UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Terapia antiplaquet ária - Disserta ção. 2....
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS RENATA CAROLINE COSTA DE FREITAS AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE miRNAs EXOSSOMAIS NA TOXICIDADE HEPÁTICA INDUZIDA PELO CLOPIDOGREL EM CÉLULAS HepG2 NATAL-RN 2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
RENATA CAROLINE COSTA DE FREITAS
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE miRNAs EXOSSOMAIS NA TOXICIDADE
HEPÁTICA INDUZIDA PELO CLOPIDOGREL EM CÉLULAS HepG2
NATAL-RN
2017
2
RENATA CAROLINE COSTA DE FREITAS
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE miRNAs EXOSSOMAIS NA TOXICIDADE
HEPÁTICA INDUZIDA PELO CLOPIDOGREL EM CÉLULAS HepG2
Dissertação apresentada ao Programa de
Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito para obtenção do título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador:
Prof. Dr. André Ducati Luchessi
NATAL-RN
2017
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde
- CCS
Freitas, Renata Caroline Costa de.
Avaliação da expressão de miRNAs exossomais na toxicidade hepática
induzida pelo clopidogrel em células HepG2 / Renata Caroline Costa de Freitas. - Natal, 2017.
54f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientador: Prof. Dr. André Ducati Luchessi.
1. Terapia antiplaquetária - Dissertação. 2. In vitro -
Dissertação. 3. Biomarcadores - Dissertação. 4. Hepatotoxicidade -
Dissertação. I. Luchessi, André Ducati. II. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 615.011
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DEDICATÓRIA
A Deus, que em sua infinita bondade me deu a vida e uma família maravilhosa. Somente Nele
por muitas vezes encontrei forças para vencer os desafios dessa jornada.
À minha família, em especial aos meus pais (Carlos e Cristina), meus irmãos (Eduardo e
Leonardo) e meu lindo Raul e seus familiares, pelo amor incondicional, pela presença em
todos os momentos da minha vida, que mesmo em todos meus estresses, decepções e vitórias,
sempre se fizeram presentes e essenciais.
Amo vocês!!!
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. André Ducati Luchessi, que ao longo destes dois anos de convivência
tanto me ajudou, me orientando tanto no âmbito profissional quando pessoal, sempre abrindo
caminhos para a realização deste e de outros trabalhos. Ressaltando sua contribuição, integral
e de forma única, para me tornar uma grande e vitoriosa profissional. Agradeço infinitamente
ainda, a possibilidade que me proporcionou em poder realizar o doutorado em um grande
centro de pesquisa, junto ao seu orientador.
À Profa. Dra. Vivian Nogueira Silbiger por dar todo apoio e incentivo desde o
primeiro momento em que estive em sua presença. Agradeço ainda, assim como o Prof.
André, todos os ensinamentos repassados ao longo dessa minha trajetória.
Ao Prof. Dr. Augusto Ducati Luchessi, pela contribuição fundamental para a
realização deste trabalho, pela abertura de seu laboratório onde pude realizar um estágio
acadêmico e de todo o conhecimento transmitido durante minha estadia junto ao seu grupo de
pesquisa.
Ao Prof. Tit. Mario Hiroyuki Hirata e a Profa. Tit. Rosario Dominguez Crespo
Hirata, pelo financiamento disponibilizado, e assim a possibilidade de executar o presente
projeto. Além disso, agradeço todo o aprendizado repassado na forma de correções e
discussões do presente manuscrito, que me possibilitou dar um grande passo científico. Por
fim, agradeço a oportunidade de me receber em seu laboratório para a continuidade da minha
carreira acadêmica e assim realizar o doutorado.
As minhas duas grandes amigas Letícia Tamborlin e Letícia Meneguello, que fiz
durante minha estadia na UNICAMP-Limeira, São Paulo, que são amigas para todos os
momentos. Pois foram presentes nas dificuldades e nas alegrias. Devo muito desse sucesso a
vocês minhas amigas.
Aos meus amigos que me apoiam desde a graduação, em especial, Geovana,
Kimênia, Elaine, Luciana, Joaquim, Iago e Mariana.
À família LBBM, meus amigos e companheiros de pesquisa, Ananília, Marina,
Jeane, Diego, Mariana, Jessica Nayara, Jéssica Santos, Isabelle, Victor Hugo, Carolinne,
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Lara, Marília, Mychelle, Ana Paula, Ayda, Conceição, Giovana, Ronald, Thâmila,
Juliane, Beatriz.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela contribuição na
minha formação profissional.
À ao CNPq e a CAPES pelo apoio financeiro para a realização deste estudo,
incluindo minha bolsa integral de estudo.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo de ação do Clopidogrel. Fonte: Adaptado de Angiolillo et al. p. 1507,
2007 (ANGIOLILLO et al., 2007). .......................................................................................... 17
Figura 2. Biogênese e atividade dos miRNAs. Fonte: Adaptado de Luo et al., p. 82, 2015
(LUO; YANG; NATTEL, 2015) .............................................................................................. 20
Figura 3. Transferência funcional de microRNA por exossomos. Fonte: Adaptado de
Stoorvogel, p. 647, 2012 (STOORVOGEL, 2012). ................................................................. 22
Figura 4. Rede regulatória entre miRNAs e mRNAs alvo envolvidos na terapia
antiplaquetária. Esta rede representa a relação entre miRNAs de GSE59488 e os mRNAs de
GSE59488. A cor verde indica os genes com alta expressão e a cor vermelha os genes pouco
expressos. .................................................................................................................................. 30
Figura 5. Fragmentação do DNA e ciclo celular de células HepG2 expostas ao clopidogrel
(6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM) por 24 h e 48 h comparado com o veículo (controle). Azul –
Fase G0/G1; Vermelho – Fase S; Verde – Fase G2 e M .......................................................... 33
Figura 6. Porcentagem de fragmentação do DNA de células HepG2 expostas ao clopidogrel
(6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM) por 24h e 48 h comparado com o controle. Dados são mostrados
como média ± SEM de três experimentos independentes e comparados pelo Kruskal-Wallis
ANOVA e a comparação em pares pelo teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0
µM ............................................................................................................................................ 34
Figura 7. Expressão de miRNAs exossomais (miR-26a-5p, miR-145-5p, miR-4701-3p, miR-
15b-5p) em sobrenadante de HepG2 após 24 e 48 horas expostas ao clopidogrel (0, 12,5, 25,
50, 100 µM). Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0
µM de clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo
teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM. .......................................................... 35
Figura 8. Expressão de mRNAs derivados de células HepG2 (EIF4G2, HMGA2, PLOD2,
STRADB, SENP5 e TLK1) depois de 24 horas de exposição ao clopidogrel (0, 12,5, 25, 50,
100 µM). Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0 µM
de clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo
teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM. .......................................................... 37
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Figura 9. Expressão de mRNAs derivados de células (EIF4G2, HMGA2, PLOD2, STRADB,
SENP5 e TLK1) depois de 48 horas de exposição ao clopidogrel (0, 12,5, 25, 50, 100 µM).
Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0 µM de
clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo teste
Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM. .................................................................. 38
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequência de iniciadores para expressão de mRNA pela RT-qPCR ....................... 28
Tabela 2. Interações entre miRNAs e mRNAs associados à toxicidade da terapia
antiplaquetária. ......................................................................................................................... 31
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LISTA DE ABREVIATURAS
°C – Graus Celsius
µg – Micrograma
µM – Micromolar
AAS - Ácido acetilsalicílico
ADP – Adenosina difosfato
Arfip1 - fator 1 de ribosilação do ADP
BaP - Benzo[a]pireno
BCL2 – regulador de apoptose
cDNA – DNA complementar
CsA - ciclosporina A
Ct – limiar do ciclo
CYP – Citocromo P450
CYP1A2 – Citocromo 1A2
CYP2B6 – Citocromo 2B6
CYP2C19 – Citocromo P450 2C19
CYP3A4 – Citocromo P450 3A4
DCV - Doenças cardiovasculares
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EIF4G2 - fator de iniciação da tradução eucariótica 4 gama 2
GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
h – horas
HepG2 - Linhagem humana derivada de carcinoma hepatocelular
HMGA2 – Grupo 2 de alça proteica de alta mobilidade
IPA - Ingenuity Pathways Analysis
IR - radiação ionizante
mg - miligrama
miRNA – microRNA
mL – mililitro
mRNA – RNA mensageiro
NCBI - Centro Nacional de Informações Biotecnológicas
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nm – nanômetro
NRQs - Quantidades Relativas Normalizadas
P2RY12 - Receptor purinérgico P2Y, acoplado a proteína G, 12
PBC - Células do sangue periférico
PI – Iodeto de Propídeo
PLOD2 - Pró-Colágeno-Lisina 2-Oxoglutarato 5-Dioxigenase
pre-miRNA – miRNA precursor
pri-miRNA – miRNA primário
RISC - Complexo de Silenciamento Induzido por RNA
RNA – Ácido ribonucleico
RPMI - Roswell Park Memorial Institute medium
RQs – Quantidades Relativas
SCA - Síndrome coronária aguda
SENP5 - Peptidase específica SUMO1 / sentrin 5
STRADB - Adaptador de quinase relacionado ao STE20 beta
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SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................... 12
ABSTRACT .................................................................................................................. 13
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 14
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .......................................................................... 16
2.1. Trombose Arterial e Tratamento ........................................................................... 16
2.2. MicroRNA: biogênese e funções .......................................................................... 18
2.3. miRNA exossomais como biomarcadores ............................................................ 20
3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 24
3.1. Objetivo Geral ....................................................................................................... 24
3.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 24
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 25
4.1. Seleção dos miRNAs através da análise de banco de dados ................................. 25
4.2. Condições de cultivo e tratamento ........................................................................ 26
4.3. Análise do DNA fragmentado ............................................................................... 26
4.4. Extração do RNA total e RT-qPCR de miRNAs .................................................. 27
4.5. Extração de RNA e RT-qPCR de mRNAs ............................................................ 28
4.6. Análises estatísticas ............................................................................................... 29
5. RESULTADOS ........................................................................................................ 30
5.1. miRNAs regulatórios e mRNAs alvos selecionados através de analises in silico 30
5.2. Fragmentação do DNA ......................................................................................... 32
5.3. Expressão de miRNAs em exossomos circulantes em sobrenadante de HepG2 .. 34
5.4. Expressão de mRNA em células HepG2 .............................................................. 36
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 39
7. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 44
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 45
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RESUMO
O clopidogrel é um fármaco utilizado na terapia para prevenção de trombose e aterosclerose.
Contudo, a hepatotoxicidade induzida por clopidogrel é um potencial efeito adverso
relacionado com lesões hepáticas e resposta antiplaquetária. Considerando a falta de
diagnóstico precoce para esse efeito adverso, miRNAs derivados de exossomos podem ser
úteis para contribuir para o monitoramento da resposta antiplaquetária e na predição do risco
de hepatotoxicidade. Portanto, primeiramente objetivamos investigar as interações miRNA-
mRNA com a toxicidade do fármaco in silico utilizando dados de microarrays disponíveis e
software Ingenuity Pathways Analysis 6 (IPA). Em seguida, o perfil de expressão exossomal
dos miR-26a-5p, miR-145-5p, miR-15b-5p e miR-4701-3p, bem como os mRNAs alvos
(PLOD2, SENP5, EIF4G2, HMGA2, STRADB e TLK1) derivados de células foram avaliadas
in vitro, uma vez que estes foram os alvos moleculares principalmente associados ao efeito
adverso. Assim, células HepG2 foram incubadas com clopidogrel a 6,25, 12,5, 25, 50 e 100
μM durante 24 e 48 h. A citotoxicidade foi avaliada por citometria de fluxo pela análise da
fragmentação do DNA e do ciclo celular. A expressão de miRNA derivados de exossomos e
de mRNA derivados de células foi avaliado pela RT-qPCR. As células tratadas com
concentrações mais elevadas de 50 e 100 μM causaram maior fragmentação do DNA após 24
e 48 h sugerindo ser uma concentração tóxica. A expressão do miR-26a-5p foi elevada e a
expressão do miR-15b-5p foi diminuída na concentração tóxica 100 μM em relação ao
controle em 24 e 48 h. HMGA2, EIF4G2, STRADB e SENP5 alvos do miR-26a-5p foram
pouco expressos nas concentrações tóxicas em 24 h e o HMGA2 se manteve pouco expresso
depois de 48 h de tratamento, em relação ao controle. TLK1, alvo do miR-15b-5p, teve
expressão diminuída em 24 h na concentração tóxica. Os resultados sugerem que
concentrações tóxicas de clopidogrel podem modular a expressão de miR-26a-5p e miR-15b-
5p e seus alvos de mRNA. Além disso, o miR-26a pode representar um marcador importante
para prever a hepatotoxicidade induzida por clopidogrel
Palavras chaves: Terapia antiplaquetária, in vitro, Biomarcadores, Hepatotoxicidade
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ABSTRACT
Clopidogrel is an essential therapy for prevention of thrombosis and atherosclerosis.
However, clopidogrel-induced hepatotoxicity is a potential adverse effect related to liver
damage and antiplatelet response. Considering the lack of diagnostic for this adverse effect,
new exosomes-derived miRNAs may be useful for improve the monitoring of response and
hepatotoxicity risk. Therefore, we first aimed to investigate the miRNA-mRNA interactions
with drug toxicity by in silico using available microarray data and Ingenuity Pathways
Analysis 6 (IPA) software. After, the exosomal-expression profile of miR-26a-5p, miR-145-
5p, miR-15b-5p and miR-4701-3p, as well as the cell-derived mRNAs target PLOD2, SENP5,
EIF4G2, HMGA2, STRADB and TLK1 were evaluated in vitro, once they were the molecular
targets mainly associated with the adverse effect. Thus, HepG2 cells were incubated with
clopidogrel at 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM for 24 and 48 h. The cytotoxicity was evaluated
by flow cytometry to analyze DNA fragmentation and cell cycle. Profile expression of
exosomes-derived miRNAs obtained by column methods and cell-derived mRNAs was
evaluated by RT-qPCR. Cells treated with higher concentrations of 50 and 100 µM caused an
increased DNA fragmentation after 24 and 48 h suggesting a toxic concentration for the cells.
The miR-26a-5p upregulation in toxic concentration of 100 μM of clopidogrel and a
downregulation of miR-15b-5p in comparison to control were observed in both period of 24
and 48 h. HMGA2, EIF4G2, STRADB and SNP5 targets of miR-26a-5p were downregulated
in toxic concentrations at 24 h and HMGA2 remains downregulated after 48 h of clopidogrel
treatment. TLK1, a target of miR-15b-5p, was downregulated at 24 h in toxic concentration.
The results are suggestive that toxic concentrations of clopidogrel may modulate the miR-
26a-5p and miR-15b-5p expression and their mRNA targets. Moreover, miR-26a may
represent an important marker to predict clopidogrel-induced hepatotoxicity.
Keyword: Antiplatelet therapy, in vitro, Biomarkers, Hepatotoxicity
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1. INTRODUÇÃO
Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica complexa caracterizada por lesões
arteriais, formação de placas ateroscleróticas e alterações dos fenótipos das células vasculares
(BADIMON; VILAHUR, 2014; WILDGRUBER; SWIRSKI; ZERNECKE, 2013). A
arteriosclerose é ainda prevista como a principal causa de morte em todo o mundo para o ano
de 2020 (MURRAY; LOPEZ, 1997). Portanto, a terapia antiagregante plaquetária tem
emergido como essencial para prevenção de sua progressão, bem como no tratamento das
complicações tromboembólicas (FINTEL, 2012).
Dentre os antiagregante plaquetários, destaca-se o clopidogrel, um pró-farmaco
ativado hepaticamente por diversas enzimas do citocromo P450 (CYP), e apresenta
farmacodinâmica associada a inibição irreversível do receptor P2RY12 (Receptor purinérgico
P2Y, acoplado a proteína G, 12), impedindo assim a formação do trombo (FITZGERALD;
FITZGERALD, 2013; SANGKUHL; KLEIN; ALTMAN, 2010; YANG et al., 2015). No
entanto, apesar da sua eficácia farmacológica, tem sido observada uma grande variabilidade
na sua resposta, levando ao desenvolvimento de eventos trombóticos recorrentes e eventos
adversos, que representam problemas clínicos importantes na medicina cardiovascular
(LEWIS; VOORA; BEITELSHEES, 2015; YANG et al., 2015).
O uso do clopidogrel também está associado a efeitos adversos comuns, incluindo
distúrbios gastrointestinais, hemorragias, púrpura trombocitopênica trombótica, neutropenia e
anemia aplástica (KAPILA et al., 2015; OCHOA-CORTES et al., 2014). A hepatotoxicidade
é um efeito raro, porém potencialmente grave, relacionado com estes fármacos, que pode
levar a hepatite fulminante se o fármaco não for interrompido (GOYAL; SRIVASTAVA;
LESSNAU, 2009; MONTEIRO et al., 2011; ZAHNO et al., 2013). Porém, os mecanismos
associados a este potencial efeito adverso não são completamente elucidados. Estudo recente
mostrou que a incubação de clopidogrel com a isoforma CYP3A4 está associada à formação
de metabólitos tóxicos para os precursores de granulócitos (MASENENI et al., 2012). Além
disso, pacientes com aumento da produção de tais metabolitos e/ou sistemas de defesa
diminuídos podem, por conseguinte, apresentar riscos aumentados de toxicidade hepática
associada ao clopidogrel (ZAHNO et al., 2013).
Nesse contexto, os avanços nas análises moleculares, particularmente aqueles
associados a análise da expressão gênica, podem ser úteis para avaliar mudanças que, podem
estar ligadas a disfunção orgânica (apoptose) ou toxicidade (dano ao DNA). As alterações na
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expressão gênica podem ainda explicar a resposta às drogas e os mecanismos subjacentes
associados aos efeitos colaterais do fígado (VICKERS; ULYANOV; FISHER, 2017).
A expressão de microRNAs (miRNAs) tem sido proposta como ferramenta a ser
utilizada como novos biomarcadores da hepatotoxicidade induzida por clopidogrel
(FONTANA, 2014; NELSON HAYES; CHAYAMA, 2016; WEILER; MERZ; KULLAK-
UBLICK, 2015). Os miRNAs são RNAs curtos, não codificantes, constituídos de 18-25
nucleotídeos, que são complementares aos RNA mensageiros (mRNA), e a ligação dos
miRNAs suprimem a tradução destes mRNAs alvos ou promove a degradação destes,
desempenhando assim um papel crucial na regulação pós-transcricional da expressão gênica,
como por exemplo o silenciamento gênico (NELSON HAYES; CHAYAMA, 2016;
STROYNOWSKA-CZERWINSKA; FISZER; KRZYZOSIAK, 2014).
Os miRNAs têm sido identificados em exossomos, que são pequenas vesículas de 40-
100 nm, liberadas de diversos tipos celulares para o espaço extracelular, onde são envolvidos
na comunicação célula-célula (HUANG et al., 2013; ZHANG et al., 2015). Além disso, tem
sido sugerido que os exossomos desempenham um papel importante na liberação precoce de
miRNAs durante lesões hepáticas induzidas por fármacos (BALA et al., 2012; MCGILL;
JAESCHKE, 2015).
Nesse contexto, recentemente nosso grupo de pesquisa sugeriu através de um estudo in
silico que alguns miRNAs (miR-26a-5p, miR-145-5p, miR-15b-5p, miR-4701-3p e miR-107)
e seus mRNA alvos são alterados em resposta ao clopidogrel e nos efeitos adversos, incluindo
hepatotoxicidade (FREITAS et al., 2016).
Portanto, devido à importância da terapia com clopidogrel como antiagregante
plaquetário e à necessidade de identificar seus efeitos adversos, particularmente a
hepatotoxicidade, objetivamos avaliar a expressão dos miRNAs exossomais em cultura de
células HepG2 incubadas com altas doses de clopidogrel, simulando assim hepatotoxicidade.
16
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Trombose Arterial e Tratamento
A trombose arterial manifestada nas doenças cardiovasculares (DCV) representa uma
das principais causas de morte em todo o mundo. De acordo com a Organização Mundial,
cerca de 17,5 milhões de pessoas morreram por comprometimentos cardiovasculares no ano
de 2012, representando uma média de 46% de todas as mortes por doenças não transmissíveis.
Estima-se que a mortalidade anual aumente para 22,2 milhões em 2030 (WHO, 2014). Dados
para o Brasil, estimam que as doenças circulatórias representem aproximadamente 30% de
todas as mortes do país (MS/SVS/DASIS, 2012).
As plaquetas desempenham um papel essencial na formação do trombo, na
homeostase, na inflamação e em particular na lesão aterosclerótica (BADIMON; VILAHUR,
2014; FRANCO; CORKEN; WARE, 2015; PANICCIA et al., 2015). Após a ruptura da placa
aterosclerótica, a matriz subendotelial é exposta seguida pela ativação e agregação plaquetária
que conduzem a formação do trombo e oclusão vascular (CAMICI et al., 2012; CHEN et al.,
2016; OTSUKA et al., 2016; WILDGRUBER; SWIRSKI; ZERNECKE, 2013). Portanto, os
fármacos antiplaquetários tornaram-se essenciais para a prevenção e tratamento da doença
aterotrombótica (FINTEL, 2012; FREYNHOFER et al., 2015).
A utilização de diversos fármacos que inibam a agregação plaquetária através de ação
em diferentes vias da cascata de ativação plaquetária tem sido usada na prevenção e no
tratamento de complicações tromboembólicas, bem como inibição da progressão da
aterosclerose (CAMICI et al., 2012; CANNON et al., 2004; LOPES, 2011). Dentre os quais,
destaca-se o clopidogrel, que é um pró-fármaco administrado via oral, que necessita ser
metabolizado através de CYPs, principalmente CYP2C19. Aproximadamente 85% do pró-
fármaco é hidrolisado por esterases no sangue para um derivado de ácido carboxílico inativo,
e apenas 15% é metabolizado pelo CYP450 no fígado para gerar um metabolito ativo. O
metabólito ativo atua de forma irreversível, inibindo o receptor de ADP (adenosina di-fostato)
chamado de P2RY12 (Purinergic Receptor P2Y, G-Protein Coupled, 12), impedindo assim a
formação do trombo, pois impede a agregação plaquetária (Figura 1) (ANGIOLILLO et al.,
2007; SANGKUHL; KLEIN; ALTMAN, 2010; SIASOS et al., 2015; TRENK;
HOCHHOLZER, 2014).
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Figura 1. Mecanismo de ação do Clopidogrel. Fonte: Adaptado de Angiolillo et al. p. 1507,
2007 (ANGIOLILLO et al., 2007).
Apesar da sua eficácia farmacológica comprovada, o clopidogrel não está
completamente livre de efeitos secundários, sendo a toxicidade um problema clínico
importante na medicina cardiovascular (HOSHINO et al., 2009; LEWIS; VOORA;
BEITELSHEES, 2015; TOPÇUOGLU; ARSAVA; AY, 2011). Nos últimos 10 anos, esforços
significativos para compreender os fatores clínicos que afetam a variabilidade na resposta aos
fármacos, produzindo uma resposta alterada com consequente aumento na taxa de efeitos
adversos (LEWIS; VOORA; BEITELSHEES, 2015).
O clopidogrel está associado a efeitos adversos comuns que incluem erupção cutânea,
distúrbios gastrointestinais, hemorragia, neutropenia, anemias (KAPILA et al., 2015), além
disso, a hepatotoxicidade tem sido relatada como um secundário, porém potente efeito
adverso relacionado com o uso do clopidogrel, podendo levar a morte do paciente se a terapia
não for descontinuada (GOYAL; SRIVASTAVA; LESSNAU, 2009; ZAHNO et al., 2013).
Os mecanismos de indução da hepatotoxicidade pelo clopidogrel ainda não são
totalmente elucidados. Poucos relatos tem sido associada seu surgimento à biotransformação
hepática por CYPs, como em estudo prévio utilizando células HepG2 co-incubadas com
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CYP2B6 e CYP2C19 e em cultura primária de hepatócitos de ratos mostrou que o clopidogrel
causou hepatotoxicidade significativa em elevadas concentrações de 100 µM e 300 µM,
sugerindo que o clopidogrel é hepatotóxico após biotransformação pelas enzimas CYP2B6 e
CYP2C19 (ZHAI et al., 2015). Outro estudo mostrou que a incubação do clopidogrel com
CYP3A4 está associada com a formação de metabólitos que são tóxicos para precursores de
granulócitos (MASENENI et al., 2012).
Portanto, considerando a falta de mecanismo elucidativos e consequentemente um
diagnóstico precoce ineficaz do efeito adverso, avanços associados a ferramentas moleculares
representa uma condição emergente na terapia deste antiagregante plaquetário.
2.2. MicroRNA: biogênese e funções
Os microRNAs (miRNAs) são moléculas de pequenos RNAs não codificante, os quais
são compostas por cerca de 22 nucleotídeos, que foram descobertos pela primeira vez em
Caenorhabditis elegans no início da década de 1990 (LEE; FEINBAUM; AMBROS, 1993).
Os miRNAs desempenham importante papel em reprimir a expressão do gene alvo a nível
pós-transcricional (VAN ROOIJ; PURCELL; LEVIN, 2012).
A transcrição de miRNAs das suas sequências genômicas é controlada pelo complexo
de RNA polimerase II e por fatores de transcrição presentes no núcleo (Figura 2) (LUO;
YANG; NATTEL, 2015). Os nucleotídeos dos transcritos primários dos miRNAs (pri-
miRNAs) formam estruturas secundárias como as regiões “stem”, em que dois segmentos de
RNA com bases complementares são pareados, e as regiões “loop”, nas quais os pares de
bases não são complementares, constituindo, assim, alças circulares (stem-loop). Três tipos de
miRNAs podem ser identificados de acordo com a localização genômica das suas sequências
primárias de codificação: miRNAs intergênicos, miRNAs intrônicos e miRNAs exônicos. Os
miRNAs intergênicos tem seus próprios promotores para a transcrição direta das suas
sequências de pri-miRNA, a transcrição de miRNAs intrônicos e exônicos é regulada pelos
promotores dos seus genes hospedeiros (BEREZIKOV, 2011; LUO; YANG; NATTEL,
2015).
No núcleo, os pri-miRNAs são processados por clivagem endonucleolítica gerando
estruturas designadas como miRNA precursores (pre-miRNA). O processamento dos pre-
miRNAs para sequências de miRNAs intergênica é mediado pela ribonuclease 3 (um
complexo protéico RNase tipo III, conhecido como Drosha), enquanto que o processamento
19
de miRNAs intrônicos e exônicos geralmente requer a modulação adicional por splicing. Um
subtipo de miRNAs intrônicos, chamado 'mirtron', produz seus pre-miRNAs de uma maneira
independente de Drosha usando apenas o splicing (BEREZIKOV, 2011). O pre-miRNA
gerado é exportado para o citoplasma por meio da proteína transportadora exportina-5
(BRONZE-DA-ROCHA, 2014; DANGWAL; THUM, 2012; LUO; YANG; NATTEL, 2015).
No citoplasma, os pré-miRNAs são processados pelo complexo enzimático Dicer
(RNase tipo III), que remove a alça na estrutura stem-loop, resultando na formação de um
duplex de miRNA. Este dúplex de miRNA é incorporado ao Complexo de Silenciamento
Induzido por RNA (RISC), no qual as duas fitas de miRNA são separadas. Uma destas fitas
permanece associada ao RISC e constitui o miRNA maduro, ao passo que a fita complementar
pode sofrer degradação (BRONZE-DA-ROCHA, 2014; DANGWAL; THUM, 2012; LUO;
YANG; NATTEL, 2015).
Os miRNAs maduros atuam regulando os vários processos celulares, como apoptose,
proliferação e diferenciação, estando ainda associados ao acometimento de diversas doenças,
pois regulam negativamente a expressão gênica por ligar-se nas sequências complementares
do RNAs mensageiros (mRNA), induzindo a desestabilização ou degradação do mRNA,
bloqueando a etapa de tradução (Figura 2) (LIU; LI; CAIRNS, 2014; LUO; YANG;
NATTEL, 2015; VAN MIL; DOEVENDANS; SLUIJTER, 2009).
A especificidade do miRNA está ligada principalmente a uma pequena sequência de
nucleotídeos, de aproximadamente 8 pares de base, chamada de seed sequence. Como essa
região apresenta um pequeno número de pares de base, um miRNA poderia se ligar em um
grande número de mRNAs, regulando a expressão de um grande número de genes (LEE et al.,
2016; LIM et al., 2005).
Um dos principais mecanismos dos miRNAs é através do transporte célula a células
pelos exossomos, os quais atuam como “mensageiros intercelulares”, transferindo informação
e sinais entre células (ZHANG et al., 2015). Assim, um melhor entendimento da função deste
miRNAs, particularmente os exossomais, no desenvolvimento de patologias ou alterações
morfofisiológicas, como aquelas observadas no fígado mediante o tratamento com clopidogrel
podem representar uma estratégia promissora na busca de uma terapia eficaz e segura.
20
Figura 2. Biogênese e atividade dos miRNAs. Fonte: Adaptado de Luo et al., p. 82, 2015
(LUO; YANG; NATTEL, 2015)
2.3. miRNA exossomais como biomarcadores
A comunicação intercelular mediada por exossomos, tem sido reportada como uma
potencial via de comunicação entre as células (YU; ODENTHAL; FRIES, 2016). A
descoberta dos exossomos representou um novo mecanismo de regulação da expressão
21
gênica. Estes achados foram primeiramente demonstrados através da adição de exossomos de
mastócitos murinos a cultura contendo mastócitos humanos. Após incubação, foi observada a
presença de proteínas murinas em células humanas (VALADI et al., 2007).
Exossomos são vesículas membranosas que possuem em torno de 40 a 100 nm de
diâmetro de origem endocítica, liberadas por uma variedade de células para o espaço
extracelular (HUANG et al., 2013), sendo encontrado também em diferentes fluidos corporais
como, plasma sanguíneo, urina, saliva, leite materno, lavado bronquial, fluido cerebral, fluido
amniótico (CLARK et al., 2012). Nos últimos anos, os exossomas emergiram como moléculas
importantes para a comunicação intercelular envolvidas em condições normais e
fisiopatológicas, como a resposta imune (ADMYRE et al., 2007), a função neuronal (JANAS
et al., 2016), no desenvolvimento e progressão de doenças como a doença hepática
(MASYUK; MASYUK; LARUSSO, 2013), doenças neurodegenerativas (HOWITT; HILL,
2016) e câncer (BEACH et al., 2014; SOUNG et al., 2017).
Os exossomos podem ser liberados por diversas células, incluindo os hepatócitos e
podem ser transferidos para outras células receptoras para regular os perfis de expressão
nestas células, sugerindo que os exossomos desempenham um papel importante na
comunicação entre células hepáticas (LOOSEN et al., 2017). Os exossomos tem sido
demonstrado por transportar diferentes ácidos nucleicos, incluindo miRNAs, que regulam
significativamente o crescimento celular e o metabolismo pela inibição pós-transcricional da
expressão gênica (YU; ODENTHAL; FRIES, 2016).
Os miRNAs são incorporados seletivamente em corpos multivesiculares, que se fundem
com a membrana plasmática, secretando assim as suas vesículas para o meio extracelular.
Assim, os exossomos podem ligar-se à membrana plasmática de uma célula alvo ou podem
ser endocitados e depois fundidos com a membrana que irá delimitar um compartimento
endocítico. Ambas as vias resultam no influxo do miRNA exossomal ao citoplasma da célula
alvo onde irá associar-se e silenciar um mRNA alvo, regulando a sua expressão gênica
(Figura 3) (STOORVOGEL, 2012). Os miRNAs envolvidos nestas vesículas estão bem
protegidos contra a degradação, realçando assim, o potencial papel dos miRNAs exossomais
como biomarcadores (SATO et al., 2016).
22
Figura 3. Transferência funcional de microRNA por exossomos. Fonte: Adaptado de
Stoorvogel, p. 647, 2012 (STOORVOGEL, 2012).
Os miRNAs exossomais tem sido associados a promoção do silenciamento gênico
similar aos miRNAs celulares e ainda intensificam evidências de que o envelopamento do
miRNA exossomal ocorre de forma não randômica, baseado na expressão diferencial do
miRNA exossomal comparado ao de células doadoras (VALADI et al., 2007).
23
Além disso, a associação de miRNAs com exossomos tem sido descrita como
característica para identificar lesões que causam dano hepático, pois os exossomos podem
desempenhar um papel importante na liberação precoce de miRNAs durante a lesão hepática
induzidas por fármacos (BALA et al., 2012; MCGILL; JAESCHKE, 2015). Recentemente, o
miRNA-122 que é abundante em hepatócitos e os miR-155, -146a e -125b, que regulam a
inflamação em células imunes, foram testados em modelos animal de doença hepática
alcoólica, de lesão hepática induzida por drogas (acetaminofeno), e de lesão hepática mediada
por receptores Toll-like (BALA et al., 2012). Os resultados indicaram que o miR-122 sérico
foi diretamente correlacionado com o aumento da ALT nos modelos estudados. O miR-155
teve sua expressão aumentada no soro nos modelos de lesões hepáticas alcoólicas e
inflamatórias, sugerindo que miRNAs circulantes podem servir como biomarcadores para
diferenciar os tipos possíveis de lesão hepática e fornecer mais especificidade para os
mecanismos da fisiopatologia.
Recente revisão também relatou as possíveis funções dos miRNAs nos mecanismos
fisiopatológicos da toxicidade induzida por drogas, bem como identificou perfis circulantes de
miRNA como promissores para a detecção e diagnóstico desta condição em situações clínicas.
Foi mostrado ainda que os possíveis mecanismos, através dos quais as espécies de miRNA
contribuem para hepatotoxicidade induzida por drogas, são emergentes e novos
biomarcadores baseados em miRNA têm potencial de contribuir para a melhora do
diagnóstico e prevenção da lesão hepática (MCGILL; JAESCHKE, 2015). Nesse contexto, a
detecção de miRNAs presente nos exossomos podem representar potenciais biomarcadores de
hepatotoxicidade associada com o clopidogrel.
Portanto, a análise da expressão de miRNAs exossomais e seus mRNAs alvos poderá
representar uma abordagem promissora, como ferramenta de análise de efeitos adversos em
órgãos alvos e não alvos, como a hepatotoxicidade relacionada a terapia com clopidogrel.
24
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a expressão dos miRNAs exossomais na hepatotoxicidade induzida pelo
clopidogrel obtidos de sobrenadante de células HepG2 tratadas com o antiagregante
plaquetário.
3.2. Objetivos específicos
Identificar, através de estudo in silico em banco dados de estudos de “chip” de DNA
disponíveis em bases de dados públicas, potenciais miRNAs e seus mRNAs alvos envolvidos
com a resposta antiagregante e com os efeitos adversos do clopidogrel
Avaliar o perfil de toxicidade do clopidogrel através da análise da fragmentação do
DNA por citometria de fluxo.
Avaliar a expressão dos miRNAs identificados in silico, em exossomos obtidos do
sobrenadante de cultura de célula HepG2 tratadas com clopidogrel;
Avaliar a expressão dos mRNAs alvos dos miRNAs exossomais diferentemente
expressos em célula HepG2 tratadas com clopidogrel, em diferentes concentrações.
Associar o perfil de expressão dos miRNAs e seus mRNA alvos com a citotoxicidade in
vitro induzida pelo clopidogrel.
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Seleção dos miRNAs através da análise de banco de dados
Os dados do perfil de expressão dos acessos GSE59488 e GSE32226 foram obtidos a
partir do NCBI (National Center for Biotechnology Information), através de Gene Expression
Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GSE59488 avaliou a expressão global de
miRNAs em plaquetas de pacientes com síndrome coronária aguda (SCA), com alta
reatividade plaquetária e baixa reatividade plaquetária. A expressão dos miRNAs foram
analisadas pelo sistema de microarranjos utilizando a plataforma Agilent GPL18402-046064
Unrestricted_Human_miRNA_V19.0_Microarray (miRNA versão ID).
GSE32226 representa um conjunto de dados de análises de expressão global de
mRNAs em células do sangue periférico (PBC) de pacientes com doença coronariana aguda
mediante a uma resposta diferencial a drogas antiplaquetárias e foi analisado usando a
plataforma Affymetrix Exon Human 1.0 ST Array. Os pacientes com doença coronária aguda
foram tratados continuamente com ácido acetilsalicílico (AAS) (100 mg/dia) e o clopidogrel
(75 mg/dia). Os dados também foram previamente publicados, na forma de artigo cientifico,
por nosso grupo de pesquisa a revista Clinica Chimica Acta (LUCHESSI et al., 2013).
Os perfis de expressão dos miRNAs de plaquetas (GSE59488) e expressão global dos
mRNAs em PBC (GSE32226) foram analisados utilizando a ferramenta de bioinformática
GEO2R (disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) e foram selecionados
aqueles com expressão diferencial superior à mudança de Log2-fold change (LogFC) e valor
de p < 0,05.
Os alvos de mRNAs dos miRNAs diferencialmente expressos em plaquetas foram
selecionados por análise in silico utilizando os bancos de dados: microRNA
(http://microrna.org), miRBase (http://www.mirbase.org), miRDB (http://mirdb.org/miRDB/),
Target Scan Human (http://www.targetscan.org/) e miRTarBase
(mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw). Foram selecionados mRNAs (n = 75), com alta pontuação para
as interações fortes miRNA-mRNA (Score ≤ 1,0).
As interações entre os miRNAs e mRNAs alvo foram analisados usando o software
Ingenuity Pathways Analysis v.6 (IPA, Ingenuity® Systems, Ca., Redwood City, EUA), o que
gerou uma rede de regulação miRNA e as metas de mRNA relacionados. Os mRNAs
diferencialmente expressos em PBC (20 mRNA) e os mRNAs alvo previsto por bases de
26
dados de miRNA (75 mRNAs) foram rastreados para identificar os alvos de 20 miRNAs
utilizando IPA. Nós ainda realizada uma interação IPA entre mRNAs expressos
diferencialmente em PBC e os miRNAs regulamentares em plaquetas. Interações miRNA-
RNA significativa foram considerados quando LogFC (FC> 2,0), pontuação mirSVR ≤ 1,0 e
p <0,05. A metodologia detalha esta apresentada no artigo previamente publicado e anexado
no item ANEXO 2 deste documento
4.2. Condições de cultivo e tratamento
A linhagem humana derivada de carcinoma hepatocelular (HepG2) foi obtida do
Banco de células do Rio de Janeiro, e mantida em meio Roswell Park Memorial Institute
medium (RPMI) (pH7,4) com 5% de soro fetal bovino livre de exossomos, a 37º C, em estufa
umidificada com atmosfera de 5% de gás carbônico. O meio de cultivo foi suplementado com
L-glutamina 2 mmoles/L, bicarbonato de sódio 44 mmoles/L, estreptomicina 10.000 UI/mL e
penicilina 10.000 UI/mL. O meio foi trocado duas vezes por semana e as células foram
tripsinizadas (solução de tripsina 0,2%) e subcultivadas uma a duas vezes por semana. Células
HepG2 foram cultivadas na ausência (controle DMSO) e na presença de concentrações
variáveis (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM) de clopidogrel.
4.3. Análise do DNA fragmentado
A quantificação de DNA fragmentado foi realizada em citometria de fluxo
(NICOLETTI et al., 1991). As células foram mantidas por 24h e 48h em tratamento com
clopidogrel usando as concentrações de 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM. Brevemente 1,5 x 105
células foram ressuspendidas em 0,2 mL de tampão de lise (0,1% de citrato de sódio e 0,1%
de Triton X-100) contendo 50 µg/mL de iodeto de propídio (PI). As células lisadas foram
incubadas, no escuro durante 1 h a 4°C, e utilizadas para a análise de fragmentação do DNA.
As células foram avaliadas em citômetro de fluxo BD Accuri™ C6 Plus (BD Biosciences)
utilizando o software fornecido pelo fabricante. Para cada teste foram avaliados dez mil
eventos. A citotoxicidade foi avaliada em triplicata.
27
4.4. Extração do RNA total e RT-qPCR de miRNAs
Para a extração do RNA total, incluindo os miRNAs, dos exossomos do sobrenadante
das culturas de HepG2 tratadas com clopidogrel nas concentrações de 0 (veiculo), 12,5, 25, 50
e 100 µM foi utilizado o protocolo do conjunto de reagentes do exoRNeasy Serum/Plasma
Maxi kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha), seguindo as recomendações do protocolo pré-
estabelecido para extração em cultura celular e com adição do controle externo de
oligonucletideos C. elegans miR-39 Spike-in control (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A
quantificação e pureza foram analisadas por espectrofotometria utilizando Nanodrop ND-
1000 (NanoDrop Technologies). Os miRNAs extraídos foram armazenados a -80°C até a
realização das próximas etapas.
A síntese do cDNA obtida a partir dos miRNAs extraídos foi realizada utilizando-se o
miScript II RT Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha), de acordo com a metodologia descrita pelo
fabricante, em termociclador Veriti™ 96-Well (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Os
cDNAs sintetizados foram armazenados a -20°C até a realização da PCR em tempo real.
Para a realização dos estudos da PCR em tempo real foram utilizados os ensaios pré-
validados miScript® Primer Assays (QIAGEN, Hilden, Alemanha) dos seguintes miRNAs:
Hs_miR-26a_2 (MIMAT0000082), Hs_miR-107_2 (MIMAT0000104), Hs_miR-145_1
(MIMAT0000437), Hs_miR-15b_2 (MIMAT0000417), Hs_miR-4701-3p_1
(MIMAT0019799). A amplificação foi realizada no sistema automatizado ABI 7500 Fast
(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Para a normalização das diferenças dos níveis de
expressão destes miRNAs, foi calculado a Quantidades Relativas Normalizadas (NRQs)
obtidas por escalonamento dos valores de expressão Ce_miR-39_1 miScript Primer Assay
(QIAGEN, Hilden, Alemanha) e a média geométrica da Quantidades Relativas (RQs) de
todos miRNAs analisados por amostras, conforme descrito anteriormente (MARABITA et al.,
2016). Os resultados estão apresentados como fold-change em relação aos valores médios do
grupo controle (veículo, 0 µM de clopidogrel).
28
Tabela 1. Sequência de iniciadores para expressão de mRNA pela RT-qPCR
4.5. Extração de RNA e RT-qPCR de mRNAs
A extração de RNA total de células HepG2 com 80-90% de confluência foi realizada
usando reagente Trizol (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A
quantificação e a pureza foram realizadas pelo espectrofotômetro usando Nanodrop ND-1000
(NanoDrop Technologies). O cDNA foi sintetizado com 2 μg de RNA total usando o
SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, EUA), de acordo com o
protocolo do fabricante e no termociclador Veriti™ 96-Well (Applied Biosystems, Carlsbad,
CA, EUA). RT-qPCR foi realizada usando QuantiTect SYBR Green PCR Kit (QIAGEN,
Hilden, Germany, Cat. Number: 204145), conforme recomendações do fabricante. RT-qPCR
Gene Sequência
PLOD2 Sense: 5´ GGCAAAGCCAGAGCTAAGAAT 3´
Anti-sense: 5´ CAGCCATTATCCTGTGTCCAT 3´
SENP5 Sense: 5´ ATGGCAGTTTGGTTCCACTC 3´
Anti-sense: 5´ CGTCCATATCCAGCATGTGT 3´
EIF4G2 Sense: 5´ CCACAAGTGACAACTTCATGC 3´
Anti-sense: 5´ TCTGAAATGCTCACCAGCTCT 3´
HMGA2 Sense: 5´ ACTTCAGCCCAGGGACAAC 3´
Anti-sense: 5´ GGTCTCTTAGGAGAGGGCTCA 3´
STRADB Sense: 5´ ACTCCCACAGGAACACTGGT 3´
Anti-sense: 5´ CAGCTGCCAACAGTGAAAAC 3´
TLK1 Sense: 5´ AAGAGGCATACCTCCTGCAA 3´
Anti-sense: 5´ AATGCAGTAGGAGAAGGGCTA 3´
GAPDH Sense: 5´ GCTGAGTACGTCGTGGAGTC 3´
Anti-sense: 5´ CTGATGATCTTGAGGCTGTTG 3´
29
foi realizada no equipamento 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). A
expressão relativa foi calculada usando o método 2−ΔΔCt
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), e os
resultados estão apresentados como fold-change em relação aos valores médios do grupo
controle (veículo, 0 µM de clopidogrel), normalizado com GAPDH que não apresentou
variações significativas de Ct entre os grupos tratados com clopidogrel e grupo controle.
4.6. Análises estatísticas
Foi desconsiderado os testes de avaliação da normalidade da distribuição das variáveis
contínuas, devido o reduzido número amostral, uma vez que o teste foi falho. Assim, as
variáveis foram analisadas pelos testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis ANOVA seguido
de comparação em pares pelo teste de Mann-Whitney. O programa utilizado nestas avaliações
foi o SPSS versão 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Para todas as análises estatísticas
realizadas, foram considerados estatisticamente significativos os resultados cujos níveis
descritivos (valores de p) forem inferiores a 0,05.
30
5. RESULTADOS
5.1. miRNAs regulatórios e mRNAs alvos selecionados através de analises in silico
A análise in silico entre os bancos de dados GSE59488 e GSE32226 indicaram cinco
miRNAs diferentemente expressos: hsa-miR-107 (miR-103-3p), hsa-miR-4701-3p (miR-
1262), hsa-miR-145-5p (miR-145-5p), hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p) e hsa-miR-26a-5p (miR-
26a-5p), os quais estão associados com a variabilidade na resposta do clopidogrel, bem como
com sua toxicidade renal e hepática. A rede de regulação, realizada com auxílio do software
IPA, envolvendo os miRNAs diferentemente expresso em GSE59488 e as mRNAs alvos do
banco de dados GSE32226 está representada na Figura 4.
Figura 4. Rede regulatória entre miRNAs e mRNAs alvo envolvidos na terapia
antiplaquetária. Esta rede representa a relação entre miRNAs de GSE59488 e os mRNAs de
GSE59488. A cor verde indica os genes com alta expressão e a cor vermelha os genes pouco
expressos.
31
A análise in silico realizada, ainda revelou que estes miRNAs e seus respectivos
mRNAs alvos estão associados tanto com a variabilidade na reatividade de plaquetas, quanto
com a resposta do clopidogrel. Interessantemente, ainda observamos que estes miRNAs estão
envolvidos com a toxicidade, principalmente a hepatotoxicidade, induzida por drogas,
incluindo o clopidogrel (Tabela 2).
Tabela 2. Interações entre miRNAs e mRNAs associados à toxicidade da terapia
antiplaquetária.
Categorias Moléculas p-valor
Fibrose hepática RPGRIP1L, GOLM1 5,78E-03-1,42E-02*
Aumento dos
níveis de LDH
CFD 9,5E-03*
Dano hepático hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), hsa-miR-143-3p
(miR-143-3p)
1,08E-02-1,08E-02*
Inflamação
hepática/Hepatites
hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), hsa-miR-143-3p
(miR-143-3p)
1,08E-02-1,08E-02*
Cirrose hepática CD80, hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), hsa-
miR-143-3p (miR-143-3p)
2,98E-02-3,65E-01*
Inflamação renal hsa-miR-30c-5p (miR-30c-5p), hsa-miR-15b-
5p (miR-16-5p)
3,42E-02-3,42E-02*
Nefrite renal hsa-miR-30c-5p (miR-30c-5p), hsa-miR-15b-
5p (miR-16-5p)
3,42E-02-3,42E-02*
Carcinoma
hepatocelular
hsa-miR-30c-5p (miR-30c-5p), hsa-miR-107
(miR-103-3p), hsa- miR-106b-5p (miR-17-5p),
hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), hsa-miR-143-3p
(miR-143-3p)
1,22E-01-1,22E-01*
Hiperplasia
hepática/
Hiperproliferação
ILF3, hsa-miR-107 (miR-103-3p), RPGRIP1L,
hsa-miR-143-3p (miR-143-3p), DICER1,
ADIPOR1, EIF4G2, CHN2, MEX3B, TET2,
HMGA2, C1QL3, MED12L, UPF2, SCN1A,
AXIN2, KCNH8, MECOM, USP15, LRP2, hsa-
miR-30c-5p (miR-30c-5p), hsa- miR-106b-5p
(miR-17-5p), SLC7A8, CLASP2, MSI2,
1,22E-01-1,42E-01*
32
GOLM1, ARIH1, STRADB, DERL1, GLMP,
hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), TLK1,
FAM98A, CLINT1
Hipertensão
pulmonar
SCN1A 1,54E-01*
Estenose cardíaca hsa-miR-30c-5p (miR-30c-5p) 1,82E-01*
Arritmia cardíaca SCN1A 2,38E-01*
Insuficiência
cardíaca
DICER1 5,31E-01*
Arteriopatia
cardíaca
MECOM 1E00*
5.2. Fragmentação do DNA
A fragmentação do DNA e o ciclo celular da cultura de HepG2 após tratamento com
clopidogrel com concentrações de 0, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μM, durante 24 e 48 horas estão
ilustrados nas figuras 5 e 6.
Os resultados indicam uma diminuição do número de células na fase G0/G1
dependente da concentração, mas não dependente do tempo (Figura 5), o que se reflete pela
fragmentação do DNA elevada e significativa produzida pelas concentrações de clopidogrel
50 e 100 μM em comparação com o grupo controle a 24 (p = 0,001 e p = 0,002,
respectivamente; Figura 6) e 48 horas (p = 0,001 e p = 0,002, respectivamente; Figura 6) após
tratamento com clopidogrel, indicando concentrações potencialmente tóxicas.
33
Figura 5. Fragmentação do DNA e ciclo celular de células HepG2 expostas ao clopidogrel
(6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM) por 24 h e 48 h comparado com o veículo (controle). Azul –
Fase G0/G1; Vermelho – Fase S; Verde – Fase G2 e M
34
Figura 6. Porcentagem de fragmentação do DNA de células HepG2 expostas ao clopidogrel
(6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM) por 24h e 48 h comparado com o controle. Dados são mostrados
como média ± SEM de três experimentos independentes e comparados pelo Kruskal-Wallis
ANOVA e a comparação em pares pelo teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0
µM
5.3. Expressão de miRNAs em exossomos circulantes em sobrenadante de HepG2
Os miRNAs relacionados com a toxicidade induzida pelo clopidogrel em exossomos de
sobrenadantes de HepG2, após 24 horas e 48 horas de tratamento, estão apresentados na
figura 7. No experimento de 24 horas, observou-se um aumento da expressão do miR-26a-5p
na concentração tóxica de 100 μM de clopidogrel quando comparada com o veículo (0 μM, p
= 0,016). Em relação ao miR-15b-5p, na concentração tóxica de clopidogrel de 100 μM a
expressão apresentou-se reduzida em relação ao veículo (0 μM, p = 0,029). Interessantemente,
após 48 horas de tratamento com clopidogrel, o miR-26a-5p continuou aumentado na
concentração de 100 μM em comparação com o veículo (p = 0,038), assim como a expressão
do miR-15b-5p também permaneceu reduzida na concentração de 100 μM quando comparado
com o controle (p = 0,029). Para todos os períodos estudados, os miR-145-5p e miR-4701-3p
não tiveram alterações estatisticamente significativas.
35
Figura 7. Expressão de miRNAs exossomais (miR-26a-5p, miR-145-5p, miR-4701-3p, miR-
15b-5p) em sobrenadante de HepG2 após 24 e 48 horas expostas ao clopidogrel (0, 12,5, 25,
50, 100 µM). Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0
µM de clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo
teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM.
36
5.4. Expressão de mRNA em células HepG2
A expressão relativa dos mRNA derivados das células e relacionadas com a
hepatotoxicidade induzida por clopidogrel após 24 horas e 48 horas de tratamento estão
representadas nas Figuras 8 e 9, respectivamente. Observou-se uma reduzida expressão do
gene EIF4G2 nas concentrações tóxicas (50 e 100 μM) quando comparada com 0 μM (p =
0,014 e p = 0,021, respectivamente). A expressão de HMGA2 também foi reduzida nas
concentrações tóxicas de 50 e 100 μM em comparação com o controle (p = 0,034 e p = 0,021,
respectivamente). A expressão de gene STRADB foi reduzida na concentração toxica de 50 e
100 μM em relação ao veículo (p = 0,021 e p = 0,014). O SENP5, assim como os demais
genes apresentados, também apresentou uma baixa expressão nas concentrações toxicas (50 e
100 μM), porém também foi menos expresso nas demais concentrações do clopidogrel (12,5 e
25 μM) em relação aos 0 μM (p = 0,034, p = 0,020, p = 0,039 e p = 0,025, respectivamente).
A expressão de TLK1 foi reduzida em 50 e 100 μM quando comparado com o controle (p =
0,034 e p = 0,021, respectivamente). O PLOD2 não apresentou alterações estatisticamente
significativas. Após 48 horas, a expressão de HMGA2 permaneceu reduzida nas
concentrações tóxicas (50 e 100 μM) quando comparada ao veículo (50 μM: p = 0,021 e 100
μM: p = 0,034). Os EIF4G2, PLOD2, STRADB, SENP5 e TLK1 não apresentaram alterações
estatisticamente significativas, após 48 h de tratamento.
37
Figura 8. Expressão de mRNAs derivados de células HepG2 (EIF4G2, HMGA2, PLOD2,
STRADB, SENP5 e TLK1) depois de 24 horas de exposição ao clopidogrel (0, 12,5, 25, 50,
100 µM). Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0 µM
de clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo
teste Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM.
38
Figura 9. Expressão de mRNAs derivados de células (EIF4G2, HMGA2, PLOD2, STRADB,
SENP5 e TLK1) depois de 48 horas de exposição ao clopidogrel (0, 12,5, 25, 50, 100 µM).
Dados são apresentados como fold-change verso o grupo controle (veículo, 0 µM de
clopidogrel) e comparado pelo Kruskal-Wallis ANOVA e a comparação em pares pelo teste
Mann-Whitney. * p < 0,05 comparado com 0 µM.
39
6. DISCUSSÃO
A falta de potenciais biomarcadores moleculares para o diagnóstico precoce dos
efeitos adversos associados a terapia com clopidogrel tem reduzido a segurança e a resposta
deste fármaco antiplaquetário utilizado na medicina cardiovascular (UEHARA; WANG;
TONG, 2015; ZAHNO et al., 2013). Os miRNAs tem uma função importante na regulação da
expressão gênica a nível pós-transcricional. Além disso, podem também reduzir ou inibir
mRNA quando regulada positivamente e a diminuição da expressão de um miRNA específico
pode aumentar os níveis de mRNA (ARORA; SIMPSON, 2008; LU; CLARK, 2012).
No presente estudo, através de uma análise in silico, evidenciamos que cinco miRNAs
(miR-26a, miR-145, miR-15b, miR-4701 e miR-107) e seus mRNAs alvos podem estar
potencialmente associados à variabilidade na reatividade plaquetária, resposta ao clopidogrel
e especialmente com a toxicidade hepática e renal induzida pelo fármaco (FREITAS et al.,
2016). A relação entre os miRNAs e seus alvos com a toxicidade induzida pela droga, indica
que estes podem representar potenciais e importantes biomarcadores de resposta do
clopidogrel, bem como um fator de predição da hepatotoxicidade, que é um raro efeito
adversos deste fármaco (MONTEIRO et al., 2011).
Assim, mediante estes resultados promissores, avaliamos a relação dos miRNAs e seus
genes alvos com a hepatotoxicidade induzida pelo clopidogrel in vitro. Nossos resultados
indicaram um perfil de fragmentação do DNA de células hepáticas, condizente com uma alta
apoptose celular após a incubação com clopidogrel nas concentrações de 50 e 100 μM,
indicando doses tóxicas que se refletiram em menor número de células na fase G0/G1 do ciclo
celular.
No entanto, os mecanismos associados a este efeito adverso não são totalmente
elucidados. Estudo relatou que o clopidogrel é tóxico nas concentrações de 10 e 100 μM para
culturas primárias de hepatócitos humanos, quando combinado com rifampicina (indutor de
CYP3A4) (ZAHNO et al., 2013). Outro estudo utilizando dois desenhos experimentais, um
com hepatócitos primários de rato e um com linhagem de células HepG2 co-incubadas com
CYP2B6- e CYP2C19-recombinante mostrou que clopidogrel causou hepatotoxicidade
significativa nas concentrações de 100 μM e 300 μM à hepatócitos primários de rato e que
esta toxicidade foi dependente de metabolitos produzidos pelas CYPs. Além disso, nas células
HepG2, o clopidogrel co-incubado com as enzimas CYP2C19 e CYP2B6 foi associado à
formação de metabólitos tóxicos para os hepatócitos, sugerindo que o clopidogrel é
hepatotóxico após biotransformação pelas enzimas CYP2C19 e CYP2B6 (ZHAI et al., 2015).
40
É provável que a biotransformação pelas isoformas de CYP produza metabólitos que
possam causar mais toxicidade do que o clopidogrel pró-fármaco (MAFFRAND, 2012). No
entanto, as células HepG2 têm baixa atividade de CYPs, particularmente CYP1A2, CYP2B6
e CYP3A4 (GERETS et al., 2012; WESTERINK; SCHOONEN, 2007), sugerindo que o
clopidogrel pode causar lesão hepatocelular neste modelo celular. A nossa hipótese de que a
toxicidade hepatocelular pode estar relacionada ao pró-fármaco é apoiada por outros estudos,
que mostraram que o clopidogrel carboxilado, principal metabólito do clopidogrel (85% dos
metabólitos), não é tóxico para células HepG2 até 100 μM (ZAHNO et al., 2013).
Estes resultados são sugestivos que em doses elevadas de clopidogrel, como as doses
de 300 e 600 mg, a variabilidade genética associada aos CYPs, alterando sua atividade, pode
levar à toxicidade hepatocelular relacionada ao pró-fármaco. Além disso, 10 μM de
clopidogrel tem sido relatado ser uma concentração que pode ser atingida no fígado de
pacientes tratados com a dose de manutenção de 75 mg por dia (ZAHNO et al., 2010, 2013).
Portanto, as concentrações tóxicas observadas em nosso estudo, 50 e 100 μM, podem ser
consideradas equivalentes as altas dosagens (dose de ataque de 600 mg seguida de 150 mg
uma vez por dia) e dose padrão (dose de ataque de 300 mg seguida de 75 mg por dia)
utilizado no protocolo de angioplastia. Essa informação é importante, especialmente porque o
fígado pode ser afetado diretamente, de forma previsível e dose-dependente, ou
idiossincrática, independente da dose e, portanto, imprevisível (WEILER; MERZ; KULLAK-
UBLICK, 2015).
O miR-26a exossomal foi regulado positivamente na concentração tóxica (100 μM) de
clopidogrel. Este resultado está de acordo com os resultados da análise in silico sugerindo que
o miR-26a desempenha um papel importante na resposta ao clopidogrel e sua hepatoxicidade
(FREITAS et al., 2016). Na função hepática, a regulação positiva de miR-26a induzida pela
exposição ao benzo[a]pireno (BaP) de HepG2 também foi relatada como potencial marcador
inovador envolvido na resposta tóxica de BaP, um hidrocarboneto aromático policíclico
utilizado como genotóxico/carcinogênico (LIZARRAGA et al., 2012). O aumento da
expressão do miR-26a em fígado de camundongos foi descrita como proteção contra lesões
hepáticas induzidas pelo etanol (HAN et al., 2015). O miR-26a também desempenha um
papel importante na proliferação de hepatócitos durante a regeneração hepática em
camundongos machos de linhagem C57BL/6J (ZHOU et al., 2012).
Zhu et al. mostrou que a associação funcional de membros da família miR-26 e seus
genes hospedeiros fornecem novas perspectivas sobre a rede reguladora da transição de fase
41
G1/S em células HepG2, sugerindo que miR-26a/b pode bloquear a transição G1/S por
ativação da proteína pRb (ponto de verificação da progressão do ciclo celular), interferindo
nos processos fisiológicos e patológicos. Os alvos previstos de miR-26 incluíram quatro genes
relacionados com a transição G1/S, são eles o CDK6, a ciclina E1, a ciclina D2 e a ciclina E2.
O aumento da expressão da família miR-26 resultou no acúmulo da população de células
HepG2 na fase G1 (ZHU et al., 2012).
Os principais mRNAs alvos do miR-26a (HMGA2, EIF4G2, STRADB e SENP5)
também foram também avaliados (FREITAS et al., 2016). Foi observada uma baixa expressão
desses genes em células HepG2 quando expostas ao clopidogrel, na concentração tóxica (100
μM).
HMGA2 é uma proteína arquitetônica que participa de vários processos celulares,
incluindo crescimento e desenvolvimento descontrolados, ligando-se a regiões ricas em AT
no DNA, alterando a estrutura da cromatina (SUN et al., 2013). Sua expressão foi reduzida na
concentração tóxica tanto em 24 como 48 h após o tratamento com clopidogrel. Estudo prévio
avaliou o miR-26a como um supressor tumoral, inibindo a proliferação de células de câncer
de vesícula biliar, e mostrou que os níveis de HMGA2 foram negativamente correlacionados
com níveis miR-26a (ZHOU et al., 2014). Portanto, a regulação negativa de HMGA2 pode
estar envolvida no mecanismo hepatotóxico do clopidogrel.
A expressão EIF4G2 foi regulada negativamente nas concentrações tóxicas, após 24 h
de tratamento com clopidogrel. EIF4G2 é um importante fator de tradução membro da família
eIF4G e seu silenciamento aumenta parcialmente a sensibilidade aos danos ao DNA induzidos
pela radiação ionizante (IR), em células de câncer de mama (BADURA et al., 2012). Além
disso, um estudo mostrou que a tradução celular é especificamente desligada durante a
apoptose de células HeLa por um mecanismo envolvendo a clivagem de EIF4G
(MARISSEN; LLOYD, 1998). Estes dados são sugestivos de que a baixa expressão de
EIF4G2, que é um alvo miR-26a, pode estar relacionada com a crescente fragmentação do
DNA em resposta ao tratamento com clopidogrel.
STRADB foi regulada negativamente nas concentrações tóxicas de 50 e100 µM, após
24 h de exposição ao clopidogrel. Estudos anteriores sugeriram que o STRADB desempenha
um papel crucial na indução da bloqueio do ciclo celular, produzindo inibição do crescimento
através da translocação de LKB1 (proteína quinase serina/treonina) do núcleo para o
citoplasma (BAAS et al., 2003; BOUDEAU et al., 2006; ZHONG; SUN; DONG, 2013),
corroborando com os nossos dados da fragmentação do DNA e ciclo celular.
42
SENP5 está envolvido com importantes processos biológicos, como divisão e
proliferação celular (DI BACCO et al., 2006). Os expressão reduzida de SENP5 após o
tratamento com clopidogrel foi observado em todas as concentrações de tratamento, sugerindo
que o clopidogrel pode afetar sua expressão, em baixas ou altas doses de tratamento,
provavelmente não associada à via de regulação pelo miR-26a. Estudo prévio em células de
osteossarcoma, sugeriu que o SENP5 é necessário para o crescimento celular e apoptose, e sua
inibição suprimir a célula de crescimento e induzir apoptose (WANG; ZHANG, 2014).
A baixa expressão do miR-15b na concentração tóxica (100 μM) foi mais evidente
após 48 h de tratamento com clopidogrel. Nosso estudo in silico relacionou o miR-15b com a
toxicidade induzida pelo clopidogrel, especialmente danos hepáticos, inflamação
hepática/hepatite, cirrose hepática, carcinoma hepatocelular (FREITAS et al., 2016). Além
disso, o miR-15b demonstrou influenciar a sobrevivência celular e a regulação do ciclo
celular (VAN ROOIJ; PURCELL; LEVIN, 2012). A baixa expressão do miR-15b também foi
descrito em células TM4 tratadas com Nonilfenol, um composto xenobiótico com efeito
citotóxico, dependente da dose, após 24 horas de tratamento (CHOI et al., 2011).
Similarmente, observou-se a redução do miR-15b em um estudo que avaliou os efeitos
precoce e tardios da doxorrubicina em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas
pluripotentes (HOLMGREN et al., 2016). Por outro lado, estudos relataram que o aumento da
expressão de miR-15b pode ser essencial para a apoptose por ligação e direcionamento de
transcritos de BCL2 (gene anti-apoptótico), na insuficiência hepática aguda induzida em
camundongos (AN et al., 2012; GUO et al., 2009). As divergências de resultados sobre o
miR-15b sugere que a sua expressão na função hepática não é completamente elucidada,
indicando a necessidade de novos estudos para melhor elucidar seu efeito regulador na via da
apoptose.
O miR-15b foi descrito no estudo de análise in silico, ser um miRNA regulador do
mRNA TLK1 (FREITAS et al., 2016). No entanto, a expressão de TLK1 também diminuiu nas
concentrações tóxicas de clopidogrel após 24 h de tratamento, sugerindo um possível aumento
no consumo deste miRNA pelas células, causando a sua concentração reduzida nos
exossomos. Apesar disso, um estudo mostrou que a repressão de TLK1 resultou em
progressão tardia da fase S, sugerindo um papel importante deste mRNA na regulação do
ciclo celular (KIM et al., 2016), o que corrobora com os presentes resultados descritos. Além
disso, outro estudo mostrou o papel do TLK1 na parada do ponto de checagem induzido por
dano do DNA após sua inibição pelo efeito da radiação (TIMIRI SHANMUGAM et al.,
43
2016), e isso é sugestivo de que TLK1 possa estar envolvido na hepatotoxicidade induzida
pelo clopidogrel.
O aumento da apoptose em altas concentrações de tratamento com clopidogrel
associada a alta expressão de miR-26a e a baixa expressão de miR-15b, bem como à
regulação de mRNAs específicos, são sugestivos de que estes miRNAs podem ser úteis como
uma ferramenta epigenética inovadora para a detecção de hepatotoxicidade induzida por
clopidogrel.
Além do mais, os exossomos desempenham um papel fundamental no processo de
comunicação célula a célula e os miRNAs exosomais tem atraído muita atenção devido aos
seus papéis reguladores da expressão gênica, sendo descritos como potenciais biomarcadores
(ZHANG et al., 2015).
Nesse contexto, os efeitos das doses tóxicas na expressão de mRNA mais
pronunciados em 24 h após o tratamento em comparação com 48 h, sugerem um importante
papel dos miRNAs exossomais na regulação de mRNAs intracelulares neste período.
Interessantemente, as mudanças na expressão de miRNAs derivados de exossomos
permaneceram em 48h, apoiando o papel dos exossomos na comunicação célula a célula e no
agravamento dos efeitos adversos em células distintas.
Similarmente, um estudo utilizando cultura de hepatócitos primários de ratos avaliou
os efeitos de muitos miRNAs e os níveis de mRNAs e proteínas em 24 h e 48 h após o
tratamento com ciclosporina A (CsA). Observou-se uma regulação significativamente positiva
de Arfip1 após 24 h de tratamento, enquanto que em 48 h a proteína arfaptina-1 foi regulada
negativamente e o Arfip1 não foi diferencialmente expresso (VAN DEN HOF et al., 2014).
Além disso, a dose de 50 mM de CsA e incubando as células durante 48 h resultou em
miRNAs expressos de forma mais significativa e interagindo com o Arfip1, suportando os
nossos dados sobre a variação na expressão de mRNA derivada de células associada ao tempo
de tratamento. Esses achados reforçam a importância de estudos em momentos diferentes para
a elucidação de mecanismos relacionados à hepatotoxicidade induzida por fármacos.
Vale ressaltar que, é provável que os efeitos tóxicos do clopidogrel em HepG2 sejam
diferentes dos hepatócitos humanos primários e estudos adicionais são necessários para
confirmar estes resultados. No entanto, este é o primeiro estudo que se atentou em avaliar a
função de miRNAs derivados de exossomos na hepatotoxicidade induzida pelo clopidogrel,
suportando a importância dos presentes resultados, uma vez que servirá como base para
confirmação em pacientes.
44
7. CONCLUSÃO
Em conclusão, as concentrações tóxicas de clopidogrel modularam a expressão dos
miR-26a e miR-15b e seus mRNAs alvo (PLOD2, EIF4G2, HMGA2, STRADB e TLK1) em
células HepG2, que estão envolvidos na apoptose celular e na regulação do ciclo celular que
podem representar um importante mecanismo de toxicidade hepática induzida por
clopidogrel. Além disso, os resultados sugerem que o perfil de expressão do miR-26a pode ser
útil como uma ferramenta epigenética inovadora para a detecção de hepatotoxicidade induzida
por clopidogrel.
45
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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