Universidade Federal Fluminense

Instituto Biomédico

Trabalho de Conclusão de Curso

Biomedicina

Natália Spitz Toledo Dias

Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações

relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de

HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados.

Habilitação: Análises Clínicas

Orientadora: Caroline Cordeiro Soares

Coorientadora: Bárbara Vieira do Lago

Laboratório de Virologia Molecular – FIOCRUZ

Niterói

2014

Universidade Federal Fluminense

Instituto Biomédico

Trabalho de Conclusão de Curso

Biomedicina

Natália Spitz Toledo Dias

Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações

relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de

HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados.

Monografia apresentada, como pré-requisito

de conclusão do curso de Biomedicina, com

habilitação em Análises Clínicas, ao Instituto

Biomédico, da Universidade Federal

Fluminense, orientada pela Doutora Caroline

Cordeiro Soares e coorientada pela Mestra

Bárbara Vieira do Lago, realizado no

Laboratório de Virologia Molecular -

FIOCRUZ.

Niterói

2014

iii

Agradecimentos

Primeiramente gostaria de agradecer a minha família, principalmente aos meus pais, Ana Paula e

Dias, por sempre terem me apoiado, me confortado nos momentos em que pensava ter falhado. Eles

sempre me impulsionaram a tentar ser o melhor que eu podia tanto na vida pessoal quanto

acadêmica, meus pais são o meu exemplo de esforço e dedicação, e me deram as condições

necessárias para que eu chegasse até aqui. Quero agradecer as minhas irmãs, Aline e Letícia, que

sempre foram minhas cúmplices, minhas melhores amigas, com quem sempre pude contar pra me

dar apoio nos momentos difíceis e sempre me proporcionaram momentos divertidíssimos.

Quero agradecer a todos o Laboratório de Virologia Molecular, principalmente às minhas

orientadoras Drª Caroline Cordeiro Soares e Ms. Bárbara Vieira do Lago que sempre foram tão

atenciosas comigo, sempre com muita paciência me ensinaram a rotina e as técnicas do laboratório,

sempre estando a disposição quando eu precisava tirar alguma dúvida. Sem a ajuda delas

provavelmente eu não teria concluído essa monografia, elas revisaram, revisaram de novo, até que

tudo parecesse estar perfeito. Quero agradecer aos meus companheiros da sala B15, Maria Clara,

Jéssica, Ágatha, Vinícius, Flávia, Oscar e Dr. Júnior, pelas conversas sempre divertidas e

instrutivas, pelas dicas, pelo estímulo e apoio em todas as situações.

Quero agradecer a todos da turma 2010.1 de biomedicina da UFF por ter sido uma turma

maravilhosa todos esses anos, eu não poderia ter desejado uma turma melhor. Com eles eu me

sentia a vontade, saber que eu podia contar com eles tornou mais fácil superar a dificuldade de ficar

longe de casa. Fiz grandes amizades que pretendo levar para o resto da vida, sei que é inevitável

perder o contado com alguns deles, mas sempre vou guardar com grande carinho as lembranças dos

momentos que vivi com essas pessoas incríveis. Obrigada por me deixarem participar do

crescimento pessoal e profissional de cada um de vocês!

Aos meus amigos Mariana e Raphael, e ao meu namorado Bruno, por sempre me descontraírem

quando eu estava estressada com alguma prova ou situação. Por me darem suporte e sempre

torcerem e acreditarem em mim mesmo quando eu não acreditava.

Obrigada a todos que me ajudaram a chegar até este momento!

iv

Resumo

Aproximadamente 10% dos indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)

são portadores crônicos do vírus da hepatite B (HBV). O monitoramento destes pacientes merece

atenção especial, já que estes progridem mais rápido para cirrose e morte por doença hepática do

que os monoinfectados pelo HBV. Por esse motivo, a terapia antiviral contra os dois vírus é

prioritária na maioria dos casos. Algumas drogas atuam na transcriptase reversa (TR), enzima

importante na replicação de ambos os vírus e, por isso, podem ser eficazes no tratamento das duas

infecções. No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante a terapia, levando a

diminuição da eficácia das drogas utilizadas. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as

mutações de resistência à Lamivudina (3TC) em populações de HBV e HIV isoladas de pacientes

coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento. Quarenta e cinco amostras de soro de

pacientes HBV/HIV coinfectados foram submetidas à análise da mutação primária rtM204V/I e das

compensatórias rtV173L e rtL180M do HBV e da mutação M184V/I do HIV-1. Todas as amostras

foram submetidas a um ensaio de nested-PCR para amplificação de um fragmento da polimerase

viral do HBV e a um RT-PCR para amplificação da região da TR do HIV-1. Vinte e cinco amostras

foram amplificadas com sucesso para o HBV e submetidas ao pirosequenciamento das mutações de

resistência do HBV. O RNA do HIV foi amplificado em treze amostras, que foram submetidas a

análise da mutação M184V/I. O sequenciamento de Sanger da região genômica S do HBV foi

realizado em 15 amostras e da região do motivo YMDD do HIV foi realizado em 2 amostras, para

posterior comparação com os resultados do pirosequenciamento. A análise da mutação M204V/I foi

realizada com sucesso em 23 amostras. A maioria das amostras (69,6%; 16/23) apresentou uma

mistura de populações selvagens (M204) e mutantes (M204V/I). Apenas população mutante

M204V foi encontrada em 21,7% (5/23) e 8,7% (2/23) das amostras estudadas eram compostas

apenas por populações selvagens. A mutação V173L foi investigada em 20 amostras. Apenas

populações selvagens foram encontradas em 90% (18/20) das amostras e apenas populações

mutantes foram encontradas em 10% (2/20) das amostras. Nas amostras submetidas ao

sequenciamento de Sanger o resultado foi o mesmo em ambos os métodos, com exceção das

amostras que apresentaram população mista no pirosequenciamento, as quais o sequenciamento

padrão detectou apenas as populações majoritárias. A mutação L180M foi investigada em 15

amostras e apenas cepas selvagens foram encontradas, pelo método de pirosequenciamento, no

entanto, esse resultado foi desconsiderado devido a uma provável falha no oligonucleotídeo

utilizado para essa mutação, uma vez que o sequenciamento de Sanger detectou 4 amostras com

essa mutação. A mutação M184V/I do HIV foi investigada em 9 amostras, e apenas populações

v

selvagens foram encontradas. O mesmo resultado foi confirmado pelo sequenciamento. O

pirosequenciamento é uma técnica sensível que pode ser útil na detecção e quantificação de

subpopulações de vírus resistentes, que talvez não fossem detectadas por outros métodos. Porém

alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que foi encontrada nas

amostras analisadas apenas pela técnica de Sanger. A alta sensibilidade do pirosequenciamento

permite que se avalie a melhor conduta terapêutica para um paciente, pois é possível detectar a

proporção de cepas selvagens e mutantes infectando o indivíduo, permitindo uma intervenção

precoce durante o tratamento.

Palavras chave: HBV, HIV, Lamivudina.

vi

Abstract

Approximately 10% of individuals infected with human immunodeficiency virus (HIV) are chronic

carriers of hepatitis B virus (HBV). The monitoring of these patients deserves special attention, as

they progress more rapidly to cirrhosis and death from liver disease than HBV monoinfected. For

this reason, the antiviral therapy against the two viruses is a priority in most cases. Some drugs act

in reverse transcriptase (RT), an important enzyme in the replication of both viruses and, therefore,

can be effective in the treatment of both diseases. However, resistance mutations may be selected

during therapy, leading to reduced efficacy of the used drugs. The aim of this study was to detect

and quantify lamivudine (3TC) resistance mutations in isolated populations from HBV/HIV

coinfected patients by pyrosequencing technique. Forty -five serum samples from HBV/HIV

coinfected patients were analyzed for primary mutation rtM204V/I and compensatory mutations

rtV173L and rtL180M inHBV and M184V/I mutation in HIV–1 genomes. All samples were

subjected to a nested-PCR assay to amplify a fragment of HBV viral polymerase and an RT - PCR

amplification of the HIV-1 RT region. Twenty-five samples were successfully amplified for HBV

and subjected to pyrosequencing of HBV resistance mutations. The HIV RNA was amplified in

thirteen samples, which were submitted to analysis of the M184V/I mutation. The Sanger

sequencing of the HBV S genomic region was performed on 15 samples and the HIV YMDD motif

was performed on 2 samples for comparison with the results of pyrosequencing. The analysis of the

M204V/I mutation was successfully performed on 23 samples. Most samples (69.6%, 16 /23)

showed a mixture of wild populations (M204) and mutants (M204V/I). Only M204V mutant

population was found in 21.7 % (5 /23) and 8.7 % (2/23 ) of samples studied were composed only

of wild populations. The V173L mutation was investigated in 20 samples. Only wild populations

were found in 90 % (18/20) of the samples, and only mutant populations were found in 10% (2 /20)

of the samples. In the samples subjected to Sanger sequencing it was found the same results for both

methods, except for samples with mixed population in pyrosequencing, which the standard

sequencing detected only the majority populations. The L180M mutation have been investigated

only in 15 samples and only wild strains were found by pyrosequencing method , however , this

result was disregarded due to a likely failure of the primer used for this mutation, since the Sanger

sequencing detected this mutation in 4 samples. The M184V / I mutation of HIV was investigated

in 9 samples, and only wild populations were found by pyrosequencing. The same result was

confirmed by standard sequencing. The pyrosequencing is a sensitive technique that can be useful

in the detection and quantification of subpopulations of resistant viruses that may not be detected by

other methods. However, some adjustments must also be made for the detection of mutations

vii

rtL180M, which was found only in the samples analyzed by the Sanger technique. The high

sensitivity of pyrosequencing enables one to evaluate the best treatment for a patient, because it is

possible to detect the ratio of wild type and mutant strains infecting an individual, allowing early

intervention during treatment.

Key-words: HBV, HIV, lamivudine.

viii

Sumário

I. Introdução...........................................................................................................................................1

I.1. VÍRUS DA HEPATITE B (HBV)..................................................................................................1

I.1.1 – Histórico....................................................................................................................................1

I.1.2 - Propriedades gerais....................................................................................................................1

I.1.3 – Organização Genômica.............................................................................................................3

I.1.4 – Replicação do HBV...................................................................................................................6

I.1.5 – Transmissão............................................................................................................................. ..8

I.1.6 – Patogenia...................................................................................................................................9

I.1.7 – Aspectos clínicos e marcadores sorológicos...........................................................................10

I.1.8 – Tratamento...............................................................................................................................12

I.2 – VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV)............................................................14

I.2.1 – Histórico..................................................................................................................................14

I.2.2 – Propriedades Gerais................................................................................................................15

I.2.3 – Organização genômica............................................................................................................16

I.2.4 – Replicação do HIV..................................................................................................................18

I.2.5– Transmissão..............................................................................................................................21

I.2.6 – Patogenia.................................................................................................................................22

I.3.7 – Evolução clínica......................................................................................................................23

I.2.8 – Tratamento...............................................................................................................................24

I.3 – COINFECÇÃO HBV-HIV.........................................................................................................26

I.4 - A TRANSCRIPTASE REVERSA..............................................................................................27

I.5 – PIROSEQUENCIAMENTO E MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA...........................................28

II. Objetivos............................................................................................................................................31

II.1 - Objetivo Geral...........................................................................................................................31

II.2 - Objetivos específicos.................................................................................................................31

III. Metodologia

III.1 – Amostragem.............................................................................................................................32

III.2 – Extração de ácidos nucléicos................................................................................................. ..32

III.3 – Ensaios de PCR.................................................................................................... ...................33

III.4 – Eletroforese..............................................................................................................................33

ix

III.5 – Pirosequenciamento ................................................................................................................34

III.6 - Sequenciamento Padrão........................................................................................................ ...36

III.7 - Alinhamento das sequencias e análise filogenética .................................................................37

IV – Resultados e Discussão.............................................................................................................38

V – Conclusão...................................................................................................................................51

VI – Referências Bibliográficas.......................................................................................................52

x

Lista de figuras

Figura 1.1 - Estrutura do HBV........................................................................................................... 2

Figura 1.2 – Microscopia eletrônica das partículas virais infecciosas e não infecciosas

do HBV ............................................................................................................................................... 3

Figura 1.3 – Modelo esquemático do genoma do HBV .................................................................... 6

Figura 1.4 – Modelo esquemático do ciclo replicativo do HBV ....................................................... 8

Figura 1.5 – Perfil sorológico da infecção pelo HBV ..................................................................... 11

Figura 1.6 - Mutações de Resistência a antivirais na Polimerase do HBV ......................................13

Figura 2.1 - Estrutura do HIV-1 ....................................................................................................... 15

Figura 2.2 - Organização genômica do HIV-1 ................................................................................. 18

Figura 2.3 - Ciclo replicativo do HIV ............................................................................................. 21

Figura 3.1 – Resultado pirosequenciamento ................................................................................... 35

Figura 3.2 - Exemplo de um pirograma fornecido pelo software PyroMark ID no AQ mode ........ 36

Figura 4.1 - Árvore filogenética HBV ............................................................................................. 48

xi

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR ............................................................... 34

Tabela 2 - Oligonucleotídeos utilizados no pirosequenciamento ................................................................... 36

Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados no seqüenciamento do HBV ............................................ 37

Tabela 4 - Informação de origem e tratamento dos pacientes........................................................... 39

Tabela 5 - Resultados das análises da mutação rtM204V/I ............................................................. 41

Tabela 6 - Comparação seqüenciamento e pirosequenciamento...................................................... 43

Tabela 7 - Resultados das análises da mutação rtL180M................................................................ 44

Tabela 8 - Resultados das análises da mutação rtV173L................................................................. 46

Tabela 9 - Resultados das análises da mutação M184V................................................................... 49

1

I – INTRODUÇÃO

I.1 – Vírus da Hepatite B

I.1.1. – Histórico

Em 1965, Blumberg e colaboradores publicaram o que viria a ser uma das

maisimportantes revelações sobre as hepatites virais. O primeiro trabalho, que buscava

caracterizartraços polimórficos hereditários em amostras de soro de diversas regiões geográficas

domundo, identificou um antígeno que aparentemente estaria relacionado a um tipo de

hepatitesérica (Blumberg et al, 1965). Neste estudo foi identificado um antígeno em uma amostra

desoro de um aborígene australiano que reagia especificamente com um anticorpo presente nosoro

de um paciente hemofílico americano. Denominou-se, então, esse antígeno de Austrália(Au), o qual

era relativamente raro na América do Norte e Europa ocidental e prevalente empopulações africanas

e asiáticas e entre pacientes com leucemia, síndrome de Down e hepatite aguda (Blumberg et al,

1967; Bayer et al, 1968). Estudos posteriores (Okochi e Murakami,1968; Prince, 1968) mostraram

que este antígeno era exclusivamente encontrado no soro deindivíduos infectados pelo vírus da

hepatite B (HBV). Posteriormente, a purificação do HBVfoi realizada a partir do soro de portadores

do antígeno Au e a partícula completa do vírus foidetectada por microscopia eletrônica (Dane et al,

1970).

Vários vírus que possuem tropismo pelos hepatócitos são conhecidos

atualmente,sendo o HBV o primeiro identificado em 1970, seguido pelo vírus da hepatite A (HAV)

(Feinstone et al, 1973), vírus da hepatite D (HDV) (Rizzeto et al, 1977), vírus da hepatite E (HEV)

(Balayan et al, 1983) e vírus da hepatite C (HCV) (Choo et al, 1989). Outros vírus foram

identificados em indivíduos com quadro clínico de hepatite pós-transfusional não A-E, porém uma

correlação direta entre as hepatopatias e as infecções causadas por esses vírus ainda não pôde ser

confirmada. Dentre eles, destacam-se o vírus da hepatite G (HGV) (Simons et al, 1995), Torque

Teno vírus (TTV) (Nishizawa et al, 1997), Torque Teno Mini virus (TTMV) (Takahashi et al, 2000)

e Torque Teno Midi vírus (TTMDV) (Ninomiya et al, 2007).

I.1.2 – Propriedades gerais

O HBV pertence à família Hepadnaviridae, que engloba um pequeno número de

vírusde DNA que apresentam tropismo por células hepáticas. Esta família é dividida em

2

doisgêneros: Orthohepadnavirus, composto por vírus que infectam mamíferos, incluindo o vírusda

hepatite B humana e Avihepadnavirus, que compreende os vírus que infectam aves(Fauquet et al,

2005; ICTV, 2012).A partícula viral completa infecciosa, também conhecida como partícula de

Dane, éesférica, com diâmetro de aproximadamente 42 nm (Dane et al, 1970). Os vírions

sãoformados por um envelope externo de glicoproteínas que constitui o antígeno de superfície

dovírus (HBsAg) (Dane et al, 1970; Almeida et al, 1971; Robinson & Lutwick,1976). OHBsAg é

composto por três proteínas: L (large), M (middle) e S (small) distribuídas emquantidades distintas

pelo envelope (Tiollais et al, 1985). O nucleocapsídeo possui simetriaicosaédrica e é formado pela

proteína do core (HBcAg) (Almeida et al, 1971) e pelo genomaviral (Robinson et al, 1974) (Figura

1.1). Estima-se que o soro de indivíduos infectados peloHBV possa apresentar concentrações

superiores a 109 partículas virais por mL (Ganem, 1996).

Figura 1.1: Estrutura do HBV. Modelo esquemático de partícula de Dane. Disponível

em: <http://people.rit.edu/japfaa/infectious.html> [Acesso em 23 jun. 2013] (Figura adaptada para o

português).

3

Além das partículas completas infecciosas, no soro de pacientes infectados podem

serencontrados outros dois tipos de partículas não infecciosas, as esféricas e filamentosas, quesão

constituídas apenas pelo HBsAg e por alguns lipídeos oriundos da célula hospedeira(Figuras 1.2).

As partículas esféricas possuem cerca de 20 nm de diâmetro e as partículasfilamentosas possuem,

aproximadamente, 22 nm de largura e comprimento variável (Robinson et al, 1976; Laub et al,

1983). Elevados níveis destas partículas não infecciosas podem ser encontradas nas fases aguda e

crônica da infecção. Presentes em concentrações superiores a 1013

partículas por mL de soro, essas

partículas não promovem infecção, pois não possuem o genoma do vírus (Rizzetto, 1998). Apesar

disso, as partículas subvirais são altamente imunogênicas e eficientes em induzir a resposta

neutralizante de anticorpos anti-HBs (Ganem, 1996).

Figura 1.2:Microscopia eletrônica das partículas virais infecciosas e não infecciosas

do HBV.Disponível em: <http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html>. [Acesso em 23 jun.

2013](Figura adaptada).

I.1.3 – Organização Genômica

O genoma do HBV, um dos menores entre os vírus que infectam o homem,

éconstituído por uma molécula de DNA circular de fita parcialmente dupla, comaproximadamente

3.200 pares de base (pb) de tamanho. A fita mais longa é complementar aos RNAs virais e, por

convenção, possui polaridade negativa (Gerlish & Robinson, 1980). Na fita de polaridade positiva,

a posição da extremidade 5’ terminal é fixa, enquanto que a posição da extremidade 3’ terminal é

4

variável. Desta forma, o comprimento da fita positiva varia de 50% a 90% do comprimento da fita

complementar (Ganem, 1996).

O genoma do HBV possui quatro fases de leitura aberta (Open Reading Frames -

ORFs) designadas de pré-S/S, pré-C/C, P e X (Shafritz & Lieberman, 1984). As ORFs

sãototalmente codificantes e estão parcialmente sobrepostas, permitindo que o HBV codifique 50%

mais proteínas do que seria esperado devido ao reduzido tamanho do seu genoma (Heermann et al,

1984; Ganem & Varmus, 1987) (Figura 1.3).

O gene pré-S/S, inclui as regiões pré-S1, pré-S2 e S, com três códons de iniciação na

mesma fase de leitura. Este gene codifica as proteínas que compõe o HBsAg, a proteína estrutural

que forma o envelope viral. A proteína L ou large, a de maior tamanho, é codificada a partir do

códon de iniciação localizado no começo da região pré-S1 e sua síntese se estende pelas regiões

pré-S1, pré-S2 e S. A proteína M ou middle é codificada pelas regiões pré-S2 e S, a partir do

segundo códon de iniciação localizado no início da pré-S2 e a proteína S ou small, a menor das

proteínas, é codificada a partir do terceiro códon de iniciação localizado no início da região S.

Todas as proteínas têm sua síntese interrompida no mesmo códon de parada localizado no final da

região S (Seeger e Mason, 2000).

Essas proteínas não são encontradas de maneira uniforme entre os diferentes tipos de

partículas virais (Heermann et al, 1984). As partículas subvirais, não infecciosas, são compostas

predominantemente por proteínas S, apresentando quantidades variáveis de proteínas M e poucas

cadeias L. Entretanto, as partículas virais infecciosas são enriquecidas de proteínas L. Como essas

proteínas são as que possuem os sítios de ligação do HBV aos receptores dos hepatócitos (Neurath

et al, 1986; Klingmuller & Schaller, 1993), é compreensível que a partícula infecciosa possua um

número consideravelmente maior de proteínas L quando comparada às partículas não infecciosas, as

quais sendo mais numerosas poderiam competir com os vírions pelos sítios de ligação aos

hepatócitos (Ganem et al, 1996).

O gene pré-C/C apresenta-se como a região mais conservada do genoma

viral,possuindo dois códons de iniciação na mesma fase de leitura aberta. A proteína HBeAg,

umaproteína não estrutural, é sintetizada a partir do primeiro códon de iniciação localizado naregião

pré-C e sua síntese se estende por toda a região C. Essa proteína é um importante marcador

sorológico de replicação viral ativa (Garcia et al, 1988; Nassal & Rieger, 1993), no entanto, ainda

não se sabe ao certo seu papel na biossíntese viral. Alguns estudos atribuem ao HBeAg a função de

atenuar a resposta imunológica do hospedeiro à proteína do nucleocapsídeo (Chang et al, 1987),

diminuir e manipular as respostas adaptativa e inata (Chen et al, 2004), possui a capacidade de

cruzar a placenta para induzir tolerância in uteropromovendo, assim, a persistência após a infecção

5

perinatal (Milich et al, 1990). Já a proteína HBcAg, uma proteína estrutural que compõe o

nucleocapsídeo viral, é codificada a partir do segundo códon de iniciação localizado no início da

região C. Esta proteína é capaz de induzir a produção de anticorpos (anti-HBc) pelo hospedeiro,

sendo importante, assim como o HBsAg, no diagnóstico sorológico da infecção (Milich &

McLachlam, 1986).

O gene P, o maior dos genes do HBV, cobre aproximadamente ¾ do genoma viral

ecodificaa polimerase viral, uma enzima multifuncional com 832 aminoácidos. Essa proteína é

funcionalmentedividida em quatro domínios: o domínio amino-terminal, com atividade de DNA

primase,necessário para o início da síntese da fita de DNA de polaridade negativa; uma

regiãochamada de espaçadora, que parece não ter nenhuma função em particular; o domínio

datranscriptase reversa, que catalisa a síntese do genoma; e o domínio carboxi-terminal quepossui

atividade de RNAse H. No gene da polimerase está presente o motivo Tyr-Met-Asp-Asp (YMDD),

essencial para a atividade de transcrição reversa (Toh et al, 1983) e que é bem conservado em todas

as transcriptases reversas virais, constituindo o sítio mais comum de aparecimento de mutações de

resistência a fármacos (François et al, 2001; Gaillard et al., 2002; Kim et al., 2012).

O gene X codifica a proteína não estrutural HBx. Essa proteína é um regulador viral

multifuncional que modula a replicação do HBV, a transcrição celular, o sinal de transdução, a

atividade do proteossoma e progressão do ciclo celular (Kim et al, 1991; Xu et al, 2010), e pode

induzir a apoptose diretamente ou sensibilizar hepatócitos a uma variedade de estímulos apoptóticos

(Kim et al, 2005). HBx também tem sido relacionado a inflamação e imunomodulação. Em

linhagens celulares de hepatoma humano, HBx induz a transcrição de citocinas inflamatórias, tais

como TNF-α, IFN-c e IL-6 (Lara-Pezzi et al, 1998; Lee et al,2010; Xiang et al, 2011). HBx também

aumenta a expressão de moléculas que são importantes na resposta imune, como o complexo

principal de histocompatibilidade (MHC) (Zhou et al, 1990).

Com base na divergência em pelo menos 8% da sequência nucleotídica do genoma

completo, o HBV foi classificado em sete genótipos (A a G) apresentando uma distribuição

geográfica distinta na população mundial (Norder et al, 1993; Norder et al, 1994; Stuyver et al,

2000; Arauz-Ruiz et al, 2002). O genótipo H apresenta uma divergência em seu genoma menor que

8% quando comparado a outro mais próximo, o genótipo F (Katoet al, 2005).Portanto, foi proposta

como critério de divergência no genoma completo, a utilização de 7,5% para a designação de novos

genótipos (Kramviset al, 2008; Kurbanov et al, 2010). Além disso, os genótipos A, B, C, D e F são

subdivididos em subgenótipos com propriedades virológicas e epidemiológicas características

(Schaefer, 2007).Recentemente, dois novos genótipos foram propostos: o genótipo I (Olinger et al,

2008) e o genótipo J (Tatematsu et al, 2009). A classificação do genótipo I parece ser bem aceita

6

(Tran et al, 2008; Colson et al, 2009; Zhang et al, 2010; Yu et al, 2010; Santos et al, 2010), no

entanto ainda são necessários mais estudos para que sejam justificadas tais classificações (Kurbanov

et al, 2010; Liu et al, 2010).

Figura 1.3:Modelo esquemático do genoma do HBV (Fonte: Gomes, 2003)

I.1.4 – Replicação do HBV

A replicação do HBV realiza-se por um mecanismo único dentre os vírus de

DNAanimais, uma vez que apresenta uma etapa envolvendo a produção de um intermediário

deRNA e a sua conversão em DNA pela ação da transcriptase reversa viral(Ganem, 1996; Nassal &

Schaller, 1996).

A infecção pelo HBV tem início a partir da adsorção viral ao aos receptores nos

hepatócitos e entrada do vírion na célula. Uma vez no citoplasma do hepatócito, o vírion perde seu

nucleocapasídeo e é transportado até o núcleo celular, onde ocorre a liberação do genoma viral

(Ganem et al, 1996).

Inicialmente, o DNA viral é convertido em uma forma de dupla fita circular

7

covalentemente ligada (cccDNA). Para tanto, a fita positiva é complementada pela DNA polimerase

celular. O cccDNA é transcrito em RNAs genômicos e subgenômicos pela RNA polimerase II

celular. Os RNAs subgenômicos atuam exclusivamente como RNAs mensageiros para a tradução

das proteínas do envelope e da proteína X. Já os RNAs genômicos servem tanto de molde para a

síntese de DNA viral (sendo chamado, neste caso, de RNA pré-genômico) como de RNAs

mensageiros para a tradução da proteína do core, da polimerase viral e do HBeAg. Os transcritos de

RNA são, então, transportados para o citoplasma celular onde serão traduzidos em suas respectivas

proteínas. Um sinal de encapsidação (ε), localizado na extremidade 5’ do RNA pré-genômico é

responsável pelo empacotamento, no citoplasma, deste RNA nos capsídeos imaturos durante a

replicação (Kidd-Ljunggren et al, 2002). A transcrição reversa é iniciada no interior do capsídeo,

onde a fita negativa é sintetizada a partir do molde de RNA viral, o qual é concomitantemente

degradado pela atividade de RNAse H da polimerase. A fita de polaridade positiva é sintetizada a

partir da fita negativa. Durante este processo, o genoma do HBV é circularizado com a

peculiaridade da fita positiva não ser completamente sintetizada, resultando em um genoma de fita

parcialmente dupla. O nucleocapsídeo pode, então, retornar ao núcleo, liberar o DNA viral (que

pode ser convertido novamente em cccDNA) para a amplificação de novos genomas (Tuttleman et

al, 1986) ou seguir para membranas intracelulares do retículo endoplasmático ou do complexo de

Golgi contendo as glicoproteínas do envelope do vírus para ser envelopado e posteriormente

secretado através da via de secreção constitutiva (Figura 1.4) (Pollack & Ganem, 1993;

Papatheodoridis et al, 2002; Ganem & Prince, 2004).

8

1.4:Modelo esquemático do ciclo replicativo do HBV (Fonte: Ganem & Prince, 2004 –

Figuraadaptada para o português).

I.1.5 – Transmissão

O HBV pode ser encontrado principalmente no sangue de indivíduos infectados. Além

disso, pode ser detectado em fluidos corporais, como urina, saliva, fluido nasofaringeano, sêmen e

fluido menstrual (Alter et al, 1977; Davison et al, 1987). A transmissão do HBV pode ocorrer por

exposição perinatal, através de relação sexual, por exposição a sangue ou derivados, transplante de

órgãos ou tecidos, seringas compartilhadas por usuários de drogas endovenosas, por lesões de pele,

objetos perfurocortantes ou através de outras exposições de origens desconhecidas (Gonçales, 1997;

Chakravarti et al, 2005; Lee et al, 2006; Gambarin-Gelwan, 2007).

9

I.1.6 – Patogenia

A infecção pelo HBV causa doença hepática em que o grau de severidade pode variar de

pessoa para pessoa. Isto ocorre tanto devido a fatores do hospedeiro, como as respostas imunes intata,

humoral e celular (Rehermann, 2003), como também devido a fatores virais, como certos genótipos,

mutaçõese a carga viral (Bertoletti, 2006). A resposta celular contra o HBV é mediada por linfócitos T, que

são responsáveis pela lesão hepática tanto na fase aguda como na fase crônica da doença (Ichiki et al,

2005).

Na infecção pelo HBV, a resposta inata é induzida após aprimeira semana de infecção e é

mediada pelas próprias célulasinfectadas que reconhecem a presença do vírus e respondemcom a produção

de interferon tipo I (INF-I) α/β que interferena síntese viral por indução de diversas proteínas (Samuel,

2001; Rehermann et al, 2005).

O HBV fica quiescente até 4-7 semanas da infecção, quando inicia multiplicação vigorosa que

geralmente é controlada por linfócitos T, tanto CD4+ como CD8+ específicos que podem ser detectados

durante o aumento da replicação viral (Bertoletti et al, 2003). A diminuição da replicação viral é observada

com o aumento proporcional das transaminases, que é indicativa de injúria hepática mediada por linfócitos

T (Rehermann et al, 2005; Bertoletti et al, 2003). A eliminação do HBV na infecção aguda está associada

auma resposta vigorosa, policlonal e multiespecífica dos linfócitos TCD4+ e CD8+ aos epítopos do HBV;

(Rehermann et al, 2003; Ichikiet al, 2005). Na resposta agudaauto-limitada a maior parte dos virions do

HBV são eliminadosna fase de incubação sem a destruição das células do fígadodevido a ação de citocinas

antivirais TNFα e INFγ produzidaspela resposta inata e adaptativa por mecanismo não citolítico mediado

por células não T (Ferrari et al, 2003)

Na fase crônica do HBV, alguns pacientes conseguemeliminação tardia devido a produção de

grandes quantidades de citocinas e linfócitos TCD8+ específicos que diminuem a carga viraldo HBV

(Rehermann et al, 2003).A persistência do HBV pode estimularcontinuamente os linfócitos T específicos

que por sua vez, previnemre-infecções, mas a recuperação e proteção contra re-infecçõesnão estão

necessariamente associadas a imunidade perene(Rehermann et al, 2003). Os pacientes cronicamente

infectados que adquirem HBV na idade adulta geralmente apresentam um defeito na respostaespecífica dos

linfócitos T (Bertoletti et al, 1994). Diversos mecanismos têm sidopropostos para explicar a disfunção dos

linfócitos T, como a tolerânciaimunológica do fígado, a exaustão dos linfócitos T devido a altos níveisde

antígenos HBsAg e HBeAg (Ferrari et al, 2006) e a supressão da respostapelos linfócitos T regulatórios

(Bertoletti, 2006).

O tipo de inóculo e a cinética de replicação do HBV podeminduzir a uma grande resposta

imune caso o vírus infecterapidamente a maioria dos hepatócitos, mas a infecção desítios extra-hepáticos

10

pode não ser acessível aos linfócitos Tespecíficos contra o HBV. O escape viral e o aparecimento

demutações também dificultam o reconhecimento dos epítopos virais. A alta incidência de cronificação na

transmissãovertical do HBV pode decorrer de uma imaturidade do sistemaimune do recém nascido

determinando diminuição da ação dos linfócitos T, com menor secreção de TNFα e INFγ no fígado

(Nakamuraet al, 2001),com uma fase de imunotolerância que pode se prolongar pordécadas permitindo

altos níveis de DNA-HBV, HBeAg etransaminases normais.

Diversos trabalhos com chimpanzés demonstraram que as manifestações hepáticas da hepatite

B aguda ocorrem quando os níveis de DNA-HBV tornam-se indetectáveis, ou seja, a lesão resulta da ação

dos linfócitos T CD4+ e CD8+ bem como da indução das citocinas como TNFα e INFγ no fígado,

evidenciando o caráter não citopático da doença (Guidottiet al, 1999). Como conseqüência do dano

hepático repetido, verifica-se a tendência para instalação do quadro de cirrose. Esse quadro representa uma

associação direta entre o grau de comprometimento dos hepatócitos e o tempo de infecção (Lee et al,

1997).

I.1.7 – Aspectos clínicos e marcadores sorológicos

O HBV pode causar hepatites aguda, fulminate e crônica, podendo, nesse caso, haver

evolução para um quadro de cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (Gonçales et al, 1997).

A hepatite B aguda caracteriza-se pela presença de anticorpos anti-HBc da classe IgM,

além dos antígenos HBs, principal marcador de infecção presente, e HBe, marcador de replicação

viral ativa, no soro do paciente infectado. Concomitantemente, o DNA pode ser detectado (Sjogren

et al, 1994).

Durante a fase de convalescença, os títulos de anti-HBc IgM decaem, ao passo que os

títulos de anti-HBc IgG aumentam, normalmente permanecendo detectáveis por toda a vida. Nessa

fase, o HBsAg e o HBeAg tendem a desaparecer, e surgem os anticorpos anti-HBe e anti-HBs. Esse

último, um anticorpo protetor que neutraliza o vírus após infecção aguda (figura 1.5 A e B). Os

marcadores de replicação viral e as manifestações clínicas evoluem de forma dependente da

interação vírus-hospedeiro (Sjogren et al, 1994).

11

Figura 1.5: Perfil sorológico da infecção pelo HBV. A – Marcadores da infecção aguda. B –

Marcadores da infecção crônica. Fonte:

<http://www.infekt.ch/index.php?catID=14&artID=644>[Acesso em 22 maio 2013] (Figura

adaptada para o português).

A associação da hepatite B a casos de carcinoma hepatocelular ocorre normalmente em

indivíduos com sorologia positiva para o HBsAg e para o Anti-HBc. Pode estar muitas vezes

associado ao genótipo do vírus infectante e acaracterísticas particulares do hospedeiro. A integração

do DNA viral ao hospedeiro parece ser o evento inicial, capaz de induzir alterações celulares e no

genoma do HBV, desencadeando processos de mutagênese e carcinogênese (Zhou et al, 1988).

Os portadores crônicos constituem o principal reservatório do HBV, devido à persistência

viral no organismo. Em função disso, pacientes com a infecção crônica representam um sério risco

de transmissão da doença(Coursaget et al, 1991; Elghouzzi et al, 1995).

Os principais fatores associados à progressão da hepatite crônica incluem a idade na qual

o indivíduo foi infectado, que é inversamente proporcional ao risco de cronicidade, e o status

imune, destacando-se a imunossupressão, como a que ocorre em indivíduos portadores do vírus da

imunodeficiência humana (HIV), pacientes renais crônicos que fazem hemodiálise, pacientes renais

12

crônicos pós-transplante e leucêmicos. A infecção dos recém-nascidos, apesar de geralmente

assintomática, representa um risco de cerca de 90% de evolução para a forma crônica da doença.

Acredita-se que o estado de imaturidade do sistema imune nos muitos jovens seja importante no

desenvolvimento desse tipo de infecção (Strauss et al, 2003).

I.1.8 – Tratamento

A terapia temcomo objetivo mais importante a prevenção da mortalidade e morbidade

hepática como ocarcinoma hepatocelular e complicações cirróticas (Wong & Chan, 2013).

Nas últimas décadas, o desenvolvimento de agentes antivirais permitiu um

avançonaterapia contra o HBV. Entre esses agentes, análogos de nucleot(s)ídeos sãoimportantes e

potentes supressores virais. Os análogos de nucleot(s)ídeos são moléculas que atuam como

terminadoras de cadeia, pois impedem a replicação por não possuírem o grupo 3’hidroxila da ribose

que faz ligação fosfodiéster, impedindo portanto o ataque nucleofílico do fosfato 5’ do nucleotídeo a

ser adicionado à hidroxila 3’, e consequentemente a extensão da cadeia nascente (Yarchoan et al,

1989; Hart et al, 1992; Vivet-Bodou et al, 2006). No entanto, quando administrados sozinhos,

elesnão são capazes de abolir definitivamente o vírus, sendo necessária a manutenção da terapia a

longo prazo para que haja eficácia terapêutica. Porém, o tratamento prolongado é

frequentementerelacionado ao surgimento de mutantes resistentes a drogas (Chien, 2010)

(Figura1.6).

Sete drogas estão atualmente disponíveis para o tratamento da hepatite B

crônica:interferon α (IFN-α) e interferon peguilado α-2a (PEG-IFN α-2a) e os análogos

denucleot(s)ídeos lamivudina (3TC), adefovir dipivoxil (ADV), entecavir (ETV), telbivudina(L-dt)

e tenofovir (TDF) (Hoofnagle et al, 2007; Lok & McMahon, 2007; Marcellin, 2009).

No caso de resistência a análogos de nucleot(s)ídeos é necessário iniciar uma terapia de

resgate com o antiviral mai efetivo e que não compartilhe resistência cruzada para minimizar o risco

de induzir cepas multiresistentes (EASL, 2012). Segundo os guias de tratamento da AASLD

(American Association for the Study of Liver Diseases) de 2009 e EASL (European Association for

the Study of the Liver) de 2012, a terapia de resgate de pacientes resistentes a Lamivudia deve ser

realizada por meio da adição de Adefovir ou Tenofovir ao tratamento. Em casos de resistência ao

adefovir oProtocolo Clínico e DiretrizesTerapêuticas para o Tratamentoda Hepatite Viral Crônica B

e Coinfecções brasileiro (Brasil, 2010) recomenda que pacientes que já estejam em uso de adefovir

eapresentem evidências de resistência devem ser resgatadospreferencialmente mediante sua

substituição por tenofovirassociado à lamivudina, desde que não a tenham utilizadopreviamente. Já

13

a EASL (2012) recomenda a troca por entecavir, ou tenofovir, ou tenofovir mais emtricitabina.

Foram descritos poucos casos de resistência ao entecavir, mas nesses casos adiciona-se o tenofovir

ao esquema de tratamento (ETV+TDF) (Sherman et al, 2007; Sherman et al, 2008).

O tratamento contra a infecção pelo HBV não é indicado para todas as fases dainfecção,

sendo restrito aos casos onde ocorre dano hepático. Segundo oProtocolo Clínico e

DiretrizesTerapêuticas para o Tratamentoda Hepatite Viral Crônica B e Coinfecçõesbrasileiro

(Brasil, 2010) os critérios utilizados para tratamento da hepatite B são positividade para o HBeAg e

alterações nos níveis de aminotransferases hepáticas (ALT/AST), assim como preconizado pelas

sociedades europeia (EASL, 2012) e americana (AASLD, 2009).

Figura1.6: Mutações de Resistência a antivirais na Polimerase do HBV. Fonte: Lok et al, 2007

(Figura adaptada para o português).

14

I.2 – Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

I.2.1 – Histórico

A AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida) foi identificada pela primeira vez em

1981 nos Estados Unidos da América após relatos de imunodeficiência em homossexuais jovens do

sexo masculino (Gottlieb et al, 1981). Posteriormente, foi descrito um quadro clínico semelhante

em pacientes hemofílicos que haviam recebido hemoderivados previamente purificados e filtrados

em filtros bacteriológicos. Como os filtros bacteriológicos não impediam a passagem de vírus, o

fato chamou atenção para que o possível agente etiológico da AIDS pudesse ser um vírus

(Montagnier, 2010).

Em 1983, um grupo de pesquisadores do Instituto Pasteur isolou um novo retrovírus

citopático para linfócitos, que ficou conhecido como LAV (Lymphadenopathy-Associated virus)

(Barre-Sinoussi et al, 1983). Concomitantemente, Robert Gallo conseguiu isolar o HTLV-1 de

alguns casos (2 de 33) de pacientes com AIDS, falhando em estabelecer a causa da doença (Gallo et

al, 1984). No ano seguinte seu grupo conseguiu isolar o retrovírus responsável, sob o nome de

HTLV-3 (Popovic et al, 1984). Neste mesmo ano, foi isolado um retrovírus a partir de pacientes

doentes de AIDS de diferentes grupos de risco, que recebeu a denominação de ARV (AIDS-

Associated Retrovirus) (Levy et al, 1984).

Em 1985, análises das sequências de nucleotídeos dos vírus HTLV-3, LAV e ARV

isolados de diversos pacientes com AIDS demonstraram que os mesmos eram muito semelhantes e

pertenciam à mesma família de retrovírus. Em 1986, o International Committee on Taxonomy of

Viruses (ICTV) renomeou estes agentes como Human Immunodeficiency Virus (HIV) (Coffin et al,

1986). Desta forma, o agente causador da AIDS foi isolado e descrito como um lentivírus da família

Retroviridae e ficou conhecido como Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (Barre-Sinoussi et

al, 1983; Levy et al, 1984; Popovic et al, 1984).

Em 1984, foram relatados vários casos de imunodeficiência na África central entre

pacientes sem histórico de comportamento de risco (Clumeck et al, 1984; Piot et al, 1984; Van de et

al, 1984). Mais tarde, em 1990, nesta mesma região, o vírus da imunodeficiência símia (SIV) foi

isolado no macaco Cercocebus atys e um lentivírus muito semelhante ao HIV-1 foi identificado em

chimpanzés (Huet et al, 1990). Hoje, a origem do HIV-1 é atribuída ao Vírus da Imunodeficiência

Símia (SIVcpz) encontrado em chimpanzés da espécie Pan troglodytes troglodytes (Gao et al,

1999). Mais recentemente, outro SIV (SIVgor) com muitas propriedades biológicas necessárias para

a infecção em humanos foi descoberto em gorilas selvagens (Gorilla gorilla gorilla) (Van et al,

15

2006; Takehisa et al,2009 ).

A evidência mais antiga de infecção pelo HIV-1 em seres humanos data de 1959 em um

homem que faleceu devido infecção por Pneumocistis jiroveci (Williams et al, 1983). Este estudo

indica que o HIV-1 atravessou a barreira das espécies e começou a se disseminar entre humanos

anteriormente a esta data. Estudos baseados em taxa de evolução pelo relógio molecular, estimaram

que por volta do ano de 1908 o SIVcpz atravessou a barreira das espécies, infectou o ser humano

múltiplas vezes e se diversificou (Bailes et al, 2003).

I.2.2 – Propriedades Gerais

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) pertence à família Retroviridae,

subfamília Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus. As partículas do HIV são envelopadas, esféricas

com diâmetro entre 125 e 145 nm (Briggs et al, 2003; 2006) e apresentam um nucleocapsídeo em

forma de cone constituído pela proteína p24. Dentro do nucleocapsídeo existem duas moléculas

idênticas de RNA de fita simples, não covalentemente ligadas, com polaridade positiva. Enzimas

virais como DNA polimerase-RNA dependente (TR/p64), integrase (IN/p32), protease (PR/p10) e a

proteína do nucleocapsídeo p6 estão associadas às moléculas de RNA viral.A parte interna do

envelope é circundada por uma capa protéica (p17) ligada ao ácido mirístico, que fornece a matriz

para a estrutura viral e é vital para a integridade do vírion. A superfície do vírus é formada por

espículas constituídas por glicoproteínas (gp120 e gp41) presentes no envelope (revisado por Wigg,

2008) (figura 2.1).

Figura 2.1: Estrutura do HIV-1. Fonte: Kuby, 2007 (figura adaptada para o português).

16

A análise filogenética do HIV em humanos divide o grupo em dois tipos: HIV-1 e

HIV-2, com diferentes organizações do genoma.O HIV-1 está intimamente relacionado ao Vírus da

imunodeficiência de símios de chipanzés (SIVcpz) e o HIV-2 é geneticamente semelhante ao Vírus

da imunodeficiência de símios que é endêmico entre macacos mangabeys - SIVsm (Gao et al.,

1999; Sharp et al., 1999; Lemey et al., 2003).

A infecção pelo HIV-1 é predominante no mundo, enquanto o HIV-2 parece ser restrito

ao oeste Africano e a poucas áreas da Ásia (Hughes & Conte, 1998; Marx et al., 2000; Yamaguchi

et al., 2000; Wigg et al., 2008).Esta diferença na distribuição epidemiológica entre os subtipos pode

ser justificada pela baixa carga viral e transmissibilidade do HIV-2(Hughes & Conte, 1998; Popper

et al., 1999; Shanmugam et al., 2000; Wigg et al., 2008).

Com base em análises filogenéticas das sequencias dos genes env e gag, o HIV-1 é

classificado em quatro grupos: M (major), O (outlier), N (não M/não O) e P (proposto

recentemente) (Plantier et al, 2009 ; Ivanov et al, 2013). Atualmente são reconhecidos nove

subtipos do grupo M de HIV-1(A–D, F–H, J e K) e ainda alguns sub-subtipos como F1, F2 e A1-

A4. Além disso, uma grande variedade de formas recombinantes circulantes e formas

recombinantes únicas tem sido identificadas, demonstrando a complexidade genética do HIV-

1(Hemelaar J, 2012; Ivanov et al, 2013). Assim como o HIV-1, o HIV-2 também é classificado em

oito subtipos (A-H) (Peterson et al, 2011; Cunha et al, 2012). Esses subtipos genéticos têm impacto

na susceptibilidade a drogas, na emergência de mutações de resistência a drogas e no desempenho

de testes de laboratório para diagnóstico e determinação de carga viral (Cunha et al, 2012).

I.2.3 – Organização genômica

O genoma do HIV-1, de aproximadamente 10 Kb, é constituído por nove genes

flanqueados por duas regiões denominadas LTR (Long Terminal Repeats), onde estão presentes

elementos de controle para integração do DNA proviral ao genoma da célula hospedeira, transcrição

e poliadenilação dos mRNAs (Veronesi et al., 1999; Snustad & Simmons, 2001).

Os genes podem ser divididos em dois grupos, os que codificam proteínas estruturais:

gag, pol e env (Freed et al., 1998; Turner & Summer, 1999) e os que codificam proteínas não-

estruturais: tat, rev, nef, vif, vpu e vpr (Emerman & Malim, 1998; Sleasman & Goodenow, 2003).

Estes últimos recebem ainda a seguinte classificação: regulatórios ou funcionais (tat e rev), que são

necessários para a replicação viral in vitro, e acessórios (vif, vpu, vpr e nef), que embora não

essenciais para replicação in vitro, contribuem para o processo in vivo. Este último grupo de genes é

17

exclusivo do gênero Lentivirus, estando ausente no genoma de outros retrovírus (Trono, 1995).

O gene pol codifica uma poliproteína de 160 kilodaltons (KD) que após clivagem

proteolítica origina as enzimas virais transcriptase reversa (TR), protease (PR) e integrase (IN). A

TR é constituída por dois monômeros: p51e p66, e representa uma enzima fundamental para o ciclo

replicativo do HIV- 1, uma vez que é responsável pela síntese de DNA (ácido desoxirribonucléico)

a partir do RNA viral (Connor & Ho 1992).

Em razão da ausência de capacidade de reparo, a TR não é capaz de corrigir erros que

ocorrem durante a retrotranscrição, o que consequentemente leva a uma alta taxa de mutações. A PR

viral está envolvida no processamento pós-traducional das poliproteínas gag (para produzir as

proteínas estruturais p24, p17 e p7 do core viral) e gag-pol (para produzir enzimas essenciais como

TR e IN). Este processamento gera várias proteínas e enzimas virais, e a PR é necessária para o

ciclo replicativo do vírus e importante alvo de terapia antirretroviral (TARV) (Gavin & Yogen

2002).

A IN é essencial para incorporação do DNA viral ao DNA celular. O genoma viral

integrado é denominado ―provírus‖ e serve de molde para a geração de RNAs genômicos e

mensageiros quando a célula infectada for ativada e começar a transcrever seus próprios genes

(Connor & Ho 1992). A IN também é responsável por outras funções no ciclo replicativo que

incluem cooperação na transcrição reversa, importação nuclear dos complexos pré-integração e

produção de partículas do vírus (Mulder et al. 2002).

O gene gag codifica uma proteína de 55kD, a qual, após clivagem, origina proteínas

da matriz (p17), do capsídeo (p24) e do nucleocapsídeo (p7/p9) (Connor & Ho 1992).

Entre os três genes estruturais, o gene env é o que revela maior variabilidade genética.

Variações nas sequências dos genes gag e pol podem levar à formação de vírus inviáveis, mas as

sequências env aceitam um grande número de substituições, muitas das quais auxiliam no escape à

resposta imune do hospedeiro (Connor & Ho 1992).

As LTRssão sequências idênticas que se localizam em cada extremidade do genoma

(5’ e 3’) e regulam a integração do genoma viral ao genoma da célula do hospedeiro, a expressão de

genes virais, bem como sua replicação (Peng et al. 1989). O gene tat regula a transcrição destas

LTRs pela ligação aos RNAs recém-transcritos.

O gene rev promove o transporte do RNA mensageiro (RNAm) do núcleo para o

citoplasma para tradução de novas proteínas de env, gag e pol. O gene nef está envolvido na

replicação do HIV-1 in vivo. O gene vif desempenha um papel importante na fase de maturação viral

mediante o desenvolvimento da estrutura cônica do capsídeo, que está envolvida na infecciosidade

dos vírions. O gene vif também pode interromper a atividade antiviral da enzima humana APOBEC,

18

umacitidina desaminase que modifica osácidos nucléicos virais por degradação proteossômica, ao

formar um complexo com essa enzima impedesua entrada nos vírions, impedindo-a de causar seu

efeito letal de hipermutação nos vírions. O gene vpu atua na liberação de vírions de células

infectadas através dobrotamento das partículas virais recém produzidas. O gene vpr se liga ao

complexo de pré-integração facilitando o transporte do material genético até o núcleo e parece estar

envolvido nareplicação do HIV nas células do hospedeiro que não estão em divisão(Barre-Sinoussi

1996, Miller et al. 2007, HIV Database, 2010a). A organização genômica do HIV-1está representada

na figura 2.2.

Figura 2.2: Organização genômica do HIV-1. MA= Matriz; CA=capsídeo;NC=nucleocapsídeo;

PR=protease; RT=Transcriptase Reversa; IN=integrase; SU=superfície; TM=Transmembrânica.

Disponível em: <http://www.stanford.edu/group/virus/retro/2005gongishmail/HIV-1.html>[Acesso

em 21 out. 2013] (Figura adaptada para oportuguês).

I.2.4 – Replicação do HIV

Os principais eventos do processo de entrada do vírus na célula do hospedeiro são

divididos entre os eventos de ligação com os receptores e co-receptores e eventos de fusão do

envelope do vírus com a membrana da célula alvo. A unidade funcional do envelope é um trímero

de gp41 e um trímero de gp120, as quais são associadas por interações não-covalentes. A associação

não-covalente destas subunidades permite mudanças significativas na conformação destas

19

glicoproteínas. A gp120 deve ser flexível para permitir a mudança conformacional e ao mesmo

tempo manter contato com a gp41. Esta flexibilidade garante a integridade do trímero após ligação

com a molécula CD4 e permite as transições da gp41 durante o processo de fusão (Pancera et al,

2010). A molécula CD4 é necessária para adsorção viral à célula hospedeira, no entanto, é

insuficiente para assegurar a entrada do HIV-1que requer co-receptores (Doranz et al., 1996; Feng

et al., 1996; Chapham & Weiss, 1997; Moore, 1997; Snustad & Simmons, 2001).

Os dois principais co-receptores, CCR5 e CXCR4, respectivamente receptores de β-

quimiocina e α-quimiocinas, são expressos diferentemente em subpopulações de células CD4+,

incluindo linfócito T, timócitos e células dendríticas (Doms, 1997; Snustad & Simmons, 2001).

Os vírus diferem na habilidade de atacar os grupos de co-receptores. Por exemplo,

aqueles que usam CCR5 infectam preferencialmente macrófagos e subpopulações de células T de

memória. Têm o crescimento relativamente lento in vitro e são infectados principalmente durante a

fase assintomática da infecção, sendo essa linhagem denominada macrófago trópica (M- trópico) ou

não indutores de sincício - NSI (Samson et al., 1996; Cecília et al., 2000; Sleasman & Goodnow,

2003).

Já os vírus que usam CXCR4 têm tropismo preferencial por linfócito T CD4+ e células

T transformadas. São altamente citopáticos e têm crescimento acelerado, sendo essa linhagem

denominada linfócito trópica (T- trópico) ou indutores de sincícios - SI (Luster et al., 1998;

Garzino-Demo et al., 2000).

A entrada do vírus se inicia com a ligação da gp120 com o primeiro domínio Ig-like

da molécula CD4 da célula alvo. A ligação com o CD4 resulta em uma reconfiguração da molécula

gp120. O ―assoalho‖ da molécula se estabiliza e a alça V3 é exposta. Os domínios da alça V3

interagem com a segunda alça extracelular dos co-receptores CCR5 ou CXCR4. Após interação

com o co-receptor, peptídeos hidrofóbicos da gp41 (peptídeos de fusão) são inseridos na membrana

da célula alvo. Este evento ancora o vírus na membrana da célula do hospedeiro, e a gp41 age como

uma ponte entre o vírus e a membrana celular. As regiões C- e N-terminal das regiões hepta-

repetidas da gp41, conhecidas como HR1 e HR2 se emparelham formando um complexo pré-

fusional estável composto por seis α-hélices do tipo helicoidal. Este emparelhamento da HR1 com a

HR2 promove a aproximação e contato entre a membrana celular e o envelope viral, formação de

poros de fusão e liberação do capsídeo no citoplasma da célula hospedeira (Eckert & Kim, 2001).

Existem outros co-receptores para HIV-1 descritos, como o CCR2 e o CCR3 que são

receptores fisiológicos para as quimiocinas MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7, MCP-

4/CCL13, eotaxina-2/CCL24, eotaxina-3/CCL26 expresso em eosinófilos e nas células da

microglia, podendo resultar em doença do sistema nervoso central (He et al., 1997; Ross & Cullen,

20

1998).

Após a entrada do vírus na célula, o RNA viral é transcrito em DNA proviral pela TR.

O processo de transcrição reversa ocorre no citoplasma da célula, 4-6 horas após a infecção. Como

há um intenso e rápido turnover do HIV-1, pode ocorrer erros de incorporação de nucleotídeos pela

transcriptase reversa levando a inserções, deleções e substituições durante a transcrição do RNA

viral em cDNA (Bebenek et al., 1989). A TR também tem baixa afinidade pela fita molde de RNA

que permite a enzima saltar de uma fita para outra gerando uma fita de cDNA com alterações e

consequentemente gerar recombinantes intra ou intersubtipos contribuindo para a alta diversidade

genética do vírus (Stuhlmann & Berg, 1992).

O cDNA viral é transportado para o núcleo a partir de complexos de pré-integração e é

então integrado ao DNA da célula hospedeira mediante ação da enzima viral IN. O genoma viral

integrado ao genoma da célula hospedeira é denominado ―provirus‖. O DNA proviral integrado ao

genoma da célula hospedeira servirá de molde para a geração de RNAs genômicos quando a célula

infectada for ativada e começar a transcrever seus próprios genes.

As células infectadas pelo HIV-1 e com DNA proviral integrado podem ser ativadas

por citocinas da resposta imune celular, como IL-2 e fator de necrose tumoral (TNF), desencadeada

pelo próprio processo infeccioso gerado pelo HIV-1 (Freed, 2001). A ativação celular resulta na

ativação da expressão gênica e ativação da RNA polimerase que inicia o processo de transcrição

gênica. No entanto, as RNA polimerases são incapazes de transcrever sequências maiores que

algumas centenas de nucleotídeos. Assim, a proteína viral tat liga-se ao RNAm e aumenta a

capacidade de transcrição da RNA polimerase, permitindo a formação de RNAm virais funcionais

que são transportados para fora do núcleo para serem traduzidos.

Durante a tradução, primeiramente são sintetizados os genes reguladores e acessórios e

depois os genes estruturais (Turner & Summers 1999, Swanson et al. 2004).

A montagem das partículas virais infecciosas ocorre mediante o empacotamento do

genoma viral, das proteínas codificadas pelo gene gag (p17, p24 e p7/p9) e das enzimas codificadas

pelo gene pol (TR, PR e IN). O complexo núcleo-proteína é inserido em um envelope contendo as

glicoproteínas virais gp120 e gp41. A liberação dos vírions ocorre por brotamento da membrana

plasmática da célula infectada e as novas partículas virais liberadas são capazes de infectar outras

células após o processo de maturação que ocorre no meio extracelular, dando continuidade ao ciclo

infeccioso (Turner & Summers 1999, Freed, 2001). A replicação do HIV está representada na figura

2.3.

21

Figura 2.3: Ciclo replicativo do HIV. Disponível em:

<http://soumaisenem.com.br/biologia/programa-de-saude/programas-de-saude-viroses-aids>

[Acesso em 22 out. 2013]

I.2.5– Transmissão

Sabe-se que a transmissão do HIV pode ocorrer por três vias: i) relações sexuais não

protegidas com parceiros contaminados; ii) Por contato com sangue ou hemoderivados,

contaminação via sanguínea, típica em usuários de drogas intravenosas que partilham seringas com

pessoas contaminadas ou indivíduos que fazem uso de transfusões sanguíneas ou hemoderivados

sem um controle específico; e iii) transmissão materno-infantil que pode ocorrer durante a

gravidez, parto ou aleitamento materno (Nishimoto et al, 2005).

22

I.2.6 – Patogenia

Durante a fase aguda da infecção pelo HIV-1 ocorre um controle inicial alcançadopelo

sistema imunológico do hospedeiro, que pode ser observado pela queda daviremia e pelo

desenvolvimento de linfócitos TCD8+ com atividade citotóxica (CTLs)antes mesmo do

aparecimento de anticorpos neutralizantes, sugerindo a participaçãode uma imunidade celular no

controle inicial do vírus (Koup et al., 1994). A este quadro associa-se a participação de citocinas

pró-inflamatórias para as quais um aumento é observado na fase inicial da infecção (Cohen et al.,

1997, Hogan et al., 2001).

O achado de que o HIV é confinado aos leucócitos CD4+ e é citopático para as células

T CD4+ estabeleceu a hipótese de que o HIV causa imunodeficiênca diretamente por matar as

células T CD4+ e impedir sua renovação (Fauci et al, 1996). Os mecanismos moleculares

involvidos na morte das células T CD4+ pela infecção do HIV tem sido bastante estudado, levando

a nova compreenção sobre os efeitos a jusante da infecção abortiva e a integração viral na morte da

célula (Douek et al, 2002; Doitsh et al, 2010; Cooper et al, 2013 ). Entretanto, o aumento das taxas

de apoptose nos indivíduos HIV-infectados não está restrito as células T CD4+ infectadas, mas

também é observado nas células T CD4+ não infectadas e em células que não são alvo da infecção

por HIV, sugerindo que o efeito citopático não é causado apenas pelo HIV (Meyaard et al, 1992;

Finkel et al, 1995).

A deterioração do sistema imune em consequência da infecção viral, tanto quantitativa

quanto funcional parece inevitável, culminando no desenvolvimento da AIDS. O advento da Terapia

Antirretroviral Altamente Ativa (Highly Active Antiretroviral Therapy– HAART) trouxe uma boa

perspectiva de controle da replicação viral e a consequente recuperação imunológica com a

reposição de células CD4+ nos indivíduos infectados, embora em longo prazo a evolução do HIV

no hospedeiro leve ao mecanismo de resistência e à reativação da replicação do vírus.

A capacidade de evolução do vírus, com mecanismos de escape como reservatório da

infecção com vírus em latência em pool de células CD4+ e o mecanismo de resistência do vírus

àsdrogas dificultam o controle da infecção(Pantaleo e Fauci, 1996; Rambaut et al,.2004). No

entanto, as pessoas que tem acesso aHAART prolongam o tempo além de obterem melhorias na

qualidade de vida.

23

I.2.7 – Evolução clínica

A doença causada pelo HIV é caracterizada por três fases: doença primária aguda,

doença crônica assintomática e doença crônica sintomática. A taxa de progressão de uma fase para

outra é altamente variável.O espectro clínico da infecção pelo HIV-1 é amplo, variando desde

formas assintomáticas até as bem estabelecidas, com riquezas de sintomas e evolução para o óbito

(Leão et al., 1997; Grant & Cock, 2001).

Após a transmissão, inicialmente o HIV se replica em linfonodos regionais. Isso

resulta em um rápido aumento na carga viral plasmática para níveis superiores a um milhão de

cópias / mL.Esta fase é acompanhada por disseminação do HIV para órgãos linfóides, intestino e do

trato genital (Embretsonet al, 1993).Seguindo o pico de viremia, carga viral no plasma diminui

coincidente com o desenvolvimento de respostas imunes celulares hospedeiras (Koup et al, 1994).

O pico de carga viral no plasma e o desenvolvimento de respostas imunes celulares estão associados

com uma doença sintomática em 60-90% dos pacientes (Tindall et al, 1988; Pedersenet al,1989).

Na ausência de tratamento, o tempo médio para desenvolver AIDS é 10-11 anos

(Rutherfordet al, 1990;Mellorset al, 1997). A sobrevida média após AIDS na ausência de terapia

anti-retroviral combinada depende da contagem de células CD4 no diagnóstico da AIDS: 3,7 anos

se a contagem de células CD4 for menor que 200 células/µL e 1,3 anos se a contagem de células

CD4 for menor que 70 células/µL (Fauci et al, 1996). No entanto, as taxas de progressão da doença

para AIDS variam de rápida progressão dentro de seis meses de soroconversão(Demarest et al,

2001), a não progressão significativa. Indivíduos sem progressão da doença foram previamente

referidos como não progressores de longo prazo. Por definição, estes indivíduos têm contagem de

células CD4 acima de 500 células/µL e foram assintomáticos apesar de mais de 10 anos de infecção

sem receber tratameto anti-HIV específico. Entre 1-5% das pessoas com infecção por HIV caem

nessa categoria(Strathdeeet al, 1995). Entretanto, com mais tempo de acompanhamento eo uso de

melhores modelos prognósticos, essas pessoas irão eventualmente experimentar a progressão da

doença.

O termo controladores de elite se refere às pessoas que mantém níveis virais

indetectáveis na ausência de terapia antiviral. Aproximadamente 0,6% das pessoas infectadas com

HIV são consideradas controladores de elite (Lambotte et al, 2005). Tem sido mostrado que essas

pessoas possuem respostas imunes HIV específicas mais fortes quando comparados com pessoas

que não controlam a replicação viral. Os fatores genéticos que se sabe estarem associados com a

progressão lenta da doença doHIV foram detectados em menos de 25% destas pessoas (Pereyra et

al, 2008), 10% das quais tinham contagem de células CD4 menor do que 350 células/ µL e 3%

24

tinham AIDS (Hunt et al, 2008). Controladores de elite tiveram níveis aumentados de

lipopolissacarídeo associados com aumento dos níveis de ativação imunológica, quando

comparados com controles HIV-negativos (Hunt et al, 2008).

Quando usado corretamente, a HAART resulta num rápido controle do HIV e restaura

parcialmente a função imune, levando a prevenção de várias complicações que definem a AIDS.

Entretanto o tratamento não restaura a saúde completamente. Os resultados de estudos realizados

em países de alta renda mostraram que adultos infectados com HIV que tiveram supressão do HIV

durável mediada por tratamento estão sob risco de desenvolver diversas disordens não-AIDS,

incluindo doenças cardiovasculares, câncer, doença renal, doença hepática, osteopenia ou

osteoporose e doença neurocognitiva (Deeks et al, 2013).

Pacientes HIV-infectados também estão sob o risco de doenças como hipertensão e

diabetes, ambos os quais são cada vez mais reconhecidos como os principais problemas de saúde

em toda a África (Murray et al, 2012).

I.2.8– Tratamento

O desenvolvimento de drogas antirretrovirais (ARV)eficazes que proporcionam

importantesopções de tratamento para o HIV-1 foi um progresso significante na luta contra o HIV.

A terapia antirretroviral tem como objetivo reduzir a viremia plasmáticaa níveis indetectáveis,

resgatar e preservar o sistema imunológico, reduzir a progressão clínica e mortalidade e diminuir a

transmissão do HIV-1 (Hammer et al. 2008).

Uma ampla variedade de combinações de drogas antirretrovirais encontra-se em uso

atualmente. Combinações de medicamentos potentes tornou-se o padrão usual de tratamento para os

indivíduos infectados pelo HIV-1. Atualmente os compostos disponíveis anti-HIV atuam nas

seguintes enzimas: transcriptase reversa, protease, proteínas de fusão e integrase.

Os inibidores de TR nucleosídicos (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor -

NRTIs) compreendem sete drogas: Zidovudina (AZT), Stavudina (d4T), Emtricitabina (FTC),

Lamivudina (3TC), Didanosina (ddl), Abacavir (ABC) e Tenofovir (TDF); que são moléculas que

atuam como terminadoras de cadeia, pois impedem a replicação por não possuírem o grupo

3’hidroxila da ribose que faz ligação fosfodiéster, impedindo portanto o ataque nucleofílico do

fosfato 5’ do nucleotídeo a ser adicionado à hidroxila 3’, e consequentemente a extensão da cadeia

nascente (Yarchoan et al, 1989; Hart et al, 1992; Vivet-Bodou et al, 2006).

São utilizados também três inibidores de TR não-nucleosídicos (Non-Nucleoside

25

Reverse Transcriptase Inhibitors - NNTRIs): Nevirapina (NVP), Efavirenz (EFV) e Etravirine

(ETR); essa classe liga-se de modo não-competitivo e reversível a transcriptase reversa, alterando

assim sua função.

Estão disponíveis no mercado dez medicamentos capazes de inibir a enzima protease:

saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), indinavir (IDV), lopinavir (LPV/r), nelfinavir, amprenavir,

atazanavir (ATV), fosamprenavir (FPV), tipranavir e darunavir (Souza & Almeida, 2003).Os

inibidores da protease interferem no processamento das poliproteínas no vírion em brotamento e

resultam em partículas não-infecciosas. O maior problema encontrado para este fármaco, é que eles

causam lipodistrofia (redistribuição de gordura, de modo que os membros tornam-se magros e a

gordura é depositada ao longo do abdômen e do dorso superior) e hiperglicemia (Strohl et al, 2004).

A enzima integrase é fundamental no processo de replicação viral, sendo responsável

pela integração do DNA viral ao cromossomo hospedeiro, permitindo assim a continuação do ciclo

da replicação viral (Souza& Almeida, 2003).Aparentemente estes compostos têm a capacidade de

prevenir o processo de integração mesmo após a formação do chamado complexo pré-integrativo,

formado pelo DNA viral, integrase e outras proteínas (Peçanhaet al, 2002).Raltegravir foi um dos

primeiros medicamentos pertencentes a essa classe, aprovado pela FDA em 2007.

O Protocolo Clínico e DiretrizesTerapêuticas Para Manejo Da Infecção Pelo HIV Em

Adultos (Brasil, 2013) recomenda como primeira linha de tratamento a combinação

TDF+3TC+EFV, sendo o efavirenz (EFV) recomendado na apresentação de dose fixa combinada,

sempre que disponível.

Embora as taxas de sucesso do tratamento antiviral sejam elevadas, pacientes em falha

virológica normalmente necessitamde alterações em seus esquemas antirretrovirais, sendo o novo

tratamento denominado ―esquema de resgate‖. Oreconhecimento precoce da falha virológica e a

escolha adequada e oportuna do novo tratamento são fundamentaispara minimizar as consequências

da supressão viral parcial ou incompleta. Um dos fatores relacionados a falha terapêutica é o

surgimento de mutações de resistência. Na terapia de resgate de indivíduos com resistência a

lamivudina é recomendado a manutenção dessa droga.

Embora a mutação no códon 184 da transcriptase reversa (M184V) leve à resistência

ao 3TC, sua presença aumentaa atividade inibitória da zidovudina (AZT) e do tenofovir (TDF),

podendo reverter parcialmente a resistência a essesmedicamentos. Mesmo na presença dessa

mutação, ainda existe uma atividade residual do 3TC. Adicionalmente,essa mutação tem impacto

favorável no fi tness viral. Assim, recomenda-se a manutenção do 3TC, mesmo com amutação

M184V, em esquemas de resgate com AZT ou TDF. Por outro lado, na presença dessa mutação, o

uso do3TC pode prejudicar a resposta ao abacavir (ABC) e, possivelmente, à didanosina (ddI), nos

26

esquemas de resgate (Brasil, 2013).

I.3 – Coinfecção HBV-HIV

O vírus da hepatite B é um dos principais problemas de saúde pública mundial, apesar

da existência de uma vacina eficiente. Estima-se que 2 bilhões de pessoas já tenham sido infectadas

e que existam no mundo cerca de 240 milhões de portadores crônicos (Ott et al, 2012). O vírus da

imunodeficiência humana (HIV-1) possui, atualmente, 34 milhões de portadores, dentro dos quais, 3

milhões também apresentam algum marcador sorológico para o HBV (Soriano et al, 2009). Devido

às vias de transmissão compartilhadas (exposição ao sangue ou hemoderivados contaminados, por

via sexual, pela injeção intravenosa e transmissão vertical), a infecção pelo HBV em pacientes HIV

positivos possui uma alta prevalência (Konopnicki et al.,2005). As duas principais consequências da

hepatite B crônica são cirrose e carcinoma hepatocelular, ambas podem levar a morte. A história

natural da hepatite B é complexa e a progressão para fibrose avançada pode variar muito. A

coinfecção com o HIV complica a história natural do HBV, promovendo elevadas taxas de casos

crônicos, após a exposição aguda, aumentando os níveis de replicação do HBV em pacientes

crônicos e diminuindo a incidência de clearence dos antígenos virais (HBeAg e HBsAg)

(Carbonero & Poveda, 2012).

A doença hepática em pacientes positivos para HIV-1 é umas das principais causas de

morbi-mortalidade, uma vez que esses indivíduos são mais propensos a tornarem-se portadores

crônicos e apresentam níveis de replicação do HBV mais elevados (Koblin et al, 1992). Uma baixa

contagem de células CD4+ em pacientes coinfectados tem sido associada ao risco de cirrose e

carcinoma hepatocelular(Clifford et al, 2008; Thio, 2009; Martín-Carbonero et al, 2011). Além

disso, a presença de infecção crônica por HBV tem um impacto negativo na progressão da AIDS,

aumentando a replicação do HIV e intensificando a perda de células CD4 (Idoko et al, 2009; Dore

et al, 2010).

Um obstáculo que pode comprometer o sucesso do tratamento antirretroviral em

pacientes HBV/HIV coinfectados está relacionado ao risco aumentado de hepatotoxicidade

relacionada ao antirretroviral (Sulkowski et al, 2000; Aceti et al, 2002; Sorianoet al, 2008). O

aparecimento de hepatotoxicidade pode complicar o gerenciamento desses pacientes, entretanto,

não se deve suspender ou contra-indicar o uso do medicamento, uma vez que a HAART reduz a

mortalidade relacionada a complicações hepáticas em pacientes HBsAg positivos com infecção por

HIV (Bonacini et al, 2004). A maioria das diretrizes recomenda a introdução precoce do tratamento

contra HIV em todos os pacientes HBV/HIV coinfectados. (Soriano et al, 2008; Department of

27

Health and Human Services, 2013; European AIDS Clinical Society, 2013).O tratamento anti-HBV

com análogos de nucleos(t)ídeos pode melhorar ou parar completamente a progressão da fibrose

hepática em pacientes HBV/HIV coinfectados.Pacientes com indicação de tratamento para hepatite

B, e para os quais o interferon não estejarecomendado, devem iniciar mais precocemente a TARV,

com esquema contendo TDF e 3TC (Brasil, 2013).

A taxa de eventos de descompensação hepática e morte diminuíram nesta população,

como resultado do uso generalizado de TDF, 3TC ou FTC, resultando na não detecção prolongada

de HBV-DNA no soro da maioria dos pacientes. (Vries-Sluijs et al, 2010; Martín-Carbonero et al,

2011).

I.4 - A transcriptase reversa

A transcriptase reversa (TR) é uma enzima importante na replicação dos dois vírus e

alvo constante no tratamento antirretroviral. No HBV, a transcriptase reversa é codificada pelo gene

da polimerase viral (ORF P), que cobre um espaço de 80% do genoma completo, e ainda se

sobrepõe a outras três ORFs: pré-S/S, C e X. A ORF P codifica um produto de 90kDa com quatro

domínios: proteína terminal, espaçador, transcriptase reversa e Rnase H. O domínio TR propicia a

atividade RNA polimerase – DNA dependente, onde se situa o motivo de aminoácidos YMDD (Tyr-

Met-Asp-Asp), que é essencial para a replicação viral (Toh et al, 1983; Das et al, 2001). Existe uma

homologia entre as polimerases virais. Em particular, essas enzimas compartilham o motivo

YMDD. A transcrição reversa é um processo sujeito a erros e, desse modo, conforme ocorre nos

retrovírus como o HIV-1, este processo resulta na seleção de quasi-espécies num indivíduo

infectado pelo HBV (Domingo and Holland 1997; Negroni, et al 2001; Fallot et al2012).

A região pol do HIV-1 codifica duas enzimas criticamente importantes: TR e protease.

A TR é um heterodímero que possui duas subunidades, uma de 51-kDa e outra de 66-kDa. Como a

TR do HBV, ela possui as atividades de DNA polimerase e de RNase H, responsáveis pela

conversão de uma fita-simples de RNA genômico viral em uma fita dupla de DNA viral na célula

hospedeira. O domínio YMDD da p66 é necessário para a função de polimerase da TR. Análises

mutacionais do YMDD da p51 indicam sua importância na montagem e interação da subunidade

durante a formação da TR em um heterodímero ativo (Mulky et al, 2004). Variações intra e inter-

clados dentro da região da polimerase são particularmente relevantes porque é sobre esta região que

muitos medicamentos antivirais são dirigidos (Spira et al, 2003).

28

I.5 – Pirosequenciamento e mutações de resistência

O tratamento simultâneo das infecções HBV/HIV-1 é delicado. As moléculas

utilizadas no tratamento antirretroviral podem ser hepatotóxicas (Altfeld et al, 1998; Wit et al,

2002) e há inúmeras interações entre as drogas utilizadas contra os dois vírus (Perronne, 2006).

Durante a última década, o desenvolvimento de análogos de nucleosídeo/nucleotídeo (NRTI) com

potencial terapêutico e boa tolerabilidade levou a grandes avanços na terapia da hepatite B e da

AIDS.No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante o tratamento, levando a

perda da susceptibilidade às drogas utilizadas. As mutações de resistência podem ser divididas em

primárias e secundárias. A resistência primária é diretamente responsável pela perda da

susceptibilidade e as mutações secundárias tendem a ser compensatórias e restauram a aptidão dos

mutantes inicialmente selecionados.

A Lamivudina (3TC) é um análogo de nucleosídeoque inibe a TR e seu uso é

preconizado na ação contra o HIV-1 e contra o HBV (Bessesen et al, 1999). É uma droga bem

tolerada, mas a eficácia contra o HBV é limitada devido ao aparecimento de vírus com mutações

relacionadas à resistência. Reativações da replicação do HBV, muitas vezes fatais, após a

emergência de mutantes de resistência ou após a interrupção do tratamento têm sido relatadas

(Bonacini 1997; Bessesen et al, 1999; Manegold et al, 2001; Taramasso et al, 2011). A frequência

de resistência geralmente é de 24% após 1 ano e 70% após 4 anos de terapia (Liaw et al., 2000;Lai

et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo, 2008). A seleção de resistência a lamivudina no HBV é

o maior problema entre os pacientes HBV/HIV coinfectados. Variantes HBV resistentes a

lamivudina desenvolvem-se mais rapidamente nessa população do que em pacientes HBV

monoinfectados (Benhamou et al,1999).

As mutações (rtL180M e rtM204V/I) estão relacionadas ao domínio da transcrição

reversa no gene da polimerase do HBV, sendo que mais de 90% dos pacientes coinfectados com

HIV-1/HBV em tratamento com 3TC apresentam essa dupla mutação (Liaw et al, 1999; Thibault et

al, 1999; Leung et al, 2001; Lai et al, 2003). Uma terceira mutação de resistência (rtV173L) pode

ser encontrada. Esta mutação e a rtL180M (mutações compensatórias) restauram parcialmente a

replicação viral cuja a capacidade é afetada pela mutação primária rtM204V/I (William et al, 2003;

Zoulim and Locarnini, 2009; Yuen and Locarnini, 2009). No gene pol do HIV-1, a mutação M184V

é a mais comum de resistência aos NRTI e pode aparecer em até 12 semanas de uso da droga

(Schuurman et al, 1995; Johnson et al, 2008).

Até o momento, o método mais comumente utilizado para detecção de resistência a

drogas é o sequenciamento direto dos produtos amplificados por PCR através do método de

29

Sanger.Além de ser um método laborioso e demorado, o sequenciamento direto é limitado por sua

incapacidade de detectar variantes presentes em quantidades minoritárias numa população

heterogênea. Portanto, outras técnicas molecularescomo o Real-Time PCR, pirosequenciamento,

RFLP(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição), seqüenciamento por

hibridização e INNO-LiPA (Innogenetics)têm sido utilizadas para discriminar misturas de

populações (Shaw et al, 2006; Shendure and Ji, 2008)

A mutação rtM204V/I é caracterizada por uma substituição de A por G no códon ATG

(metionina)no motivo YMDD gerando uma valina (YVDD) e qualquer substituição no nucleotídeo

G do mesmo códon ATG, leva a codificação do aminoácido isoleucina (YIDD). A substituição de

uma leucina na posição 180 do domínio da transcrição reversa no gene da polimerase por uma

metionina ocorre quando há uma substituição do T ou C (códons T/CTG - leucina) por A (códon

ATG – metionina), caracterizando a mutação rtL180M.A substituição do G da 1a posição do códon

GTG (valina) por T ou C na posição 173 do domínio da transcrição reversa no gene da polimerase

causa a substituição de valina por uma leucina (T/CTG), caracterizando a mutação compensatória

rtV173L.

A mutação de resistência a Lamivudina do HIV M184V/I é causada pela substituição

de um C por um G, T ou A no códon TAC na posição 184, causando uma mutação de metionina

para isoleucina. Ocorre mutação de metionina para valina quando ocorre a substituição de T por C

no códon TAC na posição 184.

O pirosequenciamento é um método de sequenciamento que quantifica a atividade da

DNA polimerase através da detecção de pirofosfato liberado pela adição de um dNTP ao extremo 3’

de um primer. Isto permite a determinação da sequencia de uma simples fita de DNA através da

síntese de uma fita complementar, uma base de cada vez, detectando qual base é adicionada a cada

etapa. O pirosequenciamento é o método mais rápido e, provavelmente, o mais sensível, atualmente

disponível para detecção de pequenas subpopulações de vírus resistentes e o único capaz de

apresentar dados quantitativos das sequencias obtidas (Mello et al., 2012).

A reação do pirosequenciamento é iniciada quando oligonucleotídeos específicos de

cada região se hibridizam com o DNA amplificado, em seguida a DNA polimerase adiciona o dNTP

a fita de DNA e cada incorporação libera uma molécula de pirofosfato (PPi).A ATP sulfurilase

converte o PPi em ATP na presença de adenosina 5’ fosfosulfato (APS). Esta ATP conduz a

conversão, mediada pela luciferase, da luciferina em oxiluciferina, que gera luz visível em

quantidades que são proporcionais à quantidade de ATP. A luz produzida na reação catalisada pela

luciferase é detectada por um chip CCD (charge coupled device) e vista como um pico na saída de

dados (Pyrogram). A altura de cada pico (luz de sinal) é proporcional ao número de nucleotídeos

30

incorporados.Apirase, uma enzima nucleotídeo-degradante, degrada continuamente nucleotídeos

não incorporados e ATP. Quando a degradação é completa, é adicionado outro nucleotídeo (Qiagen,

2013).

Esta técnica detecta populações minoritárias que representam pelo menos 5% do total

da população circulante, enquanto que o sequenciamento de Sanger detecta apenas populações

minoritárias presentes em mais de 20% do total da população da amostra (Melloet al, 2012).As

moléculas variantes com mutações de resistência a drogas, muitas vezes não detectadas, são

clinicamente relevantes, pois podem gerar a falha no tratamento antirretroviral (Wang et al, 2005;

Metzner et al, 2009). Diante disso, o pirosequenciamento apresenta-se como uma ferramenta

importante, uma vez que se propõe a detectar subpopulações virais inferiores a 10%(Leet al, 2009;

Margeridon-Thermet et al, 2009).

31

II - OBJETIVOS

Objetivo geral

Analisar o perfil de mutações de resistência à lamivudina de isolados de HBV e HIV-1

de pacientes coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento.

Objetivos específicos:

Detectar e quantificarmutações de resistência à3TC nas posições rtM204V/I, rtL180M e

rtV173L do HBV e M184V/I do HIV-1, de indivíduos coinfectados, utilizando a técnica de

pirosequenciamento.

Sequenciar os isolados de HBVe HIV através dométodo de Sanger e compararcom os

resultados obtidos pelo pirosequenciamento.

Genotipar os isolados de HBV.

32

III – METODOLOGIA

Amostragem:

Quarenta e três amostras de pacientes coinfectados HBV/HIV em duas instituições

diferentes foram selecionados. Além destas, duas outras amostras provenientes de um estudo prévio

em uma população de homens que fazem sexo com homens, também foram incluídas. Este estudo

foi aprovado pelos comitês de ética de cada local de coleta.

1- Trinta pacientes provenientes do Instituto de Pesquisa Evandro Chagas (IPEC), Rio de Janeiro.

Três pacientes possuem duas datas de coleta com intervalos de coleta de 6 meses a um ano.

2- Treze pacientes provenientes do Hospital Dia ―Esterina Corsini‖ do Núcleo do Hospital

Universitário (UFMS), tendo sido obtida a autorização institucional,Campo Grande, Mato Grosso

do Sul.

3- Dois pacientes provenientes de um estudo de prevalência de DSTs e AIDS previamente realizado

na região metropolitana de Campinas.

Todos os pacientes eram HBsAg positivos no momento da coleta.Todas as amostras de

sangue foram centrifugadas para obtenção do soro e o material foi, então, catalogado e

acondicionado em freezer a -20°C até sua utilização.

Extração de ácidos nucléicos:

A extração do material genético viral (DNA e RNA) foi realizada através do kit

comercial High Pure Viral Nucleic Acid kit (Roche Applied Science, Alemanha), utilizando-se

200µL de soro.O princípio desse método se baseia na lise do vírus presente no soro, plasma ou

sangue total ao ser incubado com Binding Buffer e Proteinase K. Em seguida, os ácidos nucléicos

se ligam especificamente a superfície das fibras de vidro presentes na coluna fornecida pelo kit. A

reação de ligação ocorre em segundos devido ao rompimento da estrutura organizada das moléculas

de água e a interação dos ácidos nucléicos com a superfície das fibras de vidro, sendo essa ligação

específica para ácidos nucleicos. Os ácidos nucléicos ligados são lavados com um tampão

removedor de inibidores, para descartar possíveis contaminantes inibidores da PCR (Reação da

Polimerase em Cadeia). Depois são purificados para descartar sais, proteínas e outras impurezas

celulares por meio do processo de lavagem. Em seguida os ácidos nucléicos são recuperados

utilizando-se um tampão de eluição.

33

Ensaios de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia):

HBV: A região pré-S/S do HBV, que se sobrepõe à região da polimerase que possui os

sítios de mutação, foi amplificada com oligonucleotídeos específicos pela reação em semi-nested

PCR. A 1a etapa de amplificação foi realizada utilizando-se os oligonucleotídeos PS1 (senso) e uma

mistura equimolar de oligonucleotídeos anti-senso (Tabela 1) S2 e S22 na mesma reação. Dois

microlitros de DNA foram adicionados à mistura de reação contendo 20 mM de Tris-HCl pH 8.4,

50 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 10 pmol de cada oligonucleotídeo e 1 U de

Taq DNA polimerase, com volume final de 25uL. A mistura foi submetida às seguintes condições:

94°C – 3 min seguido de 30 ciclos (95°C - 30 seg, 52°C - 40 seg, 72°C - 2 min), seguidos de uma

elongação final de 7 minutos a 72°C. Na 2a etapa, utilizou-se 1µl do produto amplificado na reação

anterior com os oligonucleotídeos S24 (senso) e S25 biotinilado (antisenso), nas seguintes

condições: 94°C – 3 min seguido de 35 ciclos (94°C – 30 seg, 52°C – 30 seg, 72°C – 30 seg),

seguidos de uma elongação final de 7 minutos a 72°C. O fragmento resultante da amplificação

apresenta 218 pb e serve de molde para o pirosequenciamento. Os produtos do PCR foram

analisados em gel de agarose a 2% para verificar se houve a amplificação do fragmento de

interesse.

HIV:A obtenção do cDNA pela transcrição reversa foi realizada pelo kit SuperScript®

III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen), com os

oligonucleotídeos específicos M184V F (biotinilado) e M184V R (Tabela 1) para amplificação da

região que contém a possívelmutação que será analisada (M184V do gene pol). Foram adicionados

cinco microlitros de RNA a mistura de reação contendo 2 mMMgSO4, 200µM de dNTPs, 10 pmol

de cada oligonucleotídeo e 2 U de SuperScript® III RT/ Platinum® Taq Mix num volume final se

50 µL.A mistura foi submetida às seguintes condições: um ciclo de 50ºC por 30 min, um ciclo de

94ºC por 2 min seguido de 40 ciclos (94ºC por 15 seg, 55ºC por 30 seg e 68ºC por 30 seg).O

fragmento resultante possui 123 pb e serve de molde para o pirosequenciamento.

Eletroforese:

Os produtos das PCRs foram submetidos a uma eletroforese em gel de Agarose a 2%.

O gel foi feito utilizando-se 2g de Agarose/100 ml de TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1X/ 5µL de

Brometo de Etídio. As corridas foram realizadas numa cuba com o tampão de corridaTAE 1X.Essa

técnica se baseia na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e

34

carga. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa

global de uma fita de DNA. Portanto, íons livres, moléculas de DNA ou fragmentos de DNA em

uma solução podem ser separados aplicando–se uma determinada voltagem. Ao final do processo as

cadeias de DNA estarão próximas ao catodo, que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga

negativa.

Tabela 1: Oligonucleotídeosutilizados na amplificação por PCR

Vírus Oligonucleotídeo Sequência Direção Posição

HBV PS1 5’- CCA TAT TCT TGG GAA CAA GA – 3’ Senso nt 2826 - 2845

HBV S2 5’ - GGG TTT AAA TGT ATA CCC AAA GA – 3’ Antisenso nt 841 - 819

HBV S22 5’ - GTA TTT AAA TGG ATA CCC ACA GA – 3’ Antisenso nt 841 - 819

HBV S24 5’- TTG CAC CTG TAT TCC CAT -3 Senso nt 594-611

HBV S25 Biotinilado 5’- biotina-AAA ATT GGT AAC AGC GGT AWA AA -3’ Antisenso nt 812-791

HIV M184 F 5’-biotina- CAC CAG CAA TAT TCC ARA GTA GCA -3’ Senso nt 3016 - 3040

HIV M184 R 5’- TGC CCT ATT TCT AAG TCA GAY CC-3’ Antisenso nt 3139 - 3116

Pirosequenciamento – PyroMark Q96ID

Os oligonucleotídeos para o sequenciamento do HBV (S24-S25Bio) e HIV (M184V F

e M184V R) utilizados neste procedimento flanqueiam os genes da TR, especialmente no motivo

YMDD, onde estão presentes as mutações de resistência a 3TCpara ambos os vírus.

Para a realização do pirosequenciamento é necessário fazer a solução de

estreptavidinana seguinte proporção para uma reação: 3µL de estreptavidina (Streptavidin

Sepharose™ High Performance, GE Healthcare, UK) + 40 µL de Binding Buffer (Qiagen,

Germany) + 17 µL de água (UltraPure™DEPC-treated Water, Invitrogen,San Diego, CA, USA). 60

µL dessa solução são adicionados a 20 µL do produto de PCR biotiniladoem cada poço, em uma

placa de 96 cavidades. Todas as amostras foram feitas em duplicata para garantir a confiabilidade da

análise. A placa contendo a solução e amostras é lacrada com uma fita adesiva e vortexada para que

o material genético amplificado se ligue às moléculasde estreptavidina através da biotina presente

nos produtos de PCR.Em seguida, o oligonucleotídeo específico para cada mutação de interesseé

adicionado em uma nova placa(Tabela2).Para a análise das mutações do HBV são utilizados os

primers S26 para a mutação rtM204V/I, S27 para a mutação rtV173L e S28 para rtL180M. Para

35

analisar a mutação do HIV foi utilizado o primer M184V seq (Tabela 2).Após a ligação da

estreptavidinaao produto de PCR, essa solução é purificada e adicionada à placa que contém os

oligonucleotídeos.

Os resultados do pirosequenciamento podem ser dados em três níveis de qualidade

diferentes: alta, moderada e baixa. A seguir (Figura 3.1) está uma imagem de como o software

apresenta esses níveis de qualidade.

Figura 3.1: O canto superior esquerdo possui um esquema da placa com o nível de qualidade de

cada amostra, as amostras em vermelho evidenciam uma baixa qualidade, as em laranja evidenciam

qualidade moderada e as em azul evidenciam ótima qualidade. No canto superior direito ficam

detalhes da corrida de cada amostra, incluindo a porcentagem de cada nucleotídeo adicionado.

O software também possibilita obtenção de um pirograma (Figura 3.2)onde é possível

observar os picos e a porcentagem de cada nucleotídeo adicionado.

36

Figura3.2:Exemplo de um pirograma fornecido pelo softwarePyroMark ID no AQ mode.

As amostras foram feitas em duplicata, para melhorar a confiabilidade da reação, dessa

maneira foram consideradas apenas as duplicatas que obtiveram resultados de alta qualidade.

Tabela 2: Oligonucleotídeosutilizados no pirosequenciamento.

Vírus Oligonucleotídeos Mutação Sequência do primer Direção Posição

HBV S26 rtM204V/I 5’- GTT TGG CTT TCA GYT AT -3’ Senso nt 724-736

HBV S27 rtL180M 5’- GCC TCA GYC CGT TTC T -3’ Senso nt 651-667

HBV S28 rtV173L 5’- GSA AAA TWC CTA TGG GA -3’ Senso nt 631-647

HIV M184V seq M184V/I 5’- GAT CCT ACA TAC AAA TCA TC-3’ Antisenso nt 3121-3102

Sequenciamento Padrão de nucleotídeos:

As sequências nucleotídicas referentes à região genômica S do HBV e a região do

motivo YMDD na região pol do HIVforam determinadas pela técnica de seqüenciamento. Os

produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit comercial QIAquick PCR Purification Kit

(Qiagen, Chatsworth, CA, EUA), de acordo cominstruções do fabricante.A reação de

seqüenciamento foi preparada numa placa de 96 poços, onde foi adicionado aproximadamente100

ng de DNA, oligonucleotídeos internos para o HBV e para o HIV na concentração de 3,2 pmol e

37

água MiliQ quando necessário, num volume final de 7,5 µL. Os oligonucleotídeos utilizados para o

sequenciamento do HBV foram o S1, S4, S7 e S2, descritos na Tabela 3. Já para o HIV, os

oligonucleotídeos utilizados foram o M184V F e M184V R (Tabela1). Utilizou-se reagentes e

protocolos do kit comercialBig Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA).A reação foi submetida às seguintes condições: 94˚C por 10 segundos,

50˚Cpor 5 segundos e 60˚C por 4 minutos; 40 repetições desse mesmo ciclo.Após a reação de

sequenciamento foi feita uma precipitação com isopropanol 75% (Merck) das amostras para

retiradade ddNTPs livres que podem interferir na leitura da sequência de DNA noanalisador de

DNA.A reação de sequenciamento de nucleotídeos e a leitura automática dassequências foram

realizadas com o equipamento ABI 3730 DNA Analyzer da Applied Biosystems (Plataforma Multi-

usuário da Fiocruz).

Alinhamento das sequencias e análise filogenética:

As sequências forameditadas e alinhadaspelo Clustal W no software MEGA 4.0

(Tamura et al, 2007).A genotipagem do HBV foi realizada a aprtir da construção de uma árvore

filogenética construída pelo método Neighbor-joiningcom 3000 replicatas, utilizando sequencias

referências para os genótipos.

Tabela 3:Oligonucleotídeosutilizados no seqüenciamento do HBV

Oligonucleotídeos Sequencia do Oligonucleotídeos Direção Posição

S1 5’ - CTT CTC GAGGAC TGGGGA CC – 3’ Senso nt 124 - 143

S4 5’ - TGC TGC TAT GCC TCA TCT TCT CC – 3’ Senso nt 416 - 436

S7 5’ - TGA GCC AGG AGA AAC GGG CT CC – 3’ Antisenso nt 676 - 656

S2 5’ - GGG TTT AAA TGT ATA CCC AAA GA CC – 3’ Antisenso nt 841 - 819

38

IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Quarenta e cinco amostras coletadas de pacientes com coinfecção HBV/HIV foram

submetidas aensaios de semi-nestedPCR para amplificação parcial do gene da proteína de envolope

do HBV. Apenas 25 (55% - 25/45) amostras foram amplificadas com sucesso. Essa baixa taxa de

detecção do DNA do HBV pode ser explicada pelo fato de alguns pacientes estarem sob tratamento

antiviral, portanto, com uma pressão supressora da replicação viral. As duas amostras obtidas de um

estudo prévio para detecção de hepatite B em homens que fazem sexo com homens foram

amplificadas com sucesso. Informações sobre tratamento não estavam disponíveis para todas as

amostras. A Tabela 4 mostra as informações disponíveis para as 25 amostras amplificadas.

As amostras amplificadas pela PCR foram submetidas ao pirosequenciamento, onde

foram analisadas substituições de nucleotídeos únicos (SNPs) associadas à resistência à lamivudina.

Substituições na metionina do motivo YMDD (rtM204V ou rtM204I) assim como as mutações

compensatórias rtL180M e rtV173L foram analisadas em reações separadas.

O sequenciamento pelo método de Sanger da região S do HBV foi realizado em 15

amostras. Os resultados obtidos foram comparados aos encontrados pela técnica de

pirosequenciamento para as mutações rtM204V/I, rtL180M e rtV173L do HBV. A árvore

filogenética gerada está demonstrada do na Figura 4.1. O resultado da análise da mutação rtM204V/I

pelo seqüenciamento padrão encontra-se na Tabela 9.

39

Tabela 4:Informação de origem e tratamento dos pacientes.

Amostra Local de origem Tratamento

HSH 489 HSH - Campinas X

HSH 553 HSH - Campinas X

LVM 1 - 31/08/2005 IPEC AZT+3TC+TDF+ATVr

LVM 1 - 15/03/2006 IPEC D4T+3TC

LVM 9 IPEC D4T+3TC+ LPV/r +RTV+NVP

LVM 5 IPEC TDF+3TC+LPVr

LVM 6 - 17/10/2005 IPEC TDF+3TC+ATVr

LVM 6 - 04/04/2006 IPEC TDF+3TC+ATVr

LVM 7 - 03/05/2006 IPEC Sem terapia

LVM 7 - 07/08/2006 IPEC Sem terapia

LVM 12 IPEC TDF+3TC+LPV/r

LVM 8 IPEC X

LVM 2 IPEC X

LVM 11 IPEC X

LVM 10 IPEC X

LVM 3 IPEC X

LVM 4 IPEC X

HBC 31 UFMS TDF, 3TC e AZT

HBC 126 UFMS 3TC+AZT e LPV/r +RTV

HBC 369 UFMS 3TC, LPV/r +RTV

HBC 454 UFMS 3TC ,TDF

HBC 461 UFMS 3TC, EFZ e TDF

HBC 462 UFMS Sem terapia

HBC 764 UFMS 3TC+AZT e LPV/r +RTV

HBC 786 UFMS 3TC+AZT+EFZ

X – sem informação de tratamento.

AZT- Zidovudina; 3TC- Lamivudina; TDF-Tenofovir; ATVr- Atazanavir; D4T-Estavudina; NVP- Nevirapina;

LPV/r- Lopinavir; RTV- Ritonavir; EFZ- Efavirenz.

40

Todas as amostras amplificadas nos ensaios de PCR foram submetidas a diferentes

reações de pirosequenciamento para análise das mutações escolhidas para este estudo. Em 23

amostras, referentes a 20 pacientes, foram obtidos resultados com alta qualidade para análise da

mutação M204V/I. Os resultados, descritos na Tabela 5, mostram que apenas duas amostras (LVM

3 e LVM 7) não apresentaram nenhuma mutação no motivo YMDD. O paciente LVM 7 não estava

em tratamento no momento da coleta, corroborando com os achados neste estudo. Não foi possível

obter informações sobre tratamento o paciente LVM 3, porém, pode-se especular que este também

não estava sob terapia antiviral ou a terapia era recente, uma vez que estudos demostraram o

aparecimento de mutações de resistência a lamivudina numa frequência geralmente de 24% após 1

ano e 70% após 4 anos de terapia (Liaw et al., 2000;Lai et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo,

2008).

Mutações de resistência à lamivudina (YVDD ou YIDD) foram encontradas nas 21

amostras restantes (91,3%) em variadas proporções. Cinco amostras (LVM 6,LVM 8, HBC 31,

HBC 126 e HBC 454) apresentaram população 100% mutante YVDD. O paciente LVM 6 estava

sob terapia (Tenofovir + Lamivudina + Atazanavir) nos dois momentos de coleta. Na primeira

coleta, foi observada uma população composta apenas por cepas YVDD. Dados sobre utilização ou

não de terapia antiviral não estavam disponíveis para o paciente LVM 8, porém pode-se especular

que o paciente estava em tratamento ou que já foi infectado por uma cepa mutante. A prima-

infecção com vírus mutantes já foi descrita na literatura em pacientes renais sujeitos a hemodiálise e

em pacientes com hepatite B aguda (Motta et al, 2010; Coppola et al, 2013) . No momento da

coleta, os pacientes HBC 31, 126 e 454 estavam sob tratamento com lamivudina há 12, 36 e 108

meses, respectivamente, corroborando com a literatura que descreve o aparecimento de mutações de

resistência a lamivudina com frequência geralmente de 24% após 1 ano e 70% após 4 anos de

terapia (Liaw et al., 2000;Lai et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo, 2008).

41

Tabela 5: Resultados das análises da mutação rtM204V/I, indicando a porcentagem de moléculas

selvagens ou com substituições nucleotídicas.

1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas; 2 intervalo de 6 meses entre as coletas; 3

intervalo de 3 meses entre as coletas. Wt- Wild Type. (?) – Pode estar presente ou não. Em negrito amostras 100%

mutantes ou selvagens.

Amostra Posição 1(A/GTG) Posição 3 (ATG/C/A/T) Resultado População

A (wt) G G (wt) C A T

HSH 489 86.6% 13.4% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 86,6% YMDD

13,4% YVDD Selvagem/mutante

HSH 553 85.5% 14.5% 94.9% 0.0% 0.0% 5.1% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante

LVM 11 - 31/08/2005 78.1% 21.9% 96.4% 0.0% 0.0% 3.6% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante

LVM 11 - 15/03/2006 100.0% 0.0% 93.0% 0.0% 0.0% 7.0%

93% YMDD

7% YIDD Selvagem/mutante

LVM 5 44.2% 55.8% 90.7% 0.0% 0.0% 9.3% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante

LVM 62 - 17/10/2005 0.0% 100.0% 95.9% 0.0% 0.0% 4.1% 100% YVDD Mutante YVDD

LVM 62 - 04/04/2006 100.0% 0.0% 97.7% 0.0% 0.0% 2.3%

97,7% YMDD

2,3%YIDD Selvagem/mutante

LVM 73 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100% YMDD Selvagem YMDD

LVM 73 - 07/08/2006 100.0% 0.0% 86.5% 0.0% 0.0% 13.5%

86,5% YMDD

13,5% YIDD Selvagem/mutante

LVM 8 0.0% 100.0% 89.8% 0.0% 0.0% 10.2% 100% YVDD Mutante YVDD

LVM 2 100.0% 0.0% 97.3% 0.0% 0.0% 2.7% 97,3% YMDD

2,7%YIDD Selvagem/mutante

LVM 3 100.0% 0.0% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100% YMDD Selvagem YMDD

LVM 4 100.0% 0.0% 92.8% 0.0% 0.0% 7.2% 92,8% YMDD

7,2% YIDD Selvagem/mutante

LVM 9 100.0% 0.0% 89.4% 0.0% 0.0% 10.6% 89,4% YMDD

10.6%YIDD Selvagem/mutante

LVM 10 5.7% 94.3% 93.2% 0.0% 5.5% 1.3% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante

LVM 11 100.0% 0.0% 90.8% 0.0% 0.0% 8.6% 90,8% YMDD

8,6% YIDD Selvagem/mutante

HBC 31 0.0% 100.0% 96.9% 0.0% 0.0% 3.1% 100% YVDD Mutante YVDD

HBC 126 0.0% 100.0% 90.6% 0.0% 0.0% 9.4% 100% YVDD

Mutante YVDD

HBC 454 0.0% 100.0% 93.5% 0.0% 0.0% 6.5% 100% YVDD

Mutante YVDD

HBC 461 100.0% 0.0% 97.4% 0.0% 0.0% 2.6% 97,4% YMDD

2,6% YIDD Selvagem/mutante

HBC 462 100.0% 0.0% 97.3% 0.0% 0.0% 2.7% 97,3% YMDD

2,7% YIDD Selvagem/mutante

HBC 764 100.0% 0.0% 94.6% 0.0% 0.0% 5.4% 94,6% YMDD

5,4% YIDD Selvagem/mutante

HBC 786 100.0% 0.0% 98.0% 0.0% 0.0% 2.0% 98% YMDD

2% YIDD Selvagem/mutante

42

Três pacientes (LVM 1, 6 e 7) tiveram duas amostras coletadas com intervalos de 7, 6

e 3 meses, respectivamente. Análises da primeira coleta do paciente LVM1 demonstraram a

presença de populações mistas de vírus selvagens e mutantes (V e I), sendo que não se pode afirmar

a presença da mutação YIDD. Na segunda coleta, aparentemente a mutação que codifica a

isoleucina prevaleceu e neste momento apenas amostras selvagens e mutantes YIDD foram

observados. Esse resultado foi inesperado, pois a estabilidade da mutação rtM204I foi descrita num

estudo de Zöllner et al em 2004, em que pacientes carreando esta mutação foram monitorados por 1

ano, para observar o padrão mutacional com a continuidade do tratamento com lamivudina. Neste

estudo foi observado a alteração da mutação rtM204I para a mutação rtM204V após um intervalo

de 3 a 12 meses. O mesmo resultado já havia sido observado em estudos anteriores (Bartholomewet

al, 1997; Zöllneret al, 2000; Gutfreundet al, 2000).

As análises das duas coletas da amostra LVM 6 demonstrou a presença apenas de

mutantes YVDD na primeira coleta e população mista (selvagem/YIDD) na segunda coleta. Este é

um resultado inesperado, uma possível justificativa seria a de as datas da coleta terem sido trocadas.

O paciente LVM 7 no primeiro momento analisado apresentou uma população 100%

selvagem, sem evidência do surgimento de mutantes resistentes, no entanto, na segunda amostra,

coletada 3 meses depois, foi demonstrada a presença de mutantes YIDD em uma proporção de

13,5%. Este paciente não estava em tratamento no momento da coleta. Este resultado é corroborado

pela literatura, o surgimento espontâneo de mutações de resistência no motivo YMDD em pacientes

sem tratamento já foi descrito na literatura (Tsubota,2006; Wang et al, 2009; Tanet al, 2012).

Não foi possível realizar o sequenciamento de todas as amostras submetidas ao

pirosequenciamento devido à falta de material genético suficiente ou pela falta de sucesso em

amplificar a amostra. Analisando os resultados observados na Tabela 6 em conjunto com a Tabela

5, percebe-se que o sequenciamento realizado através do método de Sanger da mutação rtM204V/I,

conseguiu identificar apenas as populações majoritárias nas amostras de população mista. Nas

amostras onde a população era 100% mutante ou selvagem, o resultado obtido no

pirosequenciamento foi igual ao obtido no sequenciamento pelo método de Sanger. Esse resultado

comprova a aplicabilidade do pirosequenciamento como um método de detecção e quantificação de

subpopulações resistentes a lamivudina (Mello et al, 2012).

43

Tabela 6: Comparação seqüenciamento e pirosequenciamento. A população majoritária no

pirosequenciamento está destacada.

WT – wild type. * Subpopulação YIDD pode estar presente ou não.

As mutações compensatórias rtL180M e rtV173L também foram analisadas nas vinte

e cinco amostras amplificadas com sucesso pela PCR. Num primeiro momento observou-se

resultados com alta qualidade em 15 amostras na análise da rtL180M pelo pirosequenciamento. A

Tabela 7 demonstra que nenhuma substituição que provocaria o aparecimento de uma metionina na

posição 180 aconteceu no códon que codifica a leucina (TTA, TTG, CTA, CTT, CTG, CTC),

apesar de populações mistas compostas pelos códons TTG e CTG terem sido observadas.

No entanto, a mutação rtL180M, que não foi detectada nos ensaios de

pirosequenciamento, foi encontrada em 4 amostras (LVM 10, LVM 8, LVM 6- 17/10/2005 e LVM

5) no ensaio convencional. É plausível a especulação de que a falha tenha ocorrido por causa do

oligonucleotídeo S27, já que para as outras regiões a técnica funcionou de maneira bastante

satisfatória. Com o resultado do sequenciamento, observou-se que as amostras LVM 10, LVM 8,

LVM 6- 17/10/2005 e LVM 5, 100% mutantes YVDD ou com população majoritária YVDD,

apresentaram a dupla mutação rtM204V e rtL180M (esta última não detectada pelo

pirosequenciamento). Assim, foi possível comprovar a presença da dupla mutação, associada com

frequencia aos casos de resistencia à 3TC (Liaw et al, 1999; Thibault et al, 1999; Leung et al, 2001;

Amostra Pirosequenciamento Sequenciamento Genótipos

M204V/I

HSH 489 Mista (wt e YVDD) YMDD F

HSH 553 Mista (wte YV/IDD*) YMDD F

LVM 1 - 31/08/2005 Mista (wte YVDD) YMDD A

LVM 1 - 15/03/2006 Mista (wt e YIDD) YMDD A

LVM 5 Mista (wt e YV/IDD*) YVDD F

LVM 6 - 17/10/2005 YVDD YVDD A

LVM 7 - 03/05/2006 YMDD YMDD D

LVM 7 - 07/08/2006 Mista (wt e YIDD) YMDD D

LVM 8 YVDD YVDD A

LVM 2 YMDD YMDD A

LVM 9 Mista (wt e YIDD) YMDD A

LVM 10 Mista (wt e YVDD) YVDD A

LVM 11 Mista (wt e YIDD) YMDD D

LVM 3 YMDD YMDD A

LVM 4 Mista (wt e YIDD) YMDD A

44

Lai et al, 2003; Taramasso et al, 2011).A mutação compensatória rtL180M é predominantemente

detectada em associação com a mutação primária rtM204V/I, funcionando como a principal

mutação compensatória com habilidade de restaurar o fitness de replicação do HBV a valores

próximos aos selvagens, além de aumentar a resistência a laminudina (Fu and Cheng, 1998;

Melegari et al, 1998; Deng and Tang, 2011).

Tabela 7: Resultados das análises da mutação rtL180M, indicando a porcentagem de moléculas

selvagens ou com substituições nucleotídicas.

Amostra L180M A/TTG ou A/CTG

T (wild type) C (wild type) A (mut)

HSH 489 0.0% 100.0% 0.0%

HSH 553 0.0% 100.0% 0.0%

LVM 11 - 31/08/2005 23.6% 76.4% 0.0%

LVM 11 - 15/03/2006 25.2% 74.8% 0.0%

LVM 2 13.7% 86.3% 0.0%

HBC 461 0.0% 100.0% 0.0%

HBC 462 0.0% 100.0% 0.0%

HBC 764 20.2% 79.8% 0.0%

HBC 786 25.1% 74.9% 0.0%

LVM 3 26.4% 73.6% 0.0%

LVM 4 26.3% 73.7% 0.0%

LVM 9 31.8% 68.2% 0.0%

LVM 7 - 03/05/2006 30.9% 69.1% 0.0%

LVM 7 - 07/08/2006 27.8% 72.2% 0.0%

LVM 11 33.5% 66.5% 0.0%

1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas;

2 amostra do mesmo

paciente com um intervalo de 3 meses entre as coletas.

As mesmas 25 amostras também foram submetidas à análise da mutação rtV173L e

resultados com alta qualidade foram obtidos em 20 amostras (Tabela8). A análise dos resultados

demonstrou que 90% (18/20) das amostras apresentaram apenas populações selvagens e 10% (2/20)

das amostras analisadas apresentou apenas populações mutantes (substituição do G por C).Essa

45

mutação é observada numa frequência menor do que as mutações rtM204V/I e rtL180M, e é

observada apenas acompanhada da dupla mutação rtM204V/I/rtL180M.Um estudo realizado por

Delaney e colaboradores (Delaney et al, 2003), demonstrou in vitro que a mutação compensatória

rtV173L juntamente com a dupla mutação rtM204V/I/rtL180M restaura a replicação viral a valores

próximos aos dos vírus selvagens(cerca de 90%), enquanto que o vírus que possui apenas da dupla

mutação rtM204V/I/rtL180M apresenta apenas 40% dos níveis de replicação selvagem.

É possível observar na Tabela 8 que o pirosequenciamento detectou duas amostras

(HBC 31 e HBC 126) 100% mutantes rtV173L. Devido a falta de material genético não foi possível

a realização do sequenciamento convencional dessas amostras para que uma comparação fosse feita

entre os resultados. Apenas amostras que apresentaram população 100% selvagem no

pirosequenciamento tiveram material genético suficiente para serem sequenciadas. Esse resultado

foi confirmado através do sequenciamento pelo método de Sanger.

46

Tabela 8: Resultados das análises da mutação rtV173L, indicando a porcentagem de moléculas

selvagens ou com substituições nucleotídicas.

Amostra V173L C/T/GTG

G (wild type) C (mut) T (mut)

HSH 489 100.0% 0.0% 0.0%

HSH 553 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 11 - 15/03/2006 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 11 - 31/08/2005 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 7 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 8 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 10 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 11 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 454 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 461 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 462 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 786 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 3 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 9 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 5 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 6 - 17/10/2005 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 764 100.0% 0.0% 0.0%

LVM 4 100.0% 0.0% 0.0%

HBC 31 0.0% 100.0% 0.0%

HBC 126 0.0% 100.0% 0.0%

1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas

O limite de detecção de subpopulações mutantes pela técnica de Sanger segundo

Mello e colaboradores (2012) é de 20%. A análise dos resultados obtidos neste estudo revelou que a

grande maioria das amostras (16/21) nas quais mutantes foram detectados, essas subpopulações

estavam presentes em taxas menores do que 20%. Ou seja, tais subpopulações não seriam

detectadas pelo sequenciamento convencional. Ainda, em algumas amostras populações mutantes

em porcentagens menores que 5% foram detectadas, corroborando com o estudo de Mello et al,

2012 onde observou-se a detecção de populações mutantes rtM204V/I em pequenas porcentagens

pelo pirosequenciamento. Entretanto, essas populações minoritárias podem se tornar majoritárias

com a continuidade do tratamento, podendo ocasionar na falha do tratamento desses

47

pacientes(Wang et al, 2005; Metzner et al, 2009). Por este motivo é importante a detecção dessas

populações mutantes quando ainda estão em baixa porcentagem, para que seja feita a escolha da

terapia mais adequada.

Uma árvore filogenética foi construída para o HBV, podendo-se observar que 20%

(3/15)das amostras pertencem ao genótipo F, 60% (9/15)ao genótipo A e 20% (3/15)ao genótipo D

(Tabela 6). Esse resultado corrobora com a literatura, uma vez que os genótipos do HBV mais

encontrados no Brasil são o A, F e D. (Araujoet al. 2004, Viana et al. 2005, Ribeiro et al. 2006).

De 3 amostras HBV/D, 2 apresentaram população mista, sendo a população selvagem majoritária e

1 apresentou apenas população selvagem. Todas as amostras HBV/F (n=3) são compostas por

população mista, sendo em duas delas, a população selvagem majoritária e em uma a população

majoritária YVDD. Das 9 amostras HBV/A, 5 são compostas por população mista: 4 possuem

população selvagem majoritária e 1 possui população YVDD majoritária. Das restantes, 2 possuem

apenas população YVDD e 2 possuem apenas população YMDD. As informações obtidas não

foram suficientes para que fosse feita uma correlação das mutações com os genótipos do HBV. No

entanto, já foi descrito na literaturauma maior prevalência da mutação rtM204V no genótipo A do

que no genótipo D, o qual apresenta frequência maior da mutação rtM204I (Zöllneret al, 2004).

48

Figura 4.1:Árvore filogenética HBV.Árvore filogenética gerada a partir do alinhamento das

sequencias parciais da região S do HBV, construídas pelo método Neighbor-joining com 3000 replicatas. As

sequencias obtidas neste estudo estão marcadas com cores. Em azul, sequencias HBV/A1; em verde,

HBV/A2; em vermelho, HBV/D e em amarelo, HBV/F.

49

Todas amostras amplificadas com sucesso na PCR para detecção do HBVforam submetidas

ao RT-PCR para detecção do HIV (n=25) e o RNA do HIV foi detectado em 11 amostras.

Adicionalmente, duas amostras não amplificadas para o HBV foram incluídas e o RNA viral foi

detectado. As 13 amostras amplificadas foram submetidas à reação de pirosequenciamento,

paraanálise de substituições de nucleotídeos únicos (SNPs) associadas a resistência à 3TC.

Substituições na metionina do motivo YMDD (M184V ou M184I) foram analisadas. A substituição

de um C por um G, T ou A no códon TAC na posição 184 causa uma mutação de metionina para

isoleucina. Ocorre mutação de metionina para valina quando ocorre a substituição de T por C no

códon TAC na posição 184.Resultados com alta qualidade foram obtidos em nove amostras. Os

resultados apresentam-se na Tabela 9, onde é possível observar que apenas populações selvagens

foram encontradas.

Tabela9:Resultadosdas análises da mutação M184V, indicando a porcentagemde moléculas

selvagens ou com substituições nucleotídicas.

M184V/I

Posição 1 Posição 2

TAC/G/T/A C/TAC

Amostra C G T A C T

(WT) (Mut) (Mut) (Mut) (Mut) (WT)

HSH 489 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

HSH 553 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

LVM 5 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

HBC 249 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

HBC 250 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

LVM 7 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

LVM 2 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

LVM 7 - 07/08/2006 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

HBC 462 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%

O sequenciamento do HIV foi realizado em duas amostras com o intuito de comprovar

se o resultado obtido pelo pirosequenciamento para o HIV estava correto, uma vez que não foi

possível a obtenção de um controle positivo que possuísse a mutação M184V/I para validar a

eficácia da detecção desta mutação por pirosequenciamento. Em ambas as metodologias usadas,

pirosequenciamento e sequenciamento padrão, foram detectaram apenas populações selvagens nas

50

amostras de HIV. Porém, sem um controle positivo da mutação M184V/I no pirosequenciamento e

sabendo que o sequenciamento padrão não detecta populações mutantes em pequenas porcentagens,

não é possível afirmar que essas amostras realmente não possuem cepas mutantes em baixas

proporções.

O pirosequenciamento se mostrou uma técnica muito útil na detecção das mutações

estudadas, porém alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que

foi encontrada nas amostras analisadas pela técnica de Sanger. Essa técnica é de rápida execução,

pouco trabalhosa e fornece resultados quantitativos, que permitem a elaboração de uma estratégia

terapêutica adequada para pacientes coinfectados.

Uma limitação do pirosequenciamento é que poucos laboratórios têm acesso a esse

equipamento, enquanto muitos laboratórios têm acesso a máquinas de senquenciamento de Sanger

automáticas. Uma limitação inerente da técnica de pirosequenciamento é que o curto comprimento

de leitura (40pb) comparado com o seqüenciamento Sanger (500pb). No entanto, para a análise de

mutações pontuais como as de resistência a lamivudina no HBV e HIV esta característica não é um

problema. Dessa forma, o pirosequenciamento é bem adequado para o rastreio de mutações

pontuais conhecidas em larga escala, mas não para exploraçãode regiões maiores em um genoma

viral.

51

V – CONCLUSÃO

A presença da mutação primária rtM204V/I foi detectada em proporções variáveis em

91.3% das amostras. A presença dessa mutação em mais de 90% das amostras representa a grande

freqüência com que essa mutação aparece em pacientes em tratamento continuado com a

lamivudina, demonstrando a importância da detecção dessa mutação em pacientes em tratamento

prolongado.

A mutação rtL180M não foi detectada pelo pirosequenciamento nas amostras

estudadas, no entanto, pelo método de Sanger, observou-se a presença dessa mutação em 4

amostras.

A mutação rtV173L foi encontrada apenas em duas amostras, pela técnica de

pirosequenciamento, como a única população detectada.

A mutação M184V/I, analisada nas amostras RNA-HIV e DNA-HBV positivas, não

foi detectada por nenhum dos métodos utilizados.

Os genótipos de HBV encontrados no presente estudo foram A1 (n=8), A2 (n=1), D

(n=3) e F (n=3) e não foi possível associá-los a nenhum perfil de mutações de resistencia à

lamivudina.

A técnica de pirosequenciamento foi capaz de detectar mutações que estão em

pequenas quantidades, que não foram detectadas pelo sequenciamento de Sanger.

52

VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aceti A, Pasquazzi C, Zechini B, De Bac C; Liver HAART Group. Hepatotoxicity development

during antiretroviral therapy containingprotease inhibitors in patients with HIV: the role of hepatitis

B and C virus infection. J Acquir Immune Defic Syndr, 2002.

Alter, HJ et al. Transmission of hepatitis B to chimpanzees by hepatitis B surface antigen-positive

saliva and semen. Infection and Immunity, 1977.

Araujo NM, Mello FC, Yoshida CF, Niel C, Gomes SA. High proportion of subgroup A' (genotype

A) among Brazilian isolates of Hepatitis B virus.Arch Virol, 2004.

Arauz-Ruiz, P; Norder, H; Robertson, BH et al. Genotype H: A new Amerindian genotype of

hepatitis B virus revealed in Central America. J. Gen Virol. 83:2059–73p, 2002.

Bailes E, Gao F, Bibollet-Ruche F, Courgnaud V, Peeters M, Marx PA, Hahn BH, Sharp PM.

Hybrid origin of SIV in chimpanzees. Science. 2003.

Balayan MS, Andjaparidze AG, Savinskaya SS, Ketiladze ES, Braginsky DM, Savinov

AP,Poleschuk VF. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via fecal-oral

route.Intervirology; 1983.

Barre-Sinoussi F. HIV as the cause of AIDS. Lancet.1996.

Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J, Dauguet C,xler-Blin C,

Vezinet-Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W and Montagnier L.Isolation of a T-lymphotropic

retrovirus from a patient at risk for acquired immunedeficiency syndrome (AIDS).Science.1983.

Bartlett JG and Moore R. A comprehensive plan for managed care of patientsinfected with human

immunodeficiency virus. Clin. Infect. Dis.,1999.

Bartholomew MM, Jansen RW, Jeffers LJ, Reddy KR, Johnson LC, BunzendahlH, Condreay LD, et

al. Hepatitis B virus resistance to lamivudinegiven for recurrent infection after orthotopic liver

transplantation. Lancet, 1997.

Bayer ME, Blumberg BS, Werner B. Particles associated with Australian antigen in the seraof

patients with leukemia, Down’s syndrome and hepatitis. Nature; 1968.

Bebenek K, Abbotts J, Roberts JD, Wilson SH, Kunkel TA. Specificity andmechanism of error-

prone replication by human immunodeficiency virus-1 reversetranscriptase. J. Biol. Chem.,1989.

53

Benhamou Y, Bochet M, Thibault V, et al. Long-term incidence of hepatitis B virus resistance to

lamivudine in human immunodeficiency virus-infected patients. Hepatology, 1999.

Bertoletti A, Constanzo A, Chisari FV, et al. Citotoxic Tlymphocyte response to a wild-tipe

hepatitis B virusepitope in patients chronically infected by variant virusescarrying substituitions

within the epitope. J Exp Med, 1994.

Bertoletti A. Immune response and viral tolerance during chronicHBV infection.Abstracts of the

12th International Symposiumon Viral Hepatitis and Liver Disease.J Clin Virol, 2006.

Bessesen M, Ives D, Condreay L, Lawrence S, Sherman KE.Chronic active hepatitis B

exacerbations in human immunodeficiency virus-infected patients following development of

resistance to or withdrawal of lamivudine.Clin Infect Dis. 1999.

Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A ―new‖ antigen in leukemic sera.JAMA; 1965.

Blumberg BS, Gerstley BJS, et al. Serum antigen(Australia antigen) in Down’s syndrome, leukemia

and hepatitis. Ann Int Me; 1967.

Bonacini M. Interaction between HIV and hepatitis B.AIDS, 1997.

Bonacini M, Louie S, Bzowej N,Wohl AR. Survival in patients with HIV infection and viral

hepatitis B or C: a cohort study. AIDS, 2004.

Brasil, Ministério da Saúde.Protocolo Clínico e DiretrizesTerapêuticas para o Tratamentoda

Hepatite Viral Crônica B e Coinfecções.2011

Brasil, Ministério da Saúde.Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para Manejo da Infecção

pelo HIV em Adultos.2013

Briggs JA, Wilk T, Welker R, Krausslich HG, Fuller SD. Structural organization of authentic,

mature HIV-1 virions and cores.EMBO J. 2003.

Briggs JA, Grunewald K, Glass B, Forster F, Krausslich HG, Fuller SD. The mechanism of HIV-1

core assembly: insights from three-dimensional reconstructions of authentic virions. Structure.

2006.

Carbonero, LM; Poveda, E. Hepatitis B Virus and HIV Infection.Semin Liver Dis; 2012

54

Cecilia, D., Kulkarni, S.S., Tripathy, S.P.,et al. Absence of coreceptor swith with

diseaseprogression in Human immunodeficiency Virus infections in India. Virology,2000.

Chao, DC; Hu KQ. Update on rescue therapies in patients with lamivudine-resistant chronic

hepatitis B.Drug Des Devel Ther, 2013.

Chakravarti, A; Rawat, D; Jain, M. A study on the perinatal transmission of the hepatitis B virus.

Indian J Med Microbiol., 2005.

Chang C, Enders G, Sprengel R, Peters N, Varmus HE, Ganem D. Expression of the precore region

of an avian hepatitis B virus is not required for viral replication. J Virol, 1987.

Chapham, P.R. & Weiss, R.A. Spoilt choice of co-receptors. Nature,1997.

Chen MT, Billaud JN, Sällberg M, Guidotti LG, Chisari FV, Jones J, et al. A function of the

hepatitis B virus precore protein is to regulate the immune response to the core antigen. Proc Natl

Acad Sci U S A, 2004.

Chien RN. On-treatment monitoring of chronic hepatitis B virus infection: An Asian–

Pacificperspective. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2010.

Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNAclone

derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science; 1989.

Chun HM;Roediger MP; Hullsiek KH et al.Hepatitis B Virus Coinfection Negatively ImpactsHIV

Outcomes in HIV Seroconverters. The Journal of Infectious Diseases; 2012.

Clifford GM, Rickenbach M, Polesel J, et al; Swiss HIV Cohort. Influence of HIV-related

immunodeficiency on the risk of hepatocellular carcinoma. AIDS, 2008.

Clumeck N, Sonnet J, Taelman H, Mascart-Lemone F, De BM, Vandeperre P, Dasnoy J, Marcelis

L, Lamy M, Jonas C. Acquired immunodeficiency syndrome in Africanpatients. N. Engl. J.

Med.1984.

Coffin J, Haase A,et al. What to call the AIDS virus? Nature;1986.

Cohen, O. J., Kinter, A., Fauci, A. S. 1997. ―Host factors in the pathogenesis ofHIV disease‖.

Immunolog. Rev., 1997.

55

Colson, P.; Roquelaure, B.; Tamalet C. Detection of a newly identified hepatitis B irus genotype in

southeastern France. Journal of Clinical Virology, 2009.

Connor RI, Ho DD. Etiology of AIDS: biology of human retroviruses. In: DevitaVT. editor. AIDS

etiology, diagnosis, treatment and prevention. Philadelphia: J.B.Lippincott Company.1992.

Cooper A, Garcia M, Petrovas C, Yamamoto T, Koup RA, Nabel GJ. HIV-1causesCD4cell

deaththroughDNA-dependentproteinkinaseduringviral integration. Nature, 2013.

Coppola N, Tonziello G, Colombatto P, et al. Lamivudine-resistant HBV strain rtM204V/Iin acute

hepatitis B. Journal of Infection, 2013.

Coursaget, P; LeCann, P; Leboulleux, D et al. Detection oh hepatitis B virus DNA by polymerase

chain reaction in HBsAg negative Senegalense patients suffering from cirrhosis or primary liver

cancer. FEMS Microbiology Letter; 1991.

Cunha, LK et al. Distribution of human immunodeficiency virus type 1 subtypes in the State of

Amazonas, Brazil, and subtype C identification.Braz J Med Biol Res. Feb; 2012.

Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australiaantigen-

associated hepatitis. Lancet;1970.

Das, K; Xiong, X; Yang, H et al. Molecular modeling and biochemical characterization reveal the

mechanism of hepatitis B virus polymerase resistance to lamivudine (3TC) and emtricitabine

(FTC). J Virol, 2001.

Davison, F; Alexander, GJ; Trowbridge, R et al. Detection of hepatitis B virus DNA in

spermatozoa, urine, saliva and leucocytes, of chronic HBsAg carriers. A lack of relashionship with

serum markers of replication. Journal of Hepatology. 1987.

Deeks SG, Lewin SR, Havlir DV.The end of AIDS: HIV infection as a chronic disease. Lancet,

2013.

Demarest JF, Jack N, Cleghorn FR, Greenberg ML, Hoff man TL,Ottinger JS, et al. Immunologic

and virologic analyses of anacutely HIV type 1-infected patient with extremely rapid

diseaseprogression. AIDS Res Hum Retroviruses, 2001.

Deng L, Tang H. Hepatitis B virus drug resistance to current nucleos(t)ideanalogs: Mechanisms and

mutation sites. Hepatology Research, 2011.

56

Doitsh G, Cavrois M, Lassen KG, Zepeda O,Yang Z,Santiago ML,et

al.AbortiveHIVinfectionmediatesCD4Tcelldepletionand inflammationinhuman lymphoidtissue.

Cell,2010.

Doms, R.W., Peiper, S.C. Unwelcomed guest with máster keys: how HIV useschemokine receptors

for cellular entry. Virology, 1997.

Doranz, B.J., Rucker, J., YI, Y., Smyth, R.J., Sanson, M., Peiper, S.C.,Parmentier, M., Collman,

R.G. & Doms, R.W. A dual-tropic primaryHIV-1 isolate that uses fusin and the b-chemokine

receptors CKR-5, CKR-3 andCKR-2b as fusion cofactors. Cell, 85: 1149 – 1158, 1996.

Dore GJ, Soriano V, Rockstroh J, et al; Smart insight study group. Frequent hepatitis B virus

rebound among HIV-hepatitis B viruscoinfected patients following antiretroviral therapy

interruption. AIDS, 2010.

DouekDC,BrenchleyJM,BettsMR,AmbrozakDR,HillBJ,OkamotoY,et al.HIV

preferentiallyinfectsHIV-specificCD4+Tcells.Nature, 2002.

EASL, European Association for the Study of the Liver.EASL Clinical Practice Guidelines:

Management of chronichepatitis B virus infection. Clinical Practice Guidelines, 2012.

Eckert DM, Kim PS. Design of Potent inhibitors of HIV entry form gp41 N-peptideregion. PNAS,

2001.

Elghouzzi, MH; Couroucé, AM; Magnius, LO. Transmission of hepatitis B virus by HBV-negative

blood transfusion. Lancet; 1995.

Embretson J, Zupancic M, Ribas JL, Burke A, Racz P, Tenner-RaczK et al. Massive covert

infection of helper T lymphocytes andmacrophages by HIV during the incubation period of

AIDS.Nature, 1993.

Emerman, M. & Malim, M. HIV-1 regulatory/accessory genes: keys to unravelingviral and host cell

biology. Science, 1998.

European AIDS Clinical Society. European AIDS Clinical Society Guidelines. Version 7.0,

October, 2013. Disponível em:

<http://www.eacsociety.org/Portals/0/Guidelines_Online_131014.pdf> Acesso em 30 de out. 2013.

57

Fallot, G; Halgand, B; Garnier, E. Recombination of hepatitis B virus DNA in patients with HIV.

Gut; 2012.

FauciAS,PantaleoG,StanleyS,WeissmanD.Immunopathogenic

mechanismsofHIVinfection.AnnInternMed ,1996.

Fauquet, CM et al. Virus Taxonomy: Eight report of the International Committee of Taxonomy of

viruses. Hepadnaviridae. San Diego, Calif: Elsevier Academic Press. 373-384, 2005.

Feinstone SM, Kapikian AZ, Purceli RH. Hepatitis A: detection by immune electronmicroscopy of

a virus like antigen associated with acute illness. Science; 182:1026-1028; 1973.

Feng, F., Broder, C.C., Kennedy, P.E. & Berger, E.A. HIV-1 entry cofactor:functional cDNA

cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor.Science, 1996.

Ferrari C, Missale B, Boni C, Urbani S. Immunopathogenesis of hepatitis B. J Hepatol, 2003.

Ferrari C, Missale G, Boni C, et al. Immunopathogenesisof HBV infection. Abstracts of the 12th

InternationalSymposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. J Clin Virol, 2006.

FinkelTH,Tudor-WilliamsG,BandaNK,CottonMF,CurielT,MonksC,etal.Apoptosis

occurspredominantlyinbystandercellsandno tin productivelyinfectedcellsofHIV-and SIV-

infectedlymphnodes.Nat Med, 1995.

François G, Kew M, Van Damme P, Mphahlele MJ, Meheus A. Mutant hepatitis B viruses: amatter

of academic interest only or a problem with far-reaching implications. Vaccine;19:3799-3815;

2001.

Freed, E.O. HIV-1 Gag Proteins: Diverse functions in the virus Life Cycle. Virology, 1998.

Freed EO. HIV-1 replication. Somat Cell Mol Genet., 2001.

Fu L, Cheng YC. Role of additional mutations outside theYMDD motif of hepatitis B virus

polymerase in L (K) SddC (3TC) resistance. Biochem Pharmacol, 1998.

Furman P A, Fyfe J A, St. Clair M H, et al. Phosphorylation of 3′-azido-3′-deoxythymidine and

selective interaction of the 5′-triphosphate with human immunodeficiency virus reverse

transcriptase.Proc Natl Acad Sci USA, 1986.

58

Gaillard RK, Barnard J, Lopez V, et al. Kinetic analysis ofwild-type and YMDD mutant hepatitis B

virus polymerases and effects of deoxyribonucleotide concentrations on polymerase activity.

Antimicrob Agents Chemother; 2002.

Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, Shearer GM, Kaplan M, Haynes BF, Palker TJ,Redfield R,

Oleske J, Safai B. Frequent detection and isolation of cytopathicretroviruses (HTLV-III) from

patients with AIDS and at risk for AIDS. Science; 1984.

Gambarin-Gelwan, M. Hepatitis B in pregnancy. Clin Liver Dis. 11:945-63, 2007.

Ganem, D et al. Hepadnaviridae and their replication. Fields Virology. 2703-2737, 1996.

Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences.N Engl

J Med; 2004.

Ganem & Varmus. The molecular biology of the hepatitis B viruses.Annu Rev Biochem. 1987.

Gao F, Bailes E, Robertson DL, Chen Y, Rodenburg CM, Michael SF, Cummins LB,Arthur LO,

Peeters M, Shaw GM, Sharp PM, Hahn BH. Origin of HIV-1 in thechimpanzee Pan troglodytes

troglodytes. Nature. 1999.

Garzino-Demo, A., De Vico, A.L., Conant, K.E., Gallo, R.C.,The role ofchemokine in Human

Immunodeficiency Virus infection. Immunologycal Reviews.,2000.

Gavin PJ, Yogev R. The role of protease inhibitor therapy in children with HIV infection. Paediatr.

Drugs. 2002.

Gerlish & Robinson, et al.Structural relationships between the surface antigens of ground squirrel

hepatitis virus and human hepatitis B virus.J Virol. 1980.

Geskus RB, Prins M, Hubert JB, Miedema F, Berkhout B, Rouzioux C, Delfraissy J F Meyer L.

The HIV RNA setpoint theory revisited. Retrovirology .2007.

Gonçales, FL. Hepatite por vírus B. In: Focaccia R. Tratado das Hepatites Virais. São Paulo:

Atheneu. 27-49, 1997.

Gottlieb MS, Schroff R, Schanker HM, Weisman JD, Fan PT, Wolf RA, Saxon A.Pneumocystis

carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthyhomosexual men: evidence of a

new acquired cellular immunodeficiency. N. Engl. J.Med.1981.

59

Grant, A.D. & Cock, K.M. ABC of AIDS – HIV infection and AIDS in thedeveloping world.

British Medical Journal,2001.

Guidotti L.G., Rochford R., Chung J., et al. Viral clearencewithout destruction in infected cells

during acute HBVinfection. Science;1999.

Gutfreund K, Williams M, George R, Bain VG, Ma MM, Yoshida EM,Villeneuve JP, et al.

Genotypic succession of mutations of the hepatitis Bvirus polymerase associated with lamivudine

resistance. J Hepatol, 2000.

Hammer SM, Eron JJ, Jr. Reiss P, Schooley RT,et al. Antiretroviral treatment of adult HIV

infection: 2008recommendations of the International AIDS Society-USA panel. JAMA. 2008.

Hart G J, Orr D C, Penn C R et al. Effects of (−)-2′-deoxy-3′-thiacytidine (3TC) 5′-triphosphate on

human immunodeficiency virus reverse transcriptase and mammalian DNA polymerases alpha,

beta, and gamma. Antimicrob Agents Chemother, 1992.

He J, Chen Y, Farzan M, Choe H, Ohagen A, Gartner S, Busciglio J. CCR3 and CCR5 are co-

receptors for HIV-1 infection of microglia. Nature, 1997.

Heermann et al. Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence.J Virol.

1984.

Hemelaar J. The origin and diversity of the HIV-1 pandemic. Trends Mol Med. 18: 182–192, 2012.

HIV Database. Los Alamos - HIV Sequence database.2010a. Disponível em: <http://www.hiv-

web.lanl.gov>. Acesso em: 28/10/2013.

Hogan, C. M., Hammer, S. M. Host determinants in HIV infection anddisease. Part 2: genetic

factors and implications for antiretroviral therapeutics, Ann. Intern. Med., 2001.

Hoofnagle JH, Doo E, Liang TJ, et al. Management of hepatitis B: summary of a clinicalresearch

workshop. Hepatology; 2007.

Huet T, Cheynier R, Meyerhans A, Roelants G,Wain-Hobson S. Genetic organization of a

chimpanzee lentivirus related to HIV-1. Nature. 1990.

Hughes, J.M. & Conte, J.E.. Group O Human Immunodeficiency Virus -1 Infections.Infectious

Disease Clinics of North America. 1998.

60

Hunt PW, Brenchley J, Sinclair E, McCune JM, Roland M, Page-Shafer K, et al. Relationship

between T cell activation and CD4+T cell count in HIV-seropositive individuals with

undetectableplasma HIV RNA levels in the absence of therapy. J Infect Dis, 2008.

Hussain M et al. Sensitive line probe assay that simultaneously detects mutations conveying

resistance to lamivudine and adefovir. J Clin Microbiol 44(3), 1094-7, 2006.

Ichiki Y., He X.S., Shimoda S., et al. T cell immunity in hepatitisB and hepatitis C virus infection:

implications forautoimmunity. Autoimmun Rev;2005.

ICTV. Virus Taxonomy: 2012 release. Hepadnaviridae.

<http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?bhcp=1>. Acesso em: 04 de jul. 2013.

Idoko J, Meloni S, Muazu M, et al. Impact of hepatitis B virus infection on human

immunodeficiency virus response to antiretroviral therapy in Nigeria. Clin Infect Dis, 2009.

Ivanov, IA; Beshkov, D; Shankar, A et al.Detailed Molecular Epidemiologic Characterization of

HIV-1 Infection in Bulgaria Reveals Broad Diversity and Evolving Phylodynamics. Plos one,

Volume 8, Issue 3, 2003.

Johnson, V et al. Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1. Top HIV Med 16(5), 138-45,

2008.

Kantor, R., Katzenstein, D. Drug resistence in non-subtype B HIV-1. J Clin Virol. v. 29, pp. 152-

159, 2004.

Karon JM, Buehler JW, Byers RH,et al. Projections of the number of personsdiagnosed with AIDS

and the number of immunosuppressed HIV-infected persons-United States, 1992-1994. MMWR

Recomm Rep. 1992.

Kato, H; Fugiwara, K; Gish, RG et al. Classifying genotype F of Hepatitis B virus into F1 and F2

subtypes. World J Gastroenterol 11: 6295-304, 2005.

Kidd-Ljunggren K, Miyakawa Y, Kidd AH. Genetic variability in hepatitis B viruses. Journalof

General Virology, 2002.

Kim CM, Koike K, Saito I, Miyamura T, Jay G. HBx gene of hepatitis B virus induces livercancer

in transgenic mice. Nature; 351:317–320; 1991.

61

Kim WH, Hong F, Jaruga B, Zhang ZS, Fan SJ, Liang TJ, Gao B. Hepatitis B virus X

proteinsensitizes primary mouse hepatocytes to ethanol- and TNF-alpha-induced apoptosis by

acaspase-3-dependent mechanism. Cell Mol Immunol; 2:40–48; 2005.

Kim HJ, Park JH, Park DI, et al. The influence of YMDD mutation patterns on clinical outcomes in

patients with adefovir add-on lamivudine combination treatment. Liver Int, 2012.

Klingmuller U, Schaller H. Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S

domain and a specific hepatocellular receptor. Journal of Virology, 67: 7414-7422; 1993.

Koblin B; Taylor P; Rubinstein P; Stevens C. Effect of duration of hepatitis B virus infection on the

association between human immunodeficiency virus type-1 and hepatitis B viral replication.

Hepatology 15(4), 590-2, 1992.

Konopnicki D, Mocroft A, de Wit S, et al. Hepatitis B and HIV: prevalence, AIDS progression,

response to highly active antiretroviral therapy and increasedmortality in the EuroSIDA cohort.

AIDS.19:2117–2125, 2005.

Koup RA, Safrit JT, Cao Y, Andrews CA, McLeod G, Borkowsky W, Farthing C, Ho DD.

Temporal association of cellular immune responses with the initial control ofviremia in primary

human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J.Virol., 1994.

Kramvis, A et al. Relationship of serological subtype, basic core promoter and precore mutations to

genotypes/subgenotypes of hepatitis B vírus. J Med Virol 80: 27-46, 2008.

Kurbanov F, Tanaka Y, Mizokami M. Geographical and genetic diversity of the human hepatitis B

virus. Hepatol Res. 40(1):14-30, jan. 2010.

Lai C, Dienstag J, Schiff E, Leung N, Atkins M., Hunt, C, Brown N, Woessner M, Boehme R,

Condreay L. Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for

patients with chronic hepatitis B. Clin Infect Dis 36(6), 687-96, 2003.

Lambotte O, Boufassa F, Madec Y, Nguyen A, Goujard C, MeyerL, et al. HIV Controllers: A

Homogeneous Group of HIV1 InfectedPatients with Spontaneous Control of Viral Replication. Clin

Infect Dis, 2005.

Lara-Pezzi E, Majano PL, Go´mez-Gonzalo M, Garcia-Monzo´n C, Moreno-Otero R, Levrero M,

Lo´pez-Cabrera M. The hepatitis B virus X protein up-regulates tumor necrosis fator alpha gene

expression in hepatocytes. Hepatology; 28:1013–1021; 1998.

62

Laub O, Rall LB, Truett M, et al. Synthesis of hepatitis B surface antigen in mammalian

cells:expression of the entire gene and the coding region. J Virol; 48(1):271-280; 1983.

Le, T; Chiarella, J et al. Low-abundance HIV drug-resistant viral variants in treatment-experienced

persons correlate with historical antiretroviral use. PLoS One, 2009.

Leão, R.N.Q. Doenças Infecciosas e Parasitárias: Enfoque Amazônico. In: Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida. Belém, Cejup, 1997.

Lee, C; Gong, Y et al. Effect of hepatitis B immunisation in newborn infants of mothers positive

hepatitis B surface antigen: systematic rewiew and meta-analysis. BMJ, 332:328-36, 2006.

Lee MJ, Jin YH, Kim K, Choi Y, Kim HC, Park S. Expression of hepatitis B virus x proteinin

hepatocytes suppresses CD8? T cell activity. Immune Net; 2010.

Lee W. Hepatitis B vírus infection. N Engl Med;1997.

Leung, N et al. Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances

hepatitis B e antigen seroconversion rates: results after 3 years of therapy. Hepatology, 2001.

Levy JA, Hoffman AD, Kramer SM, Landis JA, Shimabukuro JM, Oshiro LS.Isolation of

lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS.Science;1984.

Liaw YF, Leung NW, Chang TT, Guan R, Tai DI, Ng KY, Chien RN, Dent J, Roman L,

Edmundson S, Lai CL.Effects of extended lamivudine therapy in Asian patients with chronic

hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group.Gastroenterology. 2000.

Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology; 2007.

Lok AS, McMahon BJ.Chronic Hepatitis B: Update 2009. AASLD Practice Guidelines, 2009.

Lok AS, Zoulim F, Locarnini S et al.Antiviral Drug-Resistant HBV: Standardization of

Nomenclature and Assays and Recommendations for Management. Hepatology, 2007.

Luster, A.D. Chemokines: chemotactic cytokines that mediate inflammation. The New England

Journal of Medicine,1998.

Manegold, C; Hannoum, C; Wywiol, A et al. Reactivation of Hepatitis B Virus Replication

Accompanied by Acute Hepatitis in Patients Receiving Highly Active Antiretroviral Therapy.Clin

Infect Dis. 2001.

63

Marcellin P. Hepatitis B and hepatitis C in 2009. Liver International, 2009.

Margeridon-Thermet, S et al. Ultra-deep pyrosequencing of hepatitis B virus quasispecies from

nucleoside and nucleotide reverse-transcriptase inhibitor (NRTI)-treated patients and NRTI-naive

patients. J Infect Dis 199(9), 1275-85, 2009.

Martín-Carbonero L, Teixeira T, Poveda E, et al. Clinical and virological outcomes in HIV-infected

patients with chronic hepatitis B on long-term nucleos(t)ide analogues. AIDS, 2011.

Marx, P.A., Alcabes, P.G & Drucker, E. Philosophical Transactions The Royal Society. London,

356: 911 – 920, 2000.

Melegari M, Scaglioni PP, Wands JR. Hepatitis B virusmutants associated with 3TC and

famciclovir administrationare replication defective. Hepatology, 1998.

Mello, F et al. Detection of mixed populations of wild-type and YMDD hepatitis B variants by

pyrosequencing in acutely and chronically infected patients. BMC Microbiology 12:96, 2012.

Mello, F et al. Hepatitis B virus genotypes circulating in Brazil: molecular characterization of

genotype F isolates. BMC Microbiol 7, 103, 2007.

Mellors JW, Muñoz A, Giorgi JV, Margolick JB, Tassoni CJ, GuptaP, et al. Plasma viral load and

CD4+ lymphocytes as prognosticmarkers of HIV-1 infection. Ann Intern Med, 1997.

Metzner, KJ et al. Minority quasispecies of drug-resistant HIV-1 that lead to early therapy failure in

treatment-naive and -adherent patients. Clin Infect Dis. 15;48(2):239-47, 2009.

MeyaardL,OttoSA,JonkerRR, MijnsterMJ,KeetRPM,MiedemaF.ProgrammeddeathofTcellsinHIV-

1infection.Science, 1992.

Milich DR, Jones JE, Hughes JL, Price J, Raney AK, McLachlan A. Is a function of the secreted

hepatitis B e antigen to induce immunologic tolerance in utero? Proc Natl Acad Sci U S A, 1990.

Milich DR, McLachlan A. The nucleocapsid of hepatitis B virus is both a T-cell-independentand T-

cell-dependent antigen. Science; 234:1398-1401; 1986.

Miller JH, Presnyak V, Smith HC. The dimerization domain of HIV-1 viralinfectivity factor Vif is

required to block APOBEC3G incorporation with virions.Retrovirology.2007.

64

Mitsuya H, Broder S. Inhibition of the in vitro infectivity and cytopathic effect of human T-

lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus (HTLV-III/LAV) by 2′,3′-

dideoxynucleoside. Proc Natl Acad Sci USA, 1986.

Montagnier L. 25 years after HIV discovery: prospects for cure and vaccine.Virology. 2010.

Moore, J.P. Coreceptors: implications for HIV pathogenesis and terapy. Science, 1997.

Motta JS, Mello FC, Lago BV et al. Occult hepatitis B virus infection and lamivudine-

resistantmutations in isolates from renal patients undergoinghemodialysis. Journal of

Gastroenterology and Hepatology, 2010.

Mulder LC, Chakrabarti LA, Muesing MA. Interaction of HIV-1 integrase withDNA repair protein

hRad18. J. Biol. Chem. 2002.

Mulky, A et al. Subunit-specific analysis of the human immunodeficiency virus type 1 reverse

transcriptase in vivo. J Virol 78(13), 7089-96, 2004.

Murakami S.Hepatitis B virus X protein: a multifunctional viral regulator.J Gastroenterol. 2001.

Murray CJ, Vos T, Lozano R, et al. Disability-adjusted life years(DALYs) for 291 diseases and

injuries in 21 regions, 1990–2010:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study

2010.Lancet, 2012.

Nakamura I, Nupp JT,Cowlen M, et al. Pathogenesis ofexperimental neonatal woodchuck hepatitis

virus infection:chronicity as an outcome of infection is associated with adiminished acute hepatitis

that is temporally deficient for theexpression of interferon gamma and tumor necrosis factoralfa

messenger RNAs. Hepatology, 2001.

Nassal M, Rieger A. An intramolecular disulfide bridge between Cys-7 and Cys-61determines the

structure of the secretory core gene product (e antigen) of hepatitis B virus.Journal of Virology, 67:

4307-4315; 1993.

Nassal M, Schaller H. Hepatitis B virus replication--an update. J Viral Hepat; 1996.

Negroni M, Buc H. Mechanisms of retroviral recombination. 2001 Annu Rev Genet. 35:275-302,

2001.

Neurath AR, Kent SBH, Strick N, Parker K. Identification and chemical synthesis of a hostcell

receptor binding site on hepatitis B virus. Cell; 46: 429-436; 1986.

65

Ninomiya M, Takahashi M, Shimosegawa T, Okamoto H. Analysis of the entire genomes offifteen

torque teno midi virus variants classifiable into a third group of genus Anellovirus.Arch Virol;

152:1961-1975; 2007.

Nishimoto, T.M.I.; Eluf Neto , J.; Rozman, M.A. Transmissão materno-infantil do vírus da

imunodeficiência humana: avaliação de medidas de controle no município de Santos. Rev. Assoc.

Med. Bras., v. 51, n. 1,p 54-60, 2005.

Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, Yoshizawa H, Miyakawa Y, Mayumi M. A novel DNAvirus

(TTV) associated with elevated transaminase levels in post transfusion hepatitis ofunknown

etiology. Biochem Biophys Res Commun; 241:92-97; 1997.

Norder, H et al. Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and

natural variations in the primary structure of the surface antigenJ Gen Virol. July 1993

Norder H, Couroce AM, Magnius LO. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural

proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes. Virol.

198 (2): 498-03p, 1994.

Okochi K, Murakami S. Observations on Australian antigen in Japanese. Vox Sang;15:374-385;

1968.

Olinger C.M., Jutavijittun P., Hübschen J.M. et al. Possible new hepatitis B virus genotype,

southeast Asia. Emerging infection Disease. 14(11):1777-1780, 2008.

Ott, JJ et al. Global epidemiology of hepatitis B virus infection: New estimates of age-specific

HBsAg seroprevalence and endemicity. Vaccine, 30: 2212-2219, 2012.

Pancera M, Majeed S, Ban YE, Chen L, Huang CC, Kong L, Kwon YD. Structureof HIV-1 gp120

with gp41-interactive region reveals layered envelope architecture andbasis of conformational

mobility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010.

Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of

antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Washington, DC: U.S. Department

of Health and Human Services.Disponível em:

<http://www.aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescenGL.pdf>. Acesso em 21 de out.

2013.

66

Pantaleo, G., Fauci, A. S. Immunophatogenesis of HIV infection. Annu Rev Microbiol. Review,

1996.

Papatheodoridis GV, Dimou E, Papadimitropoulos V. Nucleoside analogues for chronic hepatitis B:

antiviral efficacy and viral resistance. Am J Gastroenterol; 2002.

Peçanha EP, Antunes OA, Tanuri A. Estratégias Farmacológicas para a Terapia Anti-AIDS. Quim.

Nova, 2002.

Pedersen C, Lindhardt BO, Jensen BL, Lauritzen E, GerstoftJ, Dickmeiss E, et al. Clinical course of

primary HIV infection:consequences for subsequent course of infection. Br Med J, 1989.

Peng C, Ho BK, Chang TW, Chang NT. Role of human immunodeficiency virustype 1-specific

protease in core protein maturation and viral infectivity. J Virol. 1989.

Pereyra F, Addo MM, Kaufmann DE, Liu Y, Miura T, Rathod A, et al. Genetic and immunologic

heterogeneity among personswho control HIV infection in the absence of therapy. J Infect Dis,

2008.

Perronne C. Antiviral hepatitis and antiretroviral drug interactions. J Hepatol 44(1 Suppl), S119-25,

2006.

Petersen, J; Buti, M.Considerations for the longterm treatment of chronic hepatitis B with

nucleos(t)ide analogs. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 6(6), 683–694, 2012.

Peterson K, Jallow S, Rowland-Jones SL, de Silva TI. Antiretroviral Therapy for HIV-2 Infection:

Recommendations for Management in Low-Resource Settings. AIDS Res Treat. Feb. 2011.

Piot P, Quinn TC, Taelman H, Feinsod FM, Minlangu KB, Wobin O, Mbendi N, Mazebo P, Ndangi

K, Stevens W. Acquired immunodeficiency syndrome in aheterosexual population in Zaire.

Lancet;1984.

Plantier, JC et al. A new human immunodeficiency virus derived from gorillas. Nature Medicine,

2009.

Pollack JR, Ganem D. An RNA stem-loop structure directs hepatitis B virus genomic

RNAencapsidation. J Virol; 1993.

67

Popper, S.J., Sarr, A.D., Travers, K.U., Gueye-Ndiaye, A., Mboup, S.,Essex, M.E. & Kanki, P.J.

Lower Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type 2 Viral Load Reflects the Difference in

Pathogenicity of HIV-1 and HIV-2. Journal Infectious Disease.1999.

Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, Gallo RC. Detection, isolation, andcontinuous production

of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDSand pre-AIDS. Science;1984.

Prince AM. An antigen detected in the blood during the incubation period of serum hepatitis. Proc

Natl Acad Sci USA; 1968.

Qiagen. Principle of Pyrosequencing Technology. Disponível em:

<http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/pyrosequencing/pyromark-q96-

id#productdetails > 10 de dezembro de 2013

Rambaut, A., Posada, D., Crandall, A. K. et al. The causes and consequences pf HIV evolution.

Reviews Nature,2004.

Rehermann B, Michelina N. Immunology of hepatitis B virus andhepatitis C virus infection. Nat

Rev Immunol, 2005.

Rehermann B. Immune Responses in Hepatitis B Virus Infection.Semin Liver Dis, 2003.

Ribeiro NR, Campos GS, Angelo AL, Braga EL, Santana N, Gomes MM, Pinho JR, De Carvalho

WA, Lyra LG, Lyra AC. Distribution of hepatitis B virus genotypes among patients with chronic

infection. Liver Int, 2006.

Rizzetto M, Canese MG, Aricò S, Crivelli O, Trepo C, Bonino F, Verme G.Immunofluorescence

detections of new antigen-antibody system (delta/anti-delta) associatedto hepatitis B virus in liver

and serum of HBsAg carriers. Gut; 1977.

Rizzeto M. Viral hepatitis in the third millenium. Researches of Virology;1998.

Robertson, D et al. HIV-1 nomenclature proposal. Science 288(5463), 2000.

Robinson WS, Lutwick LI. The virus of hepatitis, type B. N Engl J Med; 1976.

Ross TM, Cullen BR. The ability of HIV type 1 to use CCR-3 as a coreceptor iscontrolled by

envelope V1/V2 sequences acting in conjunction with a CCR-5 tropic V3loop. Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A., 1998.

68

Rutherford GW, Lifson AR, Hessol NA, Darrow WW, O’MalleyPM, Buchbinder SP, et al. Course

of HIV-I infection in a cohortof homosexual and bisexual men: an 11 year follow up study.Br Med

J, 1990.

Samson, M., Libert, F., Doranz, B.J., Rucker, J,et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian

individuals bearing mutant alleles of the CCR5 chemokine receptor gene. Nature,1996.

Samuel C.E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev, 2001.

Sanches, M., Krauchenco, S., Martins, N.H. et al. Structural Characterization of B and non-B

Subtypes of HIV-Protease: Insights into the Natural susceptibility to drug resistance. J. Mol. Biol.

2007.

Santos A. O., A., Alvaro Mora M.V., Botelho L. et al. Characterization of Hepatitis B virus (HBV)

genotypes in patients from Rondonia, Brazil. Virol J. 2010.

Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol

2007.

Schuurman, R et al. Rapid changes in human immunodeficiency virus type 1 RNA load and

appearance of drug-resistant virus populations in persons treated with lamivudine (3TC). J Infect

Dis; 1995.

Shafritz DA, Lieberman HM. The molecular biology of hepatitis B virus. Annu Rev Med. 1984.

Shanmugam, V., Switzer, W.M., Nkengarong, J.N., Garcia-Lerma, G.,Green, T.A., Ekpini, E.,

Sassan-Morokro, M., Antunes, F.,Manshino, K., Soriano, V., Wiktor, S.Z., Heneine, W. Lower

HIV-2Plasma Viral Loads May Explain Differences Between the Natural Histories ofHIV-1 and

HIV-2 Infections. Jornal Acquired Immune Defic. Syndr., 2000.

Sherman, M. et al. Entecavir for treatment of lamivudine-refractory,HBeAg-positive chronic

hepatitis B. Gastroenterology, 2006.

Sherman, M. et al. Entecavir therapy for lamivudine-refractorychronic hepatitis B: improved

virologic, biochemical, and serologyoutcomes through 96 weeks. Hepatology, 2008.

Seeger C & Mason WS. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev;2000.

69

Simons JN, Leary TP, Dawson GP. Isolation of a novel virus-like sequence associated withhuman

hepatitis. Nature Med; 1995.

Sjogren M. Serologic diagnosis of viral hepatitis. Gastroenterology Clinical North American, 1994.

Sleasman, J.W. & Goodenow, M.M. HIV-1 infection. J. Allergy Clin. Immunol., 2003.

Snustad, D.P & Simmons, M.J. A Genética dos Vírus. In: Fundamentos de Genética.Rio de Janeiro,

Guanabara Koogan S.A, p. 386 – 391, p. 2001.

Soriano V, Puoti M, Garcia-Gascó P, et al. Antiretroviral drugs and liver injury. AIDS, 2008.

Soriano V, Puoti M, Peters M, et al. Care of HIV patientswith chronic hepatitis B: updated

recommendations from the HIV-Hepatitis B Virus International Panel. AIDS, 2008.

Soriano, V; Vispo, E et al. Viral hepatitis and HIV co-infection. Antiviral Res. 2009.

Souza MVN, Almeida MV. Drogas Anti-VHI: Passado, Presente e perspectivas futuras. Quim.

Nova, 2003.

Spira, S et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug

resistance. J Antimicrob Chemother; 2003.

St. Clair M H, Richards C A, Spector T, Weinhold K J, Miller W H, Langlois A J, Furman P A. 3′-

Azido-3′-deoxythymidine triphosphate as an inhibitor and substrate of purified human

immunodeficiency virus reverse transcriptase. Antimicrob Agents Chemother, 1987.

Staprans SI and Feinberg MB. The roles of nonhuman primates in the preclinicalevaluation of

candidate AIDS vaccines. Expert. Rev. Vaccines., 2004.

Strathdee SA, Craib KJ, Hogg RS, O’Shaughnessy MV, MontanerJS, Schechter MT. Long-term

non-progression in HIV infection.Lancet, 1995.

Strauss, RT; Franque-Ranque, M; Bergström, S. et al.; Infectious etiology of jaundice among

pregnant women in Angola. Scand J Infect Dis. 2003.

Strohl WA, Rouse H, Fisher BD. Microbiologia ilustrada. Porto Alegre: Artmed, 2004.

Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome

and phylogenetic relatedness. J of Gen Virol. ; 2000.

70

Stuhlmann H, Berg P. Homologous recombination of copackaged retrovirusRNAs during reverse

transcription. J. Virol., 1992.

Sulkowski M, Thomas D, Chaisson R, et al. Hepatotoxicity associated with antiretroviral therapy in

adults infected with human immunodeficiency virus and the role of hepatitis C or B virus infection.

JAMA, 2000.

Swanson CM, Puffer BA, Ahmad KM, Doms RW, Malim MH. Retroviral mRNA nuclear export

elements regulate protein function and virion assembly. EMBO J., 2004.

Takahashi K, Iwasa Y, Hijikata M, Mishiro S. Identification of a new human DNA virus(TTV-like

mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus.Arch Virol; 2000.

Takehisa J, Kraus MH, Ayouba A, Bailes E, Van HF, Decker JM, Li Y. Origin and biology of

simian immunodeficiency virus in wild-living western gorillas. J. Virol.2009

Tan Y, Ding K, Su J, Trinh X, et al.The naturally occurring YMDD mutation among patients

chronically infected HBV and untreated with lamivudine: a systematic review and meta-

analysis.Plos One, 2012.

Taramasso, L; Caligiuri, P; Di Biagi, A et al.Lamivudine resistance mutations in European patients

with hepatitis B and patients co-infected with HIV and hepatitis B.J Med Virol. 2011.

Tatematsu, K; Tanaka, Y et al. A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human

and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J.

J., 2009.

Thibault, V et al. Hepatitis B virus (HBV) mutations associated with resistance to lamivudine in

patients coinfected with HBV and human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol; 1999.

Thio CL. Hepatitis B and human immunodeficiency virus coinfection. Hepatology, 2009.

Tindall B, Barker S, Donovan B, Barnes T, Roberts J, KronenbergC, et al. Characterization of the

acute clinical illness associatedwith human immunodefi ciency virus infection. Arch Intern Med,

1988.

Tiollais P, Pourcel C, Dejean A. The hepatitis B virus.Nature. Oct 1985.

Toh H; Hayashida H; Miyata T. Sequence homology between retroviral reverse transcriptase and

putative polymerases of hepatitis B virus and cauliflower mosaic virus. Nature, 1983.

71

Tran T. T., Trinh T. N., Abe K. New complex recombinant genotype of hepatitis B virus identified

in Vietnam. Journal of Virology, 2008.

Trono, D. HIV accessory proteins: leading roles for the supporting cast. Cell,1995.

Tsubota A. How do naturally occurring YMDD-motif mutants influencethe clinical course of

lamivudine-naïve patients with chronichepatitis B virus infection?Gastroenterol. Hepatol. 2006.

Turner, B.G. & Summers, M.F. Structural biology of HIV. JMB,1999.

Tuttleman JS, Pourcel C, Summers J. Formation of the pool of covalently closed circular viralDNA

in hepadnavirus-infected cells. Cell; 1986.

Van HF, Li Y, Neel C, Bailes E, Keele BF, Liu W, Loul S. Human immunodeficiency viruses: SIV

infection in wild gorillas. Nature.2006.

Van de PP, Rouvroy D, Lepage P, Bogaerts J, Kestelyn P, Kayihigi J, Hekker AC, Butzler JP,

Clumeck N. Acquired immunodeficiency syndrome in Rwanda.Lancet. 1984.

Veronesi, R., Focaccia, R., Lomar, V. HIV/AIDS: etiologia, patogenia e patologia clínica,

tratamento e prevenção. São Paulo, Atheneu, 436p, 1999.

Viana S, Parana R, Moreira RC, Compri AP, Macedo V. High prevalence of hepatitis B virus and

hepatitis D virus in the western Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg, 2005.

Vivet-Bodou V, Didierjean J, Isel C, Marquet R. Nucleoside and nucleotide inhibitors of HIV-1

replication. Cell Mol Life Sci, 2006.

Vries-Sluijs T, Reijnders J, Hansen B, et al. Long-term therapy with tenofovir is effective for

patients coinfected with human immunodeficiencyvirus and hepatitis B virus. Gastroenterology,

2010.

Walter SR, Thein HH, Amin J, et al. Trends in mortality after diagnosis of hepatitis B or C

infection: 1992-2006. J Hepatol.; 2011.

Wang C,et al. Characterization of mutation spectra with ultra-deeppyrosequencing: Application to

HIV-1 drug resistance. Genome Research, 2005.

Wang YQ, Pu D. Clinical analysis of natural mutation of YMDD in HBV infection patients.

Journal of China Tropical Medicine, 2009.

72

Wigg MD.Vírus da Imunodeficiência Humana. In: Santos; Romanos; Wigg.(Eds). Introdução à

Virologia Humana. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan.p.410-447, 2008.

Williams G, Stretton TB, Leonard JC. AIDS in 1959? Lancet. 1983.

Wit, F; Weverling, G et al. Incidence of and risk factors for severe hepatotoxicity associated with

antiretroviral combination therapy. J Infect Dis, 2002.

Wong V, Chan H. Chronic hepatitis B: a treatment update. Semin Liver Dis; 2013.

World Health Organization. Hepatitis B, July 2013. Disponível em:

<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/>. 16 de abril de 2013.

Wright TL.Clinical trial results and treatment resistance with lamivudine in hepatitis B.Semin Liver

Dis. 2004.

Yamaguchi, J., Devare, S.G. & Brennan, C.A. AIDS, 2000.

Yarchoan R, Mitsuya H, Myers C E, Broder S. Clinical pharmacology of 3′-azido-2′,3′-

dideoxythymidine (zidovudine) and related dideoxynucleosides. N Engl J Med, 1989.

Yu H., Yuan Q., Ge S-X.et al. Molecular and phylogenetic analyses suggest an additional hepatitis

B virus genotype ―I‖. PLoS One. 2010.

Yuen LK, Locarnini SA: Genetic variability of hepatitis B virus and response to antiviral

treatments: searching for a bigger picture. J Hepatol. 2009.

Xiang WQ, Feng WF, Ke W, Sun Z, Chen Z, Liu W. Hepatitis B virus X protein stimulatesIL-6

expression in hepatocytes via a MyD88-dependent pathway. J Hepatol; 2011.

Xu J, Yun X, Jiang J, Wei Y, Wu Y, Zhang W, Liu Y, Wang W, Wen Y, Gu J. Hepatitis Bvirus X

protein blunts senescence- like growth arrest of human hepatocellular carcinoma byreducing

Notch1 cleavage. Hepatology; 2010.

Zhang Y-L., Cheng T., Cai Y-J. et al. RNA Interference inhibits Hepatitis B Virus of different

genotypes in vitro and in vivo. BMC Microbiology, 2010.

Zhou DX, Taraboulos A, Ou JH, Yen TS. Activation of class I major histocompatibilitycomplex

gene expression by hepatitis B virus.J Virol; 1990.

73

Zhou, YZ; Slagle, B.L.; Donehower, LA.et al.; Structural analysis of a hepatitis B virus genome

integrated into chromosome 17p of a human hepatocellular carcinoma. J Virol. Nov. 1988.

Zoulim, Fabien and Locarnini, Stephen. Hepatitis B Virus Resistance to Nucleos(t)ide Analogues.

Gastroenterology. 2009.

Zoulim F, Perrillo R.Hepatitis B: reflections on the current approach to antiviral therapy.J Hepatol.

2008.

Zo¨llner B, Stoehr A, Plettenberg A, Feucht HH, Schro¨ter M, Scha¨fer P,Laufs R. In vivo dynamics

and pathogenicity of wild-type and resistanthepatitis B virus during long-term lamivudine

monotherapy—a clinicalnote.J Clin Virol, 2000.

Zöllner B, Petersen J, Puchhammer-Stöckl E, Kletzmayr J, et al. Viral Features of Lamivudine

Resistant Hepatitis BGenotypes A and D. Hepatology, 2004.