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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

MAGDA ANTONELLO TERRANA BEZERRA DE MELO BRITO

ESTUDO DE ECTOPARASITOS DE FRAGATAS (Fregata magnificens Mathews,

1914) PROVENIENTES DE CENTROS DE REABILITAÇÃO ANIMAL NO

LITORAL DO RIO DE JANEIRO E SÃO PAULO – BRASIL

NITERÓI

2018


ESTUDO DE ECTOPARASITOS DE FRAGATAS (Fregata magnificens Mathews, 1914)

PROVENIENTES DE CENTROS DE REABILITAÇÃO ANIMAL NO LITORAL DO RIO

DE JANEIRO E SÃO PAULO – BRASIL

Disertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas da Universidade Federal Fluminense como

requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Parasitologia.

Orientadora: Prof. Dr. BEATRIZ BRENER DE FIGUEIREDO

NITERÓI

2018


ESTUDO DE ECTOPARASITOS DE FRAGATA (Fregata magnificens Mathews, 1914)

PROVENIENTES DE CENTROS DE REABILITAÇÃO ANIMAL NO LITORAL DO RIO

DE JANEIRO E SÃO PAULO – BRASIL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas da Universidade Federal Fluminense como

requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Parasitologia.

Aprovado em fevereiro de 2018.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Profa. Dra. PATRÍCIA RIDDELL MILLAR

Universidade Federal Fluminense

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. RODRIGO CALDAS MENEZES

Fundação Oswaldo Cruz

______________________________________________________________________

Profa. Dra. TERESA CRISTINA BERGAMO DO BOMFIM

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

NITERÓI

2018

Dedico este trabalho à minha

família, principalmente aos meus

pais, irmãos, e primos que, com

muito carinho е apoio, não

mediram esforços para que eu

chegasse até aqui.

AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente à minha família por ter me dado o suporte necessário para a conclusão

deste curso. Meu amor por vocês é inestimável.

Aos meus queridos animais que tornam meus dias mais alegres e não me deixam desanimar

quando as coisas não vão bem. Em especial ao Farrapo e à Bolha que me deixaram no decorrer

destes dois anos de mestrado. Vocês foram importantes para mim e estão guardados com

carinho nas minhas lembranças.

Aos meus amigos do mestrado, Cinthya Domingues, Juliana Dias, Robson Santos, Joylson de

Jesus e todos os outros que fizeram destes dois anos muito mais agradáveis e divertidos que o

normal. Obrigada por serem sempre animados e por “fazerem feira” na copa do Biomédico.

À Gleice Azevedo, por ser uma pessoa especial. Agradeço por estar sempre levantando o meu

astral e pelo apoio nas horas difíceis.

Ao Otto Lehmann, que esteve ao meu lado nas horas que chorei e nas horas que sorri, nas horas

que me lamentei nas horas que demonstrei total alegria.

À minha querida orientadora, Dra Beatriz Brener, pelo suporte, apoio е confiança, pelas suas

correções e incentivos, sempre de maneira gentil, porém firme. Muito obrigada por ser essa

ótima orientadora e pessoa maravilhosa.

À Profa Dra Daniela Leles pela paciência e dedicação em me ensinar passo a passo os

procedimentos da Biologia molecular.

Ao Centro de Reabilitação de Animais Silvestres, ao Jeferson Pires e todos que me auxiliaram

nas coletas e me responderam de bom grado todas as tantas vezes que perguntei se havia

chegado fragata.

Ao Instituto Argonauta e todos os veterinários, biólogos e funcionários que fizeram as coletas

para mim de bom grado, mesmo estando fora da rotina de trabalho deles.

Aos bolsistas de iniciação científica do programa pibic, Eduardo e Mariana por terem me

ajudado tanto durante esses dois anos nas coletas e no processamento das amostras. Não sei o

que teria feito sem a ajuda de vocês.

À Elisa Pucu pela paciência em me explicar e me auxiliar no processamento dos piolhos na

biologia molecular.

Ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, pela oportunidade

do mestrado e pela bolsa concedida através da Capes.

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o

mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

RESUMO

As aves marinhas são reservatórios naturais de patógenos, podendo favorecer o transporte

destes para locais distantes. Agentes infecciosos e parasitários exercem pressões ecológicas e

evolutivas importantes sobre seus hospedeiros. Grandes populações de aves marinhas e

migratórias agregadas podem tornar o ambiente que ocupam favoráveis ao desenvolvimento de

parasitoses. A Família Fregatidae Deglang & Gerbe, 1840 possui cinco representantes dentro

do gênero Fregata. No Brasil temos a ocorrência de três espécies, Fregata. minor, Fregata.

ariel e Fregata. magnificens, sendo esta última a mais abundante e presente em toda a costa

brasileira. Os estudos de parasitos em aves marinhas são escassos, principalmente os de

identificação taxonômica. Este estudo teve por objetivo avaliar a ocorrência de ectoparasitos de

F. magnificens (Aves: Suliformes: Fregatidae) residentes no litoral do Rio de Janeiro e São

Paulo, recolhidas por centros de reabilitação. Foram estudados 15 exemplares de F. magnificens

que chegaram ao Centro de Reabilitação e Triagem de Animais Aquáticos (CRETA) em

Ubatuba - SP e ao Centro de Reabilitação de Animais Silvestres (CRAS) em Vargem Pequena

- RJ. A coleta dos ectoparasitos foi efetuada através do uso de talco ectoparasiticida. A

morfometria permitiu a identificação de três espécies distintas de piolhos mastigadores, duas

pertencentes à subordem Amblycera (Fregatiella aurifasciata e Colpocephalum spineum) e

outra à subordem Ischnocera (Pectinopygus fregatiphagus). Não se registrou qualquer outro

artrópode nos animais utilizados nas coletas. Com este estudo relatamos pela primeira vez no

Brasil a presença das espécies F. aurifasciata e C. spineum e a primeira ocorrência no Rio de

Janeiro da espécie P. fregatiphagus. Os resultados obtidos contribuirão para um melhor

atendimento das Fragatas que chegam a centros de reabilitação e para um diagnóstico

diferenciado em relação a possíveis patologias envolvendo estes animais, auxiliando assim na

ecologia e conservação das espécies e ecossistemas brasileiros.

Palavras-chave: Piolho, Aves marinhas, Amblycera, Ischnocera

ABSTRACT

Seabirds are natural reservoirs of pathogens, and may favour the transport of these to distant

sites. Infectious and parasitic agents exert significant ecological and evolutionary pressure on

their hosts. Large aggregated seabird and migratory bird populations can make the environment

they occupy conducive to the development of parasitic diseases. The Family Fregatidae

Deglang & Gerbe, 1840 has five species within the genus Fregata. In Brazil we have an

occurrence of three species, Fregata minor, Fregata ariel and Fregata magnificens, the latter

being the most abundant and present in the entire Brazilian coast. Studies of parasites in seabirds

are scarce, especially those of taxonomic identification. The objective of this study was to

evaluate the occurrence of ectoparasites of F. magnificens (Aves: Suliformes: Fregatidae) living

on the coast of Rio de Janeiro and São Paulo, rescued by wild animal rehabilitaton centers.

Fifteen specimens of F. magnificens were studied, which arrived at the Center for Rehabilitation

and Triage of Aquatic Animals (CRETA) in Ubatuba - SP and the Wild Animals Rehabilitation

Center (CRAS) in Vargem Pequena - RJ. The ectoparasites were collected through the use of

ectoparasiticide talc. Morphometry allowed the identification of three distinct species of

chewing lice, two belonging to the suborder Amblycera (Fregatiella aurifasciata and

Colpocephalum spineum) and another to the suborder Ischnocera (Pectinopygus fregatiphaus).

No other arthropod was registered in the animals used in this study. With this study, we report

for the first time in Brazil the presence of the species F. aurifasciata and C. spineum and the

first occurence in Rio de Janeiro of P. fregatiphagus. The results obtained will contribute to a

better care of frigatebirds arriving at rehabilitation centers and to a differentiated diagnosis to

possible pathologies involving these animals, thus helping in the ecology and conservation of

Brazilian species and ecosystems.

Keywords: Frigatebird, Louse, Seabirds, Amblycera, Ischnocera

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ------------------------------------------------------------------- Pág 10

LISTA DE TABELAS --------------------------------------------------------------------------- Pág 12

1. INTRODUÇÃO -------------------------------------------------------------------------------- Pág 13

2. REVISÃO DE LITERATURA ------------------------------------------------------------- Pág 15

2.1. AVES MARINHAS ----------------------------------------------------------------- Pág 15

2.2. FAMÍLIA FREGATIDAE E SUA MORFOLOGIA ------------------------------------- Pág 16

2.3. ECTOPARASITOS ------------------------------------------------------------------ Pág 21

2.3.1. PIOLHOS ------------------------------------------------------------------ Pág 22

2.3.1.1. ASPECTOS MORFOLÓGICOS GERAIS ----------------- Pág 22

2.3.1.2. COLONIZAÇÃO NO HOSPEDEIRO ---------------------- Pág 25

2.3.1.3. COEVOLUÇÃO PIOLHO-HOSPEDEIRO ---------------- Pág 27

2.3.2. HIPOBOSCÍDEOS ------------------------------------------------------- Pág 28

2.3.2.1. CLASSIFICAÇÃO E ASPECTOS MORFOLÓGICOS

GERAIS --------------------------------------------------------------------------- Pág 28

2.3.2.2. COLONIZAÇÃO NO HOSPEDEIRO E TRANSMISSÃO DE

AGENTES INFECCIOSOS ---------------------------------------------------- Pág 29

2.4. ECTOPARASITOS EM Fregata magnificens ----------------------------------- Pág 30

2.5. DIAGNÓSTICO DOS ECTOPARASITOS -------------------------------------- Pág 31

3. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------ Pág 33

3.1. OBJETIVOS GERAIS -------------------------------------------------------------- Pág 33

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ------------------------------------------------------- Pág 33

4. MATERIAL E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------ Pág 34

4.1. LOCAIS DE COLETA -------------------------------------------------------------- Pág 34

4.2. MÉTODO DE COLETA ------------------------------------------------------------ Pág 35

4.3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS ------------------------------------------- Pág 38

4.3.1. ESTUDO MORFOMÉTRICO EM MICROSCOPIA DE LUZ ----- Pág 38

4.3.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR --------------------------------------- Pág 39

5. RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------- Pág 42

5.1. DIAGNÓSTICO POR MICROSCOPIA DE LUZ ------------------------------ Pág 44

5.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR -------------------------------------------------- Pág 51

6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------------ Pág 58

7. CONCLUSÕES -------------------------------------------------------------------------------- Pág 66

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ---------------------------------------------------- Pág 67

9. ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------- Pág 75

9.1 APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE ------------------------------------------------ Pág 75

9.2 AUTORIZAÇÃO PARA COLETA DE AMOSTRAS – INSTITUTO

ARGONAUTA ------------------------------------------------------------------------------------- Pág 76

9.3 AUTORIZAÇÃO PARA COLETA DE AMOSTRAS – CRAS --------------- Pág 77

9.4 FICHA PARA COLETA DE AMOSTRAS -------------------------------------- Pág 78

9.5 CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO XXV

CONGRESSO BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA -------------------------------------- Pág 79

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Fragata (Fregata magnificens) macho com plumagem totalmente negra e saco gular

inflado de cor vermelha.

Fonte: https://www.allaboutbirds.org/guide/Magnificent_Frigatebird/id. ------------------ Pág 18

Figura 2: Fragata (Fregata magnificens) fêmea com plumagem do peito branca.

Fonte: https://www.allaboutbirds.org/guide/Magnificent_Frigatebird/id. ------------------ Pág 19

Figura 3: Fragata (Fregata magnificens) juvenil com cabeça e ventre brancos.

Fonte: http://www.darwinfoundation.org/datazone/checklists/5085/. ---------------------- Pág 19

Figura 4: Mapa representando em vermelho a distribuição de todas as espécies da família

Fregatidae.

Fonte: http://www.hbw.com/family/frigatebirds-fregatidae. --------------------------------- Pág 21

Figura 5: As quatro subordens de piolhos (Insecta: Phthiraptera), seus hospedeiros e relações

filogenéticas. Fonte: adaptado de SMITH, 2003. ----------------------------------------------- Pág 23

Figura 6: Esquema ilustrando algumas estruturas morfológicas dos piolhos mastigadores.

Fonte: adaptado de SMITH, 2001. --------------------------------------------------------------- Pág 24

Figura 7: Observação de ectoparasitos na plumagem da fragata antes do início da coleta. -- Pág 36

Figura 8: Fragata em recipiente plástico após aplicação de ectoparasiticida. ------------ Pág 37

Figura 9: Macho de Colpocephalum spineum (subordem Amblycera). A) Visão geral. Barra

lateral: 243,3 μm. B) Foco na cabeça para melhor visualização das estruturas. ------------ Pág 45

Figura 10: Fêmea de Colpocephalum spineum (subordem Amblycera). A) e B) Visão geral

mostrando variação de tamanho dos piolhos. Barra lateral: 243,3 μm. C) Foco em último tergito

para visualização das estruturas. D) e E) Foco em abdômen mostrando Tergito II com divisões

incompletas (setas vermelhas), diferentemente de demais tergitos, que apresentam divisões

completas (seta preta). ----------------------------------------------------------------------------- Pág 46

Figura 11: Fregatiella aurifasciata (subordem Amblycera). A) Visão geral da fêmea. Barra

lateral: 314,6 μm. B) Setas apontando para a constrição da antena entre o 3° e o 4° segmento.

C) Protórax apresentando uma barra de quitina transversal evidente e duas barras longitudinais

curvas em suas extremidades. D) Visão geral do macho. Barra lateral: 314,6 μm. -------- Pág 47

Figura 12: Pectinopygus fregatiphagus (Subordem Ischnocera). A) Visão geral do macho.

Barra lateral: 467,3 μm B) Setas apontando para apêndice no 3° segmento da antena do macho.

C) Visão geral da Fêmea. Barra lateral: 467,3 μm. --------------------------------------------- Pág 48

Figura 13: Eletroforese em gel de agarose a 2 % mostrando amplificações para os alvos COI e

EF-1ɑ de espécimes de piolhos de fragata (Fregata magnificens). Coluna 1 e 17: 100pb Ladder

(Ludwig). Colunas 2-11 amplificações para o alvo COI; coluna 2 (amostra 014-P1); coluna 3

(amostra 014-C1), coluna 4 (amostra 015-P1), coluna 5 (amostra 015-P2), coluna 6 (amostra

015-P3), coluna 7 (amostra 015-C1), coluna 8 (amostra 015-C2), coluna 9 (amostra 015-F1),

coluna 10 (controle negativo da extração) e coluna 11 (controle negativo da PCR). Colunas 12-

16, 18-21 e 29 amplificações para o alvo EF-1ɑ; coluna 12 (amostra 014-P1); coluna 13


015-P3), coluna 18 (amostra 015-C2), coluna 19 (amostra 015-F1), coluna 20 (controle

negativo da extração), coluna 21 (controle negativo da PCR) e coluna 29 (amostra 015-C1).

Observação: Colunas 22-28 se referem a outro experimento, e nas colunas 30-32 nada foi

aplicado. --------------------------------------------------------------------------------------------- Pág 52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Espécies de piolhos mastigadores já descritos na família Fregatidae. --------- Pág 30

Tabela 2: Descrição e codificação das amostras usadas no ensaio molecular. ------------ Pág 40

Tabela 3: Relação de fragatas (Fregata magnificens) analisados com separação por sexo,

motivo da reabilitação, presença ou não de outros animais no mesmo recinto e tempo em

cativeiro no momento da coleta dos ectoparasitos, provenientes do CRETA em São Paulo e do

CRAS no Rio de Janeiro no período de outubro de 2016 a outubro de 2017. -------------- Pág 43

Tabela 4: Espécies e quantidade de piolhos mastigadores coletados de 15 fragatas (Fregata

magnificens) provenientes do CRAS - RJ e do CRETA – SP no período de outubro de 2016 a

outubro de 2017, relacionadas de acordo com o hospedeiro e frequência de positividade de

piolhos nos animais. -------------------------------------------------------------------------------- Pág 49

Tabela 5: Espécies de piolhos mastigadores e quantidades mínimas, máximas e médias

encontradas em 15 fragatas (Fregata magnificens), provenientes do CRAS – RJ e do CRETA

– SP no período de outubro de 2016 a outubro de 2017. -------------------------------------- Pág 49

Tabela 6: Morfometria das espécies de piolhos encontradas, separados por machos e fêmeas,

relacionada com o descrito em literatura. ------------------------------------------------------- Pág 50

Tabela 7: Análise das sequências nucleotícidas obtidas para os alvos COI e EF-1ɑ de espécimes

de piolhos recuperados de fragata, comparando-se com as sequências depositada no Genbank

usando o parâmetro de maior similaridade. ----------------------------------------------------- Pág 53

13

1. INTRODUÇÃO

O parasitismo tem grande importância na ecologia e conservação das espécies e exerce

certa pressão evolutiva nas populações (LOYE; CARROL 1995). Os ectoparasitos acometem

uma vasta gama de espécies animais de todas as classes taxonômicas. Sua presença pode

ocasionar nos animais diversos processos patológicos, desde mudanças de comportamento,

alteração de pelagem ou plumagem, até lesões de pele, alterações reprodutivas, anemia e

enfraquecimento, além de serem potenciais vetores de doenças virais, bacterianas e mesmo

parasitárias (STORNI et al., 2005).

O ectoparasitismo é comumente observado em aves, não somente domésticas, mas

também silvestres. Diversos estudos discutem sobre a filogenia e taxonomia de ectoparasitos,

mas são poucos os trabalhos amplos realizados sobre a biologia e a ação destes em seus

hospedeiros silvestres (DAVIS et al., 1977). Os ectoparasitos encontrados em aves abrangem

uma diversidade de insetos e ácaros que muitas vezes infestam a pele, penas e vias aéreas de

seus hospedeiros, podendo ainda infestar os ninhos, sendo capazes de provocar nas aves um

estado grave de anemia e/ou stress, tornando estas mais suscetíveis ao desenvolvimento de

infecções secundárias (PHILIPS, 1990).

Estudos têm apontado em animais domésticos mortes por debilidade causadas por

pulgas, piolhos, carrapatos e moscas. Porém estes não são dados simples de se obter em animais

silvestres no seu ambiente natural, principalmente nas aves, já que estes animais muitas vezes

vivem em ambientes de difícil acesso e precisam ser capturados para a obtenção de tais dados

(DAVIS et al., 1977).

As aves marinhas são reservatórios naturais de patógenos importantes, podendo

favorecer o transporte destes para locais distantes (HUBÁLEK, 2004). O potencial de

transmissão de patógenos é aumentado nos períodos de reprodução, quando as aves marinhas

congregam-se em grande número e a transmissão horizontal de agentes etiológicos pode ocorrer

(SERAFINI; LUGARINI, 2014), inclusive podendo haver transmissão entre diferentes espécies

de aves que fazem seus ninhos nas mesmas ilhas (CAMPOS et al., 2004).

14

Os sítios de nidificação de diversas aves marinhas incluem a costa continental e

interior do continente, ilhas costeiras e ilhas oceânicas. Das 53 espécies de aves marinhas que

nidificam no Brasil, 20 (38%) o fazem exclusivamente em ilhas, como é o caso da Fregata

magnificens Mathews, 1914, que nidifica somente em ilhas oceânicas e costeiras (VOOREN;

BRUSQUE, 1999).

Os piolhos mastigadores, bem como os ácaros plumícolas (Acari: Acarina) são os

parasitos mais recorrentes em aves silvestres (VALIM et al., 2005). A Ordem Phthiraptera

atualmente é dividida em quatro subordens, cujos espécimes encontrados em aves estão restritos

à apenas duas subordens: Ischnocera e Amblycera (DAVIS et al., 1977; CATÃO-DIAS, 2003).

Estas duas subordens, anteriormente classificadas em conjunto como Subordem Mallophaga,

englobam todos os piolhos mastigadores, dentre os quais estão aqueles que têm como seu

hospedeiro as aves (CATÃO-DIAS, 2003).

Aves agregadas em locais de alta densidade são particularmente vulneráveis à

propagação de doenças, tanto por contato direto quanto pela contaminação de alimentos e fontes

de água por indivíduos doentes (RAPPOLE; HUBA’LEK, 2006).

Estas infestações e infecções podem levar os programas de manejo e recuperação de

animais silvestres ao insucesso, apenas devido ao desconhecimento de tais parasitismos ou

desconhecimento de formas eficazes de combatê-los.

Considerando a escassez de dados sobre ectoparasitos de aves marinhas publicados no

Brasil, informações adicionais sobre a presença e prevalência destes parasitos são necessárias

(VALIM et al., 2005).

15

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. AVES MARINHAS

As aves marinhas são naturalmente predadoras e necessitam de águas com abundância

de peixes e outros organismos para garantir sua sobrevivência e assegurar a reprodução. Por

isso, é comum encontrar estas aves em associação com cardumes de peixes (SCHREIBER;

BURGER, 2002).

Aves marinhas apresentam uma dinâmica um tanto diferente das demais espécies de

aves. São animais com uma expectativa de vida relativamente maior que as aves terrestres;

apresentam ninhadas de poucos filhotes (muitas vezes apenas um filhote por ninhada); passam

mais tempo chocando os ovos e alimentando seus filhotes e estes tem um crescimento mais

lento que os de aves não marinhas. Estes fatores provavelmente estão relacionados à falta de

predadores diretos sobre essas populações, o que permitiu a evolução das aves marinhas dessa

forma (SCHREIBER; BURGER, 2002).

Embora seja possível observar a presença de diversas espécies de aves marinhas na

costa continental brasileira, a maioria destas espécies passa longos períodos de suas vidas em

alto mar, em locais remotos. Isso torna o estudo destes animais um tanto difícil, envolvendo

grandes limitações (SCHREIBER; BURGER, 2002).

Mais de 96% das aves marinhas de todo o mundo são animais de colônia, ou seja, se

agregam em grandes grupos que podem variar de 150 a mais de 100.000 indivíduos dependendo

da espécie. Esse comportamento representa um componente importante na biologia e na

reprodução dessas aves (SHREIBER; BURGER, 2002).

As colônias de aves marinhas apresentam comportamento de resposta a mudanças

climáticas e do ambiente e podem ser importantes bioindicadores da produtividade das

atividades pesqueiras bem como da poluição dos oceanos (FURNESS; CANPHUYSEN, 1997).

Além disso, o comportamento gregário da grande maioria das espécies (colônias reprodutivas

da mesma ou de várias espécies no mesmo local) favorece a transmissão de doenças entre os

indivíduos. Por estas e outras características, as aves marinhas são consideradas sentinelas

16

importantes da saúde ambiental deste ecossistema (FURNESS; CANPHUYSEN, 1997;

SHREIBER; BURGER, 2002).

Agentes infecciosos e parasitários exercem pressões ecológicas e evolutivas

importantes sobre seus hospedeiros. Grandes populações de aves marinhas e migratórias

agregadas podem tornar o ambiente que ocupam favoráveis ao desenvolvimento de parasitoses.

Contudo a presença do parasito não resulta necessariamente em doença (SERAFINI;

LUGARINI, 2014). No entanto, a reutilização pelos animais do mesmo local reprodutivo todos

os anos pode levar ao acúmulo de um grande número de parasitos, como carrapatos e ácaros,

que também podem atuar como vetores de vírus e outros microorganismos (SHREIBER;

BURGER, 2002).

A maioria das aves marinhas vivem e constroem seus ninhos em locais relativamente

seguros de predadores mamíferos por serem, em sua maioria, inacessíveis a estes últimos.

Porém, o surgimento de atividades humanas bem como a introdução de mamíferos predadores

em regiões costeiras e oceânicas vem afetando diretamente as populações de aves marinhas,

gerando certa mortalidade de indivíduos, já que estes não evoluíram sob este tipo de pressão

ecológica (SCHREIBER; BURGER, 2002).

Um exemplo que pode ser citados é o do vison-americano (Mustela vison), introduzido

no Reino Unido, que causou grande impacto nas populações de aves marinhas da região,

principalmente em trinta-réis (Sterna sp.) e gaivotas comuns (Larus canus) (CRAIK 1995,

1997). No nordeste dos Estados Unidos várias espécies de mamíferos foram registradas se

alimentando de ovos, filhotes e adultos de trinta-réis e talha-mar (Rynchops niger). Estes

incluíram esquilos cinzentos (Sciurus carolinensis), guaxinins (Loter procyon), raposa

vermelha (Vulpes fulva), cães e gatos domésticos (BURGER; GOCHFELD, 1991).

O Brasil dispõe do litoral inter e subtropical mais extenso do mundo, chegando a 8.000

km (AB'SABER, 2001). Aqui encontram-se aproximadamente 180 espécies de aves marinhas

(CBRO, 2014), tendo-se registro de pelo menos 53 destas nidificando na costa brasileira

(VOOREN; BRUSQUE, 1999). Apesar deste número de espécies, a ornitofauna brasileira

oceânica e costeira é insuficientemente estudada, dada a extensão de litoral que o país possui

(VALIM et al. 2005).

2.2. FAMÍLIA FREGATIDAE E SUA MORFOLOGIA

As relações taxonômicas da família Fregatidae Deglang & Gerbe, 1840 por muito tempo

foram tópico de discussão entre pesquisadores devido à dificuldade de enquadrar suas

17

características em grupos mais próximos. Anteriormente esta família estava alocada na Ordem

Pelecaniformes devido a algumas características em comum como: os quatro dedos conectados

por membrana natatória; glândula de sal completamente fechada dentro da órbita (enquanto na

maioria das aves marinhas a glândula de sal encontra-se numa cavidade no topo do crânio);

bolsa gular nua, com exceção das aves tropicais onde esta é discreta e emplumada; narinas

externas podem ser em fenda (aves dos trópicos), quase fechadas (cormorões e anhingas), ou

ausentes (pelicanos, fragatas e sulídeos) (SCHREIBER; BURGER, 2002).

Mesmo com essa breve descrição é possível perceber que a relação entre os grupos de

aves dentro da ordem Pelecaniformes é incerta e a família Fregatidae se mostrava ainda mais

distante do resto da ordem (KENNEDY et al., 1996; SCHREIBER; BURGER, 2002).

Em função das diversidades e após análises filogenéticas (VAN TUINEN et al., 2001;

ERICSON et al., 2006; HACKETT et al., 2008) demonstrando sua história evolutiva e a maior

proximidade com os membros da Ordem Suliforme, a família Fregatidae foi remanejada para

esta ordem junto às famílias Sulidae, Phalacrocoracidae e Anhingidae (CBRO, 2014).

A família Fregatidae abrange aves conhecidas popularmente como fragatas, animais

com algumas características marcantes. Possuem asas longas e uma cauda profundamente

bifurcada em formato de “V”, lembrando uma tesoura (Figuras 1 e 2). Por essa característica

são comumente conhecidos como “tesourão” (DEL HOYO et al., 1992; SCHREIBER;

BURGUER, 2002). São aves longevas, podendo chegar a 30 anos de idade (JUOLA et al.,

2006). Medem de 90 a 114 cm de comprimento e apresentam de 225 a 260 cm de envergadura

da asa (SVENSSON, 2010). O peso médio é de 1,5 kg (SIBLEY, 2016).

A família Fregatidae é a única família de aves marinhas com evidente dimorfismo sexual

na plumagem. Também há diferença de tamanho entre os sexos, sendo as fêmeas ligeiramente

maiores e mais pesadas que os machos (DIAMOND, 1973; OSORNO, 1996). Os machos são

completamente negros com penas brilhantes e lustrosas na região do pescoço e possuem um

saco gular inflável (Figura 1), que se torna vermelho brilhante no período de reprodução, sendo

utilizado para atrair fêmeas para o acasalamento (MURPHY 1936; DEL HOYO et al., 1992;

SICK, 1997; NELSON, 2005). Por sua vez, as fêmeas possuem a plumagem do peito branca e

não apresentam saco gular (Figura 2). Os juvenis apresentam todo o ventre e a cabeça brancas,

mudando a cor da plumagem conforme crescem e atingem a idade reprodutiva (SVENSSON,

2010) (Figura 3). A maturidade sexual se da por volta dos cinco anos de idade (VALLE et al.,

2006). No entanto com 100 dias de vida já é possível determinar o sexo do juvenil através do

peso e do comprimento do bico, onde as fêmeas são mais pesadas e possuem o bico mais longo

que os machos (DIAMOND, 1973).

18

As fragatas são aves filopátricas, ou seja, costumam voltar ao local onde nasceram para

se reproduzirem (METZ; SCHREIBER, 2002; DEARBORN et al., 2003). Estes animais se

agrupam em grandes e densas colônias onde indivíduos em ninhos adjacentes podem alcançar

e tocar seu vizinho (DIAMOND; SCHREIBER, 2002).

O período de reprodução e criação de filhotes da família Fregatidae é

excepcionalmente longo. Os filhotes são alimentados pela mãe até um ano de idade. Os machos

abandonam os cuidados parentais e deixam a colônia após aproximadamente 6 meses da eclosão

dos ovos. Retornam no ano seguinte para nova tentativa de acasalamento, com uma nova

companheira, enquanto a fêmea fornece cuidados prolongados para o juvenil da temporada

anterior até que este se torne independente. Desse modo os machos são capazes de procriar

anualmente, enquanto as fêmeas só se reproduzem em anos alternados (DIAMOND, 1973). Em

nenhuma outra espécie de ave marinha existe essa diferença de ciclo reprodutivo entre os sexos

(DIAMOND; SCHREIBER, 2002).

Figura 1: Fragata (Fregata magnificens) macho com plumagem

totalmente negra e saco gular inflado de cor vermelha.

Fonte: https://www.allaboutbirds.org/guide/Magnificent_Frigatebird/id

19

Figura 2: Fragata (Fregata magnificens) fêmea com plumagem do peito

branca.

Fonte: https://www.allaboutbirds.org/guide/Magnificent_Frigatebird/id

Figura 3: Fragata (Fregata magnificens) juvenil com cabeça e ventre

brancos.

Fonte: http://www.darwinfoundation.org/datazone/checklists/5085/

20

A idade mínima na primeira reprodução é de 5 a 8 anos na família Fregatidae. Em

espécies longevas, essa idade tardia é geralmente considerada necessária para que os jovens

obtenham habilidades de forrageamento semelhantes às dos adultos, devido à complexidade

destas habilidades e ao alto valor reprodutivo das aves jovens. Apesar de se estimar um longo

período de vida para as fragatas (idade máxima já registrada de 34 anos), ainda não se sabe a

longevidade média em vida livre das espécies da família Fregatidae (SCHREIBER; BURGER,

2002).

As fragatas, utilizando seu bico longo de extremidade encurvada, são capazes de

capturar peixes na superfície marinha ou “peixes voadores”. Também é comum observar estes

animais “roubando” peixes de outras aves marinhas durante o voo, comportamento conhecido

como “pirataria aérea” (GIBSON-HILL, 1947; NELSON, 1968; DIAMOND, 1975). Essas aves

se especializaram neste comportamento para obtenção de alimentos pois, devido à glândula

uropigial reduzida, não possuem uma boa impermeabilização de sua plumagem que as permita

entrar na água. Quando acidentalmente caem na água, suas penas ficam encharcadas, o que as

impede de levantar voo novamente, representando um risco à sua vida (PENNYCUICK, 1987;

DEL HOYO et al., 2005; SCHREIBER; BURGUER, 2002). Este comportamento de evitar a

água junto a algumas características como corpo grande, alta longevidade e preferência por

ambientes tropicais torna estas aves bons hospedeiros para ectoparasitos (FELSO; ROZSA,

2006).

Fragatas são aves tropicais e podem ser avistadas no litoral da maioria dos países

tropicais ou sobrevoando ambientes pelágicos, principalmente próximo às ilhas onde

estabelecem seus sítios de nidificação (SCHREIBER; BURGUER, 2002). Possuem

envergadura de asa de quase 2 metros e são capazes de voar durante semanas em alto mar,

podendo chegar a altitudes de até 4000 metros, onde ocorrem condições de congelamento

(WEIMERSKIRCH et al., 2016).

Hoje tem-se conhecimento de cinco espécies dentro do gênero Fregata. Duas espécies,

Fregata minor (Tesourão-grande) e Fregata ariel (Tesourão-pequeno) , têm distribuição e

sobreposição de regiões de ocorrência no Indo-Pacífico, também podendo ser encontradas no

Atlântico Sul. A Fragata-comum ou Tesourão (Fregata magnificens) é encontrada no Atlântico

tropical, e no leste do Pacífico tropical, enquanto duas espécies, Fregata aquila e Fregata

andrewsi, são endêmicas de algumas ilhas do Atlântico (SCHREIBER; BURGUER, 2002)

(Figura 4).

21

Durante o período de reprodução as diferentes espécies de fragatas constroem seus

ninhos em galhos e copa de árvores presentes nas ilhas, nunca diretamente no solo, embora

algumas espécies tenham preferência por árvores mais baixas enquanto outras sempre procurem

as copas altas (DIAMOND, 1973; 1975). Estas aves também podem se valer da pirataria aérea

para obtenção de material para a construção de seus ninhos (DIAMOND, 1975).

No Brasil há ocorrência de três espécies: Fregata minor, nidificando na Ilha da

Trindade, Fregata ariel, nidificando nas Ilhas da Trindade e Martim Vaz e, Fregata

magnificens, com colônias na Bahia, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e

Fernando de Noronha. As ilhas de Trindade e Martin Vaz são os únicos locais onde as espécies

F. minor e F. ariel realizam nidificação no Oceano Atlântico, e ocorrem ali como as subespécies

endêmicas Fregata ariel trinitatis e Fregata minor nicolli. No hemisfério sul do oceano

Atlântico a espécie F. magnificens nidifica somente nas ilhas oceânicas e costeiras do Brasil

(VOOREN; BRUSQUE, 1999; SCHREIBER; BURGUER, 2002).

2.3. ECTOPARASITOS

Sabe-se que as aves de modo geral são acometidas por grande número de artrópodes

parasitos, como ácaros plumícolas (Acari: Acaridida), carrapatos (Acari: Ixodida), pulgas

Figura 4: Mapa representando em vermelho a distribuição de todas as

espécies da família Fregatidae.

Fonte: http://www.hbw.com/family/frigatebirds-fregatidae

22

(Insecta: Siphonaptera) e piolhos mastigadores (Insecta: Phthiraptera) (SILVA, 2009), além de

alguns tipos de insetos que podem ter parte de seu ciclo parasitando as aves, como as moscas

da família Hippoboscidae (CLAYTON; WALTHER, 1997).

Aves marinhas são comumente parasitadas por piolhos mastigadores e podem também

ser alvo de insetos hematófagos como os hipoboscídeos. Algumas espécies podem ainda ser

parasitadas por pulgas e ácaros, embora não se tenha registros destes últimos em nenhuma

espécie de fragata até o momento (SILVA, 2009).

2.3.1. PIOLHOS

2.3.1.1. ASPECTOS MORFOLÓGICOS GERAIS

Os ectoparasitos de aves de vida livre, marinhas ou continentais, mais comumente

descritos são os piolhos mastigadores (Classe: Insecta, Ordem: Phthiraptera, Subordens:

Amblycera e Ischnocera). Entretanto, outros grupos de ectoparasitos também são amplamente

relatados (DURDEN, 2002).

Os piolhos mastigadores, bem como os hematófagos, surgiram a partir de um ancestral

primitivo não-parasito relacionado à ordem Psocoptera (DURDEN, 2002) (Figura 5). Acredita-

se que seus ancestrais viveram provavelmente em cascas de árvores se alimentando de matéria

orgânica. Passaram gradualmente a se alimentar dos restos de pele dos répteis. Quando estes

começaram a apresentar penas no processo de evolução para aves, os piolhos puderam dispor

de um novo meio de abrigo e proteção, co-evoluindo com seus hospedeiros (DAVIS et al.,

1977).

Posteriormente, entre o fim do período Jurássico e início do Cretáceo, há 100 – 150

milhões de anos, se diferenciaram dando origem aos dois grupos que existem hoje, os

hematófagos e os mastigadores (DURDEN, 2002; DAVIS et al., 1977).

Atualmente os piolhos são classificados em quatro subordens distintas pertencentes à

ordem Phthiraptera: Anoplura, Amblycera, Ischnocera e Rhynchoptirina, sendo a primeira a

subordem dos piolhos hematófagos e, as demais, subordens que incluem os piolhos

mastigadores, anteriormente classificados em conjunto como “subordem Mallophaga”

(BOWMAN, 2010).

23

Existem aproximadamente 4000 espécies conhecidas de piolhos mastigadores

parasitando aves e mamíferos, em contraste com cerca de 500 espécies de piolhos hematófagos,

estes parasitando somente mamíferos. Aves não apresentam piolhos hematófagos, sendo todos

seus piolhos mastigadores (BOWMAN, 2010).

As subordens Amblycera e Ischnocera reúnem todos os piolhos mastigadores parasitos

de aves e compartilham algumas características. São pequenos, variando de 1,5 a até 10 mm de

comprimento, tendo a grande maioria um comprimento de até 4 a 5 mm. A largura varia em

torno de 1 a 2 mm (KELLOGG, 1913).

Os piolhos das subordens Ischnocera e Amblycera (Figura 6) são ápteros, de corpo

achatado dorso-ventralmente. O abdômen em geral possui placas esclerotizadas dorsais,

ventrais e laterais e, na maioria dos piolhos, apresenta um grande número de cerdas

(KELLOGG, 1913; DURDEN, 2002). A cabeça é grande, mais larga que o tórax,

diferentemente das subordens Anoplura e Rhyncophthirina. Possuem aparelho bucal

mastigador, com grandes mandíbulas na face ventral da cabeça. Alimentam-se de grande

variedade de materiais epidérmicos como descamações epidérmicas, pêlos ou penas, de acordo

com o hospedeiro e secreções sebáceas. Os indivíduos da subordem Ischnocera são geralmente

mastigadores de penas e se nutrem em zonas claramente definidas. Já os da subordem

Amblycera, além de penas, podem chegar a perfurar o canhão das penas em crescimento para

se alimentar do sangue da polpa (DAVIS et at., 1977).

Figura 5: As quatro subordens de piolhos (Insecta: Phthiraptera),

seus hospedeiros e relações filogenéticas. Fonte: adaptado de

SMITH, 2003.

24

Alguns piolhos parasitos de aves da subordem Amblycera podem eventualmente se

alimentar de exsudatos sanguíneos secos ou frescos (COSTA, 1938; BOWMAN, 2010). Os

olhos são ausentes ou rudimentares (ocellos) e estão situados atrás da inserção antenal (COSTA,

1938). As antenas apresentam diferenças entre as duas subordens. Em Amblycera estas

normalmente se apresentam em formato de “taco de golfe”, são divididas em quatro segmentos,

ficam ligeiramente escondidas na fosseta antenal sob a cabeça e não possuem diferenças entre

os sexos. Já para Ischinocera, as antenas podem apresentar de três a cinco segmentos, são

delgadas e bem visíveis na lateral da cabeça e podem se mostrar consideravelmente diferentes

Figura 6: Esquema ilustrando algumas estruturas morfológicas

dos piolhos mastigadores. Fonte: adaptado de SMITH, 2001.

25

entre os sexos dependendo da espécie. Posuem três pares de patas. O corpo pode variar entre as

espécies de esbranquiçado, castanho claro, castanho escuro e até preto amarronzado.

Normalmente a coloração indica o nível de quitinização do exoesqueleto (KELLOGG, 1913;

BOWMAN, 2010).

Os piolhos desenvolvem-se por hemimetabolia. Os adultos realizam a cópula e a fêmea

é capaz de gerar de um a dois ovos por vez no abdômen (BOWMAN, 2010). Os ovos são postos

nas penas do hospedeiro, preferencialmente em locais relativamente a salvo do bico do

hospedeiro. A localização dos ovos varia com a espécie (DAVIS et at., 1977). A eclosão ocorre

em 4 a 7 dias, da qual surge a ninfa. Esta sofre até 3 ecdises se tornando então um parasito

adulto sem sofrer nenhuma transformação marcante (KELLOGG, 1913; BOWMAN, 2010). A

duração total do ciclo é de aproximadamente 30 a 36 dias (DAVIS et at., 1977).

A grande maioria das espécies de piolhos mastigadores é parasita de aves, embora

também existam espécies parasitando mamíferos. As espécies que parasitam aves possuem duas

garras tarsais na extremidade de todos os seis membros, enquanto as espécies parasitas de

mamíferos, em sua maioria, são distinguidas por possuírem apenas uma garra tarsal. Esta é uma

adaptação relacionada à diferença entre pelos e penas do habitat destes parasitos (KELLOGG,

1913).

Observa-se uma notável diferença na velocidade de deslocamento dos indivíduos com

relação às subordens sobre as penas ou pelos de seus hospedeiros, sendo os pertencentes à

subordem Amblycera os mais ativos (COSTA, 1938).

2.3.1.2. COLONIZAÇÃO NO HOSPEDEIRO

Estudos desenvolvidos com piolhos em diversos países quanto à localização destes no

corpo de seus hospedeiros mostraram que os mesmos podem se localizar em uma zona corporal

ou região bem definida (ASH, 1960; TRIVEDI et al., 1991; GUERRA, 2008).

Em aves de produção, é comum a infestação dos animais por ectoparasitos,

principalmente piolhos. Espécies como Menacanthus stramineus e Menopon gallinae, piolhos

comuns nas galinhas domésticas, são observadas localizando-se no corpo e nas asas de seus

hospedeiros, respectivamente (GARCIA et al. 2001; FERRERO et al, 2004).

Os piolhos mastigadores normalmente passam toda sua vida num mesmo hospedeiro,

no entanto, podem infestar outro indivíduo quando os dois animais mantêm contato, durante

acasalamento, criação dos filhotes nos ninhos ou em casos de muitos indivíduos juntos no

mesmo local (KELLOGG, 1913; DAVIS et at., 1977). Também pode ocorrer destes piolhos

26

serem transportados de um indivíduo a outro por moscas da família Hippoboscidae

(THOMPSON, 1936; COSTA, 1938; DAVIS et at., 1977). Existem ainda registros de piolhos

mastigadores se fixando a pulgas, mosquitos, libélulas e mariposas (DAVIS et at., 1977).

Espécies que se transportam desta forma pertencem usualmente à subordem Ischnocera,

habitualmente a menos ativa e que dificilmente passa para outro hospedeiro por conta própria

(THOMPSON, 1936). Os piolhos mastigadores das aves tendem a ser muito mais ativos que

seus semelhantes que parasitam mamíferos. Isso ocorre pois estão sujeitos ao comportamento

de autolimpeza constante típicos das aves e podem ser predados dessa forma (BOWMAN,

2010).

Raramente ocorrem transmissões interespecíficas e isso se deve a fatores como:

estrutura física das penas, composição química do sangue, diferença de temperatura corporal

do hospedeiro, competição com populações já estabelecidas de outras espécies de piolhos

(DAVIS et at., 1977).

Os piolhos são parasitos bem adaptados e na maioria dos casos não representam um

risco a seus hospedeiros, apenas um inconveniente, embora existam exceções importantes como

o piolho humano do corpo, Pediculus humanus humanus, grande responsável pela propagação

da bactéria Rickettsia prowazekii, causadora do tifo epidêmico. No foco veterinário temos o

exemplo do piolho mastigador do cão Trichodectes canis, hospedeiro intermediário e vetor do

Dipylidium caninum, parasito intestinal de cães e gatos (BOWMAN, 2010).

Uma grande população de piolhos em um hospedeiro é um indicativo de que este

animal não está em boas condições de saúde. Fatores como estresse, nutrição deficiente ou

superpopulação de animais podem ser agravantes nos casos de doença clínica relacionada à alta

infestação por piolhos (BOWMAN, 2010).

Aves com uma infestação muito intensa de piolhos apresentam manifestações clínicas

não muito distintas da época de muda. Apesar de não gerar graves danos, os piolhos

mastigadores, quando presentes em grande número, podem causar intenso prurido, depreciação

da plumagem e quebra de penas. O movimento dos piolhos é irritante ao animal e este pode

causar danos a si mesmo pelo excesso de autolimpeza e arrumação das penas. Além disso,

espécies de piolhos que se alimentam do sangue dos canhões de penas jovens podem prejudicar

o desenvolvimento posterior da pluma (CLAYTON; ADAMS; BUSH, 2008; DAVIS et at.,

1977). Essas condições podem causar mudanças na performance das aves em disputas,

termorregulação, peso, capacidade de sobrevivência e seleção sexual (CLAYTON; ADAMS;

BUSH, 2008).

27

Quando ocorre o óbito do hospedeiro, os piolhos deixam o corpo do animal na tentativa

de encontrarem outro hospedeiro. No entanto, não conseguem se manter vivos por longo tempo,

morrendo dentro de algumas horas, ou, no mais tardar, em alguns dias (WILSON, 1934; DAVIS

et at., 1977). Alguns piolhos podem permanecer no corpo do animal, se fixando a uma bárbula

das penas com suas fortes mandíbulas, sendo então encontrados ali após a morte (KELLOGG,

1913). A morte destes parasitos se deve principalmente à falta de irradiação de calor do corpo

do hospedeiro (WILSON, 1934).

2.3.1.3. COEVOLUÇÃO PIOLHO-HOSPEDEIRO

Embora saiba-se que, via de regra, piolhos são altamente espécie específicos

(BOWMAN, 2010), é possível encontrar uma mesma espécie em distintos hospedeiros, que

apresentam entre si relações mais ou menos estreitas, quer ocupando o mesmo território, quer

povoando locais distantes ou isolados. A distribuição dos piolhos mastigadores em seus

hospedeiros apresenta uma certa fidelidade ao gênero ou família destes hospedeiros, sendo

pouco afetada pela distribuição geográfica ou condições climáticas às quais essas aves estão

submetidas (KELLOGG, 1913; DAVIS et at., 1977).

Kellogg (1913) explica que tal cenário está relacionado com o surgimento da espécie

de piolho antes da diferenciação de seu hospedeiro. Primeiramente surgem as espécies de

piolho. Estas se mantêm nas condições de temperatura e umidade que o corpo de seu hospedeiro

oferece. Quando há diferenciação de espécie da ave hospedeira, estes parasitos acompanham a

nova espécie hospedeira, porém não passam por grandes necessidades de adaptação e co-

evolução. A plumagem, a temperatura do corpo do hospedeiro, praticamente todo o ambiente

dos parasitos continua o mesmo. Nenhum fator externo atua no sentido de modificar a espécie

do parasito, portanto este consegue se manter em sua forma primitiva, comum aos novos

descendentes do antigo hospedeiro.

No entanto, o fator evolucionário do isolamento também tem influência na formação

das espécies de piolhos. Em diversas espécies tem-se uma descrição bastante flexível devido a

pequenas variações que ocorrem em espécimes coletados de diferentes hospedeiros da mesma

espécie, mesma região e até da mesma colônia (KELLOGG, 1913). Isso ocorre porque, apesar

do ambiente destes parasitos não exercer uma pressão para que estes evoluam de determinada

forma, não é possível eliminar mutações espontâneas que venham a ocorrer. Logo, estando estes

parasitos formando uma colônia fechada em sua ave hospedeira, isolados de seus semelhantes

28

pelos limites do corpo da própria ave, estas mutações serão facilmente propagadas nas gerações

seguintes de piolhos geradas naquele hospedeiro (KELLOGG, 1913).

2.3.2. HIPOBOSCÍDEOS

2.3.2.1. CLASSIFICAÇÃO E ASPECTOS MORFOLÓGICOS GERAIS

A família Hippoboscidae Samouelle, 1819 é uma família de moscas (Insecta: Diptera)

constituída por espécies hematófagas parasitos obrigatórias de diversas espécies de mamíferos

e aves (HARBISON et. al., 2009; HARBISON; CLAYTON, 2011). Os membros desta família

compreendem espécies aladas, com boa ou mediana capacidade de voo e, espécies com asas

vestigiais ou ausentes (HUTSON, 1984).

A família Hippoboscidae pertence à super-família Hippoboscoidea. Esta agrupa quatro

famílias de moscas exclusivamente hematófagas na fase adulta. São elas Hippoboscidae,

Nycteribiidae, Streblidae e Glossinidae. A família Hippoboscidae hoje apresenta três

subfamílias (Ornithomyinae, Hippoboscinae e Lipopteninae), 21 gêneros, e 213 espécies

aproximadamente (DICK, 2006). Recentemente constatou-se que as subfamílias

Hippoboscinae e Lipopteninae são grupos monofiléticos (descendentes de um ancestral

comum) (PETERSEN et al., 2007).

Todos os hipoboscídeos são morfologicamente adaptados para uma existência

ectoparasita, com exoesqueletos modificados para tal função. Os adultos podem variar de 1,5 a

12mm de comprimento dependendo da espécie. Apresentam um achatamento dorso-ventral

com função de facilitar o deslocamento entre pelos e penas do hospedeiro. O aparato bucal é

direcionado à frente e não para baixo, com sua probóscide intensamente esclerotizada. A base

da probóscide é parcialmente retraída para dentro de uma bolsa na parte ventral da cabeça

quando não está sendo usada. As patas são robustas com o fêmur largo, tíbia achatada e tarso

compacto (LLOYD, 2002). Espécies que infestam aves usualmente apresentam patas adaptadas

para correndo rapidamente para frente, para trás e para os lados no meio da pluma macia,

enquanto espécies parasitando mamíferos apresentam patas adaptadas para agarrar a pele e

pêlos grossos (BEQUAERT, 1953). Os olhos normalmente são bem desenvolvidos nas espécies

que apresentam asas funcionais, enquanto nas espécies com asas vestigiais ou ausentes os olhos

são bastante reduzidos. As antenas são pequenas e imóveis, localizadas no sulco antenal

(LLOYD, 2002).

29

Hipoboscídeos tem uma estimativa de vida de aproximadamente 80 a 100 dias de vida

(NELSON et al, 1975). Pouco se sabe sobre a biologia reprodutiva destas moscas, porém, ao

contrário da maioria dos insetos, os hipoboscídeos apresentam uma particularidade quanto ao

desenvolvimento larvar. Nesta família, grande parte do desenvolvimento das larvas ocorre

dentro do abdômen materno e a pupação ocorre quase imediatamente após a fêmea realizar a

postura das larvas (HUTSON, 1984). O estágio de pupa é o único que ocorre fora do hospedeiro

(NELSON et al., 1975) .

2.3.2.2. COLONIZAÇÃO NO HOSPEDEIRO E TRANSMISSÃO DE AGENTES

INFECCIOSOS

Diversas espécies de animais sofrem espoliação sanguínea pelos hipoboscídeos. Estas

moscas podem se alimentar em seu hospedeiro várias vezes durante o dia e, dependendo da

quantidade infestante, este hospedeiro pode ter sua saúde significativamente prejudicada,

podendo apresentar anemia (JONES, 1985) ou, no caso de filhotes, retardo em seu

desenvolvimento (BISHOPP, 1929).

Além de efeitos diretos sobre o hospedeiro, estes dípteros também são vetores de agentes

infecciosos (protozoários, helmintos, bactérias e possivelmente vírus). São responsáveis pela

transmissão de alguns tripanossomatídeos para mamíferos (BAKER, 1967; OYIEKE; REID,

2003) e é provável que também transmitam tripanossomas aviários (KUCERA, 1983). Além

disso, as moscas da família Hippoboscidae são os únicos vetores conhecidos do hemosporídeo

Haemoproteus (LEVIN et al., 2011) e, uma vez infectadas por hemosporídeos, aves podem

permanecer infectadas por muitos anos ou por toda a vida (GARNHAM, 1966; VALKIUNAS,

2005).

Populações de vida livre normalmente apresentam baixa susceptibilidade a doenças

causadas por hemoparasitos (Haematozoa). No entanto, tem-se observado que hematozoários

exercem certa influência na estrutura e conservação de comunidades de aves (QUILLFELDT

et al, 2010).

Embora a maioria dos hippoboscídeos seja capaz de voar e passar de um hospedeiro a

outro, ainda pouco se sabe sobre sua capacidade de dispersão. É admissível que o movimento

das aves marinhas hospedeiras seja o grande responsável pela dispersão destas moscas entre

ilhas (LEVIN; PARKER, 2013). Em relação às fragatas, mesmo que estas sejam filopátricas ao

local onde nasceram (METZ; SCHREIBER, 2002; DEARBORN et al., 2003), o movimento

dos juvenis até que atinjam a idade reprodutiva por volta dos cinco anos é desconhecido e

30

poderia estar facilitando a dispersão destes e de outros parasitos para outros locais (LEVIN;

PARKER, 2013).

2.4. ECTOPARASITOS EM Fregata magnificens

Existem até o momento seis espécies descritas em literatura de piolhos mastigadores

encontrados na família Fregatidae, sendo que destes, quatro possuem registro em Fregata

magnificens Mathews, 1914. São eles: Colpocephalum spineum Kellogg, 1899, Fregatiella

aurifasciata Kellogg, 1899, Pectinopygus fregatiphagus Eichler, 1943, e Pectinopygus

gracilicornis Piaget, 1880. Apesar de se saber que piolhos de modo geral são espécie

específicos, algumas destas espécies de piolhos já foram registrados em diferentes hospedeiros

da família Fregatidae (Tabela 1).

No Brasil, Tendeiro (1989) documentou a presença da espécie Colpocephalum

ehrhardti em Santa Catarina. No entanto, posteriormente esta nomenclatura foi invalidada por

ser sinonímia de C. spineum (PHTHIRAPTERA.INFO).

Tabela 1: Espécies de piolhos mastigadores já descritos na família Fregatidae.

Espécies de piolho Espécies de fragata hospedeira

1. Colpocephalum angulaticeps Fregata ariel

Fregata minor

2. Colpocephalum spineum Fregata aquila

Fregata magnificens

3. Fregatiella aurifasciata Fregata andrewsi

Fregata aquila

Fregata ariel

Fregata magnificens

Fregata minor

4. Pectinopygus crenatus Fregata aquila

5. Pectinopygus fregatiphagus Fregata magnificens

6. Pectinopygus gracilicornis Fregata minor

Fregata ariel

Fregata magnificens

31

A espécie Pectinopygus fregatiphagus, foi relatada em fragatas do Zoológico do estado

de São Paulo por Valim e colaboradores em 2005.

Além de piolhos mastigadores, outros ectoparasitos já descritos em fragatas são

exemplares da Família Hippoboscidae (GRACIOLLI; CARVALHO, 2003). Estudos em

Galápagos mostram que os dípteros desta família pertencentes ao gênero Olfersia

frequentemente parasitam fragatas e outras espécies marinhas, como por exemplo atobás. A

espécie Olfersia spinifera Leach, 1817 já foi registrada em todas as espécies de fragatas e até o

momento se mantém exclusiva a estas aves, nunca tendo sido documentada parasitando outras

espécies de aves marinhas (LEVIN; PARKER, 2013). No Brasil tem-se registro deste díptero

em Fregata magnificens, no estado do Paraná (GUIMARÃES, 1945; GRACIOLLI;

CARVALHO, 2003).

A mosca O. spinifera, é apontada como principal responsável pela transmissão do

protozoário hemoparasito Haemoproteus iwa para membros da família fregatidae (LEVIN et

al., 2011). As aves marinhas em geral são normalmente pouco afetadas por parasitos

sanguíneos, mesmo quando potenciais vetores estejam presentes. No entanto, fragatas parecem

ser mais suscetíveis a adquirir estes parasitos. Quatro das cinco espécies conhecidas de fragatas

(F. andrewsi, F. minor, F. magnificens, e F. aquila) já foram encontradas infectadas por

Haemoproteus (MADSEN et al., 2007; MERINO et al., 2012). Fragatas da espécie F.

andrewsi, residentes da Ilha do Natal (Christmas Island), parte do território australiano, foram

documentadas apresentando uma alta prevalência (56%) de Haemoproteus (QUILLFELDT et

al., 2010).

Um outro estudo realizado com Fregata minor nas Ilhas Galápagos apontou que

aparentemente todas as fragatas de vida livre desta espécie residentes das ilhas apresentam pelo

menos um exemplar desta mosca parasitando seu corpo. Este mesmo estudo também utilizou

alguns exemplares de Fregata magnificens residentes das ilhas para comparação, informando

que foi encontrada a mesma espécie de mosca nas duas espécies de fragata, no entanto os

autores colocam F. magnificens como um hospedeiro alternativo de O. spinifera (LEVIN;

PARKER, 2013).

2.5. DIAGNÓSTICO DOS ECTOPARASITOS

A pesquisa de ectoparasitos em animais, tanto domésticos como selvagens, é de

fundamental importância para a saúde e bem-estar destes animais, visto que os ectoparasitos

32

são em sua maioria prejudiciais a seu hospedeiro e podem atuar como vetores de

microorganismos patogênicos, desencadeando processos infecciosos diversos.

Embora existam diversas formas de diagnóstico parasitológico, o diagnóstico de

amostras de ectoparasitos coletadas a campo é primariamente realizado baseando-se na

morfologia observada. Para uma identificação mais precisa do agente pode-se lançar mão de

vários artifícios disponíveis, desde a utilização de microscopia ótica (PALMA, 1978), um dos

métodos mais antigos usados na identificação e classificação de organismos, até métodos mais

avançados como microscopia eletrônica de varredura (UBELAKER et al., 1973) ou biologia

molecular (RIVERA-PARRA, et al., 2015).

A técnica correta a ser escolhida para o diagnóstico dos parasitos depende de vários

fatores, como qualidade do material, modo como foi coletado, armazenamento e preservação.

Para técnicas como a microscopia óptica ou microscopia eletrônica é importante que o

ectoparasito coletado esteja inteiro, sem quebras ou amassados, pois será analizada a morfologia

e características de superfície do espécime, não podendo estas estarem alteradas ou danificadas.

Já para técnicas como a biologia molecular não há a preocupação com a integridade do

espécime, mas sim com seu armazenamento, preservação e possíveis contaminações. Neste

caso, a técnica utiliza o código genético do parasito, portanto podem ser utilizados espécimes

danificados ou mesmo apenas partes dos espécimes. O importante para esta técnica é que o

material genético seja devidamente conservado, preferencialmente congelado e longe de

contaminações.

33

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVOS GERAIS

Avaliar a ocorrência de ectoparasitos de Fregata magnificens (Aves: Suliformes:

Fregatidae) provenientes do litoral do Rio de Janeiro e São Paulo recolhidas por centros de

reabilitação de animais silvestres.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar as espécies de ectoparasitos de fragatas de centros de reabilitação de animais

silvestres através de microscopia óptica.

Identificar os locais de predileção dos ectoparasitos no corpo do hospedeiro (tegumento,

penas, plumas e região corporal);

Avaliar a intensidade de infestação dos ectoparasitos nas aves.

Verificar associação entre estado geral e sinais clínicos apresentados pelo hospedeiro e

intensidade de infestação por ectoparasitos neste.

Utilizar técnicas de biologia molecular para auxiliar na identificação e/ou confirmação

das espécies de ectoparasitos.

34

4. MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

Universidade Federal Fluminense sob o n° 846 (Anexo 1). Foram avaliadas amostras de

fragatas da espécie F. magnificens em dois centros de reabilitação de animais silvestres no

período de outubro de 2016 até outubro de 2017.

4.1. LOCAIS DE COLETA

Os animais utilizados neste estudo foram animais resgatados em seu ambiente natural

nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo e encaminhados para o Centro de Reabilitação e

Triagem de Animais Aquáticos (CRETA) e para o Centro de Reabilitação de Animais Silvestres

(CRAS).

Em Ubatuba, São Paulo, o Instituto Argonauta para Conservação Costeira e Marinha,

em parceria com o Aquário de Ubatuba, gerencia o CRETA. Este recebe animais marinhos

debilitados, entre aves, mamíferos e quelônios, resgatados do litoral de Ubatuba e redondezas.

Este trabalho de recolhimento dos animais é realizado pela equipe do Programa de

Monitoramento de Praias (PMP), que percorrem faixas litorâneas da redondeza fazendo este

resgate e eventualmente recolhendo também carcaças de animais quando estas são encontradas.

O objetivo do CRETA é atender aos encalhes de fauna, com ênfase para mamíferos aquáticos,

peixes, quelônios e aves, realizando a reabilitação e posterior reintrodução destes à natureza

(INSTITUTO, 2014).

O outro local colaborador do projeto foi o CRAS, parte da Universidade Estácio de Sá,

localizado em Vargem Pequena no Rio de Janeiro. O CRAS recebe todo tipo de animal da fauna

brasileira, inclusive animais marinhos, resgatados pela patrulha ambiental do estado do Rio de

Janeiro ou provenientes de clinicas veterinárias que não possam dar suporte aos animais.

35

Tanto o CRETA quanto o CRAS se interessaram pela parceria proposta por

entenderem que este estudo objetivou enriquecer seus conhecimentos e auxiliá-los no processo

de reabilitação dos animais. Ambos os centros mencionados disponibilizaram os parasitos das

fragatas que chegaram à reabilitação durante o período do estudo.

Todas as amostras analisadas e dados coletados foram cedidos por meio de doação

pelos centros de reabilitação participantes do estudo (Anexos 2 e 3).

4.2. MÉTODO DE COLETA

Foram coletadas amostras de fragatas da espécie Fregata magnificens provenientes do

CRETA em São Paulo e do CRAS no Rio de Janeiro.

Embora as coletas tenham, em sua maioria, sido coletadas pelos responsáveis por este

estudo, algumas tiveram de ser executadas pelos veterinários e funcionários dos centros de

reabilitação. Nestes casos, nem sempre elas se desenvolviam da forma ideal, muitas vezes

faltando dados a serem anotados na ficha de coleta de amostras e algumas vezes não se

preocupando em coletar todos os ectoparasitos possíveis.

Todos os animais que chegavam aos centros de reabilitação eram avaliados pelos

veterinários de plantão quanto ao escore corporal, grau de atividade de acordo com a espécie,

presença de ferimentos ou infecções notáveis e estado geral para determinação de sua condição

clínica. As fragatas eram julgadas para definir se estavam em condições de passar pelo

procedimento de coleta dos ectoparasitos sem que isso prejudicasse sua saúde. Caso o animal

estivesse extremamente debilitado, em condições de saúde bastante comprometida, não era

permitida a realização da coleta, já que o objetivo primário das instituições é a preservação da

vida e reabilitação dos animais para sua devolução à natureza. No entanto, nenhum animal se

encontrou nestas condições durante o período de coleta.

Todas as aves utilizadas foram previamente identificadas nos centros de reabilitação.

Foi elaborada uma ficha para a coleta das amostras com informações pertinentes ao estudo

como: sexo, idade, peso, local onde animal foi encontrado, tempo em que animal ficou em

cativeiro até a realização da coleta, se o recinto do animal era solitário ou se havia outros

animais da mesma espécie ou de outras espécies, estado geral do animal e região corporal onde

foi observada a presença de ectoparasitos (Anexo 3).

A plumagem e partes do corpo (cabeça, pescoço, corpo, asas, cauda, bico, pés) de

todas as aves foram verificadas visualmente durante aproximadamente dois minutos em busca

36

de locais de predileção dos ectoparasitos. Esta informação foi registrada na ficha antes do início

das coletas (Figura 7).

A coleta dos ectoparasitos foi efetuada através de um método simples desenvolvido

durante o período da pesquisa para se adequar ao tamanho da ave e às condições de trabalho

oferecidas pelas instituições. O animal era colocado em um recipiente plástico de tamanho

compatível e então era polvilhado com talco ectoparasiticida à base de Carbaryl e Cipermetrina

da marca Talfon top®. Em aproximadamente 5 minutos os parasitos presentes nas penas e pele

das aves começavam a cair no fundo do recipiente, podendo então ser coletados (Figura 8).

Após a queda dos parasitos a fragata era devolvida a seu recinto. A caixa cheia de pó

ectoparasiticida e com os ectoparasitos era então vertida cuidadosamente para que todo seu

conteúdo caísse dentro de um recipiente plástico de tampa rosqueada. Evitava-se a utilização

de pinças para a coleta pois poderiam danificar os espécimes. Não se adicionava nenhum tipo

de conservante à amostra neste momento para não prejudicar os diferentes experimentos a se

seguir. As amostras eram apenas refrigeradas até este material ser levado ao laboratório de

parasitologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), geralmente no dia seguinte à coleta

ou no máximo dois dias após a coleta (nestes casos o material coletado era mantido congelados).

Figura 7: Observação de ectoparasitos na

plumagem da fragata antes do início da coleta. Seta

aponta presença de um piolho.

37

Algumas das fragatas que chegaram aos centros de reabilitação estavam muito

debilitadas e acabaram indo a óbito ou sendo submetidas a eutanasia sem que a coleta dos

ectoparasitos fosse feita. Nos casos em que a carcaça havia sido congelada logo em seguida ao

óbito do animal, foram realizadas coletas post-mortem. A carcaça era então verificada em busca

dos locais de predileção dos parasitos, semelhantemente ao realizado nos animais in vivo.

Quando um parasito era encontrado este era coletado com uma pinça e também acondicionado

em um recipiente plástico de tampa rosqueada. Nestes casos não era possível executar o mesmo

procedimento realizado nos animais in vivo pois as carcaças estavam congeladas e úmidas, bem

como os parasitos, ficando estes aderidos às penas, não sendo possível fazer com que os

mesmos caíssem sozinhos das penas para um recipiente. Sendo assim, fez-se necessária a

utilização de uma pinça para as coletas.

Após serem levados ao laboratório, o material coletado era lavado com água destilada

em uma peneira de 0,150 mm de malha para separar os parasitos do pó e das sujidades. Os

espécimes de ectoparasitos coletados eram então divididos em duas amostras. Uma amostra era

Figura 8: Fragata em recipiente plástico após

aplicação de ectoparasiticida.

38

conservada em álcool 70% para clarificação e identificação morfométrica por microscopia de

luz. A outra era congelada para processamento por técnicas de Biologia Molecular.

No total foram coletadas amostras de cinco fragatas do CRETA, em São Paulo, estas

todas pelos veterinários do local, e dez do CRAS, no Rio de Janeiro, todas pelos responsáveis

deste estudo.

4.3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS

4.3.1. ESTUDO MORFOMÉTRICO EM MICROSCOPIA DE LUZ

O processamento dos piolhos foi realizado nos Laboratórios da Disciplina de

Parasitologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Instituto Biomédico, Niterói, RJ. Os

parasitos passaram por técnicas de clarificação e montagem em lâminas e foram analisados

morfometricamente para identificação.

Em análise macroscópica observou-se diferenças entre os piolhos coletados, a começar

por sua coloração, que correspondia ao seu nível de quitinização. Em função desta diferença de

quitinização o protocolo utilizado, descrito por PALMA (1978), foi modificado. Os piolhos

mais escuros eram retirados do álcool e colocados em solução de Hidróxido de Potássio (KOH)

a 10% onde ficavam por no mínimo 24hs para clarificação. Os mais claros foram submetidos à

solução de KOH a 5% também por 24hs.

Após as 24hs os piolhos eram retirados do KOH e passavam por um processo de

lavagem para retirar completamente os resíduos desta solução. Para isso ficavam em água

destilada por 30 minutos e, então, em ácido acético por mais 30 minutos com o intuito de

neutralizar a substância alcalina remanescente. Em seguida passava-se para a fase de

desidratação, onde os parasitos eram colocados em álcool 70% por 24 horas e, após este

primeiro período, passavam álcool 80% e em seguida para o 90% ficando por 30 min em cada

um. Finalmente passavam para álcool absoluto, sendo deixados por 24hs. Após a desidratação

os parasitos eram imersos em Creosoto de Faia para a etapa de diafanização, onde ficaram por

mais 24h, o que os conferia um contraste adequado para a observação no microscópio óptico.

Por fim, os piolhos eram retirados do creosoto para serem finalmente montados em lâminas

permanentes.

Os piolhos foram montados em lâminas de microscopia, junto com um pouco do

creosoto onde estavam imersos. Pingava-se então de uma a três gotas de Bálsamo do Canadá

Natural sobre o piolho, em seguida ajustando-o na lâmina para evidenciar melhor todas as

39

estruturas importantes para sua identificação. Posicionava-se então a lamínula sobre a amostra,

esta espalhando o Bálsamo uniformemente e mantendo o piolho na posição desejada. As

lâminas eram observadas rapidamente ao microscópio para verificar se a técnica prosseguiu

corretamente, fazendo ajustes da lamínula quando necessário. Em seguida eram guardadas para

a secagem do Bálsamo. Todo o processo para a montagem das lâminas foi realizado em

temperatura ambiente. A secagem das lâminas levava de três semanas a um mês, podendo então

ser analisadas.

As lâminas foram observadas em microscópio óptico Zeiss Primo Star. Os piolhos

foram medidos com micrômetro ocular. Para identificação dos gêneros seguiu-se as chaves de

identificação de PRICE et al. (2003). A identificação das espécies foi baseada em Price (1967),

Ryan e Price (1969), Eichler, (1943) e Kellogg (1899).

4.3.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR

As amostras foram analisadas no Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos da

Universidade Federal Fluminense e o sequenciamento foi realizado na Plataformas de

Sequenciamento Sanger (RPT01-A) da rede de plataformas tecnológicas - Fiocruz.

Selecionaram-se algumas amostras para este ensaio: da amostra coletada da fragata 12

- 014-RJ, utilizou-se um espécime de Pectinopygus fregatiphagus e um espécime de

Colpocephalum spineum; da amostra coletada da fragata 13 - 015-RJ, utilizou-se dois

espécimes de Pectinopygus fregatiphagus, dois espécimes de Colpocephalum spineum e um

espécime de Fregatiella aurifasciata. Para esta amostra também foi feito um pool com 5

espécimes de Pectinopygus fregatiphagus. Foi dada uma codificação para o ensaio molecular,

totalizando 8 amostras analisadas (Tabela 2).

As oito amostras de piolhos foram maceradas com auxílio de grau e pistilo usando-se

nitrogênio líquido. No macerado foi extraído o DNA com o kit comercial Purelink Genomic

DNA Kits (Invitrogen) segundo o protocolo do fabricante para extração de tecido. Para PCR

foram usados dois pares de primers distintos.

40

Tabela 2: Descrição e codificação das amostras usadas no ensaio molecular.

Amostra Espécime Código para o ensaio

molecular.

12-014-RJ Pectynophygus fregatiphagus 014-P1

Colpocephalum spineum 014-C1

13-015-RJ

Pectynophygus fregatiphagus 015-P1

Pectynophygus fregatiphagus 015-P2

Pool de Pectynophygus fregatiphagus 015-P3



Fregatiella aurifasciata 015-F1

Para amplificar um fragmento do gene COI, um marcador mitocondrial da subunidade

I da Citocromo Oxidase, comumente usado em insetos, foram utilizados os primers L6625 (5'-

COG GAT CCT TYT GRT TYT TYG GNC AYC C-3') e H7005 (5' –CCG GAT CCA CAN

CRT ART ANG TRT CRT G-3') descritos por Hafner et al., 1994 com a seguinte condição:

tampão [1X], Mg [1.5mM], dNTP [0.2mM], [200ng] de cada primer; 2.5U de Taq platinum

(Invitrogen) e 5µl de DNA. A ciclagem usada foi: 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos

à 94°C durante 30 segundos, 46°C durante 30 segundos e 72°C durante 30 segundos, e uma

extensão final a 72°C por 7 min.

Para amplificar a região EF1- α foram utilizados os primers EF1-For3 (5'-GGN GAC

AAY GTT GGY TTC AAC G-3') e Cho 10 (5'-AC RGC VAC KGT YTG HCK CAT GTC-3')

descritos por Danforth e Ji (1998), com as mesmas concentrações dos reagentes descritos

anteriormente. Contudo, a ciclagem usada foi: 4 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos de 94°C

durante 20 segundos, 45°C durante 30 segundos e 72°C durante 50 segundos, e então uma

extensão final à 72°C durante 5 min.

Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% em

tampão TAE 1X, acompanhadas de marcador molecular de 100pb (Ludwig Biotecnologia®).

Posteriormente à amplificação, os geis foram corados com Brometo de Etídio e as amplificações

visualizadas e fotodocumentadas (L-Pix, Loccus®). Os produtos amplificados foram

purificados com o KitWizards SVGel and PCR Clean-Up System (Promega), seguindo o

protocolo do fabricante. As amostras foram preparadas para sequenciamento direto com o kit

Big Dye Terminator (Applied Biosystems®). O sequenciamento foi realizado na Plataformas

41

de Sequenciamento Sanger (RPT01-A) da rede de plataformas tecnológicas - Fiocruz. As

sequências foram editadas e analisadas com o auxílio do programa de Bioinformática Chormas

v.2.1.1 e Bioedit v.7.1.9. As sequências obtidas foram comparadas com aquelas depositadas no

Genbank através da ferramenta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

42

5. RESULTADOS

Das 15 fragatas da espécie Fregata magnificens analisadas, 14 (93,3%) foram

positivas para a presença de ectoparasitos. Duas das 15 (13,3%) coletas foram realizadas post-

mortem coletando-se os parasitos da carcaça congelada pois os animais vieram a óbito antes

que pudesse ser realizada a coleta in vivo. Das 13 coletas in vivo, apenas ums ave (6,67%) se

apresentou negativa para a presença de ectoparasitos.

Das 15 fragatas que foram encaminhadas aos centros de reabilitação, oito (53,3%)

apresentavam ferimentos em asa. Três (20%) foram encontradas encharcadas. As demais

fragatas (quatro animais, 26,7%) não possuem um histórico muito elucidativo e chegaram aos

centros por estarem debilitadas, conforme pode ser observado na Tabela 3.

Não se conseguiu estabelecer uma relação entre estado geral e sinais clínicos

apresentados pelo hospedeiro e intensidade de infestação por ectoparasitos pois a coleta de

dados nos centros de reabilitação foi deficiente. As fichas dos animais nos centros, em sua

maioria não descrevia os sinais clínicos que o animal apresentava, apenas fazia breves

comentários sobre estado geral no momento de sua chegada ao centro. Porém, observou-se que

mesmo os animais debilitados e com estado geral ruim não apresentaram grande quantidade de

ectoparasitos e, o animal que apresentou uma quantidade de ectoparasitos muito acima dos

demais tinha estado geral ótimo e foi posteriormente reabilitado e devolvido à natureza.

Ao todo foram coletados 238 espécimes de piolhos. Não se observou nenhum outro

ectoparasito além de piolhos mastigadores.

43 Tabela 3: Relação de fragatas (Fregata magnificens) analisados com separação por sexo, motivo da reabilitação, presença ou não de outros animais

no mesmo recinto, tempo em cativeiro no momento da coleta dos ectoparasitos, e quantidade de ectoparasitos coletados, provenientes do CRETA

em São Paulo e do CRAS no Rio de Janeiro no período de outubro de 2016 a outubro de 2017.

Amostra e

origem

Sexo da

Fragata

Motivo da reabilitação Estado

geral

Companheiros de recinto Tempo em

cativeiro

Quantidade de

ectoparasitos

1 - 000 SP Juvenil Debilidade Ruim Nenhum 7 dias 13

2 - 001 RJ Macho Encharcado Bom 1 Fragata 17 dias 27

3 - 002 RJ Macho Fratura em asa Ruim 1 Fragata 7 dias 1

4 - 003 RJ Fêmea Debilidade Regular 1 Fragata 2 dias 20

5 - 004 RJ Macho Ferimento em asa Regular 1 Fragata 2 dias 8

6 - 005 SP Fêmea Ferimento em asa e encharcado Ótimo 1 Fragata + 1 Gaivota + 1 Biguá 11 dias 3

7 - 006 SP Macho Ferimento em asa Regular 1 Fragata + 1 Gaivota + 1 Biguá 32 dias 8

8 - 007 RJ Fêmea Debilidade Regular Nenhum 2 dias 37

9 - 008 RJ Macho Fratura em asa Regular Nenhum 1 dias 25

10 - 009 RJ Fêmea Ferimento em asa Bom Nenhum Necrópsia 24

11 - 012 RJ Macho Ferimento em asa Regular Nenhum 3 dias 0

12 - 014 RJ Macho Debilidade Regular Nenhum Necrópsia 9

13 - 015 RJ Fêmea Ferimento em asa Ótimo 1 Atobá pardo 2 dias 63

14 - 016 SP Fêmea Encharcada Bom Nenhum 6 dias 4

15 - 017 SP Juvenil Encharcado Ótimo Nenhum 2 dias 4

44

5.1. DIAGNÓSTICO POR MICROSCOPIA DE LUZ

Na microscopia de luz, os piolhos com a antena escodida e palpos maxilares presentes

foram identificados como pertencentes à subordem Amblycera. Já os com a antena livre e

ausência de palpos maxilares foram identificados como pertencentes à subordem Ischnocera.

Os espécimes foram identificados como 3 espécies distribuídas em 3 gêneros distintos.

Para identificação dos gêneros dos piolhos seguiu-se a as chaves de identificação de

Price e colaboradores (2003). Para chegar-se à nomenclatura das espécies baseou-se em Price

(1967), Ryan e Price (1969), Eichler, (1943) e Kellogg (1899). Foram identificadas as espécies

Colpocephalum spineum (Figuras 9 e 10), Fregatiella aurifasciata (Figura 11) e Pectinopygus

fregatiphagus (Figura 12).

As características morfológicas que permitiram a identificação de tais espécies de

acordo com suas descrições em literatura foram:

Colpocephalum spineum: Machos – Cabeça com largura média de 0,48mm,

formato quase quadrangular. Antenas e palpos levemente projetados para além

da margem da cabeça. Temporas largas com margens laterais plana e convexa

com várias cerdas de vários comprimentos, pelo menos dois longos. Margem

occipital amplamente côncava. Borda occipital marrom dourada pálida com

faixa marrom escura terminando em triângulos marrons enegrecidos nas bases

das bandas occipitais. Manchas oculares grandes e manchas distintas em cada

lado do “rami” dianteiro das mandíbulas que se estendem diagonalmente para

a margem frontal. Corpo com comprimento médio de 1,28mm. Corpo

alongado, estreito, com lados subparalelos. Cor marrom dourado pálido.

Marcas laterais castanhas no abdomen bastante características. Protórax curto,

com espinho e cerdas longas em cada ângulo lateral. Metatórax mais longo do

que protórax, quase tão largo quanto abdômen. Vários espinhos em uma linha

dupla ao longo das margens laterais. Tórax de cor marrom pálido. Pernas de

mesma cor do tórax, com marcações marrom escuro perto das extremidades

distai do fêmur e das tíbias. (Figura 9).

45

Fêmeas – Cabeça com largura média de 0,46mm, mais estreita e mais

arredondada anteriormente com um par de placas ventroanterior menos

evidente que o do macho. Abdomen com cerdas marginais de comprimento

uniforme, exceto cerdas pós espiraculares. Cerdas pós espiraculares bastante

longas nos tergitos II, III e VIII. Nos demais tergitos (I e IV – VII) são bem

curtas. Último tergito com 1 cerda bem longa em cada lado, com um total de 4

cerdas curtas latero-anteriormente a estas e 1 cerda posterior interna curta.

Divisões incompletas do Tergito II. Tergitos III a VIII completamente

tripartidos. Comprimento total 1,51mm. Demais estruturas em sua maioria

semelhantes ao macho (Figura 10).

Figura 9: Macho de Colpocephalum spineum (subordem Amblycera). A) Visão geral. Barra

lateral: 243,3 μm. B) Foco na cabeça para melhor visualização das estruturas. Barra lateral:

69,2 μm.

A B

46

Fregatiella aurifasciata: Fêmeas – Cabeça com largura média de 0,63mm.

Formato de meia lua com bordas suaves e convexas. Antenas com uma

constrição definida entre o 3° e o 4° segmento. Quatro cerdas bem longas e

várias curtas em cada têmpora. Margem occipital côncava com seis cerdas

relativamente longas. Cor branco-amarelada com manchas oculares escuras e

pequenas manchas marrons dentro das cavidades antenais. Comprimento total

médio de 1,99mm. Corpo de cor esbranquiçada com bandas abdominais

transversais amareladas. Superfície dorsal do abdomen apresenta muitas cerdas

em séries transversais. Protórax bem grande, com três espinhos curtos e uma

longa cerda na margem arredondada dos ângulos laterais. Cinco cerdas longas

em cada metade da margem posterior do protórax. As margens laterais são

mais escuras do que o resto do segmento. Apresenta uma barra de quitina

transversal evidente e de mesma cor do resto da estrutura e duas barras

longitudinais curvas em suas extremidades de cor mais escura. Metatórax tão

curto quanto ou mais curto que protórax. Ângulo posterior apresentando vários

pequenos espinhos. Margem posterior ligeiramente convexa, quase plana

apresentando, da lateral para o centro, duas longas cerdas, um espinho e então

mais oito longas cerdas em cada metade. Patas de cor pálida com marcas

marginais mais escuras.

A B C

Figura 10: Fêmea de Colpocephalum spineum (subordem Amblycera). A) e B) Visão geral

mostrando variação de tamanho dos piolhos. Barra lateral: 243,3 μm. C) Foco em abdômen

mostrando Tergito II com divisões incompletas (setas vermelhas), diferentemente de demais

tergitos, que apresentam divisões completas (seta preta). Barra lateral: 98,8 μm.

47

Machos – Cabeça com largura média de 0,58mm. Comprimento total médio

de 1,74mm. Último tergito com deslocamento de cerdas dorsalmente. Demais

estruturas em sua maioria semelhantes às da fêmea (Figura 11).

Pectinopygus fregatiphagus: Machos - Largura média da cabeça 0,39mm.

terceiro segmento da antena com um apêndice. Comprimento total médio de

3,12mm. Metatórax apresenta seis longas cerdas, cinco próximas e uma

afastada.

Figura 11: Fregatiella aurifasciata (subordem Amblycera). A) Visão geral da

fêmea. Barra lateral: 314,6 μm. B) Setas apontando para a constrição da antena

entre o 3° e o 4° segmento. Barra lateral: 94,8 μm C) Protórax apresentando

uma barra de quitina transversal evidente e duas barras longitudinais curvas em

suas extremidades. Barra lateral: 110,0 μm D) Visão geral do macho. Barra

lateral: 314,6 μm

A B

C D

48

Fêmeas – Largura da cabeça 0,50mm. Comprimento total médio de 3,10mm.

(Figura 12).

As espécies, quantidade, intensidade média de infestação e os respectivos hospedeiros

dos piolhos encontrados está relacionada nas Tabelas 4 e 5. A morfometria dos espécimes está

relacionada na tabela 6.

As amostras coletadas nas fragatas do CRETA, em São Paulo, apresentaram apenas

duas das três espécies encontradas: Fregatiella aurifasciata e Pectinopygus fregatiphagus. Já

nas amostras coletadas no CRAS, Rio de Janeiro, foram encontradas as três espécies de piolho.

Identificou-se uma predileção das três espécies pelas penas da região de dorso e ventre

do animal. As três espécies foram observadas nesta região. Alguns poucos exemplares foram

observados caminhando em direção ao pescoço das aves, porém não parecia ser um local de

preferência destes parasitos. Não se observou piolhos no tegumento, apenas nas plumas.

Também não foram observados piolhos em bico, patas ou extremidades (penas das asa ou da

cauda).

Em 2 animais observou-se no dorso a presença dos piolhos em maior quantidade, mas

estes se encontravam com facilidade por todo o corpo, exceto nos locais sem penas (pés, face e

bico) e nos locais onde as penas já não eram aquecidas pela irradiação do calor corporal (penas

das asas e penas da cauda).

Figura 12: Pectinopygus fregatiphagus (Subordem Ischnocera). A) Visão geral do macho.

Barra lateral: 154,6 μm B) Setas apontando para apêndice no 3° segmento da antena do

macho. Barra lateral: 467,3 μm C) Visão geral da Fêmea. Barra lateral: 467,3 μm

A B C

49

Tabela 4: Espécies e quantidade de piolhos mastigadores coletados de 15 fragatas (Fregata

magnificens) provenientes do CRAS - RJ e do CRETA – SP no período de outubro de 2016 a

outubro de 2017, relacionadas de acordo com o hospedeiro e frequência de positividade de

piolhos nos animais.

Amostra e

origem

Colpocephalum

spineum

Fregatiella

aurifasciata

Pectinopygus

fregatiphagus

Total

1 - 000 – SP - 3 10 13

2 - 001 – RJ - 15 12 27

3 - 002 – RJ - - 1 1

4 - 003 – RJ 5 1 14 20

5 - 004 – RJ - 1 7 8

6 - 005 – SP - - 3 3

7 - 006 – SP - 2 6 8

8 - 007 – RJ 2 5 30 37

9 - 008 – RJ 2 1 22 25

10 - 009 – RJ 8 5 11 24

11 - 012 – RJ - - - -

12 - 014 – RJ 2 3 4 9

13 - 015 – RJ 9 3 51 63

14 - 016 – SP - - 4 4

15 - 017 - SP - - 4 4

Total 28 39 171 238

Frequência de

positividade

6 (40%) 10 (66,7%) 14 (93,3%) 14 (93.3%)

Tabela 5: Espécies de piolhos mastigadores e quantidades mínimas, máximas e médias

encontradas em 15 fragatas (Fregata magnificens), provenientes do CRAS – RJ e do CRETA

– SP no período de outubro de 2016 a outubro de 2017.

Espécie de piolho Mínimo Máximo Média

Colpocephalum spineum 0 9 1,87

Fregatiella aurifasciata 0 15 2,6

Pectinopygus fregatiphagus 0 51 11,4

50

Colpocephalum spineum Fregatiella aurifasciata Pectinopygus fregatiphagus

Média encontrada Literatura Média encontrada Literatura Média encontrada Literatura

M F M F M F M F M F M F

Comprimento

total

1,28mm 1,51mm 1,53mm Sem

dados

1,74mm 1,99mm Sem

dados

2,19mm 2,89mm 2,76mm 2,50mm -

3,12mm

2,40mm -

3,10mm

Largura total 0,43mm 0,57mm 0,44mm Sem

dados

0,71mm 0,99mm Sem

dados

1,03mm 0,28mm 0,49mm 0,29mm -

0,37mm

0,53mm -

0,69mm

Comprimento

da cabeça

0,34mm 0,34mm 0,34mm Sem

dados

0,34mm 0,35mm Sem

dados

0,31mm 0,68mm 0,72mm 0,58mm -

0,66mm

0,63mm -

0,69mm

Largura da

cabeça

0,48mm 0,46mm 0,47mm Sem

dados

0,58mm 0,63mm Sem

dados

0,70mm 0,36mm 0,48mm 0,29mm -

0,39mm

0,41mm -

0,50mm

Tabela 6: Morfometria das espécies de piolhos encontradas, separados por machos e fêmeas, relacionada com o descrito em literatura.

51

Observou-se que as três espécies de piolhos coletadas são bastante ativas, movendo-se

rapidamente pelo corpo do animal quando este era revistado.

Não foram encontrados Hippoboscídeos ou outros tipos de ectoparasitos além dos

piolhos nas fragatas avaliadas.

Os piolhos serão depositados na Coleção de Artrópodes Vetores Ápteros de

Importância em Saúde das Comunidades, inserida na Coleção Entomológica da Fundação

Oswaldo Cruz.

5.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Para o alvo COI das 8 amostras analisadas, 5 amostras resultaram em amplificações

únicas na altura aproximada de 400-450 pares bases (pb) (Figura 13). Para o alvo EF-1ɑ todas

as amostras mostram amplificações únicas também na altura aproximada de 400-450 pb (Figura

13). O controle negativo da PCR (todos os reagentes menos o DNA, foi usado água nucelase

free) e extração do DNA (todos os reagentes menos o DNA, foi usado água nucelase free) não

mostraram amplificações para ambos os alvos.

Embora as amostras tenham apresentando amplificações únicas, a qualidade do

sequenciamento foi ruim, e para algumas amostras não foi possível definir a espécie, portanto,

para uma análise mais robusta novas reações deverão ser realizadas. Os resultados das

amplificações estão descritos na Tabela 7. As amostras que não amplificaram (015-P1, 015-P3

e 015-C2) não foram incluídas na tabela.

A amostra 015-F1 demonstrou Query coverage de 77% e similaridade de 100% com

Fregatiella aurifasciata para o alvo EF1-For3. Ou seja, dos 347 pares de base foi possível

comparar 268 pares de base com uma sequência já depositada no Gen Bank (número de acesso

KT238712), cobrindo 77% da sequencia. Dos 268 comparados os 268 foram identicos. A

sequência obtida foi depositada no Genbank sob o número de acesso MH183161.

52

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Figura 13: Eletroforese em gel de agarose a 2 % mostrando amplificações para os alvos COI e

EF-1ɑ de espécimes de piolhos de fragata (Fregata magnificens). Coluna 1 e 17: 100pb Ladder

(Ludwig). Colunas 2-11 amplificações para o alvo COI; coluna 2 (amostra 014-P1); coluna 3


015-P3), coluna 7 (amostra 015-C1), coluna 8 (amostra 015-C2), coluna 9 (amostra 015-F1),

coluna 10 (controle negativo da extração) e coluna 11 (controle negativo da PCR). Colunas 12-

16, 18-21 e 29 amplificações para o alvo EF-1ɑ; coluna 12 (amostra 014-P1); coluna 13


015-P3), coluna 18 (amostra 015-C2), coluna 19 (amostra 015-F1), coluna 20 (controle

negativo da extração), coluna 21 (controle negativo da PCR) e coluna 29 (amostra 015-C1).

Observação: Colunas 22-28 se referem a outro experimento, e nas colunas 30-32 nada foi

aplicado.

53 Tabela 7: Análise das sequências nucleotídicas obtidas para os alvos COI e EF-1ɑ de espécimes de piolhos recuperados de fragata, comparando-

se com as sequências depositada no Genbank usando o parâmetro de maior similaridade.

Código Alvo COI Alvo EF-1 ɑ

Primer

L6625

Primer

H7005

Análise Primer

EF1-For3

Primer

Cho10

Análise

014-P1 321pb.

Não foi

possível editar

a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

319pb.

Não foi

possível editar

a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

L6625:

Query coverage 76% e

similaridade de 84% com

P. fregatiphagus. (número

de acesso DQ489433).

H7005:



P. fregatifagus (número de

acesso DQ489433).

300pb.

Não foi possível

editar a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

293pb.

Não foi possível

editar a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

EF1-For3:


similaridade de 90%

com P. fregatiphagus.

(número de acesso

DQ489433).

Cho10:

Sem similaridade

54 Tabela 7: (Continuação) Análise das sequências nucleotídicas obtidas para os alvos COI e EF-1ɑ de espécimes de piolhos recuperados de fragata,

comparando-se com as sequências depositada no Genbank usando o parâmetro de maior similaridade.


Primer

L6625

Primer

H7005

Análise Primer

EF1-For3

Primer

Cho10

Análise

014-C1 360pb.

Não foi possível

editar a

sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

362pb.

Não foi possível

editar a

sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

L6625:

Apresenta alguma

similaridade com vários

outros artrópodes.

H7005:

Apresenta alguma


outros artrópodes.

336pb.

Não foi possível

editar a

sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

Não foi

possível

analisar a

sequência.

EF1-For3:

- 1º: Query coverage 93%

e similaridade de 97%

com Kurodaia sp.

(número de acesso

AF320417).

- 2°: Query coverage 93%

e similaridade de 96%

com Colpocephalum sp.

(número de acesso

AF545779).

Cho10:

Sem análise




Primer

L6625

Primer

H7005

Análise Primer

EF1-For3

Primer

Cho10

Análise

015-P2 320pb.

Não foi possível

editar a

sequência devido

à baixa qualidade

do

cromatograma.

311pb.

Não foi possível

editar a

sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

L6625:


similaridade de 94%


(número de acesso

DQ489433).

H7005:


similaridade de 99%

com P. fregatifagus

(número de acesso

DQ489433).

325pb.

Foi possível

editar a

sequência.

Não foi possível

analisar a

sequência.

EF1-For3:


similaridade de 97%


(número de acesso

DQ489433).

Cho10:


similaridade de 80%


(número de acesso

DQ489433).




Primer

L6625

Primer

H7005

Análise Primer

EF1-For3

Primer

Cho10

Análise

015-C1 357pb.

Não foi

possível editar

a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

364pb.

Não foi

possível editar

a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

L6625:

Apresenta alguma


outros artrópodes

H7005:


similaridade de 80%

com Mysidea nesomini

(número de acesso

JF734282).

332pb.

Foi possível

editar a

sequência.

289pb.

Não foi possível

editar a

sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

EF1-For3:

-1°: Query coverage 96% e

similaridade de 95% com P.

fregatiphagus. (número de

acesso AF3220417).

- 2°: Query coverage 96% e


Colpocephalum sp. (número

de acesso AF545779).

Cho10:

Sem similaridade




Primer

L6625

Primer

H7005

Análise Primer

EF1-For3

Primer

Cho10

Análise

015-F1 Não amplificou

Não amplificou Não foi possível

analisar a sequência

347pb.

Foi possível

editar a

sequência.

320pb.

Não foi possível

editar a sequência

devido à baixa

qualidade do

cromatograma.

EF1-For3:


similaridade de 100%

com Fregatiella

aurifasciata. (número

de acesso KT238712).

Cho10:

Sem similaridade

Legenda:

QUERY COVERAGE: Porcentagem da sequência submetida ao programa BLAST que é coberta pelo alinhamento (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)

58

6. DISCUSSÃO

De acordo com os dados de ambos os centros de reabilitação, tradicionalmente o número

de fragatas que chegam para serem reabilitadas anualmente é relativamente alto, em torno de

20 a 30 animais por ano em cada centro. Porém, infelizmente durante o período de coleta de

amostras para a realização deste estudo, a quantidade de fragatas que chegaram aos centros de

reabilitação foi incomumente abaixo do esperado. Ao questionar os veterinários e funcionários

dos centros de reabilitação a respeito do motivo do baixo número de animais, estes não

souberam explicar a razão exata, mas afirmaram que diversos fatores inclusive mudanças

climáticas podem interferir na quantidade de animais resgatados. O período de coleta das

amostras foi de outubro de 2016 até outubro de 2017. No ano de 2016 o Brasil foi afetado no

início do ano pelo fenômeno climático “El niño” e no final de 2016 e início de 2017 pelo

fenômeno “La niña”. Estes são fenômenos opostos de aquecimento e resfriamento anormal das

águas do oceano pacífico na região equatorial que contribuem para o deslocamento de massas

de ar quente e frio, respectivamente, pela América do Sul, alterando o clima dos países por

longos períodos de tempo. Estas mudanças climáticas podem estar relacionadas ao baixo

número de fragatas resgatadas, já que estes são animais pelágicos e estariam sob influência

direta das mudanças climáticas nos oceanos e no continente.

Embora não se tenha observado nenhum outro ectoparasito além de piolhos

mastigadores nas fragatas participantes do estudo, a literatura cita a presença de moscas da

família Hippoboscidae (Diptera) em várias espécies de fragatas, incluindo F. magnificens

(MAA, 1969; GRACIOLLI; CARVALHO, 2003; LEVIN; PARKER, 2013). No entanto, a

maioria das descrições em literatura foram realizadas coletando-se dos animais em seus

ambientes naturais, onde a concentração de parasitos é maior. Os hipoboscídeos são dípteros,

ou seja, são capazes de voar e não ficam todo o tempo no animal, podendo trocar de hospedeiro

facilmente ou ser encontrado no ambiente das colônias destes animais. Deve-se considerar

também que o número de animais analisados foi baixo, portanto, mesmo não tendo se observado

a presença de hippoboscídeos nos animais resgatados pelos centros, não se pode descartar a

possibilidade de outros ectoparasitos estarem ocorrendo nos animais em vida livre.

59

Durante a revisão de literatura notou-se que a maioria estudos sobre ectoparasitas de

fragatas são separados em estudos em piolhos mastigadores ou estudos em Hippoboscídeos.

Embora alguns livros e artigos mencionem que piolhos podem ser transportados de um

hospedeiro a outro por hippoboscídeos em diversas espécies de aves (THOMPSON, 1936;

DAVIS et at., 1977; CLAYTON; WALTHER, 1997; SILVA, 2009), nenhum deles explora

com profundidade a relação entre estes parasitos ou faz menção ao encontro de ambos em uma

mesma colônia de fragatas ou em um mesmo hospedeiro. Por isso não está muito claro na

literatura se as fragatas apresentam os dois tipos de ectoparasitos ao mesmo tempo e em que

momento isso acontece.

As espécies de piolho diagnosticadas, Fregatiella aurifasciata, Colpocephalum spineum

e Pectinopygus fregatiphagus, já eram esperadas pois todas já possuíam registro de ocorrência

em Fregata magnificens em outros países tropicais, sendo uma já registrada no Brasil (P.

fregatiphagus em São Paulo) e outra com um registro de 1989 levando outra nomenclatura (C.

spineum foi registrado em Santa Catarina como C. ehrhardti, nomenclatura hoje inválida).

Duas das espécies de piolho encontradas não estão restritas a apenas uma espécie de

hospedeiro. A espécie F. aurifasciata também possui registro de ocorrência nos hospedeiros

Fregata minor, Fregata ariel, Fregata aquila e Fregata andrewsi. A espécie C. spineum já foi

registrada também em F. aquila. A espécie P. fregatiphagus até o momento é parasito exclusivo

de F. magnificens (KELLOG, 1899; EICHLER, 1943; RYAN; PRICE, 1967; AMERSON;

EMERSON, 1971; PRICE et al, 2003). Este tipo de registro é incomum pois, de maneira geral,

os piolhos apresentam alta especificidade de hospedeiro, não sendo encontrados em outras

espécies hospedeiras, exceto por uma eventual transmissão acidental, onde usualmente o piolho

não consegue sobreviver.

A predileção observada dos parasitos pelas plumas da região de dorso e ventre do

hospedeiro provavelmente está relacionada à irradiação de calor corporal da ave. É possível

compreender que os piolhos escolham estes locais para se abrigar, já que as fragatas possuem

uma grande envergadura das asas que as permite planar por tempo prolongado. Isso faz com

que elas estejam constantemente expostas ao vento, o que mantém as extremidades das asas

sempre a uma temperatura mais baixa que o eixo do corpo do animal.

A maior parte das aves participantes do estudo chegaram aos centros de reabilitação

por apresentarem lesões em asas, quase todas causadas por linhas de pipa, provavelmente

banhadas em cerol (mistura cortante de vidro moído e cola). Uma das fragatas participantes do

estudo chegou à reabilitação apenas por estar encharcada. Esta foi retirada da água por um

pescador que informou que a ave havia se enrolado em sua linha de pesca e acabou por cair na

60

água. Como estas aves não possuem impermeabilização natural das penas como outras aves

marinhas, elas não podem entrar na água, pois ficam encharcadas e não conseguem levantar

vôo, representando assim um risco à sua vida.

A maioria dos estudos de ectoparasitos em aves de vida livre, tanto marinhas como

silvestes, mostram uma quantidade pequena de piolhos, com uma variabilidade entre 0 e 46

exemplares de cada espécie de piolho por hospedeiro (CLAYTON; WALTHER, 2001;

GONZÁLEZ-ACUÑA et al. 2011; SILVA et al., 2014; TOMÁS et al. 2016). As aves

analisadas neste estudo apresentaram uma quantidade de piolhos dentro desta faixa. Houve

apenas um animal que apresentou um número de piolhos de uma espécie um pouco acima do

encontrado em literatura (51 exemplares da espécie Pectinopygus fregatiphagus). Essa fragata

foi também a que apresentou maior quantidade total de piolhos, somando-se as três espécies,

totalizando 63. Apesar da maior quantidade de parasitos coletados, este animal estava saudável,

com ótimo escore corporal, tendo sido reabilitado e devolvido à natureza sem maiores

dificuldades.

A razão desta ave ter apresentado uma quantidade maior de parasitos pode ter diversas

explicações. Primeiramente deve-se considerar que a técnica utilizada para a coleta dos

parasitos em seus hospedeiros consegue recolher boa parte destes ectoparasitos, porém não

todos. Outros estudos semelhantes que realizam coletas de ectoparasitos não são muito claros

quanto à metodologia utilizada, portanto é difícil realizar uma comparação com os demais

métodos para avaliar a eficácia, o que pode comprometer os resultados.

Outro ponto a ser considerado é o fato desta ave, durante seu tratamento no centro, ter

sido mantida no mesmo recinto que um atobá-pardo (Sula leucogaster), uma ave comumente

encontrada nos mesmos locais de nidificação e alimentação das fragatas. Dessa forma pode-se

pensar em uma possível transmissão cruzada destes parasitos entre as duas espécies, muito

embora os parasitos identificados nunca tenham sido identificados em outros hospedeiros que

não do gênero Fregata.

Uma terceira opção a ser considerada, provavelmente a mais plausível, seria a

possibilidade deste animal estar em uma fase reprodutiva diferenciada. As fragatas, uma vez

iniciado o período reprodutivo, passam aproximadamente 50 dias chocando seus ovos e mais

de 160 dias alimentando os filhotes no ninho enquanto estes ainda não estão emplumados

(DIAMOND 1973). Os machos, contudo, abandonam os cuidados parentais cedo, muitas vezes

antes do filhote completar seis meses, enquanto a fêmea se mantém na tarefa mesmo após a

saída do filhote do ninho, com aproximadamente 180 a 190 dias (DIAMOND, 1972;

CARMONA et al, 1995; OSORNOS, 1999; BRANCO, 2011). Sabe-se que no período de

61

incubação dos ovos e crescimento dos filhotes de aves a população de ectoparasitos nestes

animais tende a crescer pois estes se acumulam no ninho destes animais e podem inclusive ser

quantificados de forma mais precisa através do ninho ao invés de no hospedeiro (LEE;

CLAYTON, 1995; CLAYTON;WALTHER, 1997).

As fragatas são aves que nidificam durante quase todo o ano e, no período de incubação

dos ovos o crescimento populacional dos piolhos nestes animais pode aumentar

consideravelmente. Portanto é possível se considerar que este animal estivesse nesta fase de

incubação antes do acidente que o levou à reabilitação.

O primeiro registro de ectoparasitos em Fregata magnificens no Brasil foi realizado

por Tendeiro (1989), que registrou o Colpocephalum ehrhardti, seguido de Valim et al. (2005),

que registraram o Pectinopygus fregatiphagus. Em ambos os registros, os pesquisadores

realizaram a coleta em apenas uma fragata em cada um de seus respectivos estudos e

encontraram apenas um indivíduo das respectivas espécies de piolho. Além disso, em ambos os

registros, as fragatas utilizadas eram animais de cativeiro.

Em nosso estudo, como as aves eram recolhidas da natureza e avaliadas pouco depois,

pôde se ter um melhor conhecimento dos ectoparasitos que ocorrem nas fragatas em seu

ambiente natural, bem como a frequência em que estes são observados nas aves. A espécie P.

fregatiphagus esteve presente em praticamente todas as aves analisadas (14/15, ou, 93,3%),

enquanto as outras duas espécies. F. aurifasciata e C. spineum, se apresentaram menos

frequentes (10/15, ou, 66,7% e 6/15, ou, 40% respectivamente).

Diferentemente do afirmado por Thompson (1936), que cita a subordem Ischnocera

como usualmente menos ativa que as demais, observou-se que os piolhos identificados neste

estudo como Pectinopygus fregatiphagus, pertencente à subordem Ischnocera, são tão ativos

quanto os outros dois gêneros identificados. Apesar deste registro de Thompson, a variedade

de espécies existentes em cada subordem é extensa e cada uma possui suas próprias

características, portanto podem haver variações dentro da subordem.

Quanto à morfometria dos espécimes coletados, muitas informações em literatura são

incompletas ou equivocadas devido ao registro errôneo de espécimes de determinada espécie

ou devido a várias mudanças em nomenclatura durante os anos. Podemos citar o exemplo do

Colpocephalum spineum, que teve seu primeiro registro no Brasil por Tendeiro (1989) como

uma nova espécie chamada de Colpocephalum ehrhardti, tendo sido esta nomenclatura

posteriormente invalidada por se tratar da mesma espécie. A espécie Fregatiella aurifasciata

era classificada anteriormente como Gênero Menopon e teve diferentes nomenclaturas, como

Menopon intermedium Piaget 1880, Menopon auri-fasciatum Kellog 1899 e Menopon

62

intermissum Harrison 1916, até que foi remanejada para um novo gênero chamado Fregatiella,

ganhando seu nome atual (RYAN; PRICE, 1969). Já a espécie Pectinopygus fregatiphagus

inicialmente foi descrita como Lipeurus gracilicornis Piaget 1880. Em seguida, Kellog em 1899

descreveu uma nova variação, conhecida como Lipeurus gracilicornis var. major, que

posteriormente se tornou sinonímia por se tratar da mesma espécie. No entanto posteriormente

foi evidenciado por Ferris (1932) que as descrições da espécie estavam equivocadas, pois Piaget

havia descrito o macho desta espécie, pareando-o com a fêmea de outra espécie de piolho

(Pectinopygus sulae Rudow, 1869) e este erro foi perpetuado pelos autores subsequentes.

Apesar destas inconstâncias na definição morfológica dos espécimes, estes

apresentaram características dentro do descrito em literatura para cada espécie, embora com

algumas pequenas variações. As medidas de largura de cabeça e comprimento total do corpo

foram exatamente iguais ao descrito em literatura por Kellogg em 1899, para a espécie

Pectinopygus fregatiphagus, tanto para machos como para fêmeas, embora esta tenha sido a

descrição mais sucinta encontrada em literatura dentre as três espécies. As demais espécies

apresentaram variações nas medidas encontradas, porém próximas ao descrito em literatura

(KELLOGG, 1899; PRICE, 1967; RYAN; PRICE, 1969).

As descrições morfológicas de cada espécie de piolho neste estudo foram feitas

comparativamente com o encontrado em literatura, portanto em certos momentos houve grande

dificuldade de se fazer a comparação e a descrição de características próprias da espécie. Os

registros de tais espécies são muito antigos e alguns possuem informações equivocadas e dados

obsoletos, além de diversas mudanças em nomenclatura o que em alguns momentos dificultou

o entendimento das características da espécie e tornou sua identificação dificultada. Por este

motivo decidiu-se complementar a identificação utilizando-se biologia molecular.

Na análise molecular, embora nenhuma das amplificações tenha resultado em um

sequenciamento ideal, aparentemente ambos os alvos (COI e EF-1ɑ) foram mais sensíveis e

específicos para detectar P. fregatiphagus, apresentando Query coverage e similaridade acima

de 90% com quase todos os primers utilizados, o que proporciona uma segurança para a

confirmação de que realmente trata-se desta espécie, assim como identificado na morfometria.

Para a espécie F. aurifasciata embora tenha se obtido amplificação com apenas um

dos alvos, o EF-1α, e apenas para uma das fitas analisada (EF1-For3) esta foi a sequência com

melhor qualidade dando uma margem para assegurar que de fato se trate desta espécie.

Já para C. spineum em ambas as amostras (14-C1 e 15-C1) foi possível a análise para

apenas um dos alvos e uma das fitas. O alvo COI foi inespecífico, dando baixa similaridade

com outros artrópodes variados nas duas amostras. O alvo EF-1α sequenciou a fita EF1-For3

63

dando similaridade com dois gêneros, o gênero Kurodaia e o gênero Colpocephalum. No

sequenciamento da outra fita, Cho10, não houve similaridade ou não foi possível analisar a

sequência devido à baixa qualidade do sequenciamento.

O gênero Kurodaia é um gênero de Colpocephalidae, e foi criado em 1926 por Uchida,

quando este observou que o piolho Colpocephalum halieeti Denny 1842 possuía diferenças

significativas para a criação de um novo gênero, nomenando-o então de Kurodaia halieeti,

sendo esta a primeira espécie do gênero (UCHIDA, 1926). Hoje o gênero tem diversas espécies

que parasitam principalmente Falconiformes e Strigiformes.

A amostra 13 - 015 utilizada para a biologia molecular foi proveniente do CRAS, que

também recebia falcões e corujas de diversas espécies para a reabilitação, o que pode levar a

crer em uma possível contaminação, embora os recintos destes animais fossem separados. No

entanto, como o gênero Kurodaia é extremamente próximo do gênero Colpocephalum, e, as

análises moleculares não foram muito precisas, é plausível a ocorrência de tamanha

similaridade. Deve-se, portanto, refazer as análises moleculares para a confirmação do gênero.

No entanto, mesmo se em nova análise molecular for confirmado o gênero Colpocephalum, a

espécie não poderá ser confirmada por este método pois não existe depósito no Genbank da

espécie Colpocephalum spineum, identificada na microscopia de luz.

Como a maioria das aves (11/15) chegou aos centros por terem sofrido acidentes, já

era de se esperar que a população parasitária destes animais estivesse em níveis brandos, de

acordo com o observado em literatura, já que, a princípio, estes animais estariam saudáveis até

o momento do acidente, portanto, com suas populações parasitárias em níveis controlados.

No entanto, observou-se que, mesmo os animais que chegaram com um quadro de

debilidade (4/15), apresentaram níveis normais de ectoparasitismo para aves de vida livre.

Esperava-se uma população parasitária um pouco mais elevada nestes casos. Porém, não se

sabe o histórico destas aves, já que eram de vida livre e não foi possível obter o registro de

sinais clínicos dos animais, já que essa informação não era corretamente preenchida nas fichas

dos centros de reabilitação. Portanto não foi possível estabelecer uma relação entre estado geral,

sinais clínicos e nível de infestação do hospedeiro por ectoparasitos.

As aves que vieram a óbito e não foram congeladas logo em seguida, não fizeram parte

deste estudo devido às características dos piolhos e outros ectoparasitos de normalmente

deixarem seu hospedeiro quando este morre, indo para o ambiente na tentativa de encontrar

outro hospedeiro próximo (WILSON, 1934; DAVIS et at., 1977). Se estas carcaças fossem

utilizadas no estudo, provavelmente não seriam encontrados ectoparasitos e isso traria um dado

errôneo para o estudo.

64

A introdução pelo homem de cães, gatos e outros mamíferos domésticos em regiões

costeiras e oceânicas vem afetando diretamente as populações de aves marinhas, gerando certa

mortalidade de indivíduos, principalmente entre aves menores que estão facilmente presentes

na região litorânea e praias do continente. Aves maiores como as fragatas são menos afetadas

pois não são tão frequentes nas praias e locais abertos de fácil acesso (SCHREIBER; BURGER,

2002). São aves que pousam apenas em locais altos, sendo raramente encontradas no chão e

nidificam em ilhas costeiras e oceânicas (VOOREN; BRUSQUE, 1999). No entanto, com a

expansão progressiva da espécie humana em ilhas costeiras, cada vez mais essas aves entram

em contato com ambientes domésticos e estão suscetíveis ao impacto causado por estes animais.

Assim como outros autores afirmam, em nosso país a introdução de cães e gatos nas

ilhas e regiões costeiras pode estar interferindo indiretamente na população de fragatas, pois

estas são aves que roubam alimentos de outras aves marinhas (GIBSON-HILL, 1947;

NELSON, 1968; DIAMOND, 1975), logo, a diminuição das populações que convivem com

elas poderia causar algum tipo de impacto na população de fragatas.

Neste estudo é possível perceber como a presença da espécie humana influencia

negativamente nas populações destes animais, pois a maioria das fragatas que chegaram aos

centros de reabilitação devido a interferências antrópicas direta ou indiretamente no ambiente

onde estes animais circulam. No entanto, não se pode concluir que humanos tenham total

responsabilidade pela debilidade de todas as aves desta espécie que chegam aos centros de

reabilitação, pois não é possível fazer uma avaliação concisa a este respeito com uma amostra

tão pequena de animais. Entretanto, é possível observar um padrão de interferência humana na

vida destas aves.

Uma das fragatas que chegou ao CRAS (n° 11 - 012 – RJ) surpreendentemente não

apresentou nenhum ectoparasito. Os veterinários e funcionários do centro de reabilitação

confirmaram que o animal não havia sido tratado para ectoparasitas antes da coleta. Este animal,

um macho, chegou ao centro por apresentar ferimento em asa esquerda e estava em condição

geral de saúde regular. Ficou em reabilitação por três dias e então pôde ser devolvido à natureza.

Este foi um resultado inesperado, pois sendo um animal de vida livre que vive em colônias com

outros da mesma e de outras espécies, é de se esperar que esteja infestado, ainda que com uma

quantidade baixa de parasitos (SERAFINI; LUGARINI, 2014).

Os resultados obtidos neste estudo foram inéditos na região onde foram realizados,

podendo contribuir para um melhor atendimento das Fragatas que chegarem a centros de

reabilitação e para um diagnóstico diferenciado em relação a possíveis patologias envolvendo

65

estes animais, auxiliando assim na ecologia e conservação das espécies e ecossistemas

brasileiros.

A espécie Fregata magnificens ainda é pouco estudada no país, mesmo tendo

ocorrência desde a América do Norte, Cabo Verde, Ilhas Galápagos até a Costa Norte da

América do Sul e Caribe (DIAMOND, 1973) e, sendo o Brasil um dos países com maior área

de ocorrência destes animais. Portanto, faz-se necessário aprofundar os conhecimentos sobre

estes animais, realizando novos estudos sobre biologia e patologias que os acometem, se

possível, comparando os resultados com colônias de outras regiões.

As perspectivas para novos estudos seriam a realização do sequenciamento dos alvos

das espécies encontradas, sobretudo do Colpocephalum spineum para depósito no GenBank,

além da realização de microscopia eletrônica de varedura para uma descrição morfológica mais

apurada de tais espécies.

66

7. CONCLUSÕES

Primeiro relato de Fregatiella aurifasciata e primeiro relato de Colpocephalum spineum

com a devida nomenclatura no Brasil em aves de vida livre resgatadas por centros de

reabilitação, nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo. E primeiro relato de

Pectinopygus fregatiphagus no Rio de Janeiro.

Observou-se predileção de infestação das espécies de piolhos encontrados pela região

de dorso e ventre do hospedeiro, em suas plumas, não sendo observados parasitos em

tegumento ou em outras regiões corporais (cabeça, pescoço, patas, bicos e asas).

As aves F. magnificens apresentaram alta ocorrência de piolhos mastigadores, porém

baixa intensidade de infestação. A espécie de maior ocorrência e intensidade foi

Pectinopygus fregatiphagus, seguido de Fregatiella aurifasciata e por último

Colpocephalum spineum.

Não foi possível estabelecer uma relação entre estado geral, sinais clínicos e nível de

infestação do hospedeiro por ectoparasitos devido à falta de informações no registro das

fichas dos animais nos centros de reabilitação.

Embora existam poucas sequências destes ectoparasitos depositadas no Genbank, e o

sequenciamento deva ser melhorado em sua qualidade, com estes resultados

preliminares da biologia molecular pode-se supor que o diagnóstico morfológico está

correto. Porém maiores estudos devem ser realizados com relação a ensaios moleculares

para se estabelecer uma maior concordância entre esta e os achados na microscopia

ótica.

67

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9.1 APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA) DA

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

9.2 AUTORIZAÇÃO PARA COLETA DE AMOSTRAS – INSTITUTO ARONAUTA

76

9.3 AUTORIZAÇÃO PARA COLETA DE AMOSTRAS – CRAS

77

9.4 FICHA PARA COLETA DE AMOSTRAS

78

9.5 CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO XXV CONGRESSO

BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA

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