tabela 16: Parâmetros individuais de detecção dos íons monitorados por

(MRM) para SMX+TMP.

Molécula Íon

precursor

Íon

produto

Tempo

(msec)

Potencial

de

Decluster

(DP)

Energia

de

Colisão

(CE)

Potencial

de saída da

célula de

colisão

(CXP)

Potencial

de

Focussing

(FP)

SMX 254,20 156,00 300 40 23 12 250

TMP 291, 20 230,20 300 31 33 18 150

Metoprolol 268,30 116,20 300 11 27 8 180

107

4.3.3.3 Condições cromatográficas

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando-se um HPLC

modelo G1311A/DE40928625 da Agilent/Alemanha, com bomba binária,

controladora, auto-injetor, coluna analítica (Genesis C18 150 x 4,6mm, 4 micra)

mantida a temperatura de 8ºC.

O cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção por espectrometria

de massas no modo MS/MS foi programado para operar com fluxo de 0,25 mL/min,

volume de injeção de 10 L e o tempo total de corrida foi ajustado para 3,8 min.

4.3.3.4 Extração das amostras (extração líquido-líquido)

Estabelecidas as condições do equipamento, iniciaram-se os testes de

extração das amostras. Os procedimentos de extração líquido-líquido das amostras

foram aplicados não apenas para as amostras dos voluntários analisadas, mas

também para os padrões das curvas de calibração e amostras de controle de

qualidade. Para a extração dos analitos (sulfametoxazol e trimetoprima) e do padrão

interno (metoprolol) das amostras biológicas, os seguintes passos foram seguidos

(Figura 16):

108

Figura 16: Esquema do procedimento de extração líquido-líquido (SMX+TMP).

As amostras foram descongeladas a temperatura ambiente e em

seguida foram colocados 200 µL de plasma em tubos de vidro descartáveis e

devidamente identificados;

Em cada um dos tubos adicionou-se 50 µL de padrão interno (solução

de Metoprolol 0,5 µg/mL);

Adicionar (250 µL) de água em cada tubo;

Em seguida as amostras foram homogeneizadas (vortex) por 10

segundos;

Adicionou-se 500 µL de Acetonitrila e 200 µL de solução tampão

fosfato de sódio dibásico 5mM (pH 6,8);

As amostras foram homogeneizadas (vortex) por 30 segundos e

centrifugadas por 10 minutos em 4000 rpm;

Transferiu-se o sobrenadante para outro jogo de tubos de vidro limpos;

Freezer

AAuuttoo--iinnjjeettoorr

Retirar 200 L

de plasma Adicionar 250 µL de

Água Milli-Q em cada tubo

vortex 10 segundos

Dissolver os resíduos em 0,4

mL de fase móvel

Acrescentar

50 L de metoprolol

(0,5 g/mL)

Centrifugação 4000 rpm/10 min

Retirar

sobrenadante

Adicionar

500 L de Acetonitrila

Adicionar

200 L de tampão fosfato de sódio

dibásico 5mM (pH 6,8)

vortex 30 segundos

Adicionar 4mL de acetate de

etila

vortex 50 segundos

Sobrenadante F. orgânica

F. inorgânica

Retirar a fase

orgânica

Dry Block

(N2) a 40°C Transferir a

solução para placa de PCR

109

Foram adicionados 4 mL de solvente de extração (Acetato de etila) e

em seguida homogeneizou-se as amostras (vortex) por 50 segundos;

A fase orgânica superior foi transferida para outro jogo de tubos de

vidro limpos nos quais as soluções foram evaporadas sob fluxo de N2 a 40ºC;

Os resíduos secos foram dissolvidos com 0,4 mL de Metanol/ Água

(45/55;v/v) + 0,5% de ácido fórmico e em seguida as soluções foram

transferidas para placas de PCR utilizando pipetas automáticas com ponteiras

de plástico descartáveis;

As placas de PCR foram tampadas e transferidas para o sistema

cromatográfico onde foram injetados 10 µL de cada amostra;

4.3.3.5 Preparo das soluções padrões dos analitos e reagentes

Todas as soluções padrões foram preparadas em balões volumétricos

(10mL) corretamente etiquetados e armazenados à 4°C. A exatidão para pesar os

padrões foi de ± 0.01 mg.

As soluções de trabalho de sulfametoxazol e trimetoprima foram

preparadas, a partir de uma diluição apropriada de uma solução estoque (Solução

Máster) 1 mg/mL em acetonitrila/água (50/50, v/v) nas seguintes concentrações

(Tabelas 17, 18).

Tabela 17: Preparo da curva de calibração para sulfametoxazol/trimetoprima.

Analitos Conc. Final

(µg/mL)

Volume adicionado

(mL)

Conc. (µg/mL)

Volume de plasma (mL)

Volume total (mL)

Fator de Diluição

SMX/TMP 100/3,5 0,10/0,10 1000/35 0,80 1 10,0

SMX/TMP 75/2,5 0,10/0,10 750/25 0,80 1 10,0

SMX/TMP 50/1,5 0,10/0,10 500/15 0,80 1 10,0

SMX/TMP 10/0,5 0,10/0,10 100/5 0,80 1 10,0

SMX/TMP 5/0,2 0,10/0,10 50/2 0,80 1 10,0

SMX/TMP 2/0,1 0,10/0,10 20/1 0,80 1 10,0

SMX/TMP 1/0,05 0,10/0,10 10/0,5 0,80 1 10,0

SMX/TMP 0,5/0,02 0,10/0,10 5/0,2 0,80 1 10,0

Padrão zero - - - - - -

Padrão branco - - - - - -

110

A Curva de Calibração consiste em duas amostras branco (amostra de

matriz processada sem padrão interno), duas amostras zero (amostra de matriz

processada com padrão interno) e amostras padrão de plasma (não zero), em

duplicata, cobrindo a faixa prevista das concentrações a serem quantificadas. A

curva de calibração foi preparada com plasma humano controle e com as soluções

de trabalho (Working Solution) preparadas para a curva de calibração contendo os

analitos a serem quantificados.

Os padrões foram preparados diariamente nas quantidades requeridas

para o ensaio. Eles foram extraídos junto com amostras do plasma e os controles de

qualidade (CQs).

Tabela 18: Preparo dos controles de qualidade sulfametoxazol/trimetoprima.

CQ Analitos Conc. Final

(µg/mL)

Volume adicionado

(mL)

Conc. (µg/mL)

Volume de

plasma (mL)

Volume total (mL)

Fator de Diluição

A SMX/TMP 80/2,8 0,2/0,2 800/28 1,60 2 10,0

M SMX/TMP 30/1,2 0,2/0,2 300/12 1,60 2 10,0

B SMX/TMP 1,5/0,06 0,2/0,2 15/0,6 1,60 2 10,0

LQ SMX/TMP 0,5/0,02 0,2/0,2 5/0,2 1,60 2 10,0

As amostras de Controle de Qualidade (CQ) tiveram como finalidade

monitorar a precisão e a exatidão do método de quantificação durante o ensaio.

Os controles de qualidade (CQB, CQM, CQA) foram preparados

diariamente nas quantidades requeridas para o ensaio. Eles foram extraídos junto

com as amostras de plasma dos voluntários e dos padrões de calibração.

A fase móvel utilizada nas análises cromatográficas foi composta por uma

mistura de metanol/água (45/55; v/v) + 0,5% de ácido fórmico. Em uma proveta

graduada (com capacidade para 1000 mL) foi adicionado 450 mL de metanol. Em

outra proveta com capacidade de 1000 mL foram adicionados 550 mL de água Milli-

Q. As soluções devem ser transferidas cuidadosamente em um frasco Schott de

1000 mL de capacidade. Adicionar 5 mL de ácido fórmico. Agitar até total

111

homogeneização. Esta preparação deve ser realizada em capela com exaustão. As

soluções foram levadas ao desgaseificador por no mínimo 10 minutos.

As soluções utilizadas no processo de extração foram: (1) Solução de

Acetato de etila (100%); (2) Solução tampão de fosfato de sódio dibásico 5mM. Para

o preparo desta solução foram pesados 0,1775 gramas de fosfato de sódio dibásico

anidro em um Becker e em seguida dissolvido com 230 mL de água Milli-Q até

completa dissolução. O pH foi ajustado a 6,8 utilizando ácido fosfórico. Após o ajuste

do pH da solução, completou-se o volume a 250 mL utilizando um balão volumétrico

de 250 mL.

4.3.4 Validação pré-estudo para quantificação de sulfadiazina

4.3.4.1 Padrão interno

A escolha do padrão interno utilizado no processo de validação e

desenvolvimento do método bioanalítico proposto deu-se através da análise de sua

estrutura química, bem como do fármaco em estudo. Os critérios utilizados para a

escolha do padrão interno foram: presença de grupos funcionais similares em ambas

às estruturas; semelhança quanto às características químicas de cada molécula; e

composição química elementar. Através desta análise preliminar foi escolhido, como

padrão, interno para a quantificação de sulfadiazina o sulfametoxazol.

4.3.4.2 Condições de detecção no espectrômetro de massa

Escolhido o padrão interno, iniciou-se a avaliação das condições

cromatográficas e do espectrômetro de massa ideais para o desenvolvimento do

método.

O espectrômetro de massa foi calibrado antes do início das análises,

utilizando soluções do analito sulfadiazina e do padrão interno sulfametoxazol para

avaliar a integridade dos cromatogramas, os íons moleculares e a performance do

espectrômetro.

112

O espectrômetro de massa equipado com interface turbospray operou no

modo positivo e os íons gerados foram monitorados através do monitoramento de

múltiplas reações (MRM). Os íons moleculares do analito e do padrão interno

apresentaram as seguintes características de detecção: Relação massa/carga (m/z)

de 251,0 > 108,1 para sulfadiazina e 254,0 > 156,0 para sulfametoxazol (PI).

A tabela 19 contém os parâmetros individuais da detecção de cada íon

monitorado.

Tabela 19: Parâmetros individuais de detecção dos íons monitorados por

(MRM) para sulfadizina.

Molécula

Íon

precursor

Íon

produto

Tempo

(msec)

Potencial

de

Decluster

(DP)

Energia

de

Colisão

(CE)

Potencial

de saída

da célula

de colisão

(CXP)

Potencial

de

Focussing

(FP)

SDZ 251,0 108,1 300 36 33 6 160

SMX 254,0 156,0 300 41 23 10 180

4.3.4.3 Condições cromatográficas

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando-se um HPLC

modelo G1311A/DE40928625 da Agilent/Alemanha, com bomba binária,

controladora, auto-injetor, coluna analítica (Genesis C18 100 x 2,1 mm, 4 micra)

mantida a temperatura de 10ºC.

O cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção por espectrometria

de massas no modo MS/MS foi programado para operar com fluxo de 0,25 mL/min,

volume de injeção de 10 L e o tempo total de corrida foi ajustado para 4 min.

4.3.4.4 Extração das amostras (extração líquido-líquido)

Estabelecidas as condições do equipamento, iniciaram-se os testes de

extração das amostras. Os procedimentos de extração líquido-líquido das amostras

113

foram aplicados não apenas para as amostras dos voluntários analisadas, mas

também para os padrões das curvas de calibração e amostras de controle de

qualidade. Para a extração do analito (sulfadiazina) e do padrão interno

(sulfametoxazol) das amostras biológicas, os seguintes passos foram seguidos

(Figura 17):

Figura 17: Esquema do procedimento de extração líquido-líquido

(sulfadiazina).

As amostras foram descongeladas a temperatura ambiente e em

seguida foram colocados 200 µL de plasma em tubos de vidro descartáveis e

devidamente identificados;

Em cada um dos tubos adicionou-se 50 µL de padrão interno (solução

de Metoprolol 5 µg/mL);

Adicionar (250 µL) de água Milli-Q em cada tubo;

Freezer

AAuuttoo--iinnjjeettoorr

Retirar 200 L

de plasma Adicionar 250 µL de Água Milli-Q em cada tubo

vortex 10 segundos

Acrescentar

50 L de sulfametoxazol

(5 g/mL)

Centrifugação 4000 rpm/10 min

Retirar

sobrenadante

Adicionar

500 L de Acetonitrila

Adicionar

200 L de tampão fosfato de sódio

dibásico 5mM (pH 6,8)

vortex 30 segundos

Adicionar 4mL de acetato de

etila

vortex 50 segundos

Sobrenadante F. orgânica

F. inorgânica

Retirar a fase

orgânica

Dry Block

(N2) a 40°C Transferir a

solução para placa de PCR

Dissolver os resíduos em 0,5

mL de MeOH/H2O (45/55,VV) + 0,5%

de AC. fórmico

114

Em seguida as amostras foram homogeneizadas (vortex) por 10

segundos;

Adicionou-se 500 µL de Acetonitrila e 200 µL de solução tampão

fosfato de sódio dibásico 5mM (pH 6,8);

As amostras foram homogeneizadas (vortex) por 30 segundos e

centrifugadas por 10 minutos em 4000 rpm;

Transferiu-se o sobrenadante para outro jogo de tubos de vidro limpos;

Foram adicionados 4 mL de solvente de extração (Acetato de etila) e

em seguida homogeneizou-se as amostras (vortex) por 50 segundos;

A fase orgânica superior foi transferida para outro jogo de tubos de

vidro limpos nos quais as soluções foram evaporadas sob fluxo de N2 a 40ºC;

Os resíduos secos foram dissolvidos com 0,5 mL de Metanol/ Água

(45/55;v/v) + 0,5% de ácido fórmico e em seguida as soluções foram

transferidas para placas de PCR utilizando pipetas automáticas com ponteiras

de plástico descartáveis;

As placas de PCR foram tampadas e transferidas para o sistema

cromatográfico onde foram injetados 10 µL de cada amostra;

4.3.4.5 Preparo das soluções padrões dos analitos e reagentes

Todas as soluções padrões foram preparadas em balões volumétricos (10

mL) corretamente etiquetados e armazenados a 4°C. A exatidão para pesar os

padrões foi de ± 0,01 mg.

As soluções de trabalho de sulfametoxazol e trimetoprima foram

preparadas, a partir de uma diluição apropriada de uma solução estoque (Solução

Máster) 1 mg/mL em acetonitrila/água (50/50, v/v) nas seguintes concentrações

(Tabelas 20, 21).

115

Tabela 20: Preparo da curva de calibração para sulfadiazina.

Analitos Conc. Final

(µg/mL)

Volume adicionado

(mL)

Conc. (µg/mL)

Volume de plasma

(mL)

Volume total (mL)

Fator de Diluição

Sulfadiazina 25 0,10 250 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 15 0,10 150 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 5 0,10 50 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 2 0,10 20 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 0,5 0,10 5 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 0,2 0,10 2 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 0,1 0,10 1 0,9 1 10,0

Sulfadiazina 0,05 0,10 0,5 0,9 1 10,0

Padrão zero - - - - - -

Padrão branco - - - - - -

A Curva de Calibração consiste em duas amostras branco (amostra de

matriz processada sem padrão interno), duas amostras zero (amostra de matriz

processada com padrão interno) e amostras padrão de plasma (não zero), em

duplicata, cobrindo a faixa prevista das concentrações a serem quantificadas. A

curva de calibração foi preparada com plasma humano controle e com as soluções

de trabalho (Working Solution) preparadas para a curva de calibração contendo o

analito a ser quantificados.

Os padrões foram preparados diariamente nas quantidades requeridas

para o ensaio. Eles foram extraídos junto com amostras do plasma e os controles de

qualidade (CQs).

116

Tabela 21: Preparo dos controles de qualidade sulfadiazina.

CQ Analito Conc. Final

(µg/mL)

Volume adicionado

(mL)

Conc. (µg/mL)

Volume de

plasma (mL)

Volume total (mL)

Fator de Diluição

D Sulfadiazina 40 0,2 400 1,80 2 10,0

A Sulfadiazina 20 0,2 200 1,80 2 10,0

M2 Sulfadiazina 10 0,2 100 1,80 2 10,0

M1 Sulfadiazina 1,5 0,3 15 2,70 3 10,0

B Sulfadiazina 0,15 0,2 1,5 1,80 2 10,0

LQ Sulfadiazina 0,05 0,2 0,5 1,80 2 10,0

As amostras de Controle de Qualidade (CQ) tiveram como finalidade

monitorar a precisão e a exatidão do método de quantificação durante o ensaio.

Os controles de qualidade (CQB, CQM1, CQM2, CQA e CQD) foram

preparados diariamente nas quantidades requeridas para o ensaio. Eles foram

extraídos junto com as amostras de plasma dos voluntários e dos padrões de

calibração.

A fase móvel utilizada nas análises cromatográficas foi composta por uma

mistura de metanol/água (55/65; v/v) + 0,5% de ácido fórmico. Em uma proveta

graduada (com capacidade para 1000 mL) foram adicionados 350 mL de metanol.

Em outra proveta com capacidade de 1000 mL foram adicionados 650 mL de água

Milli-Q. As soluções devem ser transferidas cuidadosamente em um frasco Schott de




As soluções utilizadas no processo de extração foram: (1) Solução de

Acetato de etila (100%); (2) Solução tampão de fosfato de sódio dibásico 5mM. Para

o preparo desta solução foram pesados 0,1775 gramas de fosfato de sódio dibásico

anidro em um Becker e em seguida dissolvido com 230 mL de água Milli-Q até

completa dissolução. O pH foi ajustado a 6,8 utilizando ácido fosfórico. Após o ajuste

117

do pH da solução, completou-se o volume a 250 mL utilizando um balão volumétrico

de 250 mL; (3) Metanol/água (45/55; v/v) + 0,5% de ácido fórmico. Em uma proveta

graduada (com capacidade para 1000 mL) foram adicionados 550 mL de metanol.

Em outra proveta com capacidade de 1000 mL foram adicionados 450 mL de água

Milli-Q. As soluções devem ser transferidas cuidadosamente em um frasco Schott de




4.3.5 Validação das metodologias bioanalíticas

4.3.5.1 Determinação do limite de quantificação (LQ)

O limite de quantificação do método analítico foi definido levando-se em

consideração a sensibilidade, especificidade, precisão e exatidão do método.

Para a determinação do LQ, foram feitas análises da matriz biológica

contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável

com precisão e exatidão aceitáveis. Com isto, tentou-se assegurar que os menores

valores possíveis fossem analisados, por meio de repetições de análises, com

valores sucessivamente menores, quando os inicialmente escolhidos fossem

quantificados com precisão e exatidão aceitáveis.

A determinação do LQ dos métodos propostos seguiram os seguintes

critérios:

A resposta de pico para o LQ deve ser, no mínimo, 5 vezes maior que

qualquer interferência na amostra branco no tempo de retenção do

fármaco;

O pico de resposta do fármaco no LQ deve ser identificável e

reprodutível com precisão de 20% e exatidão entre 80-120% em

relação à concentração nominal do padrão, através da análise de, no

mínimo, cinco amostras dos padrões.

118

4.3.5.2 Curva de calibração/linearidade

Para a determinação da curva de calibração analisaram-se amostras

extraídas da matriz biológica em oito concentrações distintas. A curva de calibração

incluiu a análise da amostra branco (matriz biológica isenta de padrão interno e do

padrão do fármaco), amostra zero (matriz biológica mais o padrão interno) e mais

oito amostras contendo padrão do fármaco e padrão interno contemplando o limite

de variação esperado. As amostras contendo padrão do fármaco e padrão interno

foram analisadas em triplicata.

As concentrações dos padrões foram definidas em testes preliminares,

incluindo a primeira quantificação de amostras, levando-se em consideração a

sensibilidade do método e a faixa prevista das concentrações das amostras a serem

determinadas.

A linearidade da curva de calibração foi avaliada dentro dos seguintes

critérios:

Desvio menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal do

LQ, em pelo menos duas das triplicatas;

Desvio menor ou igual a 15% em relação a concentração nominal para

as outras concentrações da curva de calibração, em pelo menos duas

das triplicatas;

No mínimo 4 de 6 concentrações da curva de calibração devem

cumprir com os critérios descritos, incluindo o LQ e a maior

concentração da curva de calibração;

O coeficiente de correlação será aceito se for igual ou maior do que

0,98.

119

4.3.5.3 Precisão e exatidão

Para avaliar a precisão e a exatidão do método bioanalítico, quatro

concentrações distintas, CQB, CQM, CQA e LQ foram analisadas. Cada amostra foi

analisada em quintuplicata. A precisão e a exatidão foram determinadas em um

mesmo lote (precisão e exatidão intralote) e em lotes diferentes (precisão e exatidão

interlotes). As análises foram realizadas em três baterias para cada parâmetro.

4.3.5.4 Precisão e exatidão intralote

A precisão e exatidão intralote foram definidas segundo os seguintes

critérios:

Precisão: para os controles CQB, CQM e CQA o coeficiente de

variação (CV) não deveria exceder 15%, e para o LQ admitiram-se

valores menores ou iguais a 20%;

Exatidão: o valor da exatidão para as amostras CQB, CQM e CQA não

deve exceder 15% do valor nominal e para o LQ admitiu-se desvios

menores ou iguais a 20%.

4.3.5.4.1 Precisão e exatidão interlote

A precisão e a exatidão interlote seguiram os mesmos critérios de

validação para a precisão e exatidão intralote.

4.3.5.4.2 Precisão e exatidão intra e interlote do processo de diluição

A validação da precisão e exatidão da diluição foi realizada utilizando um

grupo adicional, preparado através de uma mistura de plasma humano branco (sem

analito). As amostras de CQD foram diluídas duas vezes da mesma maneira que as

amostras desconhecidas. Este procedimento foi realizado na validação da

metodologia para quantificação de sulfadiazina.

120

4.3.5.5 Especificidade

Para avaliar a especificidade, foram analisadas amostras de plasma

humano branco obtidos de seis indivíduos do Centro de Hematologia e Hemoterapia

do Ceará. Cada amostra branco foi testada utilizando os procedimentos de extração

e as condições cromatográficas propostas, para avaliar possíveis interferências nos

tempos de retenção dos fármacos ou dos padrões internos e os resultados foram

comparados com aqueles obtidos com uma solução padrão dos analitos

(sulfametoxazol, trimetoprima e sulfadiazina) em concentração próxima ao Limite de

quantificação.

4.3.5.6 Recuperação

O cálculo da recuperação dos fármacos foi feito comparando-se as áreas

dos picos do analito (controles de qualidade baixo, médio e alto) das amostras

extraídas do plasma com as áreas dos picos dos analitos preparados em solução

(solução não extraída). As áreas correlacionadas com a concentração,

considerando-se que as áreas obtidas para os controles baixo, médio e alto,

preparados em solução (amostras não extraídas) correspondem, respectivamente,

as concentrações nominais dos analitos.

O cálculo da recuperação do padrão interno é feito de maneira análoga,

ou seja, comparando-se as áreas do pico do padrão interno extraída do plasma com

as áreas dos picos do padrão interno preparada em solução (amostra não extraída)

na concentração definida.

4.3.5.7 Estudo de estabilidade dos fármacos no fluido biológico

Os procedimentos de estabilidade avaliaram a estabilidade do analito no

plasma humano sob condições distintas de temperatura e acomodação, bem como

sua estabilidade em soluções de estoque.

121

A estabilidade nos fluidos biológicos é dependente das condições de

armazenamento, das propriedades químicas da droga, da matriz empregada

(plasma humano) e sistema de armazenamento. Os resultados dos presentes testes

são relevantes somente sob as mesmas condições e não devem ser extrapolados

para outras matrizes e sistemas de armazenamento.

Para o teste de estabilidade, uma série de amostras padrão foi preparada

da solução estoque (preparada recentemente no mesmo solvente utilizado para a

análise). Os respectivos controles de qualidade baixo, médio e alto, incluindo todos

os analitos e padrões internos, foram usados. Amostras do plasma humano de cada

concentração foram preparadas em volume suficiente para ter alíquotas múltiplas.

Três alíquotas de cada concentração foram processadas e quantificadas

imediatamente para fornecer valores de referência (frescos) e outras três alíquotas

para cada concentração foram processadas para os testes desejados.

Para o teste de estabilidade uma série de amostras foram preparadas da

mesma Master e Working Solutions utilizadas para as amostras CQs e LQs. As

amostras das respectivas concentrações baixa, média e alta incluindo o analito

foram utilizadas. As amostras de plasma humano de cada concentração foram

preparadas em um volume suficiente para obter alíquotas múltiplas para cada

concentração. Cinco alíquotas de cada concentração (concentração referência)

foram preparadas a fresco e imediatamente quantificadas a fim de fornecer os

valores de referência (fresco) e outras cinco alíquotas de cada concentração

armazenadas foram processadas para os seguintes testes (pós-processamento,

ciclos de descongelamento e congelamento, curta duração, longa duração e

estabilidade de soluções padrão).

4.3.5.7.1 Estabilidade Pós-processamento

Para avaliar a estabilidade pós-processamento, cinco alíquotas para cada

tipo da amostra foram armazenadas, imediatamente após a preparação, no auto-

injetor na mesma temperatura usada durante as análises (8ºC para SMX + TMP e

10°C para Sulfadiazina).

122

As amostras ficaram um período de tempo no auto-injetor superior ao

tempo da corrida analítica. Inicialmente foi realizado um teste por um período de 70

horas para SMX + TMP (Figura 18) e 48 horas para Sulfadiazina (Figura 19). A

estabilidade do analito e do padrão interno foram comparadas respectivamente com

uma concentração referência extraída a fresco.

Figura 18: Esquema dos ensaios de estabilidade pós-processamento de para

SMX +TMP.

Figura 19: Esquema dos ensaios de estabilidade pós-processamento de para SDZ.

4.3.5.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento

Para avaliar a estabilidade de congelamento e descongelamento das

amostras, um ciclo de congelamento e descongelamento foi definido como sendo o

armazenamento de amostras, em concentrações distintas, a temperatura desejada (-

20°C) seguida pelo descongelamento à temperatura ambiente, monitorada pelo

analista. Para a análise de sulfametoxazol e trimetoprima foram realizados três ciclos

de congelamento e descongelamento e para sulfadiazina foram realizados cinco

ciclos (Figuras 20 e 21).

LC-MS/MS

Auto-injetor

Temperatura de 8°C por 70 horas

LC-MS/MS

Auto-injetor

Temperatura de 10°C por 48 horas

123

Figura 20: Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento

de descongelamento para SMX +TMP.

Congelamento (-20

oC) por 26h

Degelo 1

Congelamento (-20ºC) por 16h

Degelo 2 Extração

LC-MS/MS


Degelo 3

Análise

124

Figura 21: Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento

de descongelamento para sulfadiazina.

4.3.5.7.3 Estabilidade de curta duração

Para avaliar a estabilidade de curta duração dos fármacos estudos, cinco

alíquotas de cada amostra foram congeladas, descongeladas e mantidas a

temperatura ambiente por 9 horas, o que excede o tempo previsto que as amostras

poderiam ser mantidas na temperatura ambiente após o descongelamento até que

fossem analisadas. A estabilidade foi determinada por comparação da concentração

dos analitos com a concentração de uma amostra fresca (Figura 22).

Congelamento (-20

oC) por 29h

Degelo 1


Degelo 2

Extração

LC-MS/MS


Degelo 3

Análise


Degelo 4


Degelo 5

125

Para os fármacos sulfametoxazol e trimetoprima foram analisadas

alíquotas dos controles de qualidade baixo, médio e alto. A análise das alíquotas

contaminadas com sulfadiazina foi realizada com controles de qualidade baixo e

alto.

Figura 22: Esquema dos ensaios de estabilidade de curta duração para SMX +

TMP e sulfadiazina.

4.3.5.7.4 Estabilidade das soluções padrão

Para avaliar a estabilidade da solução padrão, soluções com o analito e o

padrão interno foram preparadas recentemente e comparadas com as soluções

preparadas anteriormente armazenadas nas condições de temperatura ambiente

(TA) e refrigerada a 4°C.

4.3.5.7.5 Estabilidade de “Master Solution” (solução estoque) e “Working

solution” (solução de trabalho)

A avaliação da estabilidade das “masters solutions” tanto dos analitos

como dos padrões internos foi realizada em dois diferentes grupos. Um grupo foi

mantido à temperatura ambiente por 6 horas, tanto para os analitos quanto para os

padrões internos e o outro grupo foi mantido à temperatura refrigerada a 4°C durante

14 dias para sulfametoxazol, trimetoprima e metoprolol (padrão interno) e durante 10

dias para sulfadiazina para e sulfametoxazol (padrão interno). Ambos os grupos

foram avaliados com soluções recentemente preparadas e nas mesmas

concentrações (Figuras 23 e 24).

Congelamento (-20oC)

Degelo e temperatura

ambiente por 9 horas

LC-MS/MS

Análise

126

Figura 23: Esquema dos ensaios de estabilidade de “master e working

solutions” para SMX + TMP.

Figura 24: Esquema dos ensaios de estabilidade de “master e working

solutions” para sulfadiazina.

Temperatura ambiente por 6 horas

Extração

LC-MS/MS

Análise

Refrigeradas a

4°C por 14 dias

LC-MS/MS

Análise

Amostras Extração

Temperatura ambiente por 6 horas

Extração

LC-MS/MS

Análise

Refrigeradas a

4°C por 14 dias

LC-MS/MS

Análise

Amostras Extração

127

4.3.5.7.6 Estabilidade de longa duração

Para avaliar a estabilidade de longa duração, alíquotas de cada amostra

foram congeladas inicialmente a -20°C e então descongeladas para ser extraídas e

quantificadas após 174 dias para sulfametoxazol e trimetoprima e 59 dias para

sulfadiazina. A estabilidade foi determinada por comparação entre a concentração

do analito e a concentração de amostras frescas (Figuras 25 e 26).

Figura 25: Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração para SMX +

TMP.

Figura 26: Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração para

sulfadiazina.

Congelamento (-20ºC) por 59 dias

Degelo Extração

LC-MS/MS

Análise

Congelamento

(-20ºC) por 174 dias

Degelo

Extração

LC-MS/MS

Análise

128

RESULTADOS E DISCUSSÃO

129

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Considerações Gerais

O objetivo da etapa clínica dos ensaios clínicos foi detectar diferenças

entre as formas farmacêuticas no que se refere aos parâmetros relacionados à

absorção dos princípios ativos a partir de suas formas farmacêuticas. Desta forma,

cada protocolo clínico foi delineado com o intuito de obter os parâmetros

farmacocinéticos relevantes para a comparação estatística, visando a averiguação

da biodisponibilidade comparativa. Tais parâmetros foram obtidos diretamente a

partir da determinação das concentrações plasmáticas de sulfametoxazol,

trimetoprima e sulfadiazina, baseado na aplicação de um modelo não-

compartimental próprio para avaliação destas concentrações, após a administração

das formulações por via oral.

Neste sentido, o protocolo experimental considerado mais adequado e

aplicado nos presentes estudos foi do tipo aberto, dose única, randomizado,

cruzado, dois tratamentos, duas sequências, dois períodos com intervalo de sete

meias vidas de eliminação entre os períodos de internamento com a participação de

voluntários sadios de ambos os sexos em condições de jejum.

O delineamento cruzado utilizado nos ensaios clínicos teve o objetivo de

eliminar, ou, pelo menos, minimizar os fatores relacionados ao indivíduo, uma vez

que a formulação teste e referência de cada estudo foram comparadas no mesmo

indivíduo. O intervalo entre os internamentos compreendeu um período (sete dias)

no qual garantisse que os fármacos tivessem sido completamente eliminados do

organismo evitando, assim, possíveis efeitos residuais. A dose única é o esquema

posológico de escolha para estudos de biodisponibilidade comparativa uma vez que

favorece a detecção de diferenças no processo de absorção das formas

farmacêuticas além de ser seguro aos voluntários, ter menor custo e requer menor

tempo de ensaio.

130

A conduta adotada de todos os voluntários ingerirem a mesma dieta

(alimentos e líquidos), nos mesmos horários teve a finalidade de minimizar possíveis

interferências da dieta na absorção entre os voluntários, sendo mais uma ferramenta

de padronização.

Os tempos de coleta escolhidos em cada estudo foram baseados na meia

vida de eliminação de cada fármaco e no valor previsto de Cmax e Tmax. É

extremamente importante a escolha correta dos tempos de coleta, pois são eles que

irão definir o formato da curva de concentração plasmática versus tempo e estimar

com maior preciso o valor de Cmax, e ASC0-t utilizados na averiguação da

bioequivalência. De acordo com os órgãos regulatórios, recomenda-se que sejam

feitas coletas de sangue entre 3,5 a 5 vezes a meia vida do fármaco em estudo.

A validação de um método bioanalítico deve garantir, por meio de estudos

experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados (FINDLAY et al., 2000; SHAH et al.,

2000; MEI et al., 2003; KIMANANA, 1998; HARTMANN et al., 1998). Para tanto,

deve apresentar precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção e limite de

quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação

adequadas à análise (BRASIL, 2003c).

Os certificados de análise do analito e do PI foram apresentados com o

objetivo de documentar a identidade e o teor das Substâncias Químicas de

Referência empregadas no estudo, como preconizado pelas Boas Práticas de

Laboratório e legislação da Anvisa vigentes no país (apêndices 03, 04, 05 e 06). Na

avaliação de bioequivalência ambas as formulações sob investigação são

submetidas às mesmas condições analíticas e, portanto os resultados de ambas

estão sujeitos aos mesmos interferentes, no que diz respeito às substâncias de

referência e reagentes empregados nas análises. Portanto para a qualidade dos

dados, em relação à comparação de parâmetros farmacocinéticos nos ensaios de

bioequivalência, o grau de pureza dos padrões e reagentes não tem o mesmo grau

de importância que tem para as determinações quantitativas de princípio ativo em

formulações farmacêuticas ou dosagens bioquímicas, por exemplo. Todos os

131

ensaios foram realizados em laboratórios certificados pelos órgãos oficiais

competentes e, portanto adotamos as BPL rotineiramente.

A utilização de métodos bioanalíticos para a determinação qualitativa,

semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos

farmacêuticos e matrizes biológicas representa um papel significante na avaliação e

interpretação dos resultados de estudos de bioequivalência, biodisponibilidade e

farmacocinéticos (LINDHOLM et al., 2003; CAUSON, 1997; BRESSOLLE et al.,

1996; DAGDAR et al., 1995; CHAMBERLAIN, 1995).

O processamento de um grande número de matrizes biológicas, que

geralmente é requerido em estudos de farmacocinética, bioequivalência e

biodisponibilidade, necessita de procedimentos analíticos rápidos, sensíveis

específicos e seletivos. Entretanto, muitos métodos analíticos descritos, utilizados

para determinação de fármacos, ainda precisam ser aperfeiçoados para atender às

definições de rígidos critérios do controle de qualidade de medicamentos previstos

na legislação.

As técnicas bioanalíticas descritas foram desenvolvidas e validadas de

acordo com os critérios exigidos pela Resolução – RE nº 899, de 29 de maio de

2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA.

5.2 Sulfametoxazol + Trimetoprima


Um total de 24 voluntários sadios de ambos os sexos participaram do

estudo. A tabela 22 apresenta valores de média, desvio padrão, mínimo e máximo

dos voluntários recrutados para o ensaio clínico. A tabela apresenta os dados

separados por gênero, comparativamente aos dados de todos os voluntários.

132

Tabela 22: Dados demográficos de todos os voluntários e por gênero

IDADE (anos) ALTURA (m) PESO (kg) IMC (kg/m

2)

M F TOTAL M F TOTAL M F TOTAL M F TOTAL

MÉDIA 28,83 27,67 28,25 1,71 1,58 1,65 70,29 57,73 64,01 23,81 23,09 23,45

DP 9,17 5,52 7,43 0,09 0,05 0,10 10,92 5,31 10,57 2,10 1,86 1,97

MÍN 20 18 18 1,57 1,49 1,49 51 50,50 50,50 20,69 20,65 20,65

MAX 47 38 47 1,84 1,67 1,84 84 65,70 84 27,41 26,29 27,41

M – Masculino

F – Feminino

As formulações de sulfametoxazol + trimetoprima foram bem toleradas

pelos voluntários e nenhum evento adverso clinicamente significante foi observado.

Nenhum dos parâmetros bioquímicos e hematológicos mostrou alterações

clinicamente significantes. A pressão arterial, o pulso radial e a temperatura axilar

foram aferidos antes e após o estudo e nenhuma alteração foi observada. Todos os

voluntários terminaram o estudo em boas condições de saúde.

Os dados clínicos de cada voluntário foram registrados em ficha

apropriada que consta dos critérios de admissão, história médica pré-estudo, exame

físico geral pré e pós-estudo, resultado ECG pré e pós-estudo, ficha de

administração, coleta de sangue e aferição de sinais vitais do 1º e 2º internamentos,

registro de eventos adversos, utilização de medicamentos para os eventos adversos,

término prematuro do estudo, determinações laboratoriais e comentários adicionais.

5.2.2 Desenvolvimento e validação do método bioanalítico para

quantificação simultânea de sulfametoxazol e trimetoprima

5.2.2.1 Linearidade do método

Para definir a relação entre a resposta do instrumento e a concentração

conhecida do analito, foi gerada uma curva de calibração com oito padrões contendo

o fármaco e padrão interno.

133

A curva de calibração, definida em três corridas analíticas em duplicata,

foi linear para a faixa de concentração de 0,5, 1, 2, 5, 10, 50, 75, 100 µg/mL para

sulfametoxazol e 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,5. 2,5, 3,5 µg/mL em plasma, com um

coeficiente de correlação de 0,99. A linearidade para SMX foi definida pela seguinte

equação: y = 1,04x + 0,188 e para TMP y = 11,4x + 0,019 onde y representa a

relação da altura dos picos dos analitos e padrões internos e x representa a

concentração de cada analito (Figuras 27 e 28). Embora a sensibilidade fosse boa o

bastante para quantificar valores ainda menores, foram tomadas medidas para

garantir um LIQ próximo a 1-3% do Cmax dos fármacos em estudo (35-65 µg/mL para

SMX e 0,9-1,7 µg/mL para TMP (DOLLERY, 1999)

Figura 27: Representação gráfica da curva de calibração para sulfametoxazol y

= 1,04x + 0,188; r2= 0,9976.

134

Figura 28: Representação gráfica da curva de calibração para trimetoprima y =

11,4x + 0,019; r2= 0,9980.

O método analítico descrito para a determinação simultânea de

sulfametoxazol e trimetoprima confirma que o método proposto apresenta alta

sensibilidade, alta especificidade e rápido processamento de amostras requerido

para um estudo farmacocinético. A sensibilidade do método mostrou-se mais

eficiente (LQ=0,5 µg/mL para SMX e 0,02 µg/mL para TMP) em relação a outros

métodos descritos (MISTRI et al., 2010 – 0,88 e 0,03 µg/mL ; BRENNER et al., 2011

– 0,80 e 0,5 µg/mL; RONN et al., 1999 – 1 e 0,1 µg/mL para SMX e TMP,

respectivamente). Com os limites de quantificação de 0,5 µg/mL para SMX e 0,02

µg/mL para TMP encontrados pelo método proposto, as concentrações plasmáticas

de SMX e TMP puderam ser determinadas até 48 horas após administração oral de

200 mg de SMX e 40 mg de TMP. Assim, o presente método ofereceu sensibilidade

o bastante para realização de estudos farmacocinéticos, estabelecimento da relação

dose/efeito farmacológico, monitoração terapêutica e identificar concentrações

plasmáticas que produzam respostas tóxicas em humanos.

135

5.2.2.2 Seletividade do método

No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método de LC-

MS/MS para quantificação simultânea de SMX e TMP em plasma. O método foi

aplicado com sucesso no estudo de bioequivalência de duas formulações, referência

e teste, de SMX + TMP 40 + 8mg/mL em voluntários sadios. Os cromatogramas

livres de analitos apresentaram ausência de interferentes endógenos da matriz ao

longo da janela de eluição para SMX, TMP e padrão interno metoprolol (Figura 29).

Figura 29: Cromatogramas representativos do plasma branco: (A) canal SMX,

(B) canal TMP, (C) canal metoprolol.

A

B

C

136

As condições cromatográficas foram escolhidas para uma boa separação

dos analitos (SMX e TMP) e do padrão interno (metoprolol) de picos endógenos no

plasma. Com o uso da coluna de alta eficiência Genesis C18 150 x 4,6mm, 4 micra

foi possível obter uma separação satisfatória dos picos dos analitos e do padrão

interno utilizando uma fase móvel constituída de Metanol/Água (45/55; v/v) + 0,5 %

ácido fórmico. Os tempos de retenção do SMX, TMP e do metoprolol foram ± 1,9, ±

1,2 e ± 1,7 minutos, respectivamente (Figura 30).

Os tempos de retenção alcançados foram adequados para a análise de

um grande lote de amostras sendo inferiores a métodos, que utilizaram LC-MS/MS

como técnica de quantificação, recentemente relatados (BRENNER et al., 2011 SMX

– 3,42 min; TMP – 2,34 min usando coluna Agilent C18 150 x 4,6mm, 5 micra, fase

móvel composta de Metanol/Acetato de amônio 1 mmol/L/Ácido acético [49,5/49,5/1;

v/v/v], fluxo de 0,6 mL/min; TUERK et al., 2006 – SMX – 14,27 min, TMP – 9,16 min

usando coluna nucleodur 100-5 C18 EC 125 x 2mm, fase móvel composta de 0,1%

de ácido fórmico em água [v/v, solvente A] e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila

[v/v, solvente B]).

137


SMX – 1,5 µg/mL; (B) TMP – 0,06 µg/mL; (C) Metoprolol – 0,5 µg/mL.

C

B

A

138


Para obter a precisão e a exatidão, foram utilizadas 4 concentrações

distintas dentro da faixa das concentrações esperadas, incluindo o limite de

quantificação e as concentrações do controle de qualidade. Por definição, o

coeficiente de variação (CV), para a precisão, não pode exceder 15% para cada

concentração analisada (tolerância até 20% da concentração do limite de

quantificação). Em se tratando da exatidão, deve estar dentro de 15% do valor atual

em relação à média das amostras de cada concentração (tolerância até 20% da

concentração do limite de quantificação).

As análises da precisão e exatidão intralote do limite de quantificação

para os analitos são apresentadas nas Tabelas 23 e 24.

Tabela 23: Análise intralote do limite de quantificação - sulfametoxazol

SULFMETOXAZOL

Concentração Nominal – 0,5 µg/mL

Concentração determinada

experimentalmente

(µg/mL)

0,549

0,558

0,477

0,465

0,483

0,512

0,431

Média (µg/mL) 0,496

Precisão (CV%) 9,2

Exatidão (%) 99,3

139

Tabela 24: Análise intralote do limite de quantificação - trimetoprima

TRIMETOPRIMA



experimentalmente

(µg/mL)

0,0261*

0,021

0,0194

0,0184

0,0213

0,0188

0,0163


Precisão (CV%) 9,6

Exatidão (%) 96

As precisões e as exatidões intra e interlote para os três controles de

qualidade baixo médio e alto para SMX e TMP estão apresentados nas tabelas 25 e

26. Os resultados foram calculados a partir da média das concentrações

experimentais obtidas com a análise de 7 amostras de cada controle de qualidade.

Tabela 25: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- sulfametoxazol

(n=7) CQB (1,5 µg/mL) CQM (30 µg/mL) CQA (80 µg/mL)

01 02 03 01 02 03 01 02 03

INT

RA

-

LO

TE

Média (µg/mL) 1,61 1,59 1,38 30,4 27,2 27,1 73,4 80,8 76,8

Precisão (CV%) 3,6 2,3 4,7 6,6 3,5 4,6 2,8 13,6 2,7

Exatidão (%) 107,2 105,8 91,9 101,3 90,6 90,2 91,8 100,9 96,0

INT

ER

-

LO

TE

Média (µg/mL) 1,52 28,2 77

Precisão (CV%) 7,7 7,5 8,6

Exatidão (%) 101,7 94,0 96,2

140

Tabela 26: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- trimetoprima

(n = 7) CQB (0,06 µg/mL) CQM (1,2 µg/mL) CQA (2,8 µg/mL)

01 02 03 01 02 03 01 02 03

INT

RA

-

LO

TE

Média (µg/mL) 0,0608 0,0584 0,0612 1,15 1,10 1,13 2,44 2,69 2,74

Precisão

(CV%) 3,3 4,4 3,1 4,7 1,9 2,6 1,8 14,2 3,3

Exatidão (%) 101,4 97,4 102,0 96,2 91,8 94,5 87,3 96,2 97,9

INT

ER

-

LO

TE

Média (µg/mL) 0,0602 1,13 2,63

Precisão

(CV%) 4,0 3,7 9,7

Exatidão (%) 100,3 94,2 93,8

A precisão representa o grau de repetibilidade entre os resultados de

análises individuais em idênticas condições de ensaio e a exatidão, o grau de

concordância entre os resultados individuais encontrados e um aceito como

referência. Um método bioanalítico é considerado preciso e exato quando as

análises dos controles de qualidade baixo, médio, alto e limite de quantificação

mostrarem valores não excedentes a 15% do valor nominal analisado e para o

limite de quantificação este desvio não deve exceder 20% tanto para as mesmas

corridas (Intra-ensaio) quanto para corridas analíticas diferentes (Interensaio)

(BRASIL, 2003c; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRESSOLLE et al., 1996;

DADGAR et al., 1995).

5.2.2.4 Recuperação do método

As recuperações relativas de SMX, TMP determinadas em três

concentrações diferentes (CQB, CQM e CQA) foram 67,7, 66,3 e 74,4%, 74,5, 70,5

e 78,1%, respectivamente e para o metoprolol foi de 76,8%. Valores de

recuperações (88,5% para SMX e 83,4% para TMP) foram relatados por Amini &

Ahmadiani (2007), porém utilizando amostras de plasma com maior volume de

amostra (250 µL). Bedor et al., 2008 utilizando o mesmo volume de plasma,

apresentaram resultados de recuperação de 93,47% para SMX e 93,40% para TMP.

141

A determinação do fator de recuperação mostrou que o procedimento de

extração no qual as amostras foram submetidas foi reprodutível e consistente, nos

três níveis de concentração na faixa de alcance do método, tanto para os analitos

quanto para o padrão interno. A recuperação de um analito em um ensaio é a

resposta do detector de uma quantidade de analito adicionada e ou separada de

uma matriz biológica. A recuperação está ligada à eficiência do método analítico de

separação, dentro dos limites de variabilidade (SHAH et al., 2000).

5.2.2.5 Estabilidade dos analitos no fluido biológico

Os procedimentos de estabilidade avaliaram a estabilidade dos analitos

no plasma humano sob distintas condições de temperatura e de intervalo de tempo,

tão bem quanto à estabilidade dos analitos nas soluções estoque (Master Solution) e

de trabalho (Working solution). Cinco alíquotas de cada concentração (concentração

referência) foram preparadas a fresco e imediatamente quantificadas a fim de

fornecer os valores de referência.

Nossos resultados da análise da estabilidade não apresentaram sinais de

degradação dos fármacos em estudo. É possível, no entanto, concluir que não

houve degradação dentro dos tempos utilizados nos testes, o que é sustentado pela

avaliação da variação dos controles de qualidade durante os estudos. O objetivo

desses testes de estabilidade é antecipar a identificação de possíveis problemas. Há

comprovação com base nos controles de qualidade de que não ocorreram

problemas de estabilidade nas corridas analíticas, já que os controles de qualidade

mantiveram-se dentro dos níveis esperados e estas foram, portanto validadas

constituindo provas suficientes para aceitação dos resultados e comprovação da

estabilidade das amostras.

Nenhuma degradação significativa pode ser observada em amostras

resfriadas a 8ºC no auto-injetor por 70 horas (Tabela 27). Isto significa que podemos

programar uma corrida analítica contendo um lote de amostras, suficientemente

grande para durar igual período de tempo, com a garantia que não haverá

degradação suficiente para comprometer resultados. A tabela indica a média de

concentração em três níveis (baixo, médio e alto) para as amostras processadas, os

142

respectivos coeficientes de variação (para n=5) e a variação após 70 horas de

permanência no auto-injetor à 8ºC.

Tabela 27: Estudo de estabilidade pós-processamento – SMX e TMP

SULFAMETOXAZOL (n = 5)

CQB (1,5 µg/mL) CQM (30 µg/mL) CQA (80 µg/mL)

Referência Após 70

horas Referência

Após 70

horas Referência

Após 70

horas

Média

(µg/mL) 1,44 1,47 29,8 30,6 79,7 86,2

CV(%) 2,3 7,0 5,4 6,7 2,2 5,1

Variação 2,1 2,7 8,2

TRIMETOPRIMA (n = 5)

CQB (0,06 µg/mL) CQM (1,2 µg/mL) CQA (2,8 µg/mL)

Referência Após 70

horas Referência

Após 70

horas Referência

Após 70

horas

Média

(µg/mL) 0,0636 0,0642 1,22 1,24 2,61 2,79

CV(%) 5,2 6,9 2,1 3,5 1,4 4,2

Variação 0,9 1,6 6,9

Na análise de 3 conjuntos de amostras de plasma contaminados (CQB,

CQM, CQA) de SMX e TMP, foram preparados e estocados à -20ºC e submetidos a

3 ciclos de congelamento e descongelamento (Tabela 28). Os dados demonstraram

que as amostras de plasma podem sofrer congelamento e descongelamento pelo

menos 3 vezes sem comprometer os resultados das análises. A tabela indica a

média de concentração em três níveis (baixo, médio e alto) para as amostras

processadas, os respectivos coeficientes de variação (para n=5) e a variação entre

os dados de concentração obtidos após o 3º ciclo de congelamento e

descongelamento.

143

Tabela 28: Estudo de estabilidade após ciclos de congelamento e

descongelamento – SMX e TMP



Referência Após 3º

ciclo Referência

Após 3º

ciclo Referência

Após 3º

ciclo

Média

(µg/mL) 1,51 1,39 32,8 30,2 90,1 87,4

CV(%) 7,9 6,9 9,0 4,3 2,8 3,4

Variação 5,0 -7,9 -7,9



Referência Após 3º

ciclo Referência

Após 3º

ciclo Referência

Após 3º

ciclo

Média

(µg/mL) 0,067 0,0618 1,26 1,25 2,76 2,79

CV(%) 6,5 8,5 7,8 4,9 2,7 3,2

Variação -7,8 -0,8 1,1

Na avaliação da estabilidade de curta duração dos fármacos, cinco

alíquotas de cada controle de qualidade foram preparadas e congeladas a -20ºC e

depois descongeladas a temperatura ambiente por 9 horas. Os resultados deste

estudo estão apresentados na tabela 29.

Os valores apresentados não evidenciaram sinais de degradação

significativa uma vez que todos os valores encontraram-se dentro dos critérios

estabelecidos (BRASIL, 2003; FINDLAY et al., 2000; SHAH et al., 2000; MEI et al.,

2003, GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001). Vale salientar que o tempo do material

em bancada (curta duração) não costuma exceder 1 hora e é o mesmo utilizado

para o preparo dos controles de qualidades. Portanto, qualquer degradação afetaria

da mesma forma os controles de qualidade empregados, levando a não validação

das corridas. Podendo-se concluir, portanto, que não houve degradação dentro do

144

tempo utilizado para o teste, o que é igualmente sustentado pela avaliação da

variação dos controles de qualidade durante a condução do estudo.

Tabela 29: Estudo de estabilidade de curta duração – SMX e TMP



Referência Após 9

horas Referência

Após 9

horas Referência

Após 9

horas

Média

(µg/mL) 1,51 1,34 32,8 30,9 90,1 86,0

CV(%) 7,9 5,6 9,0 4,2 2,8 2,0

Variação -11,3 -5,8 -4,6



Referência Após 9

horas Referência

Após 9

horas Referência

Após 9

horas

Média

(µg/mL) 0,0670 0,0606 1,26 1,23 2,76 2,77

CV(%) 6,5 7,3 7,8 3,5 2,7 3,0

Variação -9,6 -2,4 0,4

Quanto à estabilidade das soluções estoque (master solution),

comparando-se os valores médios obtidos das soluções contaminadas com os

analitos e com o padrão interno preparadas recentemente com os valores médios

das soluções preparadas anteriormente e armazenadas nas condições de

temperatura ambiente (TA) por seis horas e refrigeradas a 4ºC por 10 dias, nota-se

que as variações são menores que 15% indicando, assim, a estabilidade destas

soluções (Tabela 30).

145

Tabela 30: Estabilidade soluções estoque – SMX, TMP e Metoprolol


Concentração nominal - 10 µg/mL

Amostra 4ºC

por 10 dias Referência

Amostra

(TA) por 6 h Referência

Média 9,79 10,8 10,6 10,8

CV (%) 2,57 3,45 2,45 3,45

Variação (%) -9,4 -1,9


Concentração nominal – 0,5 µg/mL

Amostra 4ºC


Amostra


Média 0,518 0,537 0,532 0,537

CV (%) 1,56 2,61 1,9 2,61

Variação (%) -3,5 -0,9

METOPROLOL (n = 5)


Amostra 4ºC


Amostra (TA)

por 6 h Referência

Média 1,02 1,01 1,04 1,01

CV (%) 0,822 2,76 5,88 2,76

Variação (%) 1,0 3,0

O mesmo padrão de comportamento pode ser observado para as

soluções de trabalho (working solution) que também foram estáveis quando

mantidas em temperatura ambiente por 06 horas, tempo superior ao necessário para

o manuseio das soluções na bancada, quando são preparados os lotes de amostras,

e após 10 dias de refrigeração a 4ºC (Tabelas 31 e 32).

146

Tabela 31: Estabilidade soluções de trabalho – SMX, TMP após 10 dias sob

refrigeração a 4ºC


CQB (1,5 µg/mL) CQA (80 µg/mL)

Amostra 4ºC

por 10 dias Referência Amostra 4ºC Referência

Média (µg/mL) 1,58 1,63 72,8 76,9

CV(%) 8,45 3,02 2,01 2,62

Variação -3,1 -5,3


CQB (0,06 µg/mL) CQA (2,8 µg/mL)

Amostra 4ºC


Média (µg/mL) 0,0633 0,0640 2,63 2,69

CV(%) 4,01 3,21 1,14 2,28

Variação -1,1 -2,2

Tabela 32: Estabilidade soluções de trabalho – SMX, TMP após 6horas de

temperatura ambiente



Amostra (TA)

por 6 h Referência

Amostra (TA)

por 6 h Referência

Média (µg/mL) 1,67 1,63 81,3 76,9

CV(%) 5,08 3,02 3,67 2,62

Variação 2,5 5,7


CQB (0,06 µg/mL) CQA (2,8 µg/mL)

Amostra (TA)

por 6 h Referência

Amostra (TA)

por 6 h Referência

Média (µg/mL) 0,0655 0,0640 2,74 2,69

CV(%) 11,2 3,21 2,44 2,28

Variação 2,3 1,9

147

Quanto aos dados da estabilidade de longa duração, a variação não foi

significativa, uma vez que as variações obtidas, quando comparadas com os valores

médios dos controles de qualidade baixo, médio e alto para as amostras recém

preparadas com os valores médios de CQB, CQM e CQA para as amostras

armazenadas durante 174 dias estiveram abaixo dos desvios permitidos de 15%

para os três controles analisados. Assim, as amostras dos voluntários sofreram o

mesmo grau de degradação, o que não interfere na avaliação dos parâmetros

farmacocinéticos relativos ao fármaco em estudo (Tabela 33).

Tabela 33: Estabilidade de longa duração – SMX e TMP



Referência Após

174 dias Referência

Após


Após

174 dias

Média

(µg/mL) 1,52 1,58 30,9 30,9 82,2 77,4

CV(%) 3,6 3,7 2,6 2,2 6,0 5,4

Variação 3,9 0,0 -5,80



Referência Após


Após


Após

174 dias

Média

(µg/mL) 0,0672 0,0601 1,21 1,16 2,73 2,79

CV(%) 1,4 5,3 1,7 6,3 4,6 3,9

Variação -10,6 -4,1 2,2

Todos os testes que compuseram a avaliação da estabilidade, das

amostras e das soluções empregadas no estudo, apresentaram coeficiente de

variação e desvio em relação à concentração referência menores que 15%, estando

assim em conformidade com os critérios de aceitação propostos pela legislação

vigente no país e internacionais.

148

5.2.3 Aplicação da metodologia bioanalítica em estudo de

farmacocinética comparada

A metodologia validada foi aplicada para determinação e avaliação dos

parâmetros farmacocinéticos relacionados à absorção de duas formulações

contendo a associação SMX + TMP suspensão (40 + 8 mg/mL) em um estudo de

biodisponibilidade comparativa.

A partir da determinação das concentrações plasmáticas de SMX e TMP

foi obtida uma curva de concentração plasmática média em função do tempo para

cada fármaco (Figuras 31 e 32) e, a partir destas, os parâmetros farmacocinéticos

foram calculados.


fármaco sulfametoxazol após a administração das formulações de SMX + TMP

em 24 voluntários saudáveis.

149


fármaco trimetoprima após a administração das formulações de SMX + TMP

em 24 voluntários saudáveis.

As figuras 31 e 32 mostram semelhança entre os perfis farmacocinéticos

relacionados à absorção das formulações estudadas. Perfil semelhante foi

observado por Mistri et al., 2011, Campero et al., 2007, Bedor et al., 2008 e Amini et

al., 2007. Esta semelhança comprova que os tempos de coleta utilizados no ensaio

clínico foram adequados para a caracterização dos perfis farmacocinéticos de

ambos os fármacos.

A estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para SMX e TMP

está apresentada nas tabelas 34 e 35.

150

Tabela 34: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para SMX

AUC0-∞

(µg*h/mL)

AUC0-tlast

(µg*h/mL)

Cmax

(µg/mL)

Tmax

(h)

T1/2

(h)

R T R T R T R T R T

Média 711,51 707,26 679,70 677,18 50,33 48,85 2,19 3,0 10,48 10,15

DP 141,71 122,45 128,07 109,86 10,52 10,21 1,25 1,97 1,47 1,78

Mínimo 485,32 471,27 469,97 459,32 34,50 33,80 0,75 1,33 8,37 8,34

Máximo 1056,32 941,47 935,78 874,07 83,90 79,70 6,00 10,0 14,71 15,83

Mediana 699,46 697,81 674,39 674,47 50,0 46,70 2,00 2,50 10,02 9,67

CV (%) 19,92 17,31 18,84 16,22 20,90 20,90 57,01 65,70 14,04 17,57

R: formulação referência

T: formulação teste

Tabela 35: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para TMP

ASC0-∞

(µg*h/mL)

ASC0-tlast

(µg*h/mL)

Cmax

(µg/mL)

Tmax

(h)

T1/2

(h)

R T R T R T R T R T

Média 21,52 22,28 21,00 21,73 1,71 1,75 1,58 1,80 7,38 7,35

DP 6,77 5,71 6,58 5,58 0,41 0,38 0,84 0,79 1,52 1,62

Mínimo 12,04 14,15 11,45 13,49 1,20 1,19 0,50 0,50 5,26 4,74

Máximo 38,16 37,32 37,36 36,70 2,59 2,86 3,00 3,50 12,07 11,85

Mediana 20,19 21,45 19,99 21,06 1,67 1,67 1,33 1,67 7,04 7,01

CV (%) 31,47 25,65 31,34 25,69 24,18 21,55 53,13 43,90 20,56 22,05

De fato, os parâmetros farmacocinéticos relacionados à absorção sofrem

influência da formulação utilizada para veiculação do fármaco e, portanto podem

apresentar diferenças entre produtos diferentes contendo o mesmo fármaco

(STORPIRTIS, 1999). Este fato não ocorreu com as formulações estudadas uma vez

que não houve diferença entre os parâmetros avaliados. Características

farmacocinéticas semelhantes foram observadas em estudos anteriores (MURRIETA

et al., 1990; MISTRI et al., 2010).

Os estudos de bioequivalência são os substitutos para os ensaios clínicos

de avaliação da equivalência terapêutica em termos de segurança e eficácia entre

as formas farmacêuticas avaliadas. Portanto, o objetivo de um estudo de

bioequivalência é identificar equivalentes farmacêuticos ou alternativas

151

farmacêuticas que serão utilizadas de forma intercambiável para o mesmo efeito

terapêutico. Neste contexto, como observado na tabela 36, considerando que os

intervalos de confiança de 90% para a razão geométrica de Cmax e ASC0-túltimo estão

dentro do intervalo (80-125%) estabelecido pela Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA) e Food and Drug Administration Agency (FDA) conclui-se que as

formulações de Sulfametoxazol + Trimetoprima 40 mg + 8 mg/mL suspensão são

bioequivalentes para velocidade e extensão de absorção.

Tabela 36: Análise da bioequivalência entre as formulações estudadas

SULFAMETOXAZOL

Teste/Referência

Média

Geométrica ou

Ponto Médio (%)

Intervalo de

confiança de

90% (%)

Poder

do teste

CV

intrassujeito

(%)

Cmax 97,10 88,59-106,43 0,9889 18,51

ASC(0-túltimo) 100,04 95,79-104,47 1,0000 8,75

TRIMETOPRIMA

Teste/Referência

Média

Geométrica ou

Ponto Médio (%)

Intervalo de

confiança de

90% (%)

Poder

do teste

CV

intrassujeito

(%)

Cmax 102,6 94,06-111,91 0,9934 17,52

ASC(0-túltimo) 104,59 100,79-108,54 1,0000 7,14

152

5.3 Sulfadiazina


Um total de 24 voluntários sadios de ambos os sexos participaram do

estudo. A tabela 37 apresenta valores de média, desvio padrão, mínimo e máximo

dos voluntários recrutados para o ensaio clínico. A tabela apresenta os dados

separados por gênero, comparativamente aos dados de todos os voluntários.

Tabela 37: Dados demográficos de todos os voluntários e por gênero

Idade (anos) Altura (m) Peso (kg) IMC (kg/m

2)

M F Total M F Total M F Total M F Total

Média 25,08 24,75 24,92 1,78 1,57 1,68 78,28 59,25 68,76 24,71 23,97 24,34

DP 7,80 5,91 6,77 0,08 0,06 0,12 10,82 5,63 12,87 2,21 2,44 2,31

Mín 18,00 18,00 18,00 1,66 1,48 1,48 62,50 52,40 52,40 21,58 20,96 20,96

Max 42,00 36,00 42,00 1,88 1,67 1,88 96,30 69,40 96,3 29,24 29,33 29,33

M – Masculino

F – Feminino

As formulações de sulfadiazina foram bem toleradas pelos voluntários e

nenhum evento adverso clinicamente significante foi observado. Nenhum dos

parâmetros bioquímicos e hematológicos mostrou alterações clinicamente

significantes. A pressão arterial, o pulso radial e a temperatura axilar foram aferidos

antes e após o estudo e nenhuma alteração foi observada. Todos os voluntários

terminaram o estudo em boas condições de saúde.

Com a análise dos dados demográficos apresentados na tabela 37

podemos verificar que estes estão em concordância com os limites estabelecidos no

protocolo clínico. Estes dados apresentam média de 24,92 anos para a idade, 1,68

m para a altura, 68,76 kg para o peso e 24,34 kg/m2 para o IMC dos voluntários, com

desvio padrão de 6,77, 0,12, 12,87 e 2,31 respectivamente. A média do IMC

determinada para todos os voluntários, n=24, não difere significativamente da

calculada separadamente por gênero que foi respectivamente para o sexo masculino

e feminino 24,71 e 23,97 Kg/m2.

153

Os dados clínicos de cada voluntário foram registrados em ficha

apropriada que consta dos critérios de admissão, história médica pré-estudo, exame

físico geral pré e pós-estudo, resultado ECG pré e pós-estudo, ficha de

administração, coleta de sangue e aferição de sinais vitais do 1º e 2º internamentos,

registro de eventos adversos, utilização de medicamentos para os eventos adversos,

término prematuro do estudo, determinações laboratoriais e comentários adicionais.

A fase clínica do estudo proporcionou resultados satisfatórios, sem perda de

amostras que pudessem comprometer as fases subsequentes.

5.3.2 Desenvolvimento e validação do método bioanalítico para

quantificação de sulfadiazina

5.3.2.1 Linearidade do método

Para definir a relação entre a resposta do instrumento e a concentração

conhecida do analito, foi gerada uma curva de calibração com oito padrões contendo

o fármaco e padrão interno.

A curva de calibração, definida em três corridas analíticas em duplicata,

foi linear para a faixa de concentração de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 15, 25 µg/mL em

plasma, com um coeficiente de correlação de 0,99. A linearidade foi definida pela

seguinte equação: y = 0,292x + -0,00127 onde y representa a relação da altura dos

picos dos analitos e padrões internos e x representa a concentração de cada analito

(Figura 33). Embora a sensibilidade fosse boa o bastante para quantificar valores

ainda menores, foram tomadas medidas para garantir um LIQ próximo a 1-3% do

Cmax (19 µg/mL) (DOLLERY, 1999; MEYER et al., 1978).

A Anvisa estabelece que, para aprovação da curva, o coeficiente de

correlação linear deve ser no mínimo de 0,98, a precisão com CV% menor que 20%

para o LOQ e 15% para os demais pontos e exatidão dentro de 80-120% para o

LOQ e 85-115% para os demais pontos. Estes resultados validam a função

matemática da curva de calibração do método, com precisão e exatidão suficientes

para fornecer resultados reprodutíveis e confiáveis (BRASIL 2003c).

154

Figura 33: Representação gráfica da curva de calibração para sulfadiazina y =

0,292x + -0,00127; r2= 0,9988.

O uso de métodos analíticos satisfatoriamente seletivos e sensíveis para

a avaliação qualitativa e quantitativa de fármacos e de seus metabólitos são pontos

críticos para a condução eficaz dos ensaios pré-clínicos e/ou biofarmacêuticos nos

estudos de farmacologia clínica. A condição imprescindível para alcançarmos

sucesso nestes estudos é o uso de métodos bioanalíticos apropriadamente

validados. A sensibilidade está associada com a capacidade de o método

discriminar entre diversos teores semelhantes e depende da inclinação da curva de

calibração. Por definição é igual à inclinação da reta de calibração dividida pela

estimativa do desvio padrão. Para dois métodos de mesma precisão o mais sensível

será o que possuir a curva de calibração com maior inclinação (LEITE, 2002).

O método analítico descrito para a determinação de sulfadiazina confirma

que o LC-MS-MS está de acordo com os conceitos de alta sensibilidade, alta

especificidade e rápido processamento de amostras requerido para um estudo

farmacocinético. A sensibilidade mostrou-se mais eficiente (LQ=0,05 µg/mL) em

relação a outros métodos descritos que alcançaram sensibilidade de 0,1 µg/mL

155

(CROUBELS; DE BAERE; DE BACKER, 2003; ABU-BASHA et al., 2009; NIELSEN

& GYRD-HANSEN, 1994; BAERT et al., 2001a; BAERT et al., 2003). Com o limite de

quantificação de 0,05 µg/mL alcançado pelo método proposto, as concentrações

plasmáticas de sulfadiazina puderam ser determinadas até 48 horas após

administração oral de 500 mg da formulação. Assim, o presente método ofereceu

sensibilidade o bastante para realização de estudos farmacocinéticos,

estabelecimento da relação dose/efeito farmacológico e identificar doses que

produzam respostas tóxicas em humanos.

5.3.2.2 Seletividade do método

A especificidade ou seletividade, segundo a USP, é a habilidade para

avaliar o analito inequivocamente, com exatidão, em presença de outros

componentes cuja presença é esperada tais como impurezas, produtos de

degradação, componentes da matriz, excipientes, outros princípios ativos e

metabólitos assegurando que o valor de concentração determinado seja

correspondente apenas ao analito de interesse (USP XXVIII, 2004).

A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um

método instrumental de separação e deve ser avaliada continuamente durante a

validação e subsequente uso do método. Algumas amostras principalmente as

matrizes biológicas podem sofrer degradação, gerando compostos que não foram

observados inicialmente, que podem co-eluir com a substância de interesse. Em

HPLC a seletividade é obtida pela escolha de colunas e condições cromatográficas

otimizadas, como: temperatura da coluna, composição da fase móvel, comprimento

de onda do detector, número de pratos teóricos, etc. (COLLINS et al, 2006).

No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método de HPLC-

MS/MS para quantificação de sulfadiazina em plasma. O método foi aplicado com

sucesso no estudo de bioequivalência de duas formulações, referência e teste, de

sulfadiazina comprimidos de 500 mg em voluntários sadios. Os cromatogramas

livres de analitos apresentaram ausência de interferentes endógenos da matriz ao

longo da janela de eluição para o fármaco e padrão interno sulfametoxazol (Figura

34).

156

Figura 34: Cromatogramas representativos do plasma branco: (A) canal

Sulfadiazina, (B) canal sulfametoxazol (PI).

As condições cromatográficas foram escolhidas para uma boa separação

do analito e do padrão interno (sulfametoxazol) de picos endógenos no plasma. Com

o uso da coluna de alta eficiência Genesis C18 100 x 2.1 mm, 4 micra foi possível

obter uma separação satisfatória dos picos do analito e do padrão interno utilizando

uma fase móvel constituída de Metanol/Água (35/65, v/v) + 0,5 % Ácido Fórmico. Os

tempos de retenção da sulfadiazina e do sulfametoxazol foram 1,42 ± 0,3, e 2,42 ±

0,3 minutos, respectivamente (Figura 35). A metodologia proposta mostrou-se bem

mais rápida em relação às anteriormente publicadas na determinação de

sulfadiazina em fluidos biológicos (CROUBELS; DE BAERE; DE BACKER, 2003 –

3,02 min utilizando LC-MS/MS, coluna Hypersil C18 100 x 3mm, 5 micra, fase móvel

isocrática composta de 1% de ácido acético em água [solução A] e metanol 100%

A

B

157

[solvente B], fluxo de 0,3 mL/min e NIELSEN; GYRD-HANSEN, 1994 – 8,5 min

utilizando HPLC- UV, coluna Nucleosil C8 250 x 4,6mm, 5 micra, fase móvel

isocrática composta de acetato de sódio 0,1 M [pH4,0] e acetonitrila [85/15, v/v] +

dimtildodecilamina 5mM, fluxo de 0,8 mL/min).


sulfadiazina – 0,15 µg/mL; (B) sulfametoxazol – 5 µg/mL.


Na avaliação da precisão e da exatidão do método foram usadas cinco

concentrações, incluindo o limite de quantificação, distintas (CQB, CQM1, CQM2,

CQA) na sua faixa de alcance (range analítico), sendo que foram feitas sete

determinações por concentração. A precisão e exatidão intra-lote foi determinada

B

A

158

pela avaliação de amostras de CQs de uma mesma corrida analítica, ou seja, de um

mesmo lote. A inter-lote foi determinada pela avaliação de amostras de CQs dos três

lotes empregados no procedimento de validação, com a avaliação da variabilidade

de um lote (de voluntários ou validação) para o outro (analisadas em dias

diferentes). O CV% foi menor que 8% nos três níveis de concentração e para os três

lotes de amostras (lote 1, 2 e 3). Com esta avaliação comprova-se que o método é

preciso e exato dentro do range para o qual foi validada a curva de calibração e

conforme limites de aceitação (15%) preconizados pela Anvisa e FDA.

As análises da precisão e exatidão intralote do limite de quantificação

para os analitos são apresentadas nas Tabelas 38.

Tabela 38: Análise intralote do limite de quantificação - Sulfadiazina

SULFADIAZINA



experimentalmente

(µg/mL)

0,0537

0,0462

0,0456

0,0490

0,0472

0,0495

0,0477


Precisão (CV%) 5,6

Exatidão (%) 96,8

As precisões e as exatidões intra e interlote para os quatro controles de

qualidade baixo médios e alto estão apresentados na tabela 39. Os resultados foram

calculados a partir da média das concentrações experimentais obtidas com a análise

de 7 amostras de cada controle de qualidade.

159

Tabela 39: Análise intra e interlote dos controles de qualidade- Sulfadiazina

(n = 7) CQB (0,15 µg/mL) CQM1 (1,5 µg/mL) CQM2 (10 µg/mL) CQA (20 µg/mL)

01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03

INT

RA

-LO

TE

Média

(µg/mL) 0,143 0,169 0,156 1,52 1,69 1,58 9,54 10,7 10,1 17,9 20,4 19,3

Precisão

(CV%) 2,1 1,6 2,2 2,6 1,2 1,0 1,5 1,2 0,8 1,7 4,4 2,5

Exatidão

(%) 95,2 112,4 103,9 101,0 113,0 105,6 95,4 107,3 101,4 89,4 101,9 96,4

INT

ER

-LO

TE

Média

(µg/mL) 0,156 1,60 10,1 19,2

Precisão

(CV%) 7,2 5,0 5,0 6,3

Exatidão

(%) 103,8 106,5 101,4 95,9

Todas as corridas analíticas foram monitoradas, quanto à precisão e

exatidão, com o objetivo de assegurar a continuidade do desempenho satisfatório do

método previamente documentada na validação. A precisão representa o grau de

repetibilidade entre os resultados de análises individuais em idênticas condições de

ensaio e a exatidão, o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados e um aceito como referência. Um método bioanalítico é considerado

preciso e exato quando as análises dos controles de qualidade baixo, médio, alto e

limite de quantificação mostrarem valores não excedentes a 15% do valor nominal

analisado e para o limite de quantificação este desvio não deve exceder 20% tanto

para as mesmas corridas (Intra-ensaio) quanto para corridas analíticas diferentes

(Inter-ensaio) (BRASIL, 2003c; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRESSOLLE et

al., 1996; DADGAR et al., 1995).

De acordo com os rígidos critérios de controle de qualidade adotados por

órgãos reguladores (Anvisa e FDA), Não é permitido estimar a concentração das

amostras através de extrapolação da curva de calibração abaixo do LIQ ou acima do

maior padrão. Em vez disso, a curva deve ser redefinida ou as amostras de

concentrações superiores devem ser diluídas e re-analisadas (BRASIL, 2003c).

160

Desta forma, durante a realização dos procedimentos de validação da metodologia

bioanalítica proposta realizamos o estudo de precisão e exatidão da validação do

processo de diluição. A tabela 40 apresenta os resultados de precisão e exatidão

para o controle de qualidade diluído (CQD).

Tabela 40: Análise intra e interlote do controle de qualidade CQD- Sulfadiazina

(n = 7) CQD (40 µg/mL)

01 02 03

INT

RA

-

LO

TE

Média (µg/mL) 37,5 36,9 39,6

Precisão (CV%) 8,7 5,1 5,9

Exatidão (%) 93,9 92,4 98,9

INT

ER

-

LO

TE

Média (µg/mL) 38

Precisão (CV%) 7,1

Exatidão (%) 95,0

5.3.2.4 Recuperação do método

As recuperações relativas da Sulfadiazina determinadas em três

concentrações diferentes (CQB, CQM e CQA) foram 66,8, 59,0 e 74,4% e 63,4%,

respectivamente e para o sulfametoxazol foi de 66,2%. Valores de recuperações

similares, utilizando 500 µL de plasma, de 74,9 %, 70,6% e 68,4% para

concentrações de 15, 1,5 e 0,15 µg/mL para SDZ foram relatados por Metz et al.,

(1996).

A determinação do fator de recuperação mostrou que o procedimento de

extração no qual as amostras foram submetidas foi reprodutível e consistente, nos

três níveis de concentração na faixa de alcance do método, tanto para os analitos

quanto para o padrão interno. A recuperação de um analito em um ensaio é a

resposta do detector de uma quantidade de analito adicionada e ou separada de

uma matriz biológica. A recuperação está ligada à eficiência do método analítico de

separação, dentro dos limites de variabilidade (SHAH et al., 2000).

161

5.3.2.5 Estabilidade do analito no fluido biológico

Os procedimentos de estabilidade avaliaram a estabilidade do analito no

plasma humano sob distintas condições de temperatura e de intervalo de tempo, tão

bem quanto sua estabilidade nas soluções estoque (Master Solution) e de trabalho

(Working solution). Cinco alíquotas, para cada concentração avaliada, foram

preparadas a fresco e imediatamente quantificadas a fim de fornecer os valores de

referência.

Nossos resultados da análise da estabilidade não apresentaram sinais de

degradação dos fármacos em estudo. É possível, no entanto, concluir que não

houve degradação dentro dos tempos utilizados no testes, o que é sustentado pela

avaliação da variação dos controles de qualidade durante os estudos. O objetivo

desses testes de estabilidade é antecipar a identificação de possíveis problemas. Há

comprovação com base nos controles de qualidade de que não ocorreram

problemas de estabilidade nas corridas analíticas, já que os controles de qualidade

mantiveram-se dentro dos níveis esperados e estas foram, portanto validadas

constituindo provas suficientes para aceitação dos resultados e comprovação da

estabilidade das amostras.

Nenhuma degradação significativa pode ser observada em amostras

resfriadas a 10ºC no autoinjetor por 48 horas (Tabela 41). Isto significa que podemos

programar uma corrida analítica contendo um lote de amostras, suficientemente

grande para durar igual período de tempo, com a garantia que não haverá

degradação suficiente para comprometer resultados. A variação entre a

concentração da amostra logo após a sua preparação (tida como referência) e a

concentração da amostra, após permanência no auto-injetor, foi menor que 5% para

os três níveis de concentração. A tabela indica a média de concentração em dois

níveis (baixo e alto) para as amostras processadas, os respectivos coeficientes de

variação (para n=5) e a variação após 48 horas de permanência no auto-injetor à

10ºC.

162

Tabela 41: Estudo de estabilidade pós-processamento – Sulfadiazina

SULFADIAZINA (n = 5)


Referência Após 48 horas Referência Após 48 horas

Média

(µg/mL) 0,149 0,153 19,9 19,9

CV(%) 1,3 2,4 1,9 2,5

Variação 2,7 0,0

Na análise de 2 conjuntos de amostras de plasma contaminados (CQB e

CQA) do analito, foram preparados e estocados à -20ºC e submetidos a 5 ciclos de

congelamento e descongelamento (Tabela 42). A tabela indica a média de

concentração em dois níveis (baixo e alto) para as amostras processadas, os

respectivos coeficientes de variação (para n=5) e a variação entre os dados de

concentração obtidos após o 5º ciclo de congelamento e descongelamento. Os

resultados do teste de congelamento e descongelamento das amostras processadas

nos indicando que estas permanecem estáveis após serem descongeladas (até a

temperatura ambiente) e re-congeladas por 5 vezes, sem comprometer a qualidade

dos resultados de análise. Em todos os níveis de concentração a variação foi menor

que 5%.

Tabela 42: Estudo de estabilidade após ciclos de congelamento e

descongelamento – Sulfadiazina



Referência Após 5º ciclo Referência Após 5º ciclo

Média

(µg/mL) 0,15 0,16 19,7 20

CV(%) 1,9 1,3 1,3 0,7

Variação 6,7 1,5

163

Na avaliação da estabilidade de curta duração dos fármacos, cinco

alíquotas de cada controle de qualidade foram preparadas e congeladas a -20ºC e

depois descongeladas a temperatura ambiente por 9 horas. Os resultados deste

estudo estão apresentados na tabela 43.

Os valores apresentados não evidenciaram sinais de degradação

significativa uma vez que todos os valores encontraram-se dentro dos critérios

estabelecidos (BRASIL, 2003c; FINDLAY et al., 2000; SHAH et al., 2000; MEI et al.,

2003, GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001). Vale salientar que o tempo do material

em bancada (curta duração) não costuma exceder 1 hora e é o mesmo utilizado

para o preparo dos controles de qualidades. Portanto, qualquer degradação afetaria

da mesma forma os controles de qualidade empregados, levando a não validação

das corridas. Podendo-se concluir, portanto, que não houve degradação dentro do

tempo utilizado para o teste, o que é igualmente sustentado pela avaliação da

variação dos controles de qualidade durante a condução do estudo.

Tabela 43: Estudo de estabilidade de curta duração – Sulfadiazina



Referência Após 9 horas Referência Após 9 horas

Média

(µg/mL) 0,15 0,16 19,7 20

CV(%) 1,9 1,3 1,3 0,7

Variação 6,7 1,5

Quanto à estabilidade das soluções estoque (master solution),

comparando-se os valores médios obtidos das soluções contaminadas com o analito

e com o padrão interno preparadas recentemente com os valores médios das

soluções preparadas anteriormente e armazenadas nas condições de temperatura

ambiente (TA) por seis horas e refrigeradas a 4ºC por 14 dias, nota-se que as

variações são menores que 15% indicando, assim, a estabilidade destas soluções

(Tabela 44).

164

Tabela 44: Estabilidade soluções estoque – Sulfadiazina e sulfametoxazol


Concentração nominal - 10 µg/mL

Amostra 4ºC


Amostra


Média 154000 159000 177000 159000

CV (%) 3,42 4,25 2,36 4,25

Variação (%) -3,1 11,3



Amostra 4ºC


Amostra (TA)

por 6 h Referência

Média 8440000 8840000 9880000 8840000

CV (%) 0,948 1,78 0,943 1,78

Variação (%) -4,5 11,8

O mesmo padrão de comportamento pode ser observado para as

soluções de trabalho (working solution) que também foram estáveis quando

mantidas em temperatura ambiente por 06 horas, tempo superior ao necessário para

o manuseio das soluções na bancada, quando são preparados os lotes de amostras,

e após 14 dias de refrigeração a 4ºC (Tabela 45).

Tabela 45: Estabilidade soluções de trabalho – Sulfadiazina após 14 dias sob

refrigeração a 4ºC



Amostra 4ºC


Média (µg/mL) 47400 45200 6680000 6610000

CV(%) 2,61 4,24 2,23 1,47

Variação 4,9 1,1

165

Tabela 46: Estabilidade soluções de trabalho – Sulfadiazina após 6horas de

temperatura ambiente



Amostra (TA)

por 6 horas Referência

Amostra (TA)

por 6 horas Referência

Média (µg/mL) 4960000 45200 73200 6610000

CV(%) 6,17 4,24 2,09 1,47

Variação 9,7 10,7

Quanto aos dados da estabilidade de longa duração, a variação não foi

significativa, uma vez que as variações obtidas, quando comparadas com os valores

médios dos controles de qualidade baixo e alto para as amostras recém preparadas

com os valores médios de CQB e CQA para as amostras armazenadas durante 59

dias estiveram abaixo dos desvios permitidos de 15% para os três controles

analisados. Assim, as amostras dos voluntários sofreram o mesmo grau de

degradação, o que não interfere na avaliação dos parâmetros farmacocinéticos

relativos ao fármaco em estudo (Tabela 47).

Tabela 47: Estabilidade de longa duração – Sulfadiazina



Referência Após 59 dias Referência Após 59 dias

Média (µg/mL) 0,166 0,153 18,6 19,7

CV(%) 1,0 2,2 1,1 7,5

Variação -7,8 5,9

Todos os testes que compuseram a avaliação da estabilidade, das

amostras e das soluções empregadas no estudo, apresentaram coeficiente de

variação e desvio em relação à concentração referência menores que 15%, estando

assim em conformidade com os critérios de aceitação propostos pela legislação

vigente no país e internacionais.

166

5.3.3 Aplicação da metodologia bioanalítica em estudo de

farmacocinética comparada

A metodologia validada foi aplicada para determinação e avaliação dos

parâmetros farmacocinéticos de duas formulações de sulfadiazina comprimidos de

500mg em um estudo de biodisponibilidade comparativa.

A partir da determinação das concentrações plasmáticas de sulfadiazina

foi obtida uma curva de concentração plasmática média em função do tempo para

cada formulação (Figura 36) e, a partir destas, os parâmetros farmacocinéticos

relacionados à absorção foram calculados.

Figura 36: Curva de concentração plasmática (µg/mL) versus tempo (h) para

sulfadiazina após a administração das formulações em 24 voluntários

saudáveis.

167

A figura 36 mostra semelhança entre os perfis farmacocinéticos das

formulações estudadas. Relatos recentes de estudos farmacocinéticos realizados

em seres humanos com a sulfadiazina são escassos. Entretanto, perfil semelhante

foi observado por Meyer et al., 1978. Esta semelhança comprova que os tempos de

coleta utilizados no ensaio clínico foram adequados para a caracterização dos perfis

farmacocinéticos de ambos os fármacos.

A estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para sulfadiazina

está apresentada na tabela 48.

Tabela 48: Estatística descritiva dos parâmetros farmacocinéticos para

sulfadiazina

ASC0-∞

(µg*h/mL)

ASC0-túltimo

(µg*h/mL)

Cmax

(µg/mL)

Tmax

(h)

T1/2

(h)

R T R T R T R T R T

Média 358,82 360,78 329,11 318,12 18,85 18,34 4,27 3,92 12,44 14,06

DP 71,92 112,92 57,07 67,94 3,92 5,75 1,28 1,22 4,97 8,43

Mínimo 258,59 219,91 244,86 204,97 12,90 9,54 2,00 2,00 8,16 8,48

Máximo 502,17 744,11 426,05 426,73 27,40 30,90 7,00 7,00 33,67 51,61

Mediana 346,18 339,73 319,10 313,32 18,05 17,05 4,25 3,50 11,17 11,83

CV (%) 20,04 31,30 17,34 21,36 20,82 31,37 29,89 31,19 39,94 59,96

R: formulação referência

T: formulação teste

De fato, os parâmetros farmacocinéticos relacionados à absorção sofrem

influência da formulação utilizada para veiculação do fármaco e, portanto podem

apresentar diferenças entre produtos diferentes contendo o mesmo fármaco

(STORPIRTIS, 1999). Este fato não ocorreu com as formulações estudadas uma vez

que não houve diferença entre os parâmetros avaliados. Características

farmacocinéticas semelhantes foram relatadas por Meyer et al., (1978) onde após

administração oral de 500 mg de sulfadiazina em dezesseis voluntários sadios do

sexo masculino foram observados os seguintes valores para Cmax, Tmax, ASC0-túltimo,

ASC0-∞ e T1/2: 17,7 µg/mL, 3,5 h, 328,5 µg*h/mL e 355,9 µg*h/mL e 10 horas,

respectivamente.

168

Os estudos de bioequivalência são os substitutos para os ensaios clínicos

de avaliação da equivalência terapêutica em termos de segurança e eficácia entre

as formas farmacêuticas avaliadas. Portanto, o objetivo de um estudo de

bioequivalência é identificar equivalentes farmacêuticos ou alternativas

farmacêuticas que serão utilizadas de forma intercambiável para o mesmo efeito

terapêutico. Neste contexto, como observado na tabela 50, considerando que os

intervalos de confiança de 90% para a razão geométrica de Cmax e ASC0-túltimo estão

dentro do intervalo (80-125%) estabelecido pela Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA) e Food and Drug Administration Agency (FDA), conclui-se que

as formulações de Sulfadiazina comprimidos de 500mg são bioequivalentes para

velocidade e extensão de absorção.

Tabela 49: Análise da bioequivalência entre as formulações estudadas

SULFADIAZINA

Teste/Referência

Média

Geométrica ou

Ponto Médio (%)

Intervalo de

confiança de

90% (%)

Poder

do teste

CV

intrassujeito

(%)

Cmax 94,96 88,01-102,45 0,9985 15,41

ASC(0-túltimo) 95,93 91,44-100,65 1,0000 9,70

169

CONSIDERAÇÕES FINAIS

170

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A validação de uma metodologia bioanalítica deve garantir, por meio de

estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações

bioanalíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. De fato, as metodologias

propostas para quantificação simultânea de sulfametoxazol e trimetoprima e

quantificação de sulfadiazina em plasma humano atenderam aos rígidos critérios

exigidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Food and Drug

Administration para realização de estudos de biodisponibilidade, bioequivalência e

farmacocinética. Além disso, ressalta-se a grande importância social e científica

desses estudos para o controle de qualidade dos medicamentos bem como o bem

estar dos pacientes que farão uso destas formulações através da realização de

monitoração terapêutica.

As metodologias analíticas desenvolvidas e validadas foram precisas, pois

os coeficientes de variação para os controles de qualidade, baixo, médio e alto

permaneceram abaixo de 15% e abaixo de 20% para o limite de quantificação.

Verificou-se exatidão, pois os valores médios permaneceram dentro dos

15% do valor nominal para o controle de qualidade baixo, médio e alto e não se

desviou mais que 20% do limite de quantificação.

Os métodos foram considerados sensíveis, pois os menores limites de

quantificação dos métodos (LQ=0,5 µg/mL para sulfametoxazol; 0,02 µg/mL para

trimetoprima e 0,05 µg/mL para sulfadiazina) apresentaram um coeficiente de

variação inferior a 20%.

Os métodos mostraram-se específicos já que não houve interferências nos

tempos de retenção dos picos dos analitos e dos padrões internos superior a 20%

da resposta do limite de quantificação.

A estabilidade dos métodos foi assegurada, através dos testes de

estabilidade de curta duração, estabilidade em ciclos de congelamento e

descongelamento, estabilidade de longa duração e estabilidade das soluções

171

padrão, onde se verificou não haver degradação dos fármacos na matriz biológica

estudada.

A robustez verificada frente a pequenas variações tais como, pH, força

iônica e quantidade do modificador orgânico da fase móvel, temperatura da coluna,

vazão da fase móvel, diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes),

procedimentos envolvidos no preparo das amostras, possibilita a intercambialidade

entre laboratórios e doseamento em outros fluidos biológicos.

As metodologias possuem vantagens em termos de custo frente a outros

métodos através do preparo de amostras relativamente simples uma vez que foram

desnecessários pré-tratamentos com cartuchos e pré-colunas.

Os métodos analíticos utilizados, LC-MS-MS, para quantificação de

sulfametoxazol, trimetoprima e sulfadiazina em plasma humano desenvolvidos e

validados apresentaram vantagens em termos de sensibilidade e tempo total de

análise em relação aos descritos o que é de grande importância durante a rotina

laboratorial na realização de estudos farmacocinéticos.

A aplicação das metodologias bioanalíticas desenvolvidas e validadas em

estudos de biodisponibilidade comparativa entre formulação contendo a associação

de sulfametoxazol+trimetoprima e de formulações contendo sulfadiazina confirmou a

intercambialidade entre os medicamentos estudados uma vez que os resultados

contemplaram os intervalos preconizados e, por conseguinte, garantindo

semelhança entre a resposta farmacocinética e eficácia terapêutica dos produtos.

172

CONCLUSÃO

173

7 CONCLUSÃO

As metodologias bioanalíticas propostas foram desenvolvidas e validadas

e quantificaram com rapidez, precisão exatidão e reprodutibilidade as amostras dos

voluntários participantes dos estudos de biodisponibilidade comparativa referentes

às formulações de uso oral sulfametoxazol + trimetoprima e sulfadiazina.

174

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8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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191

GLOSSÁRIO

192

9 GLOSSÁRIO

Fármaco - é a substância química de constituição definida que pode ter aplicação

em Farmácia, seja como preventivo, seja como curativo, seja como agente de

diagnóstico; a ser aceita esta definição, a matéria prima mineral, vegetal ou animal

da qual se podem extrair uma ou mais bases medicamentosas não é fármaco, pois

sua constituição química não é necessariamente conhecida.

Índice de Massa Corpórea (IMC) - é a razão do peso (Kg) pela altura (m) ao

quadrado. É o melhor indicador de obesidade, pois enfatiza a adiposidade relativa

dos indivíduos e minimiza os efeitos da altura.

Medicamento - produto farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado, com

finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico. É uma forma

farmacêutica terminada que contém o fármaco, geralmente em associação com

adjuvantes farmacotécnicos.

Área sob a Curva da Concentração Plasmática versus Tempo (ASC) - relaciona-

se com a quantidade ou a extensão de absorção da droga pode ser calculado pelo

método trapezoidal e expresso em unidades de concentração vezes tempo.

Área sob a Curva do Tempo Zero ao Tempo T (ASC0-t) - relaciona-se com a

quantidade da droga absorvida do tempo zero ao tempo t, onde t é a última coleta

determinada experimentalmente.

Área sob a Curva da Concentração Plasmática versus Tempo, de Zero ao

Infinito (ASC0-) - relaciona-se com a quantidade ou a extensão de absorção da

droga. A quantidade da absorção sistêmica da droga é diretamente relacionada com

ASC que é geralmente calculado pelo método trapezoidal e expresso em unidades

de concentração vezes tempo.

193

Concentração Máxima Atingida no Plasma (Cmax) - concentração mais elevada da

droga atingida na circulação sanguínea após administração de um fármaco.

Relaciona-se a intensidade da resposta farmacológica. O Cmax ideal deve estar

dentro da janela terapêutica.

Meia Vida de Eliminação da Droga (t1/2) - representa o tempo em que a

concentração da droga no plasma é reduzida à metade. Calcula-se através do

logaritmo neperiano (ln) de 2 (ln2= 0,693) dividido pela constante de eliminação. t1/2

= ln2/K.

Tempo correspondente à Concentração Máxima Atingida no Plasma (Tmax) -

tempo correspondente para que o fármaco atinja a concentração máxima (Cmax).

Amostra - termo geral que abrange: controles, brancos, amostras processadas e

desconhecidas.

Amostra branco – amostra de uma matriz biológica na qual nenhum analito foi

adicionado, utilizada para avaliar a especificidade do método bioanalítico.

Amostra de Controle de Qualidade (CQ) – amostra da matriz biológica adicionada

do analito, usada para monitorar o desempenho de um método bioanalítico e para

avaliar a integridade e validade dos resultados das amostras desconhecidas

analisadas numa corrida individual.

Amostra processada – extrato final (anterior à análise instrumental) de uma

amostra que foi submetida a várias manipulações (ex: diluição, extração,

concentração).

Amostra desconhecida – amostra biológica que é objeto de análise.

Analito – composto químico específico a ser mensurado, podendo ser o fármaco

não transformado, biomolécula ou seu derivado, metabólito ou produto de

degradação em uma matriz biológica.

194

Matriz biológica – material distinto de origem biológica, que pose ser amostrado e

processado de modo reprodutível.

Corrida analítica (ou lote) – conjunto completo de amostras em estudo, com um

número apropriado de padrões e CQs para sua validação e que tem sua análise

completa nas mesmas condições.

Método – descrição compreensível de todos os procedimentos usados em análises

de amostras.

Especificidade – habilidade do método bioanalítico de medir e diferenciar o analito

de componentes que possam estar presentes na amostra, tais como metabólitos,

impurezas, compostos de degradação ou componentes da matriz.

Exatidão – representa o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados e um valor aceito como referência.

Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração da substância em exame (analito).

Precisão – representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises

individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra

homogênea, em idênticas condições de ensaio.

Recuperação – eficiência de extração de um método analítico, expressa como a

porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparação dos

resultados analíticos de amostras branco acrescidas de padrão e submetidas ao

processo de extração, com os resultados com os resultados analíticos de soluções

padrão na extraídas.

Reprodutibilidade - precisão entre dois laboratórios. Também representa a precisão

do método sob as mesmas condições operacionais, num curto período de tempo.

195

Estabilidade – parâmetro que visa determinar se um analito mantém-se

quimicamente inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em

determinados intervalos de tempo.

Limite inferior de quantificação (LIQ) – menor quantidade de um analito numa

amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão

aceitáveis.

Limite superior de quantificação (LSQ) - maior quantidade de um analito numa

amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão

aceitáveis.

Faixa de quantificação – corresponde a uma faixa de concentração, incluindo o

LSQ e o LIQ, que pode ser confiável e reprodutivamente quantificada com exatidão

e precisão, por meio da relação concentração-resposta.

Padrão de calibração – matriz biológica a qual foi adicionada uma quantidade

conhecida de analito. Os padrões de calibração são usados para construir a curva

de calibração, com a qual são determinadas as concentrações do analito nos CQs e

nas amostras desconhecidas em estudo.

Padrão interno (PI) – composto, geralmente com características estruturais ao

analito, adicionado aos padrões de calibração e amostras em concentrações

conhecidas e constantes, para facilitar a determinação do analito.

Validação total – estabelecimento de todos os parâmetros de validação de um

método bioanalítico, aplicáveis à análise das amostras.

196

APÊNDICES

197

APÊNDICE 01

Aprovação Comitê de Ética Sulfametoxazol + Trimetoprima

198

APÊNDICE 02

Aprovação Comitê de Ética Sulfadiazina

199

APÊNDICE 03

Certificado de análise sulfametoxazol

200

APÊNDICE 04

Certificado de análise Trimetoprima

201

APÊNDICE 05

Certificado de análise Sulfadiazina

202

APÊNDICE 06

Certificado de análise Metoprolol

203

APÊNDICE 07

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Estudo de Biodisponibilidade entre uma Formulação de Sulfametoxazol e Trimetoprima Suspensão de 40 mg + 8 mg/mL, Produzidas pelo Laboratório

Sobral, (formulação teste), versus uma Formulação de Sulfametoxazol e Trimetoprima Suspensão de 200 mg + 40 mg/5 mL, Produto de Referência da

Roche Químicos e Farmacêucitos S.A. (Bactrim) em Voluntários Sadios de Ambos os Sexos

Você está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua

participação é importante, porém, você não deve participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações abaixo e faça qualquer pergunta que desejar, para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam esclarecidos.

O abaixo-assinado, _________________________________________, ______ anos, RG nº________________ declara que é de livre e espontânea vontade que está participando como voluntário do projeto de pesquisa supracitado, de responsabilidade dos Médicos Pesquisadores Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes, Prof. Dr. Fernando Antonio Frota Bezerra e da Enfermeira Pesquisadora Ismenia Osório Leite da Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) da Universidade Federal do Ceará. O abaixo-assinado está ciente que: NATUREZA E PROPÓSITO DO ESTUDO

O objetivo da pesquisa é verificar se a suspensão contendo 40 mg + 8 mg/mL de Sulfametoxazol e Trimetoprima produzidas pelo Laboratório Sobral (formulação teste) atinge níveis no sangue equivalentes a suspensão contendo 200 mg + 40

mg/5 mL de Sulfametoxazol e Trimetoprima (Bactrim) Roche Químicos e

Farmacêucitos S.A. (Bactrim) (formulação referência). Você receberá as duas medicações, cada uma em uma ocasião diferente. A ordem que você tomará cada medicação obedecerá a um sorteio.

PROCEDIMENTOS A SEREM REALIZADOS E RESPONSABILIDADES

Antes de sua participação no estudo e após a sua participação você será convidado a ir à Unidade de Farmacologia Clínica para avaliar a sua condição de saúde. Você será examinado por um médico que lhe fará um exame completo, medindo o seu pulso, sua temperatura, sua pressão arterial. Também será feito um exame do coração (eletrocardiograma). O médico lhe perguntará se você teve ou tem alguma doença e se você faz uso de algum medicamento.

Durante a visita serão coletadas amostras de sangue e urina para exames laboratoriais. Os exames laboratoriais incluem exame de sangue completo como hemograma completo (hemoglobina, hematócrito, contagem diferencial de glóbulos brancos, contagem de glóbulos vermelhos e plaquetas); bioquímica sanguínea

204

(glicose no sangue, albumina, transaminases oxalacética (AST) e pirúvica (ALT), creatinina, colesterol total, triglicerídeos, fosfatase alcalina, bilirrubina total). Sumário de urina (Urina I). Exames para a hepatite B e C; AIDS (HIV 1 e HIV 2) e βHCG (para as mulheres), no sangue, serão realizados no pré estudo.

Se você for considerado sadio para realizar o estudo, você será internado duas vezes por aproximadamente 36 horas cada período, com intervalo mínimo de 5 a 7 dias. Em cada internamento:

a) será administrado 20 mL da suspensão teste ou referência, acompanhado de 200 mL de água sem gás;

b) serão coletadas 20 amostras de sangue de 8 mL, cada, através de agulha introduzida em veia superficial para a dosagem do medicamento e mais uma amostra de 18 mL antes da administração da medicação para o controle do método de dosagem do medicamento no sangue.

c) será verificada sua pressão, pulso e temperatura, em intervalos regulares.

d) serão também servidas refeições padronizadas [ceia, na noite da internação (se não interferir com o jejum); café da manhã, almoço, lanche da tarde, jantar e ceia no dia de administração do medicamento; café da manhã no dia de alta] ou bebidas em horários preestabelecidos. Após a coleta de 24 horas você receberá alta da Unidade de Farmacologia Clínica. Cerca de 356 mL de sangue será colhido durante todo o estudo.

e) serão realizadas coletas externas nos horários de 36, 48 e 72 horas após administração da medicação em estudo.

A duração total de sua participação na pesquisa está estimada em 30 dias, a contar da primeira internação, após o processo de seleção.

RESPONSABILIDADES

É condição indispensável, para participação no ensaio clínico, que esteja em boa saúde e, portanto, não esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso de quaisquer fármacos ou medicações e que tampouco tenha participado de outro estudo clínico com medicamentos nos últimos 3 meses. Algumas regras deverão ser seguidas para sua participação no estudo: a) não pode ser dependente de fármacos ou álcool e caso o investigador tenha alguma suspeita, poderá solicitar exame de urina para detecção do uso de fármacos; b) não pode ter doado (ou retirado/perdido por qualquer motivo) sangue ou plasma dentro dos três meses que antecedem o estudo ou ter doado 1500 mL (um litro e meio) no período de um ano antecedendo o estudo; c) não pode tomar bebidas contendo cafeína e xantinas (café, chá, coca-cola, etc.) nas 12 horas que antecedem as internações até a última coleta.

É ainda de sua RESPONSABILIDADE em relação a sua participação no ensaio clínico: a) comparecer às internações na data e horários informados; b) não engravidar, conforme orientação, durante a participação no estudo (desde a seleção até o pós-estudo); c) permanecer em jejum pelo tempo previsto (pelo menos 10 horas) em cada internação; d) tomar toda a medicação prevista; e) Ingerir toda a alimentação e líquidos que tenham sido previstos; f) retornar à Unidade de Farmacologia Clínica na data, horário e local combinados, para realização da

205

consulta e exames de alta, independentemente de haver sido interrompida sua participação no estudo ou de sua desistência.

POSSÍVEIS RISCOS E DESCONFORTOS

A administração oral de Sulfametoxazol e Trimetoprima de maneira continuada pode causar reações leves como: efeitos gastrintestinais (náuseas, lesões na boca, diarreia), reações de pele e zumbidos nos ouvidos. Entretanto o aparecimento de efeitos indesejáveis após administração de dose única de Sulfametoxazol e Trimetoprima tem menor probabilidade de aparecer. Além dos efeitos citados, a administração de qualquer medicamento pode causar reações imprevisíveis.

A retirada de sangue é um procedimento seguro e pode causar um leve desconforto, além de uma mancha roxa pequena no local da picada que frequentemente resolve sem maiores problemas.

BENEFÍCIOS OU COMPENSAÇÕES

A participação neste estudo, não tem objetivo de submetê-lo a um tratamento terapêutico. Consequentemente, não se espera que a participação no estudo traga qualquer benefício em função do tratamento.

INTERCORRÊNCIAS (efeitos indesejáveis)

Se você sofrer algum malefício em decorrência direta de sua participação no estudo, você receberá tratamento nesta Instituição. Eventuais custos decorrentes de internamentos e tratamentos hospitalares, bem como óbito, se comprovadamente decorrentes de reações adversas provocadas pelo produto sob investigação, serão de responsabilidade do Patrocinador do Estudo.

RESSARCIMENTO

De acordo com valores previamente estabelecidos os voluntários serão ressarcidos das despesas e tempo despendido na realização do supracitado estudo clínico após a consulta de alta. Caso desista, ou seja, dispensado antes do estudo ser finalizado o voluntário receberá proporcionalmente ao tempo despendido, no final do estudo. Entende também que a desistência ou dispensa antes do comparecimento para a primeira internação não dá direito a ressarcimento.

Estima-se que, durante o período de sua participação no estudo, vocês terão como despesas os gastos de deslocamento da residência ou trabalho até à Unidade de Farmacologia Clínica para internação e consultas, bem como coletas de amostras após a alta; ou ao laboratório de análises clínicas para a realização dos exames. Ainda deve ser prevista eventual visita posterior para acompanhamento de eventos adversos, se estes ocorrerem. O ressarcimento destas despesas já está incluído no valor estabelecido no item acima.

206

PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA

Sua participação é voluntária e você tem a liberdade de desistir ou interromper a participação neste estudo no momento que desejar. Neste caso, você deve informar imediatamente sua decisão ao pesquisador ou a um membro de sua equipe, sem necessidade de qualquer explicação e sem que isto venha interferir no seu atendimento médico desta Instituição.

Obteve todas as informações e esclarecimentos necessários para poder decidir conscientemente sobre a participação no referido ensaio clínico.

Independente de seu desejo e consentimento, sua participação no ensaio clínico poderá ser interrompida, em função: a) da ocorrência de eventos adversos; b) da ocorrência de qualquer doença que, a critério médico, prejudique a continuação de sua participação no estudo; c) do não cumprimento das normas estabelecidas; d) de qualquer outro motivo que, a critério médico, seja do interesse de seu próprio bem-estar ou dos demais participantes; e) da suspensão do Estudo como um todo.

A Unidade de Farmacologia Clínica o manterá informado, em tempo oportuno, sempre que houver alguma informação adicional que possa influenciar seu desejo de continuar participando no estudo e prestará qualquer tipo de esclarecimento em relação ao progresso da pesquisa, conforme sua solicitação.

A interrupção não causará prejuízo ao seu atendimento, cuidado e tratamento pela equipe da Unidade de Farmacologia Clínica.

DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES QUANTO A PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO

Os registros que possam identificar sua identidade serão mantidos em sigilo, a não ser que haja obrigação legal de divulgação. A Unidade de Farmacologia Clínica não identificará o voluntário por ocasião da publicação dos resultados obtidos.

Contudo, o(s) monitor(es) do Estudo, auditor(es), membros do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará, ou autoridades do(s) órgão(s) governamentais envolvido(s) na fiscalização e acompanhamento do estudo terão direito de ter acesso aos registros originais de dados clínicos de sua pessoa, coletados durante a pesquisa, na extensão em que for permitido pela lei e regulamentações aplicáveis, com o propósito de verificar os procedimentos e dados do ensaio, sem no entanto violar a condição de que tais informações são confidenciais. Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, você está também autorizando tal acesso, mesmo se você se retirar do Estudo.

CONTATOS E PERGUNTAS

Caso surja alguma intercorrência, deverá procurar a Unidade de Farmacologia Clínica (Fone 3366-8250) e solicitar que a mesma contacte os médicos responsáveis pelo ensaio clínico ou então entrarem em contato diretamente com os mesmos nos telefones indicados no final deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

207

Poderá contactar a Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes e Dr. Fernando Antonio Frota Bezerra para receber informações adicionais, relacionadas à pesquisa ou quanto aos seus direitos como voluntário.

Poderá contactar a Secretaria do Comitê em Pesquisa da UFC, fone 3366-8338, para apresentar recursos ou reclamações em relação ao ensaio clínico.

Se você concorda com o exposto acima leia e assine o documento abaixo.

ASSINATURAS

Eu declaro que li cuidadosamente todo este documento denominado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e que, após, tive nova oportunidade de fazer perguntas sobre o conteúdo do mesmo o também sobre o Estudo e recebi explicações que responderam por completo minhas dúvidas e reafirmo estar livre e espontaneamente decidindo participar do Estudo.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, eu também estou certificando que toda a informação que eu prestei, incluindo minha história médica, é verdadeira e correta até onde é de meu conhecimento, e declaro estar recebendo uma cópia assinada deste documento.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, estou autorizando o acesso às minhas informações, conforme explicitado anteriormente.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, eu não renunciei qualquer direito legal que eu venha a ter ao participar deste Estudo.

Fortaleza, _____/_____/______

Nome do voluntário Data Assinatura

Nome da pessoa que está obtendo o termo de consentimento

Data Assinatura

Nome da Testemunha (se o voluntário não souber ler)

Data Assinatura

CONTROLE INTERNO Nº do Estudo: 30-2007 Nº do Voluntário: ________

TELEFONES PARA CONTATO

UNIDADE DE FARMACOLOGIA CLÍNICA (85) 3366 8250 Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes (85) 3366 8346 Dr. Manoel Odorico de Moraes (85) 3366 8201 Dr. Fernando Antônio Frota Bezerra (85) 3366 8346 Enfermeira Ismenia Osório Leite (85) 3366 8250

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APÊNDICE 08

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO SULFADIAZINA

Estudo de Biodisponibilidade entre uma Formulação de Sulfadiazina Comprimidos de 500 mg (formulação teste), versus uma Formulação de

Sulfadiazina Comprimidos de 500 mg (formulação referência – Suladrin®) em Voluntários Sadios de Ambos os Sexos

Você está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua

participação é importante, porém, você não deve participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações abaixo e faça qualquer pergunta que desejar, para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam esclarecidos.

O abaixo-assinado, _________________________________________, ______ anos, RG nº________________ declara que é de livre e espontânea vontade que está participando como voluntário do projeto de pesquisa supracitado, de responsabilidade dos Médicos Pesquisadores Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes, Prof. Dr. Fernando Antonio Frota Bezerra, Dra Jonaina Costa de Oliveira, das Enfermeiras Pesquisadoras Ismenia Osório Leite e Gilmara Holanda da Cunha, e dos Farmacêuticos Demétrius Fernandes do Nascimento e Andrea Vieira Pontes da Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) da Universidade Federal do Ceará. O abaixo-assinado está ciente que: NATUREZA E PROPÓSITO DO ESTUDO

O objetivo da pesquisa é verificar se o comprimido contendo 500 mg de Sulfadiazina produzido pelo Laboratório Sobral (formulação teste) atinge níveis no

sangue equivalentes ao comprimido contendo 500 mg de Sulfadiazina (Suladrin) produzido pelo Laboratório Catarinense S.A (formulação referência). Você receberá as duas medicações, cada uma em uma ocasião diferente. A ordem que você tomará cada medicação obedecerá a um sorteio.

PROCEDIMENTOS A SEREM REALIZADOS E RESPONSABILIDADES

Antes de sua participação no estudo e após a sua participação você será convidado a ir à Unidade de Farmacologia Clínica para avaliar a sua condição de saúde. Você será examinado por um médico que lhe fará um exame completo, medindo o seu pulso, sua temperatura, sua pressão arterial. Também será feito um exame do coração (eletrocardiograma). O médico lhe perguntará se você teve ou tem alguma doença e se você faz uso de algum medicamento.

Durante a visita serão coletadas amostras de sangue e urina para exames laboratoriais. Os exames laboratoriais incluem exame de sangue completo como hemograma completo (hemoglobina, hematócrito, contagem diferencial de glóbulos brancos, contagem de glóbulos vermelhos e plaquetas); bioquímica sanguínea (glicose no sangue, albumina, transaminases oxalacética (AST) e pirúvica (ALT),

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creatinina, colesterol total, triglicerídeos, fosfatase alcalina). Sumário de urina (Urina I). Exames para a hepatite B e C; AIDS (HIV 1 e HIV 2) e βHCG (para as mulheres), no sangue, serão realizados no pré-estudo.

Se você for considerado sadio para realizar o estudo, você será internado duas vezes por aproximadamente 36 horas cada período, com intervalo de 7 dias. Em cada internamento:

a) será administrado 1 comprimido da formulação teste ou referência, acompanhado de 200 mL de água sem gás;

b) serão coletadas 20 amostras de sangue de 9 mL, cada, através de agulha introduzida em veia superficial para a dosagem do medicamento e mais uma amostra de 20 mL antes da administração da medicação para o controle do método de dosagem do medicamento no sangue.

c) será verificada sua pressão, pulso e temperatura, em intervalos regulares.

d) serão também servidas refeições padronizadas [ceia, na noite da internação (se não interferir com o jejum); café da manhã, almoço, lanche da tarde, jantar e ceia no dia de administração do medicamento; café da manhã no dia de alta] ou bebidas em horários preestabelecidos. Após a coleta de 24 horas você receberá alta da Unidade de Farmacologia Clínica. Cerca de 360 mL de sangue será colhido durante todo o estudo.

e) serão realizadas coletas externas nos horários de 36 e 48 horas após administração da medicação em estudo.

A duração total de sua participação na pesquisa está estimada em 30 dias, a contar da primeira internação, após o processo de seleção.

RESPONSABILIDADES

É condição indispensável, para participação no ensaio clínico, que esteja em boa saúde e, portanto, não esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso de quaisquer fármacos ou medicações e que tampouco tenha participado de outro estudo clínico com medicamentos nos últimos 6 meses. Algumas regras deverão ser seguidas para sua participação no estudo: a) não pode ser dependente de fármacos ou álcool e caso o investigador tenha alguma suspeita, poderá solicitar exame de urina para detecção do uso de fármacos; b) não pode ter doado (ou retirado/perdido por qualquer motivo) sangue ou plasma dentro dos três meses que antecedem o estudo ou ter doado 1500 mL (um litro e meio) no período de um ano antecedendo o estudo; c) não pode tomar bebidas contendo cafeína e xantinas (café, chá, coca-cola, etc.) nas 12 horas que antecedem as internações até a última coleta.

É ainda de sua RESPONSABILIDADE em relação a sua participação no ensaio clínico: a) comparecer às internações na data e horários informados; b) não engravidar, conforme orientação, durante a participação no estudo (desde a seleção até o pós-estudo); c) permanecer em jejum pelo tempo previsto (pelo menos 10 horas) em cada internação; d) tomar toda a medicação prevista; e) Ingerir toda a alimentação e líquidos que tenham sido previstos; f) retornar à Unidade de Farmacologia Clínica na data, horário e local combinados, para realização da

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consulta e exames de alta, independentemente de haver sido interrompida sua participação no estudo ou de sua desistência.

POSSÍVEIS RISCOS E DESCONFORTOS

A administração oral de Sulfadiazina de maneira continuada pode causar reações leves como: náuseas, vômitos, reações de pele (Vermelhidão). Entretanto o aparecimento de efeitos indesejáveis após administração de dose única de Sulfadiazina tem menor probabilidade de aparecer. Além dos efeitos citados, a administração de qualquer medicamento pode causar reações imprevisíveis.

A retirada de sangue é um procedimento seguro e pode causar um leve desconforto, além de uma mancha roxa pequena no local da picada que frequentemente resolve sem maiores problemas.

BENEFÍCIOS OU COMPENSAÇÕES

A participação neste estudo, não tem objetivo de submetê-lo a um tratamento terapêutico. Consequentemente, não se espera que a participação no estudo resulte em benefício em função do tratamento.

INTERCORRÊNCIAS (efeitos indesejáveis)

Se você sofrer algum malefício em decorrência direta de sua participação no estudo, você receberá tratamento nesta Instituição. Eventuais custos decorrentes de internamentos e tratamentos hospitalares, bem como óbito, se comprovadamente decorrentes de reações adversas provocadas pelo produto sob investigação, serão de responsabilidade do Patrocinador do Estudo.

RESSARCIMENTO

De acordo com valores previamente estabelecidos os voluntários serão ressarcidos das despesas e tempo despendido na realização do supracitado estudo clínico após a consulta de alta. Caso desista, ou seja, dispensado antes do estudo ser finalizado o voluntário receberá proporcionalmente ao tempo despendido, no final do estudo. Entende também que a desistência ou dispensa antes do comparecimento para a primeira internação não dá direito a ressarcimento.

Estima-se que, durante o período de sua participação no estudo, vocês terão como despesas os gastos de deslocamento da residência ou trabalho até a Unidade de Farmacologia Clínica para internação e consultas, bem como coletas de amostras após a alta; ou ao laboratório de análises clínicas para a realização dos exames. Ainda deve ser prevista eventual visita posterior para acompanhamento de eventos adversos, se estes ocorrerem. O ressarcimento destas despesas já está incluído no valor estabelecido no item acima.

211

PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA

Sua participação é voluntária e você tem a liberdade de desistir ou interromper a participação neste estudo no momento que desejar. Neste caso, você deve informar imediatamente sua decisão ao pesquisador ou a um membro de sua equipe, sem necessidade de qualquer explicação e sem que isto venha interferir no seu atendimento médico desta Instituição.

Você obteve todas as informações e esclarecimentos necessários para poder decidir conscientemente sobre a participação no referido ensaio clínico.

Independente de seu desejo e consentimento, sua participação no ensaio clínico poderá ser interrompida, em função: a) da ocorrência de eventos adversos; b) da ocorrência de qualquer doença que, a critério médico, prejudique a continuação de sua participação no estudo; c) do não cumprimento das normas estabelecidas; d) de qualquer outro motivo que, a critério médico, seja do interesse de seu próprio bem-estar ou dos demais participantes; e) da suspensão do Estudo como um todo.

A Unidade de Farmacologia Clínica o manterá informado, em tempo oportuno, sempre que houver alguma informação adicional que possa influenciar seu desejo de continuar participando no estudo e prestará qualquer tipo de esclarecimento em relação ao progresso da pesquisa, conforme sua solicitação.

A interrupção não causará prejuízo ao seu atendimento, cuidado e tratamento pela equipe da Unidade de Farmacologia Clínica.

DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES QUANTO A PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO

Os registros que possam identificar sua identidade serão mantidos em sigilo, a não ser que haja obrigação legal de divulgação. A Unidade de Farmacologia Clínica não identificará o voluntário por ocasião da publicação dos resultados obtidos.

Contudo, o(s) monitor(es) do Estudo, auditor(es), membros do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará, ou autoridades do(s) órgão(s) governamentais envolvido(s) na fiscalização e acompanhamento do estudo terão direito de ter acesso aos registros originais de dados clínicos de sua pessoa, coletados durante a pesquisa, na extensão em que for permitido pela lei e regulamentações aplicáveis, com o propósito de verificar os procedimentos e dados do ensaio, sem no entanto violar a condição de que tais informações são confidenciais. Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, você está também autorizando tal acesso, mesmo se você se retirar do Estudo.

CONTATOS E PERGUNTAS

Caso surja alguma intercorrência, deverá procurar a Unidade de Farmacologia Clínica (Fone 3366-8250) e solicitar que a mesma contate os médicos responsáveis pelo ensaio clínico ou então entrarem em contato diretamente com os mesmos nos telefones indicados no final deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

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Poderá contatar a Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes e Dr. Fernando Antonio Frota Bezerra para receber informações adicionais, relacionadas à pesquisa ou quanto aos seus direitos como voluntário.

Poderá contatar a Secretaria do Comitê em Pesquisa da UFC, fone 3366-8338, para apresentar recursos ou reclamações em relação ao ensaio clínico.

Se você concorda com o exposto acima leia e assine o documento abaixo.

ASSINATURAS

Eu declaro que li cuidadosamente todo este documento denominado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e que, após, tive nova oportunidade de fazer perguntas sobre o conteúdo do mesmo o também sobre o Estudo e recebi explicações que responderam por completo minhas dúvidas e reafirmo estar livre e espontaneamente decidindo participar do Estudo.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, eu também estou certificando que toda a informação que eu prestei, incluindo minha história médica, é verdadeira e correta até onde é de meu conhecimento, e declaro estar recebendo uma cópia assinada deste documento.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, estou autorizando o acesso às minhas informações, conforme explicitado anteriormente.

Ao assinar este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, eu não renunciei qualquer direito legal que eu venha a ter ao participar deste Estudo.

Fortaleza, _____/_____/______

Nome do voluntário Data Assinatura

Nome da pessoa que está obtendo o termo de consentimento

Data Assinatura

Nome da Testemunha (se o voluntário não souber ler)

Data Assinatura

CONTROLE INTERNO Nº do Estudo: 30/08 Nº do Voluntário: _____

TELEFONES PARA CONTATO

UNIDADE DE FARMACOLOGIA CLÍNICA (85) 3366 8250 Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes (85) 3366 8346 Dr. Manoel Odorico de Moraes (85) 3366 8201 Dr. Fernando Antônio Frota Bezerra (85) 3366 8346 Dra Jonaina Costa de Oliveira (85) 3366 8346 Enfermeira Ismenia Osório Leite (85) 3366 8250 Enfermeira Gilmara Holanda da Cunha (85) 3366 8250 Farmacêutico Demétrius Fernandes do Nascimento (85) 3366 8250 Farmacêutica Andrea Vieira Pontes (85) 3366 8250

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